universidade federal de pernambuco centro de … · 2019-10-25 · a esquistossomose é um sério...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA
DETECÇÃO DE Schistosoma mansoni BASEADO EM NANOCOMPÓSITO DE
ÓXIDO DE FERRO E OURO
GISELLE SOARES DOS SANTOS
RECIFE
2016
GISELLE SOARES DOS SANTOS
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA DETECÇÃO
DE Schistosoma mansoni BASEADO EM NANOCOMPÓSITO DE ÓXIDO DE
FERRO E OURO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas como pré-requisito parcial para obtenção do
título de mestre em Ciências Biológicas pela Universidade
Federal de Pernambuco.
Orientado por: Profª. Drª. Maria Danielly Lima de Oliveira
RECIFE
2016
DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA DETECÇÃO
DE Schistosoma mansoni BASEADO EM NANOCOMPÓSITO DE ÓXIDO DE
FERRO E OURO
Dissertação apresentada como pré-requisito parcial
para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas pela Universidade
Federal de Pernambuco
Aprovada em: 29/02/2016
BANCA EXAMINADORA:
_____________________________________________________________
Profa. Maria Danielly Lima de Oliveira (Departamento de Bioquímica/UFPE) –
Orientadora
_____________________________________________________________
Prof. Dr. César Augusto Souza de Andrade (Departamento de Bioquímica/UFPE) - 1º
examinador
______________________________________________________________
Prof. Dr. Kleber Gonçalves Bezerra (Departamento de Engenharia Mecânica/UFPE) - 2º
examinador
Aos meus pais, Cícero e Marli pelo apoio e incentivo em todas as minhas escolhas.
Ao meu esposo Romero pelo amor, apoio, confiança e motivação incondicional.
A eles dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
Ao meu Bom Deus que me permitiu chegar até aqui, me dando forças e saúde para
superar as dificuldades e por conceder-me incontáveis bênçãos.
Aos meus pais Cícero e Marli, pelo exemplo que são, pelos valores que me ensinaram,
pelo apoio incondicional, e por acreditarem em mim.
Ao meu esposo Romero Bomfim por ser tão importante na minha vida. Sempre ao meu
lado, me pondo para cima e me fazendo acreditar que posso mais que imagino. Pelo
carinho, pela ajuda, paciência e compreensão nos momentos de dificuldade e ausência.
Você me traz paz nas horas de turbulência.
A minha família em especial meus amados irmãos e sobrinhos pelo apoio e amor em
todos os momentos.
A minha orientadora Prof. Dra. Maria Danielly Lima de Oliveira, pela oportuninade, por
acreditar em mim, pelos ensinamentos, compreensão e por me orientar de uma forma
tão atenciosa. Obrigada também pela amizade e carinho. Aprendi muito com você.
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Cesar Augusto Souza de Andrade, agradeço também
pela oportunidade, apoio, suporte e ensinamentos.
Ao nosso colaborador Fábio Lopes de Melo pelo material cedido para que este trabalho
fosse desenvolvido.
As minhas amadas amigas Flávia Garcia, Maurília Palmeira e Karen Yasmin por todo
apoio, pelas palavras de incentivo, por fazer a caminhada mais leve e divertida, amo
muito vocês. Aos poucos nos tornamos mais que amigas quase irmãs... Obrigada por
dividir comigo as angústias e alegrias. O mestrado não seria o mesmo sem vocês.
As minhas queridas amigas Juliana Miranda e Kalline Lourenço, pelo carinho,
companherismo e momentos de descontração. Foi bom poder contar com vocês.
Agradeço a todos do grupo Laboratório de Biodispositivos Nanoestruturados-
BIONANO /UFPE - Thaynara, Gabriel, Rafael, Gustavo, Elton, Estefani, Sandra,
Felipe, Raiza, Erico, Thays, Isaac, Alberto, por toda ajuda, amizade e momentos de
descontração.
Aos docentes e funcionários do Programa de Pós Graduação em Ciências
Biológicas/UFPE
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica/UFPE.
A FACEPE pelo apoio financeiro.
A todos que direta ou indiretamente colaboraram para a conclusão deste trabalho, que
mesmo não sendo citados tiveram um papel relevante na realização deste trabalho.
Meus sinceros agradecimentos.
“Conheça todas as teorias, domine todas as técnicas, mas ao tocar uma alma humana, seja
apenas outra alma humana.”
Carl Jung
RESUMO
A esquistossomose é um sério problema de saúde pública, é uma doença negligenciada e
intimamente relacionada com baixos índices de desenvolvimento social. Neste trabalho,
foi realizada uma detecção eletroquímica de DNA Schistosoma mansoni com base em
uma monocamada auto-montada de ácido mercaptobenzóico (MBA) imobilizando
nanoestruturas compostas por nanopartículas de ouro (AuNPs) e nanopartículas de
magnetita (Fe3O4_NPs). Espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e
voltametria cíclica (CV) foram utilizadas para monitorar o evento de bioreconhecimento
do sistema de MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAsonda revela uma resposta eletroquímica
eficaz indicando a modificação da superfície. O biosistema proposto foi capaz de
reconhecer sequências de nucleótidos específica de S. mansoni presente em amostras de
soro e líquido cefalorraquidiano (LCR) em diferentes concentrações de DNA do
genoma. O resultado do bioreconhecimento gerou um aumento na resistência de
transferência de elétrons e uma diminuição dos picos de corrente em concentrações de
DNA durante as medições eletroquímicas. A plataforma desenvolvida mostrou um
limite de detecção do DNA de 0,781 e 0,685 pg.μL- 1 para soro e LCR respectivamente.
Portanto, o biossensor obtido pode ser considerado como um instrumento útil para a
detecção especifica de S. mansoni em baixas concentrações em vários fluidos
biológicos.
PALAVRAS CHAVES: Biossensores, Esquistossomose, DNA, Voltametria cíclica,
Impedância eletroquímica, Nanoparticulas.
ABSTRACT
Schistosomiasis is a neglected disease closely related to the low levels of social
development and a serious public health problem. In this work, we performed an
electrochemical detection of Schistosoma mansoni DNA with a self-assembled
monolayer of mercaptobenzoic acid (MBA) immobilizing nanostructures composed by
gold nanoparticles (AuNPs) and magnetite nanoparticles (Fe3O4_NPs). Electrochemical
Impedance Spectroscopy (EIS) and Cyclic Voltammetry (CV) were used to monitor the
biorecognition event. MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe system reveals an effective
electrochemical response indicating the surface modification. The proposed biosystem
was capable to recognize specific nucleotide sequence of S. mansoni present in
cerebrospinal fluid (CFS) serum samples at different genome DNA concentrations. The
biorecognition results in an increase in the electron transfer resistance and a decrease of
the current peaks at higher DNA concentrations during electrochemical measurements.
The developed platform showed a DNA detection limit of 0.781 and 0.685 pg.µL- 1 for
serum and CFS, respectively. Therefore, the obtained biosensor can be considered as a
useful tool for specific detection of S. mansoni at low concentrations in various
biological fluids.
KEYWORDS: Biosensors, Schistosomiasis, DNA, Cyclic voltammetry,
Electrochemical impedance spectroscopy, Nanoparticles.
LISTA DE FIGURAS DA REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1 Caramujos hospedeiros intermediários da esquistossomose …..............22
Figura 2 Ciclo de transmissão parasitária da esquistossomose.............................23
Figura 3 Distribuição da esquistossomose, de acordo com o percentual de
positividade por município. Brasil, 2013................................................................25
Figura 4 Manifestação hepatoesplênica da esquistossomose................................27
Figura 5 Manifestação cutânea da esquistossomose..............................................28
Figura 6 Ciclo de transmissão parasitária da esquistossomose.............................29
Figura 7 Representação esquemática de um biossensor........................................33
Figura 8 Esquema ilustrativo do acoplamento das bases nitrogenadas que compõe
o DNA. Sítios de oxidação e redução nas moléculas de guanina, citosina e
adenina....................................................................................................................42
Figura 9 Diferentes abordagens para biossensores fluorescentes à base de NPs
metálicas.................................................................................................................45
Figura 10 Aplicações biomédicas das nanopartículas magnéticas........................47
Figura 11 Representação esquemática de uma monocamada auto-montada: (1)
grupo cabeça/âncora, (2) cauda e (3) grupo funcional............................................49
Figura 12 Representação esquemática de uma Célula eletroquímica com três
eletrodos (1) eletrodo de trabalho; (2) eletrodo de referência e (3) eletrodo
auxiliar....................................................................................................................50
Figura 13 Representação esquemática de um voltamograma cíclico típico
mostrando os parâmetros obtidos por esta técnica: (ipa) corrente de pico anódica,
(ipc) corrente de pico catódica, (Epa) potencial de pico anódico e (Epc) potencial
de pico catódico, potencial de inversão..................................................................51
Figura 14 Diferentes reversibilidades de sistemas avaliados por voltametria
cíclica: sistema reversível, quase irreversível e irreversível...................................53
Figura 15 Diagrama de nyquist- aspecto geral da Impedância Eletroquímica......55
Figura 16 Circuito equivalente de Randles para uma interface eletrodo\solução.56
Figura 17 Microscópio de Força Atômica.............................................................58
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO
Figure 1 Schematic representation of the surface modification process of the
biosensor………………………………………………………………………………108
Figure 2 Micrographs of scanning electron microscopy (SEM) of the assembly process
the MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobeS.mansoni. a) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs self-
assembled; b) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPsDNAprobeS.mansoni, c) Molecular
hybridization process-MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobeS.mansoni-genome, d)
MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobeS.mansoni-genome negative...............……………108
Figure 3 Cyclic voltammograms of the surface stepwise modification process of the
biosensor (a) and CVs at different stages of biorecognition process: Bare gold electrode
(―), MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-probeS.mansoni (―), MBA-NpFe3O4_NPs-AuNPs-
probeS.mansoni-genome (―). Cyclic voltammetry scan was initiated at - 0.2 V vs.
Ag/AgCl in positive direction at 50 mV........................................…………………....109
Figure 4 Nyquist plots (a) immobilization process layer-layer electrode: () without
modification electrode, ( ) electrode modified with MBA, ( ) MBA-EDC/NHS, ( )
MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs, ( ) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobeS.mansoni and ( )
MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobeS.mansoni-genome. (b) Sensor system response
when exposed to different concentrations of target genomic DNA and a negative control
with the respective simulated by Randles circuit : ( ) Bare gold electrode, ( )MBA-
Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobeS.mansoni, ( ) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-
DNAprobeS.mansoni, ( ) Sensor-Schistosome-genome (0.5ng/mL), ( )Sensor-
Schistosome-genome (0.25ng/mL), ( )Sensor-Schistosome-genome (0.625ng/mL),
( )Sensor-Schistosome-genome (0.031ng/mL), ( )Sensor-Schistosome-genome
(0.016ng/mL), ( ) Sensor-Schistosome-genome (0.0078ng/mL), ( ) Sensor-
Schistosome-
system after exposure to different concentrations of genomic DNA target of
Schistosome...................................................................................................................110
Figure 5 (a) Nyquist plots of the sensor and its interaction with System-CSFgenome at
different concentrations whith respective simulated data by the Randles circuit: ( ) Bare
gold electrode, ( ) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobeS.mansoni, ( ) System-
CSFgenome 0.5pg, ( ) System-CSFgenome 5.0pg, ( ) System-CSFgenome 50.0pg, ( )
System-CSFgenome 0.5ng. (b) Equivalente circuit. Supporting electrolyte: 10 mM
[Fe(CN)6]4-
/ [Fe(CN)6]3-
1:1 + 0.15 M NaCl in 10 mM PBS (pH 7.4) solution. In the
frequency range from 100 mHz to 100 kHz and (c) Ө as a function of concentration of
DNA CSF target.............................................................................................................112
LISTA DE TABELAS DO ARTIGO
Table 1 Values of the equivalent circuit elements from fitted impedance results……105
Table 2 Relative charge transfer variation from impedance data……………………..105
‘
LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Fe3O4_NPs Nanopartículas de óxido de ferro
AuNPs Nanopartículas de ouro
Cdl Capacitância da dupla camada (F)
DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês desoxyribonucleicacid)
E Potencial (V)
EIE Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
ipa Corrente de pico anódica (A)
ipc Corrente de pico catódica
Epa Potencial de pico anódico
Epc Potencial de pico catódico
SAM Camadas automontadas
NSM Neuroesquistossomose mansônica
PCR Reação em cadeia da Polimerase (do inglês polymerase chain reaction)
RNA Ácido ribonucleico (do inglês ribonucleic acid)
Rct Resistência à transferência de elétron (Ω)
RΩ Resistência ôhmica (Ω)
∆Rct% Percentual relativo da variação à transferência de carga
AFM Microscopia de força atômica (do inglês atomic-force microscopy)
VC Voltametria cíclica
Z Impedância (Ω)
Zf Impedância faradaíca (Ω)
Zim Parte Imaginária ou componente capacitiva (Ω)
Zre Parte Real ou componente resistiva (Ω)
ZW ou W Impedância de Warburg
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................... 17
2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................................. 20
2.1 ESQUISTOSSOMOSE ......................................................................................................................... 20
2.1.1 Ciclo de transmissão Parasitária............................................................................................. 21 2.1.2 Epidemiologia .......................................................................................................................... 23 2.1.3 Sintomas .................................................................................................................................. 26 2.1.4 Formas ectópicas ..................................................................................................................... 27 2.1.5 Diagnóstico da Esquistossomose ............................................................................................ 30 2.1.6 Tratamento.............................................................................................................................. 32
2.2 BIOSSENSORES ............................................................................................................................... 32
2.2.1 Classificação dos Biossensores ................................................................................................ 34 2.2.1.1 Biossensor Eletroquímico ..................................................................................................... 35 2.2.1.2 Biossensor Óptico ................................................................................................................. 38 2.2.1.3 Biossensor Piezoelétrico ....................................................................................................... 38
2.3 BIOSSENSORES PARA SCHISTOSOMA ................................................................................................... 40
2.4 GENOSSENSORES ............................................................................................................................ 41
2.5 NANOPARTÍCULAS .......................................................................................................................... 43
2.5.1 Aplicações de Nanopartículas em Biossensores ..................................................................... 44 2.5.2 Nanopartículas tipo Magnetita .............................................................................................. 46 2.5.3 Nanopartículas de Ouro .......................................................................................................... 48 2.5.4 Modificação de superfície do transdutor ............................................................................... 48
2.6 TÉCNICAS ELETROANALÍTICAS ............................................................................................................ 50
2.6.1 Voltametria Cíclica .................................................................................................................. 50 2.6.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica ........................................................................ 54
2.7 MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA .................................................................................................... 57
3. OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 59
3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................... 59
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................... 59
4. METODOLOGIA ................................................................................................................................ 60
4.1 MATERIAIS.................................................................................................................................... 60
4.2 PREPARAÇÕES DAS AMOSTRAS........................................................................................................... 60
4.3 SÍNTESE DE NANOPARTÍCULAS............................................................................................................ 61
4.4 MODIFICAÇÃO DO ELETRODO ............................................................................................................ 61
4.5 ANÁLISE DE HIBRIDIZAÇÃO ............................................................................................................... 62
4.6 MEDIDAS ELETROQUÍMICAS .............................................................................................................. 62
4.7 MEDIÇÕES DE MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA ................................................................................. 63
5. CONCLUSÃO ..................................................................................................................................... 64
6. PERSPECTIVAS .................................................................................................................................. 65
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................................... 66
APÊNDICE A - ARTIGO CIENTÍFICO ........................................................................................................ 87
ANEXO A – PEDIDO DE PATENTE ........................................................................................................ 114
ANEXO B – NORMAS DA REVISTA ...................................................................................................... 116
17
1. INTRODUÇÃO
No decorrer de sua evolução o Schistosoma resistiu às pressões seletivas impostas
por diversos fatores, tais como mudanças climáticas e ambientais, além de significativas
variações no tamanho da população de seus hospedeiros intermediário e
definitivo. Atualmente, mudanças no nível de desenvolvimento social humano
involuntariamente tem favorecido a proliferação desta parasitose, aumentando as
chances de infecção e prevalência da doença (Rollinson et al., 2013). A estreita relação
com a pobreza, o isolamento geográfico, a estigmatização, o baixo interesse político
bem como a falta de uma estrutura de financiamento global estabelecida no combate à
doença são alguns dos fatores que explicam o abandono geral da esquistossomose e
outras doenças tropicais negligenciadas em geral (Molyneux 2008; Weiss, 2008; Gray et
al., 2010).
Existem seis espécies de Schistosoma capazes de parasitar os seres humanos:
Schistosoma haematobium, Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum, Schistosoma
mekongi Schistosoma malayensis e Schistosoma intercalatum, sendo as três primeiras as
de maior ocorrência. Destas seis espécies, somente o S. mansoni vive nas Americas do
Sul e Central. A inexistência de hospedeiros intermediários susceptíveis a infecção
impossibilita a existência das outras espécies nestes locais (Gryseels et al., 2006; Davis,
2009; Brasil, 2014).
Do ponto de vista de saúde pública, a esquistossomose é considerada a mais
importante doença à base de água, ou seja, transmitida a partir do contato com água
contaminada. No Brasil uma média de 101.293 portadores de S. mansoni foram identifi
cados por meio de inquéritos coproscopicos. Segundo a Organização Mundial de Saúde
(OMS), estima-se que 200-209 milhões de pessoas no mundo estejam infectadas e que
600-779 milhões correm risco de serem infectadas em países endêmicos (WHO, 2013;
Utzinger et al., 2009; Rollenberg, 2011; Brasil, 2014). Porém estes números podem não
corresponder à realidade já que as técnicas de diagnóstico atuais não apresentam
sensibilidade elevada na detecção de infecções leves (King, 2010). Daí faz-se necessário
o desenvolvimento e implementação de metodologias mais eficazes para o diagnóstico
18
da esquistossomose, que possuam elevada sensibilidade e especificidade que serão
necessárias em programas de controle e eliminação desta doença (Utzinger et al., 2011).
