estudo fitoquÍmico e avaliaÇÃo da atividade … · tabela 5- dados de rmn de 1h e 13c da...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTILEISHMANIA DE Virola surinamensis (Rol.) Warb
Kelly Cristina de Albuquerque Freitas
BELÉM – PARÁ
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTILEISHMANIA DE Virola surinamensis (Rol.) Warb
Autor: Kelly Cristina de Albuquerque Freitas
Orientador: Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos
Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Fani Dolabela
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e medicamentos do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
BELÉM – PARÁ
2016
FOLHA DE APROVAÇÃO
Kelly Cristina de Albuquerque Freitas ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTILEISHMANIA DE
Virola surinamensis (Rol.) Warb
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Instituto Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Fármacos e Medicamentos
Aprovado em: 29/03/2016.
Banca Examinadora
______________________________________ Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos (Orientador)
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas/ ICS/ UFPA
_______________________________________ Profa. Dra. Maria Fani Dolabela (Co-Orientadora)
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas/ ICS/ UFPA
_________________________________
Prof. Dr. Luiz Carlos de Souza Rodrigues Faculdade de Ciências Farmacêuticas/ ICS/ UFPA
________________________________ Profa. Dra. Roseane Maria Ribeiro Costa
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas/ ICS/ UFPA
BELÉM - PARÁ 2016
Aos meus queridos pais, irmã e filhas, que são minha essência, base, estrutura e porto seguro.
AGRADECIMENTOS
A Deus por tudo.
A minha família, em especial a minha mãe e minhas filhas, por total apoio e
compreensão em todos os momentos mais árduos desta caminhada.
Aos meus orientadores, Dr. Lourivaldo da Silva Santos e Dra. Maria Fani Dolabela,
pelo acolhimento, paciência, compreensão, confiança e ensinamentos, os quais me
proporcionaram concluir essa etapa da vida profissional.
Aos professores do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, que
contribuíram para minha formação.
A todos os amigos da Universidade Federal do Pará que conquistei durante este
percurso.
A todos os amigos dos Laboratórios de Farmacologia – Faculdade de Ciências
Farmacêuticas e Laboratório de Produtos Naturais - UFPA, pela ajuda, convívio e
amizade.
A todos os amigos da Coordenação Estadual de Saúde Mental, Álcool e outras
Drogas, pelo incentivo na busca deste objetivo.
A SESPA, pela liberação das minhas atividades para a realização deste estudo.
RESUMO
FREITAS, K.C.A. ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTILEISHMANIA DE Virola surinamensis (Rol.) Warb. 71 f. Dissertação de Mestrado, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Pará, Belém, 2016.
O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antileishmania de subfrações ricas em neolignanas obtidas do extrato hexânico de folhas de Virola surinamensis. Na obtenção do extrato foi utilizado hexano, sendo a solução concentrada em evaporador rotatório. O extrato hexânico foi fracionado em coluna cromatográfica aberta, empregando como fase estacionária sílica gel e como fases móveis hexano, acetato de etila e metanol em gradiente de polaridade crescente. As frações 4-5 e 16-17 foram submetidas a novo fracionamento em coluna cromatografica. A Subfração 41 obtida da fração 16-17 foi chamada de C5. A partir da Fração 4-5 obtiveram-se as subfrações 16-18 (C3) e 19-23 (C4). Somente a C5 foi submetida a análises espectrofotométricas. Apenas as subfrações com maior teor de pureza (C3, C4 e C5) e ricas em neolignanas foram submetidas a avaliação de atividades biológicas. Na atividade antipromastigota realizou-se o cultivo e a manutenção das formas promastigotas da espécie de Leishmania amazonensis. Nesta avaliação utilizou-se cultura de promastigota na concentração de 5 x 106 parasitas/100µL, sendo esta tratada com diferentes concentrações de C3, C4 e C5 por 24h. Após, foi adicionado solução de sal de tetrazolio (MTT, 10mg/mL) para avaliar a viabilidade dos parasitos. Foi realizada leitura em leitor de ELISA, em 490nm. Também se avaliou a citotoxicidade de C3, C4 e C5 para células THP-1 modificadas, sendo utilizado o ensaio de viabilidade celular (MTT). Os estudos em RMN sugerem que C5 possui 3 diferentes neolignanas, sendo estas a surinamesina, virolina e uma terceira não identificada. As subfrações C3 e C4 não foram ativas contra a forma promastigota de L. amazonensis (CI50> 2C5 inibiu em 43% a viabilidade parasitária na concentração de 200 amostra apresentou citotoxicidade (C50> 5que a atividade antipromastigota do extrato hexânico, provavelmente, não esteja relacionada às neolignanas, visto que o fracionamento reduziu a atividade antipromastigota.
Palavras chave: Virola surinamensis, extrato hexânico, células THP-1, Leishmania.
ABSTRACT
FREITAS, K.C.A. PHYTOCHEMICAL STUDY AND ANTILEISHMANIAL ACTIVITY ASSESSMENT Virola surinamensis (Rol.) Warb. 71 f. Masters dissertation, Graduate Program in Pharmaceutical Sciences, Universidade Federal do Pará, Belém, 2016. This study aimed to evaluate the antileishmanial activity of subfractions rich in neolignans obtained from the hexane extract of Virola surinamensis leaves. In obtaining the extract was used hexane and the solution concentrated in a rotary evaporator. The hexane extract was fractioned into open column chromatography, employing silica gel as stationary phase and hexane ethyl acetate and methanol as mobile phase, in increasing polarity gradient. Fractions 4-5 and 16-17 were subjected to further fractionation on chromatographic column. Subfraction 41 obtained from Fraction 16-17 was called C5. From the fraction 4-5 were obtained the subfractions 16-18 (C3) and 19-23 (C4). Only C5 was subjected to spectrophotometric analysis. Only subfractions with higher-purity (C3, C4 and C5) and rich in neolignans were subjected to the evaluation of biological activities. In antipromastigote activity was carried out the cultivation and conservation of promastigotes of the Leishmania amazonensis species. This evaluation was used promastigote culture at a concentration of 5 x 106 parasitas/100µL, which is treated with different concentrations of C3, C4 and C5 for 24h. After, it was added tetrazolium salt solution (MTT, 10mg/mL) to evaluate the viability of parasites. Reading was performed in ELISA reader, at 490nm. It also assessed the cytotoxicity of C3, C4 and C5 for modified THP-1 cells, were performed using the cell viability assay (MTT). The studies at RMN suggest that C5 has three different neolignans, these being the surinamesina, virolin and a third unidentified. The subfractions C3 and C4 were not active against the promastigote form of L. amazonensis (CI50> 200 g/mL). However, the C5 inhibited by 43% parasite viability at the concentration of 200
g/mL. No sample showed cytotoxicity (C50> 500 g/mL). These results suggest that antipromastigote activity of hexane extract, probably, not related to neolignans, since the fractionation reduced antipromastigote activity. Keywords: Virola surinamensis, hexane extract, THP-1 cells, Leishmania.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Ciclo de vida de Leishmania ssp. ............................................................... 20
Figura 2- Incidência mundial de casos de leishmaniose tegumentar em 2012. ........ 22
Figura 3- Estrutura química de antimoniais pentavalentes utilizados no tratamento
das leishmanioses ..................................................................................................... 24
Figura 4- Estrutura química do isotionato de pentamidina (3) ................................... 25
Figura 5- Estrutura química da anfotericina B (4) ...................................................... 25
Figura 6- Virola surinamensis em floração, frutos e sementes. ................................. 27
Figura 7- Estruturas químicas de lignanas e neolignas isoladas de V. surinamensis.
.................................................................................................................................. 29
Figura 8- Fluxograma do fracionamento do extrato hexânico para obtenção das
substâncias. .............................................................................................................. 40
Figura 9- Desenho esquemático das placas de 96 poços de fundo chato e da
distribuição das substâncias testadas representadas por cores. .............................. 44
Figura 10- Cromatograma 1 - Gradiente de ampla extensão de C4R38-41 com fase
móvel composta por solvente A: H2O e solvente B: ACN variando de 5 a 100% de B
em 60 minutos, vazão de 1,0 mL min-1, fase estacionária C18 (Microsorb). .............. 49
Figura 11- Cromatograma 2 - Eluição isocrática de FA6C1, composta por: Fase
estacionária: Coluna Microsorb C18 fase móvel H2O:MeOH 62:38, vazão de 1mL min-
1 e detecção por absorbância no Ultra Violeta visível. ............................................... 50
Figura 12- Espectro de RMN de 1H de C5 - (CDCl3, 300MHz). ................................. 51
Figura 13- Espectro de RMN de 1H de C5, expansão - (CDCl3, 300MHz). ............... 52
Figura 14- Espectro de RMN 13C de C5 (CDCl3, 75 MHz) ........................................ 53
Figura 15- Espectro de RMN 13C de C5, expansão (CDCl3, 75 MHz). ...................... 53
Figura 16- Estrutura química da substancia surinamensina (11). ............................. 55
Figura 17 - Espectro de RMN de 1H da subfração 2 - (CDCl3, 300MHz). .................. 55
Figura 18- Espectro de RMN de 1H da subfração 2, expansão - (CDCl3, 300MHz). . 56
Figura 19- Espectro de RMN de 1H da subfração 3 - (CDCl3, 300MHz). ................... 56
Figura 20- Curva de crescimento de L. amazonsensis. ............................................ 58
Figura 21- Atividade antipromastigota dos extratos obtidos das folhas de Virola
surinamensis para L. amazonensis; CN- Controle negativo; CSOL- controle do
solvente (metanol); BRA- Branco; subfrações do extrato hexânico (C3,C4 e C5) nas
concentrações : 200µg/mL; 100µg/mL; 50µg/mL; 25µg/mL; 12,5µg/mL; 6,25µg/mL e
3,125µg/mL. .............................................................................................................. 59
Figura 22- Avaliação da citotoxicidade através do MTT. ........................................... 61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Estimativa da % do solvente B (ACN) para eluição isocrática, baseada no
tempo de retenção da última banda Tz e do gradiente inicial. ................................... 42
Tabela 2- Interpretação dos resultados baseado na faixa do CIM e CI50 .................. 45
Tabela 3- Fracionamento do extrato bruto hexânico (15g) com rendimento. ............ 49
Tabela 4- Dados de RMN 13C e 1H da substancia surinamensina (11) em
comparação com os dados da literatura para a surinamensina (Barata et al. 1978).
.................................................................................................................................. 54
Tabela 5- Dados de RMN de 1H e 13C da substância virolina (10) em comparação em
comparação com os dados da literatura para a virolina (Borges et al. 2007). ........... 57
Tabela 6- CI50 do extrato, frações, subfrações e substâncias obtidas de V.
surinamensis testados em formas promastigotas de Leishmania. ............................ 61
Tabela 7- Avaliação da citotoxicidade do extrato, frações, subrações e substâncias
obtidas de V. surinamensis. ...................................................................................... 62
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ACN Acetonitrila AcOEt Acetato de Etila CC Cromatografia em coluna CCD Cromatografia em Camada Delgada CI50 Concentração Inibitória mínima 50% CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência COSY Correlation Spectroscopy d Dupleto dd Duplo dupleto DEPT Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimetilsulfóxido DP Desvio Padrão dq Duplo quarteto HETCOR Heteronuclear Correlation Hex. Hexano Hz Hertz J Constante de acoplamento em Hertz K Fator de retenção L Litro m multipleto MeOH Metanol µg Micrograma MHz Megahertz min. Minuto mL Mililitro mm Milímetro MTT Brometo Tialzolil azul de tetrazólio OMS Organização Mundial de Saúde. pH Potencial hidrogenionico Rf Fator de Retenção RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de carbono –13 RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio –1 rpm Rotação por minuto RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 s simpleto SPE solid phase extraction Tg Tempo de retenção do gradiente Tr Tempo de retenção Tra Tempo de retenção do primeiro pico Trz Tempo de retenção do último pico UV Ultravioleta δ Deslocamento Químico μL Microlitro µM Micromolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15
2 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 18
2.1 Virola surinamensis .......................................................................................... 26
3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 32
3.1 Objetivo geral .................................................................................................... 32
3.2 Objetivos específicos........................................................................................ 32
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 33
4.1 Material ............................................................................................................... 33
4.1.1 EQUIPAMENTOS ............................................................................................ 33
4.1.2 MATERIAL DE CONSUMO ............................................................................. 34
4.1.2.1 Solventes e Reagentes. .............................................................................. 34
4.1.2.2 Meios de culturas e outros ............................................................................ 34
4.1.2.3 Vidrarias e outros materiais ........................................................................... 34
4.1.3 PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO ............................................................ 35
4.1.3.1 Preparo do meio de cultivo Novy-Nicolle-Mcneal (NNN) ............................... 36
4.1.3.2 Preparo do meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) incompleto
e completo para cultivo de Leishmanias .................................................................................. 36
4.1.3.3 Preparo do meio RPMI 1640 para cultivo de células THP-1 ......................... 36
4.1.4 MATERIAL BIOLÓGICO .................................................................................. 37
4.1.4.1 Espécie de Leishmania ................................................................................. 37
4.1.4.2 Linhagem celular e cultivo ............................................................................. 38
4.1.5 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO .............................. 38
4.2 Métodos .............................................................................................................. 38
4.2.1 ESTUDOS FITOQUÍMICOS ............................................................................. 38
4.2.1.1 Obtenção dos extratos brutos ................................................................... 39
4.2.1.2 Fracionamento do extrato hexânico .............................................................. 39
4.2.2 AVALIAÇÃO BIOLÓGICA ................................................................................ 42
4.2.2.1 Cultivo e manutenção das formas promastigotas .......................................... 42
4.2.2.2 Ensaio da atividade antipromastigota ............................................................ 43
4.2.2.3 Células THP-1 diferenciadas (macrófagos) ................................................... 45
4.2.2.4 Determinação da concentração citotóxica 50% (CC50) em células THP-1
diferenciadas (macrófagos) ....................................................................................... 46
4.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 47
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 48
5.1 Atividades biológicas……………………………………………………………… 58
6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 63
7 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 64
15
1 INTRODUÇÃO
As doenças negligenciadas não são doenças que só prevalecem em
condições de pobreza, elas contribuem para a manutenção de um quadro de
desigualdade, já que representam um grande entrave ao desenvolvimento dos
países (BRASIL, 2010). O termo ''doenças negligenciadas'' refere-se ao fato de que
essas doenças geralmente atingem populações empobrecidas que vivem em
condições não privilegiadas, com acesso precário aos cuidados de saúde, educação
e necessidades básicas, como água potável ou habitação (DUTRA e GOLLOB,
2011).
