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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PERFIL FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DE ALGUNS FRUTOS E SEMENTES

ENCONTRADOS NA FLORA CATARINENSE

PÂMELLA CRISTINE DUARTE BAGATTOLI

Itajaí, 2013

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS



ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DE ALGUNS FRUTOS E SEMENTES


Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr Rivaldo Niero Co-orientador: Profa Dra Vânia Floriani Noldin

Itajaí, julho de 2013

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ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DE ALGUNS FRUTOS


Pâmella Cristine Duarte Bagattoli ‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’

____________________________________ Rivaldo Niero, Prof°Dr.

Orientador

__________________________________________________________ Tânia Mari Bellé Bresolin, Profa Dra.

Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

______________________________________ Prof° Dr Rivaldo Niero (UNIVALI)

Presidente

______________________________________ Profa Dra Vânia Floriani Noldin (UNIVALI)

Co-orientador

______________________________________ Profa Dra Fátima de Campo Buzzi (UNIVALI)

Membro

______________________________________ Profa Dra Angela Malheiros (UNIVALI)

Membro

____________________________________ Profa Dra Claudriana Locatelli (UNOESC)

Membro externo

Itajaí (SC), 12, julho de 2013

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Dedicatória

Dedico este trabalho, a minha família pelo amor e compreensão.

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, pelos dons que me deste e pelos relacionamentos que possibilitam que eu cresça a cada dia. Aos meus pais e meu irmão, cujo amor e dedicação sempre me incentivaram a continuar, sem eles nada disso seria possível. Ao meu marido, Elton Bagattoli, meu agradecimento especial e todo meu carinho, admiração e amor. Aos meus mestres, Dr. Rivaldo Niero e Dra. Vânia Floriani Noldin, pela amizade e colaboração para a elaboração desse trabalho. A minha grande amiga Ana Flávia Fischer, pela amizade e aprendizado. “Pois cada pessoa que passa em nossa vida é única e sempre deixa um pouco de sim e leva um pouco de nós.” Aos meus amigos e técnicos de laboratórios, em especial Luisa, Juliana, Gislaine, Mateus, Daniela e demais colegas, pelo convívio e aprendizado. Aos professores Dr. Valdir Cechinel Filho e Dr. Theodoro Marcel Wagner pela ajuda para a realização desse trabalho.

Muito Obrigada!!!

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ANTIOXIDANTE E CITOTÓXICA DE ALGUNS FRUTOS



julho/2013 Orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero. Co-Orientador: Profa. Dra Vânia Floriani Noldin. Titulação: Área de concentração em produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas. Número de Páginas: 119 Substâncias químicas derivadas de produtos naturais, oriundas de animais, micro-organismos, minerais e/ou plantas, são utilizadas para o tratamento de doenças desde os primórdios da civilização humana. Atualmente cresce o interesse da comunidade científica em validar as plantas utilizadas na medicina popular, a fim de desenvolver novos fitoterápicos e fitofármacos, que possam beneficiar a população com novas opções terapêuticas, fortalecendo assim as indústrias brasileiras. Este trabalho teve como objetivo avaliar o perfil fitoquímico e a ação antioxidante e citotóxica in vitro dos extratos metanólicos obtidos dos frutos e sementes de: Solanum sessiliflorun, Diospyros inconstans, Solanum quitoense, Plinia glomerata, Rubus imperialis, Rubus rosaefolius e Garcinia achachairu oriundas da flora catarinense. Foram preparados os extratos metanólicos, os quais foram caracterizados fitoquimicamente por cromatografia em camada delgada usando reativos específicos. As substâncias fenólicas foram quantificadas pelo método de Folin-Ciocalteau. O potencial antioxidante dos extratos metanólicos, frações e subfrações foram avaliados espectrofotometricamente pelo método de sequestro dos radicais DPPH•, ABTS•, ORAC e quelante de metais. Também foi avaliada a atividade citotóxica dos extratos dos frutos e sementes em cultura celular utilizando a linhagem celular de melanoma murino (B16F10). Os resultados fitoquímicos mostraram que todos os frutos estudados possuem grande quantidade de carboidratos, principalmente frutose, glicose e sacarose além de compostos fenólicos ainda não identificados. No extrato metanólico das sementes de G. achachairu foi detectada a presença da substância gutiferona A, além de ésteres derivados de ácidos graxos e os fitoesterois, β-sitosterol e γ-sitosterol. Em todos os testes de avalição da atividade antioxidante (DPPH, ABTS, ORAC e quelante de metais) o extrato metanólico das sementes de G. achachairu apresentou os melhores resultados. No teste de citotoxicidade, tanto as sementes de Garcinia quanto suas frações e a gutiferona A, inibiram o crescimento das células tumorais B16F10 (melanona murino). Os resultados sugerem que dentre as sete espécies estudadas, as sementes de Garcinia achachairu foram as mais ativas e por isso, sugere-se a continuidade do estudo fitoquímico, objetivando a identificação dos compotos bioativos e o mecanismo de ação destes, a fim comprovar a atividade biológica do extrato das sementes de Garcinia achachairu para uso medicinal Palavras-chave: Perfil fitoquímico. Atividade antioxidante. Citotoxicidade

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PHYTOCHEMICAL PROFILE AND EVALUATION OF ANTIOXIDANT AND CYTOTOXICITY ACTIVITY OF FRUITS FROM THE FLORA OF

THE STATE OF SANTA CATARINA (SC), BRAZIL

PÂMELLA CRISTINE DUARTE BAGATTOLI July, 2013

Supervisor: Professor PhD Rivaldo Niero. Co-Supervisor: Professor PhD Vânia Floriani Noldin. Area of Concentration: Natural products and synthetic and bioactive substances. Number of pages: 119 Chemical substances derived from natural products of animal, microorganism, mineral and/or plant originhave been used to treat diseases since the dawn of human civilization. Currently, the interest of the scientific community in legitimizing the plants used in popular medicine is increasing, with the aim of developing new phytotherapic and phytopharmaceutical drugs that can benefit the populationwith new therapeutic options, and strengthen Brazilian industries. This study assesses the phytochemical profile and in vitro antioxidant and cytotoxic activity of methanolic extracts obtained from fruits and seeds of Solanum sessiliflorun, Diospyros inconstans, Solanum quitoense, Plinia glomerata, Rubus imperialis, Rubus rosaefolius and Garcinia achachairu, which are native flora of the state of Santa Catarina, Brazil. The methanolic extracts were prepared and phytochemically characterized by thin layer chromatography using specific reaction agents.The phenolic substances were quantified according to the Folin-Ciocalteau method. The antioxidant potential of the methanolic extracts, fractions and subfractions was spectrophotometrically evaluated by the DPPH•, ABTS•, ORACradical scavenging method and metal chelates. The cytotoxic activity of the fruit and seed extracts was also evaluated in murine melanoma (B16F10) cell culture. The phytochemical results revealed that all the fruits studied contain large amounts of carbohydrates, particularly fructose, glucose and sucrose, as well as phenolic compounds not yet identified. In the methanolic extract of the seeds of G. achachairu,the presence of the substance guttiferone A was detected, as well as fatty acid derivatives, and the phytosterolsβ-sitosterol andγ-sitosterol. In all the tests to evaluate antioxidant activity (DPPH, ABTS, ORAC and metal chelates) the methanolic extract of the seeds of G. achachairu presented the best results. In the cytotoxicity test, both the seeds of Garciniaand its fractions and guttiferone Ainhibited the growth of the B16F10 tumor cells (murine melanoma). The results suggest that of the seven species studied, the seeds ofGarciniaachachairuwere the most active, therefore further phytochemical studies are suggested, seeking to identify the bioactive compounds and their mechanism of action, in order to demonstrate the biological activity of the seed extract of Garcinia achachairu for medicinal use. Keywords: Phytochemical profile. Antioxidant activity. Cytotoxicity.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Frutos maduros e partes aéreas de P. glomerata......................................34 Figura 2 – Frutos maduros e partes aéreas de G. achachairu..................................36 Figura 3 - Frutos maduros e partes aéreas da R. imperialis.....................................38 Figura 4 - Frutos maduros e partes aéreas da R. rosaefolius...................................40 Figura 5 – Frutos maduros e partes aéreas da S. sessiliflorum................................41 Figura 6 – Frutos maduros e partes aéreas de S. quitoense Lam............................42 Figura 7 – Frutos maduros e partes aéreas de Diospyros inconstans......................43 Figura 8: Reação do Fenton ou Haber-Weiss...........................................................45 Figura 9: Fluxograma das operações realizadas para purificação da fração de acetato de etila de Garcinia achachairu.....................................................................60 Figura 10 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos de diferentes partes dos frutos de garcinia (G. achachairu) comparados com diferentes padrões comumente encontrados em plantas e isolados em outras partes de G. achachairu..................................................................................................................69 Figura 11 – Estrutura química da Gutiferona A isolada do extrato metanólico das sementes de G. achachairu........................................................................................70 Figura 12 – Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos de diferentes frutos com dois sistemas distintos de eluentes. A: Sistema apolar. B: Sistema polar..............................................................................................................70 Figura 13 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos das cascas e da polpa + sementes da cabeludinha (P. glomerata) (A) e dos extratos metanólicos dos frutos de amora vermelha (R. rosafolius) e amora-branca (R. imperialis) (B) com diferentes padrões de açúcares.................................................................................71 Figura 14 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos da polpa e casca do fruto maná cubiú (S. sessiliflorum) (A) e do extrato da polpa e casca da naranjila (S. quitoense) (B) com diferentes padrões de açúcares.............................72 Figura 15 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos da semente da jacu, polpa da jacu e casca da jacu (D. inconstans) (A) e dos extratos metanólicos das diferentes partes da garcinia (G. achachairu) (B) com diferentes padrões de açúcares..................................................................................................73 Figura 16 - Perfil cromatográfico da sobreposição da análise dos diferentes extratos

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clorofórmicos das sementes (a) e das cascas dos frutos (d) de G. achachairu; polpa + semente (b) e casca dos frutos (c) de P. glomerata...............................................75 Figura 17 - Perfil cromatográfico do extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu (2 µg/ml) comparados com a biblioteca de referência.........................76 Figura 18 – Estruturas químicas dos compostos presentes extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu.......................................................................................77 Figura 19 - Identificação dos esteróis do extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu (temperatura inicial da coluna 180°C)......................................................78 Figura 20 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico (0,31 mg/ml) das cascas dos frutos (B) e polpa + semente de P. glomerata (C) comparados com padrão interno quercitrina (A)................... .........................................................................................81 Figura 21 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico das sementes de G. achachairu em comparação com a Gutiferona A (0,5 mg/ml)....................................82

Figura 22 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico das cascas dos frutos de G. achachairu em comparação com a Gutiferona A (0,5 mg/ml)....................................82

Figura 23 - Curva para polifenóis totais de ácido gálico (µg/ml)...............................83 Figura 24 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: SG (sementes da garcinia – G. achachairu), RI (frutos da amora-branca – R. imperialis), CC (cascas dos frutos da cabeludinha – P. glomerata), PSC (polpas mais sementes da cabeludinha – P. glomerata) e dos controles positivos trolox e vitamina C, pelo método do sequestro do radical livre DPPH•......................87 Figura 25 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: CG (cascas dos frutos da garcinia – G. achachairu), CN (cascas dos frutos da naranjila - S. quitoense), RR (frutos da amora-vermelha – R. rosafolius), SJ (sementes da jacu – D. inconstans), CM (cascas da maná cubiú- S. sessiliflorun) pelo método do sequestro do radical livre DPPH•......................................................88 Figura 26 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) das frações e subfrações das sementes da garcinia (G. achachairu) e da substância isolada (gutiferona A), pelo método do sequestro do radical livre DPPH•..............................90

Figura 27- Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: SG (sementes de G. achachairu), CG (cascas de G. achachairu), CC (cascas dos frutos da cabeludinha – P. glomerata), PSC (polpas mais sementes da cabeludinha – P. glomerata), RI (frutos de R. imperialis) trolox e vitamina C, pelo método do sequestro do radical livre ABTS•..............................................................91 Figura 28 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: RR (frutos da amora-vermelha – R. rosafolius), CN (cascas dos frutos da naranjila- S. quitoense), SJ (sementes da jacu – D. inconstans) pelo método do sequestro do radical livre ABTS•..............................................................92

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Figura 29 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) das frações e subfrações das sementes de G. achachairu e da substância isolada (gutiferona A), pelo método do sequestro do radical livre ABTS•......................................................94 Figura 30 - Curva de decaimento da intensidade de fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações de trolox........................................................95 Figura 31 - Curva de decaimento da intensidade de fluorescência da fluoresceína na presença do extrato metanólico das sementes de G. achachairu..............................96 Figura 32 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações (µg/ml) da fração 3 das sementes de G. achachairu........97 Figura 33 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença da subfração 3 das sementes da garcinia (G. achachairu).............................................98 Figura 34 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações (µg/ml) da fração 4 das sementes da garcinia (G. achachairu).................................................................................................................98 Figura 35 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença da subfração 4 das sementes da garcinia (G. achachairu).............................................99 Figura 36 - Curva de decaimento da intensidade da fluorescência da fluoresceína na presença da Gutiferona A em diferentes concentrações (µM)..............................................................................................................100 Figura 37 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença do extrato metanólico das cascas de cabeludinha (P. glomerata)................................101 Figura 38 - Gráfico do percentual da atividade de quelação de metais em função das diferentes concentrações do extrato metanólico das sementes de G. achachairu..102 Figura 39 - Atividade citotóxica do extrato metanólico das sementes de G. achachairu e do composto isolado gutiferona A em células de melanoma murino (B16F10).................................................................................................................103 Figura 40 - Atividade citotóxica das frações das sementes de G.achachairu em células de melanoma murino (B16F10)................................................................................................................104

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Identificação das plantas em relação ao nome científico, nome popular, extrato metanólico das suas diferentes partes e suas siglas....................................57 Quadro 2: Rendimento dos extratos metanólicos brutos expresso em gramas e em percentual em relação a massa de frutos utilizados para preparação dos extratos..........................................................................................................58 Quadro 3: Teor de polifenóis totais equivalentes ao ácido gálico por grama de extrato metanólico dos frutos..................................................................................84

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAPH Dicloreto de 2,2'-azobis(2-amidinopropano)

ABTS+. 2,2`-azino-bis (3-etibenzotiazolin) 6-ácido sulfônico

ANOVA Análise de variância

CAT Catalase

CC Cascas da cabeludinha (Plinia glomerata)

CG Cascas da garcinia (Garcinia achachairu)

CJ Cascas da jacu (Diospyros inconstans)

CM Cascas da maná cubiú (Solanum sessiliflorum)

CN Cascas da naranjila (Solanum quitoense)

CSG Casca das sementes da garcinia (Garcinia achachairu)

DMSO Dimetilsufóxido

DPPH 2,2-difenil-1– picrilhidrazil

ERNs Espécies reativas de nitrogênio

EROs Espécies reativas de oxigênio

ET Transferência de elétrons

GAE Equivalente ácido gálico

Gpx Glutationa peroxidase

GSH Glutationa reduzida

GSSG Glutationa oxidada

HAT Transferência de átomo de hidrogênio

MEM Meio Mínimo Essencial

MTT [3-(4,5 – dimetiltiazol-2-il) 2,5 – brometo de difeniltetrazólio

ORAC Capacidade de absorção do radical oxigênio

PBS Salina tamponada com fosfato

PG Polpa da garcinia (Garcinia achachairu)

PJ Polpa da jacu (Diospyros inconstans)

PM Polpa da maná cubiíú (Solanum sessiliflorum)

PN Polpa da naranjila (Solanum quitoense)

PSC Polpa mais semente da cabeludinha (Plinia glomerata)

RL Radical livre

RR Rubus rosafolius

RI Rubus imperialis

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SFB Soro fetal bovino

SG Sementes da garcinia (Garcinia achachairu)

SOD Superóxido Dismutase

TEAC Capacidade antioxidante equivalente ao trolox

SJ Sementes da jacu (Diospyros inconstans)

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 24

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 28

2.1 Objetivo geral ............................................................................................. 28

2.2 Objetivos específicos ................................................................................. 28

3 REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................. 30

3.1 Importância das plantas medicinais .......................................................... 30

3.2 Frutos estudados ................................................................................................. 33

3.2.1 Plinia glomerata ................................................................................................ 33

3.2.2 Garcinia ........................................................................................................... 35

3.2.3 Gênero Rubus .................................................................................................. 38

3.2.3.1 Rubus imperialis ............................................................................................ 38

3.2.3.2 Rubus rosaefolius .......................................................................................... 39

3.2.4 Solanum sessiliflorum....................................................................................... 40

3.2.5 Solanum quitoense Lam. .................................................................................. 42

3.2.6 Diospyros inconstans ....................................................................................... 43

3.3 Radicais livres e estresse oxidativo ........................................................... 44

3.3.1 Metodologias para análise do estresse oxidativo ............................................. 47

3.4 Defesas antioxidantes ......................................................................................... 49

3.5 Atividade citotóxica .............................................................................................. 52

4 METODOLOGIA ..................................................................................................... 56

4.1 Material vegetal ................................................................................................... 56

4.2 Preparação de extratos ............................................................................. 57

4.2.1 Purificação da fraçao de acetato de etila G. achachairu .................................. 59

4.2.2 Caracterização fitoquímica ............................................................................... 60

4.2.3 Doseamento de polifenóis totais ...................................................................... 61

4.2.4 Análise fitoquimica por cromatografia gasosa acoplada em massa ................. 61

4.2.5 Análise fitoquimica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE ........ 62

4.3 Análise da atividade antioxidante .............................................................. 63

4.3.1 Atividade sequestradora do radical DPPH• ...................................................... 63

4.3.2 Atividade sequestradora do radical ABTS• ....................................................... 64

23

4.3.3 Avaliação da atividade antioxidante pelo método ORAC ................................. 64

4.3.4 Avaliação da atividade antioxidante pelo método de quelação de metais. ....... 65

4.4 Cultura celular ..................................................................................................... 66

4.4.1 Tratamento Celular ........................................................................................... 66

4.4.2 Ensaio de Viabilidade Celular ........................................................................... 67

4.5 Análise estatística ............................................................................................... 67

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 68

5.1 Análise fitoquímica...............................................................................................68

5.1.1 Análise fitoquímica preliminar por cromatografia em camada delgada ............ 68

5.1.2 Análise fitoquímica por cromatografia gasosa acoplada ao massa. ................. 74

5.1.3 Análise fitoquímica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE ........ 80

5.1.4 Doseamento de polifenóis totais ...................................................................... 82

5.2 Avaliação da Atividades Biológica........................................................................86

5.2.1Atividade sequestradora do radical DPPH• ....................................................... 86

5.2.2 Atividade sequestradora do radical ABTS• ...................................................... 91

5.2.3 Avaliação da atividade antioxidante pela capacidade de absorção do radical

oxigênio (ORAC). ...................................................................................................... 95

5.2.4 Avaliação antioxidante pelo método de quelação de metais. ......................... 102

5.2.5 Avaliação da atividade citotóxica. ................................................................... 102

6.0 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 106

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 108

24

1 INTRODUÇÃO

Substâncias químicas derivadas de produtos naturais, oriundas de animais,

micro-organismos, minerais e ou plantas, são utilizadas para o tratamento de

doenças desde os primórdios da civilização humana. Desde então, o homem

adquiriu conhecimentos empíricos sobre plantas medicinais, repassando-os às

demais gerações e, por isso, estes exerceram importante papel na descoberta de

muitos medicamentos e constituíram a base da medicina moderna, a qual está

estritamente ligada às plantas medicinais (CECHINEL-FILHO; YUNES, 2001;

BUTLER, 2005; KOEHN; CARTER, 2005; VEIGA-JUNIOR et al., 2005).