A esquistossomose ocorre de forma endêmica em vários estados brasileiros, dentre
eles Pernambuco. Além do adoecimento, o risco de óbito por esquistossomose é
bastante relevante. Atualmente considerada como grave problema de saúde pública
estando o seu combate incluso no Programa de Enfrentamento às Doenças
Negligenciadas – SANAR (Pernambuco, 2015). O desenvolvimento de novas
metodologias diagnósticas para a esquistossomose visa contribuir com a estratégia de
eliminação desta patologia.
Desta forma, os biossensores apresentam-se como importantes ferramentas para
complementar as técnicas de diagnóstico existentes, graças às suas características
exclusivas, tais como: seletividade, relativo baixo custo de desenvolvimento e
armazenagem, potencial para miniaturização, facilidade de automação além da
possibilidade de construção de dispositivos simples e portáteis (Rosato et al., 2001).
Eles conjugam um componente biológico, que interage com um elemento alvo, a um
transdutor que transforma os processos de biorreconhecimento em sinais elétricos
mensuráveis (Wang, 2000; Pathak et al, 2007).
Os biossensores são dispositivos capazes de detectar rapidamente substâncias
químicas e/ou biológicas, tanto qualitativa quanto quantitativamente, já que este
dispositivo responde seletiva e reversivelmente, produzindo um sinal elétrico cuja
intensidade depende da concentração da amostra (Alfaya, 2008).
O desenvolvimento de biossensores eletroquímicos de hibridização DNA tem
atraído esforços de investigação consideráveis nos últimos anos (Palecek, 2009).Com o
advento da nanociência e da nanotecnologia, o uso de nanomateriais no
desenvolvimento de sensores eletroquímicos de DNA tem se tornado uma prática
frequente, já que o uso destes nanomateriais imprime uma melhora significativa no
desempenho destes biossensores, oferecendo excelentes perspectivas para a concepção
de novos sistemas sensores (Bonanni, 2010; Shi et al., 2014). Isto se dá pelas
19
propriedades únicas de materiais em escala nanométrica que apresentam excelentes
possibilidades de uso na interface de eventos de reconhecimento biológicos com
transdução de sinal eletrônico (Malik et al., 2013).
Diferentes métodos de modificação de eletrodo são utilizados para aumentar a sua
sensibilidade e especificidade atenuando assim os inconvenientes inerentes na detecção
do analito. Biossensores possuem a capacidade para diminuir o intervalo de tempo entre
a adsorção da amostra e obtenção dos resultados, especialmente quando tais dispositivos
são combinados com os nanomateriais (Suárez et al., 2013). As nanopartículas de ouro
têm a capacidade de estabelecer uma imobilização estável de biomoléculas, por
conseguinte, uma grande vantagem para a preparação de biossensores. Além disso, o
uso de nanopartículas de ouro dispensa a o uso de mediadores de transferência de
elétrons, uma vez que permitem a transferência eletrônica direta entre a amostra
analisada e a superfície do eletrodo (Pingarrón et al., 2008).
Neste sentido, o desenvolvimento de genossensores impedimétricos para detecção
de Schistosoma em diferentes fluidos biológicos é de fundamental importância, pois
possibilita o diagnóstico precoce da doença e consequentemente a diminuição de sua
evolução para as formas mais graves.
20
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Esquistossomose
Também conhecida como “bilharziose”, “Xistose”, “Barriga d’água” e “Doença
dos Caramujos” a esquistossomose é uma doença infecciosa granulomatosa. A primeira
citação da doença foi feita por Teodor Bilharz em1851 (Carvalho et al., 2008a; Brasil,
2009). É uma doença tropical negligenciada debilitante, considerada uma das mais
graves infecções parasitárias do mundo (Radwa et al., 2014). No Brasil a única espécie
encontrada é o Schistosoma mansoni, que coloniza o sistema portal humano. Acredita-se
que cerca de 25 milhões de pessoas vivem em áreas endêmicas no Brasil e 4 a 6 milhões
está infectada, a maioria destas áreas estão localizadas nos estados do Nordeste
(Lambertucci, 2010; Brasil, 2013). Os focos de contaminação ocorrem
predominantemente em áreas rurais, e em comunidades pobres das periferias das
grandes cidades, onde o saneamento básico é precário ou inexistente e os dejetos são
lançados diretamente em córregos que alimentam rios e lagos que se tornam assim
ambiente propício para a proliferação dos caramujos (Vitorino et al., 2012).
A esquistossomose tem grande importância nas discussões sobre saúde em todo o
mundo devido a sua abrangência espacial e continental. Ocupa a segunda posição no
ranking das doenças tropicais, perdendo apenas para a malária, apresentando altos
índices de morbidade. É considerada uma doença insidiosa e incapacitante em idades
precoces, porém raramente fatal e está relacionada principalmente à ausência ou a
precariedade de saneamento básico (WHO, 2008).
A morbidade da doença, representada principalmente pelas formas mais graves,
está associada, entre outros fatores, à intensidade e duração da infecção e à resposta
imune do hospedeiro aos antígenos do parasito (Coura e Amaral, 2004; Jesus, 2004;
Lambertuci, 2005). A carga parasitária, por sua vez, é influenciada pelo grau de contato
com a água, reflexo das condições socioeconômicas e culturais da população. Deve-se
observar ainda que a morbidade da doença pode acarretar prejuízos tanto à cognição e
21
desenvolvimento intelectual das crianças infectadas quanto à produtividade dos
trabalhadores (Rollemberg, 2008).
2.1.1 Ciclo de transmissão Parasitária
O agente etiológico da esquistossomose mansonica, é o S. mansoni. É um
helminto da classe dos Trematoda, família Schistossomatidae e gênero Schistosoma.
São organismos digenéticos, finos, esbranquiçados e dióicos, durante o acasalamento a
fêmea adulta, mais alongada, encontra-se inserida em uma fenda do corpo do macho,
chamada de canal ginecóforo. Os indivíduos adultos habitam os vasos mesentéricos do
hospedeiro definitivo e suas formas intermediárias se desenvolvem em caramujos
gastrópodes aquáticos do gênero Biomphalaria, seu hospedeiro intermediário. O homem
é o seu principal hospedeiro definitivo, já os primatas, marsupiais, ruminantes, roedores
e lagomorfos, são considerados hospedeiros permissivos ou reservatórios, e sua
participação ainda não é totalmente conhecida no ciclo de transmissão da doença, apesar
da capacidade de todos em eliminar ovos nas fezes (Brasil, 2010; Brasil, 2009).
Dez espécies e uma subespécie de Biomphalaria ocorrem no Brasil, porém
somente três são hospedeiras naturais do Schistosoma mansoni: a) B. glabrata b) B.
tenagophila e c) B. straminea. (Figura 1). B. straminea ocorre na maioria das bacias
hidrográficas no Brasil, sendo a espécie predominante no Nordeste. B. tenagophila,
distribui-se mais restritamente ao sul da Bahia até o Rio grande do Sul (Timbó e Lima,
1999; Tibiriçá, 2008). Já o Biomphalaria glabrata é o mais importante hospedeiro
intermediário do S. mansoni nas Américas, responsável pela transmissão da
esquistossomose em quase todas as regiões onde ocorre a doença, altamente susceptível
a S. mansoni, com taxas de infecção superiores a 50% (Carvalho et al., 2008c).
22
Figura 1: caramujos hospedeiros intermediários da esquistossomose. Fontes: http://www.xenophora.org.
A transmissão parasitária (Figura 2) ocorre quando fezes humanas contendo ovos
de S. mansoni contaminam coleções hídricas (rios, córregos, lagoas e açudes). Em
condições ideais de temperatura e luz os ovos eclodem e liberam os miracídios que são
larvas ciliadas bastante ágeis com avançada capacidade de locomoção e afinidade
quimiotática aos moluscos. Algumas horas após a penetração dos miracídios no
caramujo tem início um complexo processo de alterações morfológicas originando os
esporocistos primários e esporocistos secundários e por fim a cercária. Estas rompem os
tecidos dos moluscos e se dispersam no ambiente aquático e, ao entrarem em contato
com o hospedeiro definitivo, penetram na sua pele e/ou mucosa iniciando assim o
processo infeccioso humano. Ao penetrarem a pele do hospedeiro definitivo, as
cercárias evoluem para uma forma parasitária primária chamada esquistossômulo, que
migra tanto através da circulação sanguínea quanto linfática, até atingir o coração e em
seguida os pulmões. Ao alcançarem os vasos sanguíneos os esquistossômulos são
conduzidos ao fígado, onde se desenvolvem em suas formas adultas. Nos vasos portais
mesentéricos, ocorre a sobreposição da fêmea no canal ginecóforo do macho e,
consequentemente, a cópula, seguida de oviposição (Barbosa et al., 2008; Brasil, 2005,
Brasil, 2009).
23
Figura 2: Ciclo de transmissão parasitária da esquistossomose. Fonte:
http://parasitandonaweb.xpg.uol.com.br/crbst_40.jpg.
2.1.2 Epidemiologia
Estudos realizados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) estimaram que, no
ano de 2012, cerca de 249 milhões de pessoas necessitaram de tratamento preventivo e
42,1 milhões receberam tratamento para a esquistossomose. A doença causada pelo
Schistosoma mansoni está presente em 54 países, com número maior de casos na África,
Leste do Mediterrâneo e nas Américas. Na América do Sul, é encontrada na Venezuela,
nas ilhas do Caribe e no Brasil (WHO, 2014).
Acredita-se que a esquistossomose ocorra de forma bastante significativa no
Brasil, sendo endêmica em alguns estados do Nordeste além do norte de Minas Gerais
onde ocorre a transmissão de forma mais intensa. As áreas endêmicas e focais abrangem
24
19 unidades federadas. A esquistossomose ocorre de forma endêmica nos estados do
Maranhão, Alagoas, Bahia, Rio Grande do Norte, Pernambuco, Sergipe, Paraíba,
Espírito Santo e Minas Gerais e de forma focal no Ceará, Piauí, Pará, Rio de Janeiro,
Santa Catarina, São Paulo, Paraná, Rio Grande do Sul, Goiás e no Distrito Federal, não
atingindo grandes áreas (Brasil, 2011 ).
O estado de Pernambuco é considerado a unidade federada do Brasil com maior
grau de endemicidade para a esquistossomose e apresenta aproximadamente 1/3 dos
óbitos. Nesse estado, a esquistossomose é tradicionalmente endêmica na região rural,
em localidades onde as taxas de infecção humana variam de 12% a 82%. Em 2012,
foram registrados 488 óbitos pela doença no Brasil, sendo 63,3% destes na Região
Nordeste. Pernambuco registrou o maior número de óbitos, 158, o que equivale a 32,4%
dos óbitos por esquistossomose no País. Em 2013 este numero diminuiu para 141
óbitos, em 2014 foram realizados 256.660 exames parasitológicos de fezes em 117
municípios. Apositividade de Schistosoma mansoni variou de 0,1% a 22,0% nos
municípios endêmicos (Brasil, 2013; Pernambuco, 2015).
É uma endemia de fácil expansão em função da associação de alguns fatores como
a extensão de áreas agrícolas com projetos de irrigação, devastação ambiental, utilização
das águas naturais contaminadas e ocupação das terras por uma população de baixo
nível socioeconômico (Tibiriçá, 2008). Desta forma, a esquistossomose pode ser um
indicativo socioeconômico importante, estando intimamente ligada à pobreza e a sua
relação como questão de saúde pública é decorrente desta inter-relação (Souza e Santos,
2008).
As regiões consideradas endêmicas para esquistossomose são localidades
contínuas ou adjacentes onde a transmissão da parasitose está plenamente estabelecida e
para sua classificação avaliados dois critérios: prevalência, onde as localidades são
distribuídas em áreas de baixa, média e alta endemicidade, com prevalência inferior a
5%, superiores a 5% e a 15% respectivamente, e características epidemiológicas locais,
em que as localidades são classificadas como: sem potencial de transmissão, quando não
é encontrando o hospedeiro intermediário, com potencial de transmissão quando o
25
hospedeiro intermediário é detectado e com transmissão quando há presença do
hospedeiro intermediário e pelo menos um caso autóctone nos últimos três anos (Brasil,
2009; Brasil, 2010). A Figura 3 mostra a distribuição geográfica da esquistossomose no
Brasil no ano de 2010
Figura 3: Distribuição da esquistossomose, de acordo com o percentual de positividade por município no
Brasil no ano de 2010. Fonte: Brasil, 2013.
Diante destes fatos o Ministerio da saúde elaborou um plano de ações estratégicas
de combate e definiu um conjunto de endemias negligenciadas e\ou relacionadas a
pobreza que demandam ações estratégicas para sua eliminação como problema de saúde
pública dentre elas a esquistossomose. Neste plano de ação o governo do Brasil assume
um compromisso público de eliminar ou reduzir drasticamente a carga dessas doenças.
Caracteriza-se principalmente pela proposição de estratégias de busca ativa de novos
casos e tratamento oportuno visto que esforços dirigidos especificamente para a
detecção precoce, bem como para o maior número de tratamentos realizados,
impactarão na redução da circulação ambiental dos agentes etiológicos dessas endemias,
e na redução do surgimento de novos casos e de suas consequências (Pernambuco,
2015).
26
2.1.3 Sintomas
Em relação à manifestação clínica da doença, a esquistossomose pode ser
classificada em duas formas evolutivas: a aguda e a crônica. A característica da fase
aguda é a sintomatologia bem característica como: a dermatite cercariana, provocada
pela penetração das cercárias na pele que tem sua intensidade variável desde um quadro
assintomático até o surgimento de dermatite urticariforme, com erupção papular,
eritema, edema e prurido, perdurando até cinco dias após a infecção, e a febre Katayama
que surge geralmente de um a dois meses após a infecção, apresenta-se com febre alta,
mialgias, astenia, cefaléia e tosse seca, A febre Katayama recebe este nome pois
apresenta a mesma sintomatologia que a doença primeiramente identificada na cidade
japonesa de Katayama e que estava relacionada com o S. japonicum. Os sintomas mais
comuns são mal-estar, dor de cabeça, perda do apetite, suor intenso, diarréia com ou
sem dor abdominal. Nos casos crônicos há dor abdominal, dificuldade de digestão e
náuseas. A fase crônica acomete principalmente o aparelho digestivo, com dispepsia,
surtos diarréicos (em alguns casos sanguinolentos), meteorismo, tenesmo,
hepatoesplenomegalia, e por fim sinais de hipertensão portal (Pordeus et al., 2008;
Carvalho et al., 2008b).
Os sintomas mais agudos surgem quando os vermes amadurecem no organismo
humano, após quatro a seis semanas da infecção, mas não é raro, na sua passagem pelos
pulmões, provocarem febres e problemas respiratórios. Dependendo do grau de
infestação, o fígado pode aumentar muito de tamanho e o doente fica com a barriga
inchada, daí a denominação de barriga d'água (Figura 4).
Em casos mais graves, devido a fibrose extensa do fígado, ocorre hipertensão da
circulação portal - acumula-se sangue no baço e aparecem varizes no esôfago, órgãos
cujas veias desembocam no sistema porta. A ruptura das varizes esofágicas provoca
hemorragias extensas (hematêmese) e muito graves. A desnutrição dos pacientes é
devida não só a anemia decorrente das hemorragias, mas também ao funcionamento
insuficiente do fígado (Carvalho et al., 2008c).
27
Figura 4: Manifestação hepatoesplênica da esquistossomose. Fonte: Lambertucci et al., 2009
2.1.4 Formas ectópicas
Apresentações ectópicas da esquistossomose ocorrem quando os ovos do parasita
ou formas adultas estão localizados longe do seu local normal (sistema portal).
Esquistossomose ectópica foi reportada em diferentes localizações como: no apêndice
cecal, vesícula biliar, pâncreas, peritônio, sistema urogenital, sistema nervoso central,
miocárdio, pele, esófago, estômago, tireoide e adrenal (Melo e Coelho, 2000). O ciclo
de vida do Schistosoma é bem estabelecido. No hospedeiro definitivo, após as cercárias
penetrarem a pele, migram até os vasos sanguíneos sistêmicos através dos vasos
linfáticos. Nos sinusóides portais, evoluem para vermes adultos, quando então migram
até os plexos venosos na região da bexiga e reto. Em áreas não endêmicas, sugere-se
que os vermes podem afastar-se do seu caminho habitual, causando lesões cutâneas
ectópicas (Figura 5) (Tranquilini et al, 2011). Destaca-se que manifestações através de
lesões ectópicas de pele são raras em pacientes acometidos pela esquistossomose e
podem ocorrer tardiamente. Geralmente, elas ocorrem mais em visitantes de áreas
endêmicas do que na população residente, o que pode ser justificado pela imunidade
natural, fatores raciais e genéticos (Perez, 2004; Leman et al, 2001).
28
Figura 5: Manifestação cutânea da esquistossomose. Fonte: Poderoso et al., 2008
Várias manifestações cutâneas estão associadas à infestação pelo Schistosoma.
Dentre elas a dermatite cercariana que resulta da penetração das cercárias na pele intacta
e ocorre logo após o contato com a água contaminada (Tranquilini et al., 2011). No
entanto, as lesões cutâneas podem ser causadas pela deposição de ovos ou, raramente,
de vermes adultos na pele. Esta forma de envolvimento cutâneo manifesta-se geralmente
nas regiões perigenitais e genitais (Perez, 2004). Lesões infiltrativas nestas regiões
provocam uma reação inflamatória e fibrótica, levando à formação de granulomas
(Tranquilini, 2011).
