universidade federal de sergipe programa de pÓs … · etapa de preparo do canal, torna-se...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
CITOTOXICIDADE DE MEDICAÇÕES INTRACANAIS
EM FIBROBLASTOS L929
Aracaju-SE
Fev/2014
ii
MICHELLE DE PAULA FARIAS
CITOTOXICIDADE DE MEDICAÇÕES INTRACANAIS
EM FIBROBLASTOS L929
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia, da Universidade
Federal de Sergipe, para obtenção do título de
Mestre em Odontologia.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Amália Gonzaga Ribeiro
Aracaju-Se
2014
iii
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos:
A Deus por toda proteção, força e inspiração concedidas.
A minha mãe, que sempre foi uma pessoa muito estudiosa e responsável, com certeza,
onde estiver, está orgulhosa por me ver conquistando mais essa etapa da minha vida.
Ao meu pai, por incentivar sempre o meu aperfeiçoamento e crescimento profissional.
Ao meus pequenos irmãos José e Joana pela alegria e total energia transmitidos durante
os 24 meses de realização desse curso. Em especial, a minha irmã Mônica, que mesmo morando
em outro estado, sempre me ajudou, ouvindo minhas angústias e alegrias. Amo muito vocês!
Ao meu noivo Benjamim, que sempre foi meu porto seguro, presente em todos os
momentos da minha vida (inclusive ficando comigo nos finais de semana até de madrugada no
laboratório e sem reclamar!). Quero realmente te agradecer, Amor, sem você essa caminhada
teria sido muito mais árdua. Te amo!
A minha orientadora, Profª. Dra. Maria Amália Gonzaga Ribeiro, pela paciência,
conhecimentos transmitidos e exemplo de humanidade para com os pacientes.
Ao Prof. Dr. Adriano Augusto Melo de Mendonça, pela tranquilidade, conhecimento,
atenção e disponibilidade transmitidos durante todo o curso.
Aos Prof. Dr. Wilton Mitsunari Takeshita e Dr. André Luis Faria e Silva pela ajuda
(aliás, mais que ajuda!) na realização da parte mais difícil da dissertação: a estatística.
Ao Prof. Dr. Roque Pacheco de Almeida, por ter aberto as portas do Laboratório de
Biologia Molecular do HU/UFS e permitido que essa pesquisa pudesse ser realizada.
A todos que fazem parte do Laboratório de Biologia Molecular do HU/UFS, em
especial, as doutorandas Luana e Fabrícia por todo empenho e paciência do mundo em me
explicar como tudo funcionava, me orientando desde a compra dos materiais até a leitura das
placas. Foram vários momentos e telefonemas para saber se as células estavam fungadas ou
não, não é verdade? Muito obrigada!
A graduanda Nayane e o mestrando Gustavo pela colaboração para a execução de toda
a metodologia, deixando suas vidas, profissional e pessoal, para auxiliar-me em horários
inconvenientes. Obrigada!
iv
A todas as turmas da disciplina de Endodontia e do Projeto de Extensão da UFS que me
deram a oportunidade de conhecer a vida acadêmica, agora de um novo ângulo, como
mestranda.
Aos meus amigos do curso de Mestrado pelo carinho, amizade e apoio recebidos. O
percurso foi longo e pedregoso, mas chegamos ao final, todos com o título de VENCEDORES.
Parabéns!!!!
Meu muito OBRIGADA!
v
RESUMO
As medicações intracanais são substâncias utilizadas no tratamento endodôntico que necessitam
apresentar biocompatibilidade com os tecidos perirradiculares, de modo a não causar danos
teciduais e nem interferir no processo de reparo. O estudo objetivou avaliar a citotoxicidade de
medicamentos de uso endodôntico, quando em contato com células fibroblásticas de murinos
L929, em diferentes períodos de observação. Para avaliar a citotoxicidade, foram utilizadas três
medicamentos e três veículos, divididos em sete grupos experimentais, a saber: hidróxido de
cálcio-paramonoclorofenol canforado-glicerina (HPG); iodofórmio-glicerina (IG); hidróxido
de cálcio-iodofórmio-água destilada (HCI); iodofórmio-água destilada (IA); hidróxido de
cálcio-água destilada (HC); Otosporin® (OT) e grupo controle - composto por células e meio
de cultura. Foram preparados os eluatos das medicações sendo estes colocados em contato com
as células (1 x 105 células/poço) por períodos de 24h, 48h, 72h, 5 e 7 dias. Após cada tempo
experimental, foi executado o ensaio colorimétrico, utilizando o reagente metiltetrazólio (MTT)
e a leitura das placas foi realizada no espectrofotômetro utilizando a densidade óptica de 570nm.
Os dados foram tabulados e submetidos a análise por meio da ANOVA-Tukey, com um nível
de significância de 5%. Em 24h, IG e OT (P<0,001) demonstraram maior citotoxicidade, fato
este também observado pelo grupo OT (P<0,001) quando analisado em 48h. Em 72h, pôde-se
observar que os grupos HC e OT foram mais citotóxicos quando comparados ao grupo controle.
Estes resultados também foram demonstrados nos grupos HPG, IA, HC e OT em 5 dias. Em 7
dias todas as medicações apresentaram citotoxicidade, porém o grupo OT mostrou-se mais
citotóxico (P<0,001). Com relação ao fator tempo experimental, foi observado em todos os
grupos diferença significativa entre 24h e 7 dias. Conclui-se que todas as medicações
apresentaram citotoxicidade em algum momento da pesquisa sendo o Otosporin® a medicação
intracanal mais citotóxica e, que o tempo influenciou na citotoxicidade de todas medicações
analisadas.
Descritores: Citotoxicidade; Endodontia; Hidróxido de cálcio; Iodofórmio; Fibroblastos.
vi
ABSTRACT
Intracanal dressings are substances used during endodontic treatment and requiring
biocompatible with periradicular tissues, not causing tissue damage or interfere in repair
process. This study aimed to assess the cytotoxicity of endodontic dressing when in contact
with L929 mouse fibroblast cells, after different periods. To assess the cytotoxicity of three
intracanal dressings and three vehicles were divided into seven groups, namely: calcium
hydroxide/camphorated paramonochlorophenol/ glycerin (CPG); iodoform/ glycerin (IG);
calcium hydroxide/iodoform/distilled water (CIW); iodoform/distilled water (IW); calcium
hydroxide/distilled water (CW); Otosporin® (OT); and control group. The eluates of the
medications were prepared and placed in contact with the cells (1 x 105 cells/well) during
periods of 24, 48, 72hours, 5 and 7 days. After each evaluation time, a colorimetric assay was
conducted using methyl tetrazolium reagent (MTT) and the reading of the plates was performed
in a spectrophotometer with optical density of 570 nm. Data were tabulated and subjected to
statistical analysis by ANOVA-Tukey test with a significance level of 5%. At 24hours, IG and
OT (P <0.001) showed greater cytotoxicity, as also observed by the OT group (P <0.001) when
analyzed in 48hours. In 72 hours, it could be observed that the CW and OT groups were more
cytotoxic compared to the control group. These data were also demonstrated in groups CPG,
IW, CW and OT in 5 days. Within 7 days all drugs showed cytotoxicity, but OT group showed
the most cytotoxic (P <0.001). With respect to experimental time factor was observed in all
groups significant differences between 24hours and 7 days. It is concluded that all medications
showed cytotoxicity at some point in the research being Otosporin ® the most cytotoxic and
that time influenced the cytotoxicity of all medications analyzed intracanal medication.
Keywords: Cytotoxicity; Endodontics; Calcium hydroxide; Iodoformium; Fibroblasts.
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Manipulação da pasta de hidróxido de cálcio-água destilada. 33
Figura 2. Manipulação da pasta de iodofórmio-glicerina. 33
Figura 3. Preparação dos eluatos das medicações intracanais na placa de cultura de
24 poços. 34
Figura 4. Placa de cultura de 96 poços contendo células fibroblásticas L929, reagente
MTT e meio de cultura RPMI 1640 sem soro bovino fetal. 36
Figura 5. Remoção da solução de MTT e visualização da coloração azul no fundo dos
poços. 37
Figura 6. Aparelho agitador de microplacas com a placa de cultura de 96 poços com
isopropanol acidificado com HCL 0,04M/l. 37
Figura 7. Placa de cultura de 96 poços com cristais de formanzan dissolvidos. 38
Figura 8. Leitura da placa de cultura de 96 poços no espectrofotômetro. 38
Figura 9. Relação valores de absorbância x tempos experimentais. 41
viii
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1. Descrição dos grupos e das dosagens das medicações intracanais. 32
Tabela 1. Resultados de citotoxidade em média (DP) expressa em unidades
de absorbância. 40
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
°C Graus centígrado
® Marca registrada
µg/mL Microgramas por mililitro
µL Microlitros
% Porcentagem
π Letra grega pi
BrdU 5-bromo-29-deoxyuridine
Ca2+ Cálcio
cm2 Centímetro quadrado
cm2/mL Centímetro quadrado por mililitro
CO2 Dióxido de carbono
DNA Ácido desoxirribonucleico
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
g Grama
h Altura
hGF Células fibroblásticas gengivais humanas
HCT20 Solução de hidróxido de cálcio e lauril sulfato de sódio
HPG Hidróxido de cálcio-paramonoclorofenol canforado-glicerina
IGF Fator de crescimento semelhante à insulina
ISO International Organization of Standardization
LPS Lipopolissacarídeo
mg/mL Miligramas por mililitros
min Minuto
mL Mililitro
mm Milímetros
x
mM Milimolar
MMP Matrix metaloproteinase
MTA Agregado de trióxido mineral
MTAD Doxiciclina-ácido cítrico-detergente Tween 80
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio brometo
MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximethoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-
2H-tetrazolio
M/l Molar por litro
nm Nanômetro
OH- Hidroxila
P.A Pró-análise
PCR Polymerase chain reaction
pH Potencial hidrogêniônico
PMCC Paramonoclorofenol canforado
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas
r Raio
Rpm Rotações por minuto
RPMI Meio de cultura (Roswell Park Memorial Institute)
SFB Soro fetal bovino
SCR Sistema de canais radiculares
TNF-α Fator alfa de necrose tumoral
THP-1 Células monócitos
UI/mL Unidade internacional por mililitro
U2OS Linhagem de células osteoblástica humanas
V Volume
WST 2-(2-methoxi-4-nitrofenil)-2H-tetrazolio
XTT Sódio 2,3-bis(2-metóxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)-
Carbonil]-2H-tetrazolio
xi
SUMÁRIO
1. Introdução 13
2. Revisão de Literatura 14
2.1 Biocompatibilidade 14
2.2 Medicação Intracanal 14
2.2.1 Hidróxido de cálcio P.A 15
2.2.2 Iodofórmio 16
2.2.3 Otosporin® 16
2.2.4 Veículos 17
2.3 Cultura de Células 18
2.4 Testes de Citotoxicidade 19
2.5 Pesquisas de Citotoxicidade de Medicações Intracanais 20
3. Proposição 26
3.1 Objetivo Geral 26
3.2 Objetivos Específicos 26
4. Metodologia 27
4.1 Delineamento Experimental 27
4.1.1 Tipo de Estudo 27
4.1.2 Variáveis 27
xii
4.1.3 Local da pesquisa 27
4.2 Materiais e Equipamento Utilizados 28
4.3 Procedimentos Laboratoriais 29
4.3.1 Descongelamento das Células 29
4.3.2 Cultivo das Células 30
4.3.3 Plaqueamento 31
4.3.4 Divisão dos Grupos Experimentais 31
4.3.5 Preparo dos Corpos de Prova e dos Eluatos 32
4.3.6 Contato das Células com os Eluatos 35
4.3.7 Teste de Citotoxicidade 35
4.4 Avaliação dos Dados e Análise Estatística 39
5. Resultados 40
6. Discussão 43
7. Conclusão 47
Referências 48
13
1 INTRODUÇÃO
O avanço técnico-científico dos instrumentos endodônticos, das técnicas de preparo, das
substâncias irrigantes, dos medicamentos intracanais e dos materiais obturadores, não
conseguiu erradicar os microrganismos presentes no sistema de canais radiculares (SCR), por
vezes, resistentes às substâncias químicas utilizadas durante o preparo químico-mecânico, ou,
devido a complexa morfologia dos condutos radiculares como istmos, foraminas, ramificações,
reentrâncias, canais laterais, acessórios e deltas apicais1,2,3. Essa morfologia pode dificultar a
limpeza correta dos túbulos dentinários possibilitando a permanência do biofilme bacteriano, e
do lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), levando o tratamento endodôntico ao fracasso4,5.