As plantas medicinais são utilizadas por diversos motivos, mas

predominantemente pelo baixo poder aquisitivo da população que não consegue

adquirir o medicamento, bem como a busca de terapias alternativas para doenças

crônicas e/ou sem tratamento específico (MALHEIROS et al., 2010). Além destas

razões, as plantas também são importantes para a indústria farmacêutica, visto que

a partir destas pode-se desenvolver medicamentos, tais como os fitoterápicos,

fitofármacos ou protótipos para a síntese de novos fármacos (BARREIRO; BOLZANI,

2009).

Sabe-se que muitos fármacos com ação anti-infecciosa, antitumoral,

cardiovascular, neurológica, imunológica, anti-inflamatória, entre outros, disponíveis

no mercado, ou que ainda estão sendo estudados, são oriundos de fontes naturais,

especialmente de plantas medicinais (CHIN et al., 2006; BUTLER, 2005)

Há alguns anos, o Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR)

do Centro de Ciências da Saúde da UNIVALI - SC pesquisa e avalia várias plantas

utilizadas na medicina popular. Os resultados obtidos são bastante promissores sob

o ponto de vista tanto químico como medicinal (CECHINEL-FILHO, 2000).

Além das partes aéreas, comumente utilizadas em estudos com plantas

medicinais, os frutos de muitas espécies também estão sendo alvos de pesquisas,

visto que estes são ricos em fibras, substâncias antioxidantes, e muitos outros

nutrientes importantes relacionados com a redução do risco de desenvolvimento de

doenças crônicas (ARUOMA et al., 2012).

Estudos mostram que o alto consumo de frutas e hortaliças e a baixa ingestão

de gordura auxiliam na manutenção ou na perda de peso e podem levar a uma

25

diminuição de risco no desenvolvimento de doenças crônicas, como a síndrome

metabólica, doenças cardiovascular e diabetes tipo 2 (FISK et al., 2011). Os

antioxidantes dietéticos presentes nas frutas são cada vez mais estudados com

intuito de reduzir tais doenças (ARUOMA et al., 2012).

Ainda, o consumo de frutas e vegetais pode reduzir o risco de câncer, uma

das principais causas de morte nos países ocidentais. Soerjomataram e

colaboradores (2010) relatam que alguns casos de câncer poderiam ser prevenidos

se a ingestão de frutas e vegetais fosse de 500 g por dia.

As espécies da flora catarinense selecionadas para este estudo já vem sendo

avaliadas pelo NIQFAR. São plantas utilizadas popularmente por possuírem

diferentes propriedades terapêuticas, porém, poucos estudos científicos em relação

aos efeitos citotóxicos e antioxidantes dos frutos foram encontrados na literatura.

A Rubus imperialis mais conhecida como amora-branca ou “amora-do-mato” é

encontrada por toda a região Sul do Brasil. Na medicina popular é utilizada para

diabetes, processos inflamatórios e dolorosos (CECHINEL-FILHO, 2000; NIERO;

CECHINEL-FILHO, 2008).

A amora-vermelha ou “amora-do-mato”, cujo nome científico é Rubus

rosaefolius, apresenta-se como um arbusto de flores brancas. É utilizada para aliviar

cólicas menstruais, inflamação na garganta e diarreia (SILVA; SIQUEIRA, 2000).

Industrialmente seus frutos são utilizados como fonte de flavorizante e corante, já na

culinária, é utilizada na elaboração de doces e geleias (JORGE; MARKMANN,

1993).

Garcinia achachairu pertence à família Clusiaceae. É uma fruta muito

apreciada na Bolívia, seus frutos e folhas são utilizados popularmente para

cicatrização, problemas digestivos e como laxantes. Também é indicada para úlcera

gástrica, inflamações e tratamentos reumáticos (BARBOSA; ARTIOLI, 2007).

Plinia glomerata é conhecida como “cabeludinha”, originária dos estados: Rio

de Janeiro, São Paulo e do Sul de Minas Gerais. Em Santa Catarina ocorre apenas

em áreas de cultivo. Floresce de abril a junho e seus frutos são apreciados de

outubro a dezembro (SERAFIN et al., 2007).

Diospyros inconstans Jacq., espécie nativa do sul do Brasil, conhecida como

fruta-de-jacu-macho ou caqui-do-mato, apresenta hábito arbóreo, constitui fonte de

alimento para aves como jacus e aracuãs, recomendada como ornamental e

apropriada para arborização urbana (CALIL; LEONHARDT; OLIVEIRA, 2001).

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Solanum quitoense Lam. é conhecida como naranjila. É nativa dos Andes,

sendo muito cultivada no Equador, Colômbia e América Central. Seu fruto possui

características arredondadas e sua casca é coberta por pelos (ACOSTA; PÉREZ;

VAILLANT, 2009).

A Solanum sessiliflorun é também conhecida como maná,maná-cubiu, topiro

e tomate de índio, originária da Amazônia Ocidental. É um arbusto ereto e

ramificado, atinge de 1 a 2 m de altura e pode ser cultivada em diversos solos. Seus

frutos são comestíveis e é muito utilizado na culinária (LOPES; PEREIRA, 2005).

Mediante o exposto, este estudo tem a finalidade de verificar se os frutos de

R. imperialis, R. rosaefolius, G. achachairu, P. glomerata, D. inconstans, S.

sessiliflorum e S. quitoense têm realmente papel importante na prevenção e

tratamento de doenças crônicas não transmissivéis, verificando o perfil fitoquímico e

a ação antioxidante e citotóxica in vitro.

27

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

28

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar o perfil fitoquímico e a atividade antioxidante e citotóxica in vitro dos

extratos e frações obtidos dos frutos e sementes de G. achachairu, R. imperialis, R.

rosaefolius, P. glomerata, D. inconstans, S. sessiliflorum e S. quitoense oriundas da

flora catarinense.

2.2 Objetivos específicos

- Obter os extratos dos frutos e sementes por meio da maceração a frio em metanol

e clorofórmio;

- Obter frações semipurificadas por meio de partição líquido-líquido a partir dos

extratos das sementes de G. achachairu;

- Identificar as principais classes de metabólitos secundários presentes nos extratos

metanólicos dos frutos e sementes por meio de cromatografia em camada delgada

usando reativos específicos e padrões autênticos;

- Identificar as classes de metabólitos secundários presentes nos extratos

clorofórmicos e metanólicos dos frutos e sementes de G. achachairu e P. glomerata

por meio de cromatografia gasosa acoplada a espectometro de massa (CG/EM) e

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);

- Verificar a ação antioxidante in vitro dos extratos metanólicos pelo método do

sequestro dos radicais DPPH• e ABTS•, quelante de metais e ORAC;

- Avaliar a citotoxicidade in vitro dos extratos metanólicos pelo método MTT na

linhagem celular de melanoma murino (B16F10).

30

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Importância das plantas medicinais

No planeta existem aproximadamente 500 mil espécies de plantas, no

entanto, há pouca pesquisa sobre o potencial destas em relação ao

desenvolvimento de novos medicamentos. Apenas uma pequena percentagem foi

estudada quanto às características fitoquímicas e biológicas (KOEHN; CARTER,

2005).

No Brasil, há grande diversidade de plantas, que está relacionada às boas

condições climáticas, edáficas (fatores inerentes ao solo) e potencial hídrico. Estes

fatores contribuem para a síntese de inúmeros metabólitos secundários com

potencial atividade biológica (ZUANAZZI; MAYORGA, 2010).

A utilização de plantas medicinais no Brasil se iniciou em virtude da cultura

dos índios que habitavam o país. Posteriormente, sofreu influências dos

colonizadores e de outros povos que aqui vieram habitar (KOEHN; CARTER, 2005;

BALUNAS; KINGHORN, 2005). Embora haja tradição de seu uso em vários biomas,

entre eles Amazônia, Cerrado e a Mata Atlântica, são poucas as pesquisas

etnofarmacológicas e não há estatística sobre o mercado e consumo de plantas

medicinais, apenas há vários relatos sobre o uso de plantas exóticas, em relação às

plantas nativas (VEIGA-JÚNIOR, 2008).

No Brasil o consumo de frutas e vegetais é muito baixo, um dos fatores que

contribuem para mortalidade de acordo com o Relatório Mundial de Saúde. A

Organização Mundial da Saúde (OMS) mostra que 2,7 milhões de vidas poderiam

ser salvas por ano com o consumo necessário de frutas e verduras, pois a ingestão

destes alimentos contribui para a prevenção de doenças crônicas não-transmissíveis

além de assegurar um consumo adequado de micronutrientes e fibras dietéticas

(MOURA et al., 2011).

É estimado que o baixo consumo de frutas e verduras é responsável por

cerca de 19% dos casos de câncer gastrintestinal no mundo, bem como 31% das

doenças cardíacas e 11% de acidente vascular encefálico. A ingestão mínima

recomendável é de 400 g de frutas e vegetais por dia, a fim de prevenir doenças

31

crônicas, como doenças cardíacas, neoplasias, diabetes e obesidade (WAXMAN;

KELLER; PORTER, 2003).

A prevalência de doenças crônicas não transmissíveis cresce rapidamente, e

elementos nutricionais, como vitaminas e minerais são amplamente utilizados como

terapias preventivas a fim de evitar o desenvolvimento ou controlar essas doenças.

Estudos revelam que as frutas exóticas possuem potente capacidade para melhorar

distúrbios metabólicos e suas condições resultantes, porém essas frutas são

escassas em alguns lugares do mundo devido à sua presença limitada e regional

(DEVALARAJA; JAIN; YADAV, 2011).

Reiss e colaboradores (2012), mostraram estimativas de que 20.000 casos

novos de câncer por ano poderiam ter sido evitados com o alto consumo de frutas e

vegetais. Muitas doenças crônicas estão relacionadas com o estresse oxidativo e

muitos alimentos de origem vegetal tem sido capaz de controlar tais distúrbios por

possuirem propriedades antioxidantes. As diferentes classes alimentares possuem

diferentes compostos bioativos e quando consumidos juntos produzem um interação

sinérgica tendo efeitos fisiológicos positivos sobre a saúde (WANG et al., 2012).

Pesquisas aponta o interesse da comunidade científica em caracterizar físico-

quimicamente e quantificar os componentes bioativos de frutas exóticas ou não.

Dentre todos os componentes presentes nessas frutas, aquelas que possuem

atividade antioxidante têm melhor destaque em virtude de proteger o organismo

contra o estresse oxidativo com intuito de evitar doenças originadas por esse

processo (SOUZA et al., 2012).

Cresce o interesse dos pesquisadores em validar as plantas utilizadas na

medicina popular, a fim de desenvolver novos fitoterápicos e fitofármacos, que

possam beneficiar a população com novas opções terapêuticas, fortalecendo assim

as indústrias brasileiras (CECHINEL-FILHO, 1995; YUNES; PEDROSA; CECHINEL-

FILHO, 2001; CECHINEL-FILHO, 2012).

Os produtos naturais, incluindo as plantas medicinais, são utilizados como

forma de tratamento mais acessível para 80% da população de baixa renda, e

movimenta investimentos financeiros em todo o mundo, principalmente em países

em desenvolvimento. No entanto, há pouco conhecimento científico sobre

determinadas espécies vegetais e suas propriedades químicas, toxicológicas e

farmacológicas, que possibilitem segurança e eficácia completa do uso dessas

plantas (MOREIRA-SOUZA; SALGADO; PIETRO, 2010).

32

Para que essas plantas possam ser utilizadas terapeuticamente necessitam

estarem livres de contaminação, precisam ser identificadas, cultivadas e coletadas

de maneira correta, estando livre de material estranho e contaminações inorgânicas

e microbianas. Neste aspecto, um controle de qualidade deve ser realizado desde o

seu plantio até sua comercialização e uso (MOREIRA-SOUZA; SALGADO; PIETRO,

2010).

No Brasil, os registros de medicamentos fitoterápicos, a comercialização e

distribuição de plantas medicinais são regulamentados pela Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA). A implantação da Política Nacional de Plantas

Medicinais e Fitoterápicas (Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006) representou

uma das medidas fundamentais adotadas pelo governo capaz de promover

melhorias na qualidade de vida da população brasileira, mas, também serviu para a

regulamentação da produção e uso de drogas vegetais e fitoterápicos, visando

segurança e eficácia (BRASIL, 2004; 2006; 2010).

A RDC n° 10 de 9 março de 2010, que regulamenta o registro de plantas

medicinais junto à ANVISA, e a RDC nº 14 de 31 de março de 2010, que

regulamenta o registro de fitoterápicos, determinam os aspectos a serem

observados desde a produção, distribuição e uso de plantas medicinais in natura

e/ou utilizados para produção de fitoterápicos, a fim de garantir a qualidade e

eficácia desses produtos, com intuito de promover e reconhecer as práticas

populares e tradicionais do uso de plantas e remédios caseiros na atenção primária

à saúde (VEIGA-JUNIOR 2008; PINHO; PICHONELLI, 2009; BRASIL, 2010a;

2010b).

No contexto atual, 71 plantas fazem parte do RENISUS, Relação Nacional de

Plantas Medicinais de Interesse ao SUS, que tem por finalidade orientar novos

estudos para a elaboração com segurança de fitoterápicos eficazes na prevenção e

tratamento de doenças utilizadas pela população (PINHO; PICHONELLI, 2009;

BRASIL, 2010b).

A fitoterapia se expandiu graças à preferência do consumidor por tratamentos

terapêuticos naturais, surgindo o interesse por produtos naturais como fonte de

substâncias bioativas (SCHMIDT et al., 2008; RISHTON, 2008). Há grande interesse

por parte da indústria alimentícia, das indústrias cosmética e farmacêutica em

substituir os aditivos com ação antioxidante de origem sintética por antioxidantes

naturais, em função de polêmicas sobre possíveis efeitos adversos dos agentes

33

sintéticos e, também, pelo apelo comercial dos derivados naturais (OLIVEIRA et al.,

2009).

Um estudo recente dos autores Newman e Cragg (2012, 2013) mostra que

nos últimos anos as pesquisas na área de produtos naturais vêm crescendo de

forma significativa e, cada vez mais, há descobertas de substâncias bioativas em

diversas plantas, as quais por meio de muitos estudos se tornam medicamentos ao

longo dos anos, tanto para amenizar como para prevenir diversas doenças.

As substâncias bioativas provêm da grande diversidade de espécies na

natureza e podem ser obtidas graças ao avanço nas técnicas de separação,

purificação e identificação de misturas complexas (SCHMIDT et al., 2008; RISHTON,

2008). Uma importante ferramenta para a seleção da matéria-prima tem sido os

testes in vitro, os quais auxiliam na busca por substâncias bioativas, principalmente,

em frutas e vegetais com potencial ação antioxidante (ALVES et al., 2010).

Pode-se citar como resultados dos avanços científicos a descoberta: a) da

hipericina, metabólito ativo da planta Hypericum perforatum, que apresenta atividade

antidepressiva, antiviral e antitumoral e é utilizada para tratar depressão leve a

moderada (SHEN; JI; ZHANG, 2006); b) do diterpeno paclitaxel (Taxol®), o qual foi

isolado da espécie Taxus brevifolia, sendo hoje sintetizado em escala industrial e

empregado no tratamento de neoplasias de ovário, mama e pulmão (BRANDÃO et

al., 2010).

3.2 Frutos estudados

3.2.1 Plinia glomerata

P. glomerata faz parte da família Myrtaceae considerada uma das mais

importantes da Mata Atlântica brasileira. Essa família é formada por grande número

de plantas que incluem matas rasteiras a grandes árvores, encontrada no Sul do

Brasil (OLIVEIRA et al., 2007). Também possui nome científico Myrciaria glomerata,

Eugenia cabelluda e Eugenia tomentosa (SERAFIN et al., 2007).

34

P. glomerata também conhecida como cabeludinha ou jabuticada-amarela é

um arbusto de folhagem densa, ramos pendentes e flexíveis. As folhas são

lanceoladas e aveludadas, com cerca de 11 cm de comprimento em média. Seus

frutos (Figura 1) comestíveis são sésseis com epicarpo espesso e piloso de cor

amarelada. O mesocarpo externo é denso e esbranquiçado, enquanto o interno é

gelatinoso (JORGE; FERRO; OLIVEIRA, 1996).

Figura 1- Frutos maduros e partes aéreas de P. glomerata

Fonte: Tropical Plant Catalog

Muitas espécies de Plinia têm sido estudadas com foco no seu potencial

medicinal, rendendo bons resultados em diferentes modelos experimentais, como a

atividade antidiabética, antimicrobiana, antirreumática, diurética e reguladora do

sistema digestivo (BEZERRA et al., 2006; AGRA et al., 2007; OLIVEIRA et al.,

2007).

Uma pesquisa, realizada sobre o uso popular da P. glomerata com os índios

Parezi (Sapezal - MG) relata que eles utilizavam as partes aéreas da planta para

queda de cabelo, em criança enfraquecida e pessoas debilitadas. Utilizavam na

forma de banhos de imersão em temperaturas frias, mornas ou quentes, variando de

acordo com a doença (MORAIS; MACEDO, 1996).

O extrato bruto metanólico de P. glomerata mostrou atividade antimicrobiana

contra Staphylococcus aureus; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e

Burkholderia cepacia e também potente ação analgésica a qual provavelmente está

relacionada com a presença de substâncias fenólicas (SERAFIN et al., 2007).

O extrato aquoso das folhas de Plinia edulis apresentou atividade antioxidante

in vitro, sendo que na concentração de 20 µg/ml apresentou perfil semelhante ao

35

ácido ascórbico testado nesta mesma concentração. Este mesmo extrato foi

citotóxico para células MCF-7 (linhagem tumoral de mama) (CARVALHO;

ISHIKAWA, GOUVÊA, 2012).

3.2.2 Garcinia

As plantas do gênero Garcinia pertencem à família Clusiaceae, podem ser

encontradas na África tropical, Ásia, Nova Caledônia, Polinésia e Brasil. Neste

gênero são encontrados em abundância substâncias das classes das xantonas,

benzofenonas e biflavonoides, e por isso são atribuídas diferentes atividades

biológicas, como: antioxidante, anti-inflamatória, antimicrobiana e citotóxica

(FOUOTSA et al., 2012; GONTIJO et al., 2012).

O gênero Garcinia, antigamente era conhecido como Rheedia, inclui cerca de

30 gêneros e 1000 espécies. No Brasil ocorrem 18 gêneros de Clusiaceae e cerca

de 150 espécies amplamente distribuídas em regiões tropicais do Brasil (SOUZA;

LORENZI, 2008).

A G. achachairu é originária da região de Santa Cruz – Bolívia, mas está bem

adaptada à Mata Atlântica. Popularmente, essa planta é utilizada como cicatrizante,

digestiva, laxante, antirreumática, antiulcerosa e anti-inflamatória (ALVES et al.,

2000; BARBOSA; ARTIOLE, 2007). Seus frutos são globoso-oblongos, muito

parecidos a uma nêspera, amarelos-alaranjados, com casca grossa, lisa, firme e

resistente e no seu interior a casca é creme-palha (Figura 2). A base peduncular do

fruto é estreita e a calicinal é mais larga. A polpa é branca, suculenta e de textura

mucilaginosa, não adere à casca e após a retirada do fruto a polpa se oxida

rapidamente (BARBOSA; ARTIOLE, 2007).