O envolvimento do sistema nervoso central pode ser sintomático (Figura 6) ou
sem sintomas (Moreno et al., 2003). A ocorrência de altas taxas de infestação, com
grande envolvimento pulmonar com sintomas respiratórios geralmente é relatado
(Poderoso et al., 2008). A apresentação urogenital não é incomum em áreas endêmicas
(Basílio et al, 2002).
29
Figura 6: Mielorradiculopatia esquistossomótica. A seta aponta a bolsa de urina drenada pelo cateterismo
vesical em paciente paraplégico e com retenção urinária e fecal. Fonte: Carvalho et al., 2013
A Neuroesquistossomose mansônica (NSM), refere-se à infecção por S. mansoni
com comprometimento do sistema nervoso central (SNC), que pode ou não resultar em
manifestações clínicas. Quando sintomática, é um grave distúrbio no qual o prognóstico
depende em grande parte do diagnóstico e tratamento precoces. Embora rara em
comparação a alta prevalência de manifestações hepato-intestinais, a NSM não é pouco
frequente e é provavelmente sub-reconhecida (Chen et al., 2006), portanto a sua real
prevalência é desconhecida.
O comprometimento do sistema nervoso depende da presença dos ovos ou dos
vermes adultos nos parênquimas cerebral, medular ou no espaço subaracnóideo. O
Schistosoma mansoni alcança o cérebro quando há hipertensão portal, devido ao desvio
do fluxo venoso intra-abdominal para o sistema da cava superior. Na circulação
pulmonar, por meio de “shunts” arteriovenosos pulmonares, o Schistosoma mansoni
chega a circulação sistêmica sendo embolizado para diversos órgãos, entre eles o
encéfalo (Matas, 2001). Nestes casos, o diagnóstico faz-se tardiamente, não raro em
achados de autópsia ou quando o paciente está em fase terminal da doença.
30
A neuroesquistossomose é um problema de saúde pública. Até recentemente essa
patologia era considerada rara. No entanto, a frequência do acometimento neurológico
oscila entre 0,3% e 4% dos portadores de esquistossomose. No Brasil, existem cerca de
10% de indivíduos com esquistossomose, em torno de 17 milhões, portanto há
possibilidade de existir algo em torno de 51.000 a 680.000 pessoas com
neuroesquistossomose ou com grande potencial para desenvolvê-la (Santos, 2008).
2.1.5 Diagnóstico da Esquistossomose
A detecção microscópica direta de ovos de schistosoma excretados na urina e / ou
fezes é um método específico, já que ovos de schistosoma são fáceis de detectar e
identificar em microscopia devido o tamanho e a forma característicos com uma espinha
lateral ou terminal (Wang et al., 2003). Ovos de S. mansoni podem ser encontrados a
partir do 40º dia do contágio. Embora considerado o padrão "ouro" para a detecção de
infecções por schistosoma em seres humanos, esta metodologia apresenta limitações em
infecções leves, quando os ovos ficam presos no tecido ou ainda em áreas de baixa
transmissão. Além disto, esta técnica diagnóstica não apresenta uma ferramenta
automatizada que auxilie na contagem dos ovos de S. mansoni, necessitando, portanto
de um profissional qualificado para sua execução (Wang et al., 2010).
Devido à sua facilidade operacional em campo e por permitir a quantificação de
ovos por grama de fezes o método de Kato-Katz (Katz et al., 72) é intensamente
utilizado em inquéritos coproscópicos e investigações epidemiológicas (Doenhoff et al.,
2008; Zhou et al, 2009; Stothard et al, 2009; Ibironke et al, 2011).
A detecção de anticorpos pode ser útil em determinadas circunstâncias, tais como
em pacientes não ovo excretores, mas a sua aplicação é limitada (Wang et al., 2010; Li
et al., 2010). Os ensaios diagnósticos imunológicos, ou seja, baseados na detecção de
anticorpos apresentam alta sensibilidade, no entanto, não conseguem distinguir
infecções passadas das atuais e são relativamente susceptíveis a reações cruzadas com
outros antígenos (Ross et al., 2002; Stothard et al., 2009). A maioria das técnicas se
baseiam na detecção de anticorpos IgG, IgM, ou IgE contra o antígeno solúvel do verme
31
adulto ou do ovo por ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), hemaglutinação
indireta, ou immunofluorescência (Wang et al., 2003; Wang et al., 2010).
Ensaios baseados em reação em cadeia da polimerase (PCR) são específicos e
altamente sensíveis, são utilizados na detecção de DNA de Schistosoma em excreções
humanas, soro e plasma. A sensibilidade desta técnica é bastante satisfatória, sendo o
limite de detecção de cerca de um fentograma (10-15g). (Ten Hove et al, 2008;
Wichmann et al., 2009; Gomes et al., 2010; Ibironke et al., 2011; Carvalho, 2008c).
Porém, a sua aplicação requer infraestrutura de alto custo, em laboratório de alta
tecnologia e manuseio altamente precisos das amostras além do uso de kits e
equipamentos. Sendo assim uma técnica limitada para uso em larga escala não
disponível para a rotina (Carvalho et al., 2008b; Rollinson et al., 2013).
Em adição, biópsias da bexiga ou da mucosa retal aparecem como alternativa para
o diagnóstico em pacientes com uma apresentação clínica típica de esquistossomose,
mas sem ovos detectáveis na urina ou fezes (Wang et al., 2010). Métodos indiretos de
diagnóstico desta infecção usando dados clínicos, subclínicos, ou marcadores
bioquímicos não são específicos dada a apresentação generalizada da esquistossomose.
A biópsia é um método de fácil execução e indolor, porém por ser uma técnica invasiva,
é pouco utilizada. Na esquistossomose crônica, sem hipertensão portal, uma biópsia
retal apresenta cerca de 80% de positividade enquanto que no exame de fezes, 50%.
Métodos indiretos atuais incluem o uso da avaliação clínica do paciente associado com
ultra-som, biópsia hepática e exame histológico subsequente e a medição de marcadores
bioquímicos (Wang et al., 2003; Wang et al., 2010).
A detecção de antígenos circulantes de verme adulto ou ovos marcados com
anticorpos monoclonais ou policlonais em soro, urina, ou expectoração apresenta-se
como uma nova técnica promissora que pode eventualmente substituir métodos
tradicionais de diagnóstico (Wang et al., 2003; Wang et al., 2010). Porém estudos
demostram que sua sensibilidade e/ou especificidade ainda não são suficientes para um
diagnóstico definitivo (Li et al., 2010).
32
Ante o exposto faz-se necessário o desenvolvimento de um método de detecção
rápidos, sensíveis e seletivos para a determinação da infecção pelo schistosoma tanto
para a proteção da saúde quanto para a continuação do tratamento médico (Zhou et al.,
2002a e Zhou et al., 2002b). Neste sentido a determinação eletroquímica tem se
destacado devido as vantagens de baixo custo, alta sensibilidade além de ser de fácil
manuseio (Buso et al., 2000; Zhu et al., 2009).
2.1.6 Tratamento
O tratamento da esquistossomose é medicamentoso, porém é sempre limitado pelo
reduzido número de quimioterápicos disponíveis que exibissem eficácia, segurança e
grande tolerabilidade com alta eficácia e baixa toxicidade. As drogas utilizadas são
oxaminiquine, 15 mg/kg de peso para adultos e 20 mg/kg para crianças até 15 ano, que
age nos vermes adultos, impedindo a oviposição e praziquantel 50 mg por quilo de peso
corporal (mg/Kg) em adultos e 60 mg/kg para crianças até 15 anos, sendo administrado
tanto na fase aguda como na crônica (Carvalho et al., 2008b; Brazil, 2013). No entanto,
ambos apresentam limitações, como baixa eficácia no tratamento da esquistossomose
mansônica aguda, baixa atividade sobre o S. mansoni em suas formas imaturas, bem
como falha em tratamentos devido à ocorrência de resistência ou tolerância a esses
fármacos (Frezza et al., 2007).
2.2 Biossensores
As técnicas de análises químicas e biológicas tradicionais envolvem reações que
ocorrem em solução por meio de mistura dos reagentes. Um biossensor refere-se a um
dispositivo em que o componente biológico está imobilizado no sistema e a reação
ocorre à superfície de um eletrodo (Chaubey et al, 2002).
De modo geral, o funcionamento de um biossensor, envolve a especificidade e a
alta sensibilidade do componente biológico com o substrato de interesse. Os
biossensores, além de se apresentarem como promissoras ferramentas para diagnose
33
clínica possuem uma ampla abrangência de mercado, cobrindo as áreas militar, controle
de processos, alimentícia, de bebidas e agricultura além de monitoramento ambiental
rápido e contínuo. As vantagens dos biossensores não se limitam à sensibilidade e
seletividade, mas também ao fato de, comumente, dispensarem um complicado pré-
tratamento da amostra, o que confere praticidade, rapidez nas análises e diminuído gasto
de reagentes, proporcionando assim, agilidade na obtenção dos resultados, e redução no
custo financeiro (Furtado et al., 2008).
Um sensor químico pode ser definido como sendo um dispositivo que transforma
informações químicas, em um sinal analiticamente útil. Estes sensores são geralmente
constituídos por dois componentes básicos ligados em série: um sistema de
reconhecimento químico (receptor) e um transdutor. Os biossensores são sensores
químicos, em que o sistema de reconhecimento utiliza um mecanismo biológico
(Trevenot et al, 2001) como representado na Figura 7.
Figura 7: Representação esquemática de um biossensor. Fonte
http://www.infobibos.com/Artigos/2006_2/ITBA/figura1.jpg.
34
Os biossensores são dispositivos que englobam um elemento de transdução
revestido por uma camada de reconhecimento bioativa. O elemento biosseletivo,
conhecido como biorreceptor, é o componente responsável pela
seletividade/especificidade dos biossensores, podendo ser composto por enzimas,
anticorpos, DNA, ou quaisquer outras células ou organelas de seres vivos e constitui
uma interface entre o analito e o eletrodo sensor. Esta interface é responsável pela
regulação da especificidade e sensibilidade do dispositivo, pois é capaz de reconhecer a
interação entre seus analitos específicos de forma direta ou por meio de um mediador.
Da reação da interação do bioelemento com o analito resulta num produto que é
seletivamente detectado e quantificado pelo dispositivo sensor. O elemento biológico
poderá converter o analito noutra espécie química através de uma reação bioquímica,
produzir ou libertar outro produto químico, alterar as suas propriedades ópticas,
eléctricas ou mecânicas ou produzir qualquer outra resposta que possa ser quantificada.
O transdutor tem a finalidade de converter a alteração físico-química no material
biologicamente ativo, resultante da interação com o analito, num sinal elétrico que pode
ser adequadamente processado fornecendo um sinal de saída (Lojou et al, 2006;
Chaubey et al 2002; Mello e Kubota, 2002; Campàs et al., 2008)
2.2.1 Classificação dos Biossensores
Existem diversas classificações para os biossensores. De acordo com a IUPAC
(União Internacional de Química Pura e Aplicada), podemos classificá-los de acordo
com material biológico específico usado para o modo de reconhecimento ou de
transdução de sinal ou gerado pela combinação da mesma (Thévenot et al., 2001). No
que diz respeito ao material biológico pode ser dividido em várias classes onde
destacamos os biossensores enzimáticos que apresentam enzimas como elemento de
bioreconhecimento, imunossenssores que tem utilizam proteínas globulares de soro (tais
como imunoglobulinas) e antígenos como bioreceptores. Quimiossensores que trata-se
de um sistema que utiliza proteínas que interagem com espécies químicas, tais como
hormônios, resultando em variações conformacionais. Biossensores microbiológicos
que são formados por um microrganismo imobilizado, sensível e que especificamente
35
reconhece a espécie de interesse além dos biossensores imobilizados com ácidos
nucleicos e aptâmeros (Bansi et al., 2003; Hideaki et al., 2003; Loureiro et al., 2010).
Em relação ao tipo de transdutor os biossensores podem ser classificados como
eletroquímico baseado no movimento de íons e difusão de espécies eletroativas,
termométrico onde se leva em conta a mudança de temperatura, piezoelétrico com a
alteração de microviscosidade e/ou massa como base para análise e óptico em que a
absorção ou emissão de radiação eletromagnética é o dado principal a ser analisado.
Dentre estes tipos de transdutores os eletroquímicos têm se destacado (Furtado et al.,
2008; Singh, 2008).
2.2.1.1 Biossensor Eletroquímico
Nos sensores eletroquímicos, a resposta é obtida na forma de um sinal elétrico, em
decorrência de reações químicas envolvendo íons ou elétrons, reações estas que geram
mudanças nas propriedades elétricas da solução ou da superfície do eletrodo. Estas
mudanças são usadas como parâmetro de detecção. Os sensores eletroquímicos são uma
importante subclasse de sensores químicos, nestes dispositivos um eletrodo é utilizado
como componente transdutor, com o intuito de gerar um sinal elétrico que esteja de
algum modo relacionado com a concentração do analito. Neste tipo de dispositivo um
elemento bio-específico é imobilizado na superfície de um eletrodo, que vai converter o
processo de reconhecimento biológico numa resposta quantificável (Chaubey e
Malhotra, 2002).
As técnicas eletroquímicas fornecem limites de detecção excepcionalmente baixos
e uma abundância de informações que caracterizam e descrevem eletroquimicamente
determinados sistemas, sempre baseado nas propriedades elétricas de uma solução de
analito em contato com uma célula eletroquímica. Tais informações incluem a
estequiometria e a velocidade de transferência de carga interfacial, a velocidade de
transferência de massa, a extensão de adsorção e de quimissorção e as velocidades e
constantes de equilíbrio de reações químicas. Os biossensores eletroquímicos
36
constituem a grande maioria dos biossensores desenvolvidos. Suas principais vantagens
são baixo custo, alta sensibilidade, screening rápido e estabilidade (SONG et al, 2006).
A eletroquímica é um processo interfacial que envolve a transferência (ou o
impedimento desta) de um elétron de uma espécie em solução para o eletrodo ou do
eletrodo para a solução. Para que a eletroquímica possa ser utilizada como ferramenta de
análise é necessário que ocorra um contato entre o eletrodo e o analito possibilitando
assim a transdução. Quando um eletrodo inerte é inserido em uma solução eletrolítica
ele passa a ter o potencial da solução, no entanto, se este eletrodo foi mantido em outro
potencial, antes de entrar em contato com a solução, será mantida então uma diferença
de potencial (d.d.p.). O potencial é medido geralmente em termos relativos, sendo
necessário o uso de eletrodos de referência que contêm as formas oxidadas e reduzidas
de um composto, e apresentam o potencial constante. Um terceiro eletrodo, o auxiliar
(ou contra eletrodo), é comumente empregado em uma célula eletroquímica. O contra
eletrodo é constituído de um material inerte na faixa de potencial que se deseja
trabalhar, geralmente é feito de um fio de platina. Ele tem como função principal
minimizar os erros causados pela resistência da célula no controle do potencial do
eletrodo de trabalho. Funcionando como fonte ou sorvedouro de elétrons. (Diamond,
1998; Bard e Faulkned, 2001a).
É necessário o uso do potenciostato para que uma das técnicas eletroquímicas seja
empregada. A função deste equipamento é controlar o potencial aplicado no eletrodo de
trabalho e medir a corrente que passa por ele. Dependendo do tipo de detecção estes
podem ser divididos em amperométricos, potenciométricos e condutimétricos.
Detecção amperométrica
A detecção amperométrica baseia-se na mensuração da corrente resultante do processo
de oxidação ou redução eletroquímica de uma espécie eletroativa. É normalmente obtida
através da manutenção de um potencial constante a um eletrodo de trabalho ou numa
série de eletrodos em relação a um eletrodo de referência, que também pode servir como
eletrodo auxiliar, se as correntes são baixas. A corrente resultante é diretamente
37
proporcional com a concentração em massa da espécie eletroativa ou sua taxa de
produção ou consumo (Thévelot et al., 2001). Nos métodos de detecção amperométrica
é aplicado uma diferença de potencial ao eletrodo de trabalho, conseguindo-se assim
que a espécie a ser determinada reaja e uma corrente seja gerada.
Usualmente o sistema fundamental de medida é formado por três eletrodos. Um
eletrodo de trabalho onde vai ocorrer a reação que será analisada, um eletrodo de
referência que ajusta o potencial aplicado no eletrodo de trabalho, e um contra-eletrodo
que fornece a corrente também ao eletrodo de trabalho. No entanto vale ressaltar que na
prática, para algumas aplicações, apenas os dois primeiros eletrodos serão suficientes.
Segundo a IUPAC pode ser definida como: Método de detecção em que a corrente é
proporcional à concentração da espécie geradora de corrente. A determinação
amperométrica foi o ponto de interesse neste trabalho através da técnica de Voltametria
Cíclica que será abordada mais adiante.
Detecção potenciométrica
Os biossensores potenciométricos estão relacionados com a detecção de um gradiente de
concentração de um íon com auxilio de um eletrodo. Estes dispositivos utilizam
eletrodos íon-seletivos como meio de transdução da reação biológica em um sinal
elétrico. Neste tipo de biossensor, a geração de prótons H+ altera o pH do meio e uma
diferença de potencial é criada entre um eletrodo de referência e o eletrodo íon-seletivo
(Kuralay 2005). Os biossensores potenciométricos geralmente fazem uso de um eletrodo
de referência (inerte) e um eletrodo operante, ambos em contato com a amostra, e se
baseiam no desenvolvimento de um potencial significativo no eletrodo operante por
acumulação da carga e portanto, elevação da densidade de carga. Assim, enzimas
consomem ou produzem espécies químicas fortemente polares ou íons oriundos da
catálise, que são detectadas pelo eletrodo de íons seletivos e transformadas em um sinal
mensurável.