Com o principal objetivo de combater os possíveis microrganismos que resistiram a
etapa de preparo do canal, torna-se imperioso a colocação da medicação intracanal no SCR1.
Para isso, essas medicações devem apresentar-se biocompatíveis com os tecidos
perirradiculares uma vez que permanecem em contato direto com o ligamento periodontal,
cemento e, por vezes, com o tecido ósseo, como nos casos de extravasamentos acidentais ou
intencionais.
Como forma de conhecer os possíveis efeitos tóxicos das medicações intracanais,
estudos em animais e testes de citotoxicidade com diversas células do periodonto têm sido
realizados pela comunidade científica6-10.
Apesar das pesquisas demonstrarem que algumas medicações intracanais apresentam
citotoxicidade aos tecidos, dados científicos relacionados a esse assunto ainda podem ser
considerados escassos na literatura3,11. Diante disso, este estudo teve por objetivo avaliar o
efeito citotóxico de medicações intracanais, sobre a viabilidade dos fibroblastos em diferentes
períodos observacionais.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 BIOCOMPATIBILIDADE
A biocompatibilidade é a capacidade que um material possui em causar o mínimo de
reação alérgica, inflamatória e tóxica quando em contato com os tecidos, de modo a não
promover destruição tecidual e nem interferir no processo de cura12.
Dos medicamentos utilizados na prática endodôntica, têm-se exigido que possuam a
propriedade da biocompatibilidade, não sendo carcinogênico e nem genotóxico as células, pois
são colocados no interior dos canais radiculares, próximos aos tecidos periapicais e, por vezes,
em íntimo contato com eles, como nos casos de extravasamentos via forame apical, reabsorções
radiculares e perfurações radiculares13-16.
Os produtos da degradação desses materiais também podem entrar em contato, com as
células existentes nos tecidos perirradiculares, resultando em inflamação, com uma enorme
variedade de mediadores químicos inflamatórios, incluindo, a histamina, as cininas, e
neuropeptídios, que em altos níveis causam destruição tissular e retardam o processo
cicatricial10. Por isso, esses medicamentos devem possuir a capacidade de induzir o reparo na
região lesada sem interferir na osteogênese e cementogênese7,17.
2.2 MEDICAÇÕES INTRACANAIS
As medicações intracanais são substâncias inseridas nos condutos radiculares entre as
sessões do tratamento endodôntico e apresentam alguns objetivos tais como: eliminar os
microrganismos que sobreviveram ao preparo biomecânico, neutralizar endotoxinas, impedir a
entrada de microrganismos provenientes da saliva, diminuir a sintomatologia dolorosa e o
15
processo inflamatório perirradicular, solubilizar matéria orgânica, controlar a reabsorção
dentária inflamatória externa e estimular a reparação por tecido mineralizado13,18-25.
Na prática endodôntica, alguns medicamentos intracanais podem ser utilizados como o
hidróxido de cálcio P.A, o iodofórmio e o Otosporin®2,11,21.
2.2.1 HIDRÓXIDO DE CÁLCIO P.A
O hidróxido de cálcio se apresenta na forma de um pó branco, com partículas de
tamanho e formato que possibilitam a penetração direta nas aberturas dos túbulos dentinários26.
Essa substância apresenta uma série de indicações justificando o seu uso de forma abrangente
na prática endodôntica como em casos que necessitam de capeamento pulpar direto, em
pulpectomias, necropulpectomias sem e com lesão periapical, trauma dental rizogênese
incompleta, reabsorções radiculares e em revascularização13,24,27-30.
A principal característica do hidróxido de cálcio é possuir pH alcalino, com valor de
12,831, proporcionado pela alta disponibilidade dos íons hidroxila (OH-) após a dissociação do
hidróxido de cálcio em íons Ca2+ e OH-, quando em meio aquoso32. O pH alcalino é o
responsável pela propriedade antimicrobiana observada neste medicamento33,34 sendo que os
íons Ca2+ apresentam o papel de auxiliar na formação de tecido mineralizado14,35. Essa
substância ainda expressa a capacidade de dissolver tecido orgânico e de neutralizar a
endotoxina bacteriana21,22,25,36.
O hidróxido de cálcio quando em contato direto com os tecidos subcutâneos induz
reação inflamatória de intensidade moderada a severa sendo observada desnaturação proteica
das células, neutrofilia, área de necrose e calcificações distróficas. Com o passar do tempo o
hidróxido de cálcio induz proliferação angioblástica moderada, tecido fibroso com cápsula e
quantidade moderada de fibras colágenas37-39. Mesmo apresentando essas reações teciduais,
alguns estudos consideram o hidróxido de cálcio biocompatível e não genotóxico40-42 uma vez
que a reação tecidual não causa danos irreparáveis aos tecidos. A biocompatibilidade dessa
substância está relacionada com a sua pouca solubilidade, posto que a liberação e dissolução
dos seus componentes para o meio ocorrem lentamente31.
16
2.2.2 IODOFÓRMIO
O iodofórmio apresenta-se comercialmente na forma de cristais, com coloração amarelo
- brilhante, radiopaco e pouco solúvel em água43,44. É composto por alto teor de iodo que
proporciona a este medicamento grande poder antimicrobiano,45 sendo bastante utilizado em
tratamento endodôntico de dentes decíduos com necrose pulpar, obtendo altos índices de
sucesso46.
O iodofórmio apresenta biocompatibilidade com os tecidos promovendo menor duração
da reação inflamatória quando comparado as outras medicações intracanais, apresentando uma
pequena área de necrose restrita à região da ferida e circundada por infiltrado inflamatório de
intensidade discreta, com predomínio de macrófagos47. No entanto, Moskovitz et al.48 (2012)
observaram que o iodofórmio pode causar irritação nos tecidos ao redor do ápice radicular,
sendo capaz de causar reabsorção radicular externa.
Entretanto, o iodofórmio após o contato com células de osteossarcoma humano, não
promoveu destruição do DNA, apresentando-se como não genotóxico aos tecidos49.
2.2.3 OTOSPORIN®
O Otosporin® é uma associação do corticosteróide hidrocortisona, associada aos
antibióticos sulfato de polimixina B e sulfato de neomicina, destinado inicialmente as infecções
no ouvido, como por exemplo, a otite externa. Entretanto, passou a ser utilizado na Endodontia
pelas suas excelentes propriedades anti-inflamatória, imunossupressora e vasoconstritora,
modulando dessa forma, a intensidade da reação inflamatória provocada pelo ato cirúrgico da
pulpectomia e, consequentemente, eliminando a dor pós-operatória50. Apresenta-se,
comercialmente, em suspensão aquosa, com pH ácido (5,4)51, na cor branca, sendo de fácil
manipulação, inserção e remoção dos condutos radiculares52.
Os antibióticos que compõem o Otosporin® apresentam ação sobre microrganismos
gram-negativos, especialmente Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli, e alguns gram-
17
positivos como os estafilococos53. Entretanto, para neutralizar a endotoxina bacteriana, este
medicamento não demonstrou efetividade54.
Com relação à parte biológica, foi observado que o Otosporin®, como medicação
intracanal, induziu uma resposta inflamatória severa aos tecidos com intenso infiltrado
neutrofílico e abscessos, após 7 dias da realização da pulpectomia em dentes de cães e em
subcutâneo de ratos. Esse resultado deve-se a inativação desta medicação após 72h e a limitação
da atividade anti-inflamatória do Otosporin® à fase aguda da inflamação, sendo pequena a
influência em estágios mais avançados da resposta inflamatória39,55.
2.2.4 VEÍCULOS
Os veículos são substâncias adicionadas ao soluto para a formação do curativo de
demora, cujo o objetivo é facilitar o processo de manipulação e inserção da medicação
intracanal no canal radicular, bem como, também de permitir maior dissociação e difusão dos
seus componentes químicos para o meio53.
Os veículos podem ser: aquosos, tais como água destilada, soro fisiológico e solução
anestésica; viscosos como glicerina, propileno glicol e polietileno glicol; e os oleosos, como
óleo de oliva e cânfora. A escolha desses veículos vai depender do processo patológico pulpar
instalado e da disponibilidade de tempo do paciente, uma vez que ocorre variação na velocidade
de dissociação dos componentes químicos da medicação intracanal com quem os veículos se
associam. Os aquosos proporcionam maior liberação do princípio ativo da medicação
intracanal, enquanto que os viscosos e os oleosos apresentam liberação de íons moderada e
lenta, respectivamente32.
A cânfora passou a ser associada ao paramonoclorofenol com a finalidade de diminuir
seu poder irritante56 e, dessa maneira, poder ser utilizado como veículo ativo nas medicações
intracanais. Sua citotoxicidade também é reduzida quando associado ao hidróxido de cálcio na
pasta hidróxido de cálcio-paramonoclorofenol canforado-glicerina (HPG)57-59. Apesar de ser
um veículo viscoso, algumas pesquisas demonstraram que o paramonoclorofenol canforado
18
(PMCC) permitiu alta disponibilidade de íons da medicação intracanal associada a ele para o
meio32,60.
Essa substância apesar de apresentar propriedade antimicrobiana contra o E. faecalis e
Streptococcus mutans1,61 e de induzir irritação aos tecidos, não possui efeito genotóxico e nem
mutagênico às células teciduais49.
2.3 CULTURA DE CÉLULAS
O método de utilizar células em experimentos laboratoriais foi desenvolvido como
forma de estudar as células animais fora do organismo, em um ambiente controlado, utilizando
um meio de cultura com composição padrão, ambiente de incubação definido, condições de
trabalho estéreis, além de apresentar homogeneidade na amostra quando comparada ao uso de
animais em experimentos6.