Dengue, doença de Chagas, esquistossomose, hanseníase, leishmaniose,
malária, tuberculose, entre outras, são citadas como exemplos de doenças
negligenciadas. Mais de um bilhão de pessoas estão infectadas com uma ou mais
doenças negligenciadas, representando um sexto da população mundial (OMS,
2016; BRASIL, 2010). De modo geral, algumas doenças negligenciadas vêm se
expandido pelo mundo, passando a ser notificados casos em locais que antes não
havia relatos. Um exemplo é a leishmaniose, que tem sido relatado casos em vários
países europeus (WHO, 2012).
As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania e
consideradas um grave problema de saúde pública. Segundo dados da Organização
Mundial de Saúde (OMS), 350 milhões de pessoas estão expostas ao risco de
contrair a doença, com registro aproximado de dois milhões de novos casos das
diferentes formas clínicas; presente em 98 países do mundo, distribuídos em cinco
dos seis continentes e sua notificação é compulsória em apenas 30 deles (ALVAR et
al. 2012; OMS, 2016).
As manifestações clínicas da infecção por Leishmania spp observadas em
humanos na forma tegumentar, a mais comum da doença, podem evoluir desde
lesões cutâneas autolimitadas a lesões graves de difícil resolução, assim como
observado nas formas mucosa, difusa e disseminada. Os quadros clínicos
observados na forma visceral, apresentação mais severa da doença, podem variar
16
desde quadros assintomáticos a polissintomáticos graves, com desfecho fatal sem
tratamento adequado (MÜLLER et al. 2008; WHO, 2012).
Atualmente na quimioterapia desta protozoose se utiliza os antimoniais
pentavalentes (antimoniato de N-metil glucamina - glucantime® e o estibogluconato
de sódio - pentostan®). Uma outra alternativa prevista para tratamento é a utilização
da anfotericina B e suas formulações lipossomais, porém, a estes fármacos,
associam-se questões relevantes que incluem a alta toxicidade, a resistência
emergente, administração parenteral, elevado custo e regimes de tratamento
relativamente longo (CROFT e YARDLEY, 2002; GONTIJO e MELO, 2004;
KHRAIWESH et al. 2016).
Os problemas anteriormente expostos enfatizam a importância do
desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Durante as últimas
décadas ocorreu um aumento significativo no nosso conhecimento básico do
parasito, bem como uma revolução das técnicas químicas e vários avanços em
ferramentas de bioinformática que motivaram a busca de novos agentes
leishmanicidas (MONZOTE, 2009).
Neste contexto, buscar novos fármacos com atividade antileishmania tornou-se
de extrema importância. Várias estratégias podem ser utilizadas nesta busca, como:
planejamento racional de fármacos, avaliação da atividade antileishmania de
fármacos já disponíveis no mercado com outros objetivos terapêuticos e triagem de
plantas medicinais. Vale ressaltar que, os estudos de plantas medicinais já
contribuíram de forma significativa na busca de novos fármacos.
Especificamente para leishmania, várias espécies vegetais são utilizadas no
tratamento de feridas de difícil cicatrização e doenças ulcerosas. Algumas espécies
possuem estudos preliminares que demonstraram o potencial antileishmania, um
exemplo é a Virola surinamensis. O extrato hexânico obtido das folhas de V.
surinamensis mostrou ser muito promissor, pois foi ativo em promastigota tanto em
L. chagasi (CI50= 86,4 g/mL), quanto em L. amazonensis (CI50= 79,7 g/mL) e esta
atividade pode estar relacionada à presença de misturas de hidrocarbonetos de
cadeia longa, ésteres glicerídicos, misturas de esteróides e arilpropanóides, que
foram observados pela análise do espectro de RMN de 1H (SARAIVA, 2012; VEIGA,
17
2013). Apesar destes resultados promissores, nenhum estudo avaliou o beneficio do
fracionamento deste extrato sobre esta atividade.
A realização deste trabalho se justifica em informações etnobotânicas, isto é, a
V. surinamensis é utilizada na medicina popular para o tratamento de feridas de
difícil cicatrização, sendo a leishmaniose uma doença causadora de feridas
(SCHULTES e HOLMSTED, 1971; BERGER, 1992) e em estudos anteriores onde
foram demonstrados a atividade antipromastigota do extrato hexânico de V.
surinamensis (SARAIVA, 2012; VEIGA, 2013). Baseado neste relato vêm-se propor
a avaliação da atividade antileishmania de frações do extrato hexânico obtido das
folhas de V. surinamensis.
18
2 REVISÃO DA LITERATURA
A leishmaniose é uma doença zoonótica, que afeta homens e animais. Esta
patologia é crônica, de manifestação cutânea ou visceral. Os agentes etiológicos das
leishmanioses foram observados por Cunningham em 1885, na Índia, que descreveu
formas amastigotas em casos de leishmania visceral (WHO, 2010).
Classificação taxonômica do gênero Leishmania segundo LAINSON et al.
(1986):
Reino: Protista Haeckel, 1866
Sub-Reino: Protozoa Goldfuss, 1817
Filo: Sarcomastigophora Honigberg e Balamuth, 1963
Subfilo: Mastigophora Deising, 1866
Classe: Zoomastigophorea Calkins, 1909
Ordem: Kinetoplastida Honigberg, 1963, emend. Vickerman, 1976
Sub-ordem: Trypanosomatina Kent, 1880
Família: Trypanosomatidae Doflein, 1901, emend. Grobben, 1905
Gênero: Leishmania Ross, 1903, emend. Vickerman 1977.
O gênero Leishmania foi subdividido em complexos fenotípicos agrupados em
dois subgêneros: Leishmaniae e Viannia. O subgênero Viannia tem distribuição
neotropical, causam leishmaniose cutânea e mucocutânea e compreende as
espécies descritas primeiramente como do complexo L. braziliensis: L.(V.)
braziliensis, L. (V). guyanensis, L.(V.) panamensis, e L.(V.) peruviana (LAINSON e
SHAW, 1987). O subgênero Leishmania abrange espécies que causam a
leishmaniose cutânea no Velho Mundo como L. (L.) major e L. (L.) tropica e dois
complexos, o complexo L. mexicana onde se incluem as espécies L. (L.) mexicana,
L. (L.) amazonensis, L. (L.) pifanoi e L. (L.) venezuelensis e o complexo L. donovani
cujos membros são L. (L.) donovani, L. (L.) infantume L.(L.) chagasi que causam
leishmaniose cutânea e visceral, respectivamente (GRIMALDI JUNIOR et al. 1989).
Durante seu ciclo de vida, o gênero Leishmania apresenta duas formas
evolutivas: promastigotas e amastigotas. As formas promastigotas apresentam uma
19
morfologia alongada e flagelo livre na região anterior; no citoplasma são observados
vacúolos e o núcleo é semelhante ao da forma amastigota. O cinetoplasto é
geralmente ovóide, situado entre a extremidade da região anterior da bolsa flagelar e
o núcleo, sua posição apresenta variações (ROGERS et al. 2002).
A forma amastigota é tipicamente ovóide ou esférica, sem flagelo livre,
encontrado na bolsa flagelar, observado por microscopia eletrônica. No citoplasma
são encontrados vacúolos, núcleo arredondado, cinetoplasto em forma de bastão
situado próximo ao núcleo (VANNIER SANTOS et al. 2002). Esta forma é parasita
intracelular obrigatório do sistema fagocítico mononuclear, principalmente
macrófagos, dos hospedeiros vertebrados, incluindo uma grande variedade de
mamíferos, entre eles o homem (GRIMALDI JUNIOR, 1982).
Os protozoários do gênero Leishmania possuem um ciclo de vida digenético,
uma parte ocorre no hospedeiro invertebrado e a outra no hospedeiro vertebrado. As
formas flageladas são encontradas no trato digestivo do hospedeiro invertebrado,
insetos hematófogos chamados de flebotomíneos, pertencentes à Ordem Díptera,
Família Psychodidae, Subfamília Phebotominae (RANGEL e LAINSON, 2009;
BRASIL, 2010) e Gênero Lutzomyia e Psychodopygus (RATH et al. 2003).
O hospedeiro invertebrado se infecta com as formas amastigotas durante o
repasto sanguíneo de um indivíduo ou animal parasitado, passado um período de 12
à 20 horas, estas formas se diferenciam em promastigotas (SACKS e PERKINS,
1984; DESCOTEAUX e TURCO, 1999). Passam por mudanças morfológicas,
fisiológicas e bioquímicas sofrendo diferenciação em promastigotas metacíclicas
infectantes no final do ciclo (SACKS, 1992; Figura 1).
Durante novo repasto sanguíneo, a fêmea regurgita as formas promastigotas
metacíclicas, devido à grande quantidade presente em seu trato digestivo (ANTOINE
et al. 1998). Primeiramente, ao alcançarem a corrente circulatória dos mamíferos,
essas formas serão fagocitadas por neutrófilos, algumas horas depois por
macrófagos, quando serão internalizadas no fagossoma e sofrendo fusão com os
lisossomos originando o vacúolo fagolissosomal, permanecem neste ambiente hostil,
contendo enzimas lisossomais e metabólitos reativos do oxigênio, mecanismos de
sinalização celular, produção de óxido nítrico e citocinas (CUNNINGHAM, 2002;
Figura 1).
20
Entretanto, a Leishmania é capaz de sobreviver neste ambiente, inibindo
diversos mecanismos de defesa celular que causariam sua lise e consegue se
multiplicar através de divisão binária simples, de tal modo a romper a célula
hospedeira, liberando as formas amastigotas que serão fagocitadas por outros
macrófagos (PETERS, 2008).
Os parasitas invadem os macrófagos por receptores mediadores de
endocitose, via receptores de complemento, que são clivados por proteases do
parasita; eles se multiplicam nos fagossomos ricos em aminoácidos, em baixo pH,
tendo seu metabolismo adaptado a este microambiente (STUART et al. 2008).
Durante um novo repasto sanguíneo do vetor, estas formas amastigotas são
inoculadas e irão se transformar em promastigotas procíclicos que se multiplica por
divisão binária no trato digestivo, encontradas nas regiões do proventrículo e
esôfago, onde sofrerão a metaciclogênese, que é a transformação da forma
promastigotas procíclicos não infectivo em promastigotas metacíclicos altamente
infectivo, reiniciando o ciclo (SACKS e KAMHAWI, 2001; Figura 1).
Figura 1- Ciclo de vida de Leishmania ssp.
Fonte: Centers for Disease Control and Prevention (2015, tradução MORAIS, 2015).
21
As leishmanioses se dividem em dois grupos: leismanioses
dermotrópica/mucotrópica (tegumentares) e as viscerotrópicas (viscerais; DAVID e
CRAFT, 2009). Nas Américas são reconhecidas onze espécies de Leishmania
causadoras de leishmaniose dermotrópica em humanos e oito espécies descritas
somente em animais. Entretanto, no Brasil já foram identificadas sete espécies,
sendo seis do subgênero Viannia e uma do subgênero Leishmania. As três
principais espécies são: L. (V.) braziliensis, L.(V.) guyanensise L.(L.) amazonensis e,
mais recentemente, as espécies L. (V.) lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) lindenberg e L.
(V.) shawi foram identificadas em estados das regiões Norte e Nordeste (BRASIL,
2010).
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma afecção dermatológica de
importância significativa, devido ao risco em causar deformidades que são capazes
de comprometer a vida psicossocial e econômica do indivíduo afetado,
apresentando grande distribuição de registros de casos em todas as regiões
brasileiras e considerada uma doença ocupacional (BRASIL, 2010).
A LTA caracteriza-se pelo parasitismo das células do sistema fagocítico
mononuclear (monócitos, histiócitos e macrófagos) da derme e das mucosas do
hospedeiro vertebrado, sendo a forma mais disseminada da doença (GRIMALDI
JUNIOR, 1982).
Oficialmente existem registrados mais de 200.000 casos por ano no mundo de
leishmaniose tegumentar, deste total, 70-75% dos casos ocorrem em dez países:
Afeganistão, Algéria, Colômbia, Brasil, Iran, Síria, Etiópia, Sudão, Costa Rica e Peru
(Figura 2). A OMS estima que ocorra uma incidência anual de 0,7 a 1,2 milhões de
casos (ALVAR et al. 2012; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2016). No Brasil,
no período de 1989 a 2012, foram confirmados 25.647 casos de LTA, sendo 11.036
(43,03%) casos notificados na região Norte, onde o Estado do Pará representou o
segundo maior índice de casos confirmados 4.335 (16,90%;
DATASUS/SINAN/SVS/MS, 2014).
22
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença crônica, representando a forma
mais grave das leishmanioses. Potencialmente fatal para o homem, podendo ser
letal quando não ocorre tratamento adequado (GONTIJO e MELO, 2004). Estima-se
que a incidência de LV seja de 500.000 novos casos e mais de 51.000 mortes
ocorram no mundo anualmente. É uma das doenças mais negligenciadas do mundo,
afetando as pessoas mais pobres dos países em desenvolvimento (TDR/WHO,
2011). Tem alta prevalência no subcontinente indiano e no leste da África. Estima-se
que 500.000 novos casos de LV ocorrem anualmente no mundo e mais de 90% dos
novos casos ocorrem em seis países: Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Sudão do
Sul e Sudão (WHO, 2012).
No Brasil, considerando o período de 1995 a 2012, houve um registro de 3.392
casos de LV (DATASUS/SINAN/SVS/MS, 2014). A letalidade vem aumentando
gradativamente, passando de 3,1% em 2000 para 7,1% em 2012. Os registros
apontam incidência em 22 Estados brasileiros, alcançando as cinco regiões. A
Figura 2- Incidência mundial de casos de leishmaniose tegumentar em 2012. Fonte: OMS (2013, tradução MORAIS, 2015).
23
região Nordeste concentrava 90% dos casos no final da década de 1990, nos
últimos anos a doença vem se expandindo para as regiões Centro-Oeste, Norte e
Sudeste. Os dados epidemiológicos dos últimos anos indicam também a
periurbanização e a urbanização dessa doença (BRASIL, 2011).