38
2.2.1.2 Biossensor Óptico
Este tipo de dispositivo baseia-se na análise das mudanças das propriedades
ópticas de uma solução com o intuito de monitorar a concentração de determinado
analito (Bansi et al., 2003; Hideaki e Kamura, 2003). Nestes biossensores, fibras ópticas
são usadas para conduzir as ondas de luz para detectores apropriados, tais como um
eletrodo ou semicondutor (Mehrvar e Abdi, 2004). São baseados na medição da luz
absorvida ou emitida como consequência de uma reação bioquímica. São bastante
sensíveis, no entanto, não podem ser utilizados em meios turvos. Apresentam as
seguintes vantagens: tamanho reduzido, alta velocidade de resposta, não sofrem
interferência de ruído eletromagnético, boa biocompatibilidade e não necessitam de
elementos ativos na biocamada (Bansi et al., 2003; Hideaki e Kamura, 2003).
Entre os biossensores existentes, há os biossensores ópticos baseados no principio
de ressonância de plásmons de superfície, SPR do inglês Surface Plasmon Resonance.
Eles destacam-se na investigação de interações biomoleculares devido, além das
características supracitadas, à alta seletividade e sensibilidade e tempo de resposta de
análise da amostra em poucos minutos (Moreira et al 2010).
2.2.1.3 Biossensor Piezoelétrico
O dispositivo mais estudado e utilizado na detecção de massas é a microbalança
de cristal e quatzo (QCM), designação conferida a microbalanças piezoelétricas de
cristais de Quartzo. Esses tipos de biossensores contêm em seus transdutores cristais
piezoelétricos com espécies imobilizadas. Estes cristais vibram quando expostos a um
campo elétrico. A frequência dessa vibração varia de acordo com a espessura e do corte
do cristal, sendo que cada cristal possui um frequência de vibração característica. Esta
frequência característica muda quando o cristal absorve ou desadsorve moléculas em
sua superfície. Como a variação de frequência é proporcional à variação de massa do
material adsorvido, tal variação pode ser determinada por circuitos eletrônicos (Vladmir
et al., 2004).
39
A frequência de ressonância de um cristal piezoeléctrico oscilante geralmente é
influenciada por alterações na massa em sua superfície. Por exemplo, quando esta
superfície é revestida com um antígeno, a ligação destes com seus anticorpos
específicos ocasiona o consequente aumento de massa que pode ser detectada por uma
alteração na frequência. Técnicas de Imunoensaio Piezoelétrico tem sido muito
aplicadas em campos ambientais e relacionadas com os alimentos e laboratórios clínicos
(Wang et al., 2012).
No quadro a seguir (Quadro 1) uma relação dos tipos de biossensores mais
comumente utilizados. Fonte MASCINI et al., 2001 modificado.
40
2.3 Biossensores para Schistosoma
Com o intuito de desenvolver novas metodologias diagnósticas rápidas e sensíveis
para a detecção dos agentes etiológicos da esquistossomose, dentre eles o Schistosoma
japonicum, foi elaborado um imunossensor piezoelétrico simples, sensível, e reutilizável
usando membrana monocamada auto-montada de tecnologia mista (misto SAM), uma
mistura de ácido mercaptopropiónico (MPA) e mercaptoetanol (ME) auto-montados na
superfície de cristais de quartzo por ligações de enxofre e ouro para detecção de
antígenos de S. japonicum diretamente do soro como alternativa para os métodos
convencionais de diagnóstico bem como para imunossensores com camadas
automontadas únicas. Várias amostras de soro de coelho infectadas com diferentes
concentrações de anticorpos de S. japonicum foram analisadas utilizando ambas as
técnicas de imunossensor e ELISA e, em seguida, produziu-se uma análise de
correlação. Os coeficientes de correlação atingiram 0,973 (Wang et al., 2012).
O diagnóstico precoce desta enfermidade é importante, pois infecções a longo
prazo podem resultar em lesões graves que podem causar o bloqueio do fluxo sanguíneo
e hipertensão portal, que pode redirecionar os ovos para os pulmões e cérebro, onde eles
podem ser mortais (Chou et al., 2003). Uma importante estratégia para o diagnóstico
precoce de S. japonicum parece ser a detecção direta dos antígenos. Neste sentido
Cheng (2008) buscou desenvolver um novo método diagnóstico baseado em um
biossensor piezoelétrico para detecção direta de antígenos circulantes de S. japonicum
em amostras de soro. Para isto anticorpos de imunoglobulina G (IgG) e IgM foram
purificados a partir do soro de coelho imunizado. O estudo mostrou que a QCM com as
sondas policlonais e a diluição direta de soro é um conceito novo e sensível na fase
inicial de infecção. O método foi sensível par cerca de 500 cercarias, confirmando que
este método tem potencial para detectar S.japonicum na fase inicial da infecção. Nie e
colaboradores (2012) também visando a detecção imunológica do S.japonicum
desenvolveram um imunoensaio eletroquímico magnético utilizando como base
analítica uma plataforma de superfície hidrofóbica. Este estudo mostrou-se bastante
viaável apresentando sensibilidade em concentrações de anticorpos que variam de 2ng
mL-1 a 15 µg ml-1, com um limite de detecção de ~1.3 ng mL-1. Os resultados dos
41
ensaios apontam para a viabilidade de aplicações práticas dos biossensores na detecção
deste patógeno.
Em relação a novas metodologias diagnósticas, os imunossensores eletroquímicos
têm despertado grande interesse, por trata-se de um método adequado para diagnósticos
clínicos e podem ser utilizados para situações em que a capacidade de monitoramento
em tempo real seja exigida (Pohanka e Skladal, 2008). O estudo realizado por Ninoska e
colaboradores (2009) apresentam o desenvolvimento de um imunossensor
amperométrico baseado na proteína vegetal Apirase de Solanum tuberosum para a
determinação de anti-anticorpo de S. mansoni. A imobilização foi monitorada por
voltamperometria cíclica em Fe(CN)64-/Fe(CN)6
3-, que mostrou um resposta quase-
reversíveis e estáveis ao longo do tempo. Este processo também foi caracterizado por
ângulo de contato e microscopia eletrônica de varredura.
2.4 Genossensores
Técnicas de detecção de sequências de DNA têm sido amplamente desenvolvidas
em inúmeras áreas. Em química analítica tradicionalmente o DNA de fita simples é
utilizado como sonda de investigação, acompanhado de monitoramento do processo de
hibridização, que acontece com grande especificidade e afinidade (Cunningham, 1998).
Despertando um grande interesse nos estudos baseados em metodologias eletroanalíticas
para determinação de sequências específicas de bases nitrogenadas pelo monitoramento
do processo de hibridização (Palecek e Fojta, 2001). As vantagens são: o baixo custo, o
formato simplificado de análise, a medida em tempo real, a rapidez e a seletividade
(Mikkelsn, 2004; Berney et al., 2000; Pividori et al., 2000).
O comportamento eletroquímico do DNA tem sido bastante estudado. Sua
eletroatividade reside em pontos estruturais da molécula, sendo basicamente relativa aos
processos sofridos pelas bases nitrogenadas, mais precisamente da guanina, da adenina e
da citosina, visto que estes processos ainda não estão bem descritos para a base timina,
sendo a guanina a base que mais facilmente se oxida, ou seja, apresentam menores picos
42
de oxidação em menores regiões de potencial, e as moléculas de açúcar e de fosfato são
eletroquimicamente inertes Figura 8 (Pividori et al., 2007).
Figura 8: Esquema ilustrativo do acoplamento das bases nitrogenadas que compõe o DNA. Sítios de
oxidação e redução nas moléculas de guanina, citosina e adenina. Fonte: Marques, 2009
Os genossensores são dispositivos eletroanalíticos que incorporam uma camada
genética imobilizada na superfície de um transdutor, como elemento de reconhecimento,
convertendo informações de interação genética em sinais analíticos mensuráveis
(Cunningham, 1998; Eggins, 2002). Desta forma, os genossensores eletroquímicos
convertem sinais de interação entre bases nitrogenadas específicas, em sinais elétricos.
O monitoramento da formação da dupla fita de DNA, é feito pela modificação do
eletrodo com DNA específico, que por sua vez, vai interagir com uma sequência de
43
bases complementares formando assim a dupla fita híbrida, sendo esse processo de
identificação considerado bastante eficaz e específico, mesmo em presença de diferentes
sequências não complementares (Fojta, 2002). O monitoramento direto deste processo é
baseado nos processos redox sofrido pelas sequências específicas de DNA,
principalmente da molécula de guanina. Compara-se os distintos comportamentos
eletroanalíticos entre ssDNA e dsDNA, já que, o sinal obtido para a oxidação do DNA
sobre o eletrodo modificado com fita simples difere do obtido pelo eletrodo após o
processo de hibridização e consequentemente formação da fita dupla (Pividori et al,
2007).
Estes sensores são altamente sensíveis, de baixo, fácil manuseio, portátil e
compatível com as atuais microtecnologias, principalmente pela real possibilidade de
produção em massa (Palecek, 2002). Estes genossensores são atrativos para as
investigações e diagnósticos genéticos, bem como detecção de espécies patogênicas,
analitos de interesse clínico, espécies carcinogênicas, fármacos e sequências de bases de
DNA (humano, vírus, bactéria, etc.) ( Wang et al., 2006).
2.5 Nanopartículas
As nanopartículas (NPs) podem ser definidas como nanomateriais que variam em
tamanho de 1- 100 nm e cujas propriedades físicas e químicas se alteram
significativamente pela alteração de seu tamanho. Essas propriedades diferem das
encontradas nos mesmos materiais quando em dimensões maiores (Buzea et al., 2007;
Hasan, 2014). As nanopartículas são comumente empregadas na produção de
biossensores, especialmente porque oferecem vantagens como a elevada área
superficial, facilitam a transferência eletrônica além de facilitar a imobilização das
proteínas, sendo as nanopartículas de ferro de tipo magnetita muito exploradas (Kouassi
et al., 2005; Arteaga et al., 2010; Kaushik et al., 2008).
44
2.5.1 Aplicações de Nanopartículas em Biossensores
Com o aperfeiçoamento da nanomedicina surgem novas ferramentas com
aplicações de nanomateriais como alternativa à medicina convencional. Desta forma,
diversas aplicações de nanomateriais para diagnóstico e tratamento têm sido descritas na
literatura (Blanco et al., 2011; Caruso et al., 2012; Perinotto et al., 2008). A utilização
destes nanomateriais faz com que as instrumentações e metodologias tradicionais de
análise sejam melhoradas (Kranz et al., 2011). Assim, o uso de métodos de diagnóstico
baseadas em nanopartículas oferece uma alta sensibilidade.
As nanopartículas têm sido muito frequentemente usadas no desenvolvimento de
biossensores de DNA, seja por auto-montagem de oligonucleótidos tiolados na
superfície de ouro de nanopartículas (Patolski et al., 2000; Cai et al., 2002; Wang et
al.,2003), ou por imobilização (por ex. em SAMs ou polímeros (Wang et al., 2003;
Wang et al., 2012; Li et al., 2010). Diversas abordagens têm sido usadas para a detecção
eletroquímica da hibridização de sequências de DNA com base em nanopartículas, com
vantagens em termos de custo, sensibilidade e tempo de resposta. Em detecções
piezoeléctricas de processos de hibridização o uso de nanopartículas de ouro
desempenha um papel importante na amplificação do sinal na microbalança de cristal de
quartzo (Du et al., 2009 ). Superfícies modificadas com nanopartículas de Pt, em
combinação com nanotubos de carbono, aliam as vantagens destes materiais
(transferência eletrônica e atividade eletrocatalítica) e aumentam a sensibilidade do
biossensor (Zhu et al., 2005).
Variados métodos de biosensoriamento altamente sensíveis para ácidos nucleicos,
proteínas, anticorpos, enzimas e outras moléculas biológicas têm sido desenvolvidos,
utilizando diferentes propriedades físico-químicas das nanopartículas metálicas como
nanopartículas de ouro e óxido de ferro. Dentre os métodos podemos destacar: Sensor
de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR), fluorescência, Espectroscopia Raman
amplificada por superfície (SERS) e outras atividade eletroquímica.
45
Nesta metodologia duas abordagens são normalmente utilizadas: os modelos
moleculares que dependem de NPs funcionalizadas com cadeias de DNA marcados com
fluorescência, que formam uma estrutura em grampo; e NPs metálicas funcionalizadas
com nanosondas que são cruzadas com cadeias de ácidos nucleicos de cadeia simples
marcado com fluorescência (Figura 9)(Griffin et al., 2009).
Figura 9: Diferentes abordagens para biossensores fluorescentes à base de NPs metálicas. Adaptado de
Doria et al., 2012.
O desenvolvimento de materiais com caracteristicas melhoradas para aplicações
bioanalíticas desperta o interesse no desenvolvimento de partículas usadas em
imunoensaios (Zhou et al., 2007; Bergquist et al., 2009). Para fins diagnósticos de
elevada sensibilidade e seletividade, os nanomateriais devem estar ligados a
biomoléculas específicas, por exemplo, sistemas antígeno/anticorpo, enzima/substrato,
receptores ou proteínas de membrana, sequências de aptâmeros, RNA ou DNA,
cofatores entre outros (Wang et al., 2012).
46
2.5.2 Nanopartículas tipo Magnetita
Dentre os diferentes tipos de sistemas nanoparticulados, destaca-se as
nanopartículas de óxido de ferro, essas nanopartículas possuem características
magnéticas, ou seja, podem ser manejadas pela aplicação de campos magnéticos
(Corrêa, 2007). Estas estruturas podem ser compostas de diferentes átomos ou íons com
variados momentos magnéticos e são comumente obtidas a partir de óxidos de ferro
(Yang et al., 2006).
A magnetita é um óxido formado por íons de ferro de valências diferentes (Fe2+ e
Fe3+), sua fórmula química é Fe3O4. É um composto solúvel em ácido e insolúvel em
água podendo ser encontrado sob a forma cúbica ou apresentar-se como um pó preto
metálico com brilho lustroso (Leal, 2006; Holland e Yamamura, 2009).
A finalidade de aplicação define o tipo de nanopartícula magnética produzida. A
composição, o tamanho e a síntese das magnetitas são determinados pelo alvo de
aplicação, pois este influencia em suas propriedades físico-químicas e farmacocinéticas
(Hafeli e Chastellain, 2006; Vo-Dinh, 2007; Thassu et al,, 2007). As nanopartículas
magnéticas têm sido usadas em diferentes aplicações biomédicas, tais como: carreadoras
de fármaco guiadas por campo magnético (Asmatulu et al., 2005; Tan et al., 2005),
agentes de contraste para imagem por ressonância magnética (Kim et al., 2003;
Lawaczeck et al., 2004; Gamarra et al., 2005; Jun et al, 2005; Cheng et al, 2005),
separação biomolecular magnética e diagnósticos (Liberti et al., 2001), tratamento de
tumores via hipertermia (Vo-Dinh, 2007; Thassu, 2007). A Figura 10 demostra algumas
aplicações biomédicas das nanopartículas metálicas.
47
Figura 10: Aplicações biomédicas das nanopartículas magnéticas. Adaptado de Umut, 2013.
As nanopartículas de ferro vêm sendo muito exploradas na elaboração de
biodispositivos. Seu uso apresenta como maiores vantagens a sua baixa toxicidade,
biocompatibilidade e ainda as suas propriedades magnéticas (Johnson et al., 2011;
Baratella et al., 2013). Desta forma, o uso de nanopartículas de óxido de ferro
modificadas tem como objetivo principal o desenvolvimento de dispositivos mais
econômicos, específicos, estáveis e reprodutíveis (Arteaga et al., 2010). Neste sentido
diferentes artigos (Kouassi et al., 2005; Kaushik et al., 2008; Yang et al., 2009; Baratella
et al., 2013; Netto et al., 2013) mostram a utilização de nanopartículas de óxido de ferro
para a preparação de biossensores.
48
2.5.3 Nanopartículas de Ouro
As nanopartículas têm áreas de superfície elevadas e propriedades físico-químicas
únicas que podem ser facilmente ajustadas, tornando-os candidatos ideais para o
desenvolvimento de sistemas de biosensoriamento (Vidotti et al., 2011). Entre os
nanomateriais, o ouro tem um papel especial, nos últimos anos, tem se observado um
aumento no uso de nanopartículas de ouro (AUNP) na preparação de biossensores
eletroquímicos, este fato se deve às suas características únicas, como alta
eletrocondutividade, superfície de energia e a razão entre superfície e volume,
propriedades eletrocatalíticas, possibilidade de atuar como fios condutores elétricos
entre a superfície do eléctrodo e o analito permitindo a transferência eletrônica direta
(Boujakhrout, 2016).
O ouro é caracterizado pela alta condutividade térmica, baixa resistividade elétrica
além de não ser facilmente afetado pelo oxigênio atmosférico na formação de óxido,
também apresenta baixa toxicidade. (Loiaza et al., 2011; Salehizadeh et al., 2012). Neste
sentido, o ouro proporciona a estabilidade química adequada para a funcionalização de
oligonucleótidos, proteínas, bimoléculas (Qiu et al., 2010; Loiaza et al., 2011), além de
ser bastante biocompatível com o corpo humano (Salehizadeh et al., 2012). Podemos
destacar ainda que a superfície do ouro é de fácil funcionalização com moléculas via
ligações covalentes (Lyon et al., 2004; Zhao et al., 2008).