A técnica de cultura celular, por ser um experimento in vitro, apresenta algumas
diferenças quando comparada com o modelo in vivo, como, por exemplo, a proliferação celular
que ocorre de forma tridimensional quando nos tecidos, enquanto que no laboratório apresenta
um meio que favorece o espalhamento e migração da célula. Apesar disso, o cultivo celular
tornou-se o principal modelo para substituição de animais em experimentos como forma de
protegê-los e diminuir sua aplicabilidade, sendo incentivado pelos comitês de ética de pesquisa
em animal62.
Dessa forma, a cultura celular também passou a ser utilizada em pesquisas na área da
Odontologia com a finalidade de analisar o processo de cura dos tecidos e os diferentes
mecanismos que causam a morte e/ou dano celular provocados por materiais odontológicos63.
Em uma cultura celular, as células podem ser primárias - quando são oriundas de um
fragmento de tecido e obtidas por desagregação mecânica ou enzimática sendo mantidas suas
características genotípicas e fenotípicas por um curto tempo de vida; contínuas ou permanentes–
são células mais estáveis que sobreviveram ao processo de repicagem apresentando alta
capacidade de proliferação e ainda guardam características do tecido de origem; e, células
19
transformadas – quando as características das células são modificadas deixando de ser
semelhante ao tecido original64.
Diversos tipos celulares tem sido utilizados para a análise de citotoxicidade como
fibroblastos de humanos e de murinos, macrófagos de humanos e de murinos, células-tronco,
odontoblastos, osteoblastos, leucócitos e monócitos9,11,65-70. Essas células são escolhidas a
depender das características biológicas dos materiais que serão testados e do objetivo do
estudo63.
Os fibroblastos são um típico modelo de células utilizados em ensaios de citotoxicidade
devido ao seu rápido e fácil crescimento9. São os maiores constituintes do tecido conjuntivo,
sendo o tipo de célula mais predominante no ligamento periodontal e os maiores produtores de
colágeno, elastina, glicosaminoglicanas e glicoproteínas - componentes da matriz extracelular7.
Dessa maneira, participam de forma intensa da reparação tecidual, migrando para a ferida após
serem ativados pelos fatores quimiotáxicos secretados pelos macrófagos como fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α).
Multiplicam-se, secretam citocinas (interleucinas e TNF-α) e fatores de crescimento semelhante
à insulina (IGF-I e IGF-II), produzem colágeno tipo III, proteoglicans, fibras elásticas e
colágeno tipo I12.
Para as pesquisas de citotoxicidade, podem ser utilizadas as células de humanos e de
murinos uma vez que apresentam comportamento similar e, por isso, são apropriadas para os
modelos in vitro de testes de viabilidade e proliferação de produtos endodônticos71.
2.4 TESTES DE CITOTOXICIDADE
Os testes de citotoxicidade apresentam algumas vantagens tais como simplicidade,
rapidez, economia e a capacidade de testar um grande número de materiais sob as mesmas
condições quando comparados com outros métodos6.
A análise da citotoxicidade pode ser observada através da viabilidade e proliferação das
células em métodos de ensaio, como o colorimétrico, que utilizam reagentes e corantes para
20
destacar as células facilitando sua contagem, sendo que alguns corantes penetram nas células
mortas e outros, reagem com as células vivas. Diversos reagentes e corantes tem sido citados
na literatura tais como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio brometo (MTT), 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-yl)-5-(3-carboximethoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), 2-(2-
methoxi-4-nitrofenil)-2H-tetrazolio (WST), sódio 2,3-bis(2-metóxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-
[(fenilamino)-carbonil]-2H-tetrazolio sal interno (XTT), azul de Trypan, cristal violeta, laranja
de acrodinia e vermelho neutro8,11,17,65,72-75.
O ensaio colorimétrico com o reagente MTT vem sendo utilizado frequentemente para
avaliar a citotoxicidade inespecífica de diversos tipos de materiais odontológicos dentre eles
também os endodônticos, por ser um teste padronizado pela International Organization of
Standardization (ISO) 10993-576 (2009), simples, versátil, rápido, confiável, reproduzível e que
não utilizam radioisótopos8,9,77,78.
Mosmann79 (1983) descreveu, com detalhes, esse método que está baseado na
mensuração da atividade mitocondrial através da clivagem do anel do sal tetrazólio pela enzima
succinildesidrogenase existente nas células. Durante essa quebra ocorre a conversão da solução
amarela do MTT em cristais de formazan azuis escuro. Dessa forma, somente células vivas
realizam essa redução enquanto células mortas ou com algum tipo de dano, não conseguem
reagir com a solução.
2.5 PESQUISAS SOBRE CITOTOXICIDADE DE MEDICAÇÕES INTRACANAIS
A literatura é vasta quando se trata de pesquisas científicas sobre citotoxicidade de
materiais endodônticos entretanto, é escassa quando o assunto é citotoxicidade de medicações
intracanais. Nesse ínterim, estão os estudos citados abaixo como os de:
Chang et al.80 (1998) analisaram a citotoxicidade e genoticidade do fenol canforado e o
PMCC em cultura de células fibroblásticas pulpares humanas utilizando o ensaio de
fluorescência com o corante iodeto de propídio, para a análise da viabilidade celular e, o ensaio
de precipitação de DNA, para a análise genotóxica. Os autores utilizaram na pesquisa
concentrações que variaram de 0,01 a 10 mM e, após 24h, foi observado que os dois materiais
21
foram citotóxicos aos fibroblastos, sendo que o PMCC foi mais citotóxico que o fenol canforado
e que nenhum dos dois apresentaram genotoxicidade.
Guigand et al.81 (1999) avaliaram a compatibilidade de três materiais endodônticos:
hidróxido de cálcio, óxido de cálcio e cimento a base de óxido de zinco e eugenol quando em
contato com fibroblastos de murino NIH3T3, através de três técnicas complementares: método
colorimétrico MTT, microscopia eletrônica de varredura e citometria de fluxo. A leitura foi
realizada através do espectrofotômetro com densidade óptica de 570nm, nos períodos
experimentais de 24h, 72h e 7 dias. Os autores observaram que o cimento de óxido de zinco e
eugenol foi o mais citotóxico dos três e, que o óxido de cálcio e o hidróxido de cálcio obtiveram
comportamentos semelhantes. No período de 24h, o hidróxido de cálcio apresentou 97% de
células viáveis, em 72h esse valor diminuiu para 83% e em 7 dias observou-se proliferação
celular comparável ao grupo controle.
Al-Shaher et al.82 (2004) analisaram a toxicidade do hidróxido de cálcio e do própolis
em células da polpa e do ligamento periodontal após serem isoladas de terceiros molares
extraídos. Foram realizadas diluições de 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 2,4mg/ml dos materiais e colocados
em contato com as células por 20h. Após esse período, a análise foi realizada com o corante
cristal violeta utilizando espectrofotômetro num comprimento de onda de 550nm. Os autores
observaram que o hidróxido de cálcio, mesmo em concentrações pequenas como 0,4mg/ml
matou mais de 75% das células do ligamento periodontal e mais de 90% das células da polpa e
concluíram que o hidróxido de cálcio apresentou maior citotoxicidade do que o própolis.
Barnhart et al.83 (2005) mensuraram a citotoxicidade do hipoclorito de sódio, do iodeto
de potássio, dióxido de cloro, dicloridrato de betaistina (Betadine) e solução de hidróxido de
cálcio quando em contato com fibroblastos gengivais humanos por 15 minutos utilizando kit de
ensaio CyQuant. Os autores fizeram algumas diluições tais como 0,01%, 0,1%, 1%, 10% e
observaram que o dicloridrato de betaistina foi o mais citotóxico de todos os materiais testados
e a solução de hidróxido de cálcio foi a que apresentou o maior número de células vivas,
juntamente, com o iodeto de potássio.
Silva et al.84 (2008) avaliaram a citotoxicidade e a atividade da fosfatase alcalina da
pasta de hidróxido de cálcio (Calen) e da associação dessa pasta com a clorexidina a 0,4% na
concentração de 25µg/mL quando em contato com os osteoblastos durante 3, 7 e 10 dias. Para
análise da citotoxicidade foi utilizado o reagente MTT num comprimento de onda de 570nm.
22
Os autores concluíram que não houve diferença significativa entre as pastas testadas nem com
relação a viabilidade e nem na atividade da fosfatase alcalina. Em 7 dias houve um aumento na
viabilidade celular de todas as pastas que foi semelhante com 10 dias.
Barbosa et al.85 (2009) analisaram a citotoxicidade de uma solução saturada de
hidróxido de cálcio, lauril sulfato de sódio e a associação desses dois (HCT20) em quatro
concentrações (5%, 10%, 20% e 50%) sobre células fibroblásticas L929 utilizando o método
do cromo radioativo. Após os períodos experimentais de 4 e 24h, foi observado que todas as
soluções demonstraram algum nível de toxicidade sendo que, na concentração de 50%, a
solução de hidróxido de cálcio foi mais citotóxica, enquanto que nas demais seu comportamento
foi similar ao grupo controle.
Correa et al.67 (2009) avaliaram a citotoxicidade do AH Plus, Fill Canal e de uma pasta
a base de hidróxido de cálcio em monócitos THP-1. Foram realizadas várias diluições a partir
do extrato original (100%) em 10%, 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% e 0,0001% com o próprio meio
de cultura utilizado na metodologia, RPMI 1640. Após 24h em contato com as células, foi
realizado o teste de viabilidade celular utilizando o corante azul de Trypan 0,2% e, observou-
se que o extrato original e a diluição de 10% de todos os produtos testados, diminuíram
significativamente a viabilidade celular, e que diluições abaixo de 1% causaram mínima morte
celular quando comparadas com o controle. Entre os materiais testados, a pasta a base de
hidróxido de cálcio foi a que apresentou a menor citotoxicidade quando em contato com os
monócitos.
Sepet et al.86 (2009) avaliaram a viabilidade, citomorfologia e a proliferação dos
fibroblastos 3T3, quando em contato com as pastas de hidróxido de cálcio e agregado de
trióxido mineral (MTA) no períodos experimentais de 24h, 48h e 7 dias, utilizando o corante
azul de Trypan 0,4% para a análise da viabilidade e o 5-bromo-29-deoxyuridine (BrdU) para a
análise da proliferação celular através da imunohistoquímica. Foi observado que a morfologia
das células não foi alterada com o passar dos períodos de incubação com nenhum dos materiais
analisados e, que o número de células viáveis em contato com o hidróxido de cálcio foi
diminuindo de acordo com os tempos experimentais, porém sem redução significativa. Não
houve proliferação celular quando em contato com nenhum dos dois materiais, apresentando
apenas efeito citostático no período de 24h para o MTA e, 48h para o hidróxido de cálcio.
23
Yasuda et al.3 (2010) investigaram o efeito da pasta de hidróxido de cálcio, do peróxido
de hidrogênio 3%, do hipoclorito de sódio a 5,25%, do etileno de amino tetra acético (EDTA)
a 17%, da clorexidina a 0,12% e da associação entre doxiciclina-ácido cítrico-Tween 80
(BioPure MTAD) na viabilidade, na atividade da fosfatase alcalina e na expressão do gene da
sialoproteína óssea, utilizando células osteobláticas MC3T3-E1 e do ligamento periodontal.
