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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE EXTRATOS ORGÂNICOS E

CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE UMA LECTINA DE MANILKARA RUFULA

JOSÉ HELTON DE VASCONCELOS ARCOVERDE

Recife

Fevereiro de 2015

______________________________________________________________________


AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE EXTRATOS ORGÂNICOS E

CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DE UMA LECTINA DE MANILKARA RUFULA

Tese apresentada ao programa de

Pós Graduação em Ciências

Biológicas da Universidade Federal

de Pernambuco, como requisito final

exigido para a obtenção do título de

Doutor em Ciências Biológicas, área

de concentração: Biotecnologia.

ORIENTADORA:Profa. Dra.

Maria das Graças Carneiro da

Cunha.

_______________________________________________________________

Recife, Fevereiro de 2015

Catalogação na Fonte: Bibliotecário Bruno Márcio Gouveia, CRB-4/1788

Acorverde, José Helton de Vasconcelos

Avaliação da atividade biológica de extratos orgânicos e caracterização parcial de lectina de Manilkara Rufula / José Helton de Vasconcelos Arcoverde. – Recife: O Autor, 2016. 179 f.: il. .

Orientadora: Maria das Graças Carneiro da Cunha Tese(doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, 2016.

Inclui referências e anexos

1. Caatinga 2. Plantas da Caatinga3. Lectinas I. Cunha, Maria das

Graças Carneiro II. Título.

634.909811 CDD (22.ed.) UFPE/CB-2010-268

ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica...


"Avaliação da atividade biológica de extratos orgânicos e caracterização

parcial de uma lectina de Manilkara rufula"

Tese apresentada ao programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito final exigido para a obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração: Biotecnologia.

Data de Aprovação:_23_/_02_/_2015

COMISSÃO EXAMINADORA

Profa. Dra. Maria das Graças Carneiro da Cunha- (Orientadora) Departamento de Bioquímica (LIKA/UFPE)

Prof. Dr. Thiago Henrique Napoleão - (UFPE) Departamento de Bioquímica

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Rafael Matos Ximenes - (UFPE) Departamento de Antibióticos

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Romero Marcos Pedrosa Brandão Costa- (UFRPE)

_______________________________________________________________ Profa. Dra. Marthyna Pessoa de Souza - (UFPE)

SUPLENTES

______________________________________________________________

Profa. Dra. Maria Terezados Santos Correia - (UFPE) Departamento de Bioquímica

______________________________________________________________

Profa. Dra. Márcia Vanuza da Silva - (UFPE) Departamento de Bioquímica


DEDICATÓRIA

“Dedico este trabalho a todos que me deram apoio,

principalmente a minha família que esteve sempre ao

meu lado, e nos mementos difíceis me incentivaram

para que essa conquista pudesse ser alcançada”.


AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me abençoado, iluminado e estar sempre presente

diante das dificuldades, me concedendo força e fé todos os dias para que

pudesse ter concluído mais esse objetivo em minha vida;

A meus pais, José Hiran e Maria Ideane, meu eterno agradecimento, por

acreditaram em meu potencial, e estarem sempre me apoiando e incentivando,

isso me fez mais forte para dar sempre o melhor de mim;

A minha esposa Suzana, pelo seu companheirismo, amizade,

compreensão, apoio e amor. A Hemilly Susan da qual nos últimos anos não

pude estar muito próximo, mas que esteve sempre em meu pensamento.

Vocês foram grande parte da minha inspiração para o desenvolvimento e

conclusão desse trabalho;

A meus irmãos Hiran e Jemima e a meus avós, agradeço por sempre se

orgulharem de mim e confiarem em meu trabalho;

Às minhas orientadoras Professoras Dra. Graça Cunha, Dra. Tereza

Correia e Dra. Oliane Magalhães, por acreditarem em mim. Agradeço por me

mostrarem o caminho da ciência e dividirem os vossos conhecimento, e

principalmente por fazerem parte da minha vida por alguns anos, pois vocês

serão sempre exemplos de profissionalismo e dedicação;

A Professora Dra. Marcia Vanusa, pois foi uma das pessoas que mais

contribuiu para que esse trabalho rendesse bons frutos;

A meus amigos da Pós-Graduação, pelos momentos divididos juntos,

especialmente aos colegas do Laboratório de Biotecnologia, Paulo, Pricila,

Fernando, Isabel, Carlos, Carol e Rita, que além de companheiros de trabalho

se tornaram verdadeiros amigos. Aos colegas do Laboratório de Enzimologia

nas pessoas de Douglas, Janilson, Guto e Robinson; do Laboratório de

Glicoproteínas Raiana, Michele e Aline; do Laboratório de Produtos Naturais

Barbara, Cecília, Alexandre e Seu João, e demais amigos do Departamento de

Bioquímica. Obrigado por tornarem meu trabalho mais leve e divertido, por

dividirem comigo as angústias e alegrias. Foi bom poder contar com vocês!


Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pelo título de

Doutor que me foi concedido;

A Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco

(FACEPE) pelo apoio financeiro para o desenvolvimento deste projeto;

Ao Departamento de Bioquímica na pessoa de Miron, e todos desse

departamento, que de uma forma ou de outra contribuíram para a conclusão

deste trabalho;

Muito obrigado...


Tudo o que somos nasce com nossos pensamentos e, em

nossos pensamentos, fazemos o nosso mundo.

“Buda”


RESUMO Este trabalho teve como objetivos realizar um screening com diversas espécies

da Caatinga, isolar, caracterizar e testar quimicamente moléculas bioativas

presentes nas folhas de Manilkararufula (Maçaranduba), visando agregar valor

biotecnológico às plantas desse bioma. Foram avaliadas 28 espécies vegetais

quanto à presença de lectinas, a partir do teste de atividade hemaglutinante

(AH), e inibição de tripsina. Utilizando aparelho soxhlet deferentes extratos

orgânicos foram preparados, em ordem eluotropica, com folhas de M. rufula,

utilizando os solventes clorofórmio, acetato de etila e metanol, e o perfil

fitoquímico dos extratos obtidos traçado por cromatografia em camada delgada

(CCD). Testes de atividade antioxidante,invitro, com os extratos foram

realizados pelos métodos de DPPH e Fosfomolibidênio, e os mesmos tiveram

ainda seus conteúdos de flavonoides determinados. A ação protetora de DNA

também foi avaliada para os extratos e a lectina obtida.A atividade

antimicrobiana foi realizada por diluição seriada em microplaca contra seis

espécies de bactérias.Neste estudo foi avaliada ainda a atividade termiticida

para cada um dos extratos obtidos.Uma lectina foi obtida a partir do extrato

salino das folhas de M.rufula, aprengando-se métodos tradicionais de

purificação, como fracionamento salino e cromatografia de afinidade. Dentre as

espécies analisadas, 20 apresentaram AH, onde as concentrações proteicas

nos extratos salinos variaram de 0,95 a 20,88 mg/mL, e 21 foram capazes de

inibir, em seus extratos, a atividade de tripsina em algum nível. O ensaio em

CCD revelou pouca diversidade de compostos secundários nas folhas de M.

rufula, sendo encontrados heterosídeos cianogênicos, flavonoides, triterpenos,

esteroides e taninos. Os melhores resultados de atividade antioxidante foram

obtidos com os extratos preparados com metanol e acetato de etila, os quais

apresentaram excelente sequestro de radicais livres a uma concentração de

200 µg/mL. Nestes extratos também foram encontradas uma alta concentração

de compostos fenólicos e flavonódies, os mesmos também apresentaram

atividade protetora de DNA e mostraram-se eficazes como agentes

antimicrobianos, atuando contra algumas cepas de bactérias Gram-positivas e

Gram-negativas. Os três extratos obtidos apresentaram atividade termiticida

com eliminação de 100% dos insetos em até 48 horas. A lectina foi obtida por


cromatografia em suporte de quitina e mostrou-se altamente termoestável,

mantendo sua AH mesmo quando submetida a estresses de calor e resistente

a variações de pH. A lectina não teve sua AH alterada pela presença de íons, e

em SDS-PAGE observou-se a presença de duas bandas com 42,3 e 36,2 kDa.

Esta proteína também apresentou atividade protetora de DNA e antibacteriana

contra M. luteus. Este é o primeiro relato que apresenta M. rufula como uma

espécie vegetal com potencial biotecnológico, tornando-a uma promissora fonte

de novos compostos bioativos.

Palavras chave: Caatinga; Manilkararufula; Compostos bioativos; Atividade

biológica.


ABSTRACT

This work had as objectives to perform a screening with several species from

Caatinga, isolate, characterize and test chemically bioactive molecules present

in the leaves of Manilkara rufula (maçaranduba), aiming to add value to this

biome plant biotechnology. Twenty eight plant species were evaluated for the

presence of lectins, from the hemagglutinating activity (AH) and inhibition of

trypsin. Using soxhlet apparatus different organic extracts were prepared, in

order eluotropic, with leaves of M. rufula, using solvents chloroform, ethyl

acetate and methanol. The phytochemical profile of extracts obtained charted

by thin-layer chromatography (TLC). Testing of antioxidant activity in vitro with

extracts were carried out by methods of DPPH and phosphomolybdeno and

they even had their content of flavonoids determined. The protective action of

DNA has also been evaluated for lectin and extracts. The antimicrobial activity

was performed by serial dilution in microplate against six species of bacteria. In

this study was to evaluate the termiticide activity for each of the extracts

obtained. A lectin was obtained from the saline extract of leaves of M. rufula,

utility traditional methods of purification, as salt fractionation and affinity

chromatography. Among the species analyzed, 20 presented AH, where

protein concentrations in saline extracts ranged from 0.95 to 20.88 mg/mL, 21

were able to inhibit, in their statements, the activity of trypsin on some level. The

test in TLC revealed little diversity of secondary compounds in this tissue, and

found cyanogenic glycosides, flavonoids, triterpenes, steroids and tannins. The

best results were obtained with antioxidant activity of the extracts prepared from

methanol and ethyl acetate, which showed excellent scavenging free radicals at

a concentration of 200/mL. In these extracts were also found a high

concentration of phenolic compounds and flavonods, the same also presented

protective activity of DNA and proved effective as antimicrobial agents, acting

against a few strains of Gram-positive and Gram-negative bacteria. The three

extracts obtained showed termiticide activity with 100% elimination of insects

within 48 hours. The lectin was obtain by chromatography on chitin support and

was highly thermostable, maintaining its HA even when subjected to heat and

resistant to pH changes. The lectin did not have its HA amended by presence of

ions, and SDS-PAGE showed the presence of two bands with 42.3 and 36.2


kDa. This protein also presented DNA and antibacterial protective activity

against m. luteus. This is the first report that presents M. rufula as a species

with biotechnological potential, making it a promising source of new bioactive

compounds.

Keywords: Caatinga; Manilkara rufula; Bioactive compounds; Biologic activity.


LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 1: Área de Caatinga no PARNA do Catimbau. FONTE: (ARCOVERDE, 2015)... 20

Figura 2: Localização geográfica do PARNA do Catimbau (municípios de Buíque,

Tupanatinga e Ibimirim), estado de Pernambuco, Brasil. FONTE: (ARCOVERDE, 2015 22

Figura 3: Arvore (A), folhas (B) e frutos (C) de Manilkara rufula. FONTE:

(ARCOVERDE, 2015)....................................................................................................... 30

Figura 4: Estrutura química geral dos flavonoides e suas diferentes classes. FONTE:

(RAVISHANKAR et al., 2013)............................................................................................ 42

Figura 5: Dímeros comuns de taninos condensados, (proantocianidinas) encontrados

em plantas. Variação estrutural, devido aos tipos de ligações. FONTE: (BARBEHENN

e CONSTABEL, 2011).......................................................................................................

45

Figura 6: Estrutura básica dos esteróides com a respectiva numeração dos seus

carbonos............................................................................................................................ 48

Figura 7: Estrutura do núcleo de espirostano. FONTE: (THAKUR et al., 2011).............. 49

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À JOURNAL OF CHEMICAL ECOLOGY

Figura 1: Protective effects of different extracts in DNA nicking assay. (A) Lane 1:

negative control (distilled water + DNA), (B) Lane 2: control (DNA + Fenton’s reagent),

(C) Lane 3-5: AcOEt (125 µg/mL) + Fenton’s reagent, (D) Lane 6-8: CHCl3 (125 µg/mL)

+ Fenton’s reagent, (E) Lane 9-11: MeOH (125 µg/mL) + Fenton’s reagent……………... 114

Figura 2: Termiticide activity of the chloroform (A), ethyl acetate (B) and methanol (C)

extracts prepared from the leaves of M. rufula.................................................................. 117

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À PROCESSBIOCHEMISTRY

Fig. 1: Profile of quitin affinity chromatographic column eluted with acetic acid 1mol/L… 152

Fig. 2: Molecular Characterisation. SDS-PAGE gel (12,5%) obtained through lectin

purification on quieten chromatography, stained with bright blue Coomassie. Band

molecular weights were 43,2 (A) e 36,3 (B) KDa, respectively........................................ 153

Fig. 3: Chromatography of MkaLL on Superdex-75 10/300GL column accepted to a

ÄKTA purifying system, equilibrated and eluted with NaCl 0,15 mol/L…………………….

154


Fig. 4: Effect of pH at hemagglutinating activity after incubation with different pH (4,5-

11) buffers......................................................................................................................... 155

Fig. 5: Effect of temperature at MkaLL HA in rabbit erythrocytes. The initial activity was

512 and each point over the line represents the average of three repetitions................... 156

Fig. 6: Protective effects of lectin of M. rufula in DNA nicking assay. (A) Lane 1:

negative control (distilled water + DNA), (B) Lane 2: control (DNA + Fenton’s reagent),

(3) Lane 3-5: MkaLL (5o µg/mL) + Fenton’s reagent…….................................................. 157


LISTA DE TABELAS

ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO PELA NATURAL PRODUCT RESEACH:

FORMERLY NATURAL PRODUCT LETTERS.

Table 1: Studied species and their tissues examined for lectin and trypsin inhibitor

activity with therespective titres of HA, protein concentration (mg/mL) and trypsin

inhibitory effect of the saline extracts………………………………………………………….. 94

Table S1. Species collected in the Vale do Catimbau National Park (Caatinga of

Pernambuco)……………………………………………………………………………………… 102

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À JOURNAL OF CHEMICAL ECOLOGY

Table 1: Phytochemical profile obtained by thin layer chromatography (TLC) of

chloroform, ethyl acetate and methanol extracts prepared from the leaves of M.

rufula................................................................................................................................... 112

Table 2: Concentrations (µg/ml) of the MeOH, AcOEt and CHCl3 extracts, from the

leaves of M. rufula, able to scavenge 50% of the free radicals of DPPH………………….. 113

Table 3: Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) obtained with the organic extracts from the leaves of M. rufula…... 116

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À PROCESSBIOCHEMISTRY

Table 1: Inhibition of hemagglutinating activity of 40-80% saline fraction of leaves from M. ruful. using rabbit red blood erythrocytes.…………………………………………………. 149

Table 2: Purification summary of leaf lectins from Manilkararufula................................... 150

Table 3: Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal

Concentration (CBM) of MkaLL against bacterias……………………………………………. 151


LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

AAT: Atividade Antioxidante Total

AH: Atividade Hemaglutinante

BSA: albumina sérica bovina (Bovine Serum Albumine)

CBM: Concentração Bactericida Mínima

CCD: Cromatografia em Camada Delgada

DMSO: Dimetilsulfóxido

DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo

EAG: Equivalente ao Ácido Gálico

EROs: Espécies Reativas de Oxigênio

ha: hectare

MIC: Concentração Inibitória Mínima

MkaLL: lectina das folhas de Manilkararufula

PARNA: Parque Nacional

SDS-PAGE: eletroforese em gel de proliacrilamida (Sodium Dodecyl Sulphat-

Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

SUMÁRIO Pag

1.INTRODUÇÃO................................................................................................ 17

2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................... 19

2.1 Bioma Caatinga........................................................................................ 19

2.2 Parque Nacional do Catimbal................................................................... 21

2.3 Plantas:Fontes de Novos Compostos Bioativos...................................... 22

2.4 Família Sapotaceae.................................................................................. 26

2.4.1 Gênero Manilkara............................................................................. 26

2.5 Compostos Bioativos................................................................................ 30

2.5.1 Metabólitos Primários....................................................................... 31

2.5.1.1 Lectinas......................................................................................... 32

2.5.1.1.2 Inibidores de tripisina.................................................................. 35

2.5.2 Metabolitos Secundários.................................................................. 36

2.5.2.1 Classificação.................................................................................. 38

2.5.2.1.1 Compostos Fenólicos................................................................. 38

2.5.2.1.1.1 Fenóis...................................................................................... 39

2.5.2.1.1.2 Flavonóides............................................................................. 41

2.5.2.1.1.3 Taninos.................................................................................... 43

2.5.2.1.2 Terpenóides................................................................................ 46

2.5.2.1.2.1 Esteroides................................................................................ 47

2.5.2.1.3 Saponinas................................................................................... 48

2.5.2.1.4 Compostos Nitrogenados........................................................... 51

2.5.2.1.4.1 Alcalóides................................................................................ 51

2.5.4 Atividades Biológicas de de Metabólitos Secundários...................... 52

2.5.4.1 Atividade Antioxidante................................................................... 52

2.5.4.2 Atividade Antimicrobiana............................................................... 53

2.5.4.3 Atividade termiticida...................................................................... 54

3. OBJETIVOS.................................................................................................... 56

3.1 Geral......................................................................................................... 56

3.2 Específicos................................................................................................ 56

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 58

5. CAPITULO I - ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO PELA NATURAL

PRODUCT RESEACH: FORMERLY NATURAL PRODUCT LETTERS ……… 89


6. CAPITULO II - MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À JOURNAL OF

CHEMICAL ECOLOGY....................................................................................... 104

7. CAPITULO III - MANUSCRITO A SER SUBMETIDO À PROCESS

BIOCHEMISTRY................................................................................................. 127

8. CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................... 158

ARCOVERDE J.H.V. – Avaliação da atividade biológica... 17

1. INTRODUÇÃO

As plantas com propriedades medicinais constituem a base dos sistemas

de cuidados a saúde em muitas sociedades. Ouso dos conhecimentos e

práticas associadas a esses recursos vegetais fazem parte de uma importante

estratégia ligada à conservação da biodiversidade, à descoberta de novos

medicamentos, e melhoria na qualidade de vida em comunidades rurais

(BALAKRISHNANet al., 2014).

A partir do metabolismo primário das plantas, dentre vários outros

compostos, são produzidos ácidos nucleicos, proteínas e carboidratos e,

juntamente com as reações bioquímicas básicas da mesma, como a respiração

e fotossíntese, as plantas evoluíram na produção de uma ampla variedade de

substâncias secundárias. Essas substâncias foram denominadas de compostos

ou metabólitos secundários (TAIZ eZEIGER, 2004).

As lectinas são um grupo de proteínas ou glicoproteínas de origem não

imune,altamente diversas, ubiquamente distribuídas em plantas, animais e

micro-organismos (LEI-LEI et al., 2011).Apresentam a capacidade de

reconhecer e ligar-se especificamente a mono ou oligossacarídeos sem induzir

alterações na estrutura dos mesmos (SOUZA et al., 2011).

Estudos mostram que um grande número de lectinas têm sido isoladas e

caracterizadas em diversas plantas, e estas proteínas estão emergindo como

moléculas promissoras, principalmente por conterem sítios de ligação

específicos, pois esta habilidade especial de reconhecimento pode ser utilizada

como importante ferramenta biotecnológica (COSTA et al., 2010;

CHARUNGCHITRAK et al., 2011).

A família Sapotaceae, presente no bioma da Caatinga, possui

distribuição tropical e subtropical, incluindo cerca de 50 gêneros contendo 1000

espécies de hábito arbóreo e arbustivo. No Brasil, ocorrem 14 gêneros e cerca

de 200 espécies, com destaque para Chrysophyllum, Manilkara, Micropholis,

Pouteria, Pradosiaos e Sideroxylon (ALMEIDA-JUNIOR, 2010). Quimicamente,

as espécies desta família são caracterizadas por apresentarem uma variedade

de classes de substâncias, sendo os compostos mais conhecidos as

saponinas, flavonoides, polifenois, triterpenos, carotenoides, esteroides, ácidos


graxos e taninos, com diversas atividades biológicas já comprovadas

(KUSHIMA, 2005; MONTENEGROet al., 2006; BARBOSA-FILHOet at., 2008).

No gênero Manilkara são encontradas algumas espécies que têm sido

utilizadas popularmente como plantas medicinais no tratamento de várias

enfermidades, como inflamações, febre, hemorragias, dores de estômago e

comocicatrizantes. Alguns estudos já realizados com espécies deste gênero

mostraram que, as mesmas são possuidoras de compostos com diversas

propriedades biológicas, como antimicrobiana, antiparasitária, antitumoral e

antioxidante (CHANDA e NAGANI, 2010; KANERIA e CHANDA, 2012). Na

literatura não há relatos com M. rufula que tratem do seu potencial como fonte

de compostos bioativos, sendo este o primeiro trabalho que mostra a presença

de tais componentes na espécie.

Estudos mostram que compostos naturais oferecem inúmeras

oportunidades para o desenvolvimento de novas drogas com potencial

terapêutico. Logo, explorar as potencialidades oferecidas pelas plantas da

Caatinga, é uma forma de não só contribuir para a obtenção de novos

princípios bioativos, mas também uma maneira de agregar valor à região e

contribuir para sua preservação.Diante do exposto, este trabalho teve como

objetivos, determinar o potencial biotecnológico de espécies deste bioma,

identificar e avaliarquímica e biologicamentecompostos secundários oriundos

do metabolismo celular, e obter uma lectina das folhas de Manilkararufula,

visando novas e futuras aplicaçõesde biomoléculas desta espécie como

antioxidantes e antimicrobianas.


2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Bioma Caatinga

A Caatinga é um bioma de clima semiárido com florestas arbustivas e

espinhosas, de folhas decíduas, encontradas no Nordeste brasileiro(SILVA et

al., 2014).A mesma responde por aproximadamente 10% do território nacional

e 60% da região Nordeste. Caatinga, que em Tupi significa “matabranca”,

aparência que quase sempre tem no período mais seco, é um dos tipos de

vegetação mais heterogêneo presentes no Brasil. Devido às variações de

relevo e microclima, são encontrados nesse bioma ecotopos formados por

espécies de cerrado de campos rupestres, de mata atlântica e de restinga

(RODRIGUES, 2006; PORDEUS, 2007).

Suas faixas de precipitação média anual estão entre 240-1500 mm

(LEALet al., 2005).A estação seca dura entorno de sete meses e o inverno é a

estação das chuvas, onde as temperaturas não são tão elevadas. Estas

características fazem da Caatinga um tipo peculiar de vegetação adaptada às

condições climáticas locais encontradas nesta região (TRENTIN et al., 2011).

No bioma Caatinga, já foi comprovada a existência de 510 gêneros e

5.344 espécies de plantas vasculares, dentre os quais 18 gêneros e 318

espécies são endêmicas (GIULIETTIet al., 2002), o que caracteriza essa região

como uma das grandes áreas de maior biodiversidade no Brasil.

Na Caatinga predomina a vegetação xerófita (figura 1) que carrega um

grande número de espécies vegetais. Este bioma é uma matriz de matagais

espinhosos e florestas sazonalmente secas, com bolsões de florestas tropicais

de altitude e cerrado, que abrange a maior parte dos estados do Piauí, Ceará,

Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia e parte

do nordeste de Minas Gerais, no Vale do Jequitinhonha, ocupando uma área

de aproximadamente 735.000 km2(BASSO et al., 2005), representando a

quarta maior área coberta por uma única forma de vegetação no Brasil

(CARTAXO et al., 2010), onde estão presentes espécies que não podem ser

encontradas em nenhum outro lugar do mundo.


Figura 1: Área de Caatinga no PARNA do Catimbau (ARCOVERDE, 2015).

Áreas desse bioma têm sofrido forte influência humana ao longo dos

anoslevando à perda de paisagens e trazendo consequências graves para a

manutenção da biodiversidade local(ALBUQUERQUE et al., 2005). A

fragmentação de toda Caatinga pode levar ao desaparecimento de espécies e

organismos únicos da região (NETO, 2009). Silva et al. (2014) afirmam que a

pressão antrópica associada a aridez local levou a uma extrema degradação

de grandes extensões desse bioma, dando origem aos chamados núcleos de

desertificação,o que enfatiza a importância e urgência do desenvolvimento de

estratégias sustentáveis para preservação da biodiversidade nesta área.

Neste ambiente, encontram-se espécies de ocorrência endêmica, bem

como plantas com atividades farmacológicas reconhecidas pela população

local, muitas delas ainda desconhecidas pela ciência, tanto do ponto de vista

botânico como químico e farmacológico (RODRIGUES, 2006; NETO, 2009).

Nos últimos anos tem havido um crescente interesse em adquirir

conhecimentos sobre as plantas dentro desta área (ALBUQUERQUE et al.,

2007a), e algumas publicações já descreveram a rica flora da região como

promissora fonte de compostos bioativos(ALMEIDA et al., 2005; AGRA et al.,

2007a; ALBUQUERQUE et al., 2007b; ALBUQUERQUE e OLIVEIRA, 2007;

AGRA et al., 2008).


Em termos de utilizações medicinais, alguns compostos obtidos de

plantas da Caatinga já demonstraram propriedades interessantes como anti-

inflamatória, antimicrobiana, cicatrizante e antioxidante. E estes compostos

aparecem essencialmente em algumasfamilias de plantas desta região

(ALMEIDA et al., 2005). Além disso, esses coonstituintes aparecem em

concentrações elevadas em algumas espécies que são intensamente utilizadas

para fins terapêuticos (MONTEIRO et al., 2006).Segundo Agra et al. (2007) no

nordeste do Brasil as práticas medicinais tradicionais têm sido usadas para

tratar uma imensa variedade de doenças, incluindo enfermidades da pele,

distúrbios gastrointestinais, tuberculose, infecções do trato urinário, e outras.

No entanto, algumas destas plantas utilizadas necessitam de estudos

científicos para confirmarem sua eficácia (CARTAXO et al., 2010).

2.2 Parque Nacional do Catimbau

Criado em 2002 elocalizado a 278 Km da cidade do Recife, Capital do

Estado de Pernambuco, o Parque Nacional da Serra do Catimbau (PARNA do

Catimbau), está inserido na zona de transição entre o Agreste e Sertão do

Estado, entre as coordenadas geográficas: 8°24’00” e 8°36’35” S e 37°09’30” e

37°14’40” W(figura2). Sua área é de 62.300 ha, na forma de uma poligonal e

encontra-se distribuída entre os municípios de Buíque (12.438 ha.);

Tupanatinga (23.540 ha) na Microrregião do Vale do Ipanema, e Ibimirim

(24.809 ha) na Microrregião do Moxotó Semiárido Pernambucano

(RODRIGUES, 2006). A região em estudo é considerada o segundo maior

parque arqueológico do Brasil, com aproximadamente trinta sítios

arqueológicos (PORDEUS, 2007). Em sua vegetação predomina a Caatinga

característica marcante da flora do parque, (RODRIGUES, 2006; PORDEUS,

2007), sendo uma das poucas áreas onde ainda podem ser encontradas matas

desse bioma não alteradas pela ação do homem.

O PARNA do Catimbau é constituído de paisagens com grandes

riquezas e biodiversidade impar em seu Estado. Em pesquisa realizada pela

Sociedade Nordestina de Ecologia (S.N.E), a região do Catimbau por suas

características, foi considera Área de Extrema Importância Biológica

(RODRIGUES, 2006).


Figura2: Localização geográfica do PARNA do Catimbau (municípios de Buíque, Tupanatinga e Ibimirim), estado de Pernambuco, Brasil (ARCOVERDE, 2015).

A vegetação de Caatinga presente nas áreas do Catimbau mostra

grande diversidade de espécies e estruturas, em função das variações de

relevo e do topoclima. Por essa razão, podem ser encontradas no parque,além

da quelas típicas da Caatinga,outras espécies presentes em áreas de cerrado,

campos rupestres, e mata Atlântica. Nos planaltos e chapadas dessa região,

ainda são encontradas vegetações residuais pouco conhecidas e estudadas,

como os encraves de mata úmida nos brejos de altitude e a vegetação

arbustiva perenifólia das chapadas (RODRIGUES, 2006).

2.3Plantas:Fontes de Novos Compostos Bioativos

Há milhares de anos a natureza tem sido fonte de agentes medicinais,

uma vez que dispõe de compostos altamente diversificados que muitas vezes

apresentam atividades biológicas específicas (CHANDA ePAREKH, 2010).

Tradicionalmente, as plantas, oferecem um vasto campo de estudos para a

descoberta de novos agentes com potencial terapêutico (MOOTOOSAMY e

MAHOMOODALLY, 2014), onde as informações obtidas a partir de efeitos


biológicos dos fitoterápicos tornam-se um valioso contributo para a descoberta

de novos compostos bioativos alem de permitir o desenvolvimento de novas

linhas terapêuticas (EISSA et al., 2014).

A ampliação do conhecimento etnobotânico sobre o uso de plantas com

propriedades medicinais e o desenvolvimento de pesquisas nessa área,

ganhou substancial consideração entre as comunidades científicas aolongo do

tempo. Ainda, o aumento no custo dos tratamentos convencionais para

algumas doenças, os custos crescentes das drogas de origem sintéticas e a

resistência antimicrobiana frente a vários antibióticos, tem incentivado a busca

por novos medicamentos derivados das plantas (AREEJ et al., 2013; KAYANI

et al., 2014).

Mesmo com os avanços da indústria farmacêutica na produção de

medicamentos sintéticos, diversos agentes quimioterapêuticos ainda têm sido

desenvolvidos como resultado de estudos de plantas com propriedades

medicinais (OSMAN et al., 2011). Estas têm sido usadas em várias partes

domundo para tratar diferentes enfermidades, pricipalmente em regiões com

difícil acesso a programas de saúde, onde a utilização de plantas na medicina

tradicional é muito comum por grande parte da população local (AREEJ et

al.,2013).

Várias pesquisas etnofarmacológicas têm sido publicadas nos últimos

anos com base na medicina tradicional em várias culturas da África

(KARUNAMOORTHI e TSEHAYE, 2012; SEMENYA et al., 2012), Ásia (DEY

eKUHAD, 2014), Austrália (PACKER et al., 2012), China (GHORBANI et al.,

2011), América do Sul (REHECHO et al., 2011) e em regiões específicas de

países ocidentais (CALVO et al., 2011; CAVERO et al., 2011) com o objetivo

de preservar o uso de ervas como remédios, e encontrar uma abordagem

baseada em evidências, para seu uso como medicamentos (EISSA et al.,

2014).

Estudos etnobotânicos realizados nas regiões tropicais demonstraram

que as populações locais possuem um amplo conhecimento a cerca das

espécies de plantas farmacologicamente úteis (TACHER et al., 2002; TORRE-

CUADROS e ISLEBE, 2003; ALBUQUERQUE e OLIVEIRA, 2007). Ainda,

essas informações sobre o uso dos recursos naturais também podem contribuir

para a conservação da biodiversidade local. A importância global de plantas


com propriedades medicinais pode ser atribuída pelos numerosos

medicamentos convencionais que foram derivados a partir destas, e que são

atualmente utilizados na prática clínica (HÜBSCH et al., 2014). Muitas espécies

têm sido reconhecidas por suas propriedades curativas e exercerem um

impacto benéfico sobre a saúde, apresentando diversas atividades biológicas

como, por exemplo, anti-inflamatória, antimicrobiana, antioxidante,

hipolipemiantes,antimutagênicos e outros(BALAKRISHNAN et. al., 2014).

Estudos mostram que compostos naturais puros e extratos vegetais

padronizados oferecem inúmeras oportunidades para o desenvolvimento de

novas drogas com potencial biotecnológico, devido a suadiversidade química

inigualável (ASWATHANARAYAN eVITTAL, 2013).Viegas-Jr et al. (2006)

afirmam que nos países ocidentais, onde a base da indústria farmacêutica é a

química sintética, 25% dos fármacos foram originalmente isolados de plantas.

De acorco com Almeida et al. (2005), vários estudos têm chamado a

atenção para o uso de plantas com propriedades medicinais, discutindo

diferentes hipóteses na tentativa de explicar os padrões de uso encontrados.

Stepp (2004), em seu trabalho, observou uma alta frequência de ervas

daninhassendo utilizadas para fins terapêuticos em várias partes do mundo,

sugerindo que esta preferência possa estar relacionada a aspectos químicos

das mesmas. No entanto, fatores culturais, influenciam fortemente a seleção e

uso de plantas para tais fins (AMOROZO, 2004; VANDEBROEK et al., 2004).