A LV é causada por espécies do gênero Leishmania, pertencentes ao
complexo Leishmania (Leishmania) donovani. No Brasil, o agente etiológico é a L.
chagasi, espécie semelhante à L. infantum encontrada em alguns países do
Mediterrâneo e da Ásia (GONTIJO e MELO, 2004). As raposas (Lycalopex vetulus e
Cerdocyon thous) e marsupiais (Didelphis albiventris), são considerados
reservatórios silvestres. No ambiente urbano, o cão é a principal fonte de infecção
para o vetor, podendo desenvolver os sintomas da doença, que são:
emagrecimento, queda de pêlos, crescimento e deformação das unhas, paralisia de
membros posteriores, desnutrição, entre outros (BRASIL, 2011).
As manifestações clínicas da forma visceral variam de formas assintomáticas
até o quadro clássico da doença que é caracterizado pela presença de
hepatomegalia, esplenomegalia, linfodenopatia, anorexia, perda de peso, febre,
trombocitopenia e hipergamaglobulinemia. É uma doença de caráter debilitante e
muitas vezes apresentando evolução fatal (MURRAY et al. 2005).
Em 1920, Bramachari desenvolveu o primeiro composto à base de antimônio
pentavalente, o uréia estibamina, derivado uréico do ácido p-aminofenil estibínico.
No ano de 1936, Schmidt, introduziu na terapia médica o estibogluconato de sódio
(1), conhecido comercialmente como Pentostan®, distribuído nos países de língua
inglesa (Figura 3). No Brasil, o medicamento de primeira escolha a base de
antimônio para o tratamento das leishmanioses é o antimoniato de metilglucamina
(2), comercializado como Glucantime® (Figura 3; RATH et al. 2003).
A eficácia terapêutica e o alvo biológico dos antimoniais ainda não estão bem
esclarecidos, pouco se compreende sobre o mecanismo de ação desta droga,
sugerindo que o antimônio pentavalente possa ser uma pró-droga (DEMICHELI e
FRÉZARD, 2005). Estudos sugerem que a atividade farmacológica dos antimoniais
trivalentes seja mais potente que os pentavalentes e que ocorra uma conversão
metabólica intramacrofágica da forma pentavalente a antimônio trivalente. As formas
pentavalentes (ou a forma trivalente) parecem interferir na produção de energia em
24
amastigotas de Leishmania, inibindo o processo de beta-oxidação de ácidos graxos
e glicólise do parasita, conduzindo a uma depleção dos níveis de ATP (RATH et al.
2003).
Figura 3- Estrutura química de antimoniais pentavalentes utilizados no tratamento das leishmanioses
O tratamento com antimoniais pentavalentes apresenta as seguintes
desvantagens: sua administração ser exclusivamente por via parenteral
(intramuscular ou endovenosa); elevado potencial tóxico, sendo observados efeitos
hepatóxico, cardiotóxico e nefrotóxico; elevada incidência de reações adversas
medicamentosas, sendo as dores musculares relatadas como mais frequentes.
Essas desvantagens representa risco ao tratamento, ocasionando redução,
interrupção ou abandono da quimioterapia pelo paciente antes de seu término,
levando a necessidade de tratamentos alternativos (DEMICHELI e FRÉZARD,
2005).
Os fármacos de segunda escolha para o tratamento das leishmanioses são: as
pentamidinas (3; sulfato e mesilato), o desoxicolato sódico de anfotericina B e suas
formulações. A pentamidina provavelmente atua interferindo na síntese do DNA,
alterando a morfologia do cinetoplasto e fragmentando a membrana mitocondrial,
apresenta elevado índice de toxicidade relacionada à dose acumulada (Figura 4;
RATH et al. 2003). Recomenda-se que eles sejam administrados em hospitais de
referência (CAMPOS, 2008; BRASIL, 2011).
Estibogluconato de sódio (1) Metilglucamina (2)
25
A anfotericina B (4; Figura 5) é um antibiótico poliênico com atividades
antifúngica e leishmanicida, tanto a Leishmania como os fungos, apresentam como
principal constituinte de suas membranas plasmáticas o ergosterol. O mecanismo de
ação deste antibiótico baseia-se na sua ligação ao ergosterol com posterior
alteração na permeabilidade de membrana e do equilíbrio osmótico do parasita,
ocasionando morte celular (SOARES BEZERRA et al. 2004).
São vários os efeitos colaterais da anfotericina B, incluindo febre com calafrios,
tromboflebite e ocasionalmente, toxicidades graves como miocardite, hipocalemia
severa, disfunção renal e até mesmo morte, a sua utilização requer monitoramento
hospitalar prolongado (MONZOTE, 2009)
A quimioterapia das leishmanioses possui muitas limitações, tanto pela
toxicidade dos antimoniais, quanto à baixa eficácia dos outros fármacos disponíveis
(MELO, 2009) e elevado custo dos medicamentos (CHULAY et al. 1988). Outro fato
relevante é que não existe nenhum produto realmente novo no mercado nos últimos
20 anos para tratar a doença (MELO, 2009). Este cenário mostra que estudos
Figura 4- Estrutura química do isotionato de pentamidina (3)
Figura 5- Estrutura química da anfotericina B (4)
26
devem ser efetivados de maneira a ampliar os ensaios clínicos com novos fármacos
por via oral (fluconazol e miltefosine). Além de fármacos de uso tópico para LTA
(paramomicina e imiquimod) e de produtos ativos em ambas as formas da doença
(BASANO e CAMARGO, 2004).
Outra estratégia é buscar novos fármacos ativos, podendo ser adotadas as
seguintes estratégias: avaliação atividade antileishmania de fármacos já existentes,
síntese de novas entidades químicas e avaliação da atividade, estudos in silico de
novas entidades e avaliação da atividade de espécies com alegação de uso popular.
Esta última estratégia, para leishmania, tem sido pouco explorada e pode dar valiosa
contribuição, pois estudos preliminares tem mostrado o efeito promissor destas. Uma
espécie que se mostrou favorável em estudos preliminares é a Virola surinamensis
(Myristicaceae).
2.1 Virola surinamensis
A Virola surinamenis pertence à família Myristicaceae. Esta família é
constituída por dezoito gêneros e cerca de quinhentas espécies, sendo sua
distribuição pantropical. No Brasil, a família é representada pelos gêneros:
Compsoneura, Iryanthera, Osteopholeum, Otoba (Sin.Dialyanthera) e Virola (SOUZA
e LORENZI, 2005).
Espécies do gênero Virola (Figura 6) são encontradas nos Estados da
Amazônia Legal Brasileira (SOUZA e LORENZI, 2005; CESARINO, 2006) e Ceará
(CESARINO, 2006), representando a maior distribuição geográfica (RODRIGUES,
1980). A Virola é encontrada na Costa Rica, Panamá, Antilhas Menores, Trinidad e
Tobago, Guiana Francesa, Suriname, Guiana, Venezuela, Colômbia, Equador, Peru
e Bolívia (CESARINO, 2006). O habitat dessa espécie são as várzeas e os igapós,
locais pantanosos e matas de terra firme (LEITE e LLERAS, 1993).
27
Esta família pertence à classe das angiospermas e suas árvores quando
adultas podem alcançar 35m de altura e diâmetro de 100 cm. Apresentam tronco
monopodial ortotrópico, com galhos monopodiais plagiotrópicos, compondo uma
copa reduzida e pouco ramificada; a casca lisa e fina apresenta pequenas fissuras
verticais e coloração castanho-amarelada, apresentando partes acinzentadas e
esbranquiçadas. As folhas são simples alternas e dísticas; as inflorescências são
panículas axilares ou subaxilares. As flores masculinas têm 2-20 estames unidos e
as femininas têm um único ovário com um óvulo (semente potencial). O arilo rodeia
a semente de pregas, que tem muito endosperma (tecido nutritivo em amido para o
desenvolvimento do embrião; CESARINO, 2006).
RODRIGUES (1980) propôs a segue a seguinte classificação taxonômica:
Reino: Vegetal
Divisão: Spermatophyta
Classe: Dicotyledoneae
Ordem: Laurales
Família: Myristicaceae
Gênero: Virola
Espécie: V. surinamensis (Rol.) Warb.
Na Amazônia a espécie mais utilizada na medicina popular para tratar
reumatismo, doenças de pele, asma, erisipela, câncer, gastrites e úlceras (PAIXÃO e
HIRUMA-LIMA, 2000) é a V. surinamensis, conhecida como ucuúba, que significa
árvore produtora de gordura (SOUZA e LORENZI, 2005). A Virola sebifera também é
Figura 6- Virola surinamensis em floração, frutos e sementes. Fonte: Fereira, 2013
28
muito utilizada popularmente como antiulceroso e para tratar reumatismo
(MARTÍNEZ et al. 1999).
As cascas de Virola são utilizadas por índios no preparo de “rapé” alucinógeno
e como veneno nas flechas (SCHULTES, 1973). A presença de alcaloides indólicos
triptamínicos confere o efeito alucinógeno dessas preparações (AGURREL et al.
1969). A madeira é bastante utilizada em construção de interiores, carpintaria,
marcenaria, na fabricação de caixas, palitos de fósforo, laminados, compensados,
celulose e papel. O óleo extraído das sementes (sebo de ucuúba), rico em
trimiristina e de odor agradável, pode ser usado na fabricação de velas, sabões,
cosméticos e perfumes. A árvore fornece grande quantidade de frutos para aves e
outros animais silvestres, sendo útil na recomposição de áreas degradadas e de
preservação (CESARINO, 2006).
Principalmente das folhas, cascas e sementes de espécies de Virola, foram
isolados e identificados diversos grupos de substâncias como ácidos graxos,
alcalóides, lignóides, policetídeos, flavonóides, taninos e terpenos (COROTHIE e
NAKANO, 1969; LOPES et al. 1983; BLUMENTHAL et al. 1997; MARTINEZ et al.
1999; BARATA et al. 2000; REZENDE e KATO, 2002).
Em estudos fitoquímicos, identificou-se das cascas da V. sebifera alguns
alcalóides como a N,N-dimetiltriptamina e derivados, além de β-carbolinas
(COROTHIE e NAKANO, 1969; KAWANISHI e HASHIMOTO, 1987).
Lopes et al. (1999) relataram que do fracionamento cromatográfico do extrato
diclorometano de raízes de V. surinamensis foram identificados hidrocarbonetos de
cadeia longa, esteróides e arilpropanóides. Da analise do óleo foram isolados
monoterpenos e sesquiterpenos
Estudos fitoquímicos dos frutos de V. Surinamensis permitiram isolar as
seguintes lignanas: diidrocubebina (5), sesamina (6), asarinina (7), galbulina (8) e
galgravina (9) (BLUMENTHAL et al. 1997); das folhas, foram isoladas as
neolignanas do tipo 8.O.4’ virolina (10) e surinamensina (11) (BARATA et al.1976) e
do tipo tetraidrofurânica veranguensina (12) e grandisina (13), conforme figura 7
(LOPES et al. 1998).
29
.
Sesamina (6) Ar = α-Pi Asarinina (7) Ar = β-Pi Pi = 3,4-metilenodioxifenil
Galbulina (8) Ve = 3,4-dimetoxifenil
Galgravina (9) R1 = R2 = β-CH3 Ar1 = Ar2 = α-3,4-dimetoxifenil
Virolina (10) R = H Surinamensina (11) R = OMe
Veraguensina (12)
Grandisina (13)
Diidrocubebina (5)
Figura 7- Estruturas químicas de lignanas e neolignas isoladas de V. surinamensis.
30
O estudo da avaliação da atividade antifúngica e antimicrobiana demonstrou
que os extratos hexânico, acetato de etila e metanólico de folhas de V. Surinamensis
não foram ativos para S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e C. albicans em ensaios de
difusão em Ágar e ensaios de microdiluição (SARAIVA, 2012).
A atividade antifúngica de diversas espécies do gênero Virola, incluindo V.
surinamensis, foi atribuída à presença de lignóides na composição de diferentes
partes da planta (RODRIGUEZ et al. 1996; PAGNOCCA et al. 1996; LEMUS e
CASTRO, 1989). Neolignanas sintéticas do tipo 8.O.4’ também apresentaram
atividades antifúngicas (ZACCHINO et al. 1997).
Os extratos hexânico e acetato de etila obtidos das folhas de Virola
surinamensis foram testados contra as formas promastigotas de L. chagasi e
L.amazonensis, na fase logarítimica de crescimento, utilizando no ensaio o MTT.
Entretanto, apenas o extrato hexânico apresentou atividade antipromastigota em L.
chagasi (CIM = 100 μg/mL; CI50 = 86,40 μg/mL) e em L. amazonensis (CIM = 50
μg/mL; CI50 = 79,7 μg/mL). Dados de RMN de 1H e 13C do extrato acetato de etila
sugeriram a presença de neolignanas (SARAIVA, 2012; VEIGA, 2013).
Nas concentrações utilizadas, esses extratos não mostraram atividade
citotóxica frente a macrófagos peritoneais de camundongo BALB/c, apresentando
CC50 > 500 μg/mL, assim como o controle positivo (Anfotericina B) não foi citotóxico
(CC50 > 100 μg/mL). Em todas as concentrações, não ocasionaram reduções no
número de amastigotas presentes nas células infectadas quando comparada com o
controle sem droga. (SARAIVA, 2012; VEIGA, 2013).
A surinamensina isolada das folhas de V. surinanensis apresentou atividade in
vitro contra promastigotas de espécies de Leishmania donovani (concentração
inibitória é 50% de 50 µM); enquanto que para amastigota a taxa de redução da
infecção foi de 100 µM. Além disso, foi avaliada a citotoxicidade contra macrófagos
peritoneais, sendo observado que esta substância não apresentava toxicidade
(BARATA, et al. 2000).
Do estudo da atividade antiproliferativa dos extratos e da fração orgânica,
obtidos das folhas de Virola sebifera, o extrato diclorometano apresentou
seletividade principalmente para a linhagem de pulmão (NCI-460) - CI50 de 46
31
µg/mL. A atividade observada, provavelmente, pode ser atribuída a alcaloides que
foram detectados em cromatografia de camada delgada, utilizando como revelador o
reagente de Dragendorff (DENNY et al. 2007).