Após 24h de exposição das células às várias concentrações (500-10.000µg/mL) dos materiais
analisados, foi realizado o ensaio com MTT, apresentando baixa porcentagem de células
viáveis, quando em contato com a pasta de hidróxido de cálcio em praticamente, todas as
concentrações analisadas. No que se refere a atividade da fosfatase alcalina e a expressão do
gene da sialoproteína óssea, não foi observado diminuição significativa na atividade, indicando
que pasta de hidróxido de cálcio não interfere na diferenciação e nem no processo de
mineralização das células.
Miura et al.87 (2010) analisaram a toxicidade do hidróxido de cálcio, PMCC,
Otosporin®, formocresol em células-tronco. Foram utilizadas diluições 1:9, 1:27 e 1:81 das
medicações e deixadas em contato por 2 horas com as células. Após esse período, a viabilidade
celular foi analisada utilizando o ensaio colorimétrico MTT e foi observado que o PMCC e o
formocresol apresentaram alta toxicidade próximo a 100% em todas as diluições, o Otosporin®
apresentou baixa citotoxicidade nas maiores diluições e alta citotoxicidade na menor diluição,
enquanto o hidróxido de cálcio demonstrou ser o menos citotóxico em todas as diluições.
Ruparel et al.70 (2012) avaliaram a sobrevivência de células-tronco humana da papila
apical quando em contato com a pasta antibiótica tripla (metronidazol, ciprofloxacino e
minociclina), pasta antibiótica dupla (metronidazol e ciprofloxacino), pasta antibiótica tripla
modificada (metronidazol, ciprofloxacino, cefaclor), amoxicilina com ácido clavulânico
(Augmentin) e pasta de hidróxido de cálcio (Ultracal- Ultradent, South Jordan, UT), nas
concentrações de 100mg/mL até 0,001mg/mL por 3 dias. Para isso, os autores utilizaram o
ensaio com o corante azul de Trypan e concluíram que a pasta de hidróxido de cálcio, em todas
as concentrações, promoveu sobrevivência celular, enquanto que nas demais pastas, isso só
ocorreu nas maiores diluições, a partir da concentração 1mg/mL.
Silva et al.74 (2012) investigaram a citotoxicidade e a atividade gelatinolítica das
enzimas matriz metaloproteínase 2 (MMP-2) e 9 (MMP-9) produzidas pelos fibroblastos 3T3
após a estimulação com cimento de aluminato de cálcio (EndoBinder- Binderware, São Carlos,
24
SP, Brasil), MTA, hidróxido de cálcio P.A por 24h. Para a citotoxicidade, foi utilizado o ensaio
MTT, sendo lido em espectrofotômetro com a densidade óptica de 570nm, e para a mensuração
da atividade gelatinolítica, foi realizado o ensaio de zimografia. Os autores concluíram que o
hidróxido de cálcio P.A. apresentou menor viabilidade celular e maior expressão da atividade
gelatinolítica da MMP-2 quando comparado aos demais materiais testados. Nenhum deles
induziram a atividade gelatinolítica da MMP-9.
O estudo de Petel et al.11 (2013) avaliou a viabilidade dos macrófagos RAW 264,7 e
das células epiteliais RKO quando em contato, direto e indireto, com um material indicado para
tratamento de pulpectomia de dentes decíduos a base de hidróxido de cálcio-iodofórmio-
silicone (Endoflas F.S- Sanlor&Cia, Colombia). Foram produzidos extratos dessa medicação
em várias concentrações (1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512 e 1/1024) e
colocados em contato com as células por 24h. A viabilidade celular foi testada com o método
colorimétrico XTT e foi observado que em altas concentrações o material reduziu a viabilidade
celular dos macrófagos em 80%, enquanto que para as células epiteliais essa redução foi de
60% possuindo, dessa forma, efeito citotóxico. Em baixas concentrações, o efeito foi
proliferativo.
Yadlapati et al.78 (2013) analisaram a citotoxicidade da pasta antibiótica tripla
(metonidazol, ciprofloxacino, minociclina), da pasta antibiótica dupla (metronidazol e
ciprofloxacino), minociclina e hidróxido de cálcio em pó quando em contato com fibroblastos
do ligamento periodontal humano. Outro objetivo do estudo foi avaliar a habilidade desses
medicamentos em induzir citocinas como interleucina-1α, interleucina-1β, interleucina-6,
interleucina-8, interleucina-10, interleucina-16 e TNF-α dos fibroblastos. Para tal finalidade foi
realizado o ensaio de citotoxicidade multiparamétrico que consiste na análise de três
parâmetros: a respiração mitocondrical com o reagente XTT, a integridade da membrana com
o corante vermelho neutro e a densidade de células através da coloração do DNA com o corante
violeta de cristal. Para a análise das citocinas foi realizado o polymerase chain reaction (PCR).
Após 24h e 48h em contato com os materiais, os autores observaram que o hidróxido de cálcio
apresentou viabilidade maior que 70%, enquanto a pasta antibiótica tripla foi a que possuiu
menor valores de viabilidade celular. Com relação a indução da expressão de interleucinas,
somente na pasta antibiótica tripla foi observado maiores níveis da interleucina-6.
25
Neiva et al.88 (2013) analisaram a toxicidade da polimixina B em células renais com
dosagens de 75mM e 375mM e tempos de contato de 24h, 48h, 72h. A viabilidade celular foi
determinada pela exclusão dos corantes fluorescentes laranja de acrodinia e brometo de etídio
sendo observado em 24h apenas 57% de células viáveis com a dosagem de 75mM e que com
375mM essa viabilidade foi de apenas 41%. Com 72h de contato com a polimixina B, 56% das
células permaneciam viáveis na dosagem mais baixa e 40% na maior dosagem. Esses resultados
sugerem que a polimixina B é dose e tempo dependente.
26
3 PROPOSIÇÃO
3.1 Objetivo Geral
Analisar o grau de citotoxicidade de medicações intracanais sobre as células
fibroblásticas de murino L929.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar e comparar a viabilidade celular de medicações intracanais a base de
hidróxido de cálcio, iodofórmio, Otosporin® e suas associações, nos períodos
experimentais de observação.
Avaliar o tempo em relação a viabilidade celular de cada medicação intracanal.
27
4 METODOLOGIA
4.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
4.1.1 TIPO DE ESTUDO
Essa pesquisa foi desenvolvida sob o modelo de um estudo analítico, experimental, não
randomizado e quantitativo.
4.1.2 VARIÁVEIS
Esse estudo apresenta duas variáveis independentes: medicação intracanal e tempo
experimental. A variável dependente é o valor da absorbância, medida em unidades de
absorbância.
4.1.3 LOCAL DA PESQUISA
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Biologia Molecular do Setor de Patologia do
Hospital Universitário Professor João Cardoso Nascimento Junior, da Universidade Federal de
Sergipe (UFS).
28
4.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS
Linhagem de células permanentes fibroblásticas de murino L929 - banco de
células do Laboratório de Biologia Molecular do Setor de Patologia do Hospital
Universitário Professor João Cardoso Nascimento Junior, da Universidade
Federal de Sergipe (UFS).
Câmara de fluxo laminar (ClassII Biohazard Cabenet Model 36208,
Labconcorporation, Kansas City, Missouri, EUA)
Criotubos (Global Trade Technology, São Paulo, Brasil)
Tubo tipo Falcon de 15mL e 50mL (Guangzhou Jet Bio-Filtration Products Co.,
Ltda., Guangdong, China)
Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)
Centrífuga (Hermll Labortechnik GmbH –Siemensstrasse 25D-78564,
Wehingen, Germany)
Frasco de cultivo de 25cm2, 75cm2 e 150cm2 (Greiner Bio-one, Americana, São
Paulo, Brasil)
RPMI 1640 com L-glutamina (Gibco, Life Technologies Co., Carlsbad, Calif.,
USA)
Soro bovino fetal (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)
Estufa (Estufa CO2 Incubator, Sanyo Scientific electric Co. Ltda., MCO-17AC,
Japão)
Microscópio de fase invertido (Nikon eclipse TS100-F Listed, Japan)
Tripsina a 0,25% (Cultilab Ltda, Campinas, SP, Brasil)
Ácido etilenodiaminotetraacético a 0,05% (Gibco, Life Technologies Co.,
Carlsbad, Calif., USA)
Câmara de Newbauer espelhada 0,0025mm2 (Precicolor HGB, Germany)
Placa de 96 poços com fundo chato e placa de 24 poços (Prolab, São Paulo-SP,
Brasil)
Hidróxido de cálcio (Biodinâmica Química e Farmacêutica LTDA, PR, Brasil)
Iodofórmio (K-dent, Quimidrol, SC, Brasil)
29
Otosporin® (Farmoquímica S/A, RJ, Brasil)
Água destilada (Eurofarma Laboratórios LTDA, SP, Brasil)
Paramonoclofenol canforado (Biodinâmica Química e Farmacêutica LTDA, PR,
Brasil)
Glicerina (Farmácia Única, Aracaju, SE, Brasil)
Placa de vidro
Espátula 24F (SSWhite duflex, Rio de Janeiro, RJ, Brasil)
Peagâmetro digital (Ion pHB500, Ionlab, Curitiba, PR, Brasil)
Pipetas digitais (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA)
Metiltetrazólio (Sigma, St. Louis, MO, EUA)
Isopropanol acidificado com HCL a 0,04M/l
Agitador de Microplacas (Agitador magnético Agimax- Kasvi, Curitiba, Paraná)
Espectrofotômetro de microplacas (Microplate Spectrophotometer- EpochTM,
Biotek Instruments, Inc., Winooski, Vermont, USA)
4.3 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
Toda a metodologia da pesquisa foi realizada de acordo com as normas da International
Organization of Standardization (ISO) 10993-5: 200976, organização que padroniza os testes de
citotoxicidade.
4.3.1 DESCONGELAMENTO DAS CÉLULAS
Os procedimentos realizados nessa pesquisa que necessitavam de ambiente estéril foram
executados dentro da câmara de fluxo laminar. Para o descongelamento das células
fibroblásticas, os criotubos foram colocados em banho-maria a 37ºC por 1 minuto com 5mL de
solução salina estéril com a finalidade de diluir o DMSO, substância utilizada para congelar as
células que em temperatura ambiente é tóxica para elas. Todo esse conteúdo foi vertido para
um tubo estéril tipo Falcon de 15mL e centrifugado a uma temperatura de 4ºC, em 1750 rpm
30
por 10 minuto com o objetivo de separar as células do líquido sobrenadante. Essas foram
aspiradas e ressuspendidas em 2mL de meio de cultura completo - RPMI 1640 com L-glutamina
suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) e 1% de penicilina (10000UI/mL). Em
seguida, todo o conteúdo do tubo Falcon foi transferido para o frasco de cultivo de células de
25cm2 (50mL) e, com o objetivo de completá-lo, foi adicionado mais 3mL de meio de cultura
completo. As células foram levadas a incubadora em atmosfera úmida a 37°C, com 5% CO2 e
95% de ar, de acordo com Cornélio et al.66 (2011).