A eficácia dos fitoterápicos está geralmente influenciada por vários

fatores, incluindo diferenças genéticas, condições ambientais, tais como

temperatura, exposição ao sol, disponibilidade hidrica, variação nutricional e

presença de microorganismos, que afetam os processos celulares nas plantas

e as suas respostas a estímulos (GUO et al., 2008; LI et al., 2012).A

variabilidade de compostos químicos entre as populações também tem sido

atribuída a efeitos abióticos do meio ambiente, tais como a salinidade

(BOURGOU et al., 2010;TAARIT et al., 2011) e umidade (BETTAIEB et al.,

2011) além dos anteriormente citados. Neste sentido, as composições dos

compostos ativos e as potências terapêuticas das plantas são alterados,

portanto, torna-se essencial diferenciar os locais de cultivo e as condições das

ervas para entender suas propriedades e otimizar seus usos (LEE et al., 2013).


O número de estudos sobre plantas com propriedades medicinais na

região semiárida do Nordeste brasileiro tem crescido progressivamente. No

entanto, a maioria destes são descritivos, se concentrando em apenas listar

plantas, bem como suas indicações terapêuticas, as partes utilizadas e seu

modo de uso (SILVA eANDRADE, 2002;MOREIRA et al.,

2002;ALBUQUERQUE eANDRADE, 2002;ALMEIDA et al., 2006).

O uso de plantas medicinais da Caatinga está geralmente associado à

remoção de partes destas e sua utilização como remédio. Algumas espécies

são altamente exploradas devido à extensa colheita para abastecer o setor

farmacêutico (ALBUQUERQUE eANDRADE, 2002). Numerosas espécies de

árvores do semiárido brasileirotêm sua casca retirada e usada para fins

medicinais, sendo esta uma prática extremamente comum na região. Contudo,

muitas destas árvores crescem lentamente, e em alguns casos as práticas de

coleta destrutiva podem reduzir o tamanho de uma população aumentando a

probabilidade de sua extinção local (MONTEIROet al., 2006). Muitas destas

espécies têm outras utilizações não farmacêuticas, especialmente como

madeira (ALBUQUERQUE et al., 2005; MONTEIRO et al., 2006). Desse modo,

a sustentabilidade da colheita de plantas medicinais depende de uma série de

fatores que operam em diferentes níveis. Logo as ameaças às populações de

plantas locais podem surgir a partir de outras atividades de uso das mesmas

(BOTHA et al., 2004).

A utilização e manejo de plantas é uma prática cotidiana em muitas

comunidades do Brasil que residem próximos a fragmentos de matas ou

reservas florestais. O uso frequente de recursos vegetais indica que estas

populações têm um amplo conhecimento a cerca das espécies nativas. A

importância desta informação para melhoria de vida cotidiana das populações

rurais, bem como o uso sustentável desses recursos vegetais tem sido

frequentemente apontada para a tomada de decisões sobre preservação

(CAMPOS eEHRINGHAUS, 2003; ALBUQUERQUE, 2004; MONTEIROet al.,

2006).

O problema relacionado à diminuição da biodiversidade envolve um

conjunto de alterações, como reduções da heterogeneidade biológica em uma

determinada região, por exemplo. Para se reverter o problema, é necessária

uma melhor compreensão das relações entre a biodiversidade local e o


ecossistema. Logo, as ligações entre a diversidade total de espécies

quimicamente úteis em determinada área esua disponibilidadepara as

populações locais devem ser examinadas, para que tais recursos sejam

preservados (ALBUQUERQUE eOLIVEIRA, 2007).

2.4 Família Sapotaceae

A família Sapotaceae possui distribuição tropical e subtropical, incluindo

cerca de 60 gêneros contendo 1.343 espécies de hábito arbóreo e arbustivo.

No Brasil ocorrem 14 gêneros e cerca de 200 espécies, com destaque para

Chrysophyllum, Manilkara, Micropholis, Pouteria, Pradosia e Sideroxylon

(ALMEIDA-JÚNIOR, 2010; THE-PLANT-LIST, 2013).

As plantas pertencentes à família Sapotaceae são lenhosas, arbustivas

ou arbóreas, com folhas alternas, raramente opostas ou verticiladas (Pradosia),

simples, geralmente sem estípulas e com margem geralmente inteira. A

Inflorescência é cimosa, frequentemente em panículas ou reduzidas a

fascículos axilares; as flores são pouco vistosas, unissexuadas ou

bissexuadas, actinomorfas, com estipes geralmente em número igual ou duplo

ao das pétalas (SOUZA e LORENZI, 2005).

Quimicamente, as espécies desta família são caracterizadas por

apresentarem uma variedade de classes de substâncias, sendo os compostos

mais conhecidos as saponinas, flavonoides, polifenois, triterpenos e

politerpenos, naftol, benzoquinonas, carotenoides, esteroides, ácidos graxos,

taninos e óleos essenciais, com diversas atividades biológicas, dentre elas,

antiulcerogênica, antimicrobiana e antiviral (BERROUGUI et al., 2004;

KUSHIMA, 2005; STEVENS, 2005, MONTENEGRO et al., 2006; BARBOSA-

FILHO et al., 2008).

2.4.1 Gênero Manilkara

O gênero Manilkara é constituído por cerca de 35 espécies de hábitos

arbóreos e arbustivos,sendo 19 destas espécies encontradas no Brasil, das


quais, 12 estão presentes na região Nordeste, sendo a Bahia o estado mais

diverso (GOMES et al., 2010).

No Brasil, os estudos floristicos que contemplaram a família Sapotaceae

compreendem áreas pontuais e restritas de diferentes regiões do país. Ducke

(1950) listou oito espécies amazônicas, três com ocorrência no Nordeste e três

no Sudeste; segundo o autor, as espécies de Manilkara ocorrentes na floresta

Amazônica, popularmente conhecidas como maçaranduba, maçaranduba-

vermelha, maçaranduba verdadeira ou maparajuba (CORRÊA, 1978), tem

importância não só pelo número, mas também pelo valor dos seus produtos

(madeira e látex).Ducke (1957) revisou a listagem e reconheceu 16 espécies

de Manilkara para o território nacional.

No Nordeste, algumas listagens florísticas contemplaram a ocorrência de

espécies de Manilkara, com destaque para os estudos desenvolvidos por Sales

et al. (1998), que apresentaram um checklist da flora ameaçada dos brejos de

altitude em Pernambuco; Barbosa et al. (2006) que também produziram

umchecklist das plantas do Nordeste brasileiro; e Amorim et al. (2008) que

inventariaram a flora da Reserva Biologica de Una, Bahia. Na região Norte,

Ribeiro et al. (1999) e Pennington (2006) registraram as espécies de Manilkara

ocorrentes na Reserva Ducke.

Apesar da representatividade das espécies de Manilkara nos diferentes

biomas (Amazônico, Atlântico, Caatinga e Cerrado), a floresta Atlântica possui

a maior diversidade do gênero quando se considera apenas a região Nordeste

do país (CALVENTE et al., 2005).

Aplicações no tratamento de algumas enfermidades como,inflamação,

dores no estômago e cicatrização de feridas, foram encontradas para algumas

espécies do gênero Manilkara,que têm sido utilizadas popularmente como

plantas medicinais. Estudos já realizados com espécies deste gênero

mostraram diversas propriedades invitro (FERNANDES, 2011).Em seu trabalho

Chanda e Parekh (2012) mostraram que extratos de Manilkarahexandra

possuem atividade antibacteriana contra diversas espécies de interesse

clínico,enfatizando assim a importância biotecnológica do gênero.

Um ensaio de atividade antibacteriana in vitro contra 14 importantes

bactérias patogênicas a humanos foi realizado com extrato aquoso das folhas

deManilkara zapota, e revelou uma maior atividade inibitória contra


Staphylococcus aureus, Citrobacter sp., e Proteusmirabilis. (SATISH et al.,

2008).Vários estudos já desenvolvidos com esta espécie mostraram que alguns

tecidos da mesma apresentam propriedades biológicas diversas. As folhas e

casca são utilizadas para tratar a tosse, resfriado, disenteria e diarreia. As

atividades antimicrobianas e antioxidantes são também relatadas a partir de

suas folhas (NAIR e CHANDA, 2008; KANERIA et. al., 2009).

Os resultados do estudo desenvolvido por Osman et al. (2011)

demonstraram claramente a atividade anti-cancerígena (carcinoma ascítico de

Ehrlich)invivode extratos preparados com a casca e o caule de Manilkara

zapota. Neste estudo eles obtiveram um prolongamento do tempo de vida dos

animais avaliados, alem de uma diminuição na contagem de glóbulos brancos

do sangue. Estes dois fatores são os critérios confiáveis para avaliar uma

droga anticâncer segundo os autores.

A casca da M. zapota também é utilizada tradicionalmente para o

tratamento da febre e dor. O extrato etanólico preparado com a casca desta

espécie mostrou uma inibição significativa em ensaios de edema da pata com

ratos, induzido por injeção da carragenina. A atividade anti-inflamatória,

observada pode ser devido a um efeito inibidor do extrato sobre a liberação de

histamina e/ou serotonina (GANGULY et al., 2013).

Ganguly et al. (2013) segerem que a presença de flavonóides,

saponinas, taninos e glicosídeos no extrato bruto das folhas de M. zapota,

sugerindo quea presença destes compostos pode ser responsável por sua

atividade anti-inflamatória. Outros estudos também atribuem à atividade anti-

inflamatória encontradas em extratos de plantas, a presença de fitoconstituintes

como terpenóides eesteroides, alémdeoutros já citados (MULLA et al., 2010;

ADJENE et al., 2012).

M.rufula (Miq.) é uma árvore que mede de 5 a 10 metros de altura (figura

3-A); com ramo acinzentado, indumento tomentoso a puberulento, ferrugíneo a

esbranquiçado. Suas folhas (figura 3-B)são alternas, distribuídas ao longo do

ramo, raras no ápice do mesmo. O fruto (figura 3-C)apresenta-se oblongo-

elipsóide, glabro, vermelho, alaranjado ou marrom. A M. rufula compartilha

caracteres com M. dardanoi, diferindo por apresentar inflorescência de 5 a 8

flores, enquanto M. dardanoi possui flor solitária (LAM, 1941).


M.rufula floresce entre os meses de outubro e janeiro, com maior

intensidade de floração registrada em outubro; frutifica entre janeiro e maio,

com pico de frutificação no mês de março (LAM, 1941). Está distribuída na

região Nordeste (Alagoas, Bahia, Ceará, Pernambuco, Piauí e Sergipe), em

áreas de caatinga, cerrado e na transição caatinga-cerrado. Apresenta

ocorrência na Paraíba e Rio Grande do Norte, além do registro na divisa entre

os estados de Tocantins e Bahia em vegetação de cerrado (LAM, 1941).

O último estudo relacionado à presença dessa espécie mostrou que M.

rufula apresentava-se na categoria de baixo risco de extinção (IUCN, 2001),

mas problemas com a destruição acelerada e perda das áreas de Caatinga e

Cerrado, podem em um futuramente levar a mesma a ser incluída entre as

espécies ameaçadas de extinção. Logo, faz-se necessária a tomada de

medidas e projetos para conservação das populações de M. rufula para

manutenção desses espécimes in situ.


Figura 3: Arvore (A), folhas (B) e frutos (C) de Manilkara rufula (ARCOVERDE, 2015).

2.5Compostos Bioativos

O metabolismo da planta é frequentemente dividido em duas classes

principais: a) metabolismo primário, considerado aquele que permite uma

planta utilizar água, dióxido de carbono e sais minerais para sintetizar os

metabolitos primários essenciais (açúcares, ácidos graxos, aminoácidos e

ácidos nucleicos), necessários para produzir e manter as células,estes

compostos têm uma origem muito antiga e como tal, os genes requeridos para

A

B

C

C


a sua síntese são largamente conservados entre todas as plantas conhecidas;

b) metabolitos secundários (também referidos como os produtos naturais, ou

metabolitos especializados fitoquímicos), considerados como sendo os

produtos químicos necessários para as interações de plantas com o meio

ambiente (p.ex., compostos de defesa contra pragas e agentes patogênicos)

(HURTADO-FERNÁNDEZ et al., 2011; KLIEBENSTEIN eOSBOURN, 2012).

O nível de diversidade química de uma população vegetal pode ser

associadoà intensidade com que a planta é estimulada a produzir novos

compostos. Por exemplo, o ataque de patógenos pode estimular a produção de

metabólitos como mecanismo autodefesa(BRAVO‑MONZÓN et al.,

2014).Segue-se que a capacidade de evoluir e desenvolver novas vias

metabólicas seja benéfica para adaptação a novos nichos ambientais, um

aspecto essencial de especiação da planta. Isso levanta questões importantes

sobre os mecanismos subjacentes à evoluçãometabólica em plantas

(YONEKURA-SAKAKIBARA e SAITO, 2009; GOODSTEIN et al., 2012).

A composição dos metabólitos individuais e as suas concentrações não

são constantes, mas diferem de órgão para órgão, dentro do ciclo de

desenvolvimento de uma planta e, além disso, inter e intra populações. Essa

variação leva a formação de misturas complexas de metabólitos secundários, o

que é, provavelmente, uma estratégia desenvolvida pelos vegetais contra a

seleção de herbívoros ou patógenos especializados (WINK, 2008).

2.5.1 Metabólitos Primários

Os principais compostos produzidos pelas plantas são chamados

metabólitos primários e se encontram em todas as células vegetais (PUENTES,

2009). Estes têm sido amplamente estudados na busca por novos fármacos

e/ou por moléculas de interesse biotecnológico.

Estresses bióticos e abióticos podem influenciar o metabolismo primário

das plantas, afetando a produção de alguns metabólitos importantes como

carboidratos, por exemplo (LAWO et al., 2011; SCHOEDL et al., 2013). Para os

metabólitos primários, observou-se que o estresse hídrico leva a um aumento

de mio-inositol e sacarose em algumas plantas, o que pode refletir seus

respectivos papéis como osmoprotetores (GRIMPLET et al., 2009). Também foi


observado um aumento significativo de prolina em folhas de videira (DOUPIS et

al., 2011) e bagas (DELUC et al., 2009), sob condições de déficit hídrico,

assumindo que este aminoácido possa participar da proteção contra a

formação de espécies reativas de oxigênio em excesso nos vegetais. Os

metabólitos primários estão intimamente relacionados com o fenótipo de um

organismo, podendo inclusive fornecer características nutricionais importantes

ao mesmo (HOEKENGA, 2008).

Sabe-se que as plantas se protegem contra organismos patogênicos por

diversas respostas de defesa, que incluem a produção de peptídeos

antimicrobianos a partir do seu metabolismo primário. Alguns destes produtos,

tais como lectinas (LEI-LEI et al., 2011)e inibidores de proteases (LINGARAJU

e GOWDA, 2008), são importantes componentes do sistema protetordos

vegetais, podendo haver variações entre espécies quanto a sua produção

(HOSSAIN et al., 2012).

2.5.1.1 Lectinas

As lectinas foram relatadas pela primeira vez em 1888, por Stillmark.Ao

estudar a toxicidadede extratos deRicinuscommunis (mamona), ele observou a

capacidade em aglutinar eritrócitos, devido à presença da “ricina”,proteína

extraída desta planta (KENNEDY et al., 1995). Algum tempo depois, outra

proteína com capacidade hemaglutinante, chamada “abrina”, foi encontrada em

sementes deAbrusprecatorius (Jequiriti). Mesmo com estas descobertas, o

estudo sobre lectinas só começou a ganhar força em 1960, abrindo uma ampla

área de aplicação para estas proteínas (GABOR et al., 2004).

O termo lectina (do latim lectus, que significa escolher) refere-se à

destreza dessas proteínas em ligarem-se específica e reversivelmente a

carboidratos (HE et al., 2013). As lectinas contêm pelo menos um domínio não

catalítico que lhes permite reconhecer e ligar-se seletiva e reversivelmente a

açúcares livres ou glicanos específicos, presentes em glicoproteínas e

glicolipidios, sem alterar a estrutura dos mesmos (LEI-LEI et al., 2011).

As lectinas interagem com carboidratos livres ou glicoconjugados

através de um sítio de ligação específico e por ligações não covalentes. A

diversidade estrutural das lectinas e a elevada especificidade de ligação


permitem a estas várias aplicações biotecnológicas, tais como reconhecimento

de células e glicoproteínas (SOUZA, 2011) e monitoramento dos carboidratos

na superfície celular (FAIS et al., 2009). Os procedimentos de isolamento e

caracterização para estas proteínas geralmente envolvem rastreio pela sua

capacidade de aglutinar células e precipitar glicoconjugadose o isolamento em

colunas de afinidade com ligantes específicos (VILLANUEVA, 2002). As

lectinas, quando imobilizados em suportes inertes, podem atuar como matrizes

de afinidade para isolamento de outras moléculas (PAIVA et al., 2003; SILVA et

al., 2011).

Lectinas podem ser encontradas em animais (ALPUCHE et al.,

2005;YANG et al., 2007), micro-organismos (BHOWAL et al.,2005;KHAN et al.,

2007), e plantas,nestas elas são isoladas principalmente a partir de sementes,

mas a sua ocorrência em outros tecidos vegetais, como folhas (COELHO

eSILVA, 2000), rizomas (KAUR et al., 2005), tubérculos (KAUR et al., 2006),

casca (SÁ et al., 2009a), cerne (SÁ et al., 2008) e raízes (WONG eNG,

2006),também foi relatada.

As Lectinas vegetais estão distribuídas nas seguintes famílias:

Leguminosae, Ligadoras de quitina, Ligadoras de manose de

monocotiledôneas, Cucurbitaceae, Amaranthaceae, Jacalina e RIP Tipo 2

(PEUMANS e VANDAMME et al., 1998).

A maioria das lectinas de origem vegetal apresenta especificidade por

carboidratos simples (monossacarídeos) ou complexos (oligossacarídeos e

glicanas), os quais podem ser de origem vegetal ou não, como N-

acetilglicosamina e ácidos N-glucurônico, galacturônico, xilurônico, L-idurônico,

siálico e N-acetilmurâmico (VANDAMME et al., 2008).

Lectinas ligadoras de quitina têm sido estudadas do ponto de vista

estrutural. As mais conhecidas são aquelas pertencentes à família das

heveínas, assim chamadas por possuírem em comum o dominío heveínico

como motivo estrutural de reconhecimento da quitina. Sendo especialmente

rica em resíduos de glicina e cisteína, a estrutura da haveína é mantida por

quatro pontes dissulfeto, o que lhe confere uma notável estabilidade,

característica que se estende às demais lectinas da família das heveínas.

Mesmo depois de aquecida a 90ºC por 10 minutos, a heveína ainda inibe o

crescimento de fungos (NEUMANN et al., 2004).


Lectinas tem uma importante participação nos processos fisiológicos das

plantas. Segundo Charungchitrak et al., (2011) o papel das lectinas no sistema

de defesas das plantas pode ter evoluído a partir da capacidade destas

moléculas em aglutinar e imobilizar micro-organismos. As evidências para este

papel são: a presença de lectinas em locais com potencial de invasão por

agentes infecciosos, como sementes, e a ligação dessasproteínas a vários

microrganismos e sua capacidade de inibir o crescimento destes.

As lectinas, por terem a habilidade de se ligar especificamente a

carboidratos, apresentam uma variedade de efeitos biológicos, alguns dos

quais servindo como base para a aplicação das mesmas na investigação de

atividades químicas e biotecnológicas. Estas proteínas têm sido sugeridas

como compostos naturais para controle de insetos e fungos.Souza et al.

(2011), isolaram lectina de raízes secundárias de B. monandra edemonstraram

que essa proteína possui atividade antifúngica e termiticida, ratificando o

potencial biotecnológico de lectinas para aplicações no controle de pragas

agrícolas.

A toxicidade das lectinas tem sido estudada com o objetivo de garantir

segurança ao meio ambiente e a saúde humana. Vaz et al. (2010) avaliaram

aLectina com atividade antifúngica obtida da casca de Sebstiania jacobinensis,

aqual não apresentou efeito deletério sobre náuplias de Artemia salina e

embriões de Biomphalaria glabrata, o que indica a baixa toxicidade dessas

proteínas.

Lam e Ng (2011) realizaram uma extensa revisão bibliográfica e

concluíram Lectinas podem ser expressas com sucesso heterologamente para

uma produção em larga escala. Podendo serem aplicadas em uma variedade

de culturas para uso como estratégias de manejo integrado de pragas;

provando que o uso dessas proteínas pode reduzir a carga de pesticidas

químicos atualmente usados.

Lei-Lei et al. (2011) relatam que lectinas de leguminosas são bem

conhecidas por possuirem deversas funções biológicas tais como anti-tumoral,

antiviral e anti-fúngicas.

O crescimento de fungos é considerado um fator importante na

biodeterioração de diversos materiais, como grãos armazenados, madeira,

pinturas, esculturas, couro e óleo (STERFLINGER, 2010). Espécies de


Fusarium podem causar várias doenças no trigo (WAGACHA eMUTHOMI,

2007), tomate (AGRIOS, 2005), amendoim (ROJO et al., 2007), e de outras

culturas. Efeito antifúngico sobre Fusarium foi relatado a partir de lectinas

isoladas de raízes de Astragalusmongholicus (YAN et al., 2005), cerne em

Myracrodruonurundeuva (SÁ et al., 2009b), e cascade Sebastianiajacobinensis

(VAZ et al., 2010) e raízes de B. monandra (SOUZA et al., 2011).Lei-Lei et al.

(2011) também afirmam quelectinas de leguminosas são bem conhecidas por

possuirem deversas funções biológicas tais como anti-tumoral, antiviral e

antimicrobiana.

2.5.1.1.2 Inibidores de tripisina

Os inibidores de protease estão amplamente distribuídos na natureza,

podendo ser encontrados em diversas espécies vegetais, variando

desdepequenas moléculas até peptídeos e proteínas de alto peso molecular

(IBRAHIM e PATTABHI, 2005).Geralmente são proteínas que interagem

específica e reversivelmente com enzimas proteolíticas, podendo promovendo

sua inibição por meio da competição com o substrato pelo sítio ativo da enzima

(LASKOWSKI-Jr. e QASIM, 2000; LINGARAJU e GOWDA, 2008). Desta forma,

essas proteínas são classificadas de acordo com a sua especificidade de

interação e podem afetar a atividade de serinoproteinases, cisteínoproteinases,

proteinases aspárticas e metaloproteinases (TREMACOLDI e PASCHOLATI,

2004).

Diversas atividades biológicas têm sido relatadas envolvendo inibidores

de protease, por exemplo, como agentes farmacológicos no combate a

nematóides (SAMAC e SMIGOCKI, 2003),na agriculturacontra insetos

causadores de pragas (TELANG et al., 2003), para avaliação da lipodistrofia

associada ao HIV em humanos (DIEHL et al., 2008), também quanto a sua

ação inseticida e antimicrobiana (MARINHO et al., 2008).

Essa duas classes de proteínas vegetais, lectinas e inibidores de

proteases, têm sido investigadas pelas suas aplicações em diversos processos

biológicos e em futuro próximo essas podem vir a se tornar importantes

ferramentas biotecnológicas.


2.5.2 Metabolitos Secundários

Metabólitos secundários, também referidos como compostos naturais,

são os produtos oriundos do metabolismo celular, não sendo essenciais para o

crescimento normal, desenvolvimento ou a reprodução de um organismo,

sendo utilizados para satisfazer as exigências secundárias do mesmo, por

exemplo, na competição para sobrevivência interespécies, fornecendo

mecanismos de defesa (VAISHNAV e DEMAIN, 2011).

Plantas, bactérias, fungos e organismos marinhos, como esponjas,

tunicados e corais são fontes bem conhecidas de metabólitos secundários.

Muitos destes compostos provaram valor inestimável como agentes

antibacterianos ou antifúngicos, drogas anticâncer, agentes de redução de

colesterol, imunossupressores, antiparasitários, herbicidas e ferramentas para

diagnósticos e pesquisa (VAISHNAV e DEMAIN, 2011).

Os metabólitos secundários foram considerados durante muito tempo,

produtos de excreção do vegetal, sem função definida sendo apenas produtos

uriundos do metabolismo celular (SANTOS, 2004; ALMEIDA-CORTEZ, 2005).

De acordo com Macel e Klinkhamer (2010), os metabolitos secundários de

plantaspodem variar dentro e entre as populações,podendopermitir que os

indivíduos sejam agrupados em função da proporção relativa de cada

composto que se é encontrado. A variabilidade química destes metabólitos

desempenha um importante papel, por exemplo, nas relações planta-inseto,

determinando a fragilidade da planta ou resistência da mesma a predadores.

A coevolução entre plantas, insetos, microrganismos e mamíferos

conduz à síntese desses metabólitos como forma de defesa ou atração.

Estima-se que o número desses compostos ultrapasse 400 mil, sendo em sua

maioria nitrogenados, terpenóides e fenólicos, podendo ser encontrados em

várias partes da planta e suas concentrações variando com a idade (LARA,

1991;SIMAS et al., 2004).

Nas plantas, os metabólitos secundários têm um papel importante no

processo de adaptação ao seu ambiente, contribuindo para que as mesmas

possam ter uma boa interação com os diferentes ecossistemas. Os produtos

secundários também aumentam a expectativa de sobrevivência de uma dada

espécie, por estarem envolvidos em diversas atividades biológicas com este


fim, atuando, por exemplo, como antimicrobiano, protegendo a planta de

patógenos, podendo apresentar ainda atividades antigerminativas ou tóxicas

para outros vegetais como as fitoalexinas (FUMAGALI et al., 2008).

A produção de metabólitos deve estar relacionada, ao menos

parcialmente, com a imobilidade das plantas, em vista de não poderem escapar

das pressões ambientais pelo movimento, restando suas defesas estruturais e

a produção e/ou acumulação de substâncias químicas (ALMEIDA-CORTEZ,

2005). Esta relação de metabolitos secundários com o ambiente biótico

transmite uma pressão evolutiva sobre plantas para criar novos compostos e

como tal, a maioria dos metabolitos secundários são de linhagem específica

(KLIEBENSTEIN e OSBOURN, 2012).

A importância ecológica do metabolismo secundário é ilustrada pela

observação de que mutantes vegetais que lhes faltam alguns metabólitos

específicos comumente não conseguem sobreviver no ambiente, de forma que

esses genótipos seriam rapidamente extintos em competição com plantas do

tipo selvagem (ZUEST et al., 2011). Assim, metabólitos secundários são

passíveis de serem tão essenciais para o sucesso de uma planta no ambiente

natural quanto um metabolito primário (KLIEBENSTEIN eOSBOURN, 2012).

Acredita-se que estruturas celulares reforcem a síntese de metabólitos

secundários para se protegerem contra efeitos oxidativos sob condições

estressantes. Dentre estes compostos incluem-se algumas vitaminas,

terpenóides, carotenóides, óleos essenciais e compostos fenólicos, que são

importantes em plantas para o seu desenvolvimento, crescimento normal e

defesa contra infecções (MAZID et al., 2011).

Em muitas plantas, esses metabólitos podem reduzir a disponibilidade

de proteínas para herbívoros. Estes compostos se ligam às proteínas e inibem

a sua digestão. Insetos que se alimentam de plantas ricas em taninos podem

reduzir os efeitos inibitórios deste, pela produção de surfactantes que se

assemelham a detergentes, em seus fluidos intestinais (SIMAS et al., 2004).

Estudos mostram que a presença desses metabólitos pode conferir resistência

a planta frente a alguns predadores, por exemplo, os alcaloides pirrolizidina em

Seneciojacobaea e a traça especializada Tyriajacobaeae (MACEL e

KLINKHAMER, 2010); alguns glucosinolatos em Brassicaoleracea e larvas dos

herbívoros Pierisrapae e Mamestrabrassicae (POELMAN et al., 2009.);


glicosídeos fenólicos em Populustremuloides e larvas da mariposa

Lymantriadispar (DONALDSON e LINDROTH, 2007); terpenoides em

Perseaamericana e aTriozapsyllid formadores de galhas (TORRES-GURROLA

et al., 2011).

A avaliação da variabilidade de metabólitos químicos é importante para o

entendimento das interações da planta com o ambiente, principalmente na

compreensão da estrutura química em nível de população, o que pode facilitar

a busca por agentes biologicamente ativos, concentrando-se em áreas

selecionadas, em vez de toda a distribuição de espécies (BRAVO‑MONZÓN et

al., 2014).

Devido às inúmeras atividades biológicas dos metabólitos secundários

de plantas, estes vêm sendo utilizados há séculos na medicina popular e nos

dias atuais, como medicamentos, cosméticos, matéria-prima para a química

fina e outros fins diversos (BIAVATTI et al., 2007; SAÚDE-GUIMARÃES e

FARIA, 2007; BARBOSA-FILHO et al., 2008). As plantas podem apresentar

importante atividade antioxidante devido a produção de compostos

polifenólicos. Os flavonoides e terpenóides, principalmente, apresentam-se

como corantes e pigmentos de plantas, funcionando também como

antioxidantes potentes (HOSSAIN et. al. 2012).

A riqueza em metabólitos secundários garante vantagens às plantas

para a sua sobrevivência (SANTOS, 2004). Estes metabólitos podem ser

classificados quanto à sua estrutura química: nitrogenados (alcalóides,

aminoácidos não-protéicos e glicosídeos cianogênicos), terpenóides

(triterpenos, saponinas e glicosídeos cardioativos) e fenólicos (ligninas,

flavonóides e taninos) (SANTOS, 2004; CARVALHO et al., 2004).

2.5.2.1 Classificação

2.5.2.1.1 Compostos Fenólicos

Os compostos fenólicos são um grupo diverso de substâncias, podendo

ser constituídas por moléculas simples de baixo peso molecular até moléculas

altamente complexas de peso molecular elevado. Devido a grande diversidade

em sua estrutura, eles possuem diferentes propriedades, tais como solubilidade


e polaridade que lhes permite ter diferentes interações com outras moléculas

(JAKOBEK, 2015).

Compostos fenólicos podem interagir uns com os outros e com outras

moléculas que os rodeiam. Moléculas maiores têm um maior número de grupos

hidroxila, o que as torna mais susceptíveis a um grande número de interações

com outros compostos. Mesmo aqueles com uma estrutura mais simples estão

frequentemente associados com unidades de açúcar, que por sua vez

aumentam o número de grupos hidroxila da molécula, elevando a capacidade

de interação da mesma(JAKOBEK, 2015).

Shishikura et al. (2006) estudaram o processo de emulsificação in vitro e

a influência de polifenóis no mesmo. Um modelo de emulsão de azeite,

fosfatidilcolina e sais biliares foi criado para simular pequenas condições

intestinais. Verificou-se que os polifenóis do chá verde e preto afetaram as

emulsões, aumentando o tamanho das gotas e diminuindo a área superficial

específica. Os altores sugeriram que as interações entre os polifenóis do chá e

fosfatidilcolina foram razões para tal acontecimento.

Estes com estes compostos revelaram que os mesmos possuem

algumas atividades biológicas importantes, como por exemplo, propriedades

anticancerígenas (BELLION et al., 2010) e prevenção contra doenças

cardiovasculares (HOLLMAN et al., 2011).

2.5.2.1.1.1Fenóis

Os fenóis, simples e ácidos fenólicos,constituem um grupo de

compostos fitoquímicos bastante diversificado, oriundos do metabolismo

secundário das plantas (DEY eKUHAD,2014).Galotaninos (taninos

hidrolisáveis) e proantocianidinos (taninos condensados) são compostos que

contem várias unidades básicas de polifenóis interligados numa estrutura maior

e mais complexa (CROZIER et al., 2009; LANDETE, 2011). Por outro lado, os

ácidos fenólicos são um grupo de fenóis das plantas que têm estruturas

relativamente simples, mas também podem ser ligados a unidades de açúcar.

Eles são um grande grupo de fenóis hidrofílicos (JAKOBEK, 2015).


Estruturalmente, o grupo dos fenóis apresenta um anel aromático com

um ou mais substituintes hidroxila; que variam desde moléculas simples a

compostos altamente polimerizados (KSOURIet al., 2009).

Ao longo das últimas décadas, estes compostos tornaram-se populares

por sua aplicação potencial na prevenção de várias doenças crônicas(onde os

mesmos agem protegendo as células por suas propriedades antioxidantes),

onde podem ser citados os problemas cardiovasculares, câncer, osteoporose,

diabetes melitus e doenças neurodegenerativas(MARTINSet al., 2011).