36

Figura 2 – Frutos maduros e partes aéreas de G. achachairu

Fonte: Informedfarmers

No Brasil, esse fruto é pouco conhecido, muitas vezes confundido pela

população com frutos de outras espécies, como por exemplo, o bacupari, bacuripari

e bacurizinho. Na Bolívia e no nordeste brasileiro seus frutos são comercializados,

porém são raras as pesquisas científicas que abordam esta espécie (BARBOSA;

ARTIOLE, 2007).

Estudos recentes mostraram que o extrato metanólico das sementes e dos

galhos da G. achachairu tem atividade antinociceptiva. Outros resultados dessa

pesquisa mostraram significativa ação antiúlcera relacionada a uma substância

denominada de Gutiferona A (DAL MOLIN, 2009).

Mais recentemente foram avaliados os possíveis efeitos genotóxicos e

clastogênicos do extrato das sementes de G. achachairu em diferentes células de

camundongos. Os resultados mostraram que o extrato não induziu danos ao DNA

em células hepáticas de medula óssea e testiculares em diferentes doses de (500,

1000, 2000 mg/kg) nos tempos de 4h e 24h (MARQUES et al., 2012).

Dal Molin et al. (2012), avaliou a composição química e potencial

antinociceptivo do extrato metanólico e da gutiferona A obtida das sementes de G.

achachairu. Ambos apresentaram ação antinociceptiva nos modelos de dor

induzidos por formalina, capsaicina, glutamato e carragenina.

Muitos estudos vêm sendo realizados com diferentes espécies de Garcinia,

além de utilizarem diversas partes da planta, desde a raiz até seu fruto.

Recentemente Fouotsa et al. (2012), encontraram na casca do caule de G. nobilis

uma nova xantona (caroxantona) a qual foi isolada juntamente com outras seis já

conhecidas. Gartanina e a 8-hidroxicudraxantona G inibiram a enzima α-glicosidase

em concentrações inferiores a 100 µM.

37

A partir do extrato etanólico da casca dos caules de G. bracteata foram

isoladas cinco xantonas e vinte e seis compostos conhecidos. As xantonas 1,4,5,6-

tetrahidroxi-7,8-di(3-metilbut-2-enil)xantona, globuxantona e garcinia xantona E

foram citotóxicas nas concentrações de 2,8; 3,4 e 3,1 µM, respectivamente, contra

células de leucemia humana HL-60 (NIU et al., 2012).

Do extrato metanólico das sementes da G. kola foi isolado quatro

biflavonoides, denominados de GB1a, GB2a, garcinal e ácido garcinóico, os quais

apresentaram atividade antioxidante e inibiram a produção de óxido nítrico em

macrófagos estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) (OKOKO, 2009).

Fu et al. (2012), avaliaram a atividade antioxidante de diferentes extratos das

folhas, raizes e frutos de G. xanthochymus e detectaram que somente o extrato de

acetato de etila apresentou ação semelhante ao butilhidroxitolueno (BHT).

Kaur et al. (2012), isolaram uma benzofenona poli-isoprenilada (14-deoxi-

isogarcinol) e um novo derivado acilfloroglucinol e duas moléculas já conhecidas, o

garcinol e isogarcinol, a partir da fração hexânica dos frutos de G. indica. As

substâncias garcinol e isogarcinol também foram isoladas em grandes quantidades

nas frações mais polares, como a fração clorofórmica e de aceto de etila.

G. mangostana Linn é muito utilizada na medicina tradicional para o

tratamento de dor abdominal, diarreia, feridas infectadas e úlcera, e a parte utilizada

é o pericarpo, fonte de xantonas e outras substâncias bioativas. Alguns estudos têm

sido realizados com essa espécie mostrando sua atividade antioxidante, antitumoral,

antialérgica, anti-inflamatoria, antibacteriana e antiviral (PEDRAZA-CHAVERRI et al.,

2008).

As cascas dos frutos e folhas de G. indica Choisy, conhecida como kokum,

são usados para tratar doenças inflamatórias, dores reumáticas e dores intestinais,

no sistema tradicional indiano. Estudos químicos mostraram que suas cascas

contêm proteínas, taninos, pectina, açúcares, gorduras, ácidos orgânicos, como: (-)-

ácido hidroxicítrico, ácido hidroxicítrico lactona e ácido cítrico; antocianinas,

cianidina-3-glicosídeo e cianidina-3-sambubioside, e os compostos fenólicos

poliisoprenilada garcinol e isogarcinol (KAUR et al., 2012).

Alguns estudos pré-clínicos mostram que G. indica e substâncias isoladas

desta possuem atividade antibacteriana, antifúngica, antiulcerogênica,

cardioprotetora, anticancerígena, quimiopreventiva, efeitos antioxidantes e

antiobesidade (BALIGA et al., 2011).

38

3.2.3 Gênero Rubus

O gênero Rubus pertence à família Rosaceae, subfamília da Rosoideae e

dentro dessa há muitas espécies, sendo que 250 já foram identificadas. Elas são

usadas popularmente em diversas regiões para tratamento da diabetes mellitus,

queimaduras e feridas (PATEL; ROJAS-VERA; DACKE, 2004; NIERO; CECHINEL-

FILHO, 2008).

A família Rosaceae apresenta em torno de 100 gêneros com mais de 250

espécies, grande parte encontrada em climas temperados (JOLY, 1991). Na flora

Brasileira é representada por cinco gêneros, ela é encontrada principalmente no Sul

do país (JORGE; MARKMAN, 1993).

3.2.3.1 Rubus imperialis

R. imperialis é um arbusto encontrado no Sul do Brasil, conhecido

popularmente como amora-do-mato ou amora-branca (Figura 3). Na medicina

popular é usada no tratamento de diversas doenças, como diabetes, processos

inflamatórios e dolorosos (NIERO et al., 1999).

Figura 3 - Frutos maduros e partes aéreas da R. imperialis

Fonte: FloraSBS

39

O extrato metanólico das partes aéreas quando administrados em ratos

normoglicêmicos, na dose de 300 mg/kg, reduziu significativamente as

concentrações plasmáticas de glicose quando comparado com o grupo controle,

confirmando a ação hipoglicemiante relatada pela população (KANEGUSUKU et al.,

2002).

Já o extrato metanólico das folhas, raízes e galhos apresentou atividade

antiespamódica nos modelos de contração induzida por acetilcolina em íleo e

duodeno de cobaias e ratos (EMENDÖRFER et al., 2005).

O extrato metanólico das partes aéreas apresentou também a atividade

antiviral contra herpes simples (HSV-1), cuja atividade foi atribuída à presença de

flavonoides e taninos (MÜLLER et al., 2007).

Uma pesquisa realizada anteriormente com a R. imperialis e R. rosaefolius

demonstrou que extratos e compostos obtidos das raízes de R. imperialis possuem

importante ação antimicrobiana. Uma substância isolada denominada como ácido 3-

O-metil-4-metilelágico, pode ser responsável pelo efeito encontrado (KANEGUSUKU

et al., 2002; ARDENGHI et al., 2006).

Alguns estudos já realizados com extratos de espécies deste gênero

mostraram potencial antimicrobiano e analgésico (THIEM; GOSLINSKA, 2004).

Outra pesquisa fitoquímica identificou presença de compostos triterpênicos,

esteroidais e derivados do ácido elágico (NIERO et al., 1999; KANEGUSUKU et al.,

2002). O composto niga-ichigosideo F1 isolado dessa espécie mostrou ação

antinociceptiva, cujo mecanismo de ação está relacionado com a via dopaminérgica,

glutamatérgica, colinérgica, além de envolver os sistemas taquixinérgico e

oxidonitrégico (ARDENGHI et al., 2006).

3.2.3.2 Rubus rosaefolius

Esta espécie é um arbusto de flores brancas e frutos vermelhos, conhecida

também como “amora vermelha”, “amora do mato” ou “framboesa” (Figura 4)

(JORGE; MARKMAN, 1993). Na medicina popular suas folhas são utilizadas para

aliviar cólicas menstruais, diarreia e inflamação de garganta, seus frutos se

40

consumidos excessivamente têm ação laxante. A indústria utiliza como flavorizante e

corante (COIMBRA, 1994).

Figura 4 - Frutos maduros e partes aéreas da R. rosaefolius

Fonte: Philippine Medicinal Plants

Um estudo das partes aéreas da R. rosaefolius indicou a presença de

triterpenos pentacíclicos: o ácido tormêntico e o ácido 28 -O- metoxitormêntico e de

três esteroides: estigmasterol, sitosterol e campesterol. Os testes de atividade

antinociceptiva demonstraram significantes efeitos na nocicepção de origem

inflamatória. Quando comparados com medicamentos usados clinicamente, o extrato

foi cerca de seis vezes mais potente ( KANEGUSUKU et al., 2002).

3.2.4 Solanum sessiliflorum

A Solanum sessiliflorun (Solanaceae) é também conhecida como maná,

maná-cubiu, topiro e tomate de índio, originária da Amazônia Ocidental (Figura 5)

(LOPES; PEREIRA, 2005). Esta espécie está distribuída em toda a Amazônia

brasileira, peruana e colombiana. Popularmente tem sido utilizada para controlar

hipercolesterolemia, ácido úrico, glicose, hipertensão, enxaqueca e depressão, cujas

funções são atribuídas aos altos teores de niacina (SILVA-FILHO et al., 2005).

41

Figura 5 – Frutos maduros e partes aéreas da S. sessiliflorum

Fonte: Novidades no mercado

Atualmente estão sendo realizados estudos a fim de verificar o período de

conservação, amadurecimento e germinação das sementes de maná-cubiu. Uma

pesquisa realizada recentemente avaliou a qualidade e o período de conservação

pós-colheita de maná-cubiu por meio da caracterização fisico-química e fisiológica

dos frutos mantidos sob condições ambientais (LOPES; PEREIRA, 2005; SILVA;

ROCHA; SALOMÃO, 2011).

Apesar dos frutos serem muito utilizados são poucos os estudos publicados

sobre a espécie, e a maioria é na área de agronomia, com o intuito de estudar o

envelhecimento acelerado, para a avaliação do vigor das sementes de maná-cubiu,

determinação da maturidade de frutos baseados na aparência e na composição

química para colheita e armazenamento (PEREIRA; FILHO-MARTINS, 2010;

SOUZA et al., 2008).

Sandoval (2010), avaliou o efeito antimicrobiano de extratos de S.

sessiliflorum sobre a bactéria Helicobacter pylori. Os resultados mostraram um efeito

inibitório superior a alguns antibióticos de referência disponíveis no mercado.

Ainda, Rincon e colaboradores (2011), avaliaram o teor de compostos

fenólicos e a atividade antioxidante de três variedades de frutos de S. sessiliflorum

pelo método do sequestro do radical DPPH•. Eles verificaram que há boa correlação

entre o teor de polifenóis e a atividade antioxidante (r= 0,9156), por isso, sugeriram

que esses frutos são promissores fontes de alimentos funcionais.

42

Outro estudo relata sobre a atividade antioxidante, o teor de compostos

fenólicos solúveis totais (parte comestível das sementes e cascas) e o teor de ácido

ascórbico (parte comestível) da S. sessiliflorum (CONTRERAS-CALDERÓN et al.,

2011). Porém, ainda são poucos os estudos com estes frutos relacionando o perfil

fitoquímico e a atividade antioxidante.

3.2.5 Solanum quitoense Lam.

A Solanum quitoense cresce em regiões de grande altitude. Ela é nativa dos

Andes e é cultivada para consumo em países da América Central e em alguns

países da América do Sul. A naranjila (Figura 6), como é conhecida, produz um fruto

redondo e sua casca é coberta por pelos. No período de maturação, a naranjila

passa da cor verde para laranja. A fruta contém quatro compartimentos separados

por partes membranosas e preenchidos com polpa, suas sementes são planas e

rígidas (ACOSTA; PÉREZ; VAILLANT, 2009).

Figura 6 – Frutos maduros e partes aéreas de S. quitoense Lam.

Fonte: Products e Services

O estudo conduzido por Acosta; Pérez e Vaillant (2009), verificaram alto teor

de açúcar, principalmente sacarose nos frutos de S. quitoense, e relataram a

43

presença de compostos fenólicos e carotenoides, aos quais atribuíram a atividade

antioxidante.

Em outro estudo foi analisado o extrato comestível da naranjila, detectando a

presença de compostos fenólicos como antocianinas e derivados do ácido

hidroxicinâmico, como também altas concentrações de carotenoides. Isto indica

potencial ação antioxidante destes frutos, o que os torna de interesse nutricional e

de pesquisa (MERTZ et al., 2009).

3.2.6 Diospyros inconstans

D. inconstans é uma espécie nativa do sul do Brasil. Ela é conhecida como

fruta-de-jacu-macho ou caqui-do-mato (Figura 7) e apresenta hábito arbóreo. Esta

espécie constitui fonte de alimento para aves, recomendada como ornamental e

apropriada para arborização urbana (CALIL; LEONHARDT; OLIVEIRA, 2001).

Figura 7 – Frutos maduros e partes aéreas de Diospyros inconstans

Fonte: Fotografias de la flora autoctona del Uruguay

Na literatura não tem muitos artigos relatando essa espécie, porém há artigos

sobre outras espécies de Diospyros. Um estudo recente teve como objetivo a

caracterização fitoquímica e perfil antioxidante da fruta de preto sapote (Diospyros

digyna Jacq.), o qual relatou a presença de compostos fenólicos, carotenoides e

44

tocoferóis e a capacidade antioxidante foi medida pelo DPPH (YAHIA; GUTIERREZ-

OROZCO; LEON, 2011).

3.3 Radicais livres e estresse oxidativo

Radicais livres são espécies químicas que têm um ou mais elétrons não

pareados na última camada eletrônica deixando-os muito instáveis e reativos (GATÉ,

1999).

Espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio

(ERNs) incluem os radicais livres e espécies não radicalares como: ânion superóxido

(O2•-), radical hidroxila (HO•-), alcoxila (RO •-), peróxido de hidrogênio (H2O2), óxido

nitroso (N2O), ácido nitroso (HNO2), nitritos (NO2-), nitratos (NO3

-) e peroxinitritos

(ONOO-) (FERREIRA et al., 2011).

As EROs e ERNs promovem a oxidação de proteínas, lipídeos e ácidos

nucleicos provocando severas mudanças em nível celular, quanto aos aspectos

morfológicos e fisiológicos (KAHARAMAN et al., 2003).

A geração de radicais livres e espécies reativas não radicalares são

originadas do metabolismo do oxigênio, sendo que a principal fonte geradora é a

mitocôndria por meio da cadeia transportadora de elétrons (BARBOSA et al., 2010).

No entanto, existem outras fontes geradoras de espécies reativas: macrófagos e

neutróflos, endotélio, epitélio, sistemas enzimáticos (xantina oxidase, NADPH-

oxidase, NADPH-citocromo P450 redutase, ciclo-oxigenases, óxido nítrico sintetase),

reações com metais (ferro e cobre) via reação de Fenton e de Haber-Weiss, e

reação não enzimática entre os radicais superóxido e óxido nítrico resultando na

geração de peroxinitrito (FERREIRA et al., 2011).

A geração de radicais livres é um processo contínuo e fisiológico. Durante os

processos metabólicos, os radicais agem como mediadores para a transferência de

elétrons nas diversas reações bioquímicas. Quando esses radicais são produzidos

em quantidades adequadas geram ATP (energia), ativam genes e participam de

mecanismos de defesa durante o processo de infecção. Já a produção excessiva

causa danos oxidativos contra células e tecidos (FERREIRA; MATSUBARA, 1997;

HALLIWELL; WHITEMAN, 2004).

45

As espécies reativas têm importante papel fisiológico, pois atuam mantendo

diversas funções celulares como: produção de energia, fagocitose, regulação do

crescimento celular, sinalização intracelular e síntese de substâncias biológicas

importantes (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).

Evidências mostram que o estresse oxidativo ocasionado pelas espécies

reativas tem ação deletéria ao organismo, causando envelhecimento, transformação

e morte celular, o que afeta em alguns processos patológicos, como: indução do

câncer e doenças neurodegenerativas e também na fisiopatologia de doenças

crônicas, por exemplo, doenças autoimunes, cardiopatias, entre outras

(VASCONCELOS et al., 2007).

O radical hidroxila é o mais reativo e mais lesivo. Quando este é formado o

organismo não consegue se defender, causando modificações no DNA, danos nas

proteínas, inativação enzimática, peroxidação lipídica (VASCONCELOS et al., 2007).

As EROS formadas pela redução do oxigênio são: o radical superóxido, o não

radical peroxido de hidrogênio, ácido hipocloroso e o radical hidroxil. O superóxido

pode ser produzido a partir da Co-Q ou de enzimas que contêm metais como

citocromo P450, xantina-oxidase. Quando um superóxido recebe um elétron, ele é

reduzido a peroxido de hidrogênio. O radical hidroxil é formado a partir da reação

entre o ânion superóxido com Fe3+ ou Cu2+ pela reação de Fenton (Figura 8), e a

partir da reação entre o peróxido de hidrogênio com Fe2+, reação de Haber-Weiss

(HAIDAL et al., 2011).

Figura 8: Reação de Fenton ou Haber - Weiss

Fonte: (RESENDE; SALGADO; CHAVES, 2003)

A maioria dos radicais livres formados é removida pela ação do sistema

superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase. No entanto, algumas vezes

46

o ânion superóxido e o peróxido de hidrogênio não são removidos rapidamente, e

assim, eles podem reagir entre si e produzir o radical hidroxil, o qual iniciará uma

cascata de lipoperoxidação causando danos aos tecidos. O peróxido de hidrogênio

gera outras EROs com capacidade ainda maior como, o radical hidroxil e ácido

hipocloroso (PAIXÃO-SILVA et al., 2011).

O peróxido de hidrogênio é convertido pela mieloperoxidase presente no

neutrófilo, em ácido hiplocoroso, uma espécie não radicalar que oxida vários

compostos biológicos (VASCONCELOS et al., 2007).

O estresse oxidativo ocorre em virtude de um desequilíbrio entre a geração de

compostos oxidantes e a defesa antioxidante. O organismo pode sofrer o estresse

oxidativo causado pelas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, as quais podem

ser originárias do próprio organismo ou do ambiente. Entre as milhares de

moléculas-alvo dessas espécies encontram-se as proteínas, os lipídeos e o DNA

(BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).

Todos os componentes celulares são susceptíveis às ações do oxigênio,

porém a membrana celular é a mais atingida em função da peroxidação lipídica, a

qual pode ser avaliada ou utilizada como um indicador do estresse oxidativo. A

reação entre EROs e/ou ERNs e os ácidos graxos poli-insaturados presentes nas

membranas celulares e nas lipoproteínas ocorre por diversos mecanismos, e em

virtude desse processo ser tão complexo é importante avaliar os produtos derivados

da lipoperoxidação, pois estão associados ao envelhecimento e o surgimento de

diversas doenças (LIMA; ABDALLA, 2001).