4.3.2 CULTIVO DAS CÉLULAS
Os fibroblastos foram cultivados e mantidos em estufa de CO2, e a cada dois dias o meio
de cultura foi renovado para que as células não morressem por falta de nutrientes. O
monitoramento diário do crescimento das células foi realizado utilizando-se microscópio de
fase invertido onde se observou a morfologia e o comportamento dos fibroblastos (aderência e
proliferação). Após a confirmação no microscópio de 80% de confluência (porcentagem de
células que proliferaram na base do frasco de cultura), foi iniciado o subcultivo das células
através de passagens consecutivas de frascos de cultura. Em cada passagem as células aderidas
foram desprendidas da garrafa de cultura por meio de digestão enzimática utilizando 5mL de
tripsina a 0,25% e ácido etilenodiaminotetraacético a 0,05% sendo que, todo o conjunto foi
levado a incubadora a 37°C por 5 minutos89.
Em microscópio invertido de fase, observou-se o desprendimento das células e, então,
inativou-se a tripsina com a adição de 5mL de RPMI 1640 acrescido com 10% de SBF. As
células em suspensão foram transferidas para tubos de ensaio e centrifugadas a 1250rpm, numa
temperatura de 5ºC por 10 minutos. O sobrenadante foi aspirado e os precipitados de células
(pellets) resultantes da centrifugação foram ressuspendidos em 2mL de meio de cultura
completo e depositados em novo frasco de cultura com maior área para que as células pudessem
se multiplicar. Dessa forma, foram realizadas três passagens no total até que se atingisse o
número de células suficientes para o plaqueamento.
31
4.3.3 PLAQUEAMENTO
Nesta fase do experimento, as células foram tripsinizadas e contadas na câmara de
Newbauer para a determinação do número de células existentes no frasco, a fim de proceder-se
a diluição necessária para o plaqueamento em placas de cultura de 96 poços com fundo chato.
A diluição das células foi realizada com RPMI 1640 completo de forma que 100µl dessa
suspensão celular preparada fossem semeadas nos poços contendo 1x105 células/poço. Em
seguida, as placas de 96 poços foram acondicionadas em atmosfera úmida a 37°C com 5% CO2
por 24h para que os fibroblastos pudessem aderir no fundo dos poços89-91.
4.3.4 DIVISÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS
As medicações intracanais utilizadas para a análise de citotoxicidade nesta pesquisa
foram hidróxido de cálcio, iodofórmio e Otosporin® e os veículos selecionados para o preparo
das associações foram a água destilada, a glicerina e o paramonoclorofenol canforado, por
serem as medicações intracanais e associações mais utilizadas na clínica endodôntica. Para
facilitar a análise, foram divididas em grupos, como descrito no quadro 1.
32
Quadro 1. Descrição dos grupos e das dosagens das medicações intracanais.
Grupos Componentes Dosagem
HPG Hidróxido de cálcio P.A.
Paramonoclorofenol canforado
Glicerina
1g
100µL
1.2mL
IG Iodofórmio
Glicerina
1.5g
600µL
HC Hidróxido de cálcio P.A.
Água destilada
1g
1.1mL
HCI Hidróxido de cálcio P.A.
Iodofórmio
Água destilada
1.5g
1.5g
1.75mL
IA Iodofórmio
Água destilada
1.5g
600µL
OT Otosporin® 40µL
Controle Meio de cultura
Fibroblastos 100µL
4.3.5 PREPARO DOS CORPOS DE PROVA E DOS ELUATOS
Nessa pesquisa, para a sensibilização das células fibroblásticas, foi selecionado o teste
de contato indireto, no qual eluatos das medicações intracanais testadas foram produzidos a
partir da difusão dos componentes de cada medicação intracanal para o meio de cultura e
colocados em contato com as células fibroblásticas. Não foi realizada nenhuma diluição a partir
dos eluatos originais com a finalidade de simular a rotina da prática clínica endodôntica, em
que diluições não são realizadas74,86.
Para tanto, as medicações em pó foram manipuladas dentro da câmara de fluxo laminar,
sobre placa de vidro estéril com o auxílio da espátula 24F, de acordo com a dosagem acima
descrita, até que fosse obtida a consistência de uma pasta (Figura 1 e 2). Em seguida, os corpos
de prova foram confeccionados, de modo que a forma e o volume fossem padronizados para
todos os grupos. Para isso, as pastas, foram inseridas em tubos de polietileno estéreis com o
diâmetro de 5mm por 2mm de profundidade, enquanto que, o Otosporin® foi armazenado em
tubos de 2mL do tipo eppendorfs estéreis92 .
33
Figura 1. Manipulação da pasta de hidróxido de cálcio-água destilada.
Figura 2. Manipulação da pasta de iodofórmio-glicerina.
34
Todas as medicações foram acondicionadas em uma atmosfera úmida a 37°C com 5%
CO2 durante 24h para que os corpos de provas iniciassem a presa e, facilitassem o processo de
remoção dos tubos de polietileno93. Após esse período, as medicações, ainda dentro dos tubos
de polietileno e dos eppendorfs, foram esterilizadas por meio de radiação ultravioleta por 1h
para evitar qualquer tipo de contaminação68. Para a remoção das medicações do interior dos
tubos de polietileno, foi realizada pressão no êmbolo existente no interior dos próprios tubos.
Somente no caso do Otosporin®, utilizou-se 40µL da substância como corpo de prova, sendo
que essa medida foi obtida a partir do volume do tubo de polietileno, V= πr2h.
Para cada grupo, foram confeccionados três corpos de prova, posicionados no fundo da
placa de cultura de 24 poços. Em seguida, 2mL de meio de cultura RPMI 1640 com L-glutamina
e sem soro bovino fetal e antibiótico foram inseridos nos poços e, todo o conjunto foi
armazenado em atmosfera úmida a 37°C com 5% CO2 por 24h, para que os produtos ativos das
medicações intracanais pudessem se difundir pelo meio de cultura produzindo os eluatos de
cada medicação intracanal8,17 (Figura 3). De cada medicação foi produzido 3 eluatos, inclusive
do grupo controle.
Figura 3. Preparação dos eluatos das medicações intracanais na placa de cultura de 24 poços.
Fonte: UFS,
Controle
HPG IG HC HCI IA OT
35
4.3.6 CONTATO DAS CÉLULAS COM OS ELUATOS
Na placa de cultura de 96 poços onde estavam os fibroblastos aderidos, foi removido
cuidadosamente com pipeta o meio de cultura presente e, 100µL do eluato de cada medicação
testada foi adicionado, em cada poço. Dessa forma, cada eluato preenchia 4 poços da placa de
96 poços onde estavam os fibroblastos, totalizando 12 poços por grupo, incluindo o grupo
controle, que era composto por células e meio de cultura RPMI 1640 sem soro bovino fetal10.
Toda pesquisa foi realizada em quadruplicata de cada eluato em três experimentos
independentes. Em seguida, as placas de cultura foram novamente encubadas em uma atmosfera
úmida a 37°C com 5% CO2 pelos períodos experimentais de 24h, 48h, 72h, 5 e 7dias79,83,86.
4.3.7 TESTE DE CITOTOXICIDADE
A viabilidade das células foi determinada através do método colorimétrico utilizando o
reagente MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio brometo] com a concentração de
5mg/mL em solução salina de tampão fosfato estéril em todos os períodos experimentais. Deve-
se ressaltar que, o reagente é fotossensível, assim após a sua preparação, os tubos eppendorfs
de 2mL contendo esta solução foram envolvidos em papel alumínio e a câmara de fluxo laminar
permaneceu com a luz apagada durante todo o procedimento de colocação da solução nos
poços.
Em cada período experimental, os eluatos foram cuidadosamente removidos dos poços
e, em cada poço, foram dispensados 20µL da solução reagente de MTT e 180 µL de RPMI 1640
com L-glutamina sem soro bovino fetal e antibiótico (Figura 4). As placas de cultura foram
envolvidas em papel alumínio e encubadas em atmosfera úmida a 37°C com 5% CO2 por 4h10
para que o MTT pudesse ser metabolizado. Após esse período, a solução de MTT foi aspirada
cuidadosamente e desprezada, facilitando a visualização da mudança de coloração no fundo de
cada poço (Figura 5). Essa reação ocorreu porque o sal metiltetrazólio da solução de MTT foi
reduzido pelas enzimas desidrogenases dos fibroblastos, formando cristais de formanzan, que
36
possuem coloração azul escuro. Esses cristais foram dissolvidos adicionando 100µL da solução
de isopropanol acidificado com HCL a 0,04M/l em cada poço e agitando-se a placa de cultura
por 30 min77,94 (Figura 6). A coloração da solução variou do roxo claro até o roxo escuro, de
acordo com a quantidade de cristais de formanzan presentes em cada poço e, consequentemente,
de células viáveis (Figura 7). Quanto mais intensa a cor da solução, menos citotóxica a
substância apresenta-se. Por fim, a leitura das placas de cultura foi realizada no
espectrofotômetro no comprimento de onda de 570nm8,9,75 (Figura 8) e os valores de
absorbância de cada medicação obtidos foram proporcionais a intensidade da coloração de cada
poço.
Figura 4. Placa de cultura de 96 poços contendo células fibroblásticas L929, reagente MTT e
meio de cultura RPMI 1640 sem soro bovino fetal.
OT
IG
Controle
HPG
IA
HC
HCI
37
Figura 5. Remoção da solução de MTT e visualização da coloração azul no fundo dos poços.
.
Figura 6. Aparelho agitador de microplacas com a placa de cultura de 96 poços com isopropanol
acidificado com HCL 0,04M/l.
38
Figura 7. Placa de cultura de 96 poços com cristais de formanzan dissolvidos.
Figura 8. Leitura da placa de cultura de 96 poços no espectrofotômetro.
OT
IG
Controle
HPG
IA
HC
HCI
39
4.4 AVALIAÇÃO DOS DADOS E ANÁLISE ESTATÍSTICA
A avaliação da citotoxicidade foi realizada somando os valores de absorbância obtidos
na leitura do espectrofotômetro, calculando a média e o desvio padrão de cada medicação
intracanal testada em cada tempo experimental.
Os dados apresentaram normalidade (P = 0,097) e foram submetidos à Análise de
Variância (ANOVA) de dois fatores, ou seja, “medicação intracanal” e “tempo de avaliação”.
Diante da diferença entre os grupos, os dados foram submetidos ao pós teste de Tukey com nível
de significância de 5%, com o intuito de saber em que grupo estava a diferença. O programa
utilizado para análise estatística foi o Sigmastat 3.5.
40
5 RESULTADOS
A Análise de Variância mostrou efeito significativo de tratamento para os fatores
“medicação intracanal” (P < 0,001) e “tempo de avaliação” (P < 0,001), e para a interação entre
fatores (P < 0,001). As comparações múltiplas foram realizadas com o teste de Tukey (α = 0,05)
e os resultados estão descritos na tabela 1.
Tabela 1. Resultados de citotoxicidade em média (DP) expressa em unidades de absorbância.
