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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI
PRÓ REITORIA DE ENSINO ENGENHARIA AGRONÔMICA
ADRIANE DUARTE COELHO
Desinfestação de sementes de jabuticabeira “Sabará” na propagação in vitro
Sete Lagoas 2017
ADRIANE DUARTE COELHO
Desinfestação de sementes de jabuticabeira “Sabará” na propagação in vitro
Sete Lagoas
2017
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de São João Del Rei como requisito parcial para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo.
ADRIANE DUARTE COELHO
Desinfestação de sementes de jabuticabeira “Sabará” na propagação in vitro
Sete Lagoas, 08 de fevereiro de 2017. Banca examinadora:
_______________________________________ Renata Elisa Viol – Enga. Agra. Mestranda em Ciências Agrárias (UFSJ)
_______________________________________ Mayara Neves Santos Guedes – Dra. em Agroquímica (UFSJ)
_______________________________________ José Carlos Moraes Rufini – Dr. Professor Associado (UFSJ)
Orientador
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de São João Del Rei como requisito parcial para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais e irmãs por todo apoio, carinho e incentivo para a conclusão
de mais uma etapa.
Ao meu avô Genuíno, por ter me apresentado à Ciência desde criança e por
ampliar a minha visão sobre o Universo.
Ao professor e amigo Rufini, pelo apoio, dedicação e orientação em todos os
momentos da graduação.
À Embrapa Milho e Sorgo, em especial a pesquisadora Andrea Almeida
Carneiro, por ceder parte do material utilizado nesta pesquisa e, principalmente, por
toda a atenção e conhecimento sobre a Cultura de Tecidos.
Agradeço aos amigos Pedro Arthur, Renata, Natália, Ruane, Adriano
Mendes, Luciane, Taís, Kamila, Fernanda, Fabiane, Patrícia, Rayanne e,
especialmente, a Karen Acerbi por toda sua ajuda, paciência, carinho e amor em
todos os momentos.
Aos amigos Lucas Silvério, Guilherme Volpe, Luana, Gizele, Crosley,
Kandra, Elaine, Rogélio e a todos que tive o prazer de conviver em Fargo, dos quais
tenho a felicidade de chamar de “Família”.
A todos os colegas, professores da Universidade Federal de São João Del-
Rei e integrantes do Grupo PET Agronomia UFSJ, com os quais tive o prazer de
trabalhar.
Agradeço a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a
realização deste trabalho, especialmente a Mayara Guedes, por toda a ajuda e
orientação necessária para a conclusão deste trabalho.
RESUMO
A jabuticabeira (Myrciariajaboticaba) é uma frutífera originária da região centro-
sul do Brasil e de ocorrência em quase todo o país, tendo maior produção na região
sudeste. Sua propagação é feita principalmente por meio de sementes, porém, este
método faz com que a jabuticabeira tenha um período juvenil prolongado. A
obtenção de protocolos de desinfestação e de germinação eficientes é
imprescindível para o desenvolvimento da técnica de microenxertia, a qual alia
técnicas do cultivo in vitro com a enxertia, capaz de produzir mudas sadias de
jabuticabeiras, de produção precoce e de qualidade genética superior. Desta forma,
o objetivo deste trabalho foi criar um protocolo de desinfestação e germinação de
sementes de jabuticabeira “Sabará”. Sementes de jabuticabeira sem tegumento
foram previamente tratadas com fungicida e lavadas em água corrente para retirada
dos resíduos. Posteriormente, as sementes tratadas foram levadas para a câmara de
fluxo laminar, em condições assépticas, onde foram imersas em etanol 70% por 30
segundos e em soluções com diferentes concentrações de hipoclorito de sódio
(NaClO) (0; 0,75; 1,25; 1,75; 2,25%), por 5 ou 10 minutos, acrescidas de 2 gotas de
detergente comercial. Em seguida, passaram por tríplice lavagem com água
destilada autoclavada e imediatamente inoculadas em meio de cultura ½ MS. A
germinação in vitro de sementes de jabuticabeira é um processo viável que pode ser
utilizada na produção de mudas por microenxertia. Sementes imersas em solução de
2,25% de NaClO por 10 minutos obtiveram os melhores resultados quanto a
germinação em conjunto com a redução da contaminação por fungos.
Palavras chave: assepsia, microenxertia, Myrciaria jaboticaba
ABSTRACT
Jaboticaba tree (Myrciaria jaboticaba) is a fruit species native to the Central-South
region of Brazil, and can be found in almost all country territory, whereas its best
production occurs in the Southern Region. The jaboticaba propagation is mainly
made by seeds. However, this method is responsible for a long juvenile plant
period, not interesting for fruit producers. The creation of an efficient protocol for
seeds disinfestation and germination is necessary for the development of jaboticaba
micrografting techniques, which combine tissue culture with grafting, capable of
produce health, pathogen-free, early production, and superior genetic quality plants.
Therefore, this work aimed to create an efficient protocol for disinfestation and
germination of jabuticaba “Sabará” seeds. Seed without the tegument were
previously treated with fungicide and washed in running water for residue removal.
After that, the seeds were taken to a laminar air flow chamber, on aseptic
conditions, where they were submerse in 70% ethanol, for 30 seconds, and in
Sodium Hypoclorite (NaClO) solutions, at different concentrations (0; 0.75; 1.25;
1.75; 2.25%), for 5 or 10 minutes added with 2 drops of commercial detergent.