2.5.4 Modificação de superfície do transdutor
Uma metodologia bastante empregada no desenvolvimento de biossensores
nanoestruturados é a modificação da superfície transdutora por meio da formação de
monocamadas auto-montadas (Self Assembled-Monolayers, SAMs) (Arya et al., 2009)
que propicia a ligação entre o eletrodo e as nanopartículas funcionalizadas com
biomoléculas.
49
As monocamadas auto-montadas são altamente estáveis, sensíveis, reprodutíveis e
organizados (Arya et al., 2009; Morf et al., 2006). São formadas por moléculas
orgânicas que podem conter grupos terminais específicos com propriedades que podem
ser modificadas e facilmente manipuladas. A adsorção da molécula ocorre por conta da
interação entre os grupos funcionais do adsorvente com o adsorbato, seja por forças ou
interações hidrofóbicas e após a modificação, a extremidade da monocamada passa a
governar as propriedades do eletrodo A formação de SAMs envolve a ligação seletiva
de moléculas numa superfície plana seguida de rearranjo periódico devido às forças
intermoleculares entre espécies adjacentes, sendo que grupos específicos formam uma
ligação muito estável na superfície escolhida (Freire et al., 2003; Mena et al., 2005;
Campuzano et al., 2006).
As SAMs são formadas por três partes específicas: grupo cabeça/âncora, cauda e grupo
funcional como mostra a Figura 11 (Schireiber, 1998):
Figura 11: Representação esquemática de uma monocamada auto-montada: (1) grupo cabeça/âncora, (2)
cauda e (3) grupo funcional. Fonte: Schireiber, 2000.
A aplicação desta técnica na construção de biossensores apresenta potencialidades
no que diz respeito ao aumento da sensibilidade e da estabilidade em função da faixa de
potencial trabalhada, além de fornecer um micro ambiente bastante favorável ao
material biológico imobilizado, permitindo a orientação deste material na superfície da
monocamada, podendo levar a uma orientação do centro de oxi-redução para com a
superfície do eletrodo (Freire et al., 2003; Mena et al., 2005; Campuzano et al., 2006).
50
2.6 Técnicas Eletroanalíticas
2.6.1 Voltametria Cíclica
A voltametria é uma técnica eletroanalítica que fornece informações acerca da
espécie eletroativa baseada nos registros de curvas de corrente em função de um
potencial aplicado durante o processo eletroquímico. A análise é feita em uma célula
eletroquímica constituída de um eletrodo de trabalho, sensível ao analito, um eletrodo de
referência, para controle do potencial, e um eletrodo auxiliar para controle da corrente
(Bard, 2011a) como esquematizado na Figura abaixo:
Figura 12: Representação esquemática de uma Célula eletroquímica com três eletrodos (1) eletrodo de
trabalho; (2) eletrodo de referência e (3) eletrodo auxiliar. Adaptado de Zapp 2013.
Na voltametria cíclica, o potencial elétrico aplicado no eletrodo de trabalho tem a
característica de uma onda triangular, pois a princípio a varredura de potencial é feita
em uma direção e, em seguida, na direção contrária, ao mesmo tempo em que a corrente
é medida. Deste modo, esse programa de potenciais produz uma curva voltamétrica que
51
constitui um ciclo, pois o potencial é varrido no sentido direto e depois no sentido
inverso, o ponto onde ocorre a reversão do potencial é chamado de potencial de
inversão. Os potenciais de inversão devem ser escolhidos de maneira que se possa
observar a oxidação ou redução, controlada por difusão, de uma ou mais espécies de
interesse (Skoog et al., 2002; Harris, 2005).
Parâmetros importantes que são fornecidos pela curva voltamétrica nos processos
de oxidação e de redução são representados por correntes de pico anódica (ipa) e
catódica (ipc). Além destas informações relevantes obtidas através da voltametria cíclica
são os potenciais de pico anódico (Epa) e catódico (Epc), a velocidade de varredura do
potencial (v) e o potencial de inversão (Ei). A Figura 13 representa um típico
voltamograma cíclico com seus principais parâmetros.
Figura 13: representação esquemática de um voltamograma cíclico típico mostrando os parâmetros
obtidos por esta técnica: (ipa) corrente de pico anódica, (ipc) corrente de pico catódica, (Epa) potencial de
pico anódico e (Epc) potencial de pico catódico, potencial de inversão (Ei).
A voltametria se baseia nos fenômenos que ocorrem na interface entre a superfície
do eletrodo de trabalho e a solução adjacente a essa superfície. Essa técnica é
classificada como dinâmica, pois a célula eletroquímica é trabalhada na presença de
corrente elétrica (i > 0) que, por sua vez, é medida em função da aplicação controlada de
um potencial (Skoog et al., 2002). Para que um analito seja determinado por
52
voltametria, é necessário que ele seja eletroativo. Ou seja, deve oxidar-se ou reduzir-se
em uma região de potencial aplicado na qual a transferência de elétrons seja favorecido
tanto cinéticamente quanto termodinamicamente, criando um fluxo de elétrons na
interface eletrodo/solução, ou seja, corrente elétrica. A força motriz para este evento é o
potencial aplicado no eletrodo de trabalho. Na medida em que o potencial converte-se
em mais negativo (varredura catódica), a energia dos elétrons aumenta e o eletrodo se
torna uma fonte de elétrons fazendo com que aja um fluxo de elétrons do eletrodo para a
solução (corrente de redução). Para potenciais com características mais positivos, há
uma diminuição da energia dos elétrons favorecendo a oxidação da espécie eletroativa
(varredura anódica) (Bard, 2001).
A voltametria cíclica é uma ferramenta bastante utilizada para adquirir
informações qualitativas sobre processos eletroquímicos. A eficiência desta técnica se
deve a sua característica de rapidamente fornecer informações sobre a termodinâmica de
processos redox, da cinética de reações heterogêneas de transferência de elétrons bem
como sobre reações químicas acopladas a processos adsortivos (Wang, 2000).
Esta técnica também fornece informações a respeito da reversibilidade
eletroquímica de um sistema, que está relacionada à rápida troca de elétrons entre as
espécies redox e o eletrodo. Nesta perspectiva, os sistemas eletroquímicos podem ser
classificados em: processo reversível, irreversível ou quasi-reversível, no que se refere a
reversibilidade do sistema eletroquímico como ilustrado na Figura 14 (Wang, 2000;
Silva, 2010).
53
Figura 14: Diferentes reversibilidades de sistemas avaliados por voltametria cíclica: sistema reversível,
quasireversível e irreversível (Fisher, 1996).
Em sistemas reversíveis, a velocidade de transferência de elétrons é maior que a
taxa de transferência de massa. Um equilíbrio dinâmico é estabelecida na interface do
eletrodo/solução devido a velocidade de reação ser suficientemente rápida para manter
as concentrações de reagentes e produtos em equilíbrio. A separação dos picos catódicos
e anódicos está diretamente relacionada com o numero de elétrons transferido na reação
reversível, e a diferença entre estes picos podem ser usada para identificar o número de
elétrons envolvidos na reação eletroquímica de interesse (Wang 2006).
Nos sistemas quase irreversíveis, a corrente de pico é controlada tanto pela etapa
da transferência de massa quanto pela etapa de transferência de carga. Nestes sistemas a
corrente de pico acresce com a velocidade de varredura, de maneira não proporcional, e
o potencial de pico é deslocado para valores mais negativos com o aumento da
velocidade de varredura (Wang 2006).
Já em sistemas irreversíveis, a velocidade de transferência eletrônica é insuficiente
para manter o equilíbrio na superfície do eletrodo. Quando a velocidade de
transferência de carga é mais lenta que a velocidade de varredura as concentrações das
espécies oxidadas e reduzidas não serão mais apenas função do potencial (Wang, 2006).
54
A equação de Randles-Sevcik (Equação 1) correlaciona as correntes de pico
anódicas e catódicas (ipa, ipc) e a velocidade de varredura obtidas por voltametria
cíclica em um processo reversível (SILVA, 2010).
ip = (2,69x105 ) n 3/2ACD1/2 v ½ (Eq. 1)
Onde n é o número de mols de elétrons, A é a área do eletrodo (em cm2), C é a
concentração (em mol/cm3), D é o coeficiente de difusão (em cm2 /s), e v é a
velocidade de varredura (em V/s). De acordo com a equação, a corrente é diretamente
proporcional à concentração e aumenta com a raiz quadrada da velocidade de varredura
(SILVA, 2010).
2.6.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
A Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) é baseada aplicação de um
estímulo elétrico (contínuo) fixo (uma voltagem ou corrente conhecida) ao eletrodo de
trabalho, onde adicionalmente é sobreposto outro estímulo elétrico (alternado) de
amplitude fixa e frequência variante com o tempo. Esta abordagem permite se observar
a impedância (resposta) frente a perturbação alternada realizada num extenso intervalo
de frequência. É uma técnica de caracterização elétrica, que permite estudar o
comportamento geral de um sistema quando um numero grande de processos
intercorrelacionados ocorre em diferentes velocidades (Silva, 2010; Carvalho et al.,
2006).
Atualmente a EIE é amplamente utilizada em diferentes linhas de pesquisa,desde
o transporte eletrônico em dispositivos semicondutores até o estudo de processos
cinéticos eletroquímicos das mais diferentes naturezas, ou seja, processos que ocorrem
em células fotovoltaicas (Bisquer et al., 2000), baterias de íons de lítio (Bueno et al.,
2003), sistemas de corrosão e/ou processos eletrocatalíticos (Alves et al., 2000),
eletroquímica em estado sólido e bioeletroquimica (Fey et al., 2003; Wang et al., 2000).
EIE consiste em medidas de impedância (Z) em função da frequência do sinal (ƒ) ou
55
frequência angular, sobre um amplo intervalo de frequência (Ѡ = 2πƒ). A faixa de
trabalho em freqüência depende tanto do objetivo da análise, estudo do eletrólito ou das
reações de interfaces, como da impedância do sistema (Evgenij et al., 2005; Wang
2006).
Os dados de impedância podem ser representados de diferentes maneiras, sendo as
representações gráficas mais comuns o diagrama no plano complexo (Z/ vs. Z//),
também conhecido como diagrama de Argand-Gauss, Nyquist ou Sluyters e o diagrama
de Bode ( /Z/ e φ vs. log(ɷ)) (Silva 2013).
O aspecto geral de um diagrama de nyquist é mostrado na Figura a seguir:
Figura 15 : Diagrama de nyquist- aspecto geral da impedância eletroquímica. Fonte: Stevanatto et al.,
2014.
No diagrama podemos observar uma parte indutiva para frequência acima de fr,
uma resistência de alta frequência RS, que representa a parte real da impedância para
frequência acima de fr, um primeiro e pequeno laço capacitivo do tamanho de RCT, e o
inicio do segundo e grande laço em baixas frequências que representa a frequência de
56
Warburg. Além disso, Dois parâmetros são obtidos da análise do semicírculo: RCT que
é a medida do diâmetro e a frequência de relaxação característica, ƒ, obtida no valor
máximo do semicírculo. (Stevanatto et al., 2014)
Dados de EIE podem ser analisados mediante a utilização de diferentes modelos
de medida, como circuitos equivalentes ou modelos matemáticos. O uso de modelos
elétricos contendo resistores, capacitores, indutores e outros componentes elétricos é
uma tentativa de se mostrar que a impedância eletroquímica experimental pode se
aproximar da impedância elétrica, uma vez que A aplicação de circuitos equivalentes
tem como fundamento as similaridades entre o comportamento da célula eletroquímica e
um circuito elétrico de resistores, capacitores e indutores (Barsoukov e Macdonalds,
2005; Damos et al., 2004).
O circuito equivalente de Randles é uma representação típica de um sistema
composto por capacitores e resistores (Figura 16), e é bastante útil para a análise da
impedância causada por uma reação de óxido-redução em uma interface eletrodo-
solução (Pejcic, 2006).
Figura 16 : Circuito equivalente de Randles para uma interface eletrodo\solução. Fonte: Santos, 2011
57
Onde:
RΩ = resistência da solução eletrolítica;
ZW ou W = impedância de Warburg;
Cdl = capacitância da dupla camada elétrica;
RCT = resistência de transferência de carga.
Os componentes, RΩ e ZW, representam as propriedades da solução eletrolítica e
a difusão do par redox estudado, respectivamente. A capacitância da dupla camada
elétrica é representada por Cdl por possuir a característica de capacitor (Grieshaber et
al., 2008; Damos et al., 2004).
2.7 Microscopia de Força Atômica
O princípio de funcionamento do Microscópio de força atômica (AFM) está baseado na
interação que ocorre, ao longo da varredura, entre os átomos que compõem a sua ponta
e os átomos que compõem a superfície da amostra. Com a aproximação da ponta do
AFM avizinhar-se a amostra (ordem de angstroms), os primeiro átomos da ponta
interagem com os átomos da superfície da amostra. No decorrer da varrição, a haste
sofre deflexões devidoa interação atômica, desviando o laser que incide sobre ele, o
esquema de funcionamento do AFM é mostrado na figura17. O laser é detectado por um
fotodiodo que envia essas informações de desvio da haste para o controle de
realimentação que ajusta a posição da amostra (e/ou da ponteira) e para o computador
onde é construída a topografia digitalizada da superfície da amostra (Pinto et al, 2013).
58
Figura 17: esquema de funcionamento do AFM. Fonte: Ferreira et al., 2006.
A técnica de AFM faz parte de uma nova classe de instrumentos pertencentes ao
grupo de microscopias chamadas SPM (“Scanning Probe Microscopy – SPMs”).
Recentemente, SPMs apresentam-se como ferramentas que contribuem
significativamente com diversas áreas da ciência, em especial à biologia, física, ciência
dos materiais e microeletrônica. Em sistemas biológicos incluindo células, bactérias,
vírus e biomoléculas, isso possibilita a compreensão dos fenômenos biofísicos/químicos
envolvidos, constituindo-se em mais uma ferramenta auxiliar de análise e
proporcionando um rápido desenvolvimento interdisciplinar (Ferreira et al., 2006).
Assim, é possível se obter novas informações sobre as bases moleculares dos processos
biológicos, como por ex., a investigação de biofilmes bacterianos com superfícies
metálicas em sistemas industriais, situações clínicas e adsorção de moléculas protéicas
em superfícies de biomateriais.
59
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Preparar e caracterizar filmes de Fe3O4_NPs/AuNPs depositados sobre eletrodo de ouro
para a aplicação como sensor impedimétrico e voltamétrico para a detecção do
Schistosoma mansoni.
3.2 Objetivos Específicos
Determinar parâmetros físico-químicos da sonda de Schistosoma mansoni como
elemento de biodetecção;
Avaliar características eletroquímicas da interação da sonda de Schistosoma
mansoni com o sistema Fe3O4_NPs/AuNPs;
Estudar através de técnicas eletroanalíticas as propriedades interfaciais do sistema
Fe3O4_NPs/AuNPs-Sondaschistosoma, bem como avaliação da bioatividade deste
sistema frente a amostras do S.mansoni;
Análisar morfológica e estruturalmente os filmes biológicos de Fe3O4_NPs/AuNPs-
Sondaschistosoma e Fe3O4_NPs/AuNPs-Sondaschistosoma- genoma por
microscopia eletrônica de varredura;
Determinar a capacitância da dupla camada elétrica (Cdl) através de cálculos
teóricos a partir de resultados experimentais e da resistência à transferência de carga
(Zre);
Determinar as correntes de pico anódicas (ipa) e catódicas (ipc) dos voltamogramas
cíclicos.
60
4. METODOLOGIA
4.1 Materiais
Amostras de Schistosoma foram fornecidas pelo Laboratório de Parasitologia do
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (Recife, Brasil). Todas as amostras foram
previamente caracterizadas utilizando RT-qPCR.
Ácido Marcaptobenzoico (AMB), Ouro (III), cloreto hidratado (HAuCl4 • xH2O),
(3-aminopropil) trietoxissilano (APTES), Citrato trissódico, albumina de soro bovino
(BSA), 1-[3-(dimetilamino) propil] -3-etilcarbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida
(NHS) foram adquiridos da Sigma Chemical (St. Louis, MO, EUA). Hidróxido de
amônio (NH4OH), ferro e ferricianeto de potássio foram obtidos a partir de VETEC
(Brasil). Todos outros produtos químicos utilizados neste trabalho foram de qualidade
de grau de reagente, adquirido a partir de Sigma-Aldrich, e utilizados tal como
recebidos sem purificação adicional. A água foi purificada com um sistema de
purificação Millipore Milli-Q.
4.2 Preparações das amostras
As amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR) (1 ml) de todos os pacientes e
controles foram recolhidos por punção lombar. A análise do LCR consistiu de contagem
geral e específica de célula, glicose, proteína, eletroforese de proteínas e determinações
imunológicas para esquistossomose (ELISA), herpes, sífilis, cisticercose, toxoplasmose,
citomegalovírus, vírus Epstein-Barr, vírus da imunodeficiência humana, varicela zoster,
Cryptococcus e o vírus linfotrópico humano. Estas amostras foram também analisadas
de acordo com o Brusky (2016) usando NPCR, no Centro de Pesquisa Aggeu
Magalhães na FIOCRUZ, estado de Pernambuco.
O DNA do Schistosoma foi purificado usando o illustra tissue & cells genomic
Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare, UK) de acordo com as instruções do fabricante. O
61
DNA em amostras de líquor de pacientes foi extraída e purificada usando o illustra
blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, UK) de acordo com as instruções do
fabricante. Assim, foi quantificado num espectrofotómetro e armazenado a -20°C. O
primer tiolado utilizado foi Schfo17 (5'-GTGCTGGT GGGTTGACGAGTTC-3 '). Este
primer é específico para S. mansoni (Abath, 2002).