Grupos Tempo de Avaliação
24 horas 48 horas 72 horas 5 dias 7 dias
HPG 0,91 (0,08) Ab 1,06 (0,08) Aa 0,93 (0,11) ABb 0,56 (0,10) Bc 0,47 (0,21) Bc
IG 0,81 (0,08) Bb 1,08 (0,14) Aa 0,91 (0,10) Ab 0,67 (0,12)
ABc
0,49 (0,16) Bd
HCI 0,87 (0,07) Ab 1,18 (0,16) Aa 0,82 (0,12) Ab 0,67 (0,14)
ABc
0,51 (0,10) Bd
IA 0,89 (0,07)
ABb
1,07 (0,10) Aa 0,93 (0,10) Ab 0,63 (0,06) Bc 0,44 (0,11) Bd
HC 0,98 (0,11) Ab 1,11 (0,11) Aa 0,79 (0,13) Bc 0,69 (0,09) Bd 0,47 (0,07) Be
OT 0,80 (0,03) Ba 0,85 (0,06) Ba 0,50 (0,16) Cb 0,25 (0,04) Cc 0,22 (0,03) Cc
Controle 1,00 (0,06) Ab 1,19 (0,14) Aa 0,95 (0,11) Ab 0,77 (0,21) Ac 0,65 (0,11) Ac
Letras distintas (maiúscula na vertical, minúscula na horizontal) indicam diferença estatística
significativa (α = 0,05).
Com os resultados obtidos, pode-se observar que em 24h os grupos HPG, HCI, HC
foram semelhantes ao grupo controle, sendo os grupos IG e OT semelhantes entre si e diferentes
do grupo controle, apresentando os menores valores de absorbância neste período. Em 48h,
somente o grupo OT foi diferente do grupo controle apresentando os menores valores de
absorbância. No período de 72h, os grupos IG, HCI e IA foram iguais ao grupo controle sendo
41
os demais grupos diferentes entre si e o grupo controle. Nos tempos experimentais de 5 e 7 dias
todos os grupos apresentaram valores de absorbância diferentes do grupo controle sendo que o
grupo OT foi o que obteve menores valores de absorbância nesses períodos.
Na comparação dos tempos experimentais de cada medicação, pôde-se observar na
figura 9 que para todos os grupos, 48h foi período menos citotóxico. O grupo HPG obteve
comportamento semelhante ao grupo controle com relação a variação da absorbância pelo
tempo e os grupos IG, HCI e IA foram iguais entre si na comparação da influência do tempo.
Para o grupo HC, todos os tempos experimentais foram diferentes entre si, diferenciando do
grupo OT que os valores da absorbância em 24h e 48h foram semelhantes, em 72h foi diferente
dos dois tempos anteriores e em 5 e 7 dias foram os mais citotóxicos, com valores de
absorbância semelhantes entre si.
Figura 9. Relação valores de absorbância x tempos experimentais.
42
Foi observado que houve redução dos valores de absorbância em relação aos tempos
experimentais para todos os grupos, porém no grupo OT obteve-se menores valores de
absorbância durante toda a pesquisa.
43
6 DISCUSSÃO
Os medicamentos intracanais necessitam apresentar biocompatibilidade, pois entram em
contato direto com os tecidos periapicais durante o tratamento endodôntico e, por isso, podem
induzir a morte celular, caso, sejam citotóxicos. Nesse estudo, objetivou-se analisar o efeito
tóxico dos medicamentos intracanais frente aos fibroblastos, principalmente, das pastas
endodônticas a base de iodofórmio, devido à carência de pesquisas sobre citotoxicidade que
envolvem esses materiais.
Quando se prepara o delineamento experimental de estudos de citotoxicidade, o tipo de
célula é um fator importante a ser considerado. Alguns estudos têm utilizado células primárias
que são obtidas a partir do próprio tecido e apresentam tempo de vida curto, enquanto em outros,
células permanentes são utilizadas por apresentarem maior estabilidade, facilidade de
manipulação e cultivo, e altas taxas de proliferação sem que haja alteração no fenótipo
celular3,70. Além disso, as células podem ser adquiridas a partir de humanos ou de murinos,
não havendo diferenças nas respostas obtidas entre elas71. Neste estudo, foi utilizado uma
linhagem de células permanentes de murinos (fibroblastos L929) adquiridas a partir de um
banco de células.
Dentre os tipos celulares existentes, os fibroblastos são as células mais frequentemente
empregadas em experimentos realizados com produtos odontológicos75, principalmente quando
o medicamento a ser testado entrará em contato com o tecido conjuntivo. No presente estudo,
os fibroblastos foram escolhidos, por apresentarem-se em maior número nos tecidos periapicais
e no ligamento periodontal, locais em que as medicações intracanais, ou os produtos
provenientes da sua degradação, exercem seus efeitos10. Essas células, ainda, apresentam a
característica de serem as maiores produtoras de fibras colágenas dos tecidos e, por isso,
participam ativamente do processo de reparação tecidual74.
Nos ensaios de toxicidade utilizando células, as substâncias podem ser colocadas em
contato direto ou indireto com a cultura celular, para sensibilizá-la7. Neste último caso, utiliza-
se os eluatos preparados a partir das medicações analisadas, baseando-se no fato que, quando
colocadas no interior dos condutos radiculares durante a prática clínica, os componentes das
44
medicações são liberados e diluídos nos fluidos tissulares, da mesma forma que ocorre com as
substâncias que se difundem para o meio de cultura durante a preparação dos eluatos em
pesquisas in vitro63. Uma limitação desse estudo está na dificuldade em mensurar a quantidade
de componentes liberados para o meio. Dessa forma, para uma maior semelhança com a clínica,
esse estudo foi realizado de forma indireta, após as medicações intracanais permanecerem em
contato com o meio de cultura, liberando seus componentes e produzindo os eluatos dos
medicamentos analisados.
Na literatura, os estudos com medicamentos intracanais utilizando células apresentam
diversos protocolos para a sua execução, sendo os tempos experimentais um dos parâmetros
que mais apresentam variação. Assim, determinou-se os tempos experimentais de 24h, 48h,
72h, 5 e 7 dias, baseado no uso desses medicamentos na prática clínica e em pesquisas
anteriormente realizadas na literatura que apresentavam o mesmo objetivo81,86.
Alguns tipos de ensaios de citotoxicidade tem sido utilizados no meio científico para
avaliar o potencial tóxico dos materiais endodônticos6,11,65,68. No presente estudo, a viabilidade
celular dos fibroblastos foi determinada pelo ensaio colorimétrico com o reagente MTT. Esse
ensaio, além de ser o mais utilizado em pesquisas com esse objetivo, foi escolhido para essa
pesquisa por ser indicado pela ISO 10993-576 (2009) e por apresentar simplicidade de execução,
rapidez, precisão e possibilidade de ser reproduzido74. Contudo, Yadlapati et al.78(2013)
afirmaram que, a interpretação desse tipo de ensaio deve ser cautelosa, visto que, a avaliação
acontece apenas por um único parâmetro celular, diferentemente do ensaio multiparamétrico
que analisa o metabolismo mitocondrial, a permeabilidade da membrana celular e, a densidade
e presença do DNA, ao mesmo tempo.
Neste estudo, todas as medicações analisadas, em algum momento da pesquisa,
apresentaram menores valores de absorbância que o controle e, consequentemente, menor
viabilidade celular quando comparadas ao grupo controle demonstrando citotoxicidade sobre
os fibroblastos L929. Apesar disso, algumas dessas medicações analisadas, como as
associações hidróxido de cálcio-água destilada e iodofórmio-água destilada mostraram, através
de cortes histológicos, que quando implantadas em tecido subcutâneo de ratos, induziam a
reação inflamatória leve na região seguida de reparação tecidual39,47.
A pasta de hidróxido de cálcio nas primeiras 48h não mostrou-se citotóxica, porém, a
partir de 72h apresentou-se mais citotóxica que o grupo controle. Alguns estudos
corroboram81,86 com esse achado que pode estar relacionado a pouca solubilidade e
45
difusibilidade do hidróxido de cálcio para o meio e, ao aumento do seu pH com o passar dos
dias31,81 em ensaios laboratoriais. Alto pH promove desnaturação enzimática e destruição da
membrana celular, levando a célula à morte74. Entretanto, alguns autores discordaram desses
achados demonstrando que o hidróxido de cálcio apresentou alta citotoxicidade em 24h e
proliferação celular em 7 dias de contato com as células 3,67,70,81,85. Essa discrepância pode estar
relacionada a diversidade de etapas dos protocolos existentes entre as pesquisas.
O PMCC livre de associação com outras substâncias tem demonstrado ser extremamente
citotóxico56,87. Entretanto, trabalhos experimentais em modelo animal demonstraram que
quando o PMCC é associado ao hidróxido de cálcio e a glicerina na pasta HPG, essa toxicidade
é reduzida a níveis compatíveis com os tecidos,40,41,59 não apresentando nem genotoxicidade e
nem mutagenicidade58. Altos valores de absorbância da pasta HPG também foi observada no
presente estudo e pode ser creditada a pequena concentração de PMCC liberado para os tecidos,
visto que, quando associado ao hidróxido de cálcio, o PMCC produz um sal pouco solúvel, o
paramonoclorofenolato de cálcio, que libera lentamente o paramonoclorofenol e os íons Ca2+ e
OH- para o meio, não apresentando toxicidade ao tecidos57. Além disso, essa pasta ainda
apresenta em sua composição a glicerina que é um veículo viscoso, que permite lenta
dissociação e difusão dos íons para o meio32.
A medicação iodofórmio-glicerina, no período de 24h, foi uma das medicações mais
citotóxicas quando comparadas ao controle. Resultados semelhantes foram encontrados por
Petel et al.11 (2013), no qual uma substância à base de iodofórmio e outros compostos,
apresentou baixa viabilidade celular de macrófagos e células epiteliais.
Neste estudo observou-se que o tempo influenciou na viabilidade celular, demonstrando
que todas as medicações intracanais apresentaram-se mais citotóxicas aos fibroblastos com o
passar dos tempos experimentais. Deve ser ressaltado que o Otosporin® demonstrou ser a
medicação intracanal mais citotóxica durante toda a pesquisa. Essa toxicidade foi observada
por Miura et al.87 (2010) na maior concentração utilizada por esses autores em sua pesquisa.
Uma justificativa para isso pode estar no antibiótico polimixina B, presente no Otosporin®, que
atua diretamente na membrana citoplasmática comprometendo as propriedades osmótica e os
mecanismos de transporte da membrana celular, levando a morte da célula. Sua ação não
apresenta seletividade e por isso, a polimixina B age também em células de humanos, uma vez
que a composição da membrana plasmática desta é semelhante as das bactérias88.
46
Dessa maneira, mais testes in vitro e in vivo necessitam ser realizados para definir se as
diferentes associações de medicamentos intracanais são biocompatíveis com os tecidos
perirradicular de forma que possam continuar sendo utilizados na terapia endodôntica.
47
7 CONCLUSÃO
Diante da metodologia utilizada, conclui-se que todas as medicações intracanais
apresentaram comportamento similar ao grupo controle na maior parte da pesquisa, porém com
5 e 7 dias apresentaram-se mais citotóxica que o grupo controle. O Otosporin® demonstrou ser
a medicação intracanal mais citotóxica em todos os tempos experimentais. Pôde-se observar
também que o tempo influenciou no aumento da citotoxicidade de todas as medicações
intracanais analisadas.
48
REFERÊNCIAS
1 Lana PEP, Scelza MFZ, Silva LE, Mattos-Guaraldi AL, Hirata Júnior R. Antimicrobial
activity of calcium hydroxide pastes on Enterococcus faecalis cultivated in root canal systems.
Braz Dent J. 2009;20:32-6.