Later, the explants were washed three times with autoclaved distilled water, and
immediately inoculated onto each petri dish containing ½ MS medium. In vitro seed
germination of jaboticaba is a viable process which can be used in the plant
production through micrografting. The seeds treated with 2.25% NaClO for 10
minutes showed the best results regarding seed germination and fungi
contamination reduction.
Keywords: Aseptic conditions, micrografting, Myrciaria jaboticaba
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................................1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................................................3
1.1. A cultura da jabuticabeira ............................................................................................................ 3
1.2. Cultura de tecidos vegetais .......................................................................................................... 5
3. MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................9
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 12
5. CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 17
6. REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 18
1
1. INTRODUÇÃO
Pertencente à família Myrtaceae, a jabuticabeira (Myrciaria jaboticaba) é
uma espécie frutífera originária da região centro-sul do Brasil (MATTOS, 1983) e
de ocorrência em quase todo o país, concentrando sua maior produção na região
sudeste (OLIVEIRA et al., 2003). Rico em compostos antioxidantes, altos teores de
flavonóides e antocianinas, seu fruto é comercializado in natura em mercados locais
ou transformado em geleia, licor, vinho e vinagre, sendo de grande importância
econômica para a agricultura familiar (CITADIN et al., 2010).
O principal método utilizado para a formação de mudas de jabuticabeira é a
propagação sexuada, dando origem a plantas denominadas “pés-franco” (MANICA,
2000). Contudo, a propagação por sementes faz com que a muda produzida tenha
um longo período juvenil, fato não interessante aos fruticultores, uma vez que se
deseja antecipar ao máximo a fase de produção da jabuticabeira, que leva de 8 a 15
anos para ser iniciada (SASSO, 2009).
Com a finalidade de antecipar o período de produção, produtores de mudas
de frutíferas utilizam métodos de propagação vegetativa, como estaquia, alporquia e
enxertia, os quais consistem em multiplicar uma planta assexuadamente, obtendo
indivíduos geneticamente idênticos a planta matriz, possibilitando maiores
produtividades e uniformidade do pomar. Desta forma, é possível conservar
características de matrizes com genótipos superiores, uma vez que não há
segregação dos genes, como ocorre na propagação por sementes.
Um dos métodos de propagação vegetativa que vem ganhando espaço na
fruticultura é a microenxertia, que alia as técnicas de enxertia ao cultivo in vitro,
produzindo mudas sadias em condições assépticas, livres de vírus, fungos e
bactérias. Neste método, desenvolvido por Murashige (1972), considera-se duas
plantas distintas: o porta-enxerto, que ficará em contato com o solo absorvendo
água e nutrientes, e o enxerto, que dará origem a copa da árvore.
Um dos maiores entraves do uso da técnica da microenxertia é a
contaminação dos explantes utilizados, causada por fungos e bactérias. Desta forma,
2
a etapa da desinfestação se faz imperativa e deve ser realizada de maneira eficaz,
uma vez que os microorganismos que se desenvolvem no meio de cultura competem
com os explantes por nutrientes, prejudicando o desenvolvimento e podendo causar
a morte da plântula (PEREIRA et al., 2011).
Para que não haja contaminação ao se utilizar a técnica da microenxertia, as
sementes que darão origem aos porta-enxertos devem passar previamente pela etapa
da desinfestação, onde as substâncias mais utilizadas neste processo são o etanol e o
hipoclorito de sódio (NaClO) (QUISEN & ÂNGELO, 2008). Entretanto, as
concentrações utilizadas e o tempo de exposição dependem da espécie a ser
propagada, sendo que para a cultura da jabuticabeira existem poucos estudos
relacionados a desinfestação e a germinação in vitro das sementes (ANDRADE,
2002).
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de desinfestação de
sementes de jabuticabeira a serem utilizadas como porta-enxertos na formação de
mudas por microenxertia, visando à obtenção de jabuticabeiras livres de patógenos e
de qualidade genética superior.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. A cultura da Jabuticabeira
A jabuticabeira (Myrciaria jaboticaba) é uma frutífera de ocorrência
espontânea em grande parte do país, tendo sua maior produção na região sudeste,
principalmente nos estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro
(OLIVEIRA et al., 2003). Pode ser encontrada em outros países da América do Sul,
como Bolívia, Argentina, Uruguai e Peru (ASCHERI et al., 2006), e seu cultivo está
sendo testado no estado da Flórida, para implantação de pomares nos Estados
Unidos (CITADIN et al., 2010).
Segundo Joly (2002), a jabuticabeira é classificada botanicamente como uma
planta Eudicotiledônea, pertencente à ordem Myrtales, à família Myrtaceae e ao
gênero Myrciaria, na qual existem nove espécies conhecidas de jabuticabeira.
Dentre as espécies de maior interesse, destacam-se a Myrciaria trunciflora,
conhecida como “jabuticaba de cabinho”, Myrciaria cauliflora, também chamada
de “jabuticaba-paulista” ou “açú”, e a Myrciaria jaboticaba, também conhecida
como jabuticaba “Sabará” (MATTOS, 1983). Segundo Berg (1857), a jabuticabeira
pertence ao gênero Myrciaria, entretanto, Sobral (1985) propôs a alteração de seu
gênero para Plinia. Desde então, é comum encontrarmos as duas nomenclaturas
sendo utilizadas no meio científico, sendo consideradas sinonímias.