A lipoperoxidação pode ser definida por uma cascata de eventos bioquímicos

resultante da ação dos radicais livres sobre os lipídeos insaturados das membranas

celulares, levando a destruição de sua estrutura, falência dos mecanismos de troca

de metabólitos e, numa condição extrema, à morte celular. As alterações na

membrana levam a alterações na permeabilidade, alterando fluxo iônico e o fluxo de

outras substâncias, o que resulta na perda da seletividade para entrada e/ou saída

de nutrientes e substâncias tóxicas à célula (LIMA; ABDALLA, 2001).

O processo oxidativo pode estar relacionado à etiologia de diversas doenças

crônicas não transmissíveis, entre elas: aterosclerose, câncer, diabetes, obesidade e

transtornos neurodegenerativos, processos cardiovasculares e carcinogênicos

(GREEN; BRAND; MURPHY, 2004).

47

Em especial, na etiologia do câncer, o estresse oxidativo parece estar

envolvido nos processos oxidativos de iniciação, caracterizados pela mutação do

material genético. Ainda, as espécies reativas podem atuar como promotoras de

oncogenes e inclusive promover alterações genéticas implicadas na metástase

(ROSA; COIMBRA, 2009).

Outra doença envolvendo o processo de estresse oxidativo é a síndrome

metabólica. Esse processo manifesta-se principalmente na resistência insulínica,

alterações na insulina, hiperglicemia, disfunção endotelial, dislipidemia e obesidade.

Essas manifestações estão associadas tanto ao estresse oxidativo como também

aos hábitos de vida e herança genética (FERREIRA et al., 2011).

3.3.1 Metodologias para análise do estresse oxidativo

Os principais mecanismos de substâncias antioxidantes referem-se à

transferência de átomos de hidrogênio (HAT) e de transferência de elétrons (ET).

Muitos dos ensaios baseados em HAT são de reação competitiva entre o substrato e

o antioxidante com intuito de gerar radicais peroxila por meio da decomposição dos

compostos azoiniciadores, cuja ação pode ser monitorada pelos métodos ORAC,

TRAP. Já a transferência de elétron pode ser avaliada pela capacidade antioxidante

equivalente ao trolox (TEAC) e pelo método de redução do ferro (FRAP), pois

medem a capacidade de um antioxidante em reduzir um oxidante, cuja atividade

pode ser monitorada espectrofotometricamente (PRIOR; WU; SCHAICH, 2005).

Existem diversos métodos para analisar a atividade antioxidante, o que

envolve desde ensaios químicos a testes mais complexos utilizando diversas

técnicas instrumentais. Outro aspecto relevante é que existem diferentes tipos de

radicais livres, os quais atuam de maneira diferente no organismo, portanto é difícil

analisar por um único método (ALVES et al., 2010).

O método ORAC avalia a capacidade de absorção de radicais oxigênio utiliza-

se uma substância fluorescente, comumente a fluoresceína como um marcador de

fluorescência, cujo objetivo é medir a diminuição da emissão de fluorescência na

presença de uma azoiniciador gerador de radicais, tal como o AAPH (dicloreto de

2,2'-azobis(2-amidinopropano)) (ALVES et al., 2010).

48

Este ensaio avalia a atividade antioxidante (transferência de átomos de

hidrogênio) por meio da inibição da oxidação da fluoresceína induzida pelo radical

peroxil gerado no meio de reação. A atividade antioxidante de uma dada substância

é determinada através da diferença entre a área da amostra subtraída pela área do

branco (Net ASC), medida pelo decaimento da fluorescência com a adição da

substância antioxidante no decorrer do tempo (ALVES et al., 2010).

O método do ABTS (2,2’-azino-bis (3-etibenzotiazolin) 6-ácido sulfônico)

baseia-se na capacidade das moléculas antioxidantes em reduzir o radical ABTS. A

adição do ABTS com persulfato de potássio em um meio contendo antioxidantes

permite avaliar, por meio do grau da descoloração a capacidade antioxidante. Ele é

solúvel em ambos os solventes aquosos e orgânicos e podem determinar tanto

antioxidantes hidrofílicos quanto lipofílicos (VASCONCELOS et al., 2007).

Um dos métodos mais utilizados para verificar a atividade antioxidante é a

atividade sequestradora do radical DPPH (dicloreto de 2,2’-azobis (2-

amidinopropano), no qual ocorre a doação de um elétron para o radical DPPH

estabilizando-o e por isso este passa de uma coloração violeta para amarelo, cuja

alteração de cor pode se monitorada espectrofotometricamente a 517nm. Muitos

antioxidantes que reagem rápido com radicais peroxila podem reagir lentamente ou

pode ser inerte ao DPPH, devido inacessibilidade estérica (PRIOR; WU; SCHAICH,

2005).

No método de quelação de metais utiliza-se a fenantrolina ou ferrozina como

reagente cromogênico, o que torna a solução alaranjada de acordo com a

quantidade de ferro disponível. Portanto, quanto menor a quelação de íons pela

amostra maior o número de íons disponíveis para reação com ferrozina e maior será

a absorbância (CARVALHO-SILVA et al., 2012).

Predominantemente, os métodos utilizados para avaliar a capacidade

antioxidante visam determinar a habilidade que os antioxidantes têm em sequestrar

os radicais livres gerados no meio da reação; e avaliar a eficiência dos antioxidantes

em inibir a peroxidação lipídica (SILVA et al., 2011).

49

3.4 Defesas antioxidantes

Antioxidantes são substâncias ou moléculas capazes de inibir a oxidação de

outras moléculas, ou seja, são capazes de doar elétrons para o radical livre

inativando-o, tornando ele um composto estável, com intuito de prevenir a sua

superprodução, o que ocasionaria danos oxidativos (LUZ et al., 2011).

A defesa antioxidante tem por finalidade impedir e reduzir os danos

provocados pela ação dos radicais livres e espécies reativas. Esse sistema de

defesa é classificado em enzimático e não enzimático. Os sistemas enzimáticos

consistem de várias enzimas presentes no sistema metabólico e de detoxificação de

xenobióticos, e os sistemas não enzimáticos consistem de substâncias antioxidantes

que têm origem endógena, como por exemplo, a glutationa ou dietética, como a

ingestão de flavonoides, ácido ascórbico, carotenoides, tocoferol, etc (CHORILLI;

LEONARDI; SALGADO, 2007; BARBOSA et al., 2010).

O organismo é protegido por moléculas com atividade antioxidante de fontes

endógenas ou exógenas, obtidas pela alimentação ou suplementação. Algumas

moléculas como: tocoferóis, carotenoides, flavonoides, entre outros, possuem a

função de evitar o ataque de espécies reativas oxigênio e nitrogênio ou regenerar os

prejuízos causados no sistema biológico (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006;

CATANIA; BARROS; FERREIRA, 2009).

As defesas antioxidantes enzimáticas compreendem as enzimas superóxido

dismutase (SOD), catalase (CAT), NADPH-quinona oxidoredutase, glutationa

peroxidase (GPx), e enzimas de reparo (VASCONCELOS et al., 2007, BIANCHI;

ANTUNES, 1999). Desta forma, os agentes antioxidantes enzimáticos, removem

cataliticamente radicais e espécies reativas, protegendo as células e os tecidos do

estresse oxidativo (BIANCHI; ANTUNES, 1999; BERRA; MENCK; DI MASCIO,

2006).

O sistema de defesa enzimático desempenha as seguintes funções: a SOD

catalisa a dismutação do ânion superóxido (O2•-) à peróxido de hidrogênio (H2O2); a

CAT atua na decomposição de H2O2 a O2 e água (H2O) e a GPx, catalisa a redução

de peróxidos em geral, com utilização de glutationa reduzida como co-fator


50

Os antioxidantes possuem diferentes mecanismos de ação, sendo os

principais: o impedimento da formação de radicais livres; interceptação de radicais

livres gerados pelo metabolismo celular ou por fontes exógenas; reparo das lesões

causadas pelas espécies reativas e o aumento da síntese de enzimas antioxidantes

(BIANCHI; ANTUNES, 1999).

A principal função dos antioxidantes é interagir com os radicais livres antes

que esses reajam com as moléculas biológicas, evitando as reações em cadeia.

Assim, os danos causados pelas espécies reativas podem ser reduzidos de acordo

com a atividade das substâncias endógenas e exógenas (PEREIRA; VIEIRA; LIMA,

2011).

A capacidade dos nutrientes antioxidantes em sequestrar radicais livres e

quelar metais têm sido associadas à inibição do excesso na produção de EROS. A

inibição de EROS está relacionada ao impacto benéfico à saúde humana por meio

de modulações de patogênese em diversas doenças tais como: aterosclerose,

hipertensão, doenças cardiovasculares, isquemia, diabetes mellitus, câncer e

doenças neurodegenerativas (SEIFRIED et al., 2007).

Muitos estudos têm mostrado que as frutas são ricas em nutrientes e

compostos antioxidantes como: os carboidratos, os minerais, a vitamina C, os

carotenoides, as substâncias fenólicas, dentre outras, sendo que estes constituintes

se concentram principalmente nas cascas e nas sementes (SOUSA; VIEIRA; LIMA,

2011; VIEIRA; SOUSA; MANCINI-FILHO, 2011).

Os principais antioxidantes dietéticos são algumas vitaminas, compostos

fenólicos e carotenoides. Os compostos fenólicos constituem uma importante classe

de fitoquímicos alimentares, cuja estrutura química contém pelo menos um anel

aromático no qual está ligado uma ou mais hidroxilas. Dependendo do número e da

posição das hidroxilas na molécula, sua ação antioxidante pode variar (KARAKAYA,

2004; CATALAN-BARRAJON et al., 2010).

Dentro do grupo de compostos fenólicos, os mais estudados são os

flavonoides. Eles são formados de dois aneis aromáticos com pontes de três

carbonos condensadas num oxigênio formando um anel intermediário, e são

divididos em diferentes classes: flavonóis, flavanonas, catequinas e antocianidinas

(CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007).

Quimicamente os flavonoides são doadores de elétrons. Na sua estrutura

química tem diversas hidroxilas que possuem ação antioxidante por reagirem e

51

inativarem ânion superóxido, oxigênio singlete, radicais peróxido e estabilizar

radicais livres por meio de hidrogenação ou complexação com espécies oxidantes.

Eles atuam também na inibição do ciclo celular e na indução da apoptose

(MACHADO et al., 2008).

A atividade antioxidante dos flavonoides depende da estrutura e pode ser

determinada por alguns fatores entre os quais: a reatividade como agente doador de

hidrogênios e elétrons; a reatividade perante outros antioxidantes; a estabilidade do

radical flavanoil formado e a capacidade de quelar metais de transição e interação

com as membranas. Os flavonoides são capazes de sequestrar os radicais, muitas

vezes até sendo mais efetivos que outros antioxidantes como, por exemplo, as

vitaminas C e E (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).

Os carotenoides são corantes naturais, cuja estrutura química apresenta

diversas insaturações, sendo que a ação antioxidante é proporcional ao número de

ligações duplas conjugadas, presentes nas moléculas (RAO; RAO, 2007). Os

carotenoides atuam na remoção do oxigênio singlete e de radicais peroxila, sendo o

beta-caroteno, o licopeno, a luteína, a beta-criptoxantina, a zeaxantina e a

astaxantina as substâncias mais citadas na literatura por sua ação antioxidante

(MÜLLER; FRÖHLICH; BÖHM, 2011).

A vitamina C também conhecida como ácido ascórbico possui diferentes

funções no organismo: cofator para diferentes enzimas, ação antioxidante e

participação no metabolismo iônico de minerais (CARDOSO; COZZOLINO, 2009).

Ela proporciona proteção contra a oxidação descontrolada no meio aquoso das

células, em virtude do seu alto poder redutor (COUTO; CANNIATTI-BRAZACA,

2010).

O ácido ascórbico é considerado um dos mais importantes antioxidantes

hidrossolúveis no organismo, sendo capaz de eliminar diversas espécies de radicais

livres e reduzir radicais tocoferóis novamente a sua forma ativa nas membranas

celulares, mantendo a sua integridade em células do organismo. Alguns estudos

mostram que essa vitamina pode prevenir mutações causadas por estresse oxidativo

(OLIVEIRA et al., 2011).

A vitamina E, cuja forma mais ativa é o α-tocoferol, pode ser encontrada em

lipoproteínas e em membranas, e sua ação antioxidante deve-se ao bloqueio da

lipoperoxidação por meio do sequestro do radical peroxila (SOUSA et al., 2007). O

radical peroxila oxida a vitamina E gerando o radical tocoferoxila (radical estável), e

52

que posteriormente é regenerado à vitamina E pela ação do ácido ascórbico, além

da glutationa e ácido úrico, que também são agentes de regeneração presentes no

plasma (JORDÃO JUNIOR et al., 1998).

A ação das substâncias antioxidantes, seja de fonte endógena ou exógena,

ocorre por meio da minimização ou até da remoção das substâncias oxidantes cuja

ação ocorre em algum dos três estágios do processo de oxidação: iniciação,

propagação ou término (CARDOSO; COZZOLINO, 2009).

Uma estratégia para a redução do estresse oxidativo e dos seus

consequentes danos à saúde, é a utilização de plantas frescas e/ou secas, bem

como de produtos alimentícios, cosméticos e fitoterápicos preparados à partir de

plantas com ação antioxidante (WAN-IBRAHIM; SIDIK; KUPPUSUAMY, 2010).

A descoberta dos efeitos deletérios que os radicais livres causam sobre as

células e sua possível relação com algumas doenças tanto como causador quanto

agravante, induzem a pesquisa de novas substâncias que possam minimizar ou até

mesmo prevenir os danos oxidativos às células (ALVES et al., 2010).

Muitas pesquisas estão voltadas para encontrar produtos naturais com

atividade antioxidante, em virtude dos possíveis problemas que os antioxidantes

sintéticos podem causar, os quais podem ser substituídos pelos naturais ou serem

associados (SOUSA et al., 2007).

3.5 Atividade citotóxica

A palavra câncer refere-se ao termo neoplasia, isto é, tumores malignos,

caracterizados não somente pelo crescimento descontrolado de células

transformadas, mas pela capacidade de se diferenciarem e invadirem tecidos e

órgãos, vizinhos ou distantes. Esta capacidade invasiva é denominada de metástase

(ALMEIDA et al., 2005).

O desenvolvimento do câncer é um processo complexo de vários estágios, e

que normalmente está relacionado a alterações genéticas, as quais podem ser

desencadeadas por múltiplos fatores, classificados em genéticos e ambientais. A

célula tumoral pode ser decorrente de uma mutação direta e consequente ativação

de oncogenes, ou inativação de genes supressores de tumor, o que resulta em

53

proliferação descontrolada, e deflagração do câncer (DORAI; AGGARWAL, 2004;

BYRNE et al., 2006; BENSON; LIAU, 2008).

Evidências sugerem que, para ocorrer a proliferação descontrolada das

células tumorais, além da alteração no DNA, ocorre significativa alteração no

metabolismo energético das células neoplásicas e consequente aumento na geração

de espécies reativas de oxigênio (LÓPEZ-LÁZARO, 2010).

A hereditariedade é um importante fator para o desenvolvimento do câncer,

mas, a maioria dos casos está relacionada a fatores externos associados aos

hábitos de vida, que podem induzir mutações genéticas tais como: contaminação por

metais, radiações, excesso de produção de espécies reativas de oxigênio e

nitrogênio, inflamações crônicas e xenobióticos (medicamentos, tabaco, álcool,

pesticidas, etc.), os quais podem ser determinantes até mesmo, no tipo de tumor

desenvolvido (DORAI; AGGARWAL, 2004; ALMEIDA et al., 2005; BENSON; LIAU,

2008).

No Brasil, as estimativas para o ano de 2012/2013 apontam para a ocorrência

de aproximadamente 518.510 casos novos de câncer, incluindo os casos de pele

não melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. É esperado

um total de 257.870 casos novos para o sexo masculino e 260.640 para o sexo

feminino sendo que as regiões Sul e Sudeste, de maneira geral, apresentam as

maiores taxas (INCA, 2012).

Os três principais tipos de tratamento para o câncer são: cirurgia, radioterapia

e quimioterapia. Na prática clínica, os agentes antineoplásicos são de extrema

importância, classificados de acordo com os grupamentos químicos e a ação sobre o

ciclo celular, sendo classificados em: ciclo-celular específicos e ciclo-celular não

específicos, denominados ainda, de agentes alquilantes (ALMEIDA et al., 2005).

Os quimioterápicos atuam de forma não específica, isto é, destroem ou

inibem o crescimento tanto de células neoplásicas como células normais,

especialmente as de crescimento rápido, como as gastrintestinais, capilares e as do

sistema hematopoiético e imunológico. Tal evento, explica boa parte dos efeitos

colaterais da quimioterapia, tais como: náuseas, vômitos, diarreia ou constipação,

perda de apetite e peso, alopecia, suscetibilidade às infecções, dor, febre,

depressão, e outros efeitos adversos (ALMEIDA et al., 2005; COOLBRANDT et al.,

2011).

54

Dentre alguns produtos naturais citotóxicos utilizados têm-se os alcaloides

vegetais como os alcaloides da vinca (vimblastina e vincristina), que inibem o fuso

mitótico, ligando-se às proteínas microtubulares, interrompendo a divisão celular na

metáfase. O taxol (Paclitaxel®) o qual inibe o fuso mitótico, pois promove a

estabilização dos microtúbulos, protegendo-os da despolimerização, o que resulta

no bloqueio da multiplicação celular e na perda da viabilidade celular. As

podofilotoxinas etoposida e teniposida, derivados semissintéticos da podofilotoxina

extraída da raiz Polophyllum peltatum, que bloqueiam as células nas fases S e G2 e

inibem a enzima topoisomerase II (ALMEIDA et al., 2005; COOLBRANDT et al.,

2011).

Os antioxidantes dietéticos podem ser benéficos na prevenção da neoplasia

em virtude do seu papel em função da resposta imune, pois as células fagocitárias

produzem radicais livres como defesa ao organismo contra a infecção gerada e a

ingestão adequada desses antioxidantes é relevante para prevenir danos causados

pelos oxidantes das próprias células imunes (MACHADO et al., 2008).

56

4 METODOLOGIA

4.1 Material vegetal

Os frutos de R. imperialis (V.C.Filho 012) e R. rosaefolius (V.C.Filho 035)

foram coletados na comunidade de São Sebastião no município de Treze de Maio -

SC; os frutos de G. achachairu (HBR 52637) no município de Camboriú – SC; e os

frutos de P. glomerata (V.C.Filho 52), D. inconstans (V.C.Filho 55), S. sessiliflorum

(V.C.Filho 53) e S. quitoense (V.C.Filho 54) foram obtidos na Epagri do município de

Itajaí – SC. As espécies foram identificadas pelo professor Dr. Oscar B. Iza da

Univali e uma exsicata foi registrada e depositada no herbário Barbosa Rodrigues de

Itajaí – SC.

No quadro 1 está reprentado a identificação das plantas em relação ao nome

científico e popular, além da parte da planta utilizada e sigla adotada para descrição

no texto e apresentação de gráficos e tabelas

57

Quadro 1 - Identificação das plantas em relação ao nome científico, nome popular, extrato metanólico das suas diferentes partes e sua sigla.