A capacidade antioxidante de extratos de polifenóis depende não só da

qualidade da biomassa de partida (origem geográfica, condições climáticas,

data de colheita e das condições de armazenamento), mas também dos

processos tecnológicos envolvidos na sua produção (NKHILI et al.,

2009).Diferentes estratégias de extração (líquido-líquido/sólido-líquido)

utilizando solventes convencionais têm sido empregadas para a obtenção de

compostos fenólicos oriundosde vegetais, como por exemplo, a extração em

Soxhlet, maceração, extração assistida por microondas, extração por alta

pressão hidrostática e extração com fluido supercrítico (IGNAT et al., 2011).

De acordo com Ksouriet al.(2009) os compostos fenólicos agemcomo

mediadores em reações oxidativas, podendo portanto ser usados na

prevençãodo envelhecimento precoce, além de outras doenças associadas a

ação de radicais livres.Segundo Jaramillo et al. (2010), legumes e frutas são

boas fontes destes fenóis. Por este motivo acredita-se que a ingestão de frutas

e vegetais frescos esteja relacionada com a redução de doenças

cardiovasculares e câncer.

Experimentos com modelos animais têm demonstrado que polifenóis do

chá verde reduziram os danos oxidativos causados por radicais aniônicos

superóxido e aumentaram a expectativa de vida no organismo modelo

Caenorhabditiselegans. Ainda, estes polifenóis também se mostraram capazes

de reduzir a formação de oligômeros ß-amiloide envolvidos na doença de

Alzheimer(ABBAS e WINK, 2009).

Os produtos da oxidação de fenóis recebem o nome de quinonas, sendo

as antraquinonas as mais conhecidas, devido a seu alto número presente na

natureza. As antraquinonas possuem um papel na defesa das plantas,

apresentando toxicidade para diversos insetos herbívoros, proteção contra o


ataque de fungos e alelopatia, onde a planta libera substâncias no ambiente,as

quais são capazes de inibir o crescimento de espécies competidoras

(FALKENBERG, 2003).

Cumarinas também são constituintes fenólicos derivados do

metabolismo da fenilalanina e estão amplamente distribuídas nos vegetais,

podendo ser encontradas em todas as partes de uma planta (KUSTER e

ROCHA, 2003).

2.5.2.1.1.2Flavonóides

Flavonóides constituem uma classe de numerosos compostos

quimicamente diversos que ocorrem em muitas frutas, legumes e especiarias

(CARLSEN et al., 2010). Estudos sobre estes compostos vêm sendo realizados

há muito tempo e suas propriedades quimiopreventivas estão bem

estabelecidas e documentadas na literatura (KNASMÜLLER et al.,2009). São

eles, dentre outras coisas, os responsáveis pela cor, sabor e aroma de frutas e

flores, desempenhando assim o importante papel de atraentes ou repelentes

de insetos e herbívoros (WOJAKOWSKA et al., 2013).

Flavonóides e seus derivados constituem um expressivo grupo,

diferenciado, de metabólitos secundários em plantas. Estes compostos

desempenham importantes papeis fisiológicos e bioquímicos, em muitos

processos celulares (ANDERSEN eMARKHAM, 2006). Representam um dos

maiores grupos de compostos fenólicos, podendo ser classificados em várias

subcategorias como antocianidinas, flavonóis, flavonol (catequinas e

proantocianidinas), flavanonas, flavonas e isoflavonas (CROZIER et al., 2009).

Os flavonoides possuem uma estrutura básica semelhante, consistindo

de dois grupos fenil ligados entre si por uma ponte com três carbonos

comumente ciclizados com oxigênio. São diferenciados de acordo com o grau

de insaturação e oxidação do segmento de três carbonos. Além disso, várias

moléculas de açúcar podem ser ligadas à estrutura dos flavonoides, sobre os

seus grupos hidroxila, que tornam o arranjo destas moléculas mais complexo

(figura 4). Geralmente eles são encontrados em formas glicosídicas eessa

glicosilação os torna mais solúveis em água (JAKOBEK, 2015).


Figura 4: Estrutura química geral dos flavonoides e suas diferentes classes. FONTE: (RAVISHANKAR et al., 2013).

Os flavonóides, bem como outros compostos fenólicos, apresentam

importantes funções nas plantas (ARAÚJO et al., 2008), inclusive em

taxonomia, utilizados especialmente para distinguir espécies estreitamente

relacionadas (JUDD et al., 2007).

Flavonóides podem afetar também as funções das células ligadas a

processos inflamatórios no corpo humano, agindo sobre as enzimas e vias

envolvidas neste processo, como, por exemplo, interferindo na produção de

prostaglandina E2 e Ciclooxigenases-2 (TALHOUK et al., 2007).

O interesse neste grupo de compostos é crescente, devido às suas

inúmeras funções em plantas, bem como os seus efeitos benéficos sobre a

Estrutura Geral dos Flavonoides

Flavona

Isoflavona

Flavonona

Flavonol

Flavanonol

Flavanols


saúde humana. A Identificação de metabólitos derivados fenólicos presentes

em extratos de plantas é uma tarefa importante em estudos nas muitas áreas

de pesquisas biológicas ou médicas (WOJAKOWSKA et al., 2013).Nos últimos

anos, os flavonóides e os seus análogos sintéticos têm sido intensamente

investigados no tratamento de alguns tipos de câncer (ovário, mama, cervical,

pâncreas, próstata) (LIN et al., 2009; LAZAREVIC et al., 2011).

2.5.2.1.1.3Taninos

Inicialmente os taninos foram identificados pelo seu sabor adstringente e

por sua capacidade de precipitar proteínas. Esses compostos podem ser

encontrados em muitas plantas que são utilizadas pelo homem como ervas

medicinais, na alimentação e na fabricação de bebidas. Nos vegetais, os

taninos podem ser encontrados em suas raízes, flores, frutos, folhas, cascas e

na madeira (QUEIROZ et al.,2002).

Estes compostos apresentam solubilidade em água e peso molecular

compreendido entre 500 e 3000 Dalton, possuindo a habilidade de formar

complexos om proteínas e alcalóides (MELLO e SANTOS 2001).

Existem duas classes principais de taninos: hidrolizáveis e condensados

(também conhecidos como proantocianidinas, assim denominados

provavelmente pelo fato de apresentarem pigmentos avermelhados da classe

das antocianidinas) (QUEIROZ et al., 2002; SCIONEAUX et al., 2011).

Os taninos hidrolisáveis consistem de ésteres de ácidos gálicos e seus

dímeros (ácido digálico ou hexaidroxidifênico e elágico) ligados a

monossacarídeos, principalmente a glicose, sendoos taninos elágicos bem

mais frequentes que os gálicos. Dentro dos taninos condensados, existem

vários subtipos que diferem na estereoquímica e padrão de hidroxilação dos

flavonoides, sendo denominados grupos constitutivos (SCIONEAUX et al.,

2011).

Taninos condensados são oligômeros ou polímeros de dois ou mais

flavonoides, geralmente catequinas e epicatequinas, e frequentemente as

correspondentes galocatequinas tri-hidroxiladas. Dois dos taninos condensados

mais comuns são: as procianidinas e as prodelpinidinas, cadeias lineares de

flavanol com ligações via C4-C8 (Figura5) (SCIONEAUX et al., 2011).


No entanto, as diferenças de ligações e composição de subunidades

também contribuem para a diversidade da estrutura do tanino

condensado(figura 6). Por fim, outros tipos de compostos fenólicos podem ser

conjugados com taninos oligoméricos, tais como o ácido gálico. É importante

notar que detalhes estruturais nos taninos podem influenciar diretamente seus

efeitos biológicos (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011).

Os taninos condensados perfazem, aproximadamente, a metade da

matéria seca da casca de muitas árvores. Eles constituem a segunda fonte de

polifenóis do reino vegetal, perdendo apenas para a lignina (QUEIROZ et al.,

2002). Os mesmos podem se acumular nos vacúolos, frequentemente nas

camadas epidérmicas ou subepidérmicas de folhas e frutos (McMAHON et al.,

2000).

As plantas lenhosas tendem a sintetizar taninos mais do que as

herbáceas, mas há muitas exceções. As gramíneas são desprovidas destes

compostos, e algumas famílias de plantas, que incluem membros produtores

de lenhas, não sintetizam taninos. Eles são encontrados em coníferas e

espécies caducifólias, bem como em árvores tropicais.A concentração de

taninos é uma característica altamente plástica, que varia com o genótipo da

planta, tecido, estágio de desenvolvimento e condições ambientais (McMAHON

et al., 2000; OSIER eLINDROTH, 2001).

Alguns grupos de taninos podem agir sobre o metabolismo do ácido

araquidônico desempenhando importante função no processo inflamatório

(OKUDA, 2005).Araújo et al. (2008) diz que as atividades anti-inflamatória,

analgésica e anti-úlcerogênica da casca de Myracrodruonurundeuva (aroeira),

observadas em ratos, estão relacionadas a um aumento na concentração de

compostos secundários produzidos por esta planta, especialmente taninos.

Na literatura são encontrados diversos relatos que demonstram os

efeitos benéficos, principalmente antioxidantes, de uma dieta com níveis

moderados de taninos condensados (PRIOR e GU, 2005; RASMUSSEN et al.,

2005). Devido a sua capacidade de eliminar os radicais livres, ou reduzir outros

compostos oxidados, e formar radicais semiquinonas relativamente estáveis,

estes compostos podem atuar como antioxidantes no organismo

(BARBEHENN e CONSTABEL, 2011).


Figura 5: Dímeros comuns de taninos condensados, (proantocianidinas) encontrados em plantas. Variação estrutural, devido aos tipos de ligações. FONTE: (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011).

Assim como em insetos herbívoros, os taninos também podem ser

prejudiciais para animais vertebrados. Diversos efeitos tóxicos do ácido tânico,

por exemplo, já foram relatados para diversos animais domésticos, incluindo

bovinos e suínos (MUELLER-HARVEY, 2006).

A toxicologia de taninos em herbívoros e mamíferos tem recebido pouca

atenção. A questão chave é o nível que os taninos são degradados ou

absorvidos durante a digestão, visto que as moléculas menores são as que

exercem maiores efeitos farmacológicos ou tóxicos, quando comparados aos

taninos com maior peso molecular (BARBEHENN e CONSTABEL, 2011).

Segundo Prior e Gu (2005) e Rasmussen et al. (2005) apenas taninos

condensados com um baixo grau de polimerização, tais como os dímeros, são

eficientemente absorvidos pelos herbívoros. Nos animais vertebrados, como os

humanos, acredita-se que estes compostos permanecem intactos em suas

vísceras.

Há inúmeras questões que ainda estão pendentes sobre taninos. Por

exemplo, as razões pelas quais as plantas produzem muitas estruturas

diferentes destes compostos permanecem um mistério. A questão maior é


quais são as diferenças funcionais entre as distintas estruturas de taninos em

papéis como antimicrobianos e toxinas.Apesar de várias pesquisas realizadas

sob diferentes abordagens com teores de taninos, a associação dessas

informações com o aproveitamento de plantas medicinais ainda deve ser mais

bem explorada (MONTEIRO et al., 2006; BARBEHENN e CONSTABEL, 2011).

2.5.2.1.2Terpenóides

Dentre os metabólitos produzidos pelas plantasos terpenóides aparecem

como a maior classe, com cerca de 50.000 estruturasjá identificadas

(NIOGRET et al., 2013). São bastante diversificados quimicamente, e quando

associados a outras moléculas, podem formar outros compostos secundários

(COLEY e BARONE, 2001).

Os terpenos podem alterar o ambiente abiótico local, através da

qualidade do ar e, portanto, do clima local; por exemplo, florestas de eucaliptos

australianas são conhecidas por liberarem terpenos, principalmente durante o

dia, mudando a composição iônica do ar, resultando em altas temperaturas

locais e baixa umidade local e chuvas (SUNI et al., 2008; VICKERS et al.,

2009).

Uma planta pode sintetizar vários terpenóides. As diferenças qualitativas

e quantitativas podem ser observadas em diferentes estágios do

desenvolvimento e os perfis químicos podem variar em seus diferentes tecidos

e órgãos (WINK et al., 2003; BRENES-ARGUEDAS e COLEY 2005). Essas

mudanças na proporção de terpenóides em diferentes locais são resultantes da

acumulação, transformação e/ou emissão desses compostos (NIOGRET et al.,

2013).

Terpenóides, principalmente os monoterpenos C10 e C15-sesquiterpenos,

são conhecidos por desempenhar um papel importante na biologia e ecologia

de plantas, direta ou indiretamente, e influenciar suas interações com o meio

ambiente(CHENG et al., 2007). Eles foram identificados como sendo tóxicos

podendo repelir os ataques de herbívoros (BYERS et al., 2004). Além da ação

contra herbívoros, os terpenos desempenham outras funções de grande

importância nas interações entre plantas, animais e micro-organismos. Os


terpenos também podem ser considerados como “feromônios”, aleloquímicos,

hormônios vegetais e agentes de atração polínica (TAIZ e ZEIGER, 2004).

As plantas geralmente produzem misturas complexas de terpenóides

que podem diferir significativamente entre as espécies. Para os indivíduos da

mesma espécie, estas misturas frequentemente diferemna proporção e

quantidade de cada composto químico, proporcionando fenótipos químicos

distintos (CHENG et al., 2007).

Padrões e variações fenotípicas em metabólitos secundários de plantas

têm forte importância ecológica,sendoum fator relevante para a compreensão

da história evolutiva de populações naturais (ANDREW et al., 2007).

Estes compostos são detentores de um metabolismo e bioquímica

especial, sendo responsáveis por caracterizarem cada espécie vegetal, e

funcionando como um elemento de diferenciação e especiação, que possibilita

a garantia de sobrevivência e propagação em seus ecossistemas (SANTOS,

2003).

Os triterpenóides compreendem um grupo de substâncias de origem

natural derivadas predominantemente do esqualeno, um precursor acíclico com

30 átomos de carbono. Este grande grupo de produtos naturais reúne cerca de

100 esqueletos químicos distintos. Durante o processo bioquímico de

formação dessas substâncias podem ocorrer diversas ciclizações, gerando

moléculas complexas como os triterpenos tetracíclicos e pentacíclicos (XU et

al., 2004).

Dentre as diversas atividades biológicas relatadas para triterpenos,

podemos citar os efeitos antiinflamatórios, hepatoprotetores, analgésicos,

antimicrobianos, antimicóticos, imunomodulatórios e tônicos (MUFFLER et al.,

2011).

2.5.2.1.2.1 Esteróides

Os terpenóides compõem uma grande e estruturalmente diversificada

família de compostos naturais, derivada de unidades isoprênicas. Os

compostos terpênicos podem ser classificados de acordo com a quantidade

de unidades isoprênicas em: monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15),

diterpenos (C20), sesterterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40).


Segundo Dewick (2002) os esteróides são triterpenóides modificados. A união

de duas moléculas de farnesildifosfato (C15) irá formar os triterpenos e

esteróides, elas se ligam cauda-cauda para formar o esqualeno que sofrerá

uma epoxidação catalisada por enzima gerando o esqualeno-2,3-óxido.

Os esteróides de fungos, plantas e algas podem ter um ou dois carbonos

extras ligados ao C24 da cadeia lateral em sua molécula (figura 6). Estes

metabólitos são encontrados como glicosídeos ou como álcool livre (3-OH),

esterificados a ácidos graxos, sendo constituintes das membranas dos

organismos citados anteriormente, podendo afetar a sua permeabilidade

(DEWICK, 2002; GROS, 1985).

Figura 6: Estrutura básica dos esteróides com a respectiva numeração dos seus carbonos.

2.5.2.1.3 Saponinas

Saponinas são uma das muitas classes de metabólitos secundários

encontrados em fontes naturais, particularmente abundantes em várias

espécies de plantas, mas também presentes em alguns organismos marinhos e

insetos (THAKUR et al., 2011).

Devido às suas propriedades químicas, as saponinas são capazes de

interagir com as membranas celulares e de diminuir a tensão superficial de

uma solução aquosa. Esta atividade é a razão para o nome "saponina",


derivado da palavra latina "sapo", que se refere à formação de uma espuma

estável como espuma de sabão em solução aquosa (MELZIG et al., 2001).

De acordo com o carácter químico da aglicona (conhecido como

sapogenina), elas podem ser classificadas em dois grupos com base na

natureza do seu esqueleto: um grupo de saponinas esteroidais e um grupo de

saponinas triterpenóides (HOSTETTMANN e MARSTON, 2005).

Saponinas esteroidais de plantas são principalmente os compostos

contendo 27 átomos de carbono que formam as estruturas do núcleo

espirostano (figura 7) e furostano. Na natureza, as saponinas consistem

principalmente de derivados espirostano chamadas de saponinas "reais", ou

neosaponinas, sendo raros os relatos de derivados de furostano. Alguns

autores também levam em consideração os glicosídeos de alcalóides

esteroidais e cucurbitacinas para a classificação química de saponinas

(THAKUR et al., 2011).

O amplo espectro de saponinas é resultado principalmente de um grau

variável de hidroxilação na aglicona. Grupos metila em posições epecíficas

também podem ser oxidados dando origem a outros radicais. Este arranjo

estruturalde um elemento é especialmente interessante nestes compostos, com

efeitos específicos sobre suas atividades farmacológicas (THAKUR et al.,

2011).

Figura 7: Estrutura do núcleo de espirostano. FONTE: (THAKUR et al., 2011).

As saponinas mais conhecidas são metabólitos secundários produzidos

em Magnoliophyta, abrangendo tanto dicotiledôneas quanto monocotiledôneas.


Sendo as saponinas esteroidais produzidas especialmente em algumas

famílias de monocotiledôneas, e as saponinas triterpenóides encontradas

principalmente em dicotiledôneas. Cerca de 60 famílias deste taxon produzem

este tipo de saponina, dentre elas a Sapotaceae (THAKUR et al., 2011).

Estas saponinas são compostos possuidores de diferentes propriedades

farmacológicas, como: atividade antimicrobiana, insecticida, moluscicida (ODA

et al, 2000; SPARG et al, 2004; MAZZA e GUCLU, 2007), e, recentemente,

foram avaliadas quanto à sua atividade antitumoralinvitro (ESKANDER et al.,

2013).

Existem saponinas presentes em inúmeras espécies vegetais que

apresentam toxicidade para diversos artrópodes, incluindo insetos herbívoros

(COLEY e BARONE, 2001). A toxicidade destas saponinas está associada à

capacidade desta substância em formar complexos com esteróis, dando origem

a compostos importantes que podem interferirna muda de muitos insetos, por

exemplo. Estes complexos interferem na absorção dos esteróis pelo sistema

digestivo dos animais, promovendo uma desorganização das membranas

celulares depois que entram na corrente sanguínea. Desta forma, a ação das

saponinas acaba por interferir no desenvolvimento dos insetos (GUREVITCH et

al., 2009).

Saponinas isoladas a partir de plantas mostraram, invitro,a capacidade

de inibição de crescimento celulare indução a apoptose em linhagens tumorais

(PARK et al., 2010). Sua atividade citotóxica foi descrita para uma gama destes

compostos, e novos relatos continuam a aparecer na literatura (WENG et al.,

2008; PODOLAK et al., 2010).

Um dos problemas associados com o uso destes metabólitoscomo

agentes antitumorais é a sua elevada toxicidade singular, a qual é

acompanhada de uma correlação enganosa entre dados in vitro e in vivo, este

fato complica o possível uso das saponinas como agentes citotóxicos no

cenário clínico (GAUTHIER et al., 2009).

Segundo Thakur et al. (2011) estudos desenvolvidos até o momento,

mostram que as saponinas seguramente apresentam um grande potencial

terapêutico, e com o avanço da nanotecnologia, é correto afirmar que

saponinas em forma de nanopartículas futuramente poderão mostrar diversas

aplicações biotecnológicas.


2.5.2.1.4 Compostos Nitrogenados

2.5.2.1.4.1Alcaloides

Os alcalóides, segundo Coley e Barone (2001), são os metabólitos

secundários estrutural e bioquimicamente mais diversificados. Hoje, cerca de

10.000 alcalóides já foram identificados, sendo os mais conhecidos a cocaína,

a nicotina, a morfina e a cafeína (RAVEN et al., 2001).

Alcaloides são compostos nitrogenados farmacologicamente ativos,

encontrados predominantemente nas angiospermas. Em sua grande maioria,

possuem caráter alcalino, com exceções tal como colchicina, piperina, oximas

e alguns sais quaternários como o cloridrato de larifolina (SIMÕES et al., 2004).

Alcalóides podem ser encontrados em todas as partes de um vegetal, podendo

haver acúmulo preferencial dessas substâncias em um ou mais órgãos.

Estes metabólitos se subdividem em inúmeras subclasses, de acordo

com o seu aminoácido precursor: triptofano (alcaloides indólicos e

quinolínicos), ornitina e lisina (alcaloides pirrolidínicos, tropânicos,

pirrolizidínicos, piperidínicos e quimolizidínicos), fenilalanina e tirosina

(protoalcaloide, alcaloides isoquinolínicos e benzilisoquinolínicos). Os

alcaloides pirrolizidínicos apresentam ação protetora na planta contra

predadores, sendo substâncias muito tóxicas, agindo de maneira deletéria

principalmente sobre hepatócitos (COSTA, 2008). Muitos podem atuar sobre

componentes do sistema nervoso de predadores, afetando o transporte nas

membranas, à síntese e atividade proteica. A planta contendo alcalóides pode

aumentar a quantidade deste composto, após uma agressão, como resposta

ao dano inicial provocado por herbívoros, fortalecendo dessa forma o vegetal

contra futuros ataques (TAIZ e ZEIGER, 2004; DEL-CLARO e TOREZAN-

SILINGARDI, 2012).


2.5.4 Atividdades Biológicas deMetabólitos Secundários

2.5.4.1Atividade Antioxidante

O conhecimento acerca das espécies reativas de oxigênio (EROs), um

subproduto do metabolismo normal, tem despertado grande interesse nas

últimas décadas, devido a sua participação em várias situações clínicas.EROs

podem ser produzidos em células como uma resposta a diversos fatores, como

por exemplo, tensões térmicas, agentes químicos e radiação UV e ionizante.

Dentre outras causas o estresse oxidativo pode promover danos ao DNA,

inibição das funções celulares e a peroxidação dos lipídios e proteínas.

Ademais, os EROs contribuem para o desenvolvimento do câncer, diabetes,

arteriosclerose, doenças inflamatórias, e envelhecimento (DAKAH et al., 2014).

Alguns benefícios trazidos à saúde pelas plantas são, em parte,

atribuídos aos componentes antioxidantes, incluindo vitamina C, vitamina E,

glutationa, carotenóides, ácidos fenólicos e flavonóides (XIA et al., 2012).

Os polifenóis presentes em vários vegetais são relatados como

possuidores de boas propriedades antioxidantes e protegem contra os danos

celulares causados pelos EROs. O dano ao DNA induzido pelos radicais livres

é um evento comum em todas as células vivas, sendo uma das principais

formas de agressão, podendo levar ao aparecimento de várias doenças. Nos

últimos anos, houve um crescente interesse na identificação de captadores de

radicais livres ou antioxidantes que inibissem a ação dos EROs sobre o DNA

(GIRISH et al., 2012).

Acredita-se que geralmente as plantas com maior conteúdo de

compostos fenólicos apresentam boa atividade antioxidante, pois sabe-se que

há uma correlação direta entre o teor de fenóis totais e atividade antioxidante

(BARAVALIA et al., 2009; GHOLIVAND et al., 2010). Kaneria et al. (2009),

mostraram que o extrato metanólico de M. zapota é rico em conteúdo fenólico e

mostraram ter uma boa atividade sequestradora de radicais livres DPPH.


2.5.4.2 Atividade Antimicrobiana

O aumento da resistência a múltiplas drogas em microrganismos

patogênicos associado a efeitos colaterais indesejáveis de determinados

antibióticos tem promovido um grande interesse pela busca de novos

compostos de origem vegetal com potencial antimicrobiano (KRISHNAIAH et

al., 2007; KANERIA e CHAND, 2012). Nos últimos 20 anos, tem se

intensificado o interesse por produtos naturais como fontes de novos agentes

com potencial terapêutico (CHANDA e PAREKH, 2010; TRENTIN et al., 2011).

Bactérias e fungos são agentes causadores de importantes doenças,

especialmente em pacientes imunocomprometidos. Apesar da existência de

vários antibacterianos e anti-fúngicos potentes, nas últimas décadas nota-se

um exorbitante aumento da resistência aos medicamentos convencionais

(CHANDA e PAREKH, 2010), oque tornou-se um importante problema de

saúde pública (HÜBSCH et al., 20014). O interesse em pesquisar plantas com

propriedades medicinais tem aumentado, sobretudo, com o objetivo de

identificar alternativas para superar essa resistência desenvolvida (AIYEGORO

e OKOH, 2009).

Há, no entanto, consenso entre diversos estudos, que compostos

antimicrobianos derivados de plantas apresentam uma potência inferior aos

sintéticos (VAN-VUUREN e VILJOEN, 2011).Esse fato tem impulsionado a

pesquisa no sentido de se descobrir terapias combinadas para uma maior

eficácia.Vários trabalhos já vêm investigando os resultados das interações

entre produtos antimicrobianos naturais e sintéticos (VAN-VUUREN eVILJOEN,

2006; SULIMAN et al., 2010).

Embora os antibióticos diminuam a propagação e gravidade de uma

ampla variedade de doenças infecciosas, devido ao seu uso descontrolado

destes medicamentos, as bactérias e fungos têm desenvolvido inúmeros

mecanismos para escapar dos agentes antimicrobianos (AREEJ et al., 2013).

Logo, o uso indiscriminado de antibióticos e os problemas com doenças

infecciosas emergentes tornaram inevitável à busca por novos agentes

antimicrobianos de origem vegetal (ASWATHANARAYAN e VITTAL, 2013).

Muitos compostos bioativos têm sido isolados a partir de extratos de

algas e relatados como possuidores de excelente atividade antibacteriana


(LAKSHMI, et al., 2006; OSMAN, et al., 2010) e antifúngica (ERTÜRK e TAS,

2011; STEIN et al., 2011). Suffredini et al (2004) prepararam 705 extratos

orgânicos e aquosos utilizando plantas da Floresta Amazônica e Mata

Atlântica, e observaram que muitos foram ativos contra Staphylococcus aureus,

Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Escherichiacoli.

Um estudo desenvolvido por Ramos et al. (2009) com espécies

utilizadas na medicina tradicional na região Nordeste, mostrou, in vitro, que a

maioria dos extratos de plantas dos gêneros Croton, Protium e Muntingia

calabura, apresentaram atividade contra S. aureus e B. subtilis.

Atividade antibacteriana de quatro espécies pertencentes ao gênero

Cnidoscoluspresentes na Caatinga foi avaliada por Sobrinho et al. (2012), os

resultados mostraram que cepas resistentes de S. aureus e S.

epidermidisforam sensíveis aos extratos metanólicos da casca de C.

quercifolius.

Brustein et al., (2012) em se estudo isolaram e testaram, frente a

diferentes bactérias, uma lectina (EmaL) das sementes de Eugenia

malaccensis. Os resultados mostraram que EmaL tinha uma potente atividade

antibacteriana invitro com a inibição do crescimento de algumas bactérias

patogênicas importantes. A lectina mostrou ser mais eficaz contra S. aureus e

Streptococcus sp.

Segundo Paiva et al. (2010) os tecidos vegetais contêm metabólitos

secundários e lectinas possuidores de atividade antibacteriana e antifúngica,

sendo, portanto, fontes de moléculas bioativas naturais para controlar agentes

patogénicos que causam doenças em plantas e humanos.

2.5.4.3Atividade termiticida

Cupins são pragas de insetos altamente destrutivas, que podem

danificar diversos tipos de materiais, como por exemplo a madeira de casas,

plantas e culturas agrícolas, como cana de açúcar, milho, cevada e arroz. As

colônias de cupins também causam a biodegradação da madeira, sendo estes

reconhecidos como causadores de um dos mais sérios problemas para

utilização da madeira. Sabe-se também que as térmitas podem danificar uma

variedade de outros materiais que variam desde tecidos, papel e até mesmo


aqueles não celulósicos como o amianto, betume de asfalto e folhas de metal

(BULTMAN et al., 1979).

A Natureza produziu uma grande variedade de plantas com uma

variedade de estratégias químicas defensivas. A partir da diversidade química

encontrada nas plantas, é possível se obter compostos bioativos com ação

contra diversos tipos de insetos. Pesticidas seguros, com novos mecanismos

de ação são necessárias tanto para retardar o desenvolvimento de resistência

como para ajudar a atender as regulamentações de saúde e ambientais cada

vez mais rigorosas (ANONYMO, 2000).

O uso de compostos termiticidas sintéticos vem sendo realizado há

muito tempo para tratamento do solo, bem como de culturas agrícolas diversas.

Mas atualmente existe grande interesse em se descobrir novos compostos

eficazes, que possam reduzir os danos causados por térmitas, e ao mesmo

tempo não tragam prejuízos ao meio ambientalmente e a saúde humana

(ELANGO et al., 2012). Para se evitar a poluição ambiental e problemas à

saúde, causados pelo uso de pesticidas sintéticos, frequentemente são

estudadas substâncias tóxicas aos cupins, que possam ser isoladas

naturalmente a partir de plantas (CHANG et al., 2001). Muitos extratos vegetais

e óleos essenciais (ARIHARA et al., 2004a,b; CHANG et al., 2001; CHENG et

al., 2004), podem ser as fontes alternativas destes agentes de controle para

térmitas, pois os mesmos representam fontes ricas de produtos químicos

bioativos.

Materiais lenhocelulósicos são degradados pelos térmitas, uma vez que

estes insetos produzem enzimas como as celulases e hemicelulases. As

celulases são normalmente classificadas como endoglucanases,

exoglucanases e β-glicosidases. Endoglucanases clivam as ligações de

glicosídeo aleatoriamente dentro da molécula de celulose. As exoglucanase

clivam ligações nas extremidades da cadeia de celulose e as β-glucosidases,

também conhecidas como cellobiases, catalisam a hidrólise da celobiose

(FISCHER et al., 2013).Compostos naturais anti-cupim podem apresentar

diferentes atividades contra diferentes espécies de térmitas (OSBRINK et al.,

2001) e os produtos naturais são uma fonte promissora de compostos que

exibem atividades pesticidas (IBRAHIM et al., 2004;. LAX e OSBRINK, 2003;.

ZHU et al., 2003).


3. OBJETIVOS

3.1 Geral

Realizar um screening de diversas plantas da Caatinga avaliando o seu

potencial biotecnológico, e identificar e purificar moléculas bioativas a partir de

folhas de Manilkararufula.

3.2 Específicos

3.2.1 Realizar um screening de diversas plantas da Caatinga buscando a

presença de lectinas e inibidores de tripsina;

3.2.2 Selecionar uma espécie vegetal para ser estudada;

3.2.3 Realizar um screening fitoquímico para determinação dos compostos

secundários presentes nos extratos clorofórmico, acetato de etila e metanólico

das folhas de M. rufula;

3.2.4Avaliar a atividade antioxidante dos extratos clorofórmico, acetato de etila

e metanólico das folhas de M. rufula utilizando deferentes métodos: sequestro

do radical 2,2-diphenil-2-picrilhidrazil (RSA-DPPH) e capacidade antioxidante

total utilizando o fosfomolibdenium (P-Mo);

3.2.5Determinar o conteúdo de fenois totais presentes nos extratos

clorofórmico, acetato de etila e metanólico das folhas de M. rufula;

3.2.6Efetuar estudos para determinar as melhores condições de isolamento de

lectina das folhas de M. rufula através de variações dos parâmetros de

temperatura, pH e tempo de extração, bem como presença ou ausência de

NaCl;

3.2.7Purificar uma lectina de M. rufula através de precipitação com sulfato

ecromatografia por afinidade;

3.2.8 Determinar a estabilidade da lectina frente a variações de temperatura e

pH;

3.2.9 Avaliar a atividade da lectina quanto à necessidade de íons;

3.2.10 Avaliar a atividade protetora de DNA dos extratos obtidos com

clorofórmio, acetato de etila e metanol, bem como da lectina obtidos das folhas

de M. rufula.


3.2.11Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos clorofórmico, acetato de

etila, metanólicoe da lectina obtidosdas folhas de M. rufula frentea diferentes

espécies de bactérias e fungos.

3.2.12 Avaliar a atividade anti-temitas dos extratos clorofórmico, acetato de

etila, metanólico e da lectina obtidos das folhas de M. rufula.


4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALBUQUERQUE, U. P.; MEDEIROS, P. M.; ALMEIDA, A. L.; MONTEIRO, J.