Segundo Mattos (1970), a jabuticabeira apresenta uma exigência de
temperatura entre 20ºC a 25ºC, no mínimo 1000 mm/anuais de chuva bem
distribuída e solos preferencialmente argilosos, profundos, férteis, bem dotados de
umidade e permeáveis, potencializando o crescimento desta frutífera que pode
atingir até 15 metros de altura e 40 centímetros de diâmetro.
As flores são hermafroditas e com potencial para autopolinização, podendo
florescer de duas a três vezes no ano, de acordo com os tratos culturais (DANNER
et al., 2011a). Dependendo das condições edafoclimáticas da região, a jabuticabeira
leva de 45 a 60 dias para completar o seu ciclo de desenvolvimento do fruto, desde
a polinização até a colheita (BARROS et al., 1996 apud FORTES et al., 2012).
4
Os frutos são do tipo baga globosa de até 30 mm de diâmetro, casca
apresentando tons de vermelho a preto, polpa esbranquiçada, alto teor de açúcares,
presença de inúmeros nutrientes e contendo até quatro sementes. O processo de
maturação da jabuticaba é caracterizada pela mudança das cores da casca,
decréscimo na firmeza da fruta, aumento no pH e no conteúdo de açúcares totais
(BECKER, 2015).
A jabuticaba é um fruto rico em compostos antioxidantes, altos teores de
flavonóides, antocianinas e compostos fenólicos (DANNER et al., 2011a). Sua
casca é utilizada na medicina popular contra diarreia, asma, na inflamação dos
intestinos e hemoptise. Segundo Carvalho et al., (2009), o efeito antimicrobiano do
extrato de folhas de jabuticaba tem a capacidade de inibir o crescimento de espécies
bacterianas presentes na cavidade oral, sendo indicada a incorporação deste extrato
na produção de dentifrícios, sendo considerada como matéria-prima potencial ao
combate da cárie dental.
Análises das propriedades químicas retratam os benefícios da fruta, uma vez
que se mostrou ser fonte de fibras, carboidratos, pigmentos naturais e por possuir
compostos que apresentam atividade anticarcinogênica, destacando seu potencial
uso como ingrediente na fabricação de produtos da indústria alimentícia, na
produção de farinhas e biscoitos, cosmética e farmacêutica (FERREIRA et al.,
2012).
Um dos maiores problemas enfrentados pelos fruticultores que desejam
expandir a produção do fruto no país é o alto custo das mudas, devido
principalmente à dificuldade de enraizamento de estacas de jabuticabeira
(PEREIRA et al., 2005). Desta forma, produtores de jabuticaba optam pela
propagação seminífera, a qual contribui para a diversidade genética das plantas
(RAMOS, 2016).
A propagação por sementes pode ser afetada por diversos fatores internos e
externos, como dormência, disponibilidade de água (na semente e no substrato de
germinação), luz, gases (O2), temperatura e viabilidade da semente (MARTINS et
al., 2008). As sementes de jabuticabeira conservam-se por apenas cinco dias, sendo
5
que o armazenamento a vácuo das sementes faz com que elas possam manter sua
viabilidade por até 65 dias (DANNER, 2011b).
O tamanho das sementes influencia na germinação e no desenvolvimento
inicial das espécies de jabuticabeira “Sabará” e “Cabinho”, indicando que quanto
maior o tamanho da semente, melhor são seus resultados na germinação (JÚNIOR,
et al., 2011) e, segundo Picolotto et. al (2007), o fotoperíodo não influencia na sua
germinação.
Contudo, a propagação sexuada faz com que a muda produzida tenha um
longo período juvenil. Desta forma, produtores de mudas de jabuticabeira recorrem
à propagação vegetativa, utilizando técnicas de enxertia e alporquia (SASSO, 2009).
Para obtenção de mudas clonais e de elevado padrão sanitário, é indicada a
produção de mudas por microenxertia, método que alia a enxertia com técnicas de
cultivo in vitro de tecidos vegetais.
2.2. Cultura de Tecidos Vegetais
A cultura de tecidos vegetais, é um conjunto de técnicas de cultivo in vitro
em que partes da planta, sejam estas folhas, raízes, sementes, caules ou embriões,
são alocadas em meio nutritivo sintético adequado para a regeneração e
desenvolvimento de uma nova planta, sob condições ideais de luz, assepsia, gases e
temperatura (MURASHIGE et al., 1974).
Os meios de cultura utilizados na cultura de tecidos in vitro possuem
ingredientes vitais ao desenvolvimento dos tecidos vegetais, como macronutrientes,
micronutrientes, sacarose, vitaminas e fitoreguladores. De acordo com a exigência
das fases do desenvolvimento vegetal (estabelecimento, multiplicação e
enraizamento) e a finalidade do processo (indução de calos ou indução do
crescimento vegetativo), o meio de cultura possui concentrações específicas dos
seus componentes, podendo ser de consistência mais líquida ou gelatinosa, de
acordo com a concentração de agentes gelificantes utilizados (SAAD, 2012).
O meio de cultura mais utilizado é o meio MS, criado por Murashige &
Skoog (1962), onde contém os componentes necessários para promover o
6
crescimento vegetativo da planta, porém, deve ser acrescido de reguladores vegetais
como auxinas e citocininas, para crescimento de raízes e parte aérea,
respectivamente.