Do óleo de V. surinanensis foram isolados vários sequisterpenos, como o
nerolidol, que inibiu em 100% espécies de P. falciparum na concentração de 100
µg/mL (LOPES et al., 1999). Segundo ZHANG at al. (2001) as neolignanas
tetraidrofurânicas grandisina e epigrandisina, bem como a neolignana do tipo 8.O.4’
polisiforina, apresentaram atividades antiplasmódicas frente ao Plasmodium
falciparum, onde a polisiforina foi a mais ativa, apresentando potente atividade com
CI50 = 400 ng/mL.
A atividade do nerolidol foi avaliada contra espécies de Leishmania, sendo
observado efeito inibitório do crescimento de promastigota de L. amazonensis (CI50
de 85 µM), L. braziliensis (CI50 de 74 µM) e L. chagasi (CI50 de 76 µM). O tratamento
de macrófagos infectados por L. amazonensis com nerolidol 100 µM resultou em
95% de redução nas taxas de infecção (ARRUDA, 2005).
As neolignanas do tipo 8.O.4’ virolina e surinamensina, isoladas das folhas de
V. surinamensis, foram ativas contra a penetração de cercárias do Schistossoma
mansoni (BARATA et al. 1978). Também foram atribuídas as neolignanas
veraguensina e grandisina, isoladas de V. surinamensis, ação anti-chagásica
(LOPES et al. 1998). Diante dos relatos encontrados na literatura para a espécie de
V. surinamensis, que ocorre nativa na Região Norte, onde as substancias isoladas
demonstraram inúmeras atividades biológica, indicam o potencial ativo dessa
espécie.
32
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a atividade antipromastigota de Leishmania amazonensis de subfrações
ricas em neolignanas obtidas do extrato hexânico de folhas de Virola
surinamensis.
3.2 Objetivos específicos
Obter subfrações enriquecidas de neolignanas do extrato hexânico de V.
surinamensis;
Caracterizar as subfrações por meio de RMN 1H e 13C;
Avaliar a atividade antipromastigota de L. amazonensis dessas subfrações;
Determinar a citotoxicidade dessas subfrações.
33
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 EQUIPAMENTOS
Autoclave Phoenix;
Balança analítica - Bioprecisa, modelo FA2104 N Eletronic Balance;
Banho de Ultrassom - Maxiclean, modelo 800A;
Banho Maria - SOLAB Científica, modelo SL 150;
Cabine de fluxo laminar vertical Pachane, modelo PA 310;
Câmara de análise de fluorescência por luz ultravioleta: Cabine e luz
SPECTROLINE, modelos CM-10/ ENF-260C, para visualização de CCDC
(cromatografia em camada delgada comparativa);
Câmara de CO2- Insight Pesquisa e Ensino;
Câmara de contagem Neubauer espelhada – Improved;
Capela de exaustão Quimis;
Cartuchos Strata C 18, 50 mg/mL (analítico) e cartucho Giga Tubes C18
5g/5mL (preparativo). Todos da marca Phenomenex;
Centrífuga refrigerada Cientec, modelo CT-600R;
Coluna para Cromatográfica Liquida de Alta Eficiência usadas: Microsorb C18
analítica (250 x 4,60mm, 5 µ) e Dynamax semipreparativa (250 x 10mm, 5 µ),
ambas da VARIAN;
Contador manual de células DIGETIMER;
Cromatografo liquido de alta eficiência Varian Polares, composto por duas
bombas modelo Prostar 210-218, detector com duplo canal de absorbância na
região do ultravioleta e do visível, operando com o comprimento de onda de
215-220 nm, modelo Prostar 335, injetor de amostras Rheodyne 7725i, com
alça de amostragem de 20µL para analítico e 100 µL para semi- preparativo,
interfase de comunicação Varian, modelo RS- 485/422 LCs acoplado a
microcomputador Inter Core 2 Duo, 2 GB de memória RAM com software de
integração Galaxie SW;
Dessecador de vidro;
34
Destilador de água;
Espectrômetro de ressonância magnética nuclear utilizado na obtenção dos
espectros foi o modelo Mercury 300 (VARIAN). Encontrado Laboratório de
RMN, Faculdade de química, Instituto de Ciências Exatas e Naturais (UFPA),
na obtenção dos espectros;
Estufa BOD (Demanda bioquímica de oxigênio) - Byosistens Com. Importadora
e Exportadora de Equipamentos para Laboratório LTDA, modelo HF212UV;
Estufa- Medicate Produtos Médicos, modelo MD 1.2;
Evaporadores rotativos a vácuo: BÜCHI, modelo 461 e QUIMIS, modelo Q-344-
2, utilizados na concentração dos extratos;
Geladeira;
Incubadora de CO2- Ultrasafe, modelo HF212 UV;
Leitora de microplacas Biotek, modelo ELX;
Micropipetas Paguepet, volume ajustável de 10-100µL e de 100-1000µL;
Microscópio invertido Zeizz, modelo Axiovert 25;
Microscópio óptico Eclipse, modelo E200 NIKON;
Polarímetro Perkin Elmer, modelo 341;
Seringas Hamilton com capacidade de 50 e 500 µL;
Sistema de filtração a vácuo 250 mL, membrana 0,22 μm- TPP- Switzerland;
Sistema de filtração de água Millipores, Milli-Q Plus;
Sistema de purificação de água Millipore, Milli-Q Plus.
4.1.2 MATERIAL DE CONSUMO
4.1.2.1 Solventes e Reagentes
Dimetil-sulfóxido (DMSO) Sigma-Aldrich;
Os solventes deuterados usados para espectrometria de RMN foram da marca
(TEDIA BRASIL);
Os solventes utilizados para extração e nos diversos procedimentos
cromatográficos foram solventes graus P.A. hexano, acetato de etila, metanol,
35
diclorometano (SYNTH, NUCLEAR, VETEC). Além da utilização de solventes
retificados no LPN (Laboratório de Produtos Naturais) da UFPA;
Para purificação das amostras foram utilizados: Metanol, Acetonitrila, grau
HPLC (TEDIA BRASIL);
4.1.2.2 Meio de Cultura e Outros
Álcool grau 96° GL (Álcool Etílico hidratado) Santa Cruz LTDA;
Anfotericina B 50mg solução injetável, Cristália Produtos Farmacêuticos;
Bicarbonato de sódio, Sigma-Aldrich;
Cloreto de sódio, Sigma Aldrich;
Corante Azul de Tripan em solução (0,4%/100 mL) testado para cultura de
célula- Sigma-Aldrich;
Corante Giemsa – Dinâmica química contemporânea Ltda;
Éster de forbol (12-miristato 13-acetato de forbol) Sigma-Aldrich;
Gentamicin (sulfato de gentamicina) 80mg/2mL solução injetável, Nova Farma
Indústria Farmacêutica LTDA;
Infusão de Agar base para Agar sangue- Becton Dickinson Ltda;
Meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) com glutamina e 25 MM
HEPES isento de bicarbonato de sódio, Sigma-Aldrich;
MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)a-2,5-difeniltetrazólio] 500mg, Sigma-
Aldrich;
Nos fracionamentos cromatográficos em coluna foi utilizada sílica gel 60 70-
230 mesh;
Nos procedimentos cromatográficos em camada delgada comparativa foi
empregada sílica gel 60 para CCD do tipo HF254, (MERCK);
Penicilina G, Sigma-Aldrich;
Propilenoglicol - Vital especialidades;
Solução de Ce(SO4)2 1% para revelar as substâncias exibindo coloração.
Soro bovino fetal, Gibco;
36
4.1.2.3 Vidrarias e outros materiais
Coluna cromatográfica
Garrafas para cultura de células 25cm2, SPL Life Sciences.
Garrafas para cultura de células 75cm2, TPP, Switzerland.
Lamínula 13 mm circular G13C – Glasscyto;
Placas de cultura de células de 24 poços- TPP;
Placas de cultura de células de 96 poços, fundo chato com tampa, TPP;
Ponteira 100-1000µL, azul, tipo universal, Kartell S.P.A;
Ponteira 200µL amarela, tipo universal, Labware Manufacturing CO.
Suporte de ferro.
Tubo cônico graduado 15mL não estéril (Tipo Falcon).
Tubo cônico graduado 50mL estéril (Tipo Falcon), Becton-Dicknson.
Tubos de microcentrífuga (Tubos eppendorf) de 1,5mL, Kartell SPA.
Vidrarias diversas (becker, erlenmeyer, pipetas graduadas, volumétricas e
pasteur, buretas, provetas, balões, funis, bastões de vidro). Além de espátulas
de alumínio, garras de fixação, aros e vidrinhos de penicilina.
4.1.3 PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO
4.1.3.1 Preparo do meio de cultivo Novy-Nicolle-Mcneal (NNN)
Para o preparo deste meio foram dissolvidos 14 g de Agar base e 6 g de cloreto
de sódio em 900 mL de água destilada. Em seguida, a mistura foi submetida a
aquecimento até a sua total dissolução, sendo autoclavada à temperatura de 121º C
por 15 minutos e resfriada a 50º C em banho Maria. Foi retirado o coágulo de 45 mL
de sangue de coelho desfibrinado e em seguida adicionado à mistura estéril. O meio
foi homogeneizado e distribuído em tubos (5 mL/tubo), sendo estes inclinados até
solidificação. Em seguida, levados a geladeira para que haja exsudação máxima
dentro do tubo. Na parte líquida (difásica) se encontram as substâncias nutritivas
37
necessárias ao bom funcionamento do meio. O preparo deste meio segue o protocolo
experimental do Instituto Evandro Chagas (TAYLOR e BAKER, 1968; AHMED, 2014).
4.1.3.2 Preparo do meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) incompleto e
completo para cultivo de Leishmanias
O conteúdo de 10,4 g de meio RPMI 1640 (com L-glutamina e sem bicarbonato
de sódio) em pó foi dissolvido em 200 mL água ultrapura (Milli-Q®) sob agitação
constante, adicionado 2 g de bicarbonato de sódio e o volume completado para
1000 mL. O pH do meio foi verificado e ajustado sempre quando não se encontrava
em pH neutro (pH= 7,2). O meio foi esterilizado em membrana de 0,22 µm e
acondicionado em frascos estéreis a 4ºC. Para a confecção de 40 mL do meio RPMI
completo foram adicionados 4 mL de soro fetal bovino desnaturado (56ºC/30min),
0,4 mL de uma solução de penicilina 5.000.000 UI e 10 mg/mL de gentamicina,
previamente preparada, acondicionado sob refrigeração. O preparo deste meio seguiu
o protocolo experimental do Instituto Evandro Chagas (SCHUSTER e SULLIVAN,
2002).
4.1.3.3 Preparo do meio RPMI 1640 para cultivo de células THP-1
A solução foi preparada em frasco de Erlenmeyer solubilizando 1 mM piruvato
de sódio,1500 mg/L bicarbonato de sódio, 4500 mg/L glicose, 10 mM HEPES e 10,4 g
de RPMI (sem bicarbonato de sódio e com L-glutamina) em 400 mL de água
ultrapura sob agitação. Após completa solubilização foi ajustado o volume para
1000 mL e esterilizado por filtração sob pressão com membrana de acetato de
celulose com poro de 0,22 μm em condições estéreis. O meio foi suplementado com
10% de soro fetal bovino desnaturado (56ºC/30min), 100000 U/L de penicilina,
50 mg/L de gentamicina e o pH ajustado a 7,4 com solução estéril de bicarbonato de
sódio a 0,1 mol/L, armazenado sob refrigeração , conforme protocolo Banco de
Células do Rio de Janeiro (TSUCHIYA et al.1982).
38
4.1.4 MATERIAL BIOLÓGICO
4.1.4.1 Espécie de Leishmania
Neste estudo foi utilizada a cepa MHOM/BR/2009/M26361 de L. (L.)
amazonensis, isolada de caso humano, procedente do município de Ulianópolis,
Estado do Pará, proveniente do crio banco do Instituto Evandro Chagas.
4.1.4.2 Linhagem celular e cultivo
A linhagem celular de leucemia monocítica aguda humana (THP-1) utilizada nos
experimentos biológicos in vitro, foi adquirida do banco de células do Rio de Janeiro
(BCRJ) em 26/05/2015 (Lote 000722). Cultivada em meio RPMI 1640, suplementado
com soro fetal bovino (10%) e mantida a 37ºC sob atmosfera de 5% de CO2.
4.1.5 COLETA E IDENTIFICAÇÃO DO MATERIAL BOTÂNICO
As folhas de Virola surinamensis foram coletadas na reserva da EMBRAPA, no
município de Belém, Estado do Pará, identificadas por botânicos desta instituição,
onde gerou uma exsicata de nº 180980 que se encontra catalogada no Herbário da
Embrapa Amazônia Oriental.
39
4.2 Métodos
4.2.1 ESTUDOS FITOQUÍMICOS
4.2.1.1 Obtenção dos extratos brutos
As folhas foram secas em estufa a uma temperatura de 40ºC por um período de
dois dias. Depois de secas, as folhas foram trituradas e moídas em moinho de facas
resultando em 6,2 kg de material.
O material botânico foi extraído à temperatura ambiente por percolação
seqüencial com hexano (8L), acetato de etila (6L) e metanol (5L) durante sete dias
para cada solvente. As soluções obtidas foram concentradas a vácuo. Os extratos
foram pesados e conservados sob refrigeração. A obtenção dos extratos brutos foi a
partir de 4 kg de material triturado e seco.
4.2.1.2 Fracionamento do extrato hexânico
O extrato bruto hexânico (15 g) foi fracionado por cromatografia de coluna (CC),
utilizando sílica gel MERK (70-230 mm) como fase estacionária e como fase móvel
sistemas de misturas de solventes de hexano (hex), acetato de etila (AcOEt) e
metanol (MeOH) em gradientes de polaridades crescentes, onde foram coletadas 17
alíquotas de 500mL cada, concentradas em evaporador rotativo e submetidas a
análises por meio de cromatografia em camada delgada (CCD). Como revelador
utilizou-se solução de Ce(SO4)2 1%. As alíquotas que apresentaram perfis
cromatográficos semelhantes foram reunidas, dando origem a 11 frações.