M.; LINS-NETO, E. M. F.; MELO, J. G.; SANTOS, J. P. Medicinal plants of

the Caatinga (semiarid) vegetation of NE Brazil: a quantitative

approach.Journal of Ethnopharmacology. 2007a; 114:325–354.

ABBAS, S.; WINK, M. Epigallocatechin gallate from green tea (Camellia

sinensis) increases lifespan and stress resistance in Caenorhabditis elegans.

Planta Medica. 2009; 75: 216–221.

ADJENE, J. O.; AGBONGIASEDE, M. O.; IGBIGBI, P. S. Effects of chronic

administration of aqueous Alchornea cordifolia leaf on the kidney of adult wistar

rats. Anat Journal Afr. 2012; 50-56.

AGRA, M. F.; FREITAS, P. F.; BARBOSA-FILHO, J. M. Synopsis of the plants

known as medicinal and poisonous in Northeast of Brazil. Brazilian Journal of

Pharmacognosy. 2007; 17:114–140.

AGRA, M. F.; SILVA, N. K.; BASÍLIO, I. J. L. D.; FREITAS, P. F.; BARBOSA-

FILHO, J. M. Survey of medicinal plants used in the region Northeast of Brazil.

Brazilian Journal of Pharmacognosy. 2008; 18:472–508.

AGRIOS, G.N. Plant pathology.(fifth ed.) Elsevier Academic Press, New York

2005. p. 343–346.

AIYEGORO, O. A.; OKOH, A.I. Use of bioactive plant products in combination

with standard antibiotics: implications in antimicrobial chemotherapy. Journal of

Medicinal Plants Research. 2009; 3:1147–1152.

ALBUQUERQUE, U. P. Etnobotânica aplicada para a conservação da

biodiversidade. In:ALBUQUERQUE, U. P.; LUCENA, R. F. P. (Eds.). Métodos e

Técnicas na Pesquisa Etnobotânica (Recife Ed.), Livro Rápido, NUPEEA.

2004. p. 139–159.

ALBUQUERQUE, U. P.; ANDRADE, L. H. C. Conhecimento botânico

tradicional e conservação em uma área de Caatinga no estado de

Pernambuco, nordeste do Brasil. Acta Botanica Brasílica. 2002; 16:273–285.


ALBUQUERQUE, U. P.; ANDRADE, L. H. C.; SILVA, A. C. O. Use of plant

resources in a seasonal dry forest (northeastern Brazil). Acta Botanica

Brasilica. 2005; 19:19–38.

ALBUQUERQUE, U. P.; OLIVEIRA, R. F. Is the use impact on native Caatinga

species in Brazil reduced by the high species richness of medicinal plants?

Journal of Ethnopharmacology. 2007; 113:156–170.

ALMEIDA, C. F. C. B. E.; SILVA, T. C. L.; AMORIM, E. L. C.; MAIA, M. B. S.;

ALBUQUERQUE, U. P. Life strategy and chemical composition as predictors of

the selection of medicinal plants from the Caatinga (Northeast Brazil). Journal

of Arid Environments. 2005; 62:127–142.

ALMEIDA, C. F. C. B. R.; AMORIM, E. L. C.; ALBUQUERQUE, U. P.; MAIA, M.

B. S. Medicinal plants popularly used in the Xingo regiona semi-arid location in

northeastern Brazil.Journal of Ethnobiology and Ethnomedicine, 2006; 2:15.

ALMEIDA-CORTEZ, J. “Herbivoria e mecanismos de defesa vegetal”. In:

NOGUEIRA, R. J. M. C.; ARAÚJO, E. L.; WILLADINO, L.G.; CAVALCANTE, U.

M. T. (Org.). Estresses ambientais: danos e benefícios em plantas. Recife.

2005. p.389-396.

ALMEIDA-JÚNIOR, E. B. Diversidade de Manilkaraadans. (Sapotaceae) para o

Nordeste do Brasil. Tese (Doutorado em Botânica). Universidade Federal

Rural de Pernambuco. Departamento de Botânica. 2010. p. 157.

ALPUCHE, J.; PEREYRA, A.; AGUNDIS, C.; ROSAS, C.; PASCUAL, C.;

SLOMIANNY, M.C.; VÁZQUEZ, L.; ZENTENO, E. Purification and

characterization of a lectin from the white shrimp Litopenaeus

setiferus (Crustacea decapoda) hemolymph.Biochimica et Biophysica Acta,

2005,1724:86–93.

AMORIM, A. M.; THOMAS, W. W.; CARVALHO, A. M. V.; JARDIM, J. G.

Floristics of the Una Biological Reserve, Bahia, Brazil; p. 67-146. In THOMAS,

W. W.; and BRITTON E. G. (ed.). The Atlantic coastal forest of Northeastern

Brazil. New York: The New York Botanical Garden. 2008.


AMOROZO, M.C.M. Pluralistic medical settings and medicinal plant use in rural

communities, Mato Grosso, Brazil. Journal of Ethnobiology. 2004;

24(1):139–161.

ANDERSEN, M.; MARKHAM, K.R. (Eds.). Flavonoids: Chemistry, Biochemistry

and Applications.CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton. 2006;

33487-2742.

ANDREW, R. L.; PEAKALL, R.; WALLIS, I. R.; FOLEY, W. J. Ecology. 2007;

88, 716.

ANONYMOUS. Pesticide registrants on voluntary pesticide resistance

management labeling based on mode/target site of action of pest. Fed. Reg.

2000; 65:30115–30117

ARAÚJO, T. A. S.; ALENCAR, N. L.; AMORIM, E. L. C.; ALBUQUERQUE, U.

P. A new approach to study medicinal plants with tannins and flavonoids

contents from the local knowledge. Journal of Ethnopharmacology. 2008;

120:72–80.

AREEJ, M. A.; RANDA, N. H.; NEDHAL, A. A.; REEM, A.; SUNDUS, M.;

MOHAMMAD, M.; YASSER, B. Anti-cancer, anti-inflammatory and anti-

microbial activities of plant extracts used against hematological tumors in

traditional medicine of Jordan. Journal of Ethnopharmacology. 2013; 145:

728–736.

ARIHARA, S.; UMEYAMA, A.; BANDO, S.; IMOTO, S.; ONO, M.; YOSHIKAWA,

K. Three new sesquiterpenes from the black heart wood of

Cryptomeriajaponica. Chem. Pharma. Bull. 2004a; 52:463–465.

ARIHARA, S.; UMEYAMA, A.; BANDO, S.; KOBUKE, S.; IMOTO, S.; ONO, M.;

YOSHIKAWA, K.; AMITA, K.; HASHIMOTO, S. Termiticidal constituents of the

black-heartwood of Cryptomeriajaponica. Mokuzai Gakkaishi.2004b;50:413–

421.

ASWATHANARAYAN, J. B.; VITTAL, R. R.In vitro evaluation of antioxidant and

antibacterial activities ofRotula aquatica and Ancistrocladus heyneanus:


Antioxidant and antimicrobial activity of medicinal plants.Journal of Pharmacy

Research. 2013; 6: 313–317.

BALAKRISHNAN, B.; PARAMASIVAM, S.; ARULKUMAR, A. Evaluation of the

lemongrass plant (Cymbopogoncitratus) extracted in different solvents for

antioxidant and antibacterial activity against human pathogens. Asian Pacific

Journal of Tropical Disease. 2014; 4 (1): 134-139.

ALBUQUERQUE, U. P.; MONTEIRO, J. M.; RAMOS, M. A.; AMORIM, E. L. C.

Medicinal and magic plants from a public market in northeastern Brazil.Journal

of Ethnopharmacology. 2007b; 110:76–91.

BARAVALIA, Y.; KANERIA, M.; VAGHASIYA, Y.; PAREKH, J.; CHANDA, S.

Antioxidant and antibacterial activity of Diospyrosebenum Roxb. leaf extracts.

Turk Journal Biology. 2009; 33: 159-164.

BARBEHENN, R. V.; CONSTABEL, C. P. Tannins in plant–herbivore

interactions. Phytochemistry. 2011; 72: 1551–1565.

BARBOSA, M. R. V.; SOTHERS, C.; MAYO, S.; GAMARRA-ROJAS, C. F. L.;

MESQUITA, C. A. Checklist das Plantas do Nordeste Brasileiro: Angiospermas

e Gymnospermas. Ministério da Ciência e Tecnologia. 2006. p.156.

BARBOSA-FILHO, J. M.; ALENCAR, A. A.; NUNES, X. P.; TOMAZ, A. C. A.;

SENA-FILHO, J. G.; ATHAYDE-FILHO, P. F.; SILVA, M. S.; SOUZA, M. F. V.;

DA-CUNHA, E. V. L. Sources of alpha-, beta, gamma-, delta- and epsilon-

carotenes: A twentieth century review. Revista Brasileira Farmacognosia.

2008; 18: 135-154.

BASSO, L. A.; SILVA, L. H.; FETT-NETO, A. G.; AZEVEDO Jr, W. F.;

MOREIRA, I. S.; PALMA, M. S.; CALIXTO, J. B.; ASTOLFI-FILHO, S.;

SANTOS, R. R.; SOARES, M. B.; SANTOS, D. S. The use of biodiversity as

source of new chemical entities against defined molecular targets for treatment

of malaria, tuberculosis, and T-cell mediated diseases.Memórias do Instituto

Oswaldo Cruz. 2005; 100:475–50.

BELLION, P.; DIGLES, J.; WILL, F.; DIETRICH, H.; BAUM, M.; EISENBRAND,

G., et al. Polyphenolic apple extracts: Effects of raw material and production


method on antioxidant effectiveness and reduction of DNA damage in Caco-2

cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2010; 58:6636–6642.

BERROUGUI, H.; ALVAREZ DE SOTOMAYOR, M.; PEREZ-GUERRERO, C.

Argan (Argania spinosa) oil lowers blood pressure and improves endothelial

dysfunction in spontaneously hypertensive rats. Br Jornal Nutrição. 2004;

92(6):921-929.

BETTAIEB, I.; KNIOUA, S.; HAMROUNI, I.; LIMAM, F.; MARZOUK, B. Water-

deficit impact on fatty acid and essential oil composition and antioxidant

activities of cumin (Cuminum cyminum L.) aerial parts. Journal Agric Food

Chemistry. 2011; 59:328–334. doi:10.1021/jf1037618.

BHOWAL, J.; GUHA, A. K.; CHATTERJEE, B. P. Purification and molecular

characterization of a sialic acid specific lectin from the phytopathogenic fungus

Macrophomina phaseolina.Carbohydrate Research. 2005; 340:1973–1982.

BIAVATTI, M.; MARENSI, V.; LEITE, S.N.; REIS, A. Ethnopharmacognostic

survey on botanical compendia for potential cosmeceutic species from Atlantic

Forest. Revista Brasileira Farmacognosia. 2007; 17:640-653.

BOTHA, J.; WITKOWSKI, E. T. F.; SHACKLETON, C. M.; Harvesting patterns

of Catha edulis (Bushman's tea) and Rapanea melanophloeos (Cape beech)

populations under different land management regimes in Mpumalanga, South

Africa.Koedoe. 2004; 47:1–17.

BOUE, S. M.; RAINA, A.K. Effects of plant flavonoids on fecundity, survival, and

feeding of the Formosan subterranean termite. J. Chem. Ecol. 2003; 29:2575–

2584.

BOURGOU, S.; BETTAIEB, I.; SAIDANI, M.; MARZOUK, B. Fatty acids,

essential oil, and phenolics modifications of black cumin fruit under NaCl stress

conditions. Journal Agric Food Chemistry. 2010; 58: 12399–12406.

BRAVO‑MONZÓN, A. E.; RÍOS‑VÁSQUEZ, E.; DELGADO‑LAMAS, G.;

ESPINOSA‑GARCÍA, F. J. Chemical diversity among populations of Mikania

micrantha: geographic mosaic structure and herbivory. Plant microbe animal

interactions. Original Research,Oecologia. 2014; 174: 195–203.


BRENES-ARGUEDAS, T.; COLEY, P. D. Phenotypic variation and spatial

structure of secondary chemistry in a natural population of a tropical tree

species. Oikos. 2005; 108: 410–420.

BRUSTEIN, V. P.; SOUZA-ARAUJO, F. V.; VAZ, A. F. M.; ARAUJO, R. V. S.;

PAIVA, P. M. G.; COELHO, L. C. B. B.; CARNEIRO-LEÃO, A. M. A.; TEIXEIRA,

J. A.; CARNEIRO-DA-CUNHA, M. G.; CORREIA, M. T. S. A novel antimicrobial

lectin from Eugeniamalaccensis that stimulates cutaneous healing in mice

model. Inflammopharmacol. 2012; 20:315–322.

BULTMAN, J.D.; BEAL, R.H.; AMPONG, F.F.K. Natural resistance of some

tropical African woods toCoptotermes formosanusShiraki. Forest. Prod. J.

1979; 29:46–51

BYERS, J. A.; ZHANG, Q. H.; BIRGERSSON, G. Avoidance of non-host plants

by a bark beetle,Pityogenes bidentatus, in a forest of odors.

Naturwissenschaften. 2004; 91: 215–219.

CALVENTE, A. M.; FREITAS, M. F.; ANDREATA, R. H. P. Listagem,

distribuição geográfica e conservação das espécies de Cactaceae no estado do

Rio de Janeiro. Rodriguésia. 2005; 56(87): 141-162.

CALVO, M. I.; AKERRETA, S.; CAVERO, R. Y. Pharmaceutical ethnobotany in

the Riverside of Navarra (Iberian Peninsula).Journal of Ethnopharmacology.

2011; 135:22–33.

CAMPOS, M. T.; EHRINGHAUS, C. Plant virtues are in the eyes of the

beholders: a comparison of known palm uses among indigenous and folk

communities of southwestern Amazônia. Economic Botany. 2003; 57:324–

344.

CANTRELL, C.L., DUKE, S.O., FRONCZEK, F.R., OSBRINK, W.L.,

MAMONOV, L.K., VASSILYEV, J.I., WEDGE, D.E., DAYAN, F.E. Phytotoxic

Eremophilanes fromLigularia macro-phylla. J. Agric. Food. Chem. 2007;

55(26):10656–10663.

CARLSEN, M. H.; HALVORSEN, B. L.; HOLTE, K.; BOHN, S.K.; DRAGLAND,

S.; SAMPSON, L.; WILLEY, C.; SENOO, H.; UMEZONO, Y.; SANADA, C. et al.


The total antioxidant content of more than 3100 foods, beverages, spices, herbs

and supplements used worldwide. Nutr Journal. 2010; 9:3.doi:10.1186/1475-

2891-9-3.

CARTAXO, S. L.; SOUZA, M. M.; ALBUQUERQUE, U. P. Medicinal plants with

bioprospecting potential used in semi-arid northeastern Brazil.Journal of

Ethnopharmacology. 2010; 131:326–342.

CARVALHO, J. C. T.; GOSMANN, G.; SCHENKEL, E. P. “Compostos fenólicos

simples e heterosídicos”. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.;

GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. (Ed.)

Farmacognosia: da planta ao medicamento. Editora da UFRGS/UFSC, Porto

Alegre, Florianópolis. 2004; p. 519-535.

CAVERO, R. Y.; AKERRETA, S.; CALVO, M. I. Pharmaceutical ethnobotany in

the Middle Navarra (Iberian Peninsula). Journal of Ethnopharmacology.

2011; 137:844–855.

CHANDA, S. V.; NAGANI, K. V. Antioxidant Capacity of Manilkarazapota L.

Leaves Extracts Evaluated by Four in vitroMethods. Nature and Science. Res.

2010; 8: 260-266.

CHANDA, S.; PAREKH, J. Assessment of Antimicrobial Potential of

Manilkarahexandra Leaf. Copyright: Phcog.net. 2010; 2(12):448-455.

CHANDA, S.; PAREKH, J.; Assessment of Antimicrobial Potential of

Manilkarahexandra. Leaf. Phcog J., Res. 2012; 2: 448–455.

CHANG, S. T.; CHENG, S. S.; WANG, S. Y.Antitermitic activity of essential oils

and components from Taiwania (Taiwaniacryptomerioides). J. Chem. Ecol.

2001; 27: 717–724.

CHARUNGCHITRAK, S.; PETSOM. A.; SANGVANICH, P.; KARNCHANATAT,

A. Antifungal and antibacterial activities of lectin from the seeds of

Archidendronjiringa Nielsen. Food Chemistry. 2011; 126:1025–1032.


CHENG, A. X.; LOU, Y. G.; MAO, Y. B.; LU, S.; WANG, L. J. et al. Plant

terpenoids: biosynthesis and ecological functions. Journal Integrative Plant

Biology. 2007; 49: 179–186.

CHENG, S. S.; WU, C. L.; CHANG, H. T.; KAO, Y. T.; CHANG, S. T.

Antitermitic and anti-fungal activity of essential oil of Calocedrusformosana leaf

and its composition. J. Chem. Ecol.2004; 30:1957–1967.

COELHO, L. C. B. B.; SILVA, M. B. R. Simple method to purify milligram

quantities of the galactose-specific lectin from the leaves of Bauhinia monandra.

Phytochemical Analysis. 2000; 11:1–6.

COLEY, P. D.; BARONE. J. A. Ecology of Defenses, In: Levin, S.A.

Encyclopedia of Biodiversity, New Jersey. 2001; 2:11-21.

CORNELIUS, M. L.; GRACE, J. K.; YATES, J. R. Toxicity of monoterpenoids

and other natural products to the formosan subterranean termite (Isoptera:

Rhinotermi-tidae). J. Econ. Entomol. 1997; 87:705–708.

CORRÊA, M. P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas

cultivadas. Rio de Janeiro: Imprensa Nacional. 1978.

COSTA, C. T. C. Atividade anti-helmíntica e imunomoduladora de extratos de

Cocos nucifera L. UECE - Programa de Pós-Graduação em Ciências

Veterinárias. Fortaleza – CE. 2008. p.117.

COSTA, R. M. P. B.; VAZ, A. F. M.; OLIVA, M. L. V.; COELHO, L. C. B. B.;

CORREIA, M. T. S.; CARNEIRO-DA-CUNHA, M. G. A new mistletoe

Phthirusapyrifolia leaf lectin with antimicrobial properties. Process

Biochemistry. 2010; 45: 526–533.

CROZIER, A.; JAGANATH, I. B.; CLIFFORD, M. N. Dietary phenolics:

Chemistry, bioavailability and effects on health. Natural Products Reports.

2009; 26:1001–10043.

DAKAH, A.; ZAID, S.; SULEIMAN, M.; ABBAS, S.; WINK, M.In vitro

propagation of the medicinal plant Ziziphoratenuior L. and evaluation of its


antioxidant activity. Saudi Journal of Biological Sciences. 2014; 21(4): 317-

323.

DEL-CLARO, K.; TOREZAN-SILINGARDI, H. M. Ecologia das interações

plantas-animais: uma abordagem ecológico-evolutiva. Rio de Janeiro.

Technical Books, 2012. 1° ed.

DELUC, L. G.; QUILICI, D. R.; DECENDIT, A.; GRIMPLET, J.; WHEATLEY, M.

D.; SCHLAUCH, K. A.; MERILLON, J. M.; CUSHMAN, J. C.; CRAMER, G. R.

Water deficit alters differentially metabolic pathways affecting important flavor

and quality traits in grape berries of Cabernet Sauvignon and Chardonnay.BMC

Genomics. 10. 2009.

DEWICK, P. M. Medicinal Natural Products: A biosynthetic approach. 2nd

Edition. John Wiley & Sons, Ltd. Capítulo 5, 167-289. 2002.

DEY, T. B.; KUHAD, R. C. Enhanced production and extraction of phenolic

compounds from wheat by solid-state fermentation with Rhizopusoryzae

RCK2012. Biotechnology Reports. 2014; 4:120–127.

DIEHL, L. A.; DIAS, J. R.; DIAS, A. C. S. P.; THOMAZINI; M. C.; GARCIA, L.

R.; CINAGAWA, E.; WIECHMANN, S. L.; ARRILHODIEHL, A. J. F. Prevalência

da lipodistrofia associada ao HIV em pacientes ambulatoriais

brasileiros: relação com síndrome metabólica e fatores de risco

cardiovascular. Arq Bras Endocrinol Metab. 2008; 52(4) 658-667.

DONALDSON, J. R.; LINDROTH, R. L. Genetics, environment, and their

interaction determine efficacy of chemical defense in trembling aspen. Ecology.

2007; 88:729–739.

DOUPIS, G.; CHARTZOULAKIS, K.; BEIS, A.; PATAKAS, A. Allometric and

biochemical responses of grapevines subjected to drought and enhanced

ultraviolet-B radiation.Aust. J. Grape Wine Res. 2011; 17: 36–42

DUCKE, A. As maçarandubas amazonicas. Anuário Brasileiro de Economia

Florestal. 1950;3(3): 231-244.


DUCKE, A. The genus Manilkaraadans.in Brazil, seen by a field botanist.

Journal of the Linnean Society, Botany. 1957; 55: 644-656.

EISSA, T. A. F.; PALOMINO, O. M.; CARRETERO, M. E.; GÓMEZ-

SERRANILLOS, M. P. Ethnopharmacological study of medicinal plants used in

the treatment of CNS disorders in Sinai Peninsula, Egypt. Journal of

Ethnopharmacology. 2014; 151: 317–332.

ERTÜRK, O.; TAS, B. Antibacterial and antifungal effects of some marine

algae. Kafkas Univ Vet Fak Derg. 2011; 17:121–4.

ESKANDER, J.; SAKKA, O. K.; HARAKAT, D.; LAVAUD, C. Steroidal saponins

from the leaves of Yucca desmetiana and their invitro antitumor activity:

structure activity relationship through a molecular modeling approach. Medinal

Chemistry Res. 2013; 22:507–1028.

FAIS, M.; KARAMANSKA, R.; RUSSELL, D.A.; FIELD, R.A. Lectin and

carbohydrate microarrays: New high-throughput methods for glycoprotein,

carbohydrate-binding protein and carbohydrate-active enzyme analysis.Journal

of Cereal Science. 2009, 50:306–311.

FALKENBERG, M. B. QUINONAS. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.;

GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R.

Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre: UFRGS. Revista

ampl, 2003; 5: 555-580.

FERNANDES, C. P. Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal

Manilkara Subsericea (Mart.) Dubard. Dissertação (Mestrado). Faculdade de

Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos

para Saúde – UFF, 2011. p. 172.

FISCHER, R.; OSTAFE, R.; TWYMAN, R. M. Cellulases from insects. In:

Vilcinskas, A. (Ed.), Yellow Biotechnology II: Insect Biotechnology in Plant

Protection and Industry. Advances in Biochemical

Engineering/Biotechnology.2013; 136:51–64.

FUMAGALI, E.; GONÇALVES, R. A. C.; MACHADO, M. F. P. S.; VIDOTI, G. J.;

OLIVEIRA, A. J. B. Produção de metabólitos secundários em cultura de células


e tecidos de plantas: O exemplo dos gêneros Tabernaemontana e

Aspidosperma.Brazilian Journal of Pharmacognosy. 2008; 18(4): 627-641.

ELANGO, G.; ABDUL RAHUMAN, A.; KAMARAJ, C.; BAGAVAN, A.; ABDUZ

ZAHIR, A.; SANTHOSHKUMAR, T.; MARIMUTHU, K.; VELAYUTHAM, S.;

JAYASEELAN, C.; VISHNU KIRTHI, A.; RAJAKUMAR, G. Efficacy of medicinal

plant extracts against Formosansubterranean termite, Coptotermesformosanus.

Industrial Crops and Products. 2012; 36: 524–530.

GABOR, F.; BOGNER, E.;WEISSENBOECK, A.; WIRTH, M. The lectin-cell

interaction and its implications to intestinal lectin-mediated drug delivery.

Advanced Drug Delivery Reviews. 2004; 56(4): 459-480.

GANGULY, A.; MAHMUD, Z. A.; UDDIN, M. M. N.; RAHMAN, S. M. A. In vivo

anti-inflammatory and anti-pyretic activities of Manilkarazapota leaves in albino

Wistar rats. Asian Pacific Journal of Tropical Disease. 2013; 3(4): 301–307.

GAUTHIER, C.; LEGAULT, J.; PIOCHON, M.; LAVOIE S.; TREMBLAY, S.;

PICHETTE, A. Synthesis, cytotoxicity, and hemolytic activity of chacotrioside

lupanetype neosaponins and their germanicane-type rearrangement products.

Bioorg Medicinal Chemistry Lett. 2009; 19(8):2310–2314.

GHOLIVAND, M. B.; NASRABADI, M. R.; BATOOLI, H.; EBRAHIMABADI, A. H.

Chemical composition and antioxidant activities of essential oil and methanol

extracts of Psammogeoncanescens. Food Chemistry Toxicology. 2010; 48:

24-28.

GHORBANI, A.; LANGENBERGER, G.; FENG, L.; SAUERBORN, J.

Ethnobotanical study of medicinal plants utilised by Hani ethnicity in Naban

River Watershed National Nature Reserve, Yunnan, China. Journal of

Ethnopharmacology. 2011;134: 651–667.

GIRISH, T. K.; VASUDEVARAJU, P.; UMMITI, J. S.; RAO, P. Protection of DNA

and erythrocytes from free radical induced oxidative damage by black gram

(Vignamungo L.) husk extract. Food and Chemical Toxicology. 2012; 50:

1690–1696.


GIULIETTI, A. M.; HARLEY, R. M.; QUEIROZ, L. P.; BARBOSA, M. R. V.;

BOCAGE-NETA, A. L.; FIGUEIREDO, M. A. Espécies endêmicas da caatinga.

SAMPAIO, E. V. S. B.; GIULIETTI, A. M.; VIRGÍNIO, J.; GAMARRA-ROJAS, C.

F. L. (Eds.), Vegetação e flora da caatinga, Associação Plantas do

Nordeste e Centro Nordestino de Informação sobre Plantas, Recife. 2002.

p. 103–105.

GOMES, R.; PINHEIRO, M. C. B.; LIMA, H. A; SANTIAGO-FERNANDES, L. D.

R. Biologia floral de Manilkara subsericea e de Sideroxylon obtusifolium

(Sapotaceae) em restinga. Revista Brasileira de Botânica. 2010; 33: 271-283.

GOODSTEIN, D.M.; SHU, S.; HOWSON, R.; NEUPANE, R.; HAYES, R.D.;

FAZO, J.; MITROS, T.; DIRKS, W.; HELLSTEN, U.; PUTNAM, N. et al.

Phytozome: a comparative platform for green plant genomics. Nucleic Acids

Res. 2012; 40:1178–1186.

GRIMPLET, J.; WHEATLEY, M. D.; JOUIRA, H. B.; DELUC, L. G.; CRAMER,

G. R.; Cushman, J. C. Proteomic and selected metabolite analysis of grape

berry tissues under well-watered and water-deficit stress conditions.

Proteomics. 2009; 9: 2503–2528.

GROS, E. G. Introductión al estudio de los productos naturales. Secretaria

geral de La Organización de los Estados Americanos. 1985.

GUO, L.Y.; HUNG, T.M.; BAE, K.H.; SHIN, E.M.; ZHOU, H.Y.; HONG, Y.N. et

al.Anti-inflammatory effects of schisandrin isolated from the fruit of Schisandra

chinensis Baill.European Journal of Pharmacology. 2008; 591(1–3):293–299.

GUREVITCH, J.; SCHEINER, S.M.; FOX, G.A. Ecologia vegetal. Porto Alegre.

Artmed, 2°ed. 2009.

HE, S.; SHI, J. WALID, E.; MA, Y.; XUE, S. J. Extraction and purification of a

lectin from small black kidney bean (Phaseolus vulgaris) using a reversed

micellar system. Process Biochemistry. 2013; 48(4): 746–752.


HOEKENGA, O. A. Using metabolomics to estimate unintended effects in

transgenic crop plants: problems, promises, and opportunities.Journal of

Biomolecular Techniques. 2008; 19:159–166.

HOLLMAN, P.C.H.; CASSIDY, A.; COMTE, B.; HEINONEN, M.; RICHELLE ,M.;

RICHLING, E., et al.The biological relevance of direct antioxidant effects of

polyphenols for cardiovascular health in humans is not established. The

Journal of Nutrition. 2011; 141:989–1009.

HOSSAIN, H.; JAHAN, F.; HOWLADER, SI.; DEY, SK.; HIRA, A.; AHMED, A.

et al. Evaluation of anti-inflammatory activity and total flavonoids content of

Manilkara zapota (L.) Bark. Int Journal Pharmacology and

Phytopharmacology Res. 2012; 2(1): 35-39.

HOSTETTMANN, K.; MARSTON, A. Saponins chemistry and pharma-cology of

natural products. Cambridge University Press, Cambridge. 2005.

HÜBSCH, Z.; VAN ZYL, R. L.; COCK, I. E.; VAN VUUREN, S. F. Interactive

antimicrobial and toxicity profiles of conventional antimicrobials with Southern

African medicinal plants. South African Journal of Botany. 2014; 93:185–197.

HURTADO-FERNÁNDEZ, E.; PACCHIAROTTA, T.; GÓMEZ-ROMERO, M.;

SCHOENMAKER, B.; DERKS, R.; DEELDER, A.M. et al.Ultra high performance

liquid chromatography–time of flight mass spectrometry for analysis of avocado

fruit metabolites: Method evaluation and applicability to the analysis of ripening

degrees.Journal of Chromatography A. 2011, 1218(42):7723–7738.

IBRAHIM, B. S.; PATTABHI, V. Trypsin Inhibition by a Peptide Hormone:

Crystal Structure of Trypsin–Vasopressin Complex. J. Mol. Biol. 2005; 348:

1191–1198.

IBRAHIM, S. A.; HENDERSON, G.; ZHU, B. C. R.; FEI, H.; LAINE, R. Toxicity

and behavioral effects of nootkatone, 1,10 dihydronootkatone, and

tetrahydronootkatone to the Formosansubterranean termite (Isoptera:

Rhinotermitidae). J. Econ. Ento-mol. 2004; 97:102–111.


IGNAT, I.; VOLF, I.; POPA, V.I. A critical review of methods for characterisation

of polyphenolic compounds in fruits and vegetables.Food Chemistry. 2011;

126:1821–1835.

IUCN - International Union for Conservation of Nature. IUCN Red List

Categories and Criteria: Version 3.1. IUCN Species Survival Commission.

IUCN, Gland, Switzerland and Cambridge, UK. 2001.

JAKOBEK, L. Interactions of polyphenols with carbohydrates, lipids and

proteins. Food Chemistry. 2015; 175:556–567.

JARAMILLO, S.; LOPEZ, S.; VARELA, L. M.; RODRIGUEZ-ARCOS, R.;

JIMENEZ, A.; ABIA, R. et al.The flavonol isorhamnetin exhibits cytotoxic effects

on human colon cancer cells.Journal of Agricultural and Food Chemistry.

2010; 58:10869–10875.

JUDD, W. S.; CAMPBELL, C. S.; KELLOGG, E. A.; STEVENS, P. F.;

DONOGHUE, M. J. Plant Systematics: A Phylogenetic Approach.(3rd ed.)

Sinauer Association, Sunderland, MA. 2007.

KANERIA, M.; BARAVALIA, Y.; VAGHASIYA, Y.; CHANDA, S. Determination of

antibacterial and antioxidant potential of some medicinal plants from Saurashtra

region, India. Indian J Pharm Sci. 2009, 71:406-412.

KANERIA, M.; CHANDA, S. Evaluation of antioxidant and antimicrobial

properties of Manilkara zapotaL. (chiku) leaves by sequential soxhlet extraction

method. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2012; 2(3):1526-

1533.

KANG, H. Y.; MATSUSHIMA, N.; SAMESHIMA, K.; TAKAMURA, N. Termite

resistance tests of hardwoods of Kochi growth. The strong termiticidal activity of

kagonoki (Litseacoreana Léveillé). Mokuzai Gakkaishi. 1990; 36:78-84.

KARUNAMOORTHI, K.; TSEHAYE, E.; Ethnomedicinal knowledge, belief and

self-reported practice of local inhabitants on traditional antimalarial plants and

phytotherapy. Journal of Ethnopharmacology. 2012, 141:143–150.


KAUR, A.; SINGH, J.; KAMBOJ, S.S.; SEXANA, A.K.; PANDITA, R.M.;

SHAMNUGAVEL, M. Isolation of an N-acetyl-D-glucosamine specific lectin from

the rhizomes of Arundo donax with antiproliferative activity. Phytochemistry,

2005, 66:1933–1940.