A micropropagação é uma das técnicas de maior destaque na cultura de
tecidos de plantas e tem diversas aplicações na área agrícola, sendo amplamente
utilizada em programas de pesquisas em melhoramento genético e na produção de
mudas de espécies arbóreas, ornamentais e frutíferas, visando obter plantas de
qualidade sanitária, livre de qualquer tipo de contaminação e com características
genotípicas superiores (GEORGE, 1984).
A microenxertia é uma técnica utilizada na micropropagação de plantas, a
qual consiste em microenxertar um ápice caulinar (meristema) sobre um porta-
enxerto cultivado in vitro, de aproximadamente 4 semanas de idade, para produção
de mudas de maior qualidade e produtividade (PAZ; PASCOAL, 1998). A técnica
da microenxertia pode ser, inclusive, utilizada para eliminação de viroses
(MURASHIGE et al., 1972).
Dentre as vantagens do uso das técnicas da microenxertia estão: precocidade
da produção, redução no porte da planta, assegurar que as características genéticas
desejadas não sejam perdidas, restauração de plantas injuriadas e limpeza clonal, a
qual possibilita a formação de plantas livres de viroses (REHMAN, 2015). A
germinação de sementes in vitro é um método utilizado para obtenção de plantas a
serem utilizadas como porta-enxertos no processo de microenxertia (MURASHIGE
et al., 1972).
A propagação de plantas in vitro apenas terá sucesso se a cultura não sofrer
contaminação na fase de manipulação do material vegetal a ser multiplicado,
também chamado de explante. Desta forma, é de suma importância a esterilização
do tecido vegetal, dos materiais utilizados, assim como a vedação dos recipientes
onde as plantas serão acondicionadas, caso contrário, todo o material poderá ser
perdido (GEORGE, 1984).
Ao introduzir os explantes, sejam estes sementes, embrião, folhas ou
segmentos nodais, microorganismos como fungos e bactérias podem entrar nos
7
recipientes pelo ar e causar a contaminação do material ou do meio de cultura.
Sendo assim, realizar o trabalho em câmaras de fluxo laminar, bem como utilizar
pinças e estiletes somente após esterilização é imprescindível para criar um
ambiente com alto nível de assepsia (QUISEN & ANGELO, 2008).
Para que não haja contaminação, o explante deve passar pela etapa da
desinfestação, onde a parte do vegetal a ser propagada passa por diversas etapas
para assepsia do material. Dentre os agentes utilizados na desinfestação dos
explantes, o ácido clorídrico, cloreto de mercúrio, cloreto de benzalcônico e
peróxido de hidrogênio são utilizados. Porém, as substâncias germicidas mais
utilizadas nos protocolos de desinfestação de explantes vegetais são o etanol e o
hipoclorito de sódio (NaClO) (QUISEN & ANGELO, 2008). O etanol é utilizado
geralmente nas concentrações de 70% a 80%, variando de alguns segundos a
minutos. Acima da concentração indicada, o tratamento se torna ineficiente,
podendo desidratar os tecidos vegetais de explantes mais sensíveis, como folhas
jovens e segmentos nodais (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
As concentrações de hipoclorito de sódio mais utilizadas nos protocolos de
desinfestação variam de 0,5% a 2,0% de cloro ativo, porém, alguns estudos indicam
concentrações mais altas para espécies de difícil desinfestação, com o tempo de
exposição variando de alguns segundos a minutos (TORRES et al., 2000). A alta
exposição ao hipoclorito, assim como o etanol, acaba causando efeito contrário ao
desejado, promovendo a oxidação dos tecidos e a morte dos mesmos (SMITH,
2000). Para melhorar o contato das soluções a base de cloro aos tecidos vegetais,
geralmente são adicionadas algumas gotas de detergente. Após fazer a
desinfestação, geralmente os explantes passam por uma tríplice lavagem com água
destilada autoclavada, para remoção de resíduos dos desinfestantes (TORRES et al.,
2000).
As concentrações de agentes desinfestantes utilizadas e o tempo de
exposição dependem da espécie a ser propagada (ALFENAS et al., 2004). De
acordo com Souza et al. (2011), a desinfestação de sementes de guabijuzeiro
(Myrcianthes pungens O. Berg) é mais eficiente ao se utilizar etanol 70% por 60
8
segundos, seguido de solução de hipoclorito de sódio de 4 a 6%, as quais resultaram
em 6% e 2% de contaminação fúngica, respectivamente. Segundo Martinoto et al.
(2007), para o cultivo in vitro de sementes de cagaiteira (Eugenia dysenterica DC.)
é indicado o uso de álcool 70% por 60 segundos e imersão em solução de 0,5% de
hipoclorito de sódio por 15 minutos. Picollotto et al. (2007), sugerem que a
desinfestação de sementes de jabuticabeira (Myrciaria spp.) é eficaz ao utilizar
álcool 70% por 30 segundos, seguido de imersão em solução de hipoclorito de sódio
a 5%. Entretanto, para a cultura da jabuticabeira existem poucos estudos sobre o
melhor método de desinfestação das suas sementes.
9
3. MATERIAIS E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido no laboratório de Micropropagação da
Universidade Federal de São João Del-Rei, Campus Sete Lagoas. 200 frutos de um
acesso de jabuticabeira “Sabará” foram colhidos, com as cascas apresentando
coloração 50% verde, e levados ao laboratório. Os frutos foram despolpados
manualmente e colocados em solução de CaO (2 g.L-1) por 15 minutos, para
facilitar a retirada da mucilagem.