As frações 4 e 5 (hex/AcOEt 10-15%), por apresentar o melhor perfil
cromatográfico em CCD, foram reunidas de acordo com seus fatores de retenção
(Rf´s), apresentando massa de 1,318g e submetida a novo fracionamento em CC
dando origem a 84 alíquotas de 10mL. As subfrações 16, 17 e 18 foram reunidas e
renomeadas de C3, assim como as subfrações 19, 20, 21, 22 e 23 foram renomeadas
de C4 e por indicarem baixo índice de mistura, foram selecionadas para realizarem
ensaios biológicos para atividade antipromastigota e citotoxicidade.
40
A fração 16 e 17 (MeOH 100%), com massa de 370mg, foi submetida a
fracionamento em CC originando 68 frações de 10mL. A subfração 41 (renomeada de
C5), ao secar formou 29 mg de um óleo amarelado, a analise por CCD indicou pouca
mistura e foi submetida a cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) objetivando a
purificação da substância, a analise dados de RMN 1H desta subfração sugere a
presença das neolignanas virolina (10) e surinamensina (11) .
A Figura 8 mostra o fracionamento do extrato para a purificação e isolamento
das substancias.
EXTRATO HEXÂNICO
15G
17 FRAÇÕES
11 FRAÇÔES
REUNIÂO DAS
FRAÇÕES 4-5
1,318g
REUNIÃO DAS
FRAÇÃO 16-17 3,7g
84 SUBFRAÇÕES
68 SUBFRAÇÕES
REUNIÃO DAS
SUBFRAÇÕES
REUNIÃO DAS SUBFRAÇÕES
19, 20, 21,22, 23
SUBFRAÇÃO 41
C3 C4
C5
CC
CCD
CC
CCD
CLAE RMN
CC
CCD
Figura 8- Fluxograma do fracionamento do extrato hexânico para obtenção das substâncias.
41
A amostra C5 foi submetida ao pré-tratamento de Extração em Fase Sólida
(SPE) a fim de reter impurezas e interferentes deixando passar apenas os
componentes de interesse. A solução obtida foi analisada por CLAE, para assim
buscar o melhor sistema para o isolamento.
Os cartuchos foram condicionados com 1mL de acetonitrila e depois 1mL de
água. À alíquota C5 foi adicionado 0,8mL de acetonitrila e 0,2mL de H2O, essa
solução foi levada ao ultrassom por 1 minuto e depois aplicada ao cartucho
recolhendo a solução de interesse. Uma alíquota de 20μL foi retirada dessa solução e
injetada no cromatógrafo líquido em gradiente exploratório, com objetivo de verificar
se seria possível realizar a eluição no modo isocrático, assim como obter o perfil
cromatográfico com fase móvel composta por solvente A = H2O e solvente B = ACN,
variando-se de 5 a 100% do modificador orgânico, em 60 min de análise. A vazão da
fase móvel foi de 1mL/min e o detector de absorbância na região do ultravioleta
operou com os comprimentos de onda de 190 e 600nm.
Baseado na relação (Trz-Tra)/Tg, que deve apresentar valor inferior a 0,4
(SNYDER et al.1997), foi realizado o cálculo e o resultado obtido para a relação foi
inferior a este valor, demonstrando que a separação podia ser realizada no modo
isocrático. Ainda conforme Snyder et al. (1997) que propõe os valores desejáveis para
o fator de retenção k (k=5, k=10, k=20), com base nos tempos de retenção da última
banda, estimou-se um valor de percentual do modificador orgânico para uma
separação com k =20. Assim, foi sugerido um sistema isocrático e de acordo com a
Tabela 1, composto por H2O/ACN: 38:62.
Nesta proposta buscou-se o ajuste da seletividade desejada para os analitos,
mantendo o fator de retenção (k) constante, as alterações na seletividade levaram em
consideração a interação do soluto com o solvente. Percebeu que o fator de
separação (α) entre os picos de interesse não estava satisfatório. Logo, com a
finalidade de otimizar a separação utilizou-se o nomógrafo de fase reversa para
chegar a uma fase móvel H2O/MeOH 62:38 que possibilitou a separação da mistura.
42
Tabela 1- Estimativa da % do solvente B (ACN) para eluição isocrática, baseada no
tempo de retenção da última banda Tz e do gradiente inicial.
Condições: coluna 150 x 4,60 mm; gradiente 5-100% de ACN em 60 mim; vazão 2 mL/min Fonte: Adaptado de Snyder (1996).
4.2.2 AVALIAÇÃO BIOLÓGICA
4.2.2.1 Cultivo e manutenção das formas promastigotas
As formas promastigotas da espécie L. (L.) amazonensis foram cultivadas em
meio NNN e posteriormente transferidas para o meio de crescimento RPMI, sendo
mantidas através de passagens semanais. Foram transferidos 100 µL de suspensão
de formas promastigotas do meio NNN para garrafas de cultura de células, cada uma
contendo 5 mL de meio RPMI completo. O cultivo foi observado em microscópio
invertido para verificar a viabilidade das formas em meio RPMI.
Trz (min) K=5
(% de ACN)
K=10
(% de ACN)
K=20
(% de ACN)
5 6 0 -
10 19 12 5
15 29 22 14
20 37 30 22
25 45 38 30
30 53 46 38
35 61 54 46
40 69 62 54
45 77 70 62
50 85 78 70
55 93 86 78
60 100 94 86
65 - 100 94
43
O cultivo do parasita em meio RPMI completo foi feito a 25° ± 1°C. Nas
passagens posteriores partiu-se da suspensão de promastigotas em meio RPMI,
realizando uma diluição 1:1 (suspensão de promastigotas: meio RPMI completo),
mantendo-se o cultivo na mesma condição de temperatura.
A avaliação do desenvolvimento e multiplicação das formas promastigotas de
L.(L.) amazonensis foi realizada através de curvas de crescimento adaptada para
microscópio binocular, consiste na quantificação de formas promastigotas realizada
em câmara hemocinética de Neubauer. Para a realização da contagem, foram
retirados 10 µL da suspensão de promastigotas e a parte da câmara utilizada para
contagem dos parasitas é a mesma utilizada na contagem de leucócitos, com o
auxílio de microscópio óptico em aumento de 40X. As rosetas e emaranhados não
foram incluídos. Os quatro quadrantes foram contados e obtido uma média
(URDAPILLETA, 2006). O número de parasitas foi quantificado em intervalos de 24
horas por dez dias consecutivos, sempre no mesmo horário.
4.2.2.2 Ensaio da atividade antipromastigota
As formas promastigotas de L. (L.) amazonensis obtidas durante a fase
logarítmica de crescimento, foram centrifugadas em meio RPMI completo por 10
minutos a 3500 rpm. O “pellet” foi ressuspendido em meio RPMI completo, as
promastigotas quantificadas em câmara de Neubauer e ajustadas para uma
concentração correspondente a 5 x 106 parasitas/100µL, essa concentração foi
aplicada em placas de cultura de células com fundo chato contendo 96 cavidades. A
Figura 9 demonstra o detalhamento das concentrações utilizadas do extrato, frações
e/ou substância pura (200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 μg/mL), dos controles
negativos (suspensão do parasita + meio de cultura), controle do solvente (MeOH
evaporado + suspensão do parasita + meio) e do controle positivo (Anfotericina B: 25;
12,5; 6,25; 3,125, 1,5625 e 0,7812 μg/mL). Em seguida as placas foram incubadas a
26°C por 24 horas.
44
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Legenda:
Após o período de incubação das promastigotas com as amostras e o fármaco
foram adicionados 10µL de MTT (5mg/mL) em cada poço, a placa foi recoberta com
papel alumínio, ocorrendo nova incubação por 4h em estufa a 26°C para que o MTT
seja metabolizado formando os cristais de formazan.
Após 4h, foi adicionado 10µL de dimetilsulfóxido (DMSO) e realizou uma
agitação manual da placa, por 5 minutos, para solubilizar os cristais de formazan
gerados. Realizando em seguida a leitura da densidade óptica (D.O.) das amostras
em leitor de placas de ELISA sob comprimento de onda de 490nm. A viabilidade das
formas promastigotas foi avaliada com base no metabolismo do MTT, sendo a mesma
proporcional ao valor da absorbância gerada. A porcentagem de células viáveis
(promastigotas) será calculada pela seguinte fórmula, adaptada de Ngure et al.
(2009):
a
A Concentração Inibitória 50% (CI50) é a concentração que causa a redução de
50% das células em crescimento (viáveis) e foi determinada pelo programa
GraphPad prism versão 5.04.
% viabilidade = abs. dos poços com amostra – abs. dos reagentes (branco) x 100
abs. dos poços sem amostra – abs. dos reagentes (branco)
Controle negativo Controle solvente Branco Controle positivo
Extrato, frações e/ou substância pura
25 µg/mL
12,5 µg/mL
6,25 µg/mL
3,125 µg/mL
1,5625 µg/mL
0,78125 µg/mL
0,3906 µg/mL
200 µg/mL
100 µg/mL
50 µg/mL
12,5 µg/mL
3,125 µg/mL
6,25 µg/mL
25 µg/mL
abs: absorbância
Figura 9- Desenho esquemático das placas de 96 poços de fundo chato e da distribuição das substâncias testadas representadas por cores.
45
Para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi realizada leitura
visual e para Cl50 leitura em leitor de placas de ELISA, na interpretação dos resultados
adotaram-se os seguintes critérios demonstrados na Tabela 2:
Tabela 2 - Interpretação dos resultados baseado na faixa do CIM e CI50
CIM/CI50 µg/mL RESULTADOS
Menor ou igual a 100 Ativo
Entre 101- 200 Moderadamente ativo
Acima de 200 Inativo
Fonte: Adaptado de Mota (2015).
4.2.2.3 Células THP-1 diferenciadas (macrófagos)
A diferenciação das células THP-1 de monócitos para macrófagos foi
promovida através da utilização do agente indutor éster de forbol (PMA) conforme
adaptado de Daigneault et al. (2010).
Inicialmente os monócitos foram plaqueados na densidade celular de 2x105
células/poço em placas de 96 poços, já em contato com o agente indutor (PMA), na
concentração de 200 nmol/L diluído em meio RPMI completo. Após dois dias de
exposição ao indutor, o meio foi removido e foram realizadas duas lavagens usando
meio RPMI livre de PMA. As células aderentes foram incubadas a 37ºC em estufa
com atmosfera de 5% de CO2 por mais dois dias, com trocas diárias do meio para
remoção total do agente indutor. Após este período, as células THP-1 diferenciadas
foram expostas aos tratamentos e ao controle.
46
4.2.2.4 Determinação da concentração citotóxica 50% (CC50) em células THP-1
diferenciadas (macrófagos)
O método do MTT (REILLY et al. 1998) é um ensaio colorimétrico que avalia a
viabilidade das células através de sua atividade metabólica. Consiste na redução do
MTT (brometo de 3-metil-[4-5-dimetiltiazol-2-il]- 2,5 difeniltetrazólio), que apresenta
coloração amarela, a cristais de formazan que possuem coloração púrpura. A redução
do MTT é realizada por desidrogenases mitocondriais que só estão ativas em células
viáveis.
A suspensão de macrófagos na concentração de 2 x 105 macrófagos por poço
em um volume final de 100 μL de meio RPMI 1640 completo e distribuída em placas
para cultura de células de 96 poços de fundo chato. As placas foram incubadas a
37ºC em estufa com atmosfera de 5% de CO2 durante duas horas para aderência dos
macrófagos aos poços. Após o período de incubação, foram visualizadas em
microscópio invertido para observação dos macrófagos aderidos e os poços lavados 3
vezes com meio RPMI 1640, previamente aquecido a 37ºC, para remover possíveis
células não aderentes (TEMPONE et al. 2004).
Após as lavagens às placas foram incubadas por 24h na presença das frações
e subfrações nas seguintes concentrações: 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 e
7,8125 μg/mL. O controle positivo consistiu de uma suspensão de macrófago
adicionada de Anfotericina B (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 e 1,562 μg/mL).
Após o período de incubação foi adicionado 10μL de MTT (5mg/mL) em cada
poço, a placa foi protegida da luz e nova incubação ocorreu por 4 h em estufa a 37°C
com atmosfera de 5% de CO2, após esse período, adicionou-se 10μL de
dimetilsulfóxido (DMSO) e submetida à agitação manual por 5 minutos. A leitura da
densidade óptica (D.O.) das amostras foi realizada em leitor de placas de ELISA sob
comprimento de onda de 490nm. A viabilidade das células foi avaliada com base no
metabolismo do MTT, sendo a mesma proporcional ao valor da absorbância gerada.
A porcentagem de células viáveis (macrófagos) foi analisada conforme a fórmula
adaptada de Ngure et al. (2009). A Concentração citotóxica 50% (CC50) é a
concentração que gerou redução de 50% das células viáveis.
47
Estes ensaios foram realizados sobre as células THP-1 diferenciadas,
conforme descrito no item 4.2.2.3, as quais aderem na placa e facilita a avaliação da
viabilidade celular pelos métodos do MTT.
4.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A viabilidade do parasito na presença das amostras teste foi demonstrada em
curvas de inibição em função de regressão linear para determinar a dose inibitória do
crescimento de 50% dos parasitos (CI50) feitas no programa GraphPad Prism versão
5.04.
48
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente estudo se deu a partir do extrato hexânico de folhas de V.
surinamensis, escolhido por apresentar resultados promissores para a atividade
antileishmania em estudos realizado no laboratório de Parasitologia da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da UFPA, no qual, mostrou-se ativo em L. chagasi (CIM =
100 μg/mL; CI50 = 86,40 μg/mL) e em L. amazonensis (CIM = 50 μg/mL; CI50 = 79,7
μg/mL; SARAIVA, 2012).
Outro estudo observou fato muito semelhante, frações polares obtidas de
Jacaranda puberula foram inativas em formas promastigota de Leishmania
(NAKAMURA et al. 2006), enquanto que extratos apolares mostraram elevada
atividade antileishmania (PASSERO et al. 2007). Desta maneira características
lipofílicas parecem ser requeridas para a interação com o parasita, uma vez que a
atividade dos compostos diminui com o aumento da polaridade (FERRARINI et al.
2008). Partindo dessa premissa que o extrato hexânico foi levado ao fracionamento
para identificação do marcador farmacológico.