KAUR, M.; SINGH, K.; RUP, P.J.; SAXENA, A.K.; KHAN, R.H.; ASHRAF, M.T.;

KAMBOJ, S.S.; SINGH, J. A tuber lectin from Arisaema helleborifolium Schott

with anti-insect activity against melon fruit fly,Bactrocera cucurbitae (Coquillett)

and anti-cancer effect on human cancer cell. Archives of Biochemistry and

Biophysics. 2006, 445:156–165.

KAYANI, S.; AHMAD, M.; ZAFAR, M.; SULTANA, S.; KHAN, M. P. Z; ASHRAF,

M. A.; HUSSAIN, J.; YASEEN, G. Ethnobotanical uses of medicinal plants for

respiratory disorders among the inhabitants of Gallies – Abbottabad, Northern

Pakistan. Journal of Ethnopharmacology. 2014; 156:47–60.

KENNEDY, J. F. PAIVA, P. M .G.; COREIA, M. T. S.; CAVALCANTI, M. S. M.;

COELHO, L. C. B. B. Lectins, versatile proteins of recognition: a review.

Carbohydrate Polymers. 1995; 26(3): 219-30.

KHAN, F.; AHMAD, A.; KHAN, M.I. Purification and characterization of a lectin

from endophytic fungus Fusarium solani having complex sugar

specificity.Archives of Biochemistry and Biophysics. 2007; 457:243–251.

KLIEBENSTEIN, D. J.; OSBOURN, A. Making new molecules – evolution of

pathways for novel metabolites in plants. Current Opinion in Plant Biology.

2012; 15:415–423.

KNASMÜLLER, S.; DE MARINI, D.M.; JOHNSON, I.; GERHÄUSER, C.

Chemoprevention of Cancer and DNA Damage by Dietary Factors. Wiley-VCH

Verlag GmbH & Co, Weinheim. 2009.

KRISHNAIAH, D.; SARBATLY, R.; BONO, A. Phytochemical antioxidants for

health and medicine-a move towards nature. Biotech Mol Biol Rev. 2007;

1(4):97-104.

KSOURI, R.; FALLEH, H.; MEGDICHE, W.; TRABELSI, N.; MHAMDI, B.;

CHAIEB, K.; BAKROUF, A.; MAGNÉ, C.; ABDELLY, C. Antioxidant and


antimicrobial activities of the edible medicinal halophyte Tamarixgallica L.

and related polyphenolic constituents. Food Chem. Toxicol. 2009; 47:

2083–2091.

KUSHIMA, H.; HIRUMA-LIMA, C.A.; SANTOS, M.A.; VIANA, E.; COELHO-

FERREIRA, M.; BRITO, A.R. Gastroprotective activity of Pradosia huberi on

experimentally induced gastric lesions in rodents: role of endogenous

sulphydryls and nitric oxide. J. Ethnopharmacol. 2005; 101(1-3):61-67,.

KUSTER, R. M.; ROCHA, L. M. Cumarinas, Cromonas e Xantonas. In: Simões,

C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L. A.; Petrovick,

P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre: UFRGS,

2003; 5:333-364,

LAJIDE, L.; ESCOUBAS, P.; MIZUTANI, J. Termite antifeedant activity in

Detarium microcarpum. Phytochemistry.1995; 40:1101–1104.

LAKSHMI, V.; GOEL. A. K.; SRIVASTAVA. M. N.; KULSHRESHTA, D. K.;

RAGHUBIR, R. Bioactivity of marine organisms: Part IX—Screening of some

marineflora from the Indian coasts. Indian J Exp Biol. 2006; 44:137–41.

LAM, H. J. Mimusopsrufula Miq. In Martius, Fl. bras. 7:44. 1863. Blumea. 1941;

4(2): 356.

LAM, S. K.; NG, T. B. Lectins: Production and practical applications.Applied

Microbiology and Biotechnology. 2011; 89:45–55.

LANDETE, J.M. Ellagitannins, ellagic acid and their derived metabolites: A

review about source, metabolism, functions and health. Food Research

International. 2011; 44: 1150–1160.

LARA, F. M. Princípios de resistência de plantas a insetos. 2 ed. Ícone. São

Paulo. 1991; p.331.

LASKOWSKI, Jr., M., QASIM, M. A. What can the structures of enzyme-

inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate

complexes? Biochimica et Biophysica Acta. 2000; 1477: 324-337.


LAWO, N. C.; WEINGART, G. J.; SCHUHMACHER, R.; FORNECK, A. The

volatile metabolome of grapevine roots: first insights into the metabolic

response upon phylloxera attack.Plant Physiol. Biochem. 2011; 49: 1059–

1063.

LAX, A.; OSBRINK, W. United States Department of Agriculture – Agriculture

Research Service research on targeted management of the

Formosansubterranean termite Coptotermesformosanus Shiraki (Isoptera:

Rhinotermitidae). Pest Manag. Sci. 2003; 59:788–800.

LAZAREVIC, B.; BOEZELIJN, G.; DIEP, L. M.; KVERNROD, K.; OGREN, O.;

RAMBERG, H.; et al. Efficacy and safety of short-term genistein intervention in

patients with localized prostate cancer prior to radical prostatectomy: a

randomized, placebo-controlled, double-blind phase 2 clinical trial. Nutr

Cancer. 2011; 63:889–98.

LEAL, I.R.; DA SILVA, J.M.C.; TABARELLI, M.; LACHER JR., T.E. Changing

the course of biodiversity conservation in the caatinga of Northeastern Brazil.

Conserv Biology. 2005; 19 (3):701–706.

LEE, D. K.; YOON, M. H.; KANG, Y. P.; YU, J.; PARK, J. H.; LEE, J.; KWON, S.

W. Comparison of primary and secondary metabolites for suitability to

discriminate the origins of Schisandrachinensis by GC/MS and LC/MS. Food

Chemistry. 2013; 141:3931–3937.

LEI-LEI, F.; CHENG-CHENG, Z.; SHUN, Y.; JIA-YING, Y.; BO, L.; JIN-KU, B.

Plant lectins: Targeting programmed cell death pathways as antitumor agents.

The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2011; 43: 1442–

1449.

LI, X.; DUAN, T.L.; CHEN, M.; LI, M.; CHEN, Y.Q.; ZHOU, G.H.; CUI, ET AL.

Use of the metabolomics approach to characterize Chinese medicinal material

Huangqi. Molecular Plant. 2012: 5(2):376–386.

LIN, T. S.; RUPPERT, A. S.; JOHNSON, A. J.; FISCHER, B.; HEEREMA, N. A.;

ANDRITSOS, L. A. et al. Phase II study of flavopiridol in relapsed chronic


lymphocytic leukemia demonstrating high response rates in genetically high-risk

disease. J Clin ncol. 2009; 27:6012–8.

LINGARAJU, M. H., GOWDA, L. R.. A Kunitz trypsin inhibitor of Entada

scandens seeds: Another member with single disulfite bridge. Biochimica et

Biophysica Acta. 2008; 1784:850-855.

MACEL, M.; KLINKHAMER, P. Chemotype of Senecio jacobaea affects

damage by pathogens and insect herbivores in the field. Evol Ecology. 2010;

24:237–250.

MARINHO, J. S.; OLIVEIRA, M. G. A.; GUEDES, R. N. C.; PALLINI, A.;

OLIVEIRA, C. L. Inibidores de proteases de hospedeiros nativos e exóticos e

sua ação em intestinos de lagartas de Thyrinteinaleucoceraea. R. Árvore,

Viçosa-MG. 2008; 32(6): 1125-1132.

MARTINS, S.; MUSSATTO, S. I.; MARTÍNEZ-AVILA, G.; MONTAÑEZ-SAENZ,

J.; AGUILAR, C. N.; TEIXEIRA, J. A. Bioactive phenolic compounds: production

and extraction by solid-state fermentation. A review. Biotech. Adv. 2011;

29:365–373.

MAZID, M.; KHAN, T.A.; MOHAMMAD, F. Role of secondary metabo-lites in

defense mechanisms of plants, Biol. Med. 2011; 3:232–249.

MAZZA, G.; GUCLU, Y. Saponins properties, applications and processing. Crit

Review Food Science Nutr. 2007, 47:231–258.

McMAHON, L.R.; MCALLISTER, T.A.; BERG, B.P.; MAJAK, W.; ACHARYA,

S.N.; POPP, J.D.; COULMAN, B.E.; WANG, Y.; CHENG, K.J. A review of the

effects of forage condensed tannins on ruminal fermentation and bloat in

grazing cattle. Can. Journal Plant Science. 2000; 80:469–485.

MEEPAGALA, K. M.; OSBRINK, W.; STURTZ, G.; LAX, A. Plant-derived

natural prod-ucts exhibiting activity against Formosan subterranean termites

(Coptotermesformosanus). Pest Manage. Sci. 2006; 62 (6):565–570.


MELLO, J.P.C.; SANTOS, S.C.; Simões, C.M.O.; Schenckel, E.P. (Org) Em

Farmacognosia: da planta ao medicamento. Ed. UFSC: Porto Alegre. 3°ed.

2001.

MELZIG M.F.; BADER G.; LOOSE R. Investigations of the mechanism of

membrane activity of selected triterpenoid saponins. Planta Medinal. 2001;

67(1):43–48.

MONTEIRO, J. M., ALBUQUERQUE, U. P., LINS-NETO, E. M. F., ARAUJO, E.

L., AMORIM, E. L. C. Use patterns and knowledge of medicinal species among

two rural communities in Brazil's semi-arid northeastern region.Journal of


MONTENEGRO, L. H. M.; OLIVEIRA, P. E. S; CONSERVA, L. M.; ROCHA, E.

M. M.; BRITO, A. C.; ARAÍJO, R. M. TREVISAN, M. T. S.; LEMOS, R. P. L.

Terpenóidese avaliação do potencial antiinflamatório, lavircida, anti-radicular e

anticolinesterásico de Pouteria venosa (Sapotaceae). Revista brasileira de

Farmacognosia. 2006; 16: 611-617.

MOOTOOSAMY, A.; MAHOMOODALLY, M. F. Ethnomedicinal application of

native remedies used against diabetes and related complications in Mauritius.

Journal of Ethnopharmacology. 2014; 151: 413–444.

MOREIRA, R. C. T.; COSTA, L. C. B.; COSTA, R. C. S.; ROCHA, E. A.

Abordagem etnobotânica acerca do uso de plantas medicinais na vila

Cachoeira, Ilhéus, Bahia, Brasil.Acta Farmaceutica Bonaerense. 2002;

20:205–211.

MUELLER-HARVEY, I. Unravelling the conundrum of tannins in animal nutrition

and health. Journal Science Food Agric. 2006; 86:2010–2037.

MUFFLER, K.; LEIPOLD, D.; SCHELLER, M.C.; HAAS, C.; STEINGROEWER,

J.; BLEY, T.; NEUHAUS, H.E.; MIRATA, M.A.; SCHRADER, J.; ULBER, R.

Biotransformation of triterpenes. Process Biochemistry. 2011; 46: 1–15.

MULLA, W. A.; KUCHEKAR, S. B.; KUCHEKAR, B. S. Antioxidant, anti-

nociceptive and anti-inflammatory activities of ethanolic extract of leaves of

Alocasiaindica (Schott.). J Young Pharm. 2010; 2(2): 137-143.


NAIR, R.; CHANDA, S. Antimicrobial activity of Terminaliacatappa,

Manilkarazapota and Piperbetel leaf extract. Indian Journal of

Pharmaceutical Sciences. 2008; 70: 390-393.

NETO, V. A. Estudo das atividades antinociceptiva, anti-inflamatória e

antioxidante de Sideroxylonobtusifolium (Sapotaceae). Dissertação

apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da

Universidade Federal de Sergipe. 2009. p.76.

NEUMANN, D.; Lehr, C. M.; Lenhof, H. P.; Kohlbacher, O. Computational

modeling of the sugar-lectin interaction. Advanced Drug Delivery Reviews.

2004; 56(4): 437-457.

NIOGRET, J.; EPSKY, N.D.; SCHNELL, R.J.; BOZA, E.J.; KENDRA, P.E. et al.

Terpenoid Variations within and among Half-Sibling Avocado Trees,

Perseaamericana Mill. (Lauraceae). PLoS ONE. 2013; 8(9): 73601.

NKHILI, E.; TOMAO, V.; HAJJI, H.; BOUSTANI, E.S.; CHEMAT, F. O. Dangles.

Microwave-assisted water extraction of green tea polyphenols. Phytochem.

Anal. 2009; 20:408–415.

ODA, K.; MATSUDA, H.; MURAKAMI, T.; KATAYAMA, S.; OHGITANI, T.;

YOSHIKAWA, M. Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derived

from medicinal and food plants. Biology Chemistry. 2000; 381:67–74.

OHMURA, W.; DOI, S.; AOYAMA, M.; OHARA, S. Antifeedant activity of

flavonoids and related compounds against the subterranean termite

Coptotermesformosanus Shiraki. J. Wood. Sci. 2000; 46: 149–153.

OKUDA, T. Systematics and health effects of chemically distinct tannins in

medicinal plants.Phytochemistry. 2005; 66: 2012–2031.

OSBRINK, W. L. A.; LAX, A. R.; BRENNER, R. J. Insecticide susceptibility in

Coptotermesformosanus and Reticulitermes virginicus (Isoptera:

Rhinotermitidae). J. Econ. Entomol.2001; 94:1217–1228.


OSIER, T.L.; LINDROTH, L.R. Effects of genotype, nutrient availability, and

defoliation on aspen phytochemistry and insect performance. Journal

Chemistry Ecology. 2001; 27:1289–1313.

OSMAN, M. A.; RASHID, M. M.; AZIZ, M. A.; HABIB, M. R.; KARIM, M. R.

Inhibition of Ehrlich ascites carcinoma by Manilkara zapotaL. stem bark in Swiss

albino mice. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2011; 448-451.

OSMAN, M. E. H.; ABUSHADY, A. M.; ELSHOBARY, M. E. In vitro screening of

antimicrobial activity of extracts of some macroalgae collected from Abu-Qir bay

Alexandria, Egypt. Afr J Biotechnol. 2010; 9:7203–8.

PACKER, J.; BROUWER, N.; HARRINGTON, D.; GAIKWAD J.; HERON, R.;

Yaegl Community Elders, S. Ranganathan, S. Vemulpad, J. Jamie. An

ethnobotanical study of medicinal plants used by the Yaegl Aboriginal

community in northern New South Wales, Australia. Journal of


PAIVA, P. M. G.; GOMES, F. S.; NAPOLEÃO, T. H.; SÁ, R. A.; CORREIA, M.

T. S.; COELHO, L. C. B. B. Antimicrobial activity of secondary metabolites and

lectins from plants. Current Resceach, Technology and Education Topics in

Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. A. Mendez-Vilas. 2010.

(Ed.).

PAIVA, P. M. G.; SOUZA, A. F.; OLIVA, M. L. V.; KENNEDY, J. F.;

CAVALCANTI, M. S. M.; COELHO, L. C. B. B.; SAMPAIO, C. A. M. Isolation of

trypsin inhibitor from Echinodorus paniculatus seeds by affinity chromatography

on immobilized Cratylia mollis isolectins.Bioresource Technology. 2003;

88:75–79.

PARK, J. H.; KWAK, J. H.; KHOO, J. H. et al. Cytotoxic effects of triterpenoid

saponins from Androsace umbellata against multidrug resistance (MDR) and

non-MDR cells. Arch Pharm Res. 2010; 33(8):1175–1180.

PENNINGTON, T. D. Flora da Reserva Ducke, Amazonas, Brasil: Sapotaceae.

Rodriguésia. 2006; 57 (2): 251-366.


PEUMANS, W. J.; VANDAMME, E. J. M. Plant lectins: versatile proteins with

important perspectives in biotechnology. Biotechnology and Geneteic

Engineering Rewiews. 1998, 15: 199 - 228.

PODOLAK, I.; GALANTY, A.; SOBOLEWSKA, D. Saponins as cytotoxic agents:

a review. Phytochemistry Review. 2010; 9(3):425–474.

POELMAN, E. H.; DAM, N. M.; LOON, J. J. A.; VET, L. E. M.; DICKE, M.

Chemical diversity in Brassicaoleracaea ffects biodiversity of insect herbivores.

Ecology. 2009;90:1863–1877.

PORDEUS, R. B. Diagnóstico Ambiental por Geoprocessamento do Parque

Nacional do Catimbau Dirigido a Proteção de seus Sítios Arqueológicos e

Espeleológicos. Tese (Doutorado em Geografia) - UFRJ, Programa da Pós-

Graduação em Geografia. Rio de Janeiro 2007. p.176.

PRIOR, R. L.; GU, L. W. Occurrence and biological significance of

proanthocyanidins in the American diet. Phytochemistry. 2005; 66:2264–2280.

PUENTES, L.N.D. Molecular interactions between plants and microorganisms:

saponins as plant chemical defences and their microbial tolerance. Revista de

Estudios Transdisciplinarios. 2009; 1(2):32-55.

QUEIROZ C. R. A. A.; MORAIS S. A. L.; NASCIMENTO E. A. Caracterizaçao

dos taninos da Aroeira-preta (Myracrodruonurundeuva). R. Árvore, Viçosa-

MG. 2002; 26(4):485-492.

RAMOS, S. C. S.; OLIVEIRA, J. C. S.; CÂMARA, C. A. G.; CASTELAR, I.;

CARVALHO, A. F. F. U.; LIMA-FILHO, J. V. Antibacterial and cytotoxic

properties of some plant crude extracts used in Northeastern folk medicine.

Braziliam Journal of Pharmacognosy. 2009; 19(2): 376-381.

RASMUSSEN, S. E.; FREDERIKSEN, H.; KROGHOLM, K. S.; POULSEN, L.

Dietary proanthocyanidins: occurrence, dietary intake, bioavailability, and

protection against cardiovascular disease. Mol. Nutr. Food Res. 2005. 49:159–

174.


RAVEN, P.; EVERT, R. F.; EICHHORN, S. E. Biologia vegetal. 6 ed. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan. 2001.

RAVISHANKAR, D.; RAJORA, A. K..; GRECO, F., OSBORN, H. M. I.

Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The

International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2013; 45: 2821–2831.

REHECHO, S.; URIARTE-PUEYO, I.; CALVO, J.; VIVAS, L. A.; CALVO, M. I.

Ethnopharmacological survey of medicinal plants in Nor-Yauyos, a part of the

Landscape Reserve Nor-Yauyos-Cochas, Peru.Journal of


RIBEIRO, J. E. L. S.; HOPKINS, M. J. G.; VICENTINI, A.; SOTHERS, C. A.;

COSTA, M. A. S.; BRITO, J. M.; SOUZA, M. A. D.; MARTINS, L. H. P.;

LOHMANN, L. G.; ASSUNÇÃO, P. A. C. L.; PEREIRA, E. C.; SILVA, C. F.;

MESQUITA, M. R.; PROCÓPIO, L. C. Flora da Reserva Ducke: Guia de

identificação das plantas vasculares de uma floresta de terra-firme na

Amazônia Central. Manaus: INPA. 1999. p.816.

RODRIGUES, N. M. Potencialidades e impactos ambientais no parque nacional

do catimbau e sua zona de amortecimento. Dissertação apresentada ao

Curso de Mestrado em Gestão e Políticas Ambientais da Universidade

Federal de Pernambuco. 2006. p.108.

ROJO, F.G.; REYNOSO, M.M.; FEREZ, M.; CHULZE, S.N.; TORRES, A.M.

Biological control by Trichodermaspecies of Fusarium solani causing peanut

brown root rot under field conditions.Crop Protection. 2007; 26:549–555.

SÁ, R. A.; NAPOLEÃO, T. H.; SANTOS, N. D. L.; GOMES, F. S.;

ALBUQUERQUE, A. C.; XAVIER, H. S.; COELHO, L. C. B. B.; BIEBER, L. W.;

PAIVA, P. M. G. Induction of mortality on Nasutitermes corniger (Isoptera,

Termitidae) by Myracrodruon urundeuva heart wood lectin.International

Biodeterioration and Biodegradation, 2008; 62: 460–464.

SÁ, R. A.; SANTOS, N. D. L.; SILVA, C. S. B.; NAPOLEÃO, T. H.; GOMES, F.

S.; CAVADA, B. S.; COELHO, L. C. B. B.; NAVARRO, D. M. A. F.; BIEBER, L.

W.; PAIVA, P. M. G. Larvicidal activity of lectins from Myracrodruon


urundeuva on Aedes aegypti.Comparative Biochemistry and Physiology

Part C, Toxicology and Pharmacology. 2009a; 149: 300–306.

SÁ, R. A.; GOMES, F. S.; NAPOLEÃO, T. H.; SANTOS, N. D. L.; MELO, C. M.

L.; GUSMÃO, N. B.; COELHO, L. C. B. B.; PAIVA, P. M. G.; BIEBER, L. W.

Antibacterial and antifungal activities of Myracrodruon urundeuva heart

wood.Wood Science and Technology. 2009b; 43:85–95.

SALES, M. F.; MAYO, S. J.; RODAL, M. J. N. Plantas vasculares das Florestas

Serranas de Pernambuco: Um Checklist da Flora Ameaçada dos Brejos de

Altitude, Pernambuco, Brasil. Recife, Imprensa Universitária Universidade

Federal Rural de Pernambuco. 1998. p.130.

SAMAC, D. A.; SMIGOCKI, A. C. Expression of oryzacystatin I and II in alfalfa

increases resistance to the root-lesion nematode. Phytopathology. 2003; 93:

799–804.

SANTOS, R. I. “Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários”. In:

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.;

MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao

medicamento. 5ª ed. Editora da UFSC/UFSC, Porto Alegre, Florianópolis.

2004. 403-434.

SANTOS, R. I. Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários. In:

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.;

MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao

medicamento. Porto Alegre: UFRGS. 5.ed. (rev. ampl.). 2003; 333-364.

SANTOS, S. C.; MELLO, J. C. P. Taninos. In: Farmacognosia: da planta ao

medicamento. SIMÕES, C. M. O.; GUERRA, M. P. et al. 5ed. Porto

Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC. 2004. p.1096.

SATISH, S.; RAGHAVENDRA, M. P.; RAVEESHA, K. A. Evaluation of the

antibacterial potential of some plants against human pathogenic bacteria.

Advances in Biological Research. 2008; 2:44–48.

SAÚDE-GUIMARÃES, D. A.; FARIAS, A. R. Substâncias da natureza com

atividade anti-Trypanosoma cruzi. Rev Bras Farmacogn.2007; 17:455-465.


SCHOEDL, K.; SCHUHMACHER, R.; FORNECK, A. Correlating physiological

parameters with biomarkers for UV-B stress indicators in leaves of grapevine

cultivars Pinot noir and Riesling.J. Agric. Sci. 2013; 151: 189–200.

SCIONEAUX, A. N.; SCHMIDT, M. A.; MOORE, M. A.; LINDROTH, R. L.;

WOOLEY, S. C.; HAGERMAN, A. E. Qualitative variation in proanthocyanidin

composition of Populus species and hybrids: genetics is the key. J. Chem.

Ecol. 2011; 37(1): 57-70.

SEMENYA, S.; POTGIETER, M.; ERASMUS, L. Ethnobotanical survey of

medicinal plants used by Bapedi healers to treat diabetes mellitus in the

Limpopo Province, South Africa. Journal of Ethnopharmacology. 2012; 141:

440–445.

SHISHIKURA, Y.; KHOKHAR, S.; MURRAY, B.S. Effects of tea polyphenols on

emulsification of olive oil in a small intestine model system. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54:1906–1913.

SILVA, M.C.C.; SANTANA, L.A.; SILVA-LUCCA, R.A.; LIMA, A.L.R.;

FERREIRA, J.G.; PAIVA, P.M.G.; COELHO, L.C.B.B.; OLIVA, M.L.V.; ZINGALI,

R.B.; CORREIA, M.T.S. Immobilized Cratylia mollis lectin: An affinity matrix to

purify a soybean (Glycine max) seed protein with in vitro platelet

antiaggregation and anticoagulant activities.Process Biochemistry. 2011,

46:74–80.

SILVA, S. I.; OLIVEIRA, A. F. M.; NEGRI, G.; SALATINO, A. Seed oils of

Euphorbiaceae from the Caatinga, a Brazilian tropical dry forest. Biomassand

Bioenergy. 2014; 69:124-134.

SILVA, V. A.; ANDRADE, L. H. C. Etnobotânica Xucuru: espécies

místicas.Biotemas. 2002; 15: 45–57.

SIMAS, V. R.; COSTA, E. C.; SIMAS, C. A. “Principais espécies vegetais

herbáceas em locais forrageados e não forrageados por Atta vollenweideri

Forel, 1983 (Hymenoptera: Formicidae)”. Revista da Faculdade de Zootecnia,

Veterinária e Agronomia. 2004; 10: 202-213.


SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMAN, G.; MELLO, J. C. P.;

MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento.

Ed. 4ª. Porto Alegre/ Florianópolis: Editora UFRS/ UFSC. 2004.

SOBRINHO, T. J. S. P.; CASTRO, V. T. N. DE A.; SARAIVA, A. M.; ALMEIDA,

D. M.; TAVARES, E. A.; PISCIOTTANO, M. N. C.; AMORIM, E. L. C.

Phytochemical screening and antibacterial activity of four Cnidoscolus species

(Euphorbiaceae) against standard strains and clinical isolates. Journal of

Medicinal Plants Research. 2012; 6(21): 3742-3748.

SOUZA, J. D.; SILVA, M. B. R.; ARGOLO, A. C. C.; NAPOLEÃO, T. H.; SÁ, R.

A.; CORREIA, M. T. S.; PAIVA, P. M. G.; SILVA, M. D. C.; COELHO, L. C. B. B.

A new Bauhiniamonandra galactose-specific lectin purified in milligram

quantities from secondary roots with antifungal and termiticidal activities.

International Biodeterioration & Biodegradation. 2011; 65: 696-702.

SOUZA, V. C.; LORENZI, H. Botânica Sistemática: Guia ilustrado para

identificação das famílias de Angiospermas da flora brasileira, baseado em

APG II. Nova Odessa, SP: Instituto plantarum. 2005. p.640.

SPARG, S. G.; LIGHT, M. E.; VAN-STADEN, J. Biological activities and

distribution of plant saponins. Journal Ethnopharmacology. 2004; 94:219–

243.

STEIN, E. M.; COLEPICOLO, P.; ALFONSO, F. A. K.; FUJII, M. T. Screening

for antifungal activities of extracts of the Brazilian seaweed genus Laurencia

(Ceramiales, Rhodophyta). Braz J Pharmacog. 2011; 21:290–5.

STEPP, R. The role of weeds as sources of pharmaceuticals. Journal of


STERFLINGER, K.; Fungi: Their role in deterioration of cultural heritage.Fungal

Biology Reviews. 2010, 24:47–55.

STEVENS, P. F. Angiosperm Phylogeny. website, version 5. 2005.

STILLMARK, H. Doctoral Dissertation University of Dorpat, Dorpat (Tartu),

1888.


SUFFREDINI, J. B.; SADER, H. S.; GONCALVES, A. G.; REIS, A. O.; GALES,

A. C.; VARELLA, A. D.; YOUNES, R. N. Screening of antimicrobial extracts

from plants native to the Brazilian Amazon rainforest and Atlantic forest. Braz.

J. Med. Biol.Res. 2004; 37: 379-384.

SULIMAN, S.; VAN VUUREN, S. F.; VILJOEN, A. M. Validating the in

vitro antimicrobial activity of Artemisia afra in polyherbal combinations to treat

respiratory infections.South African Journal of Botany. 2010; 76: 655–661.

SUNI, T.; KULMALA, M.; HIRSIKKO, A.; BERGMAN, T.; LAAKSO, L.; AALTO,

P.; LEUNING, R.; CLEUGH, H.; ZEGELIN, S.; HUGHES, D.; VAN GORSEL, E.;

KITCHEN, M.; VANA, M.; HORRAK, U.; MIRME, S.; MIRME, A.; SEVANTO, S.;

TWINING, J.; TADROS, C. Formation and characteristics of ions and charged

aerosol particles in a native Australian eucalypt forest. Atmos Chem Phys.

2008; 8:129–139.

TAARIT, M. B.; MSAADA, K.; HOSNI, K.; MARZOUK, B. Physiological changes

and essential oil composition of clary sage (Salviasclareal.) rosette leaves as

affected by salinity. Acta Physiol Plant. 2011; 33:153–162.

TACHER, S. I.; RIVERA, J. R. A.; ROMERO, M. M.; FERNÁNDEZ, A. D.

Caracterización del uso tradicional de la flora espontánea en la comunidad

Lacandona de Lacanha, Chiapas, México. Interciencia. 2002; 27:512–518.

TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 3ª ed., Porto Alegre: Artmed, 2004.

719p.

TALHOUK, R. S.; KARAM, C.; FOSTOK, S.; EL-JOUNI, W.; BARBOUR, E. K.

Anti-inflammatory bioactivities in plant extracts. Journal of Medicinal Food.

2007; 10:1–10.

TELANG, M.; SRINIVASAN, A.; PATANKAR, A.; HARSULKAR, A.; JOSHI, V.;

DAMLE, A.; DESHPANDE, V.; SAINANI, M.; RANJEKAR, P.; GUPTA, G.;

BIRAH, A.; RANI, S.; KACHOLE, M.; GIRI, A.; Gupta, V. Bitter gourd proteinase

inhibitors: potential growth inhibitors of Helicoverpaarmigera and Spodoptera

litura. Phytochemistry. 2003; 63: 643–652.


TELLEZ, M., ESTELL, R., FREDRICKSON, E.; POWELL, J., WEDGE, D.,

SCHRADER, K., KOBAISY, M. Extracts of Flourensiacernua (L): volatile

constituents and antifungal, antialgal, and antitermite bioactivities. J. Chem.

Ecol.2001; 27(11): 2263-73.

THAKUR, M.; MELZIG, M. F.; FUCHS, H.; WENG A. Chemistry and

pharmacology of saponins: special focus on cytotoxic properties. Botanics:

Targets and Therapy. 2011; 1:19–29.

The Plant List. http://www.theplantlist.org/1.1/browse/A/Sapotaceae/: acessado

em 24/02/2015.

TORRE-CUADROS, M. A.; ISLEBE, G. A. Traditional ecological knowledge and

use of vegetation in southeastern Mexico: a case study from Solferino, Quitana

Roo. Biodiversity and Conservation. 2003, 12:2455–2476.

TORRES-GURROLA, G.; DELGADO-LAMAS, G.; ESPINOSA-GARCÍA, F. J.

The foliar chemical profile of criollo avocado, PerseaAmericana var. drymifolia

(Lauraceae), and its relationship with the incidence of a gall-forming insect,

Triozaanceps (Triozidae). Biochem Syst Ecol. 2011; 39:102–111.

TREMACOLDI, C. R.; PASCHOLATI, S. F. Inibidor de tripsina em raízes de

Eucalyptus urophylla. Fitopatologia Brasileira. 2004; 29(2): 135-140.

TRENTIN, D. S.; GIORDANI, R. B.; ZIMMER, K. R.; SILVA, A. G.; SILVA, M.

V.; CORREIA, M. T. S.; BAUMVOL, I. J. R.; MACEDO, A. J. Potential of

medicinal plants from the Brazilian semiarid region (Caatinga) against

Staphylococcusepidermidis planktonic and biofilm lifestyles. Journal of


VAISHNAV, P.; DEMAIN, A.L. Unexpected applications of secondary

metabolites. Biotechnology Advances. 2011: 29(2): 223–229.

VAN-VUUREN, S. F.; VILJOEN, A. M. A comparative investigation of the

antimicrobial properties of indigenous South African aromatic plants with

popular commercially available essential oils.Journal of Essential Oil

Research. 2006; 18:66–71.

http://www.sciencedirect.com/science/journal/07349750


VAN-VUUREN, S. F.; VILJOEN, A. Plant-based antimicrobial studies —

methods and approaches to study the interaction between natural

products.Planta Medica. 2011; 77:1168–1182.

VANDAMME, E. J.; LANNOO, N.; PEUMANS, W. J. Plant lectins.Adv Bot

Res. 2008; 48:107–209.

VANDEBROEK, I.; CALEWAERT, J.; DE JONCKHEERE, S.; SANCA, S.;

SEMO, L.; VAN DAMME, P.; VAN PUYVELDE, L.; DE KIMPE, N. Use of

medicinal plants and pharmaceuticals by indigenous communities in the

Bolivian Andes and Amazon. Bulletin of the World Health Organization.

2004; 82(4):243–250.

VAZ, A.F.M.; COSTA, R.M.P.B.; MELO, A.M.M.A.; OLIVA, M.L.V.; SANTANA,

L.A.; SILVA-LUCCA, R.A.; COELHO, L.C.B.B.; CORREIA, M.T.S. Biocontrol

of Fusarium species by a novel lectin with low ecotoxicity isolated

from Sebastiania jacobinensis. Food Chemistry, 2010; 119: 1507–1513.