Após a desmucilagem, foi feita a lavagem do material em água corrente,
onde também se removeu o tegumento das sementes, as quais secaram em
temperatura ambiente (±28°C) por 2 horas. As sementes foram selecionadas de
acordo com seu tamanho, onde as menores foram descartadas.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com
esquema fatorial 2x5, sendo 2 tempos de imersão (5 ou 10 minutos) e 5
concentrações de hipoclorito de sódio (0; 0,75; 1,25; 1,75; 2,25%), em 4 repetições
por tratamento. A unidade experimental foi composta por uma placa de petri
contendo 5 explantes (sementes de jabuticabeira sem tegumento).
As sementes foram mantidas por 5 minutos em solução antifúngica
constituída de água destilada e Cercobin ® na concentração de 2 g.L-1 e, em
seguida, lavadas em água corrente e levadas para a etapa de desinfestação, a qual
ocorreu na câmara de fluxo laminar, em condições de completa assepsia. As
sementes foram imersas em álcool 70% por 30 segundos (QUISEN, 2008) e seguida
da imersão de hipoclorito de sódio (NaClO) nas concentrações de 0, 0,75, 1,25, 1,75
e 2,25% de cloro ativo contendo 2 gotas de detergente comercial. As sementes
ficaram em contato com a solução de hipoclorito de sódio por 5 ou 10 minutos.
Ao final de cada tratamento, as sementes passaram por uma tríplice lavagem
com água destilada autoclavada e imediatamente inoculadas em placas de petri
contendo meio de cultura ½ MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), (Tabela 1). O
pH do meio foi ajustado para 5,8, antes da inclusão do ágar e, em seguida,
autoclavado por 20 minutos a 1,5 atm e 121°C.
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Tabela 1. Composição do Meio ½ MS (Murashige & Skoog, 1962)
Após inoculação das sementes, as placas de petri foram levadas para uma
estufa incubadora B.O.D., onde permaneceram por 7 dias no escuro, de acordo com
COMPONENTE CONCENTRAÇÃO (mg.L-1)
Macronutrientes
CaCl2. 4H2O 220
KH2PO4 85
KNO3 950
MgSO4.7H2O 185
NH4NO3 825
Micronutrientes
CoCl2.6H2O 0,0125
CuSO4.5H2O 0,0125
H2BO3 3,1
KI 0,415
MnSO4.4H20 11,15
Na2MoO4.2H2O 0,125
ZnSO4.7H2O 4,3
Fe(SO4).7H2O 13,9
Na2EDTA.2H2O 18,6
Orgânicos
Ácido nicotínico 0,25
Glicina 1,00
Mio-inositol 50
Piridoxina 0,25
Tiamina 0,025
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Sasso (2009). Posteriormente, foram expostas a luz na B.O.D, sem presença de
fotoperíodo e à temperatura de 25°C.
Aos 7, 14, 21, 28 dias foram avaliadas as porcentagens de oxidação,
contaminação fúngica e bacteriana. As sementes não contaminadas em cada
observação foram transferidas para novas placas com meio de cultura ½ MS e, após
28 dias, a porcentagem de germinação das sementes de jabuticabeira foi avaliada.
Os dados foram transformados em 𝑎𝑟𝑐𝑜𝑠𝑒𝑛𝑜√(𝑥/100) e submetidos à
análise de variância e as médias comparadas estatisticamente pelo teste de Tukey
5%, utilizando o software SISVAR (FERREIRA, 2011).
12
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não houve interação significativa (p<0,05) entre o tempo de imersão e a
concentração do hipoclorito de sódio (NaClO) em nenhuma das variáveis analisadas
(Tabela 2).
Tabela 2. Resumo da análise de variância para contaminação fúngica,
contaminação bacteriana, oxidação e germinação das sementes de jabuticabeira.
n.s. Não significativo; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste de Tukey.
Os resultados obtidos apontam que o tempo de imersão e a concentração de
NaClO influencia positivamente na redução da contaminação fúngica das sementes
avaliadas (Figura 1), entretanto, o tempo de imersão não foi significativo em relação
à contaminação bacteriana, oxidação e germinação das sementes de jabuticabeira
(Tabela 3).
Figura 1. Relação entre o tempo e concentração de hipoclorito de sódio (NaClO) na
contaminação das sementes por fungos.
Tratamento Fator de Variância GL QM Contaminação fúngica CV: 31,07 Média: 0,0556
Concentração Tempo Concentração*Tempo
4 1 4
0,0048 ** 0,0042 ** 0,0004 n.s.
Contaminação bacteriana CV: 15,38 Média: 0,0696
Concentração Tempo Concentração*Tempo
4 1 4
0,0006** 0,0001 n.s. 0,0001 n.s.
Oxidação CV: 52,48 Média: 0,0459
Concentração Tempo Concentração*Tempo
4 1 4
0,0008 n.s. 0,0014 n.s. 0,0009 n.s.
Germinação CV: 10,09 Média: 0,0791
Concentração Tempo Concentração*Tempo
4 1 4
0,0005 ** 0,0001 n.s. 0,0000n.s.