4.3 Síntese de nanopartículas
As nanopartículas de ouro foram sintetizadas utilizando o método de Frens (1973).
Inicialmente, 100 mL de HAuCl4 • xH2O 0,01% foi fervida sob agitação vigorosa em
um balãode fundo redondo. 2.5mL de citrato trissódico (1% p peso) de solução foi
adicionado rapidamente à solução em ebulição, o que resulta numa mudança de cor de
amarelo pálido a vermelho escuro, indicando a formação de AuNPs. A solução foi
mantida à temperatura de ebulição durante 10 minutos.
As nanopartículas de óxido de ferro modificadas com APTES foram obtidas de
acordo com Gan et al (2011).Inicialmente, 0,2 g de Fe3O4_NPs foram adicionados a 90
mL de etanol, posteriormente, 2 mL de hidróxido de amónio (25%) e 300 µL APTES
foram adicionados à solução anterior. A mistura de reação foi agitada durante a noite. O
sistema foi separado por um imã e lavado três vezes com água desionizada para
obtenção do NH3-Fe3O4_NPs.
4.4 Modificação do eletrodo
O eletrodo de ouro foi polido em uma lixa com água desionizada, posteriormente
o eletrodo foi imerso numa solução piranha durante 5 minutos, seco à temperatura
ambiente e incubado com 2 µl AMB após a lavagem com água desionizada.
Subsequentemente, foi adicionado 2 µL de EDC 0,4 M e NHS 0,1 M em uma
proporção de 1: 1 sobre a superfície do eletrodo, a fim de ativar os grupos carboxílicos
presentes nas moléculas do AMB, por um período de 10 min. Depois disso, 2 µL de
NH3-Fe3O4_NPs foi lançada sobre o eletrodo modificado com AMB-EDC/ NHS- e
incubado por 10 min. Em seguida, os grupos amina protonadas residuais de MBA-
62
Fe3O4_NPs foi modificado com AuNPs obter (MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs) utilizando o
mesmo método de EDC / NHS. Finalmente, a sonda de DNA tiolada foi imobilizada na
superfície do AuNPs. BSA foi utilizado em todas as experiências para evitar interacções
não específicas. Em seguida, os grupos de aminas residuais de AMB-Fe3O4_NPs foram
modificado com AuNPs por auto-montagem para se obter (AMB-Fe3O4_NPs-AuNPs)
para permitir a imobilização da sonda de DNA-Schistosoma tiolado
(SondaDNAShistososma) durante 20 minutos.
4.5 Análise de hibridização
O DNA alvo foi diluído em solução tampão PBS 10 mM. Subsequentemente,
aqueceu-se durante 3 min a 40 ° C antes dos experimentos. A hibridação foi realizada
por técnica de revestimento usando 2µL do DNA alvo obtido a partir de soro humano e
LCR em diferentes concentrações.
4.6 Medidas Eletroquímicas
As análises eletroquímicas foram realizadas num PGSTAT 128N potenciostato /
galvanostato (Autolab, Holanda) em uma célula eletroquímica de três eletrodos na
presença de uma solução de 10 mM de K4 [Fe (CN) 6] 4- / K3 [Fe (CN) 6 ]3 (1: 1)
usado como uma sonda redox. A superfície do eletrodo de ouro foi usada como eletrodo
de trabalho. Eletrodo de fio de platina e eletrodo e Ag / AgCl (solução saturada de KCl)
foram usados como eletrodos auxiliares e de referência, respectivamente. Os
experimentos de EIE foram realizados a uma frequência entre 100 MHz e 100 kHz,
com uma faixa de potencial de 10 mV aplicado. Análise de CV foram realizados em
uma faixa de potenciais entre 0,7 V e -0.2V a uma velocidade de varredura de 50mVs-1.
Todas as medições electroquímicas foram realizadas em triplicado utilizando três
amostras diferentes (n = 3).
63
4.7 Medições de Microscopia de Força Atômica
Análises estrutural do sistema foram realizadas utilizando um microscópio de
força atómica (SPM-9700, Shimadzu Corporation, Japão) em um modo sem contacto
em ar à temperatura ambiente (aproximadamente 25 ° C). Cantilevers do AFM com uma
ponta de silicone (nanoworld, Japão, a frequência ressonante = 300 kHz, constante de
elasticidade = 42 N.m-1) foram usadas. As imagens (512 pontos por linha) foram
coletadas com uma taxa de varrimento de 1,0 Hz em uma área de digitalização de 7,0 ×
7,0 mm. Para eliminar artefatos, as imagens foram obtidas a partir de pelo menos duas
áreas separadas macroscopicamente em cada amostra e analisadas utilizando o software
AFM Gwyddion.
64
5. CONCLUSÃO
Neste estudo as técnicas de impedância eletroquímica e voltametria cíclica foram
utilizadas na fabricação de um novo biossensor específico para o S.mansoni. O
biossensor desenvolvido mostrou um bom desempenho para determinação da sequência
alvo genômico de S. mansoni com baixo limite de detecção, especificidade e
reprodutibilidade Todas as medições electroquímicas foram realizadas em triplicado
utilizando três amostras diferentes (n = 3). A plataforma sensora desenvolvida foi eficaz
na detecção de S. mansoni em diferentes fluidos biológicos. Estes resultados
confirmaram que esta abordagem de detecção fornece uma maneira rápida, sensível e
conveniente para a detecção de S. mansoni. O genossensor aqui exposto apresenta-se
como uma ferramenta promissora para o diagnóstico eficiente da esquistossomose em
suas diferentes manifestações clínicas.
65
6. PERSPECTIVAS
No presente estudo descreveu-se novas ferramentas necessárias para o
desenvolvimento de biossensores impedimétricos para ácidos nucleícos e também
informações físico-químicas sobre o reconhecimento do genoma de S. mansoni na
superfície sensora. O método revelou ser bastante simples seletivo e sensível ao analito.
Esse estudo serve de base para o desenvolvimento de novos sensores para
Esquistossomose em suas diferentes manifestações clinicas baseado na imobilização de
nanocompósito de óxido de ferro e ouro. Estudos posteriores poderão ser efetuados no
sentido de se obter limites de detecção mais baixos a partir de outras superfícies
sensoras, aperfeiçoamento da plataforma, bem como novas análises mais aprofundadas
utilizando microscopia de força atômica e microscopia de transmissão.
66
REFERÊNCIAS
ABATH, F.G.; MELO, F.L.; WERKHAUSER, R.P.; MONTENEGRO, L.;
MONTENEGRO, R.; SCHINDLER, H.C. Single-tube nested PCR using immobilized
internal primers., Biotechniques, 33 (2002).
ALFAYA, A.A.S.; KUBOTA, L.T.A. Utilização de materiais pelo processo de sol-gel
na construção de biossensores. Química Nova, v. 25, n. 5, p. 835-841, 2008.
ALVES, V.A.; SILVA, L.A.; BOODTS, J.F.C. Impedance study of the oxygen
evolution on the IrO2/TiO2/CeO2 system in acidic medium. Polish Journal of
Chemistry, 74, 3, 421-428, 2000.
ARYA, S. K.; SOLANKI, P. R.; DATTA, M.; MALHOTRA, B.D. Recent advances in
self-assembled monolayers based biomolecular electronic devices Biosensors and
Bioelectronics 2009, 24, 2810–2817
ARTEAGA, K. A.; RODRIGUEZ, J. A.; BARRADO, E. Magnetic solids in analytical
chemistry: a review. Analytica Chimica Acta 2010, 674, 157–165
ASMATULU, R.; ZALICH, M.A.; CLAUS, R.O.; RIFFLE, J.S. Synthesis,
characterization and targeting of biodegradable magnetic nanocomposite particles by
external magnetic fields. J. Magn. Magn. Mater. 292 (2005) 108–119.
BANSI D MALHOTRA E ANTHONY P F TURNER. Advances in Biosensors,
Elsevier Science, vol. 5, 2003.
BARATELLA, D.; MAGRO, M.; SINIGAGLIA, G., ZBORIL, R.; SALVIULO, G.,
VIANELLO, F. A glucose biosensor based on surface active maghemite nanoparticles
Biosensors and Bioelectronics 2013, 45, 13–18 49
67
BARBOSA, C.S; FAVRE, T.C; AMARAL, R.S; PIERI, O.S. Epidemiologia e controle
da esquistossomose mansoni. In: CARVALHO, O.S; COELHO; P.M.Z; LENZI, H.L.
Schistosoma mansoni e Esquistossomose: uma visão multidisciplinar. 20 ed., cap. 31,
Rio de Janeiro: FIOCRUZ, 2008.
BARD, A. J.; FAULKNERD, L. R. ELECTROCHEMICAL METHODS
Fundamentals and Applications, John Wiley, New York. second edition, 2001a.
BARD, A. J.; MIRKIN, M. V. Scanning Electrochemical Microscopy, Marcel
Dekker, New York, USA, 2001b.
BARSOUKOV & MACDONALD, Impedance Spectroscopy, 2nd ed., Wiley & Sons,
New Jersey, 2005.
BASÍLIO-DE-OLIVEIRA, C. A.; AQUINO, A.; SIMON, E. F.; EYER-SILVA, W. A.
Concomitant prostatic schistosomiasis and adenocarcinoma: case report and review.
The Brazilian Journal of Infectious Diseases 6:45-49, 2002
BERGQUIST R, JOHANSEN MV, UTZINGER J Diagnostic dilemmas in
helminthology: what tools to use and when? Trends Parasitol 25: (2009) 151–156
BERNEY, H.; WEST, J.; HAEFELE, E.; ALDERMAN, J.; LANE, W.; COLLINS, J.
K. A DNA diagnostic biosensor: development, characterization and performance.
Sensors and Actuators B, v. 68, n. 1-3, p. 100-108, Aug. 2000
BISQUER, J.; BELMONTE, G.,G.; SANTIAGO, F.,F.; FERRIOLS, N.,S.;
BOGDANOFF, P.; PEREIRA, E.,C.; Doubling exponent models for the analysis of
porous film electrodes by impedance. Relaxation of TiO2 nanoporous in aqueous
solution .Journal of Physical Chemistry B, 104:10 2287. 2000 50
68
BLANCO, E.; HSIAO, A.; MANN, A. P.; LANDRY, M. G.; MERIC-BERNSTAM, F.;
FERRARI, M. Nanomedicine in cancer therapy: innovative trends and prospects.
Cancer Science 2011,102,1247.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de Vigilância
Epidemiológica/Ministério da Saúde/Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento
de Vigilância Epidemiológica 6o ed., Brasília: Editora do Ministério da Saúde, 2005.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de Vigilância
Epidemiológica/Ministério da Saúde/Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento
de Vigilância Epidemiológica 7o ed., Brasília: Editora do Ministério da Saúde, 2009.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Situação
epidemiológica da esquistossomose no Brasil. Grupo técnico das parasitárias.
Brasília: Editora do Ministério da saúde, 2010.
BRASIL. Ministério da Saúde. Sistema de Informação do Programa de Vigilância e
Controle da Esquistossomose –SIPCE, 2011a. Disponível em:
<http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/deftohtm.exe?sinan/pce/cnv/pce.def>.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância em Doenças Transmissíveis. Plano integrado de ações estratégicas de
eliminação da hanseníase, filariose, esquistossomose e oncocercose como problema
de saúde pública, tracoma como causa de cegueira e controle das geohelmintíases :
plano de ação 2011-2015 / Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde,
Departamento de Vigilância em Doenças Transmissíveis. – 1. ed., 1. reimpr. - Brasília :
Ministério da Saúde, 2013.^
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de
Vigilância Epidemiológica.Vigilância da Esquistossomose Mansoni : diretrizes
técnicas / Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, Departamento de
69
Vigilância das Doenças Transmissíveis. – 4. ed. – Brasília : Ministério da Saúde, 2014.
144 p. : il.
BRUSCKY, I.S.; MELO, F.L.; MEDEIROS, Z.M.; ALBUQUERQUE, F.F.;
WANDERLEY, L.B.; CUNHA-CORREIA, C. Nested polymerase chain reaction in
cerebrospinal fluid for diagnosing spinal cord schistosomiasis: A promising method, J
Neurol Sci, 366 (2016) 87-90.
BONANNI A, DEL VALLE M. Use of nanomaterials for impedimetric DNA sensors:
A review. Anal Chim Acta [Internet]. Elsevier B.V.; 2010;678(1):7–17. Available
from: http://dx.doi.org/10.1016/j.aca.2010.08.022
BOUJAKHROUT, A.; DÍEZ, P.; SÁNCHEZ, A.; MARTÍNEZ-RUÍZ, P.;
PINGARRÓN, J.M.; VILLALONGA, R. Gold nanoparticles-decorated silver-
bipyridine nanobelts for the construction of mediatorless hydrogen peroxide biosensor,
Journal of Colloid and Interface Science (2016)
BUENO, P.R.; LEITE.E. R.; GIRALDI, T.R.; BULHOES, L.O.S.; LONGO, E.
Nanostructured Li íon insertion electrodes. 2. Tin dioxide nanocrystalline layers and
discussion on “nanoscale effect”.Journal of Physical Chemistry B, 107, 8878-8883,
2003.
BUSO, A.; BALBO, L.; GIOMO, M.; FARNIA, G.; SANDONÀ, G. Electrochemical
removal of tannins from aqueous solutions. Ind. Eng. Chem. Res., 39 (2000), p. 494
BUZEA, C.; PACHECO, I. I.; ROBBIE, K. Nanomaterials and nanoparticles: Sources
and toxicity. Biointerphases, 2, 2007.
CAI, H.; WANG, Y.; HE, P.; FANG, Y. Electrochemical detection of DNA
hybridization based on silver-enhanced gold nanoparticle label. Anal. Chim. Acta 469
(2002) 165
70
CAMPÀS, M.; CARPENTIER, R.; ROUILLON, R. Plant tissue-and photosynthesis-
based biosensors. Biotechnol. Adv., 26, 370–378, 2008. 52
CAMPUZANO, S.; PEDRERO, M.; MONTEMAYOR, C. Characterization of
alkanethiol-self-assembled monolayers-modified gold electrodes by electrochemical
impedance spectroscopy. Journal of Electroanalytical Chemistry, v. 586, n. 1, p. 112-
12, Jan. 2006
CARUSO, F.; HYEON, T.; ROTELLO, V. M. Nanomedicine.Chem. Soc. Rev.
2012,41,2537-8.
CARVALHO, R. B.; SOBRAL, H. A. C.; LOPES, J. M.; TODINOV, L. R.;
FORMIGA, G. J. S. Granuloma Esquistossomótico Gigante do Cólon com
Intussuscepção: Relato de Caso. Rev bras Coloproct, 2008a; 28(3): 347-349.
CARVALHO, O.S.; JANNOTTI-PASSOS, L. K.; CALDEIRA, R. L. Importância
epidemiológica e biologia molecular aplicada aos estudos dos moluscos do gênero
Biomphalaria. In: Carvalho, O.S; Coelho; P.M.Z; Lenzi, H.L. Schistosoma mansoni e
Esquistossomose: uma visão multidisciplinar. 20 ed., cap. 9, Rio de Janeiro:
FIOCRUZ, 2008b.
CARVALHO, O.S; AMARAL, R.S; DUTRA, LV; SCHOLTE R.G.C; GUERRA
M.A.M.. Distribuição espacial de Biomphalaria glabrata, B.straminea e B.tenagophila,
hospedeiros intermediários de Schistosoma mansoni no Brasil. In: Carvalho, O.S;
Coelho; P.M.Z; Lenzi, H.L. Schistosoma mansoni e Esquistossomose: uma visão
multidisciplinar. 20 ed., cap, 11. Rio de Janeiro: FIOCRUZ, 2008c
CHAUBEY, A.; MALHOTRA, B.D.; Mediated Biosensors. Biosensors and
Biolectronics 17, 2002.. 441-456
71
CHEN, A.W.Y., ALAM, M.H., WILLIAMSON, J.M.L., BRAWN, L.A.,. An unusually
late presentation of neuroschistosomiasis. J. Infect. 53, 2006155–158.
CHENG, F.Y.; SU, C.H.; YANG, Y.S.; YEH, C.S.; TSAI, C.Y.; WU, C.L. WU;
Characterization of aqueous dispersions of Fe3O4 nanoparticles and their biomedical
aplplications. Biomaterials 26 (2005) 729–738. 53
CHENG, C. W.; CHEN, C. K.; CHEN, Y. S.; CHEN, L. Y.. Determination of
Schistosoma japonicum circulating antigens in dilution serum by piezoelectric
immunosensor and S/N enhancemen. Biosensors and Bioelectronics 24 (2008) 136–
140
CHOU, Y., CHIOU, H., TIU, C., CHIOU, S., LEE, S., HUNG, G.,WU, S., KUO, B.,
LEE, R., CHIANG, J., CHANG, T., YU, C.,. American Journal of Tropical Medicine
and Hygiene 68, 182003–23.
CORRÊA, F.A.P. Avaliação da biocompatibilidade de fluído magnético à base de
nanopartículas de maghemita recobertas por polifosfato em camundongos. Dissertação
(Pós-Graduação em Patologia Molecular). Universidade de Brasília, 2007
COURA, J. R.; AMARAL, R. S. Epidemiological and control aspects of schistosomiasis
in Brazilian endemic areas. Mem Inst Oswaldo Cruz 2004; 99:13-19
CUNNINGHAM, A. J. Introduction to bioanalytical sensors. New York: Wiley, 1998
DAMOS, F. S.; MENDES, R. K.; KUBOTA, L. T.; Aplicações de QCM, EIS e SPR na
investigação de superfícies e interfaces para o desenvolvimento de biossensores, Quim.