A Tabela 3 mostra os rendimentos obtidos do fracionamento do extrato
Hexânico em CC utilizando como eluentes misturas de solventes em polaridade
crescente, sendo que as frações majoritárias (64,6%) encontram-se presentes na
faixa sistema Hex (100%) e Hex/AcOEt (30%) e a minoritária (24,6%) no sistema
MeOH (100%). Estes resultados sugerem que o extrato hexânico de V. surinamensis
deve possuir majoritariamente substâncias com menor polaridade.
49
Tabela 3- Fracionamento do extrato bruto hexânico (15g) com rendimento.
Sistema de solventes Frações Massa / rendimento
Hex - 100% Hex/AcOEt - 3% Hex/AcOEt - 5% Hex/AcOEt - 10% Hex/AcOEt - 15% Hex/AcOEt - 20% Hex/AcOEt - 25% Hex/AcOEt - 30% Hex/AcOEt - 35% Hex/AcOEt - 40% Hex/AcOEt - 45% Hex/AcOEt - 50% Hex/AcOEt - 75% AcOEt - 100% AcOEt/ MeOH - 50% MeOH - 100%
1-2 3 4* 5 6* 7 8* 9
10* 11 12 13 14 15 16* 17
3,451g/ 23% 0,564g/ 3,76%
- 1,318g/ 8,78%
- 0,478g/ 3,18%
- 3,885g/ 25,9%
- 0,784g/ 5,22% 0,006g/ 0,04% 0,076g/ 0,50% 0,73g/ 4,86%
0,008g/ 0,05% -
3,7g/ 24,6%
Legenda: * Frações que foram reunidas conforme perfil cromatográfico em CCD.
A subfração C5 demonstrou em CCD um baixo índice de mistura e foi
refracionada em cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) semipreparativa,
objetivando a purificação da substância. A Figura 10 mostra no cromatograma 1 a
análise da solução a partir do tratamento SPE, subsequente se buscou um melhor
sistema de isolamento, onde o perfil exploratório demostrou ser bastante complexo,
apresentando picos referentes a compostos de alta, média e baixa polaridade.
64,6% Fração
majoritária
Fração minoritária
Figura 10- Cromatograma 1 - Gradiente de ampla extensão de C4R38-41 com fase móvel composta por solvente A: H2O e solvente B: ACN variando de 5 a 100% de B em 60 minutos, vazão de 1,0 mL min
-1,
fase estacionária C18 (Microsorb).
50
O cromatograma 2 mostra que o constituinte com maior área de absorbância
(96,6%) possui tempo de retenção em torno de 37 minutos, sugerindo ser uma
substancia de baixa polaridade, conforme a Figura 11. Nesta condição, realizou a
separação dos constituintes da mistura, sendo coletadas três subfrações,
posteriormente renomeadas de 1, 2 e 3. As subfrações majoritárias 2 e 3, assim como
a subfração C5, obtida por CC, foram submetidas a analises de RMN de 1H e 13C para
identificação das substâncias.
.
Na análise dos dados do espectro de RMN de 1H da fração C5 (Figuras 12 e
13), mostraram na região dos aromáticos um simpleto em δH 6,60 integrando dois
hidrogênios referentes a H-2 e H-6, um duplo dupleto em δH 6,85 (1H, J = 8,4 e 1,5
Hz) é atribuído ao hidrogênio H-6’, um dupleto em δH 6,92 (1H, J = 1,5 Hz) referente
ao H-2’ e outro dupleto localizado em δH 6,93 atribuído ao H-5’ que possui J = 8,4 Hz
resultado do acoplamento orto com H-6’.
A observação de um dupleto (J= 6,0 Hz) em δH 1,19 referente aos hidrogênios
da metila-9 e um duplo dupleto (J=1,2 e 6,6 Hz) em δH 1,87 referente aos hidrogênios
da metila-9’. O duplo quarteto observado em δH 4,10 (J= 6 e 7,8 Hz) é referente ao
hidrogênio H-8 que acopla com H-7 e os hidrogênios da metila-9. O dupleto em δH
4,60 (J= 8,4 Hz) é referente ao acoplamento de H-7 com H-8 com a configuração treo.
1
2
3
Figura 11 - Cromatograma 2 - Eluição isocrática de FA6C1, composta por: Fase estacionária:
Coluna Microsorb C18 fase móvel H2O:MeOH 62:38, vazão de 1mL min-1
e detecção por absorbância
no Ultra Violeta visível.
51
Observou-se também os sinais em δH 3,82, 3,85, 3,85 e 3,91 referentes a
quatro metoxilas, sendo este último mais desprotegido atribuído à posição 4 por sofrer
impedimento espacial ficando fora do plano do anel aromático.
Outros sinais foram observados como um duplo quarteto (1H, J= 6,6 e 15,3 Hz)
em δH 6,14 referente ao hidrogênio olefínico do carbono C-8’, cuja constante de
acoplamento caracteriza o sistema olefínico trans, e o duplo dupleto em δH 6,35 (1H,
J= 1,5 e 15,9 Hz) que caracteriza também o sistema olefínico trans do hidrogênio
ligado ao carbono C-7’.
Figura 12- Espectro de RMN de 1H de C5 - (CDCl3, 300MHz).
52
A análise do espectro de RMN 13C (Figuras 14 e 15) da fração C5 mostra sinais
dos carbonos das quatro metoxilas (OMe) em δC 55,70 atribuída a 3’-OMe, δC 56,07
para 3-OMe e 5-OMe que são equivalentes, e para 4-OMe a mais desprotegida
observa-se um sinal em δC 60,80. Aos pares de carbono C-2/C-6 e C-3/C-5 foram
atribuídos, respectivamente, os sinais em δC 104,16 e 153,15 por serem equivalentes.
Figura 13 - Espectro de RMN de 1H de C5, expansão - (CDCl3, 300MHz).
53
Os dados de RMN 1H e 13C estão de acordo com os dados da literatura para a
substância surinamensina (11) de configuração treo e representados na Tabela 4 e
Figura 16 (BARATA et al. 1978).
Figura 14- Espectro de RMN 13
C de C5 (CDCl3, 75 MHz)
Figura 15- Espectro de RMN 13
C de C5, expansão (CDCl3, 75 MHz).
54
Tabela 4 - Dados de RMN 13C e 1H da substancia surinamensina (11) em comparação
com os dados da literatura para a surinamensina (Barata et al. 1978).
Presente estudo
Barata et al. (1978)
Presente estudo
Barata et al. (1978)
C δC (75 MHz)
* H δH (300 MHz) δH (100 MHz)
1 137,7 137,6
2 104,3 104,2 2 6,61 (2H, s) 6,60 (2H, s)
3 153,2 152,9
4 135,6 135,5
5 153,2 152,9
6 104,3 104,2 6 6,61 (2H, s) 6,60 (2H, s)
7 83,9 83,6 7 4,62 (d, J= 8,0 Hz) 4,60 (1H, d, J= 8,4
Hz)
8 78,6 78,5 8 4,14 (m) 4,10 (1H, dq, J= 6,0 e
7,8 Hz)
9 17,1 17,0 9 1,19 (d, J= 6,0 Hz) 1,19 (3H, d, J= 6,0)
1’ 133,5 133,3
2’ 109,2 109,1 2’ 6,9 (m) 6,92 (1H, d, J= 1,5
Hz)
3’ 150,7 150,5
4’ 146,6 146,4
5’ 118,7 118,6 5’ 6,9 (m) 6,93 (1H, d, J= 8,4
Hz)
6’ 118,9 118,7 6’ 6,9 (m) 6,85 (1H, dd, J= 1,5 e
8,4 Hz)
7’ 130,4 130,2 7’ 6,37 (d, J= 16 Hz) 6,35 (1H, dd, J= 1,5 e
15,9 Hz)
8’ 124,9 124,6 8’ 6,24 (m) 6,14 (1H, dq, J= 6,6 e
15,3 Hz)
9’ 18,3 18,2 9’ 1,87 (d, J= 5,5 Hz) 1,87 (3H, dd, J= 1,2 e
6,6 Hz)
OMe 55,7 56,0 OMe 3,82 (s) 3,82 (3H, s)
OMe 56,1 56,0 OMe 3,86 (s) 3,85 (3H, s)
OMe 56,1 56,0 OMe 3,86 (s) 3,85 (3H, s)
OMe 60,8 60,6 OMe 3,90 (s) 3,91 (3H, s)
Legenda: *Frequência do aparelho e solventes não especificados; solvente utilizado no presente estudo CDCl3;
55
Os dados da análise do espectro de RMN de 1H da subfração 2, oriunda do
fracionamento em CLAE, também evidenciam sinais sugestivos da presença da
surinamensina em mistura com a neolignana 8.O.4’ virolina (10), na proporção de 1:1,
demonstrando que o processo de separação não foi efetivo, conforme mostrado nas
Figuras 17 e 18.
Figura 16- Estrutura química da substancia surinamensina (11).
Figura 17 - Espectro de RMN de 1H da subfração 2 - (CDCl3, 300MHz).
56
Os sinais que caracterizam presença das neolignanas virolina em mistura com a
surinamensina se repetem no espectro de RMN 1H da subfração 3 e sugere que
exista uma terceira neolignana não caracterizada nesta subfração, conforme
demonstrado na Figura 19.
Os dados de RMN 1H e 13C estão de acordo com os dados da literatura para a
substância virolina (11) e representados na Tabela 5 (BORGES et al. 2007).
Figura 18- Espectro de RMN de 1H da subfração 2, expansão - (CDCl3, 300MHz).
Figura 19- Espectro de RMN de 1H da subfração 3 - (CDCl3, 300MHz).
57
Tabela 5 - Dados de RMN de 1H e 13C da substância virolina (10) em comparação em
comparação com os dados da literatura para a virolina (Borges et al. 2007).
Presente estudo
Borges et al. (2007)
Presente estudo
Borges et al. (2007)
C δC (75 MHz)
δC (100 MHz) H δH (300 MHz) δH (300 MHz)
1 133,52 132,7 1 -
2 109,22 109,3 2 6,61 (2H, s) 6,81 - 6,94
3 146,63 148,3 3 -
4 150,73 150,9 4 -
5 109,22 111,0 5 6,61 (2H, s) 6,81 - 6,94
6 118,95 120,0 6 6,61 (2H, s) 6,81 - 6,94
7 78,67 78,4 7 4,62 (d, J= 8,0 Hz) 4,63 (1H, d, J= 8,5 Hz)
8 83,87 84,1 8 4,14 (m) 4,09 (1H, dq, J= 8,5 e 6,3 Hz)
9 17,11 17,0 9 1,19 (d, J= 6,0 Hz) 1,5 (3H, d, J= 6,3 Hz)
1’ 133,52 133,5 1’ -
2’ 109,22 110,2 2’ 6,9 (m) 6,81 - 6,94
3’ 150,73 149,1 3’ -
4’ 146,63 146,8 4’ -
5’ 118,95 118,8 5’ 6,9 (m) 6,81 - 6,94
6’ 124,91 120,0 6’ 6,9 (m) 6,81 - 6,94
7’ 130,41 130,5 7’ 6,37 (d, J= 16 Hz) 6,35 (1H, dd, J= 15,7 e 1,5 Hz)
8’ 124,91 124,8 8’ 6,24 (m) 6,14 (1H, dq, J= 15,7 e 6,5Hz)
9’ 18,33 18,3 9’ 1,87 (d, J = 5,5 Hz) 1,87 (3H, dd,J= 6,5 e 1,6 Hz)
OMe 56,10 56,2 OMe 3,82 (s) 3,87 (3H, s)
OMe 55,72 55,9 OMe 3,86 (s) 3,88 (3H, s)
OMe 55,72 55,8 OMe 3,90 (s) 3,91 (3H, s)
Legenda: Solvente utilizado no presente estudo CDCl3;
58
5.1 Atividades biológicas
Visando determinar o melhor momento para a realização dos ensaios, fez-se a
curva de crescimento das promastigotas de L. amazonensis e estabeleceu-se a fase
logarítmica entre o quarto e o quinto dia de cultivo, onde a maior concentração foi
encontrada no quinto dia (Figura 20). Dados da literatura também relatam a maior
parasitemia no quarto dia e que a fase log iria até o quinto dia (MENDES, 2006;
VEIGA, 2013). Através desta curva é possível determinar a fase exponencial e a fase
estacionária de crescimento de microrganismos em cada sistema de cultivo.
A fase log representa à intensa reprodução do parasita, são basicamente mais
arredondas e apresentam baixa motilidade, o contrário ocorre com as promastigotas
metacíclicas (correspondente à fase estacionária), consideradas as formas infectivas
para o hospedeiro mamífero, apresentam reduzida divisão celular, maior motilidade e
apresentam-se mais afiladas na sua estrutura (KILLICK KENDRICK, 1974). Em meio
de cultura in vitro, estas formas se diferenciam em formas metacíclicas infectantes,
repetindo o processo de metaciclogênese que acontece no hospedeiro invertebrado
(MELO, 2009).
Figura 20 - Curva de crescimento de L. amazonsensis.
59
A premissa deste trabalho foi que frações ricas em lignanas e neolignanas
devem ser mais ativas que o extrato Hexânico, motivo pelo qual se escolheu as
subtrações C3, C4 e C5 para os ensaios biológicos realizados neste trabalho,
esperava-se que a fração C5 fosse mais promissora que as frações C3 e C4.
As lignanas e neolignanas correspondem cerca de 50% dos constituintes
químicos isolados da família Myristicaceae (MORAIS, 2008; LOPES et al. 2004) e
possuem importantes propriedades biológicas, tais como: atividades antifúngicas
(ZACCHINO et al. 1997), antipsoritica e antimalárica (LOPES et al. 1999). A atividade
leishmanicida nas espécies V. oleifera, V. surinamensis, V.donovani e V. pavonis foi
atribuída à presença de neolignanas (FERNANDES et al. 1993).
As subfrações testadas (C3 e C4) do extrato hexânico obtido das folhas de V.
surinamensis não inibiram o crescimento de promastigota de L. amazonensis (CI50 >
200μg/mL). Somente a subfração C5 na concentração 200µg/mL inibiu o crescimento
de promastigotas em 43% (Figura 21).