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Tabela 3. Contaminação fúngica, contaminação bacteriana, oxidação e germinação
das sementes de jabuticabeira submetidas a diferentes tempos de imersão em
hipoclorito de sódio (NaClO).
Tempo (min)
Contaminação Fúngica
(%)
Contaminação Bacteriana
(%) Oxidação
(%) Germinação
(%) 5 66,15 b 70,95 n.s. 39,90 n.s. 83,10 n.s.
10 45,45 a 15,50n.s. 52,05 n.s. 77,70 n.s. CV(%) 31,07 15,38 52,48 10,09
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, segundo teste de Tukey 5%.
A concentração da solução de NaClO contribuiu expressivamente para a
desinfestação das sementes de jabuticabeira em relação à contaminação fúngica
(Figura 2), onde maiores concentrações proporcionaram resultados expressivos,
atingindo uma queda de aproximadamente 60% na contaminação das sementes
imersas em 2,25% de NaClO (p<0.05).
Figura 2. Relação entre as diferentes concentrações de hipoclorito de sódio(NaClO)
e contaminação das sementes por fungos.
Em experimento desenvolvido por Santos (2015), sementes de jabuticabeira
com tegumento foram inoculadas em meio de cultura ½ MS para teste de
germinação in vitro, onde houve 100% de contaminação fúngica dos explantes.
Provavelmente, a retirada do tegumento implicou no melhor resultado observado
neste estudo, uma vez que o tegumento favorece os microorganismos a se ocultarem
14
em suas ondulações e assim não serem completamente afetados pelo processo da
desinfestação, resultando na contaminação do meio de cultura e dos explantes.
A imersão em solução de hipoclorito de sódio apresentou baixo rendimento
na redução da contaminação bacteriana. Apesar de ter sido reduzida em até 20%, é
possível perceber uma relação diretamente proporcional entre o aumento da
concentração de NaClO e a contaminação bacteriana (Figura 3).
Figura 3. Relação entre diferentes concentrações de NaClO e a contaminação dos
explantes por bactérias
Em estudo semelhante com a cultura da jabuticabeira, Picolotto et al. (2007)
indicaram que o uso de hipoclorito de sódio na concentração de 2,25% diminuiu a
contaminação de bactérias em 90%, divergindo dos resultados encontrados neste
trabalho. Provavelmente, ao utilizar o bico de Bunsen, o tempo de exposição ao
fogo não foi suficiente para a assepsia das pinças utilizadas. De acordo com Fortes
et al. (2012), este tipo de contaminação é a mais comum nos cultivos in vitro.
A oxidação dos explantes não foi influenciada pelo tempo de imersão e
concentração de NaClO utilizada, apresentando uma média de 45% de oxidação em
todos os tratamentos. O resultado encontrado foi, provavelmente, devido à liberação
de compostos fenólicos pela semente de jabuticabeira, uma vez que a baixa
concentração de cloro ativo utilizada não é agressiva aos tecidos vegetais a ponto de
15
causar oxidação dos tecidos. Provavelmente, os valores de oxidação encontrados
não foram maiores devido à sugestão de Sasso (2009) que, ao deixar o meio de
cultura com sementes de jabuticabeira sete dias no escuro, encontrou menores
valores de oxidação, uma vez que as sementes de jabuticabeira tendem a liberar
menos compostos fenólicos na ausência de luz.
A germinação das sementes foi influenciada positivamente pela
concentração de hipoclorito de sódio utilizada, onde todos as sementes imersas em
NaClO tiveram melhores resultados em relação ao controle, aumentando a
germinação em até 20% (Figura 4).
Figura 4. Relação entre a concentração de NaClO utilizada e a germinação
das sementes de jabuticabeira.
Em experimento semelhante, ao utilizar 2,25% de hipoclorito de sódio e
meio MS para germinação de sementes de jabuticabeira com tegumento, Picolotto et
al. (2007) obtiveram 0% de germinação em 42 dias na presença de luz, em
contrapartida aos resultados obtidos neste estudo, onde a germinação iniciou-se no
9° dia e alcançou valores entre 68% a 86%. Uma possível causa seria a
permeabilidade do tegumento, pois, com sua retirada, a dormência foi superada,
permitindo a germinação das sementes em menor tempo.
Outra possível explicação está no fato de que, neste estudo, foi utilizado
somente 50% dos sais (1/2 MS) no meio de cultura, criando uma situação de menor
diferença de potencial osmótico, se comparado ao meio de cultura MS (utilizando
16
100% dos sais). Ao utilizar 100% dos sais na preparação do meio de cultura, este
ficará mais concentrado que a semente, fazendo com que, por diferença de potencial
osmótico, a água flua da semente para o meio de cultura, causando desidratação e
prejudicando a sua germinação.
17
5. CONCLUSÃO
A germinação in vitro de sementes de jabuticabeira é um processo viável
que pode ser utilizada na produção de porta-enxertos visando a técnica da
microenxertia.
Para realizar a desinfestação de sementes de jabuticabeira “Sabará” para
cultivo in vitro e promover a sua germinação, é indicada a imersão das sementes em
solução de hipoclorito de sódio (2,25%) por 10 minutos, uma vez que se obteve
uma baixa contaminação por fungos (5%) e altos valores de germinação (86%).
18
6. REFERÊNCIAS
ALFENAS, A.C.; ZUZA, E.A.V.; MAFIA, R.G.; ASSIS, T.F. Clonagem e doenças
do eucalipto. Viçosa, MG: Universidade Federal de Viçosa, 442p, 2004.