VERMA, R.K., VERMA, S.K. Phytochemical and termiticidal study of

Lantanacamaravar. aculeata leaves. Fitoterapia. 2006; 77(6):466–468.

VICKERS, C. E.; GERSHENZON, J.; LERDAU, M. T.; LORETO, F. A unified

mechanism of action for volatile isoprenoids in plant abiotic stress. Nat Chem

Biol. 2009; 5:283–291.

VIEGAS-Jr. C.; BOLZANI, C.; SILVA, V.; ELIEZER, J. Os produtos naturais e a

química medicinal moderna. Quimica Nova.2006; 29: 326-337.

VILLANUEVA, M.A. Elimination of artefacts on native Western blots arising from

endogenous lectin activity.Journal of Biochemical and Biophysical Methods.

2002; 50:141–149.

WAGACHA, J.M.; MUTHOMI, J. W.Fusarium culmorum: Infection process,

mechanisms of mycotoxin production and their role in pathogenesis in wheat.

Crop Protection. 2007; 26:877–885.


WENG, A.; BACHRAN, C.; FUCHS, H.; MELZIG, M. F. Soapwort saponins

trigger clathrin-mediated endocytosis of saporin, a type I ribosome-inactivating

protein. Chem Biol Interact. 2008; 176 (2–3): 204–211.

WINK, M. Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecular

perspective. Phytochemistry. 2003; 64:3–19.

WINK, M. Plant secondary metabolism: diversity, function and its

evolution.Natural Products Communications, 2008, 3:1205–1216.

WOJAKOWSKA, A.; PIASECKA, A.; GARCÍA-LÓPEZ, P.M.; ZAMORA-

NATERA, F.; KRAJEWSKI, P.; MARCZAK, Ł.; KACHLICKI, P.; STOBIECKI, M.

Structural analysis and profiling of phenolic secondary metabolites of Mexican

lupine species using LC–MS techniques. Phytochemistry. 2013; 92:71–86.

WONG, J.H.; NG, T.B. Isolation and characterization of a glucose/mannose-

specific lectin with stimulatory effect on nitric oxide production by macrophages

from the emperor banana.The International Journal of Biochemistry and

Cell Biology. 2006; 38:234–243.

XIA, L.; JUNYING, Z.; WENYUAN, G.; HAIYANG, W. Study on chemical

composition, anti-inflammatory and anti-microbial activities of extracts from

Chinese pear fruit (Pyrusbretschneideri Rehd.). Food and Chemical

Toxicology. 2012; 50: 3673–3679.

XU, R.; FAZIO, G. C.; MATSUDA, S. P. T. On the origins of triterpenoid skeletal

diversity. Phytochemistry. 2004; 65: 261-291.

YAN, Q.; JIANG, Z.; YANG, S.; DENG, W.; HAN, L. A novel homodimeric lectin

fromAstragalus mongholicus with antifungal activity.Archives of Biochemistry

and Biophysics. 2005; 442: 72–81.

YANG, T. L.; FANG, L.; SHAOJING, L.; XUN, X. Purification and

characterisation of a calcium-independent lectin (PjLec) from the haemolymph

of the shrimp Penaeus japonicas. Fish & Shellfish Immunology. 2007; 22:88–

97.


YONEKURA-SAKAKIBARA, K.; SAITO, K. Functional genomics for plant

natural product biosynthesis. Nat Prod Rep, 2009, 26:1466–1487.

ZHU, B. C. R.; HENDERSON, G.; ADAMS, R. P.; MAO, L.; YU, Y.; LAIN, R.A.

Repellency of vetiver oils from different biogenetic and geographical origins

against Formosan subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae).

Sociobiology. 2003; 42: 623–638.

ZUEST, T.; JOSEPH, B.; SHIMIZU, K. K.; KLIEBENSTEIN, D. J.; TURNBULL,

L. A. Using knockout mutants to reveal the growth costs of defensive traits.Proc

R Soc B-Biol Sci. 2011; 278: 2598–2603.


5. CAPITULO I

ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO

REVISTA:

Natural Product Reseach: Formerly Natural Product Letters

TÍTULO:

Screening of Caatinga Plants as Sources of Lectins and Trypsin Inhibitors

Publishednonline: 26, Mar, 2014.


SUPPLEMENTARY MATERIAL

Screening of Caatinga plants as sources of lectins and trypsin inhibitors

José Hélton Vasconcelos Arcoverdea, Aline de Souza Carvalho

a, Fernanda Pacífico de

Almeida Nevesa, Bianca Paiva Dionízio

a, Emmanuel Viana Pontual

a, Patrícia Maria

Guedes Paivaa, Thiago Henrique Napoleão

a,*, Maria Tereza dos Santos Correia, Márcia

Vanusa da Silva, and Maria das Graças Carneiro-da-Cunha

aDepartamento de Bioquímica, CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade

Universitária, 50670-420, Recife, Pernambuco, Brasil.

Abstract

Although it is one of the most threatened areas in the Earth, there are few studies on the

biotechnological potential of the Caatinga. This work evaluated 36 extracts from 27

Caatinga plants for lectin and trypsin inhibitor activities. The presence of lectin was

detected in 77.7% of samples by haemagglutinating assay. The highest values of

specific haemagglutinating activity were found to extracts of leaves from Mimosa

lewesii, Bauhinia acuruana and Manilkara rufula and of branches from Myracrodruon

urundeuva. Trypsin inhibitor activity was detected in 63.9% of the tested extracts being

strong inhibitory effect (> 70%) found in 11 samples. This work demonstrates that

Caatinga is a potential source of bioactive plant proteins that can be isolated and studied

for several applications. The biochemical prospecting of Caatinga is essential for

collection of bioactive principles so as to add conservation value to the region.

Keywords: biochemical prospecting; Caatinga; lectin; plant proteins; protease inhibitor.


1. Experimental

Plant material

The plants were collected at several sites in the Vale do Catimbau National Park

(PARNA do Catimbau) in Pernambuco, Brazil. Botanical specimens were identified at

the Herbarium of the Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), where a voucher for

each species was deposited. The species studied are listed in Table S1 with their

respective scientific names, common names in Portuguese, voucher numbers and uses.

Extracts and protein concentration

The aerial parts of plants (leaves, fruit), the bark of the stems and the roots were

dried in an oven at 45 °C for 2-3 days. The dry material was ground into powder using a

bench grinder. The powders were added to a 0.15 M NaCl solution at a ratio of 10%

(w/v), under constant and gentle agitation for 4 h, at 4 °C or 28 °C. The mixtures were

passed through filter paper and centrifuged (9,000 g, 4 °C, 10 min) and the supernatant

corresponded to extracts. The extracts were then assessed for protein concentration and

haemagglutinating and trypsin inhibitor activities. The estimation of protein

concentration was carried out according to Lowry et al. (1951), using a standard curve

of bovine serum albumin (BSA), with values between 31.25 and 500 g/ml.

Haemagglutinating activity

The presence of lectins was determined in microtiter plates (Paiva & Coelho

1992) using a 2.5% (v/v) suspension of rabbit erythrocytes treated with glutaraldehyde

(Bing et al. 1967). The haemagglutinating activity (HA) was determined by adding 50

L of 0.15 M NaCl in all wells and 50 L of the sample to be evaluated in the second

well of the horizontal row, with successive dilutions until 1:2048 and disregarding the

final 50 L. Then 50 L of the erythrocyte suspension were added to each well and the

plate left to stand for 45 min at 28 ºC. One haemagglutinating unit (titer-1

) was defined

as the reciprocal of the highest dilution of the sample promoting full agglutination of

erythrocytes. The specific HA corresponds to the ratio between titer and protein

concentration in mg/mL.


Trypsin inhibitor activity

The inhibition of trypsin activity was evaluated according to Pontual et al.

(2012) in microplates of 96 wells using 0.1 mg/mL of bovine trypsin in 0.1 M Tris-HCl

(pH 8.0), containing 0.02 M CaCl2. The bovine trypsin (5 μl) was incubated (5 min,

37°C) with the extract (50 μl) in Tris-HCl pH 8.0 (150 μl). Subsequently, the synthetic

substrate BApNA (N-benzoyl-arginine-ρ-nitroanilide), dissolved in dimethyl sulfoxide,

was added (5 μl) and the mixture was incubated (30 min, 37 °C). The hydrolysis of the

substrate was tracked by the measurement of absorbance at 405 nm. The inhibitory

activity was determined by remaining hydrolytic activity and inhibition percentages

were calculated as follows: % inhibition = 100 - [100 x (residual activity /activity in

control)]. Assays were performed in triplicate. Inhibition effect was ranked as low

(<30%), moderate (30-70%) and strong (>70%). Reaction blanks containing only

substrate and/or extract were also performed.

2. References

Agra MF, Baracho GS, Silva NK, Basílio IJLD, Coelho VPM. 2007a. Medicinal and

poisonous diversity of the flora of “Cariri Paraibano”, Brazil. Journal of

Ethnopharmacology 111:383–395.

Agra MF, Freitas PF, Barbosa-Filho JM. 2007b. Synopsis of the plants known as

medicinal and poisonous in Northeast of Brazil. Rev. Bras. Farmacogn. 17:114–

140.

Alves JJA, Nascimento SS. 2010. Levantamento fitogeográfico das plantas medicinais

nativas do cariri Paraibano. Rev. Geogr. Acadêmica 4:73-85.

Bing DH, Weyand JG, Stavinsky AB. 1967. Hemagglutination with aldehyde-fixed

erythrocytes for assay of antigens and antibodies. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.

124:1166-1170.

Braga R. 1976. Plantas do Nordeste, especialmente do Ceará. Mossoró: ESAM.

Ducke A. 1953. As leguminosas de Pernambuco e Paraíba. Mem. Inst. Oswaldo Cruz

51: 417-461

Ferraz JSF, Albuquerque UP, Meunier IMJ. 2006. Valor de uso e estrutura da vegetação

lenhosa às margens do riacho Navio, Floresta, PE, Brasil. Acta Bot. Bras. 20:125-

134.


Foroughbakhch R, Haudd LA, Maiti RK, Rodriguez M, Hernandez-Pinheiro J, Baddi

MH, Cespedes AE, Ponce-Moreno EE. 2000. Techniques of germination and

growth potential of some fuelwood species in Northeastern Mexico. Phyton 69:17-

22.

Leal IR, Vicente A, Tabarelli M. 2003. Ecologia e conservação da Caatinga. Editora

Universitária da UFPE. Herbivoria por caprinos na caatinga. p. 695-715.

Loiola MIB, Paterno GBC, Diniz JA, Calada JF, Oliveira ACP. 2010. Leguminosae e

seu potencial de uso em comunidades rurais de São Miguel do Gostoso – RN. Rev.

Caatinga 23:59-70.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. 1951. Protein measurement with the

Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.

Milano MS, Rizzi NE, Kaniaok VC. 2004. Princípios básicos de manejo e

administração de áreas silvestres. Curitiba: Departamento de Recursos Naturais

Renováveis, Instituto de Terras, Cartografia e Florestas.

Moraes LG, Alonso AM, Oliveira-Filho EC. 2011. Plantas medicinais no tratamento do

câncer: uma breve revisão de literatura. Universitas: Ciências da Saúde, 9:77-99.

Moreira DL, Guarim-Neto G. 2009. Usos múltiplos de plantas do cerrado: um estudo

etnobotânico na comunidade sítio Pindura, Rosário Oeste, Mato Grosso, Brasil.

Polibotánica 27:159-190.

Paiva PMG, Coelho LCBB. 1992. Purification and partial characterization of two lectin

isoforms from Cratylia mollis Mart (camaratu bean). Appl. Biochem. Biotechnol.

36:113–118.

Pereira SC, Gamarra-Rojas G, Lima M, Gallindo FAT. 2003. Plantas úteis do Nordeste

do Brasil. Recife: Centro Nordestino de Informações sobre Plantas/Associação

Plantas do Nordeste.

Pinos-Rodríguez JM, Aguirre-Rivera JR, Mellado M, García-López JC, Álvarez-

Fuentes G, Méndez-Villazana JC. 2007. Chemical and digestibility characteristics

of some woody species browsed by goats in Central Mexico. J. Appl. Animal Res.

32: 149-153.

Pontual EV, Napoleão TH, de Assis CR, Bezerra RS, Xavier HS, Navarro DMAF,

Coelho LCBB, Paiva PMG. 2012. Effect of Moringa oleifera flower extract on

larval trypsin and acethylcholinesterase activities in Aedes aegypti. Arch. Insect

Biochem. Physiol. 70:135-152.


Queiroz CRAA, Morais SAL, Nascimento EA. 2002. Caracterização dos taninos da

aroeira-preta (Myracrodruon urundeuva). Rev. Árvore 26:485-492.

Ramírez RG, González-Rodrígues H, Ramírez-Orduña R, Cerrillo-Soto MA, Juárez-

Reyes AS. 2006. Seasonal trends of macro and micro minerals in 10 browse species

that grow in northeastern Mexico. Animal Feed Sci. Technol. 128:155–164.

Salin TC. 2010. Caracterização de sistemas de produção no município de Ibimirim,

região semiárida de Pernambuco: as bases para o planejamento agroflorestal.

Recife: Universidade Federal Rural de Pernambuco.

Silva TMS, Lins ACS, Costa DA, Cavalcante JMS, Matias WN, Souza MFV, Filho RB.

2006. Constituintes químicos e atividade antioxidante de Sida galheirensis Ulbr.

(Malvaceae). Quim. Nova 29:1250-1254.

Silva VA, Andrade LHC. 2004. O significado cultural das espécies botânicas entre

indígenas de Pernambuco: o caso Xucuru. Biotemas 17:79-94.

Souza, M. A. 2011. Fitossociologia em áreas de caatinga e conhecimento etnobotânico

do murici (Byrsonima gardneriana A. Juss.), Semiárido Alagoano. Areia:

UFPB/CCA.

Tokarnia CH, Peixoto PV, Dobereiner L. 1994. Intoxicação experimental por

Piptadenia macrocarpa (Leg. Mimodoideae) em bovinos. Pesq. Vet. Bras. 14:57-

63.


Table S1. Species collected in the Vale do Catimbau National Park (Caatinga of Pernambuco).

Scientific name Common name (in

Brazil)

Voucher Ethnobotanical uses

Abarema cochliacapos ---- ----

Anadenanthera colubrina var. cebil Angico IPA 84.039 Timber, fuel, animal feed, human food, construction, veterinary

and technological use

Apuleia leiocarpa Garapa, grápia IPA 84.886 Timber, fuel, animal feed, ornamental use, reforestation

Bauhinia acuruana Mororó IPA 84.042 Timber, forrage, fuel

Buchenavia capitata Tanimbuca Landscaping

Byrsonima gardneriana Murici IPA 84.882 Fuel, veterinary use

Chamaecrista desvauxii Camponesa IPA 84.064 Fuel

Commiphora leptophloeos Amburana IPA 84.037 Timber

Dioclea grandiflora Mucunã-de-caroço IPA 84.057 Timber, animal feed, veterinary and medicinal use

Eugenia brejoensis Cutia IPA 84.033 ----

Harpochilus neesianus ----- IPA 84.879 -----

Hymenaea courbaril var. courbaril Jatobá IPA 84.888 Fuel

Ipomea brasiliana ---- IPA 84.883 ----

Jacaranda rugosa Jacarandá IPA 84.881 Landscaping

Manilkara rufula Maçaranduba IPA 84.889 Fuel, animal feed, veterinary use

Mimosa lewesii ---- IPA 84.053 ----


Myracrodruon urundeuva Aroeira preta IPA 84.059 Timber, fuel, animal feed, landscaping, veterinary & apicultural

use

Myroxylum peruiferum Cabreúva IPA 84.110 Timber, fuel, construction, perfume, ornamental use

Ouratea blanchetiana ----- IPA 84.044 -----

Parkinsonia aculeata Acácia, turco, junco IPA 84.113 Fuel, reforestation, landscaping, apicultual & ornamental use

Piptadenia viridiflora Espinheiro, icarapé IPA 84.058 Fuel, animal feed

Pityrocarpa moniliformis Canzenzo, quipembe IPA 84.048 Timber, forrage, animal feed, human food, apicultural & medicinal

use

Poincianella microphylla Catingueira IPA 84.880 Forrage, fuel, animal feed, human food, construction, medicinal &

technological use

Senna splendida Fedegoso grande IPA 84.040 Fuel

Sida galheirensis Malva branca IPA 84.078 Medicinal use

Sideroxylum obtusifolium Umbuzeiro, quixaba IPA 84.076 Timber, fuel, veterinary use

Stigmaphyllon paralias Amarelinho IPA 84.090 -----

References: Agra et al. 2007a,b; Ducke 1953; Braga 1976; Tokarnia et al. 1994; Queiroz et al. 2002; Leal et al. 2003; Pereira et al. 2003; Milano

et al. 2004; Silva et al. 2004; Foroughbakhch et al. 2005; Ferraz et al. 2006; Ramírez et al. 2006; Silva et al. 2006; Pinos-Rodríguez et al. 2007;

Moreira & Guarim-Neto 2009; Alves & Nascimento 2010; Loiola et al. 2010; Salin 2010; Moraes et al. 2011; Souza 2011.


6. CAPITULO II

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO

REVISTA:

Journal of Chemical Ecology

TÍTULO:

EVALUATION OF ANTIOXIDANT, ANTIBACTERIAL, DNA-PROTECTIVE

AND ANTI-TERMITE ACTIVITIES OF MANILKARARUFULA (MIQ.) H. J.

LAM. (SAPOTACEAE)


EVALUATION OF ANTIOXIDANT, ANTIBACTERIAL, DNA-PROTECTIVE

AND ANTI-TERMITE ACTIVITIES OF MANILKARA RUFULA (MIQ.) H. J.

LAM. (SAPOTACEAE)

1JOSÉ HELTON VASCONCELOS ARCOVERDE, 1RAIANA APOLINÁRIO DE

PAULA, 1MYCHELY SHEILA MELO, 1BARBARA DE AZEVEDO RAMOS,

1DANIEL RODRIGO DE ARAUJO, 2RAFAEL MATOS XIMENES,

1ALEXANDRE GOMES DA SILVA, , 1THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO,

1MÁRCIA VANUZA DA SILVA, 1MARIA TEREZA DOS SANTOS CORREIA,

1,2MARIA DAS GRAÇAS CARNEIRO-DA-CUNHA*

1Departamento de Bioquímica, CCB, Universidade Federal de Pernambuco,

Cidade Universitária, 50670-420 Recife, Pernambuco, Brazil.

2Laboratório de Biotecnologia, LIKA, Universidade Federal de Pernambuco,


3Departamento de Antibióticos, CCB, Universidade Federal de Pernambuco,


(*) Corresponding author: Phone: +55.81.21268547; Fax: +55.81.21268576

E-mail address: [email protected] (M.G. Carneiro-da-Cunha)

Abstract - Bioactive compounds are found in many plants and are known to

possess biological properties. Manilkara, which belongs to the family

Sapotaceae, contains species that are popularly used to treat various diseases.

The objective of this work was to evaluate the antioxidant, antibacterial, DNA-

protective and anti-termite activities of organic extracts prepared from the

leaves of M. rufula, which were extracted in an eluotropic series with the

solvents chloroform, ethyl acetate and methanol. The phytochemical profile

obtained from the extracts was traced using thin-layer chromatography and

some compounds were observed, which were mostly phenolic derivatives, such

as tannins and flavonoids. The extracts prepared with ethyl acetate and

methanol showed significant antioxidant activity, in vitro, which was detected

using DPPH and phosphomolybdenum methods. These extracts also


contained high concentrations of phenolic compounds and flavonoids, had

DNA-protective activity, and were shown to be effective antimicrobial agents

that acted against some strains of Gram-negative and Gram-positive bacteria.

The three extracts also exhibited termiticide activity and eliminated 100% of the

insects within 48 hours. This is the first study that shows M. rufula is a valuable

plant species with biotechnological potential, making it a promising source of

new biological compounds.

Keywords- bioactive compounds – antioxidant – DNA nicking - termiticide.

INTRODUCTION

Plants are a focus in many fields of study, mainly because they present

diverse pharmacological activities and have been used for therapeutic purposes

by many traditional societies for a long period of time (Sittiwet and

Puangpronpitag 2009). Actually, studies have shown that pure natural

compounds and standardized plant extracts offer numerous opportunities to

develop new drugs with biotechnological potential (Aswathanarayan and Vittal

2013; Mendez et al. 2012).

Reactive oxygen species (ROS), a subproduct of the normal metabolism,

have aroused great interest over the last few decades due to their involvement

in pathologies. ROS can be produced in cells as a response to various factors,

for example, chemical agents and radiation. Oxidative stress can promote DNA

damage, inhibiting cellular functions and the peroxidation of lipids and proteins,

contributing to the development of sicknesses, such as cancer, diabetes,

arteriosclerosis, inflammation problems and premature aging (Dakah et al.

2014). Polyphenols found in many plants are reported to have good antioxidant

properties and protect against cell damage caused by ROS. In recent years,

there has been a growing interest in identifying scavengers of free radicals and

antioxidants that specifically inhibit ROS actions in cellular genetic material

(Girish et al. 2012).

The rising prevalence of multidrug resistance in pathogenic

microorganisms and the undesirable side effects of certain antibiotics have


further increased an interest in searching for new antimicrobial drugs that

originate from plants. This is because one of the various ways plants defend

themselves against pathogenic microorganisms is the production of bioactive

molecules (Hossain et al. 2011).

The family Sapotaceae has a tropical and subtropical distribution and

includes approximately 50 genera and 1000 species of trees and shrubs. In

Brazil there are 200 species within 14 genera of Sapotaceae, such as

Chrysophyllum, Manilkara, Micropholis, Pouteria, Pradosiaos and Sideroxylon

(Almeida-Junior 2010). Chemically, species of this family are characterized by

having various classes of substances, for example, saponins, flavonoids,

polyphenols, triterpenes, carotenoids, steroids, fatty acids and tannins;

scientifically, these compounds have already been shown to have diverse

biological activities (Barbosa-Filho et al. 2008; Kushima 2005; Montenegro et al.

2006). Some species of Manilkara, have been popularly used as medicinal

plants to heal wounds and to treat various illnesses, such as inflammation,

fever, postpartum hemorrhages and, upset stomachs. In vitro, species of this

genus have shown antimicrobial, anti-parasitic, anti-tumor and antioxidant

activity (Fernandes et al. 2011). Manilkara rufula, also known as maçaranduba,

is used by some traditional communities to treat stomach problems, as an

antipyretic, to heal wounds and to control worm infestations.

There is a continuous necessity to search for new species of plants that

have biotechnological potential. The objective of this work was to evaluate the

antioxidant, antimicrobial, DNA-protective and anti-termite activities of organic

extracts prepared from the leaves of Manilkara rufula, which were extracted in

an eluotropic series with the solvents chloroform, ethyl acetate and methanol.

METHODS AND MATERIALS

Collection of Plant Material. Leaves of M. rufula, free of diseases, were

collected in an area of Parque Nacional do Catimbau (PARNA do Catimbau),

northeastern Brazil, in January (dry season) and June (rainy season) of 2012.

Voucher specimens were identified and deposited in the herbarium at the

Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) under the numbers 86769 and


86770. The collected leaves were dried in a dryer at 37ºC for 72h. The dried

material was ground and stored at 4°C until use.

Organic Extracts. The extracts, from the powder of the leaves of M. rufula, were

made in a Soxhlet apparatus using organic solvents, chloroform (CHCl3), ethyl

acetate (AcOEt) and methanol (MeOH), in an eluotropic series. One hundred

grams of the sample was packed in muslin cloth and used for the extraction at a

temperature below the boiling point of each solvent. All of the samples were

submitted to reflux until saturation (24 h). After this period, the extracts were

filtered through Whatman filter paper (nº 1). In all cases, the solvents were

removed until the organic extracts were dry, separately concentrated using a

rotary evaporator at 45°C under reduced pressure, and stored at -10 ºC. The

concentrated residue was dissolved in sterilized dimethyl sulfoxide (DMSO-

1:9), methanol (PA) or NaCl (0.15 M) when necessary. The extracts were

filtered with a 0.22µm filter (type GV Millipore) and used for the study

Phytochemical Screening. To determine the phytochemical compounds present

in the extracts, standard reference assays were developed. The identification of

flavonoid aglycone, flavonoid heterosides, cinnamic derivatives and alkaloids

was made according to Wagner and Bladt (1996); mono and sesquiterpenes,

triterpenes and steroids according to Harborne (1998); and condensed

proanthocyanidins and leucoanthocyanidins according to Roberts et al. (1957).

Assays of Antioxidant Activity

Scavenging activity of the radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH).

Antioxidant activity was determined from the reactions of scavenging the stable

radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) by the molecular components

present in the extracts of M. rufula; the methodology was based on Blois (1958).

A methanol solution of DPPH (20 mg/ml) was prepared and its concentration

adjusted for an absorbance between 0.6 and 0.7 at 517nm. A 250μl aliquot of

this solution was mixed with 40μl of different concentrations of the extracts (10,

25, 50, 100, 200, 300 and 400 µg /ml dissolved in methanol) and the

absorbance was read after thirty minutes. Quercetin and ascorbic acid were

used as reference compounds for the assay. The tests were performed in

triplicate.

The radical scavenging of DPPH was calculated by the following formula:

Scavenged [DPPH](%) = (Abs sample Abs control)Abs control x 100


Total Antioxidant Activity. The total antioxidant activity (TAA) was evaluated

based on the method used by Pietro et al. (1999). An aliquot (100 µL) of the

sample in methanol (1mg/mL) was added to 1000 µL of phosphomolybdenum

(600 mM of sulfuric acid, 28 mM of sodium phosphate and 4 mM of ammonium

molybdate) and incubated in a water bath (bain-marie) at 95°C for 90 minutes.

The same procedure was used to prepare the control, which was a methanol

and phosphomolybdenum solution. After cooling to 25°C, the absorbance of

the samples was measured at 695 nm. The test was performed in triplicate and

the total antioxidant activity was expressed in relation to the ascorbic acid and

calculated by the following formula:

TAA%=(Aa – Ac)(Aaa – Ac) x 100

Where: Ac=Absorbance of the control, Aa=Absorbance of the sample,

Aaa=Absorbance of the ascorbic acid.

Dosage of Phenolic Compounds. The total phenolic content was determined by

the Folin-Ciocalteu method according to McDonald et al. (2001). The extracts

were adjusted to a concentration of 1 mg/ml in methanol, and 900 µL of distilled

water, 100 µL of the sample and 500 µL of the Folin-Ciocalteu reagent (1:10)

were added to each sample tube. After 10 minutes in the dark, 2.5 ml of 7.5%

sodium carbonate was added and left for 20 more minutes in the dark at room

temperature (25 ± 2°C). After this period the absorbance of the samples, at

765nm, was read against white. A curve of the calibration pattern was prepared

using gallic acid dissolved in methanol and the following linear equation was

found: y=0.023x + 0.62, r²= 0.995. The concentration of total phenol in the

sample was determined from this curve. The total phenol in the extract was

expressed in terms of the equivalent of gallic acid (GAE mg/g of extract).

Dosage of Flavonoids. Determining the flavonoids was based on the

methodology described by Woisky and Salatino (1998), with modifications. The

results were expressed as quercetin equivalents (EQ) per milligram of sample.

The extracts were prepared at 1mg/mL.


DNA Nicking Assay. The DNA nicking assay was performed using pBR 322

plasmid DNA. The reaction mixture contained 0.3 µL of plasmid DNA, 10 µL of

Fenton’s reagent (30 mM H2O2, 50 mM ascorbic acid, and 80 mM FeCl3)

followed by the addition of extracts. The final volume of the mixture was brought

up to 25 µL using distilled water. The mixture was then incubated for 30 min at

37 °C and the DNA was analyzed on 1% agarose gel (prepared by dissolving 1

g of agarose in 100 mL of 0.5 x TBE Buffer) (Kaur et al. 2008). The

measurement of DNA damage protection was analyzed by Total Lab Quant.

Antibacterial activity

Determination of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum

Bactericidal Concentration (MBC). The bacteria was provided in nutrient agar

(DifcoTM) by the Departamento de Antibióticos (DA) at the Universidade Federal

de Pernambuco (UFPE), Brazil, and stored at 4°C. The Gram-positive strains

were Staphylococcus aureus (UFPEDA-02), Micrococcus luteus (UFPEDA-100)

and Bacillus subtilis (UFPEDA-86), and the Gram-negative strains were

Pseudomonas aeruginosa (UFPEDA-416), Escherichia coli (UFPEDA-224) and

Klebsiella pneumoniae (UFPEDA-396). The bacteria were cultivated in nutrient

broth (DifcoTM) in 250 ml, shaken bottles, and incubated overnight in an orbital

agitator at 100 rpm and 37°C. The cellular concentration was determined by

measuring the turbidity of the suspension using calibration curves (turbidity

equivalent to 0.5 on the MacFarland scale).

The susceptibility tests for determining the minimum inhibitory

concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were

performed using CLSI (2011). The bacteria were cultivated for 24 hours at

37oC. The extracts were dissolved in 10% DMSO and the dilutions were

prepared in microtiter plates with 96 wells containing culture medium; final

concentrations varied from 0.190 to 50 mg/ml. Posteriorly, 20 µl of the bacterial

suspension was inoculated in the microplate and the tests were carried out

using a final volume of 200 µl. The plates were incubated at 37°C for 24 hours.

Chloramphenicol was used as a positive control. Cell viability was observed

using Resazurin solution (0.01%) and was indicated by a change in color.

Changes from pink to purple were considered to have bacterial growth. For

each extract corresponding to the lowest concentrations tested, which did not


change color after macroscopic evaluation, the MIC was determined and

expressed in mg/mL. Using the results of the MIC test, the concentrations that

were shown to be completely absent of bacterial growth were identified and 10

µl of each culture was transferred to Petri plates containing Mueller-Hinton agar

and incubated for 24 h at 37°C to determine the MBC. The lowest sample

concentration, where there was no growth on the agar surface, was defined as

the MBC.

Anti-termite Activity

Insects. A colony of Nasutitermes corniger was collected from an area of

Atlantic Forest located on the campus of the Universidade Federal Rural de

Pernambuco, Brazil. The termite colony was selected according to overall

integrity criteria. The nest was carefully removed from the trunk of a tree using a

machete and then transferred to the laboratory. The colony was maintained at

28 ± 2°C (70 ± 5% relative humidity) in the dark for 6 h and subsequently used

in the bioassays.

Termiticidal Assay. Termiticidal activity was evaluated by a no-choice bioassay

based on the method described by Kang et al. (1990). Each experimental unit

consisted of a Petri dish (90 x 15 mm, TPP-Techno Plastic Products,

Trasadingen, Switzerland) with the bottom covered with filter paper. A filter

paper disk (4 cm in diameter) impregnated with 200ml of sample in 0.15 M NaCl

was put in each dish. Termiticidal activity was evaluated for the organic extracts

made from the leaves M. rufula with chloroform, ethyl acetate and methanol

(2.5, 5 and 10 mg/ml of extract). For the negative controls, the filter paper was

impregnated with 0.15 M NaCl. A total of 20 active termites (at a worker-to-

soldier ratio of 4:1) were transferred to each dish; these were maintained at

28°C in the dark. Insect survival was evaluated daily until all insects were dead.

Bioassays were carried out in four replicates for each concentration and survival

rates (as percentages) were obtained for each treatment.

Statistical Analysis. Each experiment was performed at least three times and

results are presented as the mean ± SD. The statistical analysis was performed

using the Student’s t-test. Differences were considered significant at p< 0.05.

The concentration needed for 50% inhibition (IC50) was estimated graphically by

a linear regression analysis.


RESULTS

Extracts and Phytochemical Screening. The extracts obtained with the

chloroform, ethyl acetate and methanol solvents yielded 3.71%, 2.35%

and15.71% (p/p respectively) of dry weight in relation to the powder of the

leaves (100g) used to prepare the extracts.

The phytochemical analyses using M. rufula revealed the presence of

cyanogenic heterosides, phenolic compounds (flavonoids and tannins),

triterpenes and steroids; alkaloids, cinnamic derivatives and saponins were not

observed (Table 1).

Table 1: Phytochemical profile obtained by thin layer chromatography (TLC) of chloroform, ethyl acetate and methanol extracts prepared from the leaves of M. rufula.

Presence (+) or absence (-) of compound. Visualization of a band with low color intensity (+), intermediate intensity (++) and high intensity (+++) using TLC.