Nova, Vol. 27, No. 6, 970-979, 2004.
DAVIS, A. Schistosomiasis. In: Cook, G.C., Zumla, A.I. (Eds.), Manson’s Tropical
Diseases. Saunders Elsevier, 2009. pp. 1425–1460
72
DIAMOND, D. Principles of chemical and biological sensors. John Wiley e sons. Inc.
1998. New York , USA. p. 3- 166.
DOENHOFF, M. J., CIOLI, D., UTZINGER, J. Praziquantel: mechanisms of action,
resistance and new derivatives for schistosomiasis. Curr Opin Infect Dis.
2008;21:659–67. 54
DU, P.; LI, H.; MEI, Z.; LIU, S. Electrochemical DNA biosensor for the detection of
DNA hybridization with the amplification of Au nanoparticles and CdS
nanoparticles.Bioelectrochemistry 75 (2009) 37
EGGINS, B. R. Chemical sensors and biosensors. New York: Wiley, 2002.
EVGENIJ BARSOUKOV, J. ROSS MACDONALD; Impedance Spectroscopy:
Theory, Experiment, and Applications, New Jersey; Wiley-Interscience, 2005.
FERREIRA, A. A. P.; YAMANAKA, H. Atomic force microscopy applied to
immunoassays. Quím. Nova vol.29 no.1. 2006
FEY, G.T.K.; WENG, Z.X.; CHEN, J.G.; KUMAR, T.P.; Mater. Chem. Phys. 2003,
80, 309.
FISHER, A. C. Electrode Dynamics. Oxford Chemistry Primers, p. 96, 1996.
FOJTA, M. Electrochemical sensors for DNA interactions and damage. Review.
Electroanalysis, v. 14, n. 21, p.1494-1500, Nov. 2002.
FREIRE, R. S.; PESSOA, C. A.; KUBOTA, L.T. Emprego de monocamadas
autoorganizadas no desenvolvimento de sensores eletroquímicos. Química Nova, v. 26,
n. 3, p. 381-389, 2003.
73
FRENS, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse
gold suspensions, Nature Phys. Sci, 241 (1973) 20-22.
FREZZA, T.F., MADI. R.R., BANIN, T.M., PINTO, M.C., SOUZA, A.L.R.,
GREMIÃO, M.P.D., ALLEGRETTI, S.M. Efeito do praziquantel incorporado a
lipossomas nos diferentes estágios de desenvolvimento dos ovos de Schistosoma
mansoni. Rev Ciênc Farm Básica Apl. 2007;28 (2):209-14. 55
FURTADO, R. F., DUTRA, R. A. F., ALVES, C. R.; PIMENTA, M. G. R.; GUEDES.
M. I. F. Aplicações de biossensores na análise da qualidade de alimentos. Embrapa
agroindústria tropical. 2008.
GAN, N.; JIN, H.; LI, T. ; ZHENG, L.Fe(3)O(4)/Au magnetic nanoparticle
amplification strategies for ultrasensitive electrochemical immunoassay of alfa-
fetoprotein, Int J Nanomedicine, 6 (2011) 3259-3269.
GAMARRA, L.F.; BRITO, G.E.S.; PONTUSCHKA, W.M.; AMARO, E.; PARMA,
A.H.C.; GOYA, G.F. Biocompatible superparamagnetic iron oxide nanoparticles used
for contrast agents: a structural and magnetic study. J. Magn. Magn. Mater. 289
(2005), 439–441
GOMES, L.I., DOS SANTOS MARQUES, L.H., ENK, M.J., DE OLIVEIRA, M.C.,
COELHO, P.M.,RABELLO, A.,. Development and evaluation of a sensitive PCR-
ELISA systemfor detection of Schistosoma infection in feces. PLoS Negl. Trop. Dis. 4,
2010e664.
GRAY, D.J.; MCMANUS, D. P.; LI, Y. S.; WILLIAMS, G. M.; BERGQUIST, R.;
ROSS.A. G. Schistosomiasis elimination: lessons from the past guide the future. Lancet
Infect. Dis. 2010.10, 733–736.
74
GRYSEELS, B.; POLMAN, K.; CLERINX, J.; KESTENS, L. Human schistosomiasis.
Lancet. 2006. 368, 1106–1118
GRIESHABER, D.; MACKENZIE, R.; VOROS, J.; REIMHULT, E.; Electrochemical
Biosensors – Sensor Principles and Architectures, Sensors 2008, 8, 1400-1458
GRIFFIN, J.; SINGH, A.K.; SENAPATI, D.; RHODES, P.; MITCHELL, K.;
ROBINSON, B.; YU, E.; RAY, P.C. Size- and distance-dependent nanoparticle surface-
energy transfer (NSET) method for selective sensing of hepatitis C virus RNA.
Chemistry 2009, 15, 342-351 56 Hafeli, O.; Chastellain, M. Nanoparticulates as drug
carriers. Imperial College Press, Londres, 2006.
HARRIS, D. C. Análise Química Quantitativa. 6. ed. Rio de Janeiro: LTC, 2005. 876 p
HASAN, S. A Review on Nanoparticles: Their Synthesis and Types. Research Journal
of Recent Sciences. 2014, 4, 1-3.
HIDEAKI NAKAMURA E ISAO KARUBE. Current research activity in Biosensors,
Anal. Bional. Chem. vol. 377, pp. 446-468, 2003
HOLLAND, H.; YAMAMURA, M. Adsorção de íons uranilo em nanopartículas de
magnetita. Associação Brasileira De Energia Nuclear: Rio de Janeiro (2009).
IBIRONKE, O.A., PHILLIPS, A.E., GARBA, A., LAMINE, S.M., SHIFF, C.,
Diagnosis of Schis-tosoma haematobium by detection of specific DNA fragments from
filtered urinesamples. Am. J. Trop. Med. Hyg. 84. 2011., 998–1001
JESUS, A. R.; MAGALHAES, A.; MIRANDA, D. G.; MIRANDA, R. G.; ARAUJO,
M. I.; DE JESUS, A. A. et al. Association of type 2 cytokines with hepatic fibrosis in
human Schistosoma mansoni infection.. Infect Immun 2004; 72:3391-3397
75
JOHNSON,P. V.; PARK AND, H. J.; DRISCOLL, A. J. “Enzyme Nanoparticle
Fabrication: Magnetic Nanoparticle Synthesis and Enzyme Immobilization,” Methods
in Molecular Biology, Vol. 679, 2011, pp. 183-191.
JUN, Y.W.; HUH, Y.M.; CHOI, J.S.; LEE, J.H.; SONG, H.T.; KIM, S.; et al. Nanoscale
size effect of magnetic nanocrystals and their utilization for câncer diagnosis via
magnetic resonance imaging. J. Am. Chem. Soc. 127 (2005) 5732–5733. 57
KAUSHIK, A.; KHAN, R.; SOLANKI, P. R.; PANDEY, P.; ALAM, J.; AHMAD, S.;
MALHOTRA, B. D. Biosensors and Bioelectronics 2008, 24, 676–683
KATZ, N., CHAVES, A., PELLEGRINO, J., (1972).Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo
14, 397—400.
KIM, D.K.; MIKHAYLOVA, M.; WANG, F.H.; KEHT, J.; BJELKE, B.; ZHANG, Y.;
et al. Magnetic core-bilayer shell nanoparticle: A novel vehicle for entrapment of poorly
water-soluble drugs. Chem. Mater. 15 (2003) 4343–4351.
KING, C.H.Parasites and poverty: the case of schistosomiasis. Acta Trop. 2010.
113,95–104.
KRANZ, C.; EATON, D. C.; MIZAIKOFF, B.; Anal. Bioanal. Chem. 2011,399,2309
KOUASSI, G. K.; IRUDAYARAJ, J.; MCCARTY, G. BioMagnetic Research and
Technology 2005, doi:10.1186/1477-044X-3-1
KURALAY, F.; ÖZYÖRÜK, H.; YILDIZ, A. Potentiometric enzyme electrode for urea
determination using immobilized urease in poly(vinylferrocenium) film. Sensors and
Actuators B: Chemical, 109 (2), p. 194-199, 2005
76
LAMBERTUCCI J, SILVA L, VOIETA I. Esquistossomose Mansônica. In: Coura JR,
editor. Dinâmica das Doenças Infecciosas e Parasitárias. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan; 2005. p. 931-946.
LAMBERTUCCI, J. R. “Acute schistosomiasis mansoni: revisited and reconsidered,”
Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, vol. 105, no. 4, pp. 422–435, 2010.
LAWACZECK, R.; MENZEL, M.; PIETSCH, H. Superparamagnetic iron oxide
particles contrast media for magnetic resonance imaging. Appl. Organomet. Chem. 18
(2004) 506–513 58
LEAL, R. Estudo da magnetita como material adsorvedor de íons uranilo. Instituto de
pesquisas energéticas e nucleares - "Autarquia associada à Universidade de São
Paulo. São Paulo, 2006.
LEMAN, J. A.; SMAL,L G.; WILKS, D.; TIDMAN, M. J. Localized popular cutaneous
schistosomiasis: two cases in travellers. Clinical and Experimental Dermatology
2001; 26: 50-2.
LI, F.; FENG, Y.; DONG, P.; TANG, B. Gold nanoparticles modified electrode via a
mercapto-diazoaminobenzene monolayer and its development in DNA electrochemical
biosensor.. Biosens. Bioelectron. 25 (2010) 2084.
LI, F.; HAN, X.; LIU, S. Development of an electrochemical DNA biosensor with a
high sensitivity of fM by dendritic gold nanostructure modified electrode.Biosens.
Bioelectron., 26 (2011), pp. 2619–2625.
LIBERTI, P.A.; RAO, C.G.; TERSTAPPEN, L.W.M.M. Optimization of ferrofluids
and protocols for the enrichment of breast tumor cells in blood. J. Magn. Magn. Mater.
225 (2001) 301–307
77
LOUREIRO, F. C. C. L.; ARLINGO, G. S. B. N., CLEUMAR, S. M., ANTONIO, M.
N. LIMA., HELMUT, N. A method for determining the mutual diffusion coeficcient of
molecular solutes based on surface plasmon resonance spectroscopy, Sensors and
Actuators B, Chemical, vol. 1, pp. 1-8, 2010.
LYON, J. L.; FLEMING, D. A.; STONE, M. B.; SCHIFFER, P.; WILLIAMS, M. E.
Synthesis of Fe Oxide Core/Au Shell Nanoparticles by Iterative Hydroxylamine
Seeding. Nano Letters 4, 719 (2004).
LOAIZA, O. A.; JUBETE, E.; OCHOTECO, E.; CABAÑERO, G.; GRANDE, H.;
RODRIGUEZ, J. Biosensors and Bioelectronics 26, 2194 (2011).] 59
LOJOU, É.; BIANCO, P.; (2006). Application of the electrochemical concepts and
techniques to amperometric biosensor devices. J. Electroceram. 16, 79-91.
MALIK P, KATYAL V, MALIK V, ASATKAR A, INWATI G, MUKHERJEE TK.
Nanobiosensors: Concepts and Variations. ISRN Nanomater [Internet]. 2013;2013:1–9.
Available from: http://www.hindawi.com/journals/isrn/2013/327435/
MATAS, S. L. A.; Neuroesquistossomose. Rev. Neurociências 9(1): 27-31, 2001
MEHRVAR, M., ABDI, M. Recent Developments, Characteristics, and Potential
Applications of Electrochemical Biosensors. Analytical Sciences, 2004, 20(8), 1113.
MELO, A. L.; COELHO, P. M. Z. Schistosoma mansoni. In: Neves DP, Melo AL,
Genaro O, Linardi PM (eds) Parasitologia Humana, 10ª edição, Editora Atheneu, São
Paulo, p. 174-193, 2000.
MELLO, L. D.; KUBOTA, L. T. Review of the use of biosensors as analytical tools in
the food and drink industries. Food Chemistry, 77, 237–256, 2002.
78
MENA, M .L.; YÁÑEZ-SEDEÑO, P.; PINGARRÓN, J. M. A comparison of different
strategies for the construction of amperometric enzyme biosensors using gold
nanoparticle-modified electrodes. Analytical Biochemistry, v. 336, n. 1, p. 20-27, Jan.
2005.
MIKKELSEN, S. R.; CORTÓN, E. Bioanalytical chemistry. New York: Wiley, 2004
MOLYNEUX, D. H. Combating the “other diseases” of MDG 6 changing the paradigm
to achieve equity and poverty reduction? Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008. 102,
509–519. 60
MOREIRA, C. S.; LIMA, A. M. N.; THIRSTRUP, C.; NEFF, H. A disposable, low cost
prism-based surface plasmon resonance (SPR) biosensor, World Congress on
Biosensors 2010: Biosensors 2010, 2010
MORENO-CARVALHO, O. A.; NASCIMENTO-CARVALHO, C. M.; BACELAR, A.
L, ANDRADE-FILHO, A.; COSTA, G.; FONTES, J. B.; ASSIS, T. Clinical and
cerebrospinal fluid (CSF) profile and CSF criteria for the diagnosis of spinal cord
schistosomiasis. Arquivos de Neuro-Psiquiatria 61:353-358, 2003
MORF, P.; RAIMONDI,F.; NOTHOFER, H. G.; SCHNYDER, B.; YASUDA, B.;
WESSELS, J. M.; JUNG, T. A. Langmuir 2006, 22, 658–663.
NIE, J. ZHANG, Y. WANG, H. WANG, S. SHEN, G.Superhydrophobic surface-based
magnetic electrochemical immunoassay for detection of Schistosoma japonicum
antibodies, Biosens Bioelectron, 33 (2012) 23-28.
NETTO, C. G. C. M.; TOMA, H. E.; ANDRADE, L. H. Journal of Molecular Catalysis
B: Enzymatic 2013, 85-86, 71–92.
79
NINOSKA I. B.; RAMÍREZ, M..; FORTES, A. M. S.; BELKIS, V. Construcción de
un Inmunosensor Amperométrico utilizando Apirasa de Solanum tuberosum para la
Detección de Esquistosomiasis. Información Tecnológica. Vol. 20(3), 125-134 (2009)
PALECEK, E.; FOJTA, M. Detecting DNA hybridization and damage. Analytical
Chemistry, v. 73, n. 3, p. 74a-83a, Feb. 2001
PALECEK, E. Past, present and future of nucleic acids electrochemistry. Talanta, v.
56, n. 4, p. 806-819, Oct. 2002 61
PALEČEK E. Fifty years of nucleic acid electrochemistry. Electroanalysis. 2009;21(3-
5):239–51.
PATHAK, P.; KATIYAR, V. K.; GIRI, S. Cancer Research - Nanoparticles,
Nanobiosensors and Their Use in Cancer Research. AZojono Journal of
Nanotechnology Online. 2007. v.3, set.
PATOLSKY, F.; RANJIT, K. T.; LICHTENSTEIN, A.; WILLNER, I. Chem.
Commun. (2000) 1025.
PEJCIC, B.; DE MARCO, R.; Impedance spectroscopy: Over 35 years of
electrochemical sensor optimization, Electrochimica Acta 51, 6217–6229, 2006
PEREZ, E. H. Ectopic cutaneous schistosomiasis. Int J Dermatol 2004; 43: 550-2.
PERINOTTO, A. C.; CASELI, L.; HAYASAKA, C. O.; RIUL, A.; OLIVEIRA, O. N.;
ZUCOLOTTO, V.; Thin Solid Films 2008,. 51,-69
PERNAMBUCO. Secretaria Estadual de Saúde. Secretaria Executiva de Vigilância em
Saúde. Plano Integrado de Ações para o Enfretamento às Doenças Negligenciadas
no Estado de Pernambuco/ SANAR – 2015 - 2018 / Secretaria Estadual de Saúde.
80
Secretaria Executiva de Vigilância em Saúde. – Recife: Secretaria Estadual de Saúde,
2015. 46p. : il. – (Série A. Normas e Manuais Técnicos)
PINGARRÓN, J. M.; SEDEÑO, P. Y.; CORTÉS, A. G. Gold nanoparticle-based
electrochemical biosensors. Journal Electrochimica Acta, V. 53, p. 5848–5866, 2008.
PINTO, E. P.; RAMOS, G. Q.; FONSECA FILHO, H.D. O Microscópio de Força
Atômica (AFM): importante ferramenta no estudo da morfologia de superfícies na
escala manométrica. Macapá, v. 3, n. 2, p. 41-50, jul.-dez. 2013 62
PIVIDORI, M. I.; MERKOÇI, A.; ALEGRET, S. Electrochemical genosensor design:
immobilization of oligonucleotides onto transducers surfaces and detection methods.
Biosensors and Bioelectronics, v. 15, n. 5-6, p. 291-303, Aug. 2000.
PIVIDORI, M. I.; LERMO, A.; ZACCO, E.; HERNÁNDEZ, S.; FABIANO, S.;
ALEGRET, S. Bioaffinity platforms based on carbon-polymer biocomposites for
electrochemical biosensing. Thin Solid Films, v, 516, n. 2-4, p. 284-292, Dec. 2007.
PODEROSO, W. L. S.; SANTANA, W. B.; COSTA, E. F; CIPOLOTTI, R.;
FAKHOURI, R. Ectopic schistosomiasis: description of five cases involving skin, one
ovarian case and one adrenal case. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.41 no.6 Uberaba
Nov./Dec. 2008
POHANKA M. y P. Skladal; Electrochemical biosensors – principles and applications,
Review, J. Appl. Biomed.: 6, 57-64 (2008), ISSN 1214-0287
PORDEUS, C. L.; AGUIAR, R. L.; QUININO, M. L. R.; BARBOSA, C. S. A
ocorrência das formas aguda e crônica da esquistossomose mansônica no Brasil no
período de 1997 a 2006: uma revisão de literatura. Epidemiol Serv Saúde
2008;17(3):163-75.