ANDRADE, S. R. M. Princípios de cultura de tecidos vegetais. Planaltina.
Documentos 58. Embrapa Cerrados, 16p. 2002.
ASCHERI, D.P.R.; ASCHERI, J.L.R.; CARVALHO, C.W.P. Caracterização da
farinha do bagaço da jabuticaba e propriedades funcionais dos extrusados. Ciênc.
Tecnol. Aliment., Campinas, v. 26, p. 897-905, 2006.
BARROS, R.S; FINGER, F.L.; MAGALHAES, M.M. Changes in non-structural
carbohydrates in developing fruit of Myrciaria jaboticaba. Scientia Horticulturae, v.
66, p. 209-215, 1996.
BECKER, F.S.; VILAS BOAS, A.C.; SALES, A.; TAVARES, L.S.; SIQUEIRA,
H.H.; VILAS BOAS, E.V.B. Characterization of 'Sabará' Jabuticabas at different
maturation stages. Acta Sci., Agron., v. 37, n. 4, p. 457-462, 2015.
CARVALHO, C.M.; MACEDO-COSTA, M.R. , PEREIRA, M.S.V. ; HIGINO,
J.S.; CARVALHO, L.F.P.C.; COSTA, L.J.. Efeito antimicrobiano in vitro do
extrato de jabuticaba [Myrciaria cauliflora (Mart.) O.Berg.] sobre Streptococcus da
cavidade oral. Rev. Bras. Pl. Med., v.11, n.1, p.79-83, 2009.
CITADIN, I.; DANNER, M.A.;SASSO, S.A.Z. Jabuticabeiras. Revista Brasileira de
Fruticultura, Jaboticabal, v. 32, n.2, p 343-656, 2010.
DANNER, M.A.; CITADIN, I.; SASSO, S.A.Z.; SCARIOT, S.; BENIN, G. Genetic
dissimilarity among jabuticaba trees native to Southwestern Paraná, Brazil. Revista
Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.33, n.2, p.517-525, 2011a.
DANNER, M.A.; CITADIN, I.; SASSO, S.A.Z; AMBROSIO, R.; JÚNIOR, A.W.
Armazenamento a vácuo prolonga a viabilidade de sementes de jabuticabeira. Rev.
Bras. Frutic., Jaboticabal , v. 33, n. 1, p. 246-252, 2011b.
19
DONADIO, L. C. Jabuticaba (Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg). Jaboticabal:
Funep, 2000. 55p.
EFFEGEM, C.; GONTIJO, A.B.P.L.; CAMPANHARO, A.; GONTIJO, I.
Desinfestação e germinação in vitro de sementes de pimenta-do-reino (Piper
nigrum). Enciclopédia Biosfera. Goiânia, v.10,n.18, p.1221-1228, 2014.
FERREIRA, D. F.Sisvar: a computer statistical analysis system. Ciência e
Agrotecnologia (UFLA), v. 35, n.6, p. 1039-1042, 2011.
FERREIRA, A. E.; FERREIRA, B. S.; LAGES, M. M. B.; RODRIGUES, V. A. F.;
THÉ, P. M. P.; PINTO, N. A. V. D. Production, characterization and use in cookies
of flour of peel of jabuticaba. Alim. Nutr. , v. 23, n. 4, p. 603-607, 2012.
FORTES, G.A.C. Análise multiparamétrica da qualidade dos frutos, mostos e
vinhos de jabuticaba. Dissertação (Mestrado em Química) Universidade Federal de
Goiás, Instituto de Química, 2012.51p.
GEORGE, E. F.; Sherrington, P. D. Plant propagation by tissue culture. Handbook
and Directory of Commercial Laboratories Exegetics Ltd, Hant, Reino Unido,
1984.709p.
GRATTAPAGLIA, D. & MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A.
C.; CALDAS, L. S. & BUSO, J. A. (ed). Cultura de tecidos e transformação
genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-CNPH, v. 1, p. 183-260, 1998.
JOLY, A.B. Botânica: Introdução à taxonomia vegetal. 13º Ed. São Paulo,
Companhia Editora Nacional, 2002. 777p.
JUNIOR, A. W.; SILVA, J.O. da C.; PIMENTEL, L.D.; SANTOS, C.E.M.
BRUCKNER, C.H. Germinação e desenvolvimento inicial de duas espécies de
jabuticabeira em função do tamanho das sementes. Acta Scientiarium. Maringá, v.
33, n.1, p. 105-109, 2011.
20
LIMA, A.J.B; DUARTE, A.C; ALVES, A.P.C., C. ALVES. Caracterização química
do fruto jabuticaba (Myrciaria cauliflora Berg) e de suas frações. Archivos
Latinoamericanos de Nutrición, v.58, n.4, p.416-421, 2008.
MANICA, I. Frutas nativas, silvestres e exóticas: técnicas de produção e mercado:
abiu, amora-preta, araçá, bacuri, biribá, carambola, cereja-do-rio-grande, jabuticaba.
Porto Alegre: Cinco Continentes, 2000. 327 p.
MARTINOTTO, C.; PAIVA, R.;SANTOS, B.R.;SOARES, F.P.; NOGUEIRA,
R.C.; SILVA, A.A.N. Efeito da escarificação e luminosidade na germinação in vitro
de sementes de cagaiteira (Eugenia dysenterica DC.). Ciência e agrotecnologia, v.