Scavenging of the DPPH Radical. The molecule DPPH (2,2-diphenyl-

picrilidrazil) is characterized as a free radical that possesses the ability to

donate a free electron to an antioxidant molecule, making it stable. This transfer

causes the reagent to lose its purple color (Md, et al., 2013) and the degree of

discoloration indicates the antioxidant potential of the sample. In this study, the

extracts of Manilkara rufula exhibited a high degree of scavenging of the DPPH

radical compared to the controls used (quercetin and ascorbic acid).

Class of secondary metabolites Manilkara rufula

Leaves

Cyanogenic heterosides +

CHCl3 AcOEt MeOH

Flavonoids (aglycones) - + +

Flavonoids ( heterosides) - ++ ++

Cinnamic derivatives - - -

Triterpenes +++ ++ -

Steroids +++ ++ -

Monoterpenes and Sesquiterpenes - - -

Alkaloids - - -

Condensed proanthocyanidins and leucoanthocyanidins

- + (monomers) ++ (condensates)


Of the three organic extracts tested, two (AcOEt and MeOH) decolorized

the DPPH reagent at concentrations of 84.15 µg/ml and 42.93 µg/ml,

respectively, and the potential to eliminate free radicals was in the following

order: extract MeOH > AcOEt > CHCl3 (Table 2). These results show that

Manilkara rufula is an important source of bioactive compounds with antioxidant

potential.

Table 2: Concentrations (µg/ml) of the MeOH, AcOEt and CHCl3 extracts, from the leaves of M. rufula, able to scavenge 50% of the free radicals of DPPH.

IC50 Values Confidence interval

CONTROLS

Quercetin >10

Ascorbic Acid 26.93 26.14 - 27.75

EXTRACTS

Chloroform <400

Ethyl acetate 84.15 71.26 - 99.37

Methanol 42.93 38.61 - 47.72

The extract CHCl3 did not present satisfactory activity. The highest

concentration only scavenged 6.637% of the free radical. This low antioxidant

action could be related to the absence of phenolic compounds in this fraction.

The AcOEt and MeOH extracts showed better results, at concentrations of

200 µg/ml, and scavenged 84.37% and 84.01% of the DPPH, respectively. For

the highest concentration tested (400 µg/ml) the free radical scavenging activity

was 86.358% and 84.145%, respectively. As seen in figure 1, at 200 µg/ml and

above there was little variation in the antioxidant power of the extracts from M.

rufula, and the scavenging power was as high as the controls used.

Total Antioxidant Activity. The results show that the total antioxidant activities of

the CHCl3, AcOEt and MeOH fractions were 35.78% (± 2.15), 40.80% (± 1.84)

and 76.25% (± 1.08), respectively, when compared to the ascorbic acid

compound that was considered to have 100% antioxidant capacity. Even

though the fraction obtained from the chloroform did not present satisfactory


antioxidant activity for the DPPH assay, it did show 35.78% (± 2.15) anti-radical

activity for the same method of analysis.

Total Phenols and Flavonoids. Among the three extracts, MeOH showed the

highest quantity of phenolic compounds (79.913 ± 0.86 mg EAG / g), followed

by AcOEt (73.493 ± 1.19 mg EAG / g). The high quantity of phenolic

compounds could be related to the high antioxidant activity that was

demonstrated in this study. The fraction obtained with CHCl3 did not reveal the

presence of phenolic compounds, which could be related to its low antioxidant

activity.

The amount of flavonoids found in this study showed that the highest

concentration of this metabolite was present in the AcOEt extract (56.03 ± 0.03

mg EQ/mg), followed by MeOH (72.23 ± 0.04 mg EQ/mg). In the CHCl3 extract,

a low concentration of flavonoids was found (5.30 ± 0.02 mg EQ/mg), which

justifies the failure to detect these compounds in the TLC assay for that fraction.

DNA Nicking Assay. In the DNA protection assay, with exception to the

methanol fraction, it was possible to observe that the extracts prepared from the

leaves of M. rufula offered protection against damage to the supercoiled

plasmid pBR322 DNA, induced by the hydroxyl radical present in Fenton’s

reagent (Figure 1). In this test the activity of the fractions obtained from CHCl3,

AcOEt and MeOH was evaluated by the degree of protection to prevent the

degradation of the DNA. Figure 3 shows the protective activity of the extracts

evaluated. Different concentrations were analyzed and the CHCl3 and AcOEt

extracts at 125 µ/mL reduced the damage caused to the DNA by the hydroxyl

radical from the reagent. The MeOH fraction showed no protective activity, even

at a concentration of 250 µ/mL, because all of the DNA was degraded.

Figurea 1: Protective effects of different extracts in the DNA nicking assay. (A) Lane 1: negative control (distilled water + DNA), (B) Lane 2: control (DNA + Fenton’s reagent), (C) Lane 3-5: AcOEt (125 µg/mL) + Fenton’s reagent, (D) Lane 6-8: CHCl3 (125 µg/mL) + Fenton’s reagent, (E) Lane 9-11: MeOH (125 µg/mL) + Fenton’s reagent.


Antibacterial Activity. The three extracts prepared from the leaves of M. rufula

were evaluated for their antimicrobial activity against different strains of

bacteria. The best results obtained were with the methanol and ethyl acetate

extracts. The extract prepared with ethyl acetate showed inhibitory activity

against one of the strains tested, Micrococus luteus (MIC 0.78 mg/mL).

However, the methanol extract stood out for showing inhibitory activity against

four of the six strains analyzed (Table 3). The chloroform extract did not

promote growth inhibition for the pathogens tested.

Termiticide Activity. In the present study, the organic extracts from the leaves of

M. rufula, prepared with chloroform, ethyl acetate and methanol, were evaluated

for their termiticide potential against workers and soldiers of N. corniger. All of

the extracts, at concentrations of 2.5, 5 and 10 mg/mL, exhibited significant (p <

0.05) termiticide activity against the workers compared with the negative control

(Figure 2-A,B,C), and all of the termites were dead after 48 hours of exposure to

the extracts. However, the extracts did not exhibit activity against the soldiers.


Table 3: Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) obtained with the organic extracts from the leaves of M. rufula.

Bacteria Extracts

MIC (mg/ml) MBC (mg/ml)

Chloramphenicol (µg/mL)

CLO ACE MET CLO ACE MET

S. aureus – UFPEDA-02 3.125 ND 25 3.125 - > 25 ND

M. luteus - UFPEDA-100 0.781 ND 0.78 0.78 - 3.12 3.12

B. subtillis- UFPEDA-86 1.562 ND 12.5 12.5 - ND 25.0

E. coli – UFPEDA-224 0.781 ND 25.0 3.125 - > 25 >12.5

K. pneumonieae – UFPEDA-396 1.562 ND 12.5 3.125 - 12.5 6.25

P. aeruginosa – UFPEDA-416 6.250 ND 25.0 - - 25.0 -

CLO: chloroform extract; ACE: ethyl acetate extract; MET: methanol extract. ND: not detected.


Figure 2: Termiticide activity of the chloroform (A), ethyl acetate (B) and methanol (C) extracts prepared from the leaves of M. rufula.

DISCUSSION

In this study the highest yielding extract, in relation to the leaf, was produced

with the methanol solvent. These data corroborate a study by Hossain et al.

(2011), which reported that yields of an extracted compound are higher when

using methanol compared to other solvents, such as chloroform, ethyl acetate

and hexane.

The results of this work show that the leaves of M. rufula possess

metabolites with high antioxidant activity, compared to the controls, which might

be the result of elevated levels of phenolic and flavonoid compounds present in

the extracts prepared with ethyl acetate and methanol. Studies that evaluated

the chemical composition of some representative of the genus Manilkara

showed the presence of triterpenes, saponins and flavonoids in leaves and

roots (Oliveira et al. 2014). Works have conclusively shown a direct relation

between the content of phenolic compounds and antioxidant activity of some


plants. Thus, the chemical composition found in an active extract is an

important factor governing the efficacy of natural antioxidants (Hossain et al.

2011; Shah and Hossain 2014). For some plants, the presence of

phytoconstituents (such as, terpenoids, steroids, flavonoids, tannins and

glycosides) has been reported to be responsible for anti-inflammatory and

antipyretic properties (Adjene et al. 2012; Mulla et al. 2010).

The antioxidant activity of the extracts made with ethyl acetate and

methanol could be related to the extraction power these solvents have on

phenolic compounds, as well as to the number of hydroxyl groups and the

structural conformation that these phenols might have in the sample (Alves et

al. 2010). According to Medini et al. (2014), extracts prepared with nonpolar

solvents, such as hexane, have lower anti-free radical activity, whereas those

prepared with more polar solvents, such as methanol, have higher activity

against these radicals. According to Medini et al. (2014), plants contain a high

variation of compounds with antioxidant capacity, but this is difficult to measure

separately for each compound. This study shows for the first time the anti-free

radical action, in vitro, of organic extracts prepared from the leaves of M. rufula.

This finding corroborates a study by Kaneria et al. (2009) that focused on a

species in the same genus (M. zapota) and found that the methanol extract

from the leaves was also rich in phenolic content and had good scavenging

activity of DPPH free radicals.

The highest antioxidant activity evaluated by the phosphomolybdenum

method, among the extracts prepared with the leaves of M. rufula, was obtained

from the MeOH fraction. Likewise, Uma et al. (2011) observed that methanol

extracts exhibited a higher potential for all antioxidant trials when compared to

an ethanol extract and acetone for the green microalgae Desmococcus

olivaceous and Chiorococcum humicola. In our work it was observed that the

chloroform extract also presented antioxidant activity for this method; this

activity was not detected by the DPPH method. Chanda and Nagani (2010)

showed there was no relation between the extracts of leaves of Manilkara

zapota, prepared with different solvents, and their antioxidant activity. These

results agree with those of Baravalia et al. (2009) and Gholivand et al. (2010),

which affirmed that, in general, plants with a higher content of phenolic

compounds exhibit good antioxidant activity, since it is known that there is a


direct correlation between the amount of total phenols and such activity.

According to the present results it is possible to conclude that the extracts from

the same plant, prepared with different solvents, show distinct levels of

antioxidant activity. It is essential to perform more than one test to evaluate the

antioxidant potential of a plant species since each solvent is capable of

extracting different phytoconstituents.

As with the phenolic compounds, the presence of high concentrations of

flavonoids in the AcOEt and MeOH extracts, as well as the low quantity in the

CHCl3 fraction, can influence their antioxidant potential. According to Sousa et

al. (2007), phenolic compounds are stable mainly because of the resonance of

the aromatic rings present in these structures and, thus, antioxidant activity is

related to the reducing properties and chemical structure of these compounds,

and plays an important role in the neutralization or scavenging of free radicals

and chelation of transition metals acting on the oxidation process. Flavonoides,

present in the extracts analyzed here, are considered one of the most common

groups of natural components encountered in plants and are involved in various

biological actions (Suhartono et al. 2012). Already, it is known that flavonoids

and phenolic acids, such as rutin, quercetin, luteolin, gallic acid and caffeic acid,

can produce significant antioxidant activity (Li et al. 2012).

The results of this study showed that the CHCl3 and AcOEt fractions were

capable of impeding the degradation of the supercoiled plasmid pBR322 DNA.

Hydroxyl radicals are highly reactive, can form in all biological systems, have

been characterized has highly harmful, are involved in some pathologies, and

can cause damage to almost all types of molecules found in living cells

(Hochestein and Atallah 1988). ROS have the ability to break DNA molecules,

which can contribute to carcinogenesis and mutagenesis (Babu et al. 2001),

and in the human body there is no specific enzyme defense against these

agents. For this reason, the discovery of compounds capable of eliminating

hydroxyl radicals is of critical importance for the prevention of some diseases

induced by oxidative stress (Zhou et al. 2010). Polyphenols are compounds

capable of chelating active ions of iron and make them inert, and, consequently,

they are not involved in Fenton’s reaction (Walia et al. 2009); in this case, the

presence of these metabolites in the extracts is involved in inhibiting DNA

damage.


Previous studies have demonstrated that triterpenoids and flavonoid

compounds exhibit significant antimicrobial activity against Gram-positive

bacteria, such as S. aureus (Li et al. 2012). These data reinforce our results

since flavonoids were also present in the methanol extract, which had inhibitory

action against S. aureus.

Patel and Rao (2012) studied various plant species belonging to the

family Sapotaceae. They showed that methanol extracts, among various others

tested, had the best antibacterial activity because this solvent is capable of

extracting compounds that exhibit antibacterial action as some phenolic

derivatives. The same authors also pointed out that extracts from the fruits of

Manilkara hexandra, prepared with acetone and methanol, presented significant

antibacterial activity against Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Escherichia coli

and Salmonella paratyphi. In the same way, Chanda and Parekh (2012)

showed in a study with extracts prepared from the leaves M. hexandra that

there was high antimicrobial activity against different species of bacteria.

Another study conducted with M. zapota, in vitro, showed its leaves and bark

possess antimicrobial and antioxidant activity (Kaneria et al. 2009).

Antimicrobial activity assays of aqueous and ethanol extracts from the

stem of M. zapota used against different strains bacteria revealed that the

ethanol fraction showed activity against various species of bacteria, such as S.

aureus, S. epidermides, B. subtilis, P. aeruginosa, P. vulgeris, K. pneumoniae,

E. coli, Salmonela typhimurium, Proteus vulgaris, P. mirabilis and Micrococcus

flavus (Nair and Chanda 2008).

Natural products derived from extracts of plants have been tested in

programs to discover new insecticide agents that control termites but do not

damage the environment. Some of the natural products tested are vulgarone B

(isolated from Artemisia douglasiana), apiol (from Ligusticum hultenii) and cnicin

(from Centaurea maculosa), which killed species of the termite Coptotermes

formosanus (Meepagala et al. 2006). Cantrell et al. (2007) showed that

compounds isolated from plants present significant termiticide activity, which

was observed by the reduction in the consumption of filter paper used in the

trials and by the death of the insects.

In our study, the presence of flavonoids was detected ethyl acetate and

methanol extracts and triterpenos were detected in the chloroform extract


(among others), and all of the termiticide agents were effective, killing 100% of

the termites within 48h. Alkaloids, monoterpenoids, toxic hydrocarbons

(Cornelius et al. 1997), flavonoids and related compounds obtained from plants

are toxic against ants and termites (Boue and Raina 2003; Ohmura et al.,

2000). A methanol extract from the leaves of Detarium microcarpum possessed

strong anti-termite activity (Lajide et al. 1995). Fractions made with hexane,

diethyl ether and ethanol, from the leaves of Flourensia cernua, exhibited high

termiticide activity; the majority of the hexane fraction was monoterpenoids and

the majority of the ethanol fraction was sesquiterpenoids (Tellez et al. 2001).

Verma and Verma (2006) reported that extracts of 5% chloroform, from the

leaves of Lantana camara, presented significant termiticide activity. It is worth

mentioning that this is the first study developed with M. rufula, where organic

extracts prepared from the leaves of this species were evaluated for there

antimicrobial and anti-termite potential.

The organic extracts from the leaves of M. rufula, prepared with the ethyl

acetate and methanol solvents, showed antioxidant activity and were effective

antimicrobial agents that acted against Gram-positive and Gram-negative

bacteria. The three organic extracts prepared from the leaves of M. rufula

presented termiticide activity against Nasutitermes corniger workers. This is the

first study that demonstrates the biological potential of Manilkara rufula, and

revealed that the leaves of this plant can be a good source of bioactive compounds. Future

studies are necessary to isolate and identify the compounds responsible for the activities

detected

ACKNOWLEDGMENTS

The author José Helton V. Arcoverde is recipient of a scholarship

from Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco

(FACEPE). The authors express their gratitude to the Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for research grants and

fellowship (MTSC and MGCC) and by financial support. Rede NanoBiotec,

Núcleo de Bioprospecção da Caatinga/ INSA, as well as IcmBio for the

authorization to collect in Parque Nacional do Catimbau (16.888 Sisbio).


REFERENCES

Adjene JO, Agbongiasede MO, Igbigbi PS (2012) Effects of chronic

administration of aqueous Alchornea cordifolialeaf on the kidney of adult wistar

rats. Anat J Afr. Res 1: 50-56.

Almeida-Júnior EB (2010) Diversidade de Manilkara Adans. (Sapotaceae) para

o Nordeste do Brasil. Tese (Doutorado em Botânica), Universidade Federal

Rural de Pernambuco. Departamento de Botânica, pp 157.

Alves CQ, David JM, David JP, Bahia MV, Aguiar M (2010) Métodos para

determinação de atividade antioxidante in vitro em substratos orgânicos.

Química Nova 33: 2202-2210.

Aswathanarayan JB, Vittal RR (2013) In vitro evaluation of antioxidant and

antibacterial activities ofRotula aquatica and Ancistrocladus heyneanus:

Antioxidant and antimicrobial activity of medicinal plants. Journal of Pharmacy

Research 6: 313–317.

Babu BH, Shylesh BS, Padikkala J (2001) Antioxidant and hepatoprotective

effect of Alanthus icicifocus. Fitoterapia 72:272–277.

Baravalia Y, Kaneria M, Vaghasiya Y, Parekh J, Chanda S (2009) Antioxidant

and antibacterial activity of Diospyros ebenum Roxb. leaf extracts. Turk J Biol

33:159-164.

Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz ACA, Sena-Filho JG,

Athaide-Filho PF, Silva MS, Souza MFV, Da-Cunha EVL (2008) Sources of

alpha-, beta-, gamma, delta- and epsilon-carotenes: A twentieth century review.

Revista brasileira de Farmacognosia 18:135-154.

Blois MS (1958) Antioxidant determinations by the use of a stable free radical.

Nature Res 181:1199-1200.

Boue SM, Raina AK (2003) Effects of plant flavonoids on fecundity, survival,

and feeding of the Formosan subterranean termite. J Chem Ecol 29:2575–

2584.

Cantrell CL, Duke SO, Fronczek FR, Osbrink WL, Mamonov LK, Vassilyev JI,

Wedge DE, Dayan FE (2007) Phytotoxic Eremophilanes fromLigularia macro-

phylla. J Agric Food Chem 55:10656–10663.

Chanda SV, Nagani KV (2010) Antioxidant Capacity of Manilkara zapota L.

Leaves Extracts Evaluated by Four in vitroMethods. Nature and Science 8:260-

266.

Chanda S, Parekh J (2012) Assessment of Antimicrobial Potential of Manilkara

hexandra. Leaf. Phcog J Res 2:448–455.


Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2011) Performance

standards for antimicrobial susceptibility testing. Twenty-first informational

supplement. CLSI.M100-S21.

Cornelius ML, Grace JK, Yates JR, (1997) Toxicity of monoterpenoids and other

natural products to the formosan subterranean termite (Isoptera: Rhinotermi-

tidae). J Econ Entomol 87:705–708.

Dakah A. et al. (2014) In vitro propagation of the medicinal plant Ziziphora

tenuior L. and evaluation of its antioxidant activity. Saudi Journal of Biological

Sciences 21:317- 323.

Fernandes CP, Correa AL, Cruz RAS et al. (2011) Anticholinesterasic activity of

Manilkara subsericea (Mart.) Dubardt riterpenes. Latin American Journal of

Pharmacy 30:1631–1634.

Gholivand MB, Nasrabadi MR, Batooli H, Ebrahimabadi AH (2010) Chemical

composition and antioxidant activities of essential oil and methanol extracts of

Psammogeon canescens. Food Chem Toxicol 48:24-28.

Girish TK, Vasudevaraju P, Ummiti JS, Rao P (2012) Protection of DNA and

erythrocytes from free radical induced oxidative damage by black gram (Vigna

mungo L.) husk extract. Food and Chemical Toxicology 50:1690–1696.

Harborne JB (1998) Phytochemical Methods. 3 (ed) Londres Chapman & Hall

1998.

Hochestein P, Atallah AS (1988) The nature of oxidant and antioxidant systems

in the inhibition of mutation and cancer. Mutat Res 202:363–375.

Hossain MA, Shah MD, Gnanaraj C, Iqbal M (2011) In vitro total phenolics,

flavonoids contents and antioxidant activity of essential oil, various organic

extracts from the leaves of tropical medicinal plant Tetrastigma from Sabah.

Asian Pacific Journal of Tropical 4: 717–721

Kaneria M, Baravalia Y, Vaghasiya Y, Chanda S (2009) Determination of

antibacterial and antioxidant potential of some medicinal plants from Saurashtra

region. India. Indian J Pharma Sci Res 71:406-412.

Kang HY, Matsushima N, Sameshima K, Takamura N (1990) Termite

resistance tests of hardwoods of Kochi growth. The strong termiticidal activity of

kagonoki (Litsea coreana Léveillé). Mokuzai Gakkaishi 36:78-84.

Kaur R, Arora S, Singh B (2008) Antioxidant activity of the phenol rich fractions

of leaves of Chukrasia tabularis. A Juss Bio Technol 99:7692–7698.

Kushima H, Hiruma-Lima CA, Santos MA, Viana E, Coelho-Ferreira M, Brito AR

(2005) Gastroprotective activity of Pradosia huberi on experimentally induced


gastric lesions in rodents: role of endogenous sulphydryls and nitric oxide. J

Ethnopharmacol 101:61-67.

Lajide L, Escoubas P, Mizutani J (1995) Termite antifeedant activity in Detarium

microcarpum. Phytochemistry 40:1101–1104.

Li X, Zhang J, Gao W, Wang H (2012) Study on chemical composition, anti-

inflammatory and anti-microbial activities of extracts from Chinese pear fruit

(Pyrus bretschneideri Rehd.). Food and Chemical Toxicology 50:3673–3679.

McDonald S et al. (2001) Phenolic content and antioxidant activity of olive

extracts. Food Chem Res 73:73-84.

Medini F, Fellah H, Ksouri R, Abdelly C (2014) Total phenolic, flavonoid and

tannin contents and antioxidant and antimicrobial activities of organic

extracts of shoots of the plant Limonium delicatulum. Journal of Taibah

University for Science 3:216-224.

Meepagala KM, Osbrink W, Sturtz G, Lax A (2006) Plant-derived natural prod-

ucts exhibiting activity against Formosan subterranean termites (Coptotermes

formosanus). Pest Manage Sci 62:565–570

Mendez M, Rodríguez R, Ruiz J, Morales-Adame D, Castillo F, Hernández-

Castillo FD, Aguilar CN, (2012) Antibacterial activity of plant extracts obtained

with alternative organics solvents against food-borne pathogen bactéria.

Industrial Crops and Products 37:445–450.

Montenegro LHM, Oliveira PES, Conserva LM, Rocha EMM, Brito AC, Araíjo

RM, Trevisan MTS, Lemos RPL (2006) Terpenóides e avaliação do potencial

antiinflamatório, lavircida, anti-radicular e anticolinesterásico de Pouteria

venosa (Sapotaceae). Revista brasileira de Farmacognosia 16:611-617.

Mulla WA, Kuchekar SB, Kuchekar BS (2010) Antioxidant, anti-nociceptive and

anti-inflammatory activities of ethanolic extract of leaves of Alocasia indica

(Schott.). J Young Pharm 2:137-143.

Nair R, Chanda S (2008) Antimicrobial activity of Termina catappa, Manilkara

zapota and Piper betel leaf extract. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences

70:390–393.

Ohmura W, Doi S, Aoyama M, Ohara S (2000) Antifeedant activity of flavonoids

and related compounds against the subterranean termite Coptotermes

formosanus Shiraki. J Wood Sci 46:149–153.

Oliveira EC, Fernandes CP, Sanchez EF, Rocha L, Fuly AL (2014) Inhibitory

Effect of Plant Manilkara subsericea against Biological Activities of Lachesis

muta Snake Venom. BioMed Research International 9:21-25.


Patel PR, Rao TVR (2012) Screening of antibacterial activity of some

underutilized fruits of Sapotaceae. International Food Research Journal

19:1227-1231.

Pietro P, Pineda M, Aguilar M (1999) Spectrophotometric quantification of

antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex:

specific application to the determination of vitamin E. Anal Biochem 269:337–

341.

Roberts EAH, Cartwright RA, Oldschool M (1957) Phenolic substances of

manufactured tea. I. Fractionation and paper chromatography of water-soluble

substances. J Sci Food Agr 8: 72-80.

Shah MD, Hossain MA (2014) Total flavonoids content and biochemical

screening of the leaves of tropical endemic medicinal plant Merremia

borneensis. Arab J Chem 7:1034-1038.

Sittiwet C, Puangpronpitag D (2009) Antibacterial activity of Cryptolepis

buchanani aqueous Extract. Int J Biol Chem 3:90–94.

Sousa CMM, Silva HR, Vieira-Jr GM, Ayres MCC, Costa CLS, Araújo DS,

Cavalcante LCD, Barros EDS, Araújo PBM, Brandão MS, Chaves MH (2007)

Fenóis Totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Quimica

Nova 30:351-355.

Suhartono E, Viani E, Rahmadhan MA, Gultom IS, Rakhman MF,

Indrawardhana D (2012) Total flavonoid and Antioxidant Activity of Some

Selected Medicinal Plants in South Kalimantan of Indonesian. APCBEE

Procedia 4:235 – 239.

Tellez M, Estell R, Fredrickson E, Powell J, Wedge D, Schrader K, Kobaisy M

(2001) Extracts of Flourensia cernua (L): volatile constituents and antifungal,

antialgal, and antitermite bioactivities. J Chem Ecol 27:2263-2273.

Uma R, Sivasubramanian V, Devaraj SNJ (2011) Evaluation of in vitro

antioxidant activities and antiproliferative activity of green microalgae,

Desmococcus olivaceous and Chlorococcum humicola. Algal Biomass Utln

2:82– 93.

Verma RK, Verma SK (2006) Phytochemical and termiticidal study of Lantana

camaravar. aculeata leaves. Fitoterapia 77:466–468.

Wagner H, Bladt S (1996) Plant drug analysis – A thin layer chromatography

atlas. Springer. 2(ed). Munich.

Walia H, Kumar S, Arora S (2009) Antiradical efficacy and protective effect of

water/fractions of Terminalia chebula on DNA cleavage. J Chin Clin Med 4:671–

673.


Woisky RG, Salatino A (1998) Analysis of pró polis: some parameters and

procedures for chemical quality control. Journal Apicultural Research 37:99-

105.

Zhou D, Ruan J, Cai Y, Xiong Z, Fu W, Wei A (2010) Antioxidant and

hepatoprotective activity of ethanol extract of Arachniodes exilis (Hance) Ching.

J Ethnopharmacol 129:232–237.

Zhu BCR, Henderson G, Adams RP, Mao L, Yu Y, Lain RA (2003) Repellency

of vetiver oils from different biogenetic and geographical origins against

Formosan subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae). Sociobiology

42:623–638.


7. CAPITULO III

MANUSCRITO A SER SUBMETIDO

REVISTA:

Process Biochemistry

TÍTULO:

PARCIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF Manilkararufula

(Miq.) H. J. LAM. (Sapotaceae) LEAF LECTIN AND ITS DNA PROTECTION

CAPACITIES AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY


PARCIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF Manilkara rufula 1

(Miq.) H. J. LAM. (Sapotaceae) LEAF LECTIN AND ITS DNA PROTECTION 2

CAPACITIES AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY 3

1José H. V. Arcoverde, 1Raiana A. de Paula; 1Douglas H. O. Andrade; 3Kilma C, 4

Paz; 1Márcia V. da Silva, 1Maria T. S. Correia, 2Oliane M. C. Magalhães,*1,3 5

Maria G. Carneiro-da-Cunha 6

7

1Departamento de Bioquímica, CCB, Universidade Federal de 8

Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-420 Recife, Pernambuco, Brasil. 9

2Departamento de Micologia, CCB, Universidade Federal de 10

Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-420 Recife, Pernambuco, Brasil. 11

3Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - LIKA, Universidade 12

Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50670-901 Recife, Pernambuco, 13

Brasil. 14

15

* Corresponding author at: Departamento de Bioquímica, Centro de 16

Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Av. Prof. 17

Moraes Rego s/n, CEP 50.670-420 Recife, PE, Brazil. Tel.: +55 81 2126 8540; 18

fax: +55 81 21268576. E-mail address: [email protected] (M.G. Carneiro-da-19

Cunha). 20

21

22

23

24

25


Abstract 26

Manilkara rufula leaf lectin was obtained from different seasons collected 27

material through ammonium sulfate saturation. The crude extract precipitated 28

termed 40-80% fraction, which was applied into a chitin chromatographic 29

column,capable to bind lectin. The column was eluted with 1,0 M acetic acid for 30

6 hours, and the adsorbed colect, lyophilised and named MkaLL. DNA 31

protective activity was performed using pBR322 plasmid and Fenton reagent. 32

Antibacterial activity was determined by micro dilution in titer plate. High 33

resolution chromatography through AKTA presented two distinct peaks, and 34

SDS-PAGE of the lectin under reducing conditions in the presence of 2-35

mercaptoethanol, showed two bands with molecular weight of 46,2 and 36,3 36

kDa. Seasonality was not a determinant factor for lectin obtention, MkaLL was 37

not dependant on mono or divalent cations. It was stable up to 80°C and 38

exhibited maximum hemagglutination at basic pH (8,5-9,5). MkaLL revealed an 39

antimicrobial activity against M. luteus and DNA protective activity. This was the 40

first report of a lectin obtained from a specimen of Manilcara genus, due to this 41

these data could be significant for better determine its biotecnology potential. 42

43

Keywords: Lectin, Manilkara rufula; DNA protection ; antibacterial activity. 44

45

46

47

48

49

50


Introduction 51

The plant kingdom presents as a valuable source of biomolecules among these, 52

lectins shows to have unique specifications [1]. These proteins have the ability 53

to specifically and reversibly bind different mono and polysaccharides without 54

changing their structures. 55

Lectins are naturally found in different plant tissues, with various 56

functions, also occurring in other organisms such as animals [2]. 57

Plant lectins carbohydrates specificity make them a valuable 58

biotechnology tool with multiple applications. Some lectins were used as 59

vaccine additives due to there ability to bind glycosylated molecules present on 60

cell surfaces [3]. 61

Previous studies demonstrated its anti tumoral activity, and importance 62

for diagnostic through cell type differentiation [4,5,6]. It has been proved to have 63

a wide potential for insect control [7], antibacterial activity [8] and applications 64

against diverse microorganisms infections [9]. 65

Oxygen reactive species (OREs) are produced by all aerobic cells. Their 66

defence against free radicals is accomplished through antioxidant molecules, 67

like enzymes [10]. However, when OREs levels exceeds the defence capacity, 68

the result could be a DNA oxidative damage, which promotes breaks in the 69

molecules chain inducing a mutation, that can develop a cancer [11]. 70

Despite the growing interest on isolation,structural and functional 71

characterisation of bioactive compounds, still have a lot to be studied at 72

Caatinga region [12]. 73

This biome represents the fifth larger area covered with a single type of 74

vegetation in Brazil, distributed among 60% of Northeast region [13]. In past 75


years, plants containing medicinal properties of this area have drawn attention 76

to be researched more about them [14], as some publications already described 77

therapeutic actions of Caatinga´s flora [14,15,16]. 78

Included in this environment is the Sapotaceae family, encompassing 50 79

genus with 1000 species,approximately. In Brazil occurs 14 different genrera, 80

like Manilkara [17]. In this genera has many species used as medicinal plants 81

for treatment of fever, haemorrhage, cicatrising, antimicrobials,antiparasitc, 82

antitumoral and antioxidants activity [18]. Studies carried with M. zapota 83

demonstrated that various tissues presents biological properties. From its 84

leaves were related antimicrobial,antioxidant and pesticide activities [19,20]. 85

The work showed Manilkara hexandra extracts possess antimicrobial activity 86

against many clinical interest species. 87

The aim of this study was to purify and partially characterise lectins from 88

M. rufula leaves, well as evaluating its DNA protective and antibacterial activity. 89

Until the moment there is no studies leading to information about presence and 90

biotechnology potential of this genus lectins, this being the first report. 91

92

Materials and Metods 93

Chemicals 94

Sugars (D-glucose, D-xylose, D-arabinose, D-galactose, Sacarose, N-acetyl-D-95

glucosamine), sodium chloride, ammonium sulfate, acetic acid and 96

chromatographic matrices (Chitin, Superdex-75 10/300GL) were purchased 97

from Sigma-Aldrich Chemical Company (USA). All reagents were of analytical 98

grade. 99

100


Plant Specimen 101

M. rufula leaves were collected from Catimbau National Park (PARNA do 102

Catimbau), located in Pernambuco, Brazil, between January and June ( dry and 103

raining season,respectively). A specimen was identified and deposited in 104

Pernambuco Agronomic Institute (IPA) herbarium, through vouchers numbered 105

86769 e 86770, dry and raining season specimen, respectively. 106

107

Lectin Extraction 108

Green leaves from the top of the host plant were washed with distilled water, 109

dried in a hothouse at 37°C for 3 days. Dried leaves were then powdered and 110

stored at 4°C until utilisation. The powder was homogenised in 10% (w/v) 0.15 111

mol L�1

NaCl and maintained under constant agitation at 25°C for 8 h [22]. 112

The mixture was filtered through Whatman (nº: 1) filter paper and centrifuged at 113