Nome Científico Nome popular Extrato metanólico Sigla

Garcinia achachairu

Garcinia achachairu

Garcinia achachairu

Garcinia achachairu

Garcinia Sementes

Cascas das sementes

Polpa

Cascas dos frutos

SG

CSG

PG

CG

Garcinia

Garcinia

Garcinia

Solanum quitoense

Solanum quitoense

Naranjila

Naranjila

Polpa

Cascas dos frutos

PN

CN

Rubus rosaefolius amora-vermelha Frutos RR

Diospyros inconstans



Jacu

Jacu

Jacu

Cascas dos frutos

Polpa

Sementes

CJ

PJ

SJ

Solanum sessiliflorun

Solanum sessiliflorun

Maná

Maná

Cascas dos frutos

Polpa

CM

PM

Rubus imperialis amora-branca Frutos RI

Plinia glomerata

Plinia glomerata

cabeludinha

cabeludinha

Cascas dos frutos

Polpa + sementes

CC

PSC

Derivados da fração Acetato de Etila obtida a partir do extrato metanólico das

sementes da Garcinia

Fração 1 (15-60)

Fração 2 (61- 120)

Fração 3 (121-170)

Fração 4 (171-176)

Garcinia Sementes da Garcinia

Sementes da Garcinia



Fr. 1

Garcinia Fr. 2

Garcinia Fr. 3

Garcinia Fr. 4

Subfração 3 (5 - 67)

Subfração 4 (76-88)

Garcinia

Garcinia



Sub-Fr. 3

Sub-Fr. 4

4.2 Preparação de extratos

O material moído e seco (frutos) foi macerado com metanol durante sete dias,

com troca do solvente no quarto dia a fim de renovar o líquido extrator e esgotar a

58

droga vegetal. Após término do processo de maceração, o solvente foi evaporado à

pressão reduzida em rotaevaporador à 50°C e acondicionado em recipiente

previamente tarado em dessecador até peso constante para determinação do

rendimento total do extrato (Quadro 2). Os extratos obtidos foram denominados de

“Extrato Metanólico Bruto” (CECHINEL-FILHO; YUNES, 1998).

Quadro 2: Rendimento dos extratos metanólicos brutos expresso em gramas e em percentual em relação a massa de frutos utilizados para preparação dos extratos.

Nome Científico Extrato

metanólico

Massa dos

frutos (g)

Massa do

extrato MeOH

(g)

Rendimento

%

Garcinia achachairu Semente 38,57 5,17 11

Garcinia achachairu Casca da

semente 49,40 10,56 9

Garcinia achachairu Polpa 345,0 37,18 13

Garcinia achachairu Casca do fruto 489,0 43,77 21

Solanum quitoense Polpa 304,70 11,91 7

Solanum quitoense Casca do fruto 142,35 3,83 5

Rubus rosaefolius Fruto 70,53 4,79 9

Diospyros inconstans Casca do fruto 82,90 7,13 5

Diospyros inconstans Polpa 82,90 4,51 3

Diospyros inconstans Semente 94,94 4,72 3

Solanum sessiliflorun Casca do fruto 166,78 4,71 4

Solanum sessiliflorun Polpa 144,84 4,62 3

Rubus imperialis Fruto 67,0 3,89 6

Plinia glomerata Casca do fruto 406,0 36,12 9

Plinia glomerata Polpa +

semente 366,0 24,13 7

Paralelamente, uma alíquota do extrato metanólico (100 mg) foi solubilizado

com cerca de 2 ml de clorofórmio, filtrado e evaporado o solvente. Um solução de 2

59

mg/ml em clorofórmio foi preparada e injetada diretamente no cromatógrafo gasoso.

O mesmo procedimento foi realizado para o extrato metanólico analisado via CLAE.

No entanto, o solvente utilizado foi o metanol e a solução injetada na concentração

de 0,31 mg/ml.

Considerando a fácil coleta e rendimento, o extrato bruto das sementes de G.

achachairu foram particionados com diferentes solventes de polaridade crescente,

como diclorometano, acetato de etila e butanol para a obtenção das respectivas

frações semi-purificadas e possibilitar um estudo fitoquímico mais aprofundado

(HOSTETTMANN, 1997; NIERO et al., 2003).

4.2.1 Purificação da fração de acetato de etila de G. achachairu

Considerando que o extrato metanólico das sementes mostrou melhor perfil

cromatográfico, esta foi selecionada para procedimentos de purificação por meio de

cromatografia em coluna.

Neste sentido, 700 mg foi submetida à usando cromatografia de coluna (CC)

em sílica gel (85,98g) em uma coluna de dimensão 3,5x50 cm empacotada com

CHCl3 100% e eluída com CHCl3:MeOH aumentando-se gradativamente a

polaridade. Foram coletadas 176 frações de aproximadamente 20 ml cada. As

frações foram reunidas conforme perfil semelhante, através de cromatografia em

camada delgada (CCD) em quatro frações: fração 1 (15-60); fração 2 (61-120);

fração 3 (121-170) e fração 4 (171-176).

A fração 4 (171-176; 173,67 mg) foi recromatografada utilizando sistema de

cromatografia flash, sílica gel (10,242 g) de granulometria 70-230 mesh (Φ = 0,063-

0,20 nm), empacotada com 95:05 CHCl3:MeOH e eluída com o mesmo sistema de

solventes. Rendendo 90 novas subfrações, que foram reunidas de acordo com a

semelhança analisada por CCD. A subfração 4 (76-88; 34,9 mg) eluída CHCl3:MeOH

80:20% apresentou-se como um sólido amorfo e coloração marrom e está em

processo de identificação.

A fração 3 (121-170; 179,3 mg) foi recromatografada em CC, utilizando sílica

gel (8,47g), empacotada com 100% CHCl3 e eluída com CHCl3 e MeOH aumentando

gradativamente a polaridade, rendendo 77 subfrações, que foram reunidas de

60

acordo com perfil semelhante, através de CCD. A subfração 3 (5-67; 49,3 mg) eluída

CHCl3:MeOH 95:05% apresentou-se como um sólido amorfo e coloração marrom e

está em processo identificação. Um fluxograma das operações realizadas encontra-

se na Figura 9.

Figura 9: Fluxograma das operações realizadas para purificação da fração acetato

de etila das sementes de Garcinia achachairu.

4.2.2 Caracterização fitoquímica

Alíquotas dos extratos metanólicos e das frações foram analisadas por meio

de cromatografia em camada delgada (CCD), na tentativa de estabelecer o perfil

fitoquímico dos frutos. As amostras foram eluídas com diferentes sistemas de

solventes com aumento gradual de polaridade, para melhor resolução e perfil

cromatográfico. As diferentes classes de compostos foram reveladas com reagentes

61

específicos como: anisaldeído sulfúrico para terpenos e esteroides; cloreto férrico

para fenólicos; hidróxido de potássio para cumarinas; dragendorff para alcaloides;

entre outros (UGAZ, 1994).

4.2.3 Doseamento de polifenóis totais

O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método

espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, utilizando ácido gálico como padrão. O

reagente de Folin-Ciocalteau é uma solução de íons complexos poliméricos

formados a partir de heteropoliácidos fosfomolibdicos e fosfotúngsticos. Esse

reagente oxida os fenolatos, reduzindo os ácidos a um complexo azul que pode ser

monitorado espectrofotometricamente a 750 nm (SINGLETON; ROSSI JR, 1965;

SOUSA et al., 2007).

A curva de calibração foi construída utilizando como padrão o ácido gálico

(Vetec®) 99% de pureza. As leituras das absorbâncias foram realizadas em

comprimento de onda de 750 nm em espectrofômetro de absorção UV-Visível marca

Spectrophometer SP 2000 UV (Bel Photonics). Para determinação do teor de

polifenóis nas amostras, os extratos foram dissolvidos em metanol e diluídos em

água destilada. O cálculo foi realizado por meio da equação da reta obtida pela

curva de calibração e o resultado expresso em equivalente de ácido gálico/mg de

extrato.

4.2.4 Análise fitoquímica por cromatografia gasosa acoplada em massa.

A análise por cromatografia gasosa acoplada ao massa foi realizada

utilizando um cromatógrafo gasoso Shimadzu (Modelo QP – 2010s série) equipado

com injetor AOC – 20i e uma coluna de sílica fundida – TRX-1 (30 m x 0,25 mm),

espessura 0,1 µm. A temperatura do injetor foi de 300°C e a do forno iniciou a 80°C

permanecendo por 1 minuto em seguida a velocidade de aquecimento foi a uma

taxa de 25ºC/min até 210ºC. Logo a velocidade foi novamente alterada de 15ºC/min

62

até 290ºC, finalizando numa taxa de 12ºC/min até 310°C permanecendo por 10 min.

Como gás de arraste foi utilizado o hélio (99,999%) a uma taxa constante baixa 0,80

ml/min.

As amostras de G. achachairu e P. glomerata (2 µl) foram injetadas a uma

razão de proporção de 40:1. A linha de transferência MS foi mantida na temperatura

de 250°C acoplada ao detector de massas equipado com um software database

NIST08. A identificação dos compostos foi realizada por comparação dos dados da

biblioteca NIST08.

4.2.5 Análise fitoquímica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE

A análise foi conduzida utilizando um cromatógrafo de alta perfomace

(Waters) equipado com uma bomba 600-F 717 e amostrador automático, seguido

pela linha eliminadora de gás AF e equipado com detector visivel (PDA 2996). A

coluna empregada foi fase reversa C18 (25 cm; 4,6 d.i; 0,5 µm de espessura; Luna,

Phenomenex) a 25°C.

A separação cromatógrafica foi realizada sob fluxo de eluente de 0,9 ml/ min

com gradiente de polaridade, utilizando-se metanol: acetonitrila: água (acidificada

com H3PO4; pH 3,57), na proporção inicial de 8:2:90, passando para 88:2:10 em 25

minutos. A varredura do espectro UV-Vis foi realizada de 200-400 nm (detecção de

256 nm). Os solventes utilizados eram de grau HPLC, todos foram filtrados (0,2 µm,

Scheicher e Shuell, Maidstone, Kent, UK) e desgaseificados através do ultrassom

antes do uso. As amostras foram injetadas (0,31mg/ml) automaticamente em

volumes de 20µl e comparado com quercitrina (0,31mg/ml), para a P. Glomerata e

gutiferona A para G. achachairu.

63

4.3 Análise da atividade antioxidante

4.3.1 Atividade sequestradora do radical DPPH•

O método DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) tem como base a redução da

absorbância na região do visível (comprimento de onda de 517 nm) do radical

DPPH• por antioxidantes (BRAND-WILLIAMS et al., 1995).

Para a avaliação da atividade antioxidante, foram preparadas soluções

metanólicas de cada extrato na concentração de 1 mg/ml, as quais foram diluídas

sequencialmente. Para a semente da garcínia, polpa + semente da cabeludinha e

casca da cabeludinha as concentrações variaram de 3,125 à 50 µg/ml. Para os

demais extratos as concentrações variaram de 7,8 à 250 µg/ml.

Em seguida foi adicionado 1 ml da solução de DPPH• 0,004%, que após

homogeneização foram incubadas protegidas da luz em temperatura ambiente

durante 30 minutos.

Os experimentos foram efetuados em triplicata de triplicata e o percentual do

radical DPPH nas amostras calculado pela seguinte equação:

% de DPPH• = [(A - BA) x 100]/ C,

onde:

A: absorbância das amostras (com DPPH•)

BA: absorbância do branco das amostras (sem DPPH•)

C: absorbância do controle negativo (100 % de DPPH•)

A percentagem de atividade antioxidante corresponde à quantidade de DDPH•

consumida pelo antioxidante, sendo que a quantidade de antioxidante necessária

para decrescer a concentração inicial de DPPH• em 50% foi denominada de

concentração efetiva (CE50). Quanto maior o consumo de DPPH• por uma amostra,

menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante.

A atividade das amostras foi comparada com as vitaminas C e E,

determinadas por meio da obtenção da curva padrão de trolox (análogo à vitamina

E) e da vitamina C, analisadas nas mesmas condições.

64

4.3.2 Atividade sequestradora do radical ABTS•

A atividade antioxidante dos extratos foi avaliada pela atividade redutora

frente ao radical ABTS•, o cátion do ácido 2,2'-azinobis-(3-etil-benzotiazolino-6-

sulfônico) foi obtido pela reação entre ABTS (7 mM) com persulfato de potássio (2,45

mM) após um período de 12 horas à temperatura ambiente, no escuro e sob

agitação, segundo metodologia descrita por Re e colaboradores (2003). A redução

do radical ABTS• por substâncias antioxidantes doadoras de hidrogênio pode ser

monitorada espectrofotometricamente pelo desaparecimento da cor verde em 734

nm.

O radical formado foi diluído com etanol até absorbância de 0,7 ± 0,2 à 734

nm. Em 1 ml das diluições de cada extrato foi adicionado 3 ml do radical ABTS•, e

após 6 min de reação no escuro foi efetuada a leitura. A atividade das amostras foi

comparada com a vitamina C e com a vitamina E, analisadas nas mesmas

condições.

4.3.3 Avaliação da atividade antioxidante pelo método ORAC

Esse método consiste em avaliar a capacidade de absorção do radical

oxigênio (ORAC) por uma substância antioxidante, gerado no meio de reação após a

adição de um agente azoiniciador como o AAPH (dihidrocloreto de 2,2'-azobis(2-

amidinopropano) que oxida uma proteína fluorescente, e o decaimento da

fluorescência indica a oxidação desta em função do tempo (CAO; ALESSIO;

CUTLER, 1993).

O método do ORAC baseia-se em um mecanismo de transferência de átomos

de hidrogênio que mede a capacidade de captura de um radical específico, o peroxil,

gerado a partir de uma molécula orgânica de AAPH (ZULUETA; ESTEVE; FRÍGOLA,

2009).

O experimento foi realizado em placa de 96 poços. Foi adicionado 50 µl da

solução de fluoresceína (80 nM), 50 µl das amostras testadas ou 50 µl do tampão

fosfato sódio 75 mM (pH 7,4) nos poços controles (branco), os quais foram

65

incubados à 37 °C por 15 minutos. Após, foi adicionado 100 µl de APPH (200 mM).

A atividade antioxidante foi monitorada cineticamente a cada 2 minutos durante 80

minutos após a adição do AAPH, em leitor de microplaca marca TECAN-GENios

com filtro de excitação 485 nm e de emissão 528 nm. A atividade antioxidante das

substâncias está expressa como área sob a curva de fluorescência integrada ao

longo do tempo (ti: tempo inicial e tf: tempo final) usando o software GraphPad

Prisma®. O procedimento foi realizado em triplicata para cada amostra em cada

concentração. Os resultados foram expressos em unidades de ORAC e em

milimoles equivalentes de trolox/g.ml-1 de extrato (mM TE/g.ml-1 de extrato). Assim,

os maiores valores de TE significam maior capacidade antioxidante da amostra

(POBLETE et al., 2009).

ORAC= ___[ASC – ASCº]____ . f (referência)

[ASCreferência – ASC°]

Onde:

ASC = Área sob a curva na presença das amostras testadas, integradas entre o

tempo zero e 80 minutos;

ASCº = Área sob a curva do controle (branco).

ASCreferência= Área sob a curva para o composto de referência (trolox – 25 µM).

f = fator de diluição, igual à razão entre o volume total de AAPH+fluoresceína e o

volume da amostra;

(referência) = concentração do composto referência (trolox) em mM

4.3.4 Avaliação da atividade antioxidante pelo método de quelação de metais.

Esse método tem por finalidade medir a atividade antioxidante baseada na

capacidade de quelação do íon ferro. O ferro é o elemento mais importante na pró-

oxidação lipídica, entre os metais de transição, sendo de alta reatividade. A

fenantrolina pode quantitativamente formar complexos com o Fe2+. Na presença de

agentes quelantes, a competição dos quelantes com a fenantrolina pelo ferro, resulta

no descrécimo da coloração. Quando ocorrem baixas absorbâncias indicam alta

66

atividade quelante de metal (DECKER; WELCH, 1990; TANG et al., 2002; GULÇIN,

2006).

Em cada tubo contendo 50 µl de diferentes concentrações dos extratos

metanólicos (100, 75, 50, 25 10 µl) ou controle negativo (sem tratamento) foi

adicionado 50 µl da solução de sulfato ferroso 2 mM, e o volume completado com

água destilada até o volume final de 2 ml, os quais foram agitados e incubados por

10 minutos em local escuro. Após essa etapa foi acrescentado 200 µl fenantrolina

em cada tubo, agitado e incubado por 10 min., em seguida foi realizado a leitura da

absorbância a 510 nm. Como controle positivo foi utilizado EDTA numa

concentração de 10 mM.

4.4 Cultura celular

Para avaliação da atividade citotóxica in vitro foram utilizadas células tumorais

B16F10 (melanoma murino), obtidas do Banco de Células do Rio de Janeiro.

As células foram mantidas em garrafas plásticas de cultura, contendo meio

DMEM (Dulbecco´s Modified Eagles Medium), suplementado com 10% de soro fetal

bovino, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 50 µg/ml de anfotericina

B, 10 mM HEPES, pH 7.4, em estufa umidificada a 37 oC e com 5% CO2. Antes da

realização dos experimentos, o número de células viáveis foi avaliado pelo método

de Azul de Trypan (FRESHNEY, 1987) e a contagem realizada em câmara de

Neubauer.

4.4.1 Tratamento Celular

Os extratos foram dissolvidos em DMSO (dimetilsulfóxido) e utilizados

imediatamente após a preparação das suspensões, os quais foram diluídos em meio

de cultura a fim de obter as concentrações desejadas nos experimentos. As células

(3 x 104) foram incubadas com os extratos em placas de 96 poços em diferentes

tempos. Foram utilizados controles de células sem tratamento e com o diluente

67

DMSO nas mesmas proporções utilizadas para dissolver os extratos. A

concentração máxima de DMSO adicionada às células foi de 0,1%.

4.4.2 Ensaio de Viabilidade Celular

A viabilidade celular foi analisada pelo método MTT [3-(4,5-Dimetilthiazol-2-il)-

2,5-difeniltetrazólio brometo] (MOSMANN, 1983). O MTT é um sal de tetrazólio de

cor amarela, que é reduzido a formazan, de cor violeta, pelas desidrogenases

mitocondriais das células viáveis. Decorrido o tempo de incubação, o meio de cultura

foi retirado e acrescentado um novo meio contendo o MTT (0,5mg/ml) seguido de

incubação por 2 horas, a 37°C. Este meio foi retirado e o precipitado formazan

dissolvido com DMSO e a leitura feita em leitor de microplacas Spectrostarnano

(BWG-LABTECH) a 540 nm. A densidade óptica obtida do grupo controle, células

sem tratamento, foi considerado como 100% de células viáveis, a fim de estabelecer

as curvas de concentração vs resposta .

4.5 Análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. Para

comparação das médias aritméticas foi utilizado a análise de variância (ANOVA) e o

teste de Tuhey, usando o software Prisma 6,0 (GrahPad Prisma) e o programa

Instat®. Adotou-se o nível de significância de 5% de probabilidade (p<0,05).

68

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análise Fitoquímica

5.1.1 Análise fitoquímica preliminar por cromatografia em camada delgada

A cromatografia em camada delgada - CCD é uma técnica que embora

simples, é muito utilizada em screening fitoquímicos na tentativa de detectar

diferentes classes de substâncias em extratos vegetais. No entanto, quando se

trabalha com extratos, oriundos dos frutos, observa-se um certo grau de dificuldade

na caracterização e no isolamento das substâncias bioativas, em função do alto teor

de açúcares.