2 Lima RKP, Guerreiro-Tanomaru JM, Faria-Junior NB, Tanomaru-Filho M. Effectiveness of
calcium hydroxide-based intracanal medicaments against Enterococcus faecalis. Int Endod J.
2012;45:311-6.
3 Yasuda Y, Tatematsu Y, Fujii S, Maeda H, Akamine A, Torabinejad M, Saito T. Effect of
MTAD on the differentiation of osteoblast-like cells. J Endod. 2010;36:260-3.
4 Vieira AR, Siqueira Jr JF, Ricucci D, Lopes WSP. Dentinal tubule infection as the cause of
recurrent disease and late endodontic treatment failure: a case report. J Endod. 2012;38:250-4.
5 Ricucci D, Loghin S, Siqueira Junior JF. Exuberant biofilm infection in a lateral canal as the
cause of short-term endodontic treatment failure: report of a case. J Endod. 2013;39:712-8.
6 Zeferino EG, Bueno CES, Oyama LM, Ribeiro DA. Ex vivo assessment of genotoxicity and
cytotoxicity in murine fibroblasts exposed to white MTA or white Portland cement with 15%
bismuth oxide. Int Endod J. 2010;43:843-8.
7 Silva EJNL, Accorsi-Mendonça T, Almeida JFA, Ferraz CCR, Gomes BPFA, Zaia AA.
Evaluation of cytotoxicity and up-regulation of gelatinases in human fibroblasts cells by four
root canal sealers. J Endod. 2012;45:49-56.
8 Bin CV, Valera MC, Camargo SEA, Rabelo SB, Silva GO, Balducci I, Camargo CHR.
Cytotoxicity and genotoxicity of root canal sealers based on mineral trioxide aggregate. J
Endod. 2012;38:495-500.
9 Hirshman WR, Wheater MA, Bringas JS, Hoen MM. Cytotoxicity comparison of three
current direct pulp capping agents with a new bioceramic root repair putty. J Endod.
2012;38:385-8.
10 Yoshino P, Nishiyama CK, Modena KCS, Santos CF, Sipert CR. In vitro cytotoxicity of
White MTA, MTA Fillapex and Portland Cement on human periodontal ligament fibroblasts.
Braz Dent J. 2013;24:111-6.
11 Petel R, Moskovitz M, Tickotsky N, Halabi A, Goldstein J, Houri-Haddad Y. Cytotoxicity
and proliferative effects of iodoform-containing root canal-filling material on RAW 264.7
macrophage and RKO epithelial cell lines. Arch Oral Biol. 2013;58:75-81.
12 Kumar V, Abbas AK, Fausto N. Tecido de renovação e reparação: regeneração, cicatrização
e fibrose. In: Kumar V, Abbas AK, Fausto N. Robbins e Cotran– Patologia: bases patológicas
das doenças.7ªed. Rio de Janeiro: Elsevier; 2005. p.91-123.
49
13 Heward S, Sedgley C. Effects of intracanal mineral trioxide aggregate and calcium
hydroxide during four weeks on pH changes simulated root surface resorption defects: An in
vitro study using matched pairs of human teeth. J Endod. 2011;37:40-4.
14 Marão HF, Panzarini SR, Aranega AM, Sonoda CK, Poi WR, Esteves JC, Silva PIS.
Periapical tissue reactions to calcium hydroxide and MTA after external root resorption as a
sequela of delayed tooth replantation. Dent Traumatol. 2012;28:306-13.
15 Ioannidis K, Thomaidis V, Fiska A, Lambrianidis T. Lack of periradicular healing and
gradually increasing swelling two years after intentional extrusion of calcium hydroxide into
periapical lesion: report of a case. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.
2010;109:e86-e91.
16 Pontius V, Pontius O, Braun A, Frankenberger R, Roggendorf MJ. Retrospective evaluation
of perforations repairs in 6 private practices. J Endod. 2013;39:1346-58.
17 Camargo SEA, Camargo CHR, Hiller KA, Rode SM, Schweikl H, Schmalz G. Cytotoxicity
and genotoxicity of pulp capping materials in two cell lines. Int Endod J. 2009;42:227-37.
18 Ordinola-Zapata R, Bramante CM, Minotti PG, Cavenago BC, Garcia RB, Bernardineli N,
Jaramillo DE, Duarte MAH. Antimicrobial activity of triantibiotic paste, 2% chlorhexidine gel,
and calcium hydroxide on an intraoral- infected dentin biofilm model. J Endod. 2013;39:115-
8.
19 Siqueira Jr JF, Lopes HP, Uzeda M. Recontamination of coronally unsealed root canals
medicated with camphorated paramonochlorophenol or calcium hydroxide pastes after saliva
challenge. J Endod. 1998;24:11-4.
20 Kandaswamy D, Venkateshbabu N, Gogulnath D, Kindo AJ. Dentinal tubule disinfection
with 2% chlorhexidine gel, propolis, morinda citrifolia juice, 2% povidone iodine, and calcium
hydroxide. Int Endod J. 2010;43:419-23.
21 Valera MC, Rosa JA, Maekawa LE, Oliveira LD, Carvalho CAT, Koga-Ito CY, Jorge AOC.
Action of propolis and medications against Escherichia coli and endotoxin in root canals. Oral
Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2010;110:e70-4.
22 Maekawa LE, Valera MC, Oliveira LD, Carvalho CAT, Koga-Ito CY, Jorge AOC. In vitro
evaluation of the action of irrigating solutions associated with intracanal medications on
Escherichia coli and its endotoxin in root canals. J Appl Oral Sci. 2011;19:106-12.
23 Ballal NV, Kumar SR, Laxmikanth HK, Saraswathi MV. Comparative evaluation of
different chelators in removal of calcium hydroxide preparations from root canals. Aust Dent
J. 2012;57:344-8.
24 Souza RA, Silva-Souza YTC, Colombo S, Lago M, Duarte MAH, Pécora JD. Healing of a
tooth with an overinstrumented apex, extensive transportation and periapical lesion using a
5mm calcium hydroxide apical plug: an 8 year follow-up report. Braz Dent J. 2012;23:608-11.
50
25 Slutzky-Goldberg I, Hanut A, Matalon S, Baev V, Slutzky H. The effect of dentin on the
pulp tissue dissolution capacity of sodium hypochlorite and calcium hydroxide. J Endod.
2013;39:980-3.
26 Komabayashi T, D’souza RN, Dechow PC, Safavi KE, Spanberg LSW. Particle size and
shape of calcium hydroxide. J Endod. 2009;35:284-7.
27 Ji YM, Jeon SH, Park JY, Chung JH, Choung YH, Choung PH. Dental stem cell therapy,
with calcium hydroxide in dental pulp capping. Tissue Eng Part A. 2010;16:1823-33.
28 Cehreli ZC, Isbitiren B, Sara S, Erbas G. Regenerative endodontic treatment
(Revascularization) of immature necrotic molars medicated with calcium hydroxide: A cases
series. J Endod. 2011;37:1327-30.
29 Mohammadi Z, Dummer PMH. Properties and applications of calcium hydroxide in
endodontics and dental traumatology. J Endod. 2011;44:697-730
30 Yassen GH, Chin J, Mohammedsharif AG, Alsoufy SS, Othman SS, Eckert G. The effect of
frequency of calcium hydroxide dressing change and various pre-and inter-operative factors on
the endodontic treatment of traumatized immature permanent incisors. Dent Traumatol. 2012;
28:296-301.
31 Guerreiro-Tanomaru JM, Chula DG, Lima RKP, Berbert FLVC, Tanomaru-Filho M.
Release and diffusion of hydroxyl ion from calcium hydroxide-based medicaments. Dent
Traumatol. 2012;28:320-3.
32 Vianna ME, Zélio DM, Ferraz CCR, Zaia AA, Souza-Filho FJ, Gomes BPFA. Concentration
of hydrogen ions in several calcium hydroxide pastes over different periods of time. Braz Dent
J. 2009;20:382-8.
33 Pavaskar R, Ataide IN, Chalakkal P, Pinto MJ, Fernandes KS, Keny RV, Kamath A. An in
vitro study comparing the intracanal effectiveness of calcium hydroxide and linezolid-based
medicaments against Enterococcus faecalis. J Endod. 2012;38:95-100.
34 Weckwerth PH, Carnietto C, Weckwerth ACVB, Duarte MAH, Kuga MC, Vivan RR. In
vitro susceptibility of oral Candida albicans strains to different pH levels and calcium
hydroxide saturated aqueous solution. Braz Dent J. 2012;23:192-8.
35 Holland R, Souza V, Nery MJ, Otoboni Filho JA, Bernabé PFE, Dezan Jr E. Reaction of rat
connective tissue to implanted dentin tubes filled with mineral trioxide aggregate or calcium
hydroxide. J Endod. 1999;25:161-6.
36 Baik JE, Jang KS, Kang SS, Yun CH, Lee K, Kim BG, Kum KY, Han SH. Calcium
hydroxide inactivates lipoteichoic acid from Enterococcus faecalis through deacylation of the
lipid moiety. J Endod. 2011;37:191-6.
51
37 Nelson-Filho P, Bezerra Silva LA, Leonardo MR, Sabbag Utrilla L, Figueiredo F.
Connective tissue responses to calcium hydroxide-based root canal medicaments. Int Endod J.
1999;32:303-311.
38 Camargo SEA, Rode SM, Prado RF, Carvalho YR, Camargo CHR. Subcutaneous tissue
reaction to castor oil bean and calcium hydroxide in rats. J Appl Oral Sci. 2010;18:273-8.
39 Tomaz PJS, Farias MP, Piva MR, Albuquerque-Junior RLC, Ribeiro MAG. Effect of laser
therapy in inflamed tissue by medications based on iodoform. Am J Appl Sci. 2013;10:81-8.
40 Tanomaru Filho M, Leonardo MR, Silva LAB. Effect of irrigating solution and calcium
hydroxide root canal dressing on the repair of apical and periapical tissues of teeth with
periapical lesion. J Endod. 2002;28:295-9.
41 Silveira AMV, Lopes HP, Siqueira Jr JF, Macedo SB, Consolaro A. Periradicular repair after
two-visit endodontic treatment using two different intracanal medications compared to single-
visit endodontic treatment. Braz Dent J. 2007;18:299-304.
42 Ribeiro DA, Marques MEA, Salvadori DMF. Lack of genotoxicity of formocresol,
paramonochlorophenol, and calcium hydroxide on mammalian cells by comet assay. J Endod.
2004;30:593-6. Ca2+ OH-
43 Bortoluzzi EA, Guerreiro-Tanomaru JM, Tanomaru-Filho M, Duarte MAH. Radiografic
effect of different radiopacifiers on a potencial retrograde filling material. Oral Surg Oral Med
Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2009;108:628-32.
44 Duarte MAH, El Kadre GDO, Vivan RR, Guerreiro-Tanomaru JM, Tanomaru-Filho M,
Moraes IG. Radiopacity of Portland Cement associated with different radiopacifying agents. J
Endod. 2009;35:737-40.
45 Cwikla SJ, Bélanger M, Giguère S, Progulske-Fox A, Vertucci FJ. Dentinal tubule
disinfection using three calcium hydroxide formulations. J Endod. 2005;31:50-2.