4°C for 10 minutes at 8.000rpm. All the supernatants obtained were designated 114

crude extract. 115

116

Hemagglutinating activity and hemagglutinating activity inhibition 117

Hemagglutinating activity (HA) of lectins was evaluated in microtiter plates 118

utilising glutaraldehyde treated rabbit erythrocytes. Lectin aliquots (50uL) were 119

2-fold serially diluted with 0.15 mol L�1

NaCl forward the addition of 2.5% (v/v) 120

erythrocytes. Succeeding 45 min of incubation,HA was determined as the 121

contrary of the titer; this matching to the lowest sample dilution exhibiting 122

complete hemagglutination , visually validated through the absence of 123

erythrocyte precipitation. The specific HA was determined by the relation of HA 124

to protein concentration [22]. 125


Protein Determination 126

According to Smith [23], the protein concentration was analysed using a 127

standard curve of bovine seric albumin (BSA), with values among 20 and 2.000 128

μg/ml. 129

130

Purification of M. rufula (MkaLL) leaf lectin 131

CE was 20%-saturated with ammonium sulfate for 4h at room temperature and 132

centrifuged at 12.000 µ g for 15 min at 4°C. The precipitate was stored and 133

corresponded to the 0-20% fraction, and the supernatant was adjusted to 20–134

40% saturation. This procedure continued until 100% saturation. The 135

precipitates were resuspended in 0.15 mol L-1

NaCl and dialysed against 136

distilled water and 0.15 mol L-1

NaCl for 6 hours and the highest saline fraction 137

(40-80%) was used for chromatographic procedures. Affinity chromatography 138

was done by applying 25 ml of 40-80% fraction (51,4 mg/mL of protein) onto a 139

chitin column (100ml) previously packed and equilibrated 0.15 mol L-1

NaCl at 140

a flow rate of 20 mL h-1 after collecting unabsorbed samples of 6 mL (more 141

than 0.03 absorbance at 280 nm), the column was eluted with 1,0 mol L-1

142

acetic acid. Fractions with absorbance higher than 0,1 were pooled, dialysed 143

against NaCl 5 mM at 25ºC, lyophilised, suspended in distilled water and 144

denominated MkaLL. To analyse the purification protocol efficiency, MkaLL was 145

suspended in 0.15 mol L-1

NaCl (1 mg mL-1 ) was loaded onto a Superdex-75 146

10/300GL column coupled to an A KTA purifier system and eluted with 0.3 mol 147

c NaCl at 0.5 mL min-1. 148

149


Gel Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 150

Polyacrylamide electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulphate 151

(SDS–PAGE) was performed on a 12,5% (w/v) gel following the method 152

described by Laemmli [24]. MkaLL lectin, samples were submitted to reducing 153

and non-reducing conditions in the presence or absence of 2-mercaptoethanol 154

reducing agent, respectively. Standard marker proteins ( Broad Range Protein 155

Molecular Weight Markers with proteins sizes 10, 15, 25, 35, 50, 75, 100, 150 156

and 225 kDa), purchased from Promega. Protein bands were stained with Coomassie 157

Brilliant Blue (CBB) 0,02% (w/v) for 16 hours at room temperature. 158

Discolouration was proceeded of consecutive washes on 10% (v/v) acetic acid. 159

160

Effect of mono and divalent ions, pH and temperature 161

Samples of MkaLL (500 µg/mL and HA=512) were used to evaluate the effect of 162

metal ions, pH and temperature on MkaLL HA. The result of mono (Na+

and 163

K+

) and divalent metal ions (Ca2+

, Mg2+

and Mn2+

) on HA was accomplished 164

according to Pajic et al. [25]. 165

The purified lectin solution was previously dialysed against 0.025 mol 166

L-1

EDTA for 16 h at 4°C and then dialysed against deionised water (8 h at 167

4°C). Subsequently, the HA was carried out in microtiter plates with dialysed 168

lectin preparation (50 mL) serially 2-fold diluted 0.02 mol L-1

of the different ions 169

(50 mL) prepared in 0.15 mol L-1 NaCl. The microtiter plate was standing at 170

25°C for 45 min before the inclusion of a 2.5% (v/v) erythrocyte suspension (50 171

µ L). 172


The effect of pH on the HA of purified lectin was carried out in 0.01 mol 173

L-1

buffers that differed in terms of their pKa value (citrate phosphate pH 3,0-174

6,5; Tris-HCl pH 7.0- 9,5; glycine-NaOH pH 10-12), where lectin samples were 175

incubated for 30 min and HA posteriorly determined. The effect of temperature 176

on HA of MkaLL was evaluated by incubating 1 mL of purified lectin at 30, 40, 177

50, 60, 70, 80, 90 and 100°C for 30 min [26], followed by a HA assay. 178

179

DNA Nicking Assay 180

The DNA nicking assay was performed using pBR322 plasmid DNA. The 181

reaction mixture contained 0.3 µL of plasmid DNA, 10 µL of Fenton’s reagent 182

(30 mM H2O2, 50 mM ascorbic acid, and 80 mM FeCl3) followed by the addition 183

of extracts. The final volume of the mixture was brought up to 25 µL using 184

distilled water. The mixture was then incubated for 30 min at 37 °C and the DNA 185

was analysed on 1% agarose gel (prepared by dissolving 1 g of agarose in 100 186

mL of 0,5 x TBE Buffer) [27]. The measurement of DNA damage protection was 187

analysed by Total Lab Quant. 188

189

Antibacterial Activity 190

Bacteria were provided by the Department of Antibiotics (DA), Universidade 191

Federal de Pernambuco (UFPE), Brazil in DifcoTM

Nutrient Agar (NA) and 192

stored at 4°C. Gram-positive strains were Staphylococcus aureus (UFPEDA-193

02), Micrococcus luteus (UFPEDA-100),Bacillus subtilis (UFPEDA-86), and 194

Gram-negative strains were Pseudomonas aeruginosa (UFPEDA-416) and 195

Klebsiella pneumoniae (UFPEDA-396). Bacteria were grown in shaker flasks 196


(250 mL) containing DifcoTM

Nutrient Broth (NB) and incubated overnight in a 197

orbital shaker at 100 rpm and 37°C. The cell concentration was determined by 198

measuring the suspension turbidity at 600 nm and then converted to colony 199

forming units (105

to 106

CFU mL-1

) using appropriate calibration curves 200

(turbidity equivalent to 0.5 in the McFarland scale). One CFU represents a 201

viable cell capable of promoting bacterial growth. 202

The susceptibility assay for determination of minimum inhibition 203

concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) was 204

executed by micro dilution through CSLI [28]. Bacteria were grown for 24 205

hours at 37oC. MkaLL samples were adjusted for 1mg/mL and serial diluted in 206

titer plates, with final concentrations ranging from 0,09 to 500 µg/ml. Afterwards, 207

20 µl of bacterial suspension (106–10-7 CFU/ml) were inoculated,tests realised 208

in a final volume of 200 µl and incubated at 30°C for 24 hours. Cloranfenicol 209

was applied as a positive standard and Resazurin (0,01%) as an indicator 210

through color changing, a bacterial growth is indicated by changing from purple 211

to pink. The minimum inhibitory concentration (MIC) corresponded to the 212

minimum lectin concentration that inhibited visible bacterial growth, expressed 213

in µg/mL. 10 µl of each concentration without growth were inoculated in petri 214

plates with Agar Mueller-Hinton and incubated as described above for further 215

identification. The minimum bactericidal concentration corresponded to the 216

minimum concentration of lectin that inhibited 100% growth in the Agar surface. 217

All experiments were done in triplicates. 218

219

Results and discussion 220

Lectin obtention 221


By Schwob et al. [29] the season were a sample is collected is one of most 222

important factors, as quantity and some active components are not constant 223

during the year, since season variation could interfere in diverse metabolic 224

contents, such as lectins. 225

Total content variation likewise relative proportion of plant metabolic 226

occurs in different seasons [30]. Seasonality is a factor that acts directly on 227

photosynthesis in plants. Plants use a variety of ways to regulate foliar light 228

absorption, thereby preventing light energy absorption in excess, which may 229

cause modifications to the synthesis of biomolecules [31]. 230

Considering that plant lectins are part of this products, our investigation 231

of seasonal dynamics on M. rufula extracts by HA analysis revealed a non 232

variation between heavy rain and drought periods extracts. We suggest that M. 233

rufula leaf lectin is not sensible for seasonal alterations 234

235

Purification and parcial characterisation of M. rufula leaf lectin. 236

Among the fractions saturated with ammonium sulfate from CE, F40-48% 237

showed the most SHA (39,8) and was, therefore, chosen for lectin purification 238

protocol. 239

AH inhibition test of saline fraction showed that it can occur in the 240

presence of some sugars (table 1). The affinity chromatography method is 241

based on the specific bind capacity of a protein, also reversible for some 242

carbohydrates. This way quieten column was chosen to purify MkaLL. 243

The chitin chromatographic step revealed a single active peak eluted 244

with 1 M/L acetic acid, suggesting isolation of the lectin (fig. 1). This MkaLL 245

active peak presented a yield of 0,9% and a 4,5-fold purification factor (table 246


2),yielding a total of 11,28mg of MkaLL from 10 g of M. rufula leaves [31]. 247

Bauhinia forficata yielded 13 mg of purified lectin from 10g of seeds [32]. 248

SDS-PAGE of eluted material showed two polypeptide bands between 42,3 and 249

36,2 kDa (fig. 2). By Oliveira et al. [33], plant lectins are isolated front their 250

natural source, even though isoforms presence decreases the sample 251

heterogeneity. Upon non reduction with 2-mercaptoethanol, this lectin 252

consistently dissociated into two bands. Stoeva et al. [34] also reported lectins 253

isoforms which binds chitin in Viscum album mistletoe. Similar results were 254

reported by Agrawal et al. [35] for presence of six isoforms of SL-I lectin. 255

In addition, MkaLL was submitted for a second purification, ÄKTA system 256

of liquid chromatography with high capacity of purification, using Superdex-75 257

10/300GL. The Superdex-75 10/300GL step revealed two peaks (fig. 3). 258

Associating to SDS-PAGE result, it suggests isolation of two lectins or one 259

isoform of MkaLL. 260

Oliveira et al. [36] reported that different lectins could present 261

agglutination differences according to the nature of glycoproteins on celular 262

surfaces. MkaLL presented agglutination on rabbit erythrocytes in relation to HA 263

to human erythrocytes (A+ and O+). B. variegata candida lectin (BVL) was not 264

able to agglutinate rabbit erythrocytes [37], the B. monandra [38], showed a HA 265

on rabbit and human erythrocytes. This variations confirms that each lectin is 266

particular for it specificity for carbohydrates or glycoproteins. 267

MkaLL showed a high affinity for D-glucose and N-Acetyl-D-268

Glycosamine, where these sugars inhibited HA in 5 unities at a minimum 269

concentration of 62,5 µg/mL. Other lectins have HA inhibited by low 270

concentration of these sugars [39, 40]. Silva, et al. [32] related even though BfL 271


lectin was little inhibited by N-Acetyl-D-Glucosamine,it was adsorbed in chitin 272

support. In regard of F40-80% been inhibited by glucose , the support with this 273

carbohydrate was not sufficient for MkaLL isolation. It is noteworthy, this is the 274

first work which shows a Manilkara lectin isolation. 275

MkaLL HA was not affected by mono or divalent ions. MkaLL HA was 276

stable at different pH values(4,5-11), and the highest HA was obtained at 277

alkaline pH (8,5 – 9,5) (fig.4), in acid pH the lectins tends to decrease activity. 278

MkaLL was heat-stable up to 80°C, with a progressive loss until 100°C 279

(fig. 5), this lectin was high thermostable as it HA only diminished at 80°C, and 280

when heated for three hours at 100°C still presenting HA. MkaLL was resistant 281

to chemical or physical stress, such as pH and temperature. 282

A Medeiros et al. [41] study on the effect of temperature and pH 283

demonstrated that the lectin acquired was stable for heat and pH, however it HA 284

was lost with temperatures over 60°C, also the HA of CaL was not disturbed by 285

divalent cations (Ca2+, Mg2+ ou M2+). In same way, the lectin isolated from 286

Haliclona cratera [25] showed a low stability, maintaining the HA until 56°C and 287

pH ranging from 4,6 to 10,2. 288

289

DNA Nicking 290

The inhibitory action of MkaLL over the attack of hydroxyl radicals to the DNA 291

was evaluated through in vitro cleavage of pBR322 plasmid. According to Jung 292

and Surh [42] DNA damage is associated to the conversion form of the plasmid 293

from the supercoiled to a linear and round. The figure 6 shows the MkaLL 294

inhibition effect on a 50 µg/mL, which blocked the cleavage of DNA plasmid, 295


consequently changing format and total degradation of the molecule in a lack of 296

lectin. 297

Mutations or breaks in the double-stranded chain may contribute to 298

formation of chromosomal aberrations leading to cancer. Therefore, oxidative 299

injuries seems to be relevant to the carcinogenic process [43, 44]. Hence, it is 300

thought that MkaLL could be a future tool to inhibit these injuries and previne 301

cancer development through ORE´s. This is the first report on a Manilkara 302

lectin, MkaLL, able to protect plasmodia DNA against oxidative injuries caused 303

by hydroxyl radicals. 304

305

Antibacterial activity 306

Several studies have been performed to evaluate interactions involving plant 307

lectins with bacteria [45, 46]. Others done to evaluate this interaction focused in 308

obtain new bioactive molecules [26, 47, 48]. 309

Bacterial resistant microorganism are increasing, emerging the interest 310

to research new antibiotics derived from plants. 311

In vitro antibacterial assays demonstrated that the MkaLL exhibited antibacterial 312

activity against only one tested pathogenic bacteria (M. luteus) (table 3). 313

A lectin isolated from Araucaria angustifolia seeds led to the formation of 314

pores and disruption of the Gram-positive bacteria membrane, being more 315

active against Gram positive bacteria than Gram-negative bacteria [49]. 316

Lectin concentrations over 500 µg/ml were not used for this assay, since 317

according to Costa et al. [31] becomes unfeasible the use of high 318

concentrations of proteins, by virtue of these biomolecules may interfere with 319

the growth of microorganisms, not per its direct action as an antimicrobial but by 320


increasing the osmolarity killing microorganisms and thereby leading false-321

positive results. 322

This is the first report of a lectin (MkaLL) for Manilkara genera obtained from the 323

leaves of Manilkara rufula (Maçaranduba). The purification protocol using chitin 324

allowed obtaining a lectin, which appeared as two polypeptide bands in SDS-325

PAGE. The purification on AKTA system suggests the isolation of two lectins or 326

MkaLL isoforms in chitin column. This showed to be highly thermostable and 327

resistant to pH variations. MkaLL revealed to possess DNA protective activity 328

against hydroxyl radicals and antimicrobial activity against M. luteus. 329

330

Acknowledgments 331

The author José Helton V. Arcoverde is recipient of a scholarship 332

from Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco 333

(FACEPE). The authors express their gratitude to the Conselho Nacional de 334

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for research grants and 335

fellowship (MTSC and MGCC) and by financial support. Rede NanoBiotec, 336

Núcleo de Bioprospecção da Caatinga/ INSA, as well as IcmBio for the 337

authorization to collect in Parque Nacional do Catimbau (16.888 Sisbio). 338

339

Bibliographic References 340

[1] Fernandez-del-Carmen A, Juárez P, Presa S, Granell A, Orzáez D. 341

Recombinant jacalin-like plant lectins are produced at high levels in Nicotiana 342

benthamiana and retain agglutination activity and sugar specificity. Journal of 343

Biotechnology 2013; 163:391–400. 344

[2] Atalaha BA, Vleesschauwer D, Xub J, Fouquaert E, Höfte M, Van Damme 345

EJM. Transcriptional behavior of EUL-related rice lectins toward important 346

abiotic and biotic stresses. Journal of Plant Physiology 2014; 171:986–992. 347


[3] Granell A, Fernandez-del-Carmen A, Orzaez D. In planta production of plant- 348

derived and non-plant-derived adjuvants. Expert Review of Vaccines 2010; 349

9:843–858. 350

[4] Liu B, Bian H-j, Bao Jk. Plant lectins: potential antineoplastic drugs from 351

bench to clinic. Cancer Letters 2010; 287:1–12. 352

[5] Rillahan CD, Paulson JC. Glycan microarrays for decoding the glycome. 353

Annual Review of Biochemistry 2011; 80:797–823. 354

[6] Wang SY, Yu QJ, Bao JK, Liu B. Polygonatum cyrtonema lectin, a potential 355

antineoplastic drug targeting programmed cell death pathways. Biochem 356

Biophys Res Commun 2011; 406:497–500 357

[7] Oliveira CFR, Luz LA, Paiva PMG, Coelho LCBB, Marangoni S, Macedo 358

MLR. Evaluation of seed coagulant Moringa oleifera lectin (cMoL) as a 359

bioinsecticidal tool with potential for the control of insects. Process Biochem 360

2011; 46:498–504. 361

[8] Brustein VP, Souza-Arauíjo FV, Vaz AFM, Arauújo RVS, Paiva PMG, 362

Coelho LCBB, Carneiro-Leaão AMA, Teixeira JA, Carneiro-da-Cunha MG, 363

Correia MTS. A novel antimicrobial lectin from Eugenia malaccensis that 364

stimulates cutaneous healing in mice model. Inflammopharmacol 2012; 20:315–365

322. 366

[9] Gemeiner P, Mislovicova D, Tkac J, Svitel J, Patoprsty V, Hrabarova E, 367

Kogan G, Kozar T. Lectinomics II. A highway to biomedical/clinical diagnostics. 368

Biotechnol Adv 2009; 27:1–15. 369

[10] Genestra M. Oxyl radicals, redox-sensitive signaling cascades and 370

antioxidants. Cell Signal 2007; 19:1807–1819. 371

[11] Jeong JB, Park JH, Lee HK, Ju SY, Hong SC, Lee JR, Chung GY, Lim JH, 372

Jeong HJ. Protective effect of the extracts from Cnidium officinale against 373

oxidative damage induced by hydrogen peroxide via antioxidant effect. Food 374

and Chemical Toxicology 2009; 47:525–529. 375


[12] Arcoverde JHV, Carvalho AS, Neves FP, Dionízio BP, Pontual EV, Paiva 376

PM, Napoleão TH, Correia MT, Da Silva MV, Carneiro-da-Cunha MG. 377

Screening of Caatinga plants as sources of lectins and trypsin inhibitors. Natural 378

Product Research 2014; 28:1297-301. 379

[13] Sampaio EVSB, Giuiietti AM, Vírginio J, Gamarra-Rojas CFL. Vegetação e 380

flora da Caatinga, 1ht Ed. Associação Plantas do Nordeste, Recife 2002. p. 381

176. 382

[14] Albuquerque UP, Medeiros PM, Almeida AL, Monteiro JM, Lins-Neto EMF, 383

Melo JG, Santos JP. Medicinal plants of the caatinga (semi-arid) vegetation of 384

NE Brazil: a quantitative approach. Journal of Ethnopharmacology 2007; 385

114:325–354. 386

[15] Agra MF, Silva NK, Basílio IJLD, Freitas PF, Barbosa-Filho JM. Survey of 387

medicinal plants used in the region Northeast of Brazil. Brazilian Journal of 388

Pharmacognosy 2008; 18:472–508. 389

[16] Almeida CFCBE, Silva TCL, Amorim ELC, Maia MBS, Albuquerque UP. 390

Life strategy and chemical composition as predictors of the selection of 391

medicinal plants from the caatinga (Northeast Brazil). Journal of Arid Envi-392

ronments 2005; 62:127–142. 393

[17] Almeida-Júnior EB. Diversidade de Manilkara Adans. (Sapotaceae) para o 394

Nordeste do Brasil. Tese (Doutorado em Botânica). Universidade Federal Rural 395

de Pernambuco. Departamento de Botânica. 2010. p. 157. 396

[18] Fernandes CP. Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal 397

Manilkara Subsericea (Mart.) Dubard. Dissertação (Mestrado). Faculdade de 398

Farmácia. Programa de Pós-Graduação emCiências Aplicadas a Produtos para 399

Saúde – UFF. 2011. p. 79. 400

[19] Kaneria M, Baravalia Y, Vaghasiya Y, Chanda S. Determination of 401

antibacterial and antioxidant potential of some medicinal plants from Saurashtra 402

region, India. Indian J Pharm Sci 2009; 71:406-412. 403


[20] Kamaraj C, Rajakumar G, Rahuman AA, Velayutham K, Bagavan A, Zahir 404

AA, Elango G. Feeding deterrent activity of synthesized silver nanoparticles 405

using Manilkara zapota leaf extract against the house fly, Musca domestica 406

(Diptera: Muscidae). Parasitol Res 2012; 111:2439–2448. 407

[21] Chanda S, Parekh A. Assessment of Antimicrobial Potential of Manilkara 408

hexandra Leaf. Phcog J 2012; 12:448–455. 409

[22] Correia MTS, Coelho LCBB. Purification of a glucose/manose specific 410

lectin, isoforma 1, fromseeds of Cratylia mollis Mart. (Camaratu Bean). Appl 411

Biochem Biotechnol 1995; 55:61–273. 412

[23] Smith PK, et al. Measurement of protein Using Bicinchoninic Ácid. Anal. 413

Biochem 1985; 150:75-85. 414

[24] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the 415

head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227:680–5. 416

[25] Pajic I, Kljajic Z, Dogovic N, Sladic D, Juranic Z, Gasic MJ. A novel lectin 417

from the sponge Haliclona cratera: isolation, characterization and biological 418

activity. Comp Biochem Physiol C 2002; 132:213–221. 419

[26] Oliveira MDL, Andrade CAS, Santos-Magalhaães NS, Coelho LCBB, 420

Teixeira JA, Carneiro-da-Cunha MG, et al. Purification of a lectin from Eugenia 421

uniflora L. seeds and its potential antibacterial activity. Lett Appl Microbiol 2008; 422

46:371–6. 423

[28] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards 424

for antimicrobial susceptibility testing. Twenty-first informational supplement 425

2011; CLSI.M100-S21. 426

[27] Kaur R, Arora S, Singh B. Antioxidant activity of the phenol rich fractions of 427

leaves of Chukrasia tabularis. A Juss Bio Technol 2008; 99:7692–7698. 428

[29] Schwob I, Bessiere JM, Masotti V, Viano J. Biochem Syst Ecol 2004. p. 429

735. 430


[30] Gobbo-Neto L, Lopes NP. Plantas medicinais: fatores de influência no 431

conteúdo de metabólitos secundários. Quim. Nova 2007; 2:374-381. 432

[31] Costa RMPB, Vaz AFM, Oliva MLV, Coelho LCBB, Correia MTS, Carneiro-433

da-Cunha MG. A new mistletoe Phthirusa pyrifolialeaf lectin with antimicrobial 434

properties. Process Biochemistry 2010; 45:526–533. 435

[32] Silva MCC, Santana LA, Mentelee R, Ferreira RS, Miranda A, Silva-Lucca 436

RA, Sampaio MU, Correia MTS, Oliva MLV. Purification, primary structure and 437

potential functions of a novel lectin from Bauhinia forficata seeds. Process 438

Biochemistry 2012; 47:1049–1059. 439

[33] Oliveira C, Teixeira JA, Domingues L. Recombinant lectins: an array of 440

tailor-made glycan-interaction biosynthetic tools. Critical Reviews in 441

Biotechnology 2013; 33:66-80. 442

[34] Stoeva S, Franz M, Wacker R, Krauspenhaar R, Guthohrlein E, MikhailovA, 443

et al. Primary Structure, isoforms, and molecular modeling of a chitin-binding 444

mistletoe lectin. Arch Biochem Biophys 2001; 392:23–31. 445

[35] Agrawal P, Kumar S, Rani Das H. Mass spectrometric characterization of 446

isoform variants of peanut (Arachis hypogaea) stem lectin (SL-I). Journa L of 447

Proteomics 2010; 73:1573–1586. 448

[36] Oliveira JTA, Melo VMM, Camara MFL, Vasconcelos IM, Beltramini LM, 449

Machado OLT, et al. Purification and physicochemical characterization of a 450

cotyledonary lectin from Luetzelburgia auriculata. Phytochemistry 2002; 451

63:301–10. 452

[37] Silva JA, Damico DCS, Baldasso PA, Mattioli MA, Winck FV, Fraceto LF, et 453

al. Isolation and biochemical characterization of a galactoside binding lectin 454

from Bauhinia variegata Candida (BvcL) seeds. Protein J 2007; 26:193–201. 455

[38] Coelho LCBB, Silva MBR. Simple method to purify milligram quantities of 456

the galactose-specific lectin from the leaves of Bauhinia monandra. Phytochem 457

Anal 2000; 11:295–300. 458


[39] Silva JA, Damico DCS, Baldasso PA, Mattioli MA, Winck FV, Fraceto LF, et 459

al. Isolation and biochemical characterization of a galactoside binding lectin 460

from Bauhinia variegata Candida (BvcL) seeds. Protein J 2007; 26:193–201. 461

[40] Pinto LS, Nagano CS, Oliveira TM, Moura TR, Sampaio AH, Debray H, et 462

al. Purification and molecular cloning of a new galactose-specific lectin from 463

Bauhinia variegata seeds. J Biosci 2008; 33:355–63. 464

[41] Medeiros DS, Medeiros TL, Ribeiro JKC, Monteiro NKV, Migliolo L, Uchoa 465

AF, Vasconcelos IM, Oliveira AS, Sales MP, Santos EA. A lactose specific 466

lectin from the sponge Cinachyrella apion: Purification, characterization, N-467

terminal sequences alignment and agglutinating activity on Leishmania 468

promastigotes. Comparative Biochemistry and Physiology 2010; 155:211–216. 469

[42] Jung Y, Surh Y. Oxidative DNA damage and cytotoxicity induced by 470

copperstimulated redox cycling of salsolinol, a neurotoxic tetrahydroisoquinoline 471

alkaloid. Free Radic. Biol. Med 2001; 30:1407–1417. 472

[43] Wang H, Gao XD, Zhou GC, Cai L, YaO WB. In vitro and in vivo antioxidant 473

activity of aqueous extract from Choerospondias axillaris fruit. Food Chem 474

2008; 106:888–895. 475

[44] Wang T, Chen LX, Long Y, Wu WM, Wang R. DNA damage induced by 476

caffeic acid phenyl ester in the presence of Cu(II) ions: potential mechanism of 477

its anticancer properties. Cancer Lett 2008; 263:77–88. 478

[45] Wang XW, Wang JX. Diversity and multiple functions of lectins in shrimp 479

immunity. Dev. Comp. Immunol 2013; 39:27–38. 480

[46] Zhang Y, Qiu L, Song L, Zhang H, Zhao J, Wang L, et al. Cloning and 481

characterization of a novel C-type lectin gene from shrimp Litopenaeus 482

vannamei. Fish Shellfish Immunol 2009; 26:183–192 483

[47] Randrianarivelo R, Sarter S, Odoux E, Brat P, Lebrun M, Romestand B, et 484

al. Composition and antimicrobial activity of essential oils of Cinnamosma 485

fragrans. Food Chem 2009; 114:680–4. 486


[48] Gaidamashvili M, Staden J. Interaction of lectin-like proteins of South 487

African medicinal plants with Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis. J 488

Ethno-pharmacol 2002; 80:131–5. 489

[49] Santi-Gadelha T, Gadelha CAA, Aragão KS, Oliveira CC, Mota MRL, 490

Gomes RC, et al. Purification and biological effects of Araucaria angustifolia 491

(Araucaria-ceae) seed lectin. Biochem Biophys Res Commun 2006; 350:1050–492

5 493

494

495


Superscription of figures 496

497

Fig. 1: Profile of quitin affinity chromatographic column eluted with acetic acid 498

1mol/L. 499

Chromatogram: Sample abs at 280nm (▲); Sample Log of HA(●); (↓) 500

beginning of elution, MkaLL was obtained between intervals of fractions 110-501

132. 502

503

Fig. 2: Molecular Characterisation. SDS-PAGE gel (12,5%) obtained through 504

lectin purification on quieten chromatography, stained with bright blue 505

Coomassie. Band molecular weights were 43,2 (A) e 36,3 (B) KDa, 506

respectively. 507

508

Fig. 3: Chromatography of MkaLL on Superdex-75 10/300GL column accepted 509

to a ÄKTA purifying system, equilibrated and eluted with NaCl 0,15 mol/L. 510

511

Fig. 4: Effect of pH at hemagglutinating activity after incubation with different pH 512

(4,5-11) buffers. 513

514

Fig. 5: Effect of temperature at MkaLL HA in rabbit erythrocytes. The initial 515

activity was 512 and each point over the line represents the average of three 516

repetitions. 517

518

Fig. 6: Protective effects of lectin of M. rufula in DNA nicking assay. (A) Lane 1: 519

negative control (distilled water + DNA), (B) Lane 2: control (DNA + Fenton’s 520

reagent), (3) Lane 3-5: MkaLL (5o µg/mL) + Fenton’s reagent. 521

522

523

524


Table 1: Inhibition of hemagglutinating activity of 40-80% saline fraction of 525

leaves from M. ruful. using rabbit red blood erythrocytes. 526

527

528

Lectin concentration: 500 µg/mL 529

Initial HAtiter corresponded: 2048. 530

Assay achieved at room temperature (25°C) using a 2.5% suspension of 531

erythrocytes. 532

533

534

535

Carbohydrates

(µg/mL) 500 250 125 62.50 31.25

D-glucose + + + + -

D-fructose - - - - -

D-xylose - - - - -

D-arabinose - - - - -

D-galactose + + - - -

Sucrose - - - - -

N-acetyl-D-

glucosamine + + + + -


Tabela 2: Purification summary of leaf lectins from Manilkara rufula. 536

537

Lectin

Fraction

Vol.

(ml)

Protein

(mg)

Activity

total

(AH)

aAHE

(AH/mg

)

bfold

Purific.

c Yield (%)

Ext.Crud

e

100 5.360 204.800 38.2 1.00 100

F: 40-

80%

45 2.313 92.160 39.8 1.04 45.0

MakaLL 240 11.28 1.920 170.2 4.45 0.9

538

MkaLL: lectin obtained from M. rufula leaves by quitin chromatography.. 539

a Specific Hemagglutinating Activity; agglutinating against rabbit erythrocytes. 540

b Purification fold: relation between SHA of lectin and SHA of crude extract. 541

c Yield: relation between HA of crude extract and lectin. 542

543

544


Table 3: Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal 545

Concentration(CBM) of MkaLL against bacterias. 546

547

Bactérias MIC (µg/mL) CMB (µg/mL)

S. aureus – UFPEDA-02 ND ND

M. luteus - UFPEDA-100 250 > 250

B. subtillis- UFPEDA-86 ND ND

E. coli – UFPEDA-224 ND ND

K. pneumonieae – UFPEDA-396 ND ND

P. Aeruginosa – UFPEDA-416 ND ND

548

Mkal: M. rufula lectin. 549

ND: Not detected. 550

MIC: Minimum Inhibitory Concentration corresponded to the minimal lectin 551

concentration that inhibited bacterial growth, in titer plates. 552

CBM: Minimun Bactericidal Concentration was determined as the highest 553

dilution (lowest concentration) without growth on Agar plates. 554

555

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676


8. CONSIDERAÇÕES FINAIS 1. Na Caatinga há uma grande vareidade de espéceis vegetais ricas em

compostos bioquímicos que devem ser melhor explorados.

2. Os solventes clorofórmio, acetato de etila e metanol mostraram-se eficientes

para extração de metabólitos secundários das folhas de M. rufula.

3. Nas folhas de M. rufula estão presentesuma expressiva quantidade de

flavonoides, esteroides e taninos.

4. Os extratos orgânicos das folhas de M. rufula mostraram atividade

antioxidante, protetora de DNA, anti-bacteriana e termiticida.

5. Uma lectina (MkaLL) com atividade protetora de DNA e anti-bacteriana foi

isolada das folhas de M. rufula.

7. M. rufula apresenta-se como uma promissora fonte de compostos bioativos.

universidade federal de pernambuco centro de … · figura 7: estrutura do núcleo de espirostano....

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