BRA
C5
200µg/mL
100µg/mL
50µg/mL
25µg/mL
12,5µg/mL
6,25µg/mL
3,125µg/mL
C3 C4
C N C. SOL
Figura 21 - Atividade antipromastigota dos extratos obtidos das folhas de Virola surinamensis para
L. amazonensis; CN - Controle negativo; CSOL- controle do solvente (metanol); BRA- Branco;
subfrações do extrato hexânico (C3,C4 e C5) nas concentrações : 200µg/mL; 100µg/mL; 50µg/mL;
25µg/mL; 12,5µg/mL; 6,25µg/mL e 3,125µg/mL.
60
Quando se relaciona os resultados obtidos neste estudo ao de Veiga (2013)
observa-se que a treo-surinamesina também foi inativa em forma promastigota de L
amazonensis. Outro estudo também avaliou a atividade antipromastigota de outra
neolignana, nerodiol, sendo observada que esta não foi ativa (Tabela 6; ARRUDA et
al. 2005).
As neolignanas machila G e veraguensina apresentaram atividade in vitro
frente às formas promastigotas de L. donovani (SILVA FILHO et al. 2008). As lignanas
verrucosina e guaiacina submetidas a teste de triagem frente à forma promastigota de
L.amazonensis, L.chagasi e L. braziliensis, mostraram-se muito ativas contra a
primeira espécie de Leishmania (CI50 de 27 µg/mL e 45 µg/mL, respectivamente;
MORAIS, 2008). No entanto, no presente estudo, subfrações ricas em neolignanas
virolina e surinamesinas foram inativas (Tabela 6), sugerindo que a atividade do
extrato hexânico esteja relacionada a outra classe de metabólito secundário.
No extrato hexânico foi detectado também misturas de hidrocarbonetos de
cadeia longa, estér de glicerídeos, mistura de esteroide e arilpropanóides, sugerindo
que outros metabólitos possam apresentar atividade antipromastigota (SARAIVA,
2012). Estes resultados também sugerem que a(s) molécula(s) ativa(s) devem possuir
caráter apolar.
Estudos têm levantado a hipótese de provável interação dos diferentes
compostos químicos (sinergismo) presentes no extrato seja responsável pela
atividade biológica (MARCUCCI, 1996; DIAS, 2012; RIOS; RECIO; VILLAR, 1987;
BIRDI et al. 2010).
Alguns estudos vêm mostrando que características de polaridade interferem na
atividade antipromastigota de Leishmania (NAKAMURA et al. 2006; PASSERO et al.
2007; SARAIVA 2012). Desta maneira características lipofílicas parecem ser
requeridas para a interação com o parasita, uma vez que a atividade dos compostos
diminui com o aumento da polaridade (FERRARINI et al. 2008). No presente estudo,
misturas de hidrocarbonetos de cadeia longa, mistura de esteroide e arilpropanóides
podem estar relacionadas à atividade antipromastigota do extrato hexânico.
61
Tabela 6 - CI50 do extrato, frações, subfrações e substâncias obtidas de V.
surinamensis testados em formas promastigotas de Leishmania.
Promastigota (CI50- µg/mL)
Amostras Neste estudo Estudos anteriores
Extrato Hexânico ND 79,7+ 1,3a Extrato Acetato de Etila ND >200 a Extrato Metanólico ND >200 a Treo-surinamesina ND >200 a Nerodiol ND 18,28b Verrucosina ND 27c Guaiacina 45c C3 >200 ND C4 >200 ND C5: virolina+suramesina >200* ND
Visando avaliar a citotoxicidade de C3, C4 e C5 realizou-se o ensaio do MTT.
As células foram expostas a diferentes concentrações de 500 a 7,8125 μg/ml das
amostras e ao controle (anfotericina nas concentrações de 100 a 1,562 μg/ml), por 48
horas. Todas as amostras avaliadas não afetaram a viabilidade celular (CC50> 200
mg/mL; Figura 22; Tabela 7)
C N C. SOL BRA
Anfotericina Fr. C3 Fr. C4 Fr. C5
6,25µg/mL
250µg/mL
125µg/mL
62,5µg/mL
31,25µg/mL
15,625µg/mL
7,8125µg/mL
100µg/mL
50µg/mL
25µg/mL
12,5µg/mL
500µg/mL
3,125µg/mL
1,562µg/mL
Legenda: a- Veiga, 2013; b- Arruda et al. 2005; c- Morais, 2008; * % inibitório = 43%
Figura 22- Avaliação da citotoxicidade através do MTT.
62
A C5 é constituída de treo-surinamesina e virolina não apresentou toxicidade
para as células THP-1 modificadas. Outro estudo avaliou a citotoxicidade de treo-
surinamesina em macrófagos peritoneais, sendo verificado que esta substância não
foi tóxica (Tabela 7; VEIGA, 2013). Este resultado corrobora com os obtidos no
presente estudo.
Tabela 7 - Avaliação da citotoxicidade do extrato, frações, subrações e substâncias obtidas de V. surinamensis.
Amostras Citotoxicidade (CC50: µg/mL)
Neste estudo Veiga (2013)
Extrato hexânico ND >500 Treo-surinamesina ND >500 Grandisina ND 0,078µMa C3 >200 ND C4 >200 ND C5 >200 ND
Legenda: a- Rezende et al. 2007 ;CC50 = Concentração citotóxica 50%
Outro fato que vale ressaltar é que o fracionamento reduziu a atividade
antipromastigota, entretanto parece que não interferiu na citotoxicidade (Tabela 7).
Algumas neolignanas mostraram efeito antioxidante, reduzindo a peroxidação lipídica
(REZENDE et al. 2005). Esta capacidade antioxidante pode estar relacionada a baixa
citotoxicidade.
63
6 CONCLUSÃO
Conforme pesquisa bibliográfica realizada sobre os estudos químicos
realizados com as folhas de V. surinamensis, as classes de substâncias
frequentemente encontradas são: lignanas, neolignanas e flavonoides, podendo
constatar que a classe de substâncias encontradas neste estudo está de acordo com
o perfil químico da planta.
A atividade antipromastigota do extrato hexânico de folhas de V. surinamensis
não está relacionada aos metabolitos majoritários, neolignanas. Esta atividade pode
estar relacionada a algum metabolito secundário minoritário com características de
baixa polaridade.
64
7 REFERÊNCIAS
AGURREL, S.; HOLSTEDT, B.; LINDGREN, J.E.; SCHULTES, R.E. Alkaloids in certain species of Virola and other south American plants of ethnopharmacologic interest. Acta Chemica Scandinavica, v. 23, n.3, p.903-916, 1969.
AHMED, N.H. Cultivation of parasites. Tropical Parasitology, v. 4(2), p. 80-89, 2014.
ALVAR, J. et al. Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLoS ONE, San Francisco, v. 7, n. 5, p. e35671, 2012.
ANTOINE, J.C.; RINA, E.; LANG, T.; COURRET, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology, v. 7, n. 10, p. 392-401, 1998.
ARRUDA, D.C.; D’ALEXANDRI, F.L.; KATZIN, A. M.; ULIANA, S.R.B. Antileishmanial activity of the terpeno nerolidol. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 49, n. 5, p. 1679-1687, may. 2005.
BARATA, L.; SANTOS, L.; FERRI, P.; PHILLIPSON, J.; PAINE, A.; CROFT, S. Anti-leishmanial activity of neolignans from Virola species and synthetic analogue. Phytochemistry, v. 55, n. 6, p. 589-595, 2000.
BARATA, L.E.S. BAKER, P.M.; GOTTLIEB, O.R.; RÚVEDA, E.A. Neolignans of Virola surinamensis. Phytochemistry, v. 17, n. 4, p. 783-786, 1978.
BARATA, L.E.S. Isolamento e Síntese de Neolignanas de Virola surinamensis (Rol) Warb. 1976. 195 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, 1976.
BASANO, S.A.; CAMARGO, L.M.A. Leishmaniose tegumentar americana: histórico, epidemiologia e perspectivas de controle. Revista Brasileira de Epidemiologia, v. 7, n. 3, p. 328-337, 2004.
BERGER, M.E. Plantas Medicinais da Amazônia, 2ª ed. Brasil: CNPq, 1992, 207 p.
BIRDI, T. et al. Newer insights into the mechanism of action of Psidium guajava L. leaves in infectious diarrhoea. BMC Complementary and Alternative Medicine, v. 10, n. 33, p. 1-11, Jun. 2010.
BLUMENTHAL, E.E.A.; SILVA, M.S.; YOSHIDA, M. Lignoids, flavonoids and polyketides of Virola surinamensis. Phytochemistry, v. 46, p. 745-749, 1997.
BORGES, F.C.; SANTOS, L.S.; CORRÊA, M.J.C.; OLIVEIRIA, M.N.; SILVA FILHO, A.P.S. Potencial alelopático de duas neolignanas isoladas de folhas de Virola surinamensis (Myristicaceae). Planta Daninha, v.25, n.1, p. 51-59, 2007.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Leishmaniose Visceral Recomendações clínicas para redução da letalidade. Série A. Normas e Manuais Técnicos. 1.ª edição atualizada, Brasília – DF: MS, 2011, 82 p.
65
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana. Série A. Normas e Manuais Técnicos. 2.ª edição atualizada, Brasília – DF: MS, 2010, 180 p.
CAMPOS, J.F.F. Ação leishmanicida in vitro da miltefosine em formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) braziliensis e estudo in vivo de sua eficácia tratamento da leishmaniose cutânea experimental. 2008. 79 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde), Universidade de Brasília, Brasília, 2008.
CDC (CENTERS CONTROL DISEASE AND PREVENTION). Leishmaniasis: Life Cycle. CDC, 2015. Disponível em:˂http://www.cdc.gov/dpdx/leishmaniasis/˃. Acesso em: 20 fev. 2016.
CESARINO, F. informativo técnico rede de sementes da Amazônia Instituto de Pesquisas Científicas e Tecnológicas do Estado do Amapá, Versão impressa ISSN 1679-6500 Nº 14, 2006.
CHULAY, J. D.; FLECKENSTEIN, L.; SMITH, D H. Phamacokinetics of antimony during treatment of visceral leishmaniasis with sodium stibogluconate or meglumine antimoniate. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v.82, p.69-72, 1988.
COROTHIE, E.; NAKANO, T. Constituents of the bark of Virola sebifera. Planta Medica, v. 17, p. 184- 188, 1969.
CROFT, S.L.; YARDLEY, V. Chemotherapy of leishmaniasis. Current Pharmaceutical Design , v. 8, n. 4, p. 319-342, 2002.
CUNNINGHAM, A.C. Parasitic Adaptive Mechanisms in infection by Leishmania.
Experimental and Molecular Pathology, v. 72, p. 132-141, 2002.
DAIGNEAULT, M. et al. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and Monocyte-Derived Macrophages. PLoS ONE, v. 5, n. 1, p. 1-10, 2010.
DATASUS. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Leishmaniose Tegumentar Americana casos confirmados notificados no SINAN. Disponível em: ˂http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/tabnet/dh?sinannet/lta/bases/ltabrnet.def˃. Acesso em: 21 jun. 2014.
DATASUS. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Leishmaniose Visceral casos confirmados notificados no SINAN. Disponível em: ˂ http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/tabnet/dh?sinannet/leishvi/bases/leishvbrnet.def ˃. Acesso em: 21 jun. 2014.
DAVID, C.V.; CRAFT, N. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Dermatologic Therapy, v. 22, p. 491-502, 2009.
66
DEMICHELI, C.; FRÉZARD, F. Pentavalent Antimonials: from chemistry to the design of new drugs. Drugs Design Reviews, v. 2, n. 3, p. 243-249, 2005.
DENNY, C.; ZACHARIAS, M.E.; KOHN, L.K., FOGLIO, M.A., CARVALHO, J.E. Atividade antiproliferativa dos extratos e da fração orgânica obtidos das folhas de Virola sebifera Aubl. (Myristicaceae). Revista Brasileira de Farmacogosia, v. 17, n. 4, p. 598-603, 2007.
DESCOTEAUX, A.; TURCO, J. S. Glycoconjugates in Leishmania infectivity. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1455, n. 2-3, p. 341-352, Oct. 1999.
DIAS, J. F. G. Fitoquímica e ensaios biológicos do extrato bruto etanólico, frações e substâncias isoladas provenientes das cascas de Geissospermum vellosii Allemão (APOCYNACEAE). 2012. 135 f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) - Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2012.
DUTRA, W.O.; GOLLOB, K.J. Negleted diseases: In need of bare necessities and breakthroughs. Drug Development Research, v 72, p 427-428, 2011.
FERNANDES, A.M.A.P.; BARATA, L.E.S.; FERRI, P.H. Lignan and a neolignan from V. olifera leaves. Phytochemistry, v. 32, n. 6, p. 1567-1572, 1993.
FERRARINI S.R.; GRAEBIN, C.S.; LIMBERGER, J.; CANTO, R.F.S.; DIAS, D.O.; ROSA, R.G.; MADEIRA, M.F. EIFLER LIMA, V.L. S. Synthesis of limonene β -amino alcohol derivatives in support of new antileishmanial therapies. Memória do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v.103, n.8, p.773-777, dec. 2008.
FERREIRA, L.V. Museu Goeldi alerta para a extinção da árvore Virola. Disponível em: ˂ http://www.oeco.org.br/noticias/27503-museu-goeldi-alerta-para-a-extincao-da-arvore-virola/ ˃. Acesso: 20 dez. 2015.
GONTIJO, C.M.F.; MELO, M.N. Leishmaniose visceral no Brasil: quadro atual, desafíos e perspectivas. Revista Brasileira de Epidemiologia, v. 7, n. 3 p. 338-349, 2004.
GRIMALDI JUNIOR, G. Leishmanioses tegumentares: aspectos clínicos e imunopatológicos. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 77, n. 2, p. 195-215, 1982.
GRIMALDI JUNIOR, G.; TESH, R.B.; McMAHON-PRATT, D. A review of the geographic distribution and epidemiology of leshmaniasis in the new world. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. v. 41, n. 6, p. 687-725, 1989.
KAWANISHI, K.; HASHIMOTO, Y. Long chain esters of Virola species. Phytochemistry, v. 26, p. 749-752, 1987.
KILLICK KENDRICK, R.; MOLYNEUX, D.H.; ASHFORD, R.W. Ultrastructural observations on the attachment of Leishmania in the sandflay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v.68, p.269-276, 1974.