46 Mortazavi M, Mesbahi M. Comparison of zinc oxide and eugenol, and Vitapex for root canal
treatment of necrotic primary teeth. Int J Paediatr Dent. 2004;14:417-24.
47 Pallotta RC, Machado MEL, Reis NS, Martins GHR, Nabeshima CK. Tissue inflammatory
response to implantation of calcium hydroxide and iodoform in the back of rats. Rev Odont
Cienc. 2010;25:59-64.
48 Moskovitz M, Tickotsky N, Ashkar H, Holan G. Degree of root resorption after root canal
treatment with iodoform containing filling material in primary molars. Quintessence Int.
2012;43:361-68.
49 Huang TH, Hung CJ, Chen YJ, Chien HC, Kao CT. Cytologic effects of primary tooth
endodontic filling materials. J Dent Sci. 2009;4:18-24.
52
50 Holland R. Emprego da associação de corticosteroide-antibiótico durante o tratamento
endodôntico. Rev Paul Odontol. 1980;1:4-7.
51 Fachin EVF, Scarparo RK, Pezzi AP, Luisi SB, Sant’ana M Filho. Effect of betamethasone
on the pulp after topical application to the dentin of rat teeth: vascular aspects of the
inflammation. J Appl Oral Sci. 2009;17:335-9.
52 Estrela C, Estrela CRA, Guimarães LF, Silva RS, Pécora JD. Surface tension of calcium
hydroxide associated with different substances. J Appl Oral Sci. 2005;13:152-6
53 Estrela C, Bammann LL, Pimenta FC, Pécora JD. Control of microorganisms in vitro by
calcium hydroxide pastes. Int Endod J. 2001;34:341-5.
54 Oliveira LD, Leão MVP, Carvalho CAT, Camargo CHR, Valera MC, Jorge AOC,
Unterkircher CS. In vitro effects of calcium hydroxide and polymyxin B on endotoxins in root
canals. J Dent. 2005;33:107-14.
55 Ramos IFAS, Biz MT, Paulino N, Scremin A, Della Bona A, Barletta FB, Figueiredo JAP.
Histopathological analysis of corticosteroid-antibiotic preparation and propolis paste
formulation as intracanal medication after pulpectomy: an in vivo study. J Appl Oral Sci.
2010;50-6.
56 Spangberg L, Rutberg M, Rydinge E. Biologic effects of endodontic antimicrobial agents.J
Endod. 1979;5:166-75.
57 Anthony DR, Gordon TM, Del Rio CE. The effect of three vehicles on the pH of calcium
hydroxide. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1982;54:560-5.
58 Gayva SMM, Siqueira Junior JF. Direct genotoxicity and mutagenicity of endodontic
substances and materials as evaluated by two prokaryotic test systems. J Appl Oral Sci.
2005;13:387-92.
59 Grecca FS, Leonardo MR, Silva LAB, Tanomaru Filho M, Borges MAG. Radiografic
evaluation of periradicular repair after endodontic treatment of dog’s teeth with induced
periradicular periodontitis. J Endod. 2001;27:610-2.
60 Camargo CHR, Bernardineli N, Valera MC, Carvalho CAT, Oliveira LD, Menezes MM,
Afonso SE, Mancini MNG. Vehicle influence on calcium hydroxide pastes diffusion in human
and bovine teeth. Dent Traumatol. 2006;22:302-6.
61 Lima RA, Carvalho CBM, Ribeiro TR, Fonteles CSR. Antimicrobial efficacy of
chlorhexidine and calcium hydroxide/camphorated paramonochlorophenol on infected primary
molars: A split-mouth randomized clinical trial. Quintessence Int. 2013;44:113-22.
62 Moraes AM, Augusto EFP, Castilho RL. Tecnologia do cultivo de células animais: de
biofármacos a terapia gênica. São Paulo: Rocca; 2007.p.503.
53
63 Lessa FCR, Aranha AMF, Hebling J, Souza Costa CA. Cytotoxic effects of White-MTA and
MTA-BIO cements on odontoblast-like cells (MDPC-23). Braz Dent J. 2010;21:24-31.
64 Thonemann B, Schmalz G, Hiller KA, Schweikl H. Response of L929 mouse fibroblasts,
primary and immortalized bovine dental papilla-derived cell lines to dental resin components.
Dent Materials. 2002;18:318-23.
65 Baraba A, Zeljezic D, Kopjar N, Mladinic M, Anic I, Miletic I. Evaluation cytotoxic and
genotoxic effects of two resin-based root-canal sealers and their components on human
leucocytes in vitro. Int Endod J. 2011;44:652-61.
66 Cornélio ALG, Salles LP, Paz MC, Cirelli JA, Guerreiro-Tanomaru JM, Tanomaru-Filho
M. Cytotoxicity of Portland cement with radiopacifying agents: A cell death study. J Endod.
2011;37:203-10.
67 Correa GTB, Veranio GAC, Silva LE, Hirata Junior R, Coil JM, Scelza MFZ. Cytotoxicity
evaluation of two root canal sealers and a commercial calcium hydroxide paste on THP1 cell
line by trypan blue assay. J Appl Oral Sci. 2009;17:457-61.
68 Modareszadeh MR, Chogle AS, Mickel AK, Jin G, Kowsar H, Salamat N, Shaikh S,
Outbudin S. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int
Endod J. 2011;44:154-61.
69 Orban EO, Maden M, Senguüven B. Odontoblast-like cell numbers and reparative dentine
thickness after direct pulp capping with platelet-rich plasma and enamel matrix derivative: a
histomorphometric evaluation. Int Endod J. 2012;45:317-25.
70 Ruparel NB, Teixeira FB, Ferraz CCR, Diogenes A. Direct effect of intracanal medicaments
on survival of stem cells of the apical papilla. J Endod. 2012;38:1372-5.
71 Khashaba RM, Chutkan NB, Borke JL. Comparative study of biocompatibility of newly
developed calcium phosphate-based root canal sealers on fibroblasts derived from primary
human gingiva and a mouse L929 cell line. Int Endod J. 2009;42:711-8.
72 Santos RL, Pithon MM, Martins FO, Romanos MTV, Ruellas ACO. Cytotoxicity of latex
and non-latex orthodontic elastomeric ligatures on L929 mouse fibroblasts. Braz Dent J.
2010;21:205-10.
73 Karapinar-Kazandag M, Bayrak OF, Yalvaç ME, Ersev H, Tanalp J, Sahin F, Bayirli G.
Cytotoxicity of 5 endodontic sealers on L929 cell line and human dental pulp cells. Int Endod
J. 2011;44:626-34.
74 Silva EJNL, Herrera DR, Almeida JFA, Ferraz CCR, Gomes BPFA, Zaia AA. Evaluation
of cytotoxicity and up-regulation of gelatinases in fibroblast cells by three root repair materials.
Int Endod J. 2012;45, 815-20.
54
75 Wheater MA, Falvo J, Ruiz F, Byars M. Chlorhexidine, ethanol, lipopolysaccharide and
nicotine do not enhance the cytotoxicity of a calcium hydroxide pulp capping material. Int
Endod J. 2012;45:989-95.
76 International Organization for Standardization. ISO 10993-5: Biological evaluation of
medical devices- tests for in vitro cytotoxicity. Suiça, 2009. 34p.
77 Zhang W, Li Z, Peng B. Ex vivo cytotoxicity of new calcium silicate-based canal filling
material. Int Endod J. 2010;43:769-74.
78 Yadlapati M, Souza LC, Dorn S, Garlet GP, Letra A, Silva RM. Deleterious effect of triple
antibiotic paste on human periodontal ligament fibroblasts. Int Endod J. 2013;46:1-7.
79 Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to
proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods.1983;65:55-63.
80 Chang YC, Huang FM, Cheng MH, Chou LS, Chou MY. In vitro evaluation of the
cytotoxicity and genotoxicity of root canal medicines on human pulp fibroblasts. J Endod.
1998;24:604-606.
81 Guigand M, Pellen-Mussi P, Le Goff A, Vulcain JM, Bonnaure-Mallet M. Evaluation of the
cytocompatibility of three endodontic materials. J Endod. 1999;25:419-23.
82 Al-Shaher A, Wallace J, Agarwal S, Bretz W, Baugh D. Effect of propolis on human
fibroblasts from the pulp and periodontal ligament. J Endod. 2004;30:359-61.
83 Barnhart BD, Chuang A, Lucca JJD, Roberts S, Liewerh F, Joyce AP. An in vitro evaluation
of the cytotoxicity of various endodontic irrigants on human gingival fibroblasts. J Endod.
2005;31:613-5.
84 Silva RAB, Leonardo MR, Silva LAB, Castro LMS, Rosa AL, Oliveira PT. Effects of the
association between a calcium hydroxide paste e 0,4% chlorexidine on the development the
osteogenic phenotype in vitro.J Endod. 2008;34:1485-9.
85 Barbosa SV, Barroso CMS, Ruiz PA. Cytotoxicity of endodontic irrigants containing
calcium hydroxide and sodium lauryl sulphate on fibroblasts derived from mouse L929 cell
line. Braz Dent J. 2009;20:118-21.
86 Sepet E, Pinar A, Ilhan B, Ulukapi I, Bilir A, Tuna S. Cytotoxic effects of calcium hydroxide
and mineral trioxide aggregate on 3T3 fibroblast cell line in vitro. Quintessence Int.
2009;10:e55-61.
87 Miura CAS, Sá MS, Lima RS, Machado MAAM, Telles PDS. Avaliação da toxicidade de
materiais endodônticos em células-tronco da polpa dentária. Rev Odontol Bras Central.
2010;19:192-5.
88 Neiva LBM, Fonseca CD, Watanabe M, Vattimo MFF. Polymyxin B: dose and time
dependent nephrotoxicity effect in vitro. Acta Paul Enferm. 2013;26:57-62.
55
89 Silva EJNL, Rosa TP, Herrera DR, Jacinto RC, Gomes BPFA, Zaia AA. Evaluation of
cytotoxicity and physicochemical properties of calcium silicate-based endodontic sealer MTA
Fillapex. J Endod. 2013;39:274-7.
90 Kuan YH, Li YC, Huang FM, Chang YC. The upregulation of tumour necrosis factor-α and
surface antigens expression on macrophages by bisphenol A-glycidyl-methacrylate. Int Endod
J. 2012;45:619-26.
91 Chang HH, Chang MC, Huang GF, Wang YL, Chan CP, Wang TM, Lin PS, Jeng JH. Effect
of triethylene glycol dimethacrylate on the cytotoxicity, cyclooxygenase-2 expression and
prostanoids production in human dental pulp cells. Int Endod J. 2012;45:848-58.
92 Mendonça AAM, Souza PPC, Hebling J, Costa CAS. Cytotoxic effects of hard-setting
cements applied on the odontoblast cell line MDPC-23. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral
Radiol Endod. 2007; e1-e7.
93 Xu P, Liang J, Dong G, Zheng L, Ye L. Cytotoxicity of RealSeal on human osteoblast-like
MG63. J Endod.2010;36:40-4.
94 Gomes-Filho JE, Watanabe S, Gomes AC, Faria MD, Lodi CS, Oliveira SHP. Evaluation of
the effects of endodontic materials on fibroblast viability and cytokine production. J Endod.
2009;35:1577-9.