31, n.6, p.1668-1671, 2007.
MARTINS, C. C.; CAMARA, A. T. R.; MACHADO, C. G.; NAKAGAWA, J.
Métodos de superação de dormência de sementes de Barbatimão. Acta Scientiarum.
Agronomy, v. 30, n. 3, p. 381-385, 2008.
MATTOS, J.L.R. Frutíferas nativas do Brasil. São Paulo: Nobel, 1983. 92p.
MATTOS, J.R. As espécies da secção Cauliflorae Berg do gênero Myrciaria Berg
(Myrtaceae). Comunicações avulsas de Botânica. n. 51. São Paulo. 1970. p.33
MURASHIGE, T. & SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, v.15, p. 473–497, 1962.
MURASHIGE, T.; BITTERS, W.P.; RANGAN, T.S.; NAUER, E.M.;
ROISTACHER, C.N.; HOLLYDAY, P.B. A technique of shoot apex grafting and
its utilization towards recovering virus-free Citrus clones. Hortscience, Alexandria,
v.7, p.118-119, 1972.
MURASHIGE, Toshio. Plant propagation through tissue cultures. Annual review of
plant physiology, v. 25, n. 1, p. 135-166, 1974.
OLIVEIRA, A. L.; BRUNINI, M. A.; SALADINI, C. A. R.; BAZZO, F. R.
Caracterização tecnológica de jabuticabas ‘sabará’ provenientes de diferentes
regiões de cultivo. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 25, n. 3, p. 397-400, 2003.
21
PAZ, O. P.; PASQUAL, M. Microenxertia. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.;
BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasilia:
Embrapa – CNPH; CBAB, v.1, p.147-159, 1998.
PEREIRA, M.; OLIVEIRA, A.L.; GONÇALVES, A.N.; ALMEIDA, M. Efeitos de
substratos, valores de pH e concentrações de AIB no enraizamento de estacas
apicais de jabuticabeira [Myrciaria jaboticaba (Vell) O. Berg.]. Scientia Florestalis,
Piracicaba, n.69, p.84-92, 2005.
Pereira, G.A.; Correa, L.S.; Boliani, A.C. Desinfestação e estabelecimento in vitro
de explantes de bananeira ‘Grande naine’ em diferentes concentrações de
hipoclorito de sódio. Revista Brasileira de Fruticultura Edição Especial: 222-226,
2011.
PICOLOTTO, L.; SCHUCH, M. W.; DE SOUZA, J. A.; DA SILVA, L. C.; FERRI,
J.;FACHINELLO, J. C. Efeito do hipoclorito de sódio, fotoperíodo e temperatura
no estabelecimento in vitro de jabuticabeira. Scientia Agraria, v. 8, n. 1, p. 19-23,
2007.
QUISEN, R. C.; ANGELO, P. C. S. Manual de procedimentos do laboratório de
cultura de tecidos da Embrapa Amazônia Ocidental. 1° Ed. Manaus, AM, 2008. 44
p.
RAMOS, M.C.P. Crescimento e marcha de absorção de nutrientes em genótipos de
jabuticabeira Sabará. Dissertação (Mestrado em Ciências Agrárias), 2016. 62p.
REHMAN, H.U.; GILL, M.I.S. Micrografting of Fruit Crops - A Review. Journal
Horticulture , v. 2, 2015. 151p.
SAAD, A.I.M; ELSHAHED, A.M. Plant tissue culture media. Recent advances in
plant in vitro culture, p. 29-40, 2012.
SANTOS, S. K. ; PEREIRA, S. S. ; COSTA JUNIOR, O. D ; SANTOS, L. A ;
COSTA, N. P. Germinação in vitro de jabuticabeira (Myrciaria jaboticaba). In: 20º
Congresso Brasileiro de Floricultura e Plantas Ornamentais e 7º Congresso
22
Brasileiro de Cultura de Tecidos de Plantas, 2015, Piracicaba. 20º Congresso
Brasileiro de Floricultura e Plantas Ornamentais e 7º Congresso Brasileiro de
Cultura de Tecidos de Plantas, 2015.
SASSO, S.A.Z.; Propagação vegetativa de jabuticabeira. Dissertação (Mestrado).
Pato Branco. UTFPR, 2009. 64p.
SMITH, J. Micro-propagation of the Gymea Lily: a report for the Rural Industries
Research and Development Corporation. Kingston: RIRDC, 2000. 59p
SOBRAL, M. Alterações nomeclaturais em plinia (Myrtaceae). Boletim do Museu
Botânico de Curitiba, Curitiba, n. 63, p.1-4, 1985.
SOUZA, L.S.; FIOR, C.S.; SOUZA, P.V.D.; SCHWARZ, S.F. Desinfestação de
sementes e multiplicação in vitro de guabijuzeiro a partir de segmentos apicais
juvenis (Myrcianthes pungens O. Berg). Revista Brasileira de Fruticultura, v. 33,
n.3, p. 691-697, 2011.
TORRES, A. C.; FERREIRA, A. T.; SÁ, F. G.; BUSO, J. A.; CALDAS, L. S.;
NASCIMENTO, A. S.; BRÌGIDO, M. M. & ROMANO, E. Glossário de
Biotecnologia vegetal. Brasília: Embrapa Hortaliças. 2000.