As figuras 10A e 10B mostram o perfil fitoquímico das diferentes partes de G.

achachairu utilizando diferentes eluentes e reveladas com anisaldeído sulfúrico e

cloreto férrico, respectivamente. Como pode ser observado, apenas o extrato das

sementes quando eluído na proporção 65:35 (hexano:acetona) e revelado com

anisaldeído apresentou manchas características de compostos mais apolares

semelhantes a esteróis e terpenoides. Por outro lado, os demais extratos mostraram

substâncias de caráter mais polares com retenção total das manchas no ponto de

origem da cromatoplaca. Considerando que o extrato metanólico das sementes

apresentou melhor perfil cromatográfico, foi analisada em comparação a alguns

compostos previamente isolados de outras espécies. Nesta análise, é possível

observar apenas a presença de gutiferona A, quando revelada com cloreto férrico

(Figura 10B).

69

Figura 10 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos de diferentes partes dos frutos de garcinia (G. achachairu) comparados com diferentes padrões comumente encontrados em plantas e isolados em outras partes de G. achachairu.

GC (casca dos frutos da garcinia); GCS (casca das sementes da garcinia); GS (sementes da garcinia); GP (polpa da garcinia); GA (gutiferona A); V (volkensiflavona) Eluentes - A: 65:35 hexano/acetona; B: 80:20 clorofórmio/metanol. Reveladores: 10A: Anisaldeído sulfúrico; 10B: Cloreto férrico.

Marques e colaboradores (2012), analisaram o perfil fitoquímico do extrato

metanólico das sementes de G. achachairu e detectaram a presença de doze

compostos, dos quais sete foram identificados, sendo o composto majoritário a

Gutiferona A (Figura 11).

Um estudo de Okoko (2009), mostrou que o extrato metanólico das sementes

de Garcinia kola após procedimentos de cromatografia em coluna rendeu cinco

frações. Na fração ME4 observou-se a presença de quatro compostos: os

biflavonoides GB1 e GB2, o ácido garcinal e o ácido garcinoico, aos quais foi

atribuída a atividade antioxidante encontrada no extrato das sementes G. kola. No

entanto, em nosso trabalho não foi evidenciado estes compostos, quando analisados

por CCD.

70

Figura 11 – Estrutura química da Gutiferona A isolada do extrato metanólico das sementes de G. achachairu.

Fonte: Dal Molin e colaboradores (2012)

Em relação aos frutos da maná-cubiu (S. sessiliflorum) e amora-vermelha (R.

rosaefolius) quando avaliados por CCD, foi observado que todas as amostras dos

extratos, ficaram retidos na origem da cromatoplaca nos sistemas de eluentes

utilizados, sugerindo a presença de compostos polares com perfil característico de

carboidratos quando revelados com anisaldeído sulfúrico (Figura 12).

Figura 12 – Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos de diferentes frutos com dois sistemas distintos de eluentes. A: Sistema apolar. B: Sistema polar.

PM (polpa da Maná-cubiu - Solanum sessiliflorun); CM (cascas da Maná-cubiu - Solanum sessiliflorun); RR (frutos amoara- vermelha - Rubus rosafolius). Eluentes - A: 70:30 hexano/acetona; B: 80:20 clorofórmio/ metanol. Reveladore anisaldeído sulfúrico.

71

Alguns extratos das polpas das espécies estudadas foram submetidos à

cromatografia em camada delgada utilizando-se eluente e reagente específicos para

açúcares, além dos padrões de sacarose, maltose, frutose e glicose. A figura 13A

mostra que os extratos das cascas e da polpa + sementes da cabeludinha (P.

glomerata) contêm sacarose e frutose. Os extratos dos frutos da amora-branca (R.

imperialis) e vermelha (R. rosafolius) apresentam apenas frutose e glicose (Figura

13B).

Embora estudos anteriores realizados em nossos laboratórios com as partes

aéreas de R. imperialis e R. rosaefolius, tenham demonstrado diferentes classes de

compostos como triterpenóides, esteróides e derivados do ácido elágico, nos

cromatogramas dos frutos destas espécies não foram detectados (NIERO et al,

1999, KANEGUSUKU et al., 2007; NIERO; CECHINEL-FILHO, 2008).

Figura 13 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos das cascas e da polpa + semente da cabeludinha (P. glomerata) (A) e dos extratos metanólicos dos frutos de amora vermelha (R. rosafolius) e amora-branca (R. imperialis) (B) com diferentes padrões de açúcares.

M (maltose); S (sacarose); F (frutose); G (glicose); CC (casca da cabeludinha – P. glomerata); PSC (polpa + semente da cabeludinha – P. glomerata); RR (amora-vermelha – R. rosafolius) e RI (amora-branca – R. imperialis). Eluentes: clorofórmio:metanol:ácido acético: água (4:4:0,5:0,5). Revelador: difenilamina, anilina, ácido fosfórico, acetona.

Da mesma forma, na cromatoplaca contendo o extrato da polpa do maná

cubiú (S. sessiliflorum) é possivel observar a presença da maltose, sacarose e

glicose, por outro lado, nas cascas dos frutos apenas a frutose (Figura 14A). Quando

se analisa as CCDs dos extratos da polpa e cascas da naranjila (S. quitoense) é

A B

72

possível observar a presença de maltose, sacarose e glicose, não apresentando

frutose nestas amostras (Figura 14B).

Figura 14 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos da polpa e casca do fruto maná cubiú (S. sessiliflorum) (A) e do extrato da polpa e casca da naranjila (S. quitoense) (B) com diferentes padrões de açúcares.

M (maltose); S (sacarose); F (frutose); G (glicose); PM (polpa do maná cubiú – S. sessiliflorum); CM (cascas dos frutos do maná cubiú – S. sessiliflorum); CN (cascas dos frutos da naranjila – S. quitoense) e PN (polpa da naranjila – S. quitoense). Eluentes: clorofórmio:metanol:ácido acético: água (4:4:0,5:0,5). Revelador: difenilamina, anilina, ácido fosfórico, acetona.

A figura 15A apresenta o perfil por CCD dos extratos metanólicos das

sementes, polpa e cascas da jacu (D. inconstans). Nesta cromatoplaca é posssivel

observar a presença de sacarose, glicose e frutose, porém não apresenta maltose.

Já os extratos metanólicos das diferentes partes dos frutos da Garcinia (G.

achachairu) contêm sacarose e frutose (Figura 15 B).

A B

73

Figura 15 - Cromatografia em camada delgada dos extratos metanólicos da semente da jacu, polpa da jacu e casca da jacu (D. inconstans) (A) e dos extratos metanólicos das diferentes partes da garcinia (G. achachairu) (B) com diferentes padrões de açúcares.

M (maltose); S (sacarose); F (frutose); G (glicose); JS (semente da jacu – D. inconstans); JP (polpa da jacu – D. inconstans); JC (cascas da jacu - D. inconstans) e CG (casca da garcinia – G. achachairu); SG (sementes da garcinia – G. achachairu); PG (polpa da garcinia – G. achachairu); CSG (cascas da semente da garcinia – G. achachairu). Eluentes: clorofórmio:metanol:ácido acético:água (4:4:0,5:0,5). Revelador: difenilamina, anilina, ácido fosfórico, acetona.

Estudar os frutos destas espécies acarretou algumas dificuldades em virtude

de serem ricas em açúcares (sacarose/glicose/frutose) o que dificulta a investigação

de outros constituintes químicos que posam ter alguma propriedade funcional. Foi

possível observar também que as cascas, as sementes e as frutas inteiras possuem

propriedades funcionais, ao contrário da polpa a qual muitas vezes tem pouca ou

nenhuma propriedade, quando separada de outra parte da fruta, a não ser grande

quantidade de açúcar.

Outro grande desafio foi trabalhar com extrato bruto ao invés de substâncias

isoladas, pois, no momento das análises in vitro, a complexidade da mistura de

inúmeras substâncias (clorofila, açúcares, etc.) dificulta a análise biológica. No

entanto, deve-se salientar que o extrato pode apresentar ação sinérgica, o que não é

possível observar em susbtâncias isoladas, por isso, neste trabalho inicialmente

avaliou-se o perfil fitoquímico dos extratos e a atividade antioxidante pelos métodos

DPPH e ABTS, e somente os extratos com melhores resultados foram avaliados

quanto aos demais métodos de análise biológica e fitoquímica.

As frutas são as principais fontes dietéticas de polifenóis, porém muitos

fatores intrínsecos (cultivo, variedade, estágio de maturação) e extrínsecos

B A

74

(condições climáticas e edáficas) podem interferir tanto na qualidade quanto na

quantidade desses polifenóis. Portanto, uma boa ação antioxidante muitas vezes

depende da estrutura química e da concentração desses fitoquímicos (MELO et al.,

2008).

Para obter uma boa atividade antioxidante de um extrato vegetal é necessária

a máxima extração dos compostos bioativos, sendo que esses apresentam

polaridades diferentes, e por isso a escolha do solvente é determinante. Assim,

preferem-se solventes universais como o metanol, que extraem inúmeras

substâncias, e separação dos compostos por polaridade é feita posteriormente com

extrações sucessivas com solventes de diferentes (DUZZIONO et al., 2010).

Assim, o ideal é isolar e quantificar o maior número de compostos bioativos

presentes, a fim de conhecer melhor a capacidade antioxidante de uma fruta, e

também utilizar vários métodos possíveis para avaliar a sua atividade antioxidante

(DUZZIONO et al., 2010).

5.1.2 Análise fitoquímica por cromatografia gasosa acoplada ao massa

Na tentativa de melhor analisar a composição química dos extratos

metanólicos das sementes e das cascas dos frutos de G. achachairu e polpa +

sementes e as cascas dos frutos de P. glomerata, uma análise por cromatografia

gasosa acoplada à espectrometria de massa foi realizada. Neste aspecto, os

extratos metanólicos secos foram solubilizados com clorofórmio a fim de evitar a

extração dos açúcares e permitir um melhor perfil cromatográfico. A figura 16 mostra

o perfil qualitativo de diferentes partes dos frutos das amostras analisadas.

Como pode ser observado, o extrato da polpa + sementes (Figura 16 b) e

das cascas dos frutos (Figura 16 c) de P. glomerata apresentaram perfil

cromatográfico semelhante. Já os extratos das cascas dos frutos (Figura 16 d) e das

sementes (Figura 16 a) de G. achachairu apresentaram um perfil bem diferente. As

sementes apresentaram um melhor perfil cromatográfico tanto em número de

substâncias quanto em concentração, mostrando que as sementes de G. achachairu

são muito mais promissoras sob o ponto de vista fitoquímico, do que as cascas dos

frutos.

75

Figura 16 - Perfil cromatográfico da sobreposição da análise dos diferentes extratos clorofórmicos das sementes (a) e das cascas dos frutos (d) de G. achachairu; polpa + semente (b) e casca dos frutos (c) de P. glomerata.

Tendo em vista que o extrato das sementes de G. achachairu apresentou

melhor perfil cromatográfico, uma nova análise foi realizada (Figura 17).

76

Figura 17 - Perfil cromatográfico do extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu (2 µg/ml) comparados com a biblioteca de referência.

Este cromatograma mostra aproximadamente nove compostos, os quais

foram identificados por comparação com a biblioteca de referência como:

o-diidroxibenzeno (1), metil éster do ácido palmítico (2), ácido palmítico (3), cis–metil

éster do ácido vacênico (4), 12-metil éster do ácido octacenoico (5), metil éster do

ácido esteárico (6), palmitina (7), oleína (8) e estearina (9). As estruturas estão

demonstradas na figura 18.

77

Figura 18 – Estruturas químicas dos compostos presentes extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu.

Um estudo realizado por Cano-Campos e colaboradores (2011), analisou o

perfil fitoquímico do extrato dos frutos de Randia echinocarpa. A cromatografia

gasosa da fração hexânica mostrou a presença de ácidos graxos e esteróis, sendo

os principais, ácido palmítico, ácido linoleico, campesterol, estigmasterol e β-

sitosterol. Os autores verificaram atividade antimutagênica desta fração hexânica

frente a diversos agentes mutagênicos e atribuíram a atividade biológica aos

componentes presentes, justificando, por exemplo, que o β- sitosterol altera a

permeabilidade da membrana celular impendindo a penetração dos agentes

mutagênicos.

Os mesmos autores sugerem que o consumo de frutas exóticas deveria ser

estimulado, visto que várias destas frutas são ricas em compostos esteroidais,

ácidos graxos, pigmentos e compostos fenólicos que apresentam potencial atividade

biológica, especificamente, atividade antimutagênica a qual está intimamente

relacionada com ação antitumoral, visto que todo tumor inicia-se após a mutação de

78

uma célula normal (CANO-CAMPOS et al., 2011).

Considerando que alguns fitoesteróis apresentam importante papel na

atividade antimutagênica como supracitado, uma análise cromatográfica em

condições de temperatura mais elevada foi realizada na possibilidade de detectar

esta classe de substâncias (Figura 19).

Como pode ser observado, o extrato clorofórmico das sementes de G.

achachairu apresenta β-sitosterol e ɤ-sitosterol identificados nos tempos de retenção

de 12,5 e 13,5 min., respectivamente, além de outros compostos já identificados no

cromatograma sugerindo que a atividade encontrada, pode estar em parte,

relacionada com a presença destas substâncias.

Um estudo realizado por Iyer e Patil (2012), relatou o efeito anti-

hiperlipidêmico e antitumoral do extrato etanólico, da fração clorofórmica e do

fitoesterol (estigmast-5-en-3β-ol) isolado de Salvadora persica L. Os autores

sugerem que dietas ricas em alimentos contendo substâncias com ação

antioxidante, principalmente fitosteróis, podem contribuir para a terapêutica

antitumoral e anti-hiperlipidêmica.

Figura 19 - Identificação dos esteróis do extrato clorofórmico das sementes de G. achachairu (temperatura inicial da coluna 180°C).

O óleo dos frutos de Pistacia lentiscus L. mostrou um importante potencial

nutritivo, cujo perfil fitoquímico analisado por cromatografia gasosa, evidenciou a

79

presença de ácidos graxos monoinsaturados, ácidos graxos essenciais (ômega-3) e

fitoesteróis, tais como β-sitosterol e campesterol. Este óleo pode ser utilizado tanto

para fins medicinais como para indústria alimentícia, cuja composição pode ser

comparável a de outros óleos comumentes utilizados e obtidos do amedoim e

girassol (TRABELSI et al., 2012).

Wannes e colaboradores (2010), descrevem sobre a composição química do

pericarpo, sementes e óleo dos frutos inteiros de Myrtus communis var. italica ,

enfatizando sobre a distribuição de ácidos graxos e glicerol lipídeos, sendo os mais

predominantes o ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico e linolênico presentes

em todas as partes analisadas porém em diferentes proporções. Também foi

identificado nos frutos inteiros e nas sementes, ácidos graxos monoinsaturados e

poliinsaturados, e no pericarpo concentrações elevadas de ácidos graxos saturados

(WANNES et al., 2010).

Os estudos citados acima apresentam ácidos graxos e fitoesteróis

semelhantes aos encontrados nos frutos em nosso trabalho, mostrando a

importância destes tanto para fins medicinais quanto para a indústria alimentícia.

Atualmente muitas pesquisas estão direcionadas ao perfil fitoquimico de

plantas medicinais, principalmente dos seus frutos. Em outro trabalho foi

determinada a composição dos lipídeos presentes nas sementes, no pericarpo e nas

frutas inteiras de Coriandrum sativum L. Os principais ácidos graxos identificados

foram o ácido linoleico, palmítico e oleico. Além disso, foram detectados tocoferol e o

tocotrienóis no óleo da fruta inteira, no óleo das sementes e no óleo do pericarpo em

diferentes proporções (SRITI et al., 2010).

Os componentes lipídicos dos frutos, mesmo sendo em quantidades menores

contribuem para o desenvolvimento do aroma e do sabor característico de cada

espécie durante a maturação, além de contribuírem para o valor nutricional (SRITI et

al., 2010).

80

5.1.3 Análise fitoquímica por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE

Considerando que a cromatografia gasosa é utilizada para identificação de

compostos mais apolares, uma análise de extratos metanólicos das cascas e da

polpa + sementes da P. glomerata, foi realizada utilizando a cromatografia líquida de

alta eficiência.

Como pode ser observado na figura 20, no extrato das cascas de P.

glomerata (Figura 20B) há aproximadamente quatro compostos, observados nos

tempos de retenção de 3,5; 4,5; 18,5; 21,5 minutos, respectivamente. Por outro lado,

o cromatograma obtido do extrato da polpa + semente (Figura 20C) mostra um perfil

cromatográfico bastante diferente com cerca de dez constituintes químicos

aproximadamente. Quando se compara o perfil cromatográfico do padrão

(Quercitrina) com os cromatogramas dos extratos, observa-se claramente que

apenas no extrato das cascas de P. glomerata, a quercetrina parece estar presente

em baixas concentrações. É importante mencionar que a quercitrina é um dos

principais constituintes das partes aéreas conforme relatado por Serafin et al. (2007).

Considerando que esse estudo foi realizado em partes da planta e época de coletas

diferentes, fica claro que fatores edáficos, influenciam diretamente na concentração

de constituintes químicos (GLOBO-NETO; LOPES, 2007).

Hong e colaboradores (2013), mostraram que a quercitrina apresenta

atividade antioxidante, antimelanogênica e antitumoral. Outro estudo recente

demonstrou atividade antioxidante da quercitrina contra radiação UVB induzida (YI et

al., 2013).

O presente trabalho mostrou que os extratos metanólicos da casca e da polpa

+ semente de P. glomerata apresentaram uma atividade antioxidante tanto no

método de DPPH quanto ABTS, além de um elevado teor de polifenóis comparados

aos outros extratos estudados.

Diante do exposto, e considerando a baixa concentração de quercitrina nos

extratos estudados é evidente que outros compostos devem estar contribuindo para

atividade antioxidante encontrada.

81

Figura 20 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico (0,31 mg/ml) das cascas dos frutos (B) e polpa + semente de P. glomerata (C) comparados com padrão interno quercitrina (A).

Em relação aos extratos metanólicos de G. achachairu, as figuras 21 A e B,

mostram que a gutiferona A está presente, em baixas concentrações. Isto vem de

encontro às análises cromatográficas por meio de CCD realizadas neste trabalho e

CLAE-MS realizada por Marques e colaboradores (2012). Entretanto, quando se

analisa o cromatograma das cascas dos frutos (Figuras 22 A e B), fica claro que a

gutiferona A não está presente.

O efeito citotóxico e antioxidante observado neste estudo para o extrato

metanólico das sementes de G. achachairu, pode ser justificado pela presença da

gutiferona A, que quando avaliada isoladamente apresentou tais propriedades. Por

outo lado, a mesma analogia não pode ser usada para as cascas dos frutos, tendo

em vista que a Gutiferona A não está presente. Neste aspecto, pode-se sugerir que

outros compostos presentes, poderão estar contribuindo para o efeito encontrado,

entre eles os polifenóis.

82

Figura 21 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico das sementes de G. achachairu em comparação com a Gutiferona A (0,5 mg/ml).

Figura 22 - Perfil cromatográfico do extrato metanólico das cascas dos frutos de G. achachairu em comparação com a Gutiferona A (0,5 mg/ml).

5.1.4 Doseamento de polifenóis totais

A figura 23 apresenta a curva padrão de doseamento do ácido gálico com o

reativo Folin-Ciocalteu e a equação da reta utilizada para determinação do teor de

polifenóis dos extratos metanólicos. Os resultados estão expressos em mg

equivalente ao ácido gálico (GAE) por g de extrato (Quadro 3).

Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência

natural, os compostos fenólicos são os mais estudados. Comumente, nos extratos

vegetais que tem ação antioxidante, os derivados fenólicos são as substâncias

responsáveis por tal efeito. Eles atuam principalmente por suas propriedades

redutoras dependentes da estrutura química. Esta propriedade desempenha um

a) Gutiferona A

b) Ext. MeOH das sementes

de G. achachairu

a

b

83

papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de

metais de transição, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do

processo oxidativo (SOUSA et al., 2007).

Figura 23 - Curva para polifenóis totais de ácido gálico (µg/ml).

Os teores de polifenóis totais foram quantificados apenas nos extratos

metanólicos que apresentaram CE50 frente ao radical DPPH• inferior a 100 µg/ml. Os

extratos das cascas de garcinia (9,7 mg GAE.g-1), polpa + semente da cabeludinha

(8,9 mg GAE.g-1), cascas da naranjila (8,8 mg GAE.g-1) e sementes da jacu (9,3 mg

GAE.g-1) apresentaram teores de polifenóis superiores ao do extrato das sementes

da garcinia (8,4 mg GAE.g-1), cuja atividade antioxidante pelo método DPPH• foi

mais ativa e apresentou menor CE50 indicando que provavelmente esta ação deva-

se não somente a concentração de polifenóis presentes no extrato, mas também ao

tipo de polifenol, pois a ação antioxidante destas substâncias está relacionada com a

estrutura química destes compostos e a disponibilidade das hidroxilas.

84

Quadro 3: Teor de polifenóis totais equivalentes ao ácido gálico por grama de extrato metanólico dos frutos.

Nome científico Nome popular Extrato metanólico Sigla Polifenóis Totais

(mg GAE.g-1)

G. achachairu Garcinia Sementes SG 8,4

G. achachairu Garcinia Casca das sementes CSG 2,3

G. achachairu Garcinia Casca dos frutos CG 9,7

S. quitoense Naranjila Cascas dos frutos CN 8,8

R. rosaefolius Amora-vermelha Frutos RR 5,4

D. inconstans Jacu Sementes SJ 9,3

S. sessiliflorun Maná Cascas dos frutos CM 4,2

R. imperialis Amora-branca Frutos RI 8,1

P. glomerata Cabeludinha Polpa + sementes PSC 8,9

P. glomerata Cabeludinha Cascas dos frutos CC 8,3

Muitos fatores influenciam a atividade antioxidante dos compostos de

natureza fenólica, em especial, a posição de substituição e o número de grupos

hidroxilas, as propriedades de outros grupos substituintes e a possibilidade de

formação de ligações de hidrogênio (PANALLA et al., 2001; CHENG et al., 2002;

FOTI, 2007).

Fu e colaboradores (2012), analisaram as frações das frutas de G.

xanthochymus em relação ao conteúdo de polifenóis, e mostraram que a fração de

acetato de etila foi a que apresentou maior teor de polifenóis (13,53 ± 0,09 mg

GA/100mg), seguida da fração éter de petróleo (8,21 ± 0,05 mg GA/100mg). Este

estudo relatou maiores teores de polifenóis do que os apresentados neste trabalho,

mostrando a importância da análise fitoquímica de cada espécie e de suas distintas

partes.

Segundo Panalla e colaboradores (2001), compostos contendo a hidroxila na

posição para são mais ativos que aqueles substituídos em orto ou meta. Ainda, a

atividade antioxidante não depende apenas da força de energia da ligação da

hidroxila, mas também da estabilização das espécies cátion-radicalar e radicalar

formadas (CAO et al., 2005; FOTI, 2007; SCOTTI et al., 2007; SOUZA et al., 2007).

85

Almeida et al. (2011), mostraram o conteúdo de compostos fenólicos de onze

frutas exóticas cultivadas no nordeste do Brasil. A atividade antioxidante foi avaliada

pelos métodos do DPPH e ABTS. As frutas murici e mangaba apresentaram boa

atividade antioxidante, havendo correlação positiva entre o teor de polifenóis e a

atividade antioxidante analisada pelos métodos ABTS e DPPH (R=0,94 P ≤ 0,001) e

(R = 0,88, P ≤ 0,001) respectivamente, o que justifica o doseamento de polifenóis

quando se avalia a atividade antioxidante.

Dembitsky e colaboradores (2011), identificaram as características físico-

químicas e nutricionais de vinte frutas exóticas e da influência de seus compostos

ativos. Foram realizadas investigações in vitro e in vivo, as quais demonstraram que

essas frutas exóticas alteraram positivamente o perfil lipídico, sendo relacionado a

atividade antioxidante com o teor de polifenóis.

A bioatividade de algumas frutas raras como: durian, fruta cobra e mangostão,

foi investigada por Gorinstein et al. (2011). Essas frutas foram comparadas entre si e

também com frutas convencionais: durian com manga e abacate, fruta cobra com

mangostão e kiwi. O conteúdo de polifenóis e potencial antioxidante foram

analisados em diferentes extratos (metanol, água, acetona e hexano). Para essa

investigação foi realizado estudo in vivo com 25 ratos, cujas rações foram

suplementadas com as frutas exóticas, e observou-se que as rações suplementadas

afetaram positivamente o perfil lipídico, sendo possível concluir que os compostos

bioativos apresentavam significativa atividade antioxidante.

Constata-se que os resultados desses trabalhos, mostram perspectivas

promissoras para a utilização das frutas exóticas por causa da atividade antioxidante

e dos seus teores de polifenóis, enfatizando a necessidade de promover o consumo

dessas frutas exóticas as quais podem auxiliar no equilíbrio nutricional do

organismo. Tais estudos apontam para a importância de pesquisas que avaliam a

composição química e atividade antioxidante não somente de plantas medicinais

como também de frutas exóticas, com potencial nutritivo e de renda para as regiões

onde são coletadas.

86

5.2 Avaliação da Atividade Biológica

5.2.1 Atividade sequestradora do radical DPPH•

Os extratos metanólicos dos frutos e das distintas partes foram avaliados

inicialmente quanto à atividade antioxidante pelo método do sequestro do radical

livre DPPH•, como uma forma de “screening”, a fim de selecionar os frutos a serem

estudados em relação ao perfil fitoquímico e demais atividades biológicas.

O método do sequestro do radical DPPH• baseia-se na redução da

concentração do radical DPPH•. É um dos mais empregados na seleção de

compostos orgânicos com possível atividade antioxidante. Nessa reação, a espécie

DPPH• é reduzida pelas substâncias antioxidantes, normalmente por transferência

de um átomo de hidrogênio (BONDET; BRAND-WILLIAMS; BERSET, 1997; SOUSA

et al., 2007).

Na figura 24 estão apresentadas as CE50 dos extratos metanólicos das

diferentes partes dos frutos frente ao radical DPPH• comparados aos controles

positivos trolox (CE50 = 11,9 µg/ml) e vitamina C (CE50 = 6,8 µg/ml).

Os extratos metanólicos das sementes de G. achachairu (SG), dos frutos de

R. imperialis (RI), das cascas da cabeludinha (P. glomerata) (CC), da polpa +

sementes da cabeludinha (P. glomerata) (PSC) apresentaram CE50 inferior a 30

µg/ml, 27 ± 3,2; 24 ± 1,2; 15,9 ± 2,4 e 16,3 ± 1,8 µg/ml, respectivamente.

O extrato metanólico das cascas de P. glomerata apresentou atividade

estatisticamente semelhante aos controles positivos trolox e vitamina C, indicando

importante potencial antioxidante, a qual foi semelhante para o fruto (polpa +

semente).

87

Figura 24 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: SG (sementes da garcinia – G. achachairu), RI (frutos da amora-branca – R. imperialis), CC (cascas dos frutos da cabeludinha – P. glomerata), PSC (polpas + sementes da cabeludinha – P. glomerata) e dos controles positivos trolox e vitamina C, pelo método do sequestro do radical livre DPPH•.

SG RI CC PSC Trolox Vit. C0

5

10

15

20

25

30

35**b*b

**b*b

**a*a **c

*a*a

**a

CE

50 (

µµ µµg/

ml)

*aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si e com o padrão trolox (p < 0,05). **aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si e com o padrão vitamina C (p < 0,05).

Os extratos metanólicos das cascas de garcinia - CG (92,9 ± 9,1 µg/ml), da

casca da naranjila - CN (134,6 ± 3,7 µg/ml), Rubus rosaefolius - RR (291,7 ± 4,2

µg/ml), sementes da jacu - SJ (164,4 ± 8,9 µg/ml) e das cascas da mana-cubiú - CM

(313,3 ± 1,2 µg/ml) apresentaram CE50 superior a 100 µg/ml (Figura 25), indicando

baixo potencial antioxidante destes extratos.

Ferreira, Rosso e Mercante (2010), nos seus estudos, também realizados

com Rubus, mostraram a atividade antioxidante de diferentes extratos da amora-

preta (Rubus spp), apresentando valores em uma faixa de 946,5 a 2.209,6 mM

TEAC/100 g de amora-preta.

88

Figura 25 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: CG (cascas dos frutos da garcinia – G. achachairu), CN (cascas dos frutos da naranjila - S. quitoense), RR (frutos da amora-vermelha – R. rosafolius), SJ (sementes da jacu – D. inconstans), CM (cascas da maná cubiú- S. sessiliflorun) pelo método do sequestro do radical livre DPPH•.

CG CN RR SJ CM0

50

100

150

200

250

300

350

a

b

c

d

cC

E50

(µµ µµg/

ml)

aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si (p < 0,05).

Na análise de extratos etanólicos das sementes das Rubus coreanun (FBSE)

e do vinho (WBSE), Ku e Mu (2008), registraram uma CE50: 4,58 µg/ml e CE50: 4,28

µg/ml, respectivamente frente ao radical DPPH, cujos valores foram muito inferiores

aos obtidos neste estudo, considerando que R. imperialis apresentou CE50: 24 ± 1,2

µg/ml e R. rosaefolius CE50: 291,7 ± 4,2 µg/ml. Tal diferença provavelmente deve-se

a composição de distintos polifenóis nestas espécies, bem como a utilização de

sementes, que normalmente concentram mais substâncias bioativas, enquanto a

polpa concentra maior teor de açúcares e fibras.

Carvalho, Ishikawa, Gouvêa (2012), demonstraram que o extrato aquoso das

folhas de Plinia edulis foi citotóxico contra células de câncer de mama (Linhagem

MCF-7) e a atividade antioxidante foi semelhante a do ácido ascórbico (20 µg/ml

sequestrando aproximadamente 100% DPPH•), a qual foi relacionada à presença de

polifenóis 54.34 ± 0.02 mg/g equivalente ao ácido gálico. No presente estudo o

extrato metanólico das cascas e da polpa com sementes dos frutos de P. glomerata

(cabeludinha) apresentaram CE50 de 15,9 ± 2,4 µg/ml e 16,3 ± 1,8 µg/ml

respectivamente, demonstrando também significativa atividade antioxidante.

Celli, Pereira-Netto e Beta (2011), estudaram a atividade antioxidante do

extrato acetônico dos frutos de duas variedades de Eugenia uniflora L. (vermelha e a

89

roxa). Os frutos de ambas as variedades foram classificados em quatro estágios de

desenvolvimento: verde (imaturo), amarelo, laranja e vermelho (maduro). Para

ambas as variedades, a melhor atividade antioxidante foi no estágio imaturo (os

extratos sequestraram 75% do radical DPPH•).

O estudo acima demonstra que para a análise de atividade biológica de

frutos, as melhores amostras são a de frutos imaturos, pois a concentração de

metabólitos secundários parece ser maior durante o desenvolvimento dos frutos, já

que a maioria destes metabólitos execem papel de defesa e reserva para a planta,

enquanto que na maturação destes, há um aumento na concentração de açúcares.

No entanto, o objetivo deste trabalho é avaliar o potencial nutracêutico uma vez que

a população consome os frutos maduros, e por isso, ainda que a atividade biológica

seja menor, é desta forma que ocorre o consumo destes frutos.

Na figura 26 estão apresentadas as CE50 das frações e subfrações obtidas a

partir da fração acetato de etila submetidas à cromatrografia em coluna bem como

das subfrações que foram purificadas também por cromatografia em coluna e do

composto majoritário, isolado anteriormente deste extrato (Gutiferona A), frente ao

radical DPPH.

A gutiferona A mostrou maior atividade antioxidante (CE50= 10,75 ± 2,7 µg/ml)

quando comparada com as frações: Fr.1 (CE50=15,04 ± 3,1 µg/ml), Fr.3 (CE50= 12,97

± 2,2 µg/ml) e Fr.4 (CE50= 17,32 ± 4,2 µg/ml) e com as subfrações: SubFr. (3

CE50=24,29 ± 4,91 µg/ml) e SubFr.4 (.CE50=21,50 ± 4,12 µg/ml).

Ainda, deve-se destacar que as subfrações apresentaram antividade

antioxidante inferior às frações de origem, indicando que o sinergismo entre os

diferentes polifenóis presentes nas frações parece ser importante para a atividade

antioxidante.

Embora não se tenha elucidado quimicamente as substâncias presentes nas

subfrações 3 e 4, uma análise por CCD mostrou que são substâncias diferentes da

gutiferona A. No entanto, estudos estão em andamento na tentativa de elucidar

estas estruturas.

90

Figura 26 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) das frações e subfrações das sementes da garcinia (G. achachairu) e da substância isolada (gutiferona A), pelo método do sequestro do radical livre DPPH•.

Fr. 1 Fr. 3 Fr. 4 Gut. A SubFr.3 SubFr.40

10

20

30

aa

a

a

a

aC

E50

(µµ µµ

g/m

l)

aCE50 com letras diferentes diferem estatisticamente entre si em nivel de 5% (p < 0,05).

FU et al. (2012), ao avaliar a atividade antioxidante da G. xanthochymus

observaram que as frações das folhas tiveram melhor resultado tanto para redução

do radical DPPH• quanto ABTS•, com CI50 da fração de acetato de etila de 6,10

µg/ml para o radical DPPH• e 6,74 µg/ml para o radical ABTS•. Esse resultado foi

relacionado ao conteúdo fenólico e a atividade antioxidante foi equivalente ao BHT.

Já WANG et al. (2012), avaliaram a atividade antioxidante por meio do sequestro do

radical DPPH• da G. mangostana Linn. O extrato bruto etanólico do pericarpo de

mangostão apresentou uma IC50: 7,32 ± 0,4 µg/ml.

No presente estudo, o extrato metanólico da SG apresentou CE50 de 27 ± 3,2

µg/ml e CG CE50 de 92,9 ± 9,1 µg/ml, sendo menos efetivos que os extratos citados

nos trabalhos de outras espécies de garcinia. Isso pode estar relacionado com a

possível diferença na constituição química entre as espécies ou a efeitos sazonais

(GOBBO NETO, 2007).

Neste trabalho, a gutiferona A, composto isolado das sementes de G.

achachairu teve maior atividade antioxidante tanto no sequestro do radical DPPH•

quanto no ABTS•, com CE50: 10,75 ± 2,7 e 8,48 ± 1,46 µg/ml, respectivamente.

Vieira e colaboradores (2011), analisaram a capacidade antioxidante do

extrato aquoso e hidroalcóolico de sete frutas, sendo elas: acerola, bacari, cajá, caju,

goiaba e tamarindo. A bacari apresentou maior atividade antioxidante tanto no

extrato aquoso quanto no hidroalcóolico (aquoso CE50: 4700,24 µg/ml, hidroalcóolico

91

CE50: 2356,96 µg/ml) e a menor atividade foi a da acerola (aquoso CE50: 24,42

µg/ml, hidroalcóolico CE50: 1,74 µg/ml). Esse estudo aborda a capacidade

antioxidante de diversas frutas e pode-se observar que dependendo da forma de

preparação do extrato, pode interferir na capacidade antioxidante.

5.2.2 Atividade sequestradora do radical ABTS•

Na figura 27 estão expressos os resultados da atividade antioxidante dos

extratos metanólicos pelo método do sequestro do radical livre ABTS••••, cujas plantas

mais ativas foram a G. achachairu (extrato metanólico das sementes - SG) com

CE50= 23,28 ± 1,43 µg/ml e P. glomerata (tanto o extrato metanólico das cascas - CC

com CE50= 23,54 ± 1,2 µg/ml como o extrato da polpa + sementes – PSC com CE50=

24,8 ± 0,7 µg/ml). A atividade foi comparada com os controles positivos trolox (CE50

= 8,2 µg/ml ± 0,9 µg/ml) e vitamina C (CE50 = 6,6 ± 1,1 µg/ml).

Figura 27- Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: SG (sementes de G. achachairu), CG (cascas de G. achachairu), CC (cascas dos frutos da cabeludinha – P. glomerata), PSC (polpas mais sementes da cabeludinha – P. glomerata), RI (frutos de R. imperialis) trolox e vitamina C, pelo método do sequestro do radical livre ABTS•.

S.G C.G CC PSC RI Trolox Vit. C0

5

10

15

20

25

30

35

a

b

a a

b

c cCE

50 (

µµ µµg/

ml)


92

Um estudo da antioxidante da G. xanthochymus em relação à capacidade de

eliminação de radicais livres por sequestro do ABTS• mostrou que a fração de

acetato de etila das folhas (IC50: 6,74 ± 0,09 µg/ml) e a fração de éter de petróleo

dos frutos (IC50: 8 ± 0,31 µg/ml) foram mais efetivas que o padrão BHT (IC50: 9,29±

0,14 µg/ml) (FU et al., 2012).

Victoria et al. (2012), investigaram o óleo essencial (OE) das folhas de

Eugenia uniflora L. em relação as suas propriedades antioxidantes, antibacterianas e

antifúngicas. O OE apresentou atividade antioxidante nos dois métodos utilizados

(DPPH• e ABTS•), com IC50 de 833,3 ± 20,7 e 8,1 ± 0,20 µg/ml, respectivamente. O

óleo dessa planta foi mais potente no ensaio do ABTS, sugerindo que o mecanismo

da planta é baseado principalmente na transferência de elétrons.

Nossos resultados mostram que a G. achachairu foi mais potente no ensaio

do ABTS em relação à atividade antioxidante e a P. glomerata foi mais ativa no

sequestro do radical DPPH•.

Os extratos que apresentaram menor atividade antioxidante pelo método

ABTS• estão apresentados na figura 28. Dos três extratos, o mais ativo foi o das

sementes da jacu (Diospyros inconstans) (CE50: 73,20 ± 0,009 µg/ml), seguido pelo

extrato das cascas da naranjila (S. quitoense Lam.) com CE50= 99,71 ± 0,01 µg/ml e

da amora-vermelha (R. rosafolius) com CE50 de 135,52 ± 0,2 µg/ml.

Figura 28 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) dos extratos metanólicos de: RR (frutos da amora-vermelha – R. rosafolius), CN (cascas dos frutos da naranjila- S. quitoense), SJ (sementes da jacu – D. inconstans) pelo método do sequestro do radical livre ABTS•.