67
KHRAIWESH, M.; LEED, S.; RONCAL, N.; JOHNSON, J.; SCIOTTI, R.; SMITH, P.; READ, L.; PARIS, R.; HUDSON, T.; HICKMAN, M.; GROGL, M. Antileishmanial Activity of Compounds Derived from the Medicines for Malaria Venture Open Access Box Against Intracellular Leishmania major Amastigotes. The Americam Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 94, p. 340-347, 2016.
LAINSON, R.; SHAW, J.J. Evolution, classification and geographical distribution. In: PETERS, W.; KILLICK-KENDRICK, R. The leishmaniasis in biology and medicine, v.1, p. 1-120, 1987.
LAINSON, R.; SHAW, J.J.; SILVEIRA, F.T.; BRAGA, R.R.; RYAN, L.; PÓVOA, M.M.; ISHIKAWA, E.A.Y. A leishmania e as Leishmanioses. Instituto Evandro Chagas, v. 1, p. 83-124, 1986.
LEITE, A.M.C.; LLERAS, E. Áreas prioritárias na Amazônia para a conservação dos recursos genéticos de espécies florestais nativas: fase preliminar. Acta Botânica Brasilica, v. 7, n. 1, p. 61-94, 1993.
LEMUS, S.M., CASTRO, C.O. Potential antifungal neolignans from Virola koschnyi fruits. Spectroscopy, v. 7, n. 5-6, p. 353-358, 1989.
LOPES, L.M.X.; YOSHIDA, M.; GOTTLIEB, O.R. Dibenzylbutyrolactone lignans from Virola sebifera. Phytochemistry, v. 22, n. 6, p. 1516-1518, 1983.
LOPES, N.P.; ALBUQUERQUE, S.; KATO, M.J.; YOSHIDA, M. Flavonoids and lignans from Virola surinamensis twigs and their in vitro activity against Trypanosoma cruzi. Planta Medica, v. 64, p. 667-669, 1998.
LOPES, N.P.; KATO, M.J.; YOSHIDA, M. Antifungal constituents from roots of Virola surinamensis. Phytochemistry, v. 51, p. 29-33, 1999.
LOPES, N.P.; SANTOS, P.A.; KATO, M.J.; YOSHIDA, M. New butenolides in plantlets of Virola surinamensis (Myristicaceae). Chemical and Pharmaceutical Bulletin, v. 52, n.10, p. 1255–1257, 2004.
MARCUCCI, M. C. Propriedades biológicas e terapêuticas dos constituintes químicos da própolis. Química Nova, v. 19, n. 5, p. 530-536, 1996.
MARTINEZ, V.J.C.; ALDANA, J.M.I.; CUCA, S.L.E. Dibenzylbutane lignans from Virola sebifera leaves. Phytochemistry, v. 50, p. 883-886, 1999.
MELO, N.M. Avaliação da atividade anti-Leishmania in vitro de complexos Sb(V)-ribonucleosídeos em Leishmania (Leishmania) chagasi. 2009. 120 f. Dissertação (Mestrado em Parasitologia) Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2009.
68
MENDES, J.M.M. Ação leishmanicida de extratos de plantas no desenvolvimento de promastigotas de Leishmania amazonensis e estudo do perfil metabólico utilizando a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). 2006. 89 f. Dissertação (mestrado em Medicina Tropical)- Instituto de Patologia tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goías, Goías, 2006.
MONZOTE, L. Current Treatment of Leishmaniasis: A Review. The Open Antimicrobial Agents Journal, v. 1, p. 9-19, 2009.
MORAIS, S.K.R. Constituintes químicos de algumas espécies de Myristicaceae. 2008. 107 f. Tese (doutorado em Química Orgânica) - Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
MORAIS, R. C. S. Aplicabilidade da técnica de PCR em tempo real para caracterização de espécies de Leishmania. 2015. 62 f. Dissertação (Mestrado em Biociências e Biotecnologia) - Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2015.
MOTA, E.F.; ROSARIO, D.M.; VEIGA, A.S.S.; BRASIL, D.S.; SILVEIRA, F.T.; DOLABELA, M.F. Biological activities of Croton palanostigma Klotzch. Pharmacognosy Magazine, v. 43, p. 601-606, 2015.
MÜLLER, I.; HAILU, A.; CHOI, B.S.; ABEBE, T.; FUENTES, J.M.; MUNDER, M.; MODOLELL, M.; KROPF, P. Age-related alteration of arginase activity impacts on severity of leishmaniasis. Neglected Tropical Diseases, v. 2, n. 5, p. 1-10, 2008.
MURRAY, H.W.; BERMAN, J.D.; DAVIES, C.R.; SARAIVA, N.G. Advances and leishmaniasis. Lancet, v. 366, p. 1561-1577, 2005.
NAKAMURA, C. V.; SANTOS, A. O.; VENDRAMENTO, M. C.; LUIZE, P. S.; DIAS FILHO, B.P.; CORTEZ, D.A.G.; NAKAMURA, T.U. Atividade antileishmania do extrato hidroalcoólico e de frações obtidas de Piper regnelli (Miq.) C.DC. pallescens (C.DC.) Yunck. Revista Brasileira de Farmacognosia, v.16, n.1, p.61-66, jan./mar. 2006.
NGURE, P.K.; TONUI, W.K.; INGONGA, J.; MUTAI, C.; KIGONDU, E.; NG’ANG’A, Z.; RUKUNGA, G.; KIMUTAI, A. In vitro antileishmanial activity of extracts of Warburgia ugandensis (Canellaceae), a Kenyan medicinal plant. Journal of Medicinal Plants Research, v.3, n.2, p.61-66, 2009.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Global Health Observatory Map Gallery. Disponível em: <http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/en/>. Acesso em: 3 dez. 2015
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Leishmaniasis. Disponível em: <http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/en/>. Acesso em: 5 dez. 2016.
PAGNOCCA, F.C.; RIBEIRO, S.B.; TORKOMIAN, V.L.V.; HEBLING, M.J.A; BUENO, O.C.; SILVA, O.A.; FERNANDES, J.B; VIEIRA, P.C; SILVA, M.F.G.F.; FERREIRA, G.A. Toxicity of lignans to symbiotic fungus of leaf-cutting ants. Journal of Chemical Ecology, v. 22, n. 7, p. 1325-1330, 1996.
69
PAIXÃO, L.B.; HIRUMA-LIMA, A.C. Virola surinamensis (Rol.) Warb.: Um estudo etnofarmacológico. Anais do XIV Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, p. 109, 2000.
PASSERO, L.F.D.; CASTRO, A.A.; TOMOKANE, T.Y.; KATO, M.J.; PAULINETTI, T.F.; CORBETT, C.E.P.; LAURENTI, M.D. Anti-leishmania activity of semi-purified fraction of Jacaranda puberula leaves. Parasitology Research, v.101, p.677-680, 2007.
PETERS, N.C.; EGEN, J.G.; SECUNDINO, N.; DEBRABANT, A.; KIMBLIN, N.; KAMHAWI, S.; LAWYER, P.; FAY, M.P.; GERMAIN, R.N.; SACKS, D. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science, v. 321, n. 5891, p. 970-974, 2008.
RANGEL, E.F.; LAINSON, R. Proven and putative vectors of American cutaneous leishmaniasis in Brazil: aspects of their biology and vectorial competence. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 104, n. 7, p. 937-934, 2009.
RATH, S.; TRIVELIN, L.A.; IMBRUNITO, T.R.; TOMAZELA, D.M.; JESÚS, M.N.; MARZAL. P.C.; ANDRADE JÚNIOR, H.F.; TEMPONE, A.G. Antimoniais empregados no tratamento da leishmaniose: estado da arte. Quimica Nova v. 26, p. 550-555, 2003.
REILLY, T.P.; BELLEVUE, F.H.; WOSTER, P.M.; SVENSSON, C.K. Comparison of the in vitro cytotoxicity of hydroxylamine metabolites of sulfamethoxazole and dapsone. Biochemical Pharmacology, v. 55, n. 6, p. 803–810, 1998.
REZENDE, K.R.; DAVINO, S.C.; BARROS, S.B.; KATO, M.J. Antioxidant activity of aryltetralone lignans and derivatives from Virola sebifera (Aubl.).Natural Product Research, v. 19, n.7, 661-666, 2005.
REZENDE, R.K.; KATO, M.J. Dibenzylbutane and aryltetralone lignans from seeds of Virola sebifera. Phytochemistry, v. 61, p. 427-432, 2002.
RIOS, J. L.; RECIO, M.C.; VILLAR, A. Antimicrobial activity of selected plants employed in the Spanish Mediterranean area. Journal of Ethnopharmacology, v. 21, n. 2, p. 139-152, Nov. 1987.
RODRIGUES, W.A. Revisão taxonômica das espécies de Virola Aublet (Myristicaceae) do Brasil. Acta Amazonica, v. 10, p. 1–127, 1980.
RODRIGUEZ, G. et al. Anais da XIV Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil
127, 1996.
ROGERS, M.E.; CHANCE, M.L.; BATES, P.A. The role of promastigote secretory gel in the origin and transmission the infective stage of Leishmania mexicana by the sandflyLutzomyia longipalpis. Parasitology, v. 124, p. 495-507, 2002.
70
SACKS, D.; KAMHAWI, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology, v. 55, p. 453-83, 2001.
SACKS, D.L. The structure and function of the surface lipophosphoglycan on different developmental stages of Leishmania promastigotes. Infectious Agents and Disease, v. 1, n. 4, p. 200 -206, Aug. 1992.
SACKS, D. L.; PERKINS, P. V. Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science, v. 223, n. 4643, p. 1417-1419. Mar. 1984.
SARAIVA, M.E.V. Atividade antimicrobiana e antipromastigota de extratos e frações de Virola surinamensis (Rol. Ex Rottb.) Warb (Myristicaceae). 2012. 57 f. Dissertação (mestrado em Ciências Farmacêuticas na área de fármacos e medicamentos) - Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará, Belém, 2012.
SCHULTES, R.E.; Evolution of the identification of the Myristicaceae Hallucinogens of South-America. Journal of Ethnopharmacology, v. 1, n. 3, p. 211, 1973.
SCHULTES, R.E.; HOLMSTED, B. Comments on poisonous plants from tropical new world. 8. Miscellaneous plants of South-America. Lloydia, v. 34, n. 1, p. 61-90, 1971.
SCHUSTER, F.L; SULLIVAN, J.J. Cultivation of Clinically Significant Hemoflagellates. American Society for Microbiology. Clinical Microbiologigy Reviews, v. 15, n. 3, p. 374-389, 2002.
SILVA FILHO, A.A.; COSTA, E.S.; CUNHA, W.R.; SILVA, M.L.A.; DHAMMIKA, N.P.; BASTOS, J.K. In vitro antileishmania and antimalarial activities of tetrahydrofuran lignans isolated from Nectandra megapotamica (Lauraceae). Phytotherapy Research, v.22, p.1307-1310, 2008.
SNYDER, L.R.; DORLAN, J.W. Initial experiments in high-performance liquid chromatographic method development. I. Use of a starting gradient run. Journal of Chromatography, v.721, p.3-14, 1996.
SOARES-BEZERRA, R. J.; LEON, L.; GENESTRA, M. Recentes avanços da quimioterapia das leishmanioses: moléculas intracelulares como alvo de fármacos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 40, n. 2, p. 139-149, 2004.
SOUZA, V.C.; LORENZI, H. Botânica Sistemática - Guia ilustrado para identificação das famílias de angiospermas da flora brasileira, baseado em APG II. Nova Odessa: Plantarum, 2005. 640 p.
STUART, K.; BRUN, R.; CROFT, S.; FAIRLAMB, A.; GÜRTLER, R.G.; MCKERROW, J.; REED, S.; TARLETON, S. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. The Journal of the Clinical Investigation, v. 118, n. 4, p. 1301-1310, 2008.
71
TAYLOR, A.E; BAKER, J.R. The Cultivation of Parasites In Vitro. Oxford, United Kingdom: Blackwell Scientific Publications, Ltd; 1968.
TDR/WHO. Data needed on people infected with visceral leishmaniasis: call for expansion of working database. For research on diseases of poverty (TDR) news item, may. 2011. Disponível em: ˂http://www.who.int/tdr/news/2011/vl-working-database/en/˃. Acesso: 20 jun. 2014.
TEMPONE, A.G. et al. Targeting Leishmania (L.) chagasi amastigotes through macrophage scavenger receptors: the use of drugs entrapped in liposomes containing phosphatidylserine. Journal Antimicrobial Chemotherapy, v. 54, n. 1, p. 60-68, Jul. 2004.
TSUCHIYA, S. et al. Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester. Cancer Research, v. 42, p. 1530-1536, 1982.
URDAPILLETA, A.A.A. Atividade de substâncias isoladas de liquens sobre formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis e Leishmania (V.) braziliensis. 2006. 78 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)- Universidade de Brasília, Brasília-DF, 2006.
VANNIER SANTOS, M.A.; MARTINY, A.; SOUZA, W. Cell biology of Leishmania spp.: invading and evading. Current Pharmaceutical Design. v. 8, n.4, p. 297-318, 2002.
VEIGA, A.S.S. Atividade antileishmania de plantas Amazônicas. 2013. 150 f. Dissertação (mestrado em Ciências Farmacêuticas na área de fármacos e medicamentos) - Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará, Belém, 2013.
WHO. Control of the leishmaniasis. Geneva: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases, 2010.
WHO. Research priorities for Chagas disease, human African trypanosomiasis and leishmaniasis. Geneva: TDR Disease Reference Group on Chagas Disease, Human African Trypanosomiasis and Leishmaniasis, 2012. (III Series, 975).
ZACCHINO, S.; RODRÍGUEZ, G.; PEZZENATI, G.; ORELLANA, G.; ENRIZ, R.; GONZALEZ SIERRA, M. In vitro evaluation of antifungal properties oj 8’.0.4’- neolignans. Journal of Natural Products, v. 60, n. 7, p. 659-662, 1997.
ZHANG, H.J.; TAMEZ, P.A.; HOANG, V.D.; TAN, G.T.; HUNG, N.V.; XUAN, L.T.; HUONG, L.M.; CUONG, N.; THAO, D.T.; SOEJARTO, D.D.; FONG, H.H.S.; PEZZUTO, J.M. Antimalarial compounds from Rhaphidophora decursiva. Journal of Natural Products, v. 64, p. 772-777, 2001.