RR CN S.J0

25

50

75

100

125

150 a

b

c

CE

50 (

µµ µµg/

ml)


93

Krishnaiah, Sarbatly e Nithyanandam (2011), realizaram uma revisão sobre o

potencial antioxidante de diversos extratos de plantas medicinais utilizando caule,

raiz, casca, folhas, frutos e sementes. Muitos antioxidantes sintéticos são utilizados

como aditivos alimentares, no entanto, diversas plantas possuem atividade

antioxidante semelhante a estes sintéticos, como por exemplo, Diospyros abyssinica,

demonstrando que há espécies que podem servir como alternativa para indústria em

relação ao processamento de alimentos.

As sementes de D. inconstans pesquisada neste estudo foi a mais ativa

perante aos outros dois gêneros em relação a atividade do radical ABTS•, como

pode ser observado na figura 28.

Rubus sp. é utilizada na medicina tradicional por sua atividade

anticonvulsivante, relaxante muscular, antimicrobiana e agente de eliminação

radicais. Martini e colaboradores (2009), testaram a atividade antimicrobiana das

folhas de Rubus ulmifolius e seus polifenóis isolados contra duas cepas do H. pylori.

Todos os polifenóis, bem como o extrato da folha mostraram atividade antibacteriana

contra ambas às cepas de H. pylori.

Na figura 29 estão apresentados os resultados das CE50 das frações e

subfrações das sementes de G. achachairu e da gutiferona A, as quais foram

testadas pelo método do ABTS•, sendo que a fração 3 (CE50: 10,93 ± 2,38 µg/ml) foi

a que obteve melhor resultado dentre as frações avaliadas com uma atividade

semelhante à gutiferona A (CE50: 8,48 ± 1,46 µg/ml). Tal como observado no teste

do DPPH, as subfrações apresentaram atividade antioxidante inferior às frações de

origem, pois a SubFr.3 apresentou CE50: 24,94 ± 8,65 µg/ml e a SubFr.4 uma CE50:

17,65 ± 4,55 µg/ml.

94

Figura 29 - Atividade antioxidante expressa em CE50 (µg/ml) das frações e subfrações das sementes de G. achachairu e da substância isolada (gutiferona A), pelo método do sequestro do radical livre ABTS•.

Fr. 1 Fr. 3 Fr. 4 Gut. A SubFr.3 SubFr.40

5

10

15

20

25

30

35

a

a

a

a

a

a

CE

50(µµ µµ

g/m

l)


Marques e colaboradores (2012), identificaram através de cromatografia

líquida acoplada a espectrometria de massas, os principais compostos encontrados

no extrato das sementes de G. achachairu, sendo que esse extrato apresentou 12

compostos, dos quais eles identificaram sete, sendo o majoritário, o composto

gutiferona A.

A gutiferona A é uma benzofenona poliisoprenilada com ação citotóxica in

vitro e ação antitumoral em modelos de roedores. Pardo-Andreu e colaboradores

(2011), relataram que a atividade antitumoral desta substância parece estar

relacionada com a permeabilização da membrana mitocondrial, com consequente

geração de EROs e depleção de ATP.

Dias e colaboradores (2012), sintetizaram seis derivados da gutiferona A e

avaliaram a atividade antimicrobiana contra fungos oportunistas e patogênicos. Esse

estudo mostrou que os derivados da gutiferona A apresentaram atividade antifúngica

mais potente do que a molécula original não sendo citotóxicos.

95

5.2.3 Avaliação da atividade antioxidante pela capacidade de absorção do radical

oxigênio (ORAC).

O ensaio ORAC combina o tempo e o percentual de inibição da ação do

radical pelo antioxidante, sendo este o único método que permite a medida total dos

radicais gerados e usa a área sob a curva (ASC) para a quantificação ao invés da

“lag fase” utilizada pelos outros métodos para quantificação dos radicais


A figura 30 representa o decaimento da intensidade fluorescência da

fluoresceína na presença do controle (trolox). A ASC do controle (fluoresceína +

AAPH) foi de 306814 enquanto que a ASC do trolox na concentração de 25 µM foi

de 1,39 x 106.

Figura 30 - Curva de decaimento da intensidade de fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações de trolox.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

10000

20000

30000

40000

50000

C

5 µM10 µM

25 µM50 µM

100 µM

Tempo (min)

15 µM75 µM

Fluo

resc

ênci

a (U

R)

A figura 31 apresenta o decaimento da intensidade de fluorescência da

fluoresceína na presença do extrato metanólico das sementes de G. achachairu, em

diferentes concentrações em função do tempo. A ASC do controle (fluoresceína +

AAPH) foi de 226975 enquanto que a ASC do extrato na maior concentração testada

(75 µg/ml) foi de 2.03 x 106 (1.550,3 mM TE/g.ml-1 de extrato).

96

Figura 31 - Curva de decaimento da intensidade de fluorescência da fluoresceína na presença do extrato metanólico das sementes de G. achachairu.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000 C

5 µg/ml20 µg/ml35 µg/ml50 µg/ml

75 µg/ml

Tempo (min)

Fluo

resc

ênci

a (U

R)

O conteúdo de polifenóis totais nos frutos de Garcinia multifolia foi de 21,54

mg GAE/g e nos frutos de G. villosa de 27,64 mg GAE/g. No método do ORAC

mostrou-se que as flores (590,23 mmol TE/g) apresentaram atividade antioxidante

superior aos frutos (741,16 mmol TE/g) (DANIELS et al., 2011).

Na figura 32 estão representados as curvas do decaimento da fluorescência

da fluoresceína na presença de diferentes concentrações da fração 3 obtidas das

sementes de G. achachairu. Pode-se observar que a atividade antioxidante é

dependente da concentração. A ASC do controle (fluoresceína + AAPH) foi de

226975 enquanto que a ASC do extrato na maior concentração testada foi de 1.5441

x 106 sendo equivalente a 4.246,5 mM TE/g.ml-1 de amostra.

97

Figura 32 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações (µg/ml) da fração 3 das sementes de G. achachairu.

0 10 20 30 40 50 60 70 800

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000C

1 µg/ml2 µg/ml4 µg/ml8 µg/ml12 µg/ml20 µg/ml

Tempo (min)

Fluo

resc

ênci

a (U

R)

A figura 33 mostra a curva do decaimento da intensidade da fluorescência da

fluoresceína na presença do subfração 3, mostrando que quanto maior a

concentração dessa subfração em função tempo, mais efetiva em relação a

atividade antioxidante.

A ASC do controle (fluoresceína + AAPH) foi de 72064 enquanto que a ASC

da subfração na maior concentração testada (20 µg/ml) foi de 411190 (4.824,2 mM

TE/g.ml-1 de amostra). Nesta metodologia, a subfração apresentou atividade

antioxidante superior à fração de origem.

Wang et al. (2012), avaliaram a atividade antioxidante pelo método do ORAC

da G. mangostana Linn. O extrato bruto etanólico do pericarpo de mangostão

(MPEE) apresentou atividade equivalente a 562 ± 5,4 µmol TE/g de fruto.

98

Figura 33 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença da subfração 3 das sementes da garcinia (G. achachairu).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

2500

5000

7500

10000

12500 C

2 µg/ml12 µg/ml20 µg/ml30 µg/ml40 µg/ml

Tempo (min)

Fluo

resc

ênci

a (U

R)

A figura abaixo mostra o decaimento da fluorescência da fluoresceína perante

a fração 4 obtida das sementes da garcinia (Figura 34). A ASC do controle

(fluoresceína + AAPH) foi de 226975 enquanto que a ASC do extrato na maior

concentração testada foi de 2.07 x 106 (2971,25 mM TE/g.ml-1 de amostra).

Figura 34 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença de diferentes concentrações (µg/ml) da fração 4 das sementes da garcinia (G. achachairu).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

C

2 µg/ml

8 µg/ml12 µg/ml

40 µg/ml4 µg/ml 20 µg/ml

Tempo (min)

Fluo

resc

ênci

a (U

R)

99

Na Figura 35 apresenta-se o decaimento da intensidade da fluorescência da

fluoresceína na presença da subfração 4 (oriunda da purificação da fração 4) das

sementes de G. achachairu. Pode-se observar que quanto maior a concentração da

subfração maior a atividade antioxidante em função do tempo. A ASC do controle

(fluoresceína + AAPH) foi de 72064 enquanto que a ASC do extrato na maior

concentração testada foi de 605635 (506 mM TE/g.ml-1).

Figura 35 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença da subfração 4 das sementes da garcinia (G. achachairu).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

2500

5000

7500

10000

12500

C

2 µg/ml8 µg/ml

20 µg/ml40 µg/ml

60 µg/ml12 µg/ml50 µg/ml

Tempo (min)

Fluo

resc

ênci

a (U

R)

A figura 36 mostra os resultados da gutiferona A pelo método do ORAC. A

ASC do controle (fluoresceína + AAPH) foi de 72064 enquanto que a ASC da

gutiferona A na maior concentração testada foi de 356171, o que é equivalente a

404 mM TE/M de gutiferona A.

100

Figura 36 - Curva de decaimento da intensidade da fluorescência da fluoresceína na presença da Gutiferona A em diferentes concentrações (µM).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

2500

5000

7500

10000

12500C


Tempo (min)

Fluo

resc

ênci

a (U

R)

Carvalho et al. (2012), investigaram a atividade citotóxica, antioxidante e

mutagênica da molécula isolada 7-epi-clusianona obtida do pericarpo da Garcinia

brasiliensis e do extrato de hexano em diferentes concentrações, mostrando que em

relação à atividade antioxidante a molécula isolada teve maior atividade que o

extrato em todas as concentrações.

Em nossos estudos somente os extratos metanólicos de G. achachairu, as

frações e subfrações e o composto isolado (gutiferona A) das sementes de G.

achachairu, e o extrato metanólico das cascas de P. glomerata foram avaliados pelo

método do ORAC, tendo em vista que, somente estes apresentaram CE50 inferior a

30 µg/ml nos métodos do sequestro do radical DPPH e ABTS.

Na figura 37 observa-se o decaimento da intensidade da fluorescência da

fluoresceína na presença do radical AAPH e quando adicionadas diferentes

concentrações do extrato metanólico da casca de P. glomerata. A atividade

antioxidante é observada pela redução do decaimento da fluorescência em função

da concentração e do tempo. A ASC do controle (fluoresceína + AAPH) foi de

226975 enquanto que a ASC do extrato na maior concentração testada foi de 1.78 x

106 (133,4 mM TE/g.ml-1).

101

Figura 37 - Curva de decaimento da fluorescência da fluoresceína na presença do extrato metanólico das cascas de cabeludinha (P. glomerata).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

10000

20000

30000

40000

50000 C


Tempo (min)

Fluo

resc

ênci

a (U

R)

Mertz et al. (2009), relatam um estudo sobre a atividade antioxidante, o teor

de compostos fenólicos e carotenoides de três frutas tropicais (blackberry andina,

naranjila e tomate de árvore), analisando a parte comestível dessas frutas. Os

ácidos fenólicos foram detectados na polpa da naranjila, já os carotenoides foram

semelhantes nas duas variedades de tomate, sendo a atividade antioxidante

analisada pelo método ORAC e equivalente ao suco das frutas: maçã (1,9 mM

TE/g), tomate (1,6 mM TE/g) uva vermelha (4,0 mM TE/g) e laranja (6,8 mM TE/g).

Daniels e colaboradores (2011), investigaram a capacidade antioxidante das

folhas, bulbos, raízes, flores e frutos da Gethyllis multifoliae e Gethyllis villosa. As

flores e os frutos dessas espécies mostraram maior atividade antioxidante quando

comparados com folhas, bulbos e raízes. Esse estudo avaliou a capacidade

antioxidante de outros gêneros, mas relatou de forma importante que muitas vezes

as frutas possuem maior atividade antioxidante do que as demais partes das plantas,

ainda que, as frutas cotenham muitos açúcares, como: glicose, sacarose, frutose,

entre outros.

102

5.2.4 Avaliação antioxidante pelo método de quelação de metais.

A atividade antioxidante do extrato metanólico das sementes de G.

achachairu foi verificada também pela habilidade de quelação do metal ferro (Figura

38). Na concentração de 100 µg/ml o extrato quelou aproximadamente 72%,

impedindo que o metal livre pudesse gerar radicais. Como pode ser observado, à

medida que a concentração aumenta há um acréscimo no percentual de quelação

de metal produzindo um efeito dose-resposta. Por outro lado, os extratos das demais

plantas avaliadas não apresentaram atividade quelante.

Figura 38 - Gráfico do percentual da atividade de quelação de metais em função das diferentes concentrações do extrato metanólico das sementes de G. achachairu.

10 25 40 55 70 85 1000

10

20

30

40

50

60

70

80

Conc. (µµµµg/ml)

% a

tivi

dad

e q

uel

ação

Okoko (2009), verificou a atividade quelante de metais de diferentes frações

do extrato metanólico das sementes de G. kola, sendo que a maior atividade

quelante em percentual foi de 35% com 1,5 µg/ml de fração.

5.2.5 Avaliação da atividade citotóxica.

Em relação à atividade citotóxica pode-se observar que tanto o extrato

metanólico das sementes de G. achachairu quanto o composto isolado, gutiferona A,

103

inibiram o crescimento das células tumorais B16F10 (melanona murino), com valores

calculados de CI50 de: 49,6 ± 2,1 µg/ml e 48,6 ± 5,4 µM, respectivamente (Figura

39).

Figura 39 - Atividade citotóxica do extrato metanólico das sementes de G. achachairu e do composto isolado gutiferona A em células de melanoma murino (B16F10).

30 45 60 75 90

10

25

40

55

70

85

100

semente da garcinia ( µµµµg/ml)

% c

élu

las

viáv

eis

30 45 60 75 90

10

25

40

55

70

85

100

gutiferona A ( µµµµM)

% c

élu

las

viav

éis

Nguyen, Trinh, Nguyen (2012), isolaram três novas benzofenonas

poliisoprenilada, quatro xantonas e o citrato de trimetilo a partir do pericarpo de

Garcinia cochinchinensis. Essas estruturas foram elucidadas por métodos

espectroscópicos, e posteriormente todas as gutiferonas foram testadas quanto a

sua citotoxicidade em três linhagens de células humanas, sendo: MCF-7, Hela e

NCI-H460. A gutiferona Q mostrou melhor atividade citotóxica, IC50 no intervalo de

2,74-4,04 mg/ml contra as células testadas, cujos valores são bem maiores do que

os valores encontrados neste trabalho.

Shadid e colaboradores (2007), avaliaram a atividade citotóxica de compostos

isolados do extrato clorofórmico de G. cantleyana (CI50 variando de 0,22 –

17,17µg/ml) em diferentes linhagens celulares de câncer de ovário, de mama e de

cólon. Estes distintos valores devem-se não somente a diferença da atividade

antitumoral intrínsica dos compostos, mas também da resistência das diferentes

linhagens de células tumorais frente aos tratamentos, por exemplo, células de

melanoma são resistentes a inúmeros compostos utilizados na clínica.

Deng e colaboradores (2012), isolaram da resina de Garcinia hanburyi três

novas xantonas, sendo: ácido garcinólico, ácido 10α-etoxi-9,10-dihidromorellico,

ácido 10α-etoxi-9,10-dihidrogambogênico e mais seis compostos conhecidos. Esses

compostos apresentaram citotoxicidade contra diferentes linhagens celulares.

104

A fração 4 das sementes de G. achachairu na maior concentração testada,

90 µg/ml, apresentou uma citotoxicidade de aproximadamente 43 %, já a fração 3 na

concentração de 90 µg/ml apresentou citotoxicidade de 70 % (CI50 77 µg/ml) (Figura

40).

Figura 40 - Atividade citotóxica das frações da semente de G.achachairu em células de melanoma murino (B16F10).

30 45 60 75 90

0

25

50

75

100

Fr. 3Fr. 4

Conc. (µµµµg/ml)

% c

élul

as v

iáve

is

Muitas pesquisas têm sido realizadas com diferentes plantas em diferentes

áreas da pesquisa farmacêutica, a fim de obter resultados que auxiliem na busca por

novos fitoterápicos ou até mesmo medicamentos que auxiliem na saúde das

pessoas, ou pelo simples fato de ingerir um alimento que contenha compostos

biativos capazes de prevenir ou auxiliar no tratamento de muitas doenças.

Pode-se observar que atualmente existem muitas pesquisas relacionadas às

frutas em virtude destas possuírem compostos biotivos capazes de diversas funções

no nosso organismo, principalmente de atuarem como antioxidantes, e assim evitar

a formação ou a propagação dos danos causados pelos radicais livres, os quais

estão implicados com a etiologia de diversas doenças crônicas não transmissíveis,

como as doenças cardiovasculares e neoplasias.

106

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Com base nos resultados obtidos no presente trabalho pode-se concluir que:

� A avaliação fitoquímica dos extratos metanólicos indicou que somente nos

extratos das sementes de G. achachairu detectaram-se compostos fenólicos,

enquanto nos demais extratos não foram detectados quando revelados com

cloreto férrico.

� O perfil fitoquímico dos extratos dos frutos de S. sessiliflorum (maná-cubiú)

e R. rosaefolius (amora-vermelha) indicou a presença de compostos polares

como carboidratos quando revelados com anisaldeído sulfúrico

� O estudo comparativo com alguns padrões de açúcares mostrou que os

extratos das sementes de G. achachairu contêm sacarose e frutose. O extrato

da casca e da polpa de Plinia glomerata apresentaram sacarose e frutose.

� O extrato da polpa, casca e a semente de D. inconstans (jacu) apresentou

glicose, sacarose e frutose, já o extrato da polpa de S. sessiliflorum (maná-

cubiú) apresentou maltose, sacarose e glicose, sua casca apenas frutose. No

extrato da polpa S. quitoense (naranjila) foi possível observar a presença de

maltose e glicose.

� A análise cromatográfica por CGMS do extrato mais apolar de P. glomerata e

G.achachairu revelou que apresentam composição química distinta e que G.

achachairu apresenta principalmente ésteres de ácidos graxos e os fitosterois

α-sitosterol e γ- sitosterol.

� A análise cromatográfica por CLAE do extrato mais polar de P. glomerata e

G.achachairu também revelou que apresentam composição química distinta e

que G. achachairu apresenta principalmente Gutiferona A.

� Os resultados obtidos no ensaio da atividade antioxidante com o sequestro do

radical DPPH• os extratos metanólicos que obtiveram melhor ação

107

antioxidante foram os das cascas da Cabeludinha (CC) e o da polpa +

sementes da Cabeludinha (PSC).

� No método do sequestro do radical livre ABTS••••, a atividade antioxidante dos

extratos metanólicos mais ativos foram da G. achachairu (extrato metanólico

das sementes - SG) e P. glomerata (extrato metanólico da casca - CC)

comparadas com os controles positivo trolox e vitamina C.

� No método do ORAC o extrato metanólico das sementes de G. achachairu,

em diferentes concentrações em função do tempo, foi o que melhor

apresentou atividade antioxidante, superior inclusive ao do composto isolado

Gutiferona A.

� Em relação à determinação de compostos fenólicos totais os extratos

metanólicos das cascas dos frutos da garcinia e as sementes da Jacu

apresentaram maior conteúdo de polifenóis.

� Na determinação do potencial antioxidante pelo método de quelante de

metais, o extrato metanólico das sementes de G. Achachairu foi o único que

mostrou atividade antioxidante.

� No teste de citotoxicidade, o extrato metanólico das sementes de G.

achachairu e o seu composto isolado (Gutiferona A), inibiram o crescimento

das células tumorais B16F10, sendo que ambos inibiram em 50% o

crescimento celular em concentração inferior a 50 µg/ml.

108

REFERÊNCIAS

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