81
QIU, J. D.; PENG, H. P.; ANG, R. P. L.; XIA, X. H. Biosensors and Bioelectronics
25, 1447 (2010).
RADWA, E. E.; MOHAMMED, B.; SHEREEN F. MOSSALLAM, I. A. EGLAL, M.
A. HAMIDA. A. M. KHALIL. Combination of the two schistosomal antigens Sm14 and
Sm29 elicits significant protection against experimental Schistosoma mansoni infection.
Experimental Parasitology 145 (2014) 51–60.
ROLLEMBERG C, QUINTANS J, SANTOS R. Avaliação do Programa de Controle de
Esquistossomose no Bairro Santa Maria, Aracaju, Sergipe, sob a perspectiva
farmacêutica. Rev FAPESE 2008; 4:63-82 63
ROLLEMBERG, C. V. V. Aspetos epidemiológicos e distribuição geográfica da
esquistossomose e geo-helmintos, no Estado de Sergipe, de acordo com os dados do
Programa de Controle da Esquistossomose. Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical, 2011. 44(1), 91-96
ROLLINSON, D.; KNOPP, S.; LEVITZ, S.; STOTHARD, J, R.; TCHUENTÉ, L, T.;
GARBA, A.; MOHAMMED, K. A.; SCHUR,N.; PERSON, B.; COLLEY,D, G.,
UTZINGER.J. Time to set the agenda for schistosomiasis elimination. Acta Tropica
128 (2013) 423– 440.
ROSATTO, S. S.; FREIRE, R. S.; DURÁN, N, KUBOTA, L. T.; Biossensores
Amperompetricos para Determinação de Compostos Fenólicos em Amostras de
Interesse Ambiental. Química Nova. v. 24, p. 77- 86, 2001
ROSS, A. G. P.; BARTLEY, P. B.; SLEIGH, A. C, OLDS, G. R.; LI, Y.; WILLIAMS,
G. M.; MCMANUS, D. P. Schistosomiasis. N Eng J Med 2002; 346:1212-9.
SALEHIZADEH, H.; HEKMATIAN, E.; SADEGHIAND, K.; KENNEDY, M.
JournalofNanobiotechnology 10, 3 (2012).
82
SANTOS, A.R. Esquistossomose. Fundação Nacional da Saúde – Gerência Técnica
de Esquistossomose. Disponível em –
http://www.funasa.gov.br/acoes/doencas/esquis/esquis.htm.
SCHREIBER, F.; EBERHARDT, A.; LEUNG, T. Y. B.; SCHWARTZ, P.
WETTERER, S. M.; LAVRICH, D. J.; BERMAN, L. P. FENTER, P. EISENBERGER,
G. SCOLES, Physical Review B 57 (1998) 12474-12481
SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de Análise Instrumental. 5.
ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. 836 p.
SHI A, WANG J, HAN X, FANG X, ZHANG Y. A sensitive electrochemical DNA
biosensor based on gold nanomaterial and graphene amplified signal. Sensors
Actuators, B Chem [Internet]. Elsevier B.V.; 2014;200:206–12. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.snb.2014.04.024
SILVA, B. V. M.; CAVALCANTI, I. T.; MATTOS, A. B.; MOURA, P.;
SOTOMAYOR,M. D. P. T.; DUTRA, R. F. Disposable immunosensor for human
cardiac troponin T based on streptavidin-microsphere modified screen-printed electrode.
Biosens. Bioelectron., 26, 1062–1067, 2010.
STEVANATTO, L. C.; BRUSAMARELLO, V. J.; TAIROV, S. Parameter
identification and analysis of uncertainties in measuraments of lead-acid batteries. IEEE
trans. Instrum. Meas. Vol 63, no. 4, pp 761-768. 2014
SINGH, M.; VERMA, N.; GARG, A.K.; REDHU, N.; (2008). Urea Biossensors –
Review. Sensors and Actuators B: Chem., doi:10.1016/j.snb.2008
SONG, S.; XU, H.; FAN. C. Potential Diagnostic Applications of Biosensors: Current
and Future Directions. International Journal of Nanomedicine, v.1, n.4, p.433-440,
2006.
83
SOUZA, F.A; SANTOS, I. Disseminação da Esquistossomose Mansônica na Região de
Santa Cruz das Palmeiras-SP. Rev. LOGOS, 16 p.43, 2008.
STOTHARD, J.R., SOUSA-FIGUEIREDO, J.C., STANDLEY, C., VAN DAM, G.J.,
KNOPP, S., UTZINGER, J.,AMERI, H., KHAMIS, A.N., KHAMIS, I.S., DEELDER,
A.M., MOHAMMED, K.A., ROLLINSON,D., An evaluation of urine-CCA strip test
and fingerprick blood SEA-ELISAfor detection of urinary schistosomiasis in
schoolchildren in Zanzibar. Acta Trop.111. 2009., 64–70 65
SUÁREZ, G., SANTSCHI, C., MARTIN, O.J.F., SLAVEYKOVA, V.I., Biosensor
based on chemically-designed anchorable cytochrome c for the detection of H2O2
released by aquaticcells. Biosens. Bioelectron. 42 (0), 2013.. 385–390.
TAN, S.T.; WENDORFF, J.H.; PIETZONKA, C.; JIA, Z.H.; WANG, G.Q.
Biocompatible and biodegradable polymer nanofibers displaying superparamagnetic
properties. Chem. Phys. Chem. 6 (2005) 1461–1465.
TEN HOVE, R.J., VERWEIJ, J.J., VEREECKEN, K., POLMAN, K., DIEYE, L., VAN
LIESHOUT, L., Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of
Schistosoma man-soni and S. haematobium infection in stool samples collected in
northern Senegal.Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102, 2008..179–185.
THASSU, D.; DELEERS, M.; PATHAK.Y Nanoparticulate drug delivery systems.
Informa Heakthcare, New York, 2007.
TIBIRIÇA, S.H.C. Epidemiologia da Esquistossomose em três Municípios da
Microrregião de juiz de Fora, Minas Gerais. Tese de Doutorado, Universidade Federal
de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil, 2008.
TIMBÓ, M.J.M; LIMA, J.W.O. Esquistossomose: uma visão geral do problema. Rev.
Medicina do Ceará, 39(1-2) p. 1-14,1999.
84
TRANQUILLINI, G.; DE FREITAS F. H. I.; TADEU V. R.; GUEVARA S. L. A.;
LEITÃO, R.; BEDIN, V. Esquistossomose cutânea ectópica: relato de caso. Med Cutan
Iber Lat Am 2011;39(6):268-271)
THÉVENOT, D. R.; TOTH, K.; DURST, R. A.; WILSON, G. S. Electrochemical
biosensors: recommended definitions and classifications. Biosens. Bioelectron., 16,
121–31, 2001. 66
UTZINGER, J.; RASO, G.; BROOKER, S.; DE SAVIGNY, TANNER, M.;
ORNBJERG, N.; SINGER, B. H.; N’GORAN, E. K. Schistosomiasis and neglected
tropical diseases: towardsintegrated and sustainable control and a word of caution.
Parasitology. 2009.136,1859–1874
UTZINGER, J.; N’GORAN, E. K.; CAFFREY, C. R.; KEISER, J. From innovation to
appli-cation: social-ecological context, diagnostics, drugs and integrated control
ofschistosomiasis. Acta Trop. 2011. 120 (Suppl. 1), S121–S137.
VLADIMIR, L.; ALEXEEV, S. D.; DAVID, N. F.; SANFORD, A. A. Photonic Crystal
Glucose-Sensing Material for Noninvasive Monitoring of Glucose in Tear Fluid.
Clinical Chemistry, n. 50, p. 2353- 2360, 2004.
VIDOTTI, M. ;CARVALHAL, R. F.; MENDES, R. K.; FERREIRA, D. C.
M.;KUBOTA, L. T. Biosensors Based on Gold Nanostructures. J.Braz.Chem.Soc.,
Vol.22, No.1, 3-20, 2011.
VITORINO, R. R.; SOUZA, F. P. C.; COSTA, A. P.; FARIA JÚNIOR, F. C.;
SANTANA, L. A.; GOMES, A. P. Schistosomiasis mansoni: diagnosis, treatment,
epidemiology, prophylaxis and control. Rev Bras Clin Med. São Paulo, 2012 jan-
fev;10(1):39-45
85
VO-DINH, T.; Nanotechnology in biology and medicine: methods, devices and
applications. Taylor & Francis Gorup, Boca Raton, 2007.
WANG. J. From DNA Biosensors to Gene Chips. Nucleic Acids Research. 2000. v.28,
n.16, p.3011-3016.
WANG, M.; SUN, C.; WANG, L.; JI, X.; BAI, Y.; LI, T.; LI, J. J. Pharm. Biomed.
Anal. 33 (2003) 1117
WANG, J.; ZHANG, S.; ZHAN, Y. Anal. Biochem. 396 (2010) 304. 67
WANG S, YIN T, ZENG S, CHE H, YANG F, et al. A Piezoelectric Immunosensor
Using Hybrid Self-Assembled Monolayers for Detection of Schistosoma japonicum.
(2012) PLoS ONE 7(1): e30779. doi:10.1371/journal.pone.0030779
WANG, Y.; ZHOU, A. Spectroscopic studies on the binding of methylene blue with
DNA by means of cyclodextrin supramolecular systems. Journal of Photochemistry
and Photobiology A: Chemistry, v. 190, n. 1, p. 121-127, July 2006.
WEISS, M. G. Stigma and the social burden of neglected tropical diseases. PLoS Negl.
Trop. Dis. 2008.2, e237.
WICHMANN, D., PANNING, M., QUACK, T., KRAMME, S., BURCHARD, G.D.,
GREVELDING, C.,DROSTEN, C., 2009. Diagnosing schistosomiasis by detection of
cell-free parasiteDNA in human plasma. PLoS Negl. Trop. Dis. 3, e422.
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Elimination of schistosomiasis in low
transmission áreas: Salvador, Bahia, 18-19 Aug. 2008. Geneva, 2009. Report of the
WHO informal
86
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Schistosomiasis. Disponível em:
<www.who. int/mediacentre/factsheets/fs115/en/>. Acesso em: 01 jun. 2014.
YANG, J.; PARK, S.B.; YOON, H.G.; HUH, Y.M.; HAAM, S. Preparation of
poly_caprolactone nanoparticles containing magnetite for magnetic drug carrier.
International Journal of Pharmaceutics. 324 (2006) 185-190.
YANG, L.; REN, X.; TANG, F.; ZHANG, L. Biosensors and Bioelectronics 2009, 25,
889– 895.
ZHAO, X.; CAI, Y.; WANG, T.; SHI, Y.; JIANG, G. Analytical Chemistry. 80, 9091
(2008). 68
ZHOU, Y.M., HU S.Q., CAO, Z.X., SHEN, G.L, YU, R.Q. Anal. Lett., 35 (12)
(2002a), p. 1919
ZHOU, Y.M., LIU, G.D., WU, Z.Y., SHEN, G.L., YU, R.Q. Anal. Sci., 18 (2002b), p.
155
ZHOU, X.; BERGQUIST, R.; OLVEDA, R.; UTZINGER, J. Important Helminth
Infections in Southeast Asia: Diversity and Potential for Control and Elimination, 2009.
Parte 1. Volume 72 de Advances in Parasitology.480p.
ZHOU, X. N, GUO, J. G, WU, X.H, WU, Q.J, ZHENG J, et al. (2007) Epidemiology of
schistosomiasis in the Peoples’ Republic of China, 2004. Emerging Infectious
Diseases 13: 1470–1476.
ZHU, N. N.; CHANG, Z.; HEB, P. G.; FANG, Y. Z. Anal. Chim. Acta 545 (2005) 21
ZHU, N. N.; XU, Q.; LI, S.N.; GAO H. Electrochem. Commun., 11 (12) (2009), p.
2308
87
APÊNDICE A - Artigo Científico
IMPEDIMETRIC NANOSTRUCTURED GENOSENSOR FOR DETECTION OF
SCHISTOSOMIASIS IN CEREBROSPINAL FLUID AND SERUM SAMPLES
Artigo submetido à revista Sensors and Actuators B.
88
IMPEDIMETRIC NANOSTRUCTURED GENOSENSOR FOR DETECTION OF
SCHISTOSOMIASIS IN CEREBROSPINAL FLUID AND SERUM SAMPLES
Giselle, S. Santos 1, Cesar A.S. Andrade
2, Fabio, L. Melo
3, Maria D.L. Oliveira
1,2
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Pernambuco, 50670-901 Recife, PE, Brasil
2Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Pernambuco, 50670-901
Recife, PE, Brasil
3 Laboratório de Doenças Transmissíveis, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães,
50670-420 Recife, PE, Brazil
*To whom correspondence should be addressed.
M.D.L. Oliveira, Departamento de Bioquímica, UFPE, 50670-901, Recife, PE, Brazil
Phone: +55-81-2126.8450; Fax: +55-81-2126.8547
E-mail: [email protected]
89
Abstract
Schistosomiasis is a neglected disease closely related to the low levels of social
development and a serious public health problem. In this work, we performed an
electrochemical detection of Schistosoma mansoni DNA with a self-assembled
monolayer of mercaptobenzoic acid (MBA) immobilizing nanostructures composed
by gold nanoparticles (AuNPs) and magnetite nanoparticles (Fe3O4_NPs).
Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) and Cyclic Voltammetry (CV) were
used to monitor the biorecognition event. MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe
system reveals an effective electrochemical response indicating the surface
modification. The proposed biosystem was capable to recognize specific nucleotide
sequence of S. mansoni present in cerebrospinal fluid (CFS) serum samples at
different genome DNA concentrations. The biorecognition results in an increase in
the electron transfer resistance and a decrease of the current peaks at higher DNA
concentrations during electrochemical measurements. The developed platform
showed a DNA detection limit of 0.781 and 0.685 pg.µL- 1
for serum and CFS,
respectively. Therefore, the obtained biosensor can be considered as a useful tool for
specific detection of S. mansoni at low concentrations in various biological fluids.
Keywords: Biosensors; Schistosomiasis; DNA; Cyclic Voltammetry; Impedance
Spectroscopy; Metal Nanoparticles.
90
1. Introduction
Schistosomiasis is an important parasitic disease for public health caused by
helminth Schistosoma mansoni [1], which can be found in many tropical regions of the
globe [2]. Some studies have reported six to seven million people affected in Brazil [3,
4] with higher prevalence in Northeast states [2] and Southeast states [5, 6].
A severe form of S. mansoni is the ectopic schistosomiasis that can manifest in
different ways, especially involving the nervous system [7]. In these infections, spinal
cord is more frequently affected than the brain [8] . The early treatment of the disease is
essential for a good prognosis and preventing indiscriminate use of drugs by patients.
Therefore, it is necessary the development of affordable diagnostic techniques with high
sensibility and specificity [9]. Schistosomiasis diagnosis is based on the analysis of
faecal samples and cerebrospinal fluid (CSF) for nervous system manifestation [7, 10].
Some diagnostic tests such as ELISA, indirect fluorescence immunoassay,
radioimmunoassay are also commonly used [11]. In general, diagnostic tests require
expensive equipment and supplies, specialized technicians and are time-consuming [12].
In this context, electrochemical genosensors have been used as an excellent
alternative for the development of new methods for diagnosis [13, 14]. Electrochemical
techniques reveal changes in the electrical properties of the electrode surface such as
resistance and capacitance [15]. Impedimetric nanosensors are promising due to their
potential for rapid detection of DNA sequences with low cost and sensitivity [15, 16].
The association of metal nanoparticles have yielded nanostructured materials with
distinctive properties [17]. Of note, the improved electroanalytical performance of
nanostructured sensors is attributed to their high conductivity, large surface area,
stability and biocompatibility [18]. In particular, optical, magnetic and catalytic
91
properties of solid surfaces can be improved using magnetite (Fe3O4_NPs) and gold
nanoparticles (AuNPs) [19-21]. Fe3O4_NPs and AuNPs have been used as platforms for
the development of biosensors due to the ability to provide a stable immobilization of
large amount of biomolecules and improvement of the biocompatibility [22, 23] .
In this work, we reported the construction of new highly sensitive electrochemical
genosensor based on self-assembled monolayers of mercaptobenzoic acid (AMB) for S.
mansoni detection. Aminated-Fe3O4_NPs and AuNPs were immobilized on AMB layers
(Fig. 1). To the best of our knowledge is the first time that an electrochemical platform
is developed for specific detection of S. mansoni.
2. Experimental
2.1. Materials
S. mansoni samples were provided by the Parasitology Laboratory Aggeu
Magalhães Research Center (Recife, Brazil). All samples were previously characterized
using RT-qPCR.
Mercaptobenzoic acid (AMB), gold(III) chloride hydrate (HAuCl4 • xH2O), (3-
aminopropyl)triethoxysilane (APTES), trisodium citrate, bovine serum albumin (BSA),
1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-
hydroxysuccinimide (NHS) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Ammonium hydroxide (NH4OH), potassium ferri- and ferrocyanide were obtained from
VETEC (Brazil). All other chemicals used in this work were reagent-grade quality and
used as received without further purification. Ultrapure water was obtained from a
Millipore Milli-Q system.
92
2.2. Sample preparation
CSF samples (1 mL) from all patients and controls were collected by lumbar
puncture. CSF analysis consisted of general and specific cell count, CSF glucose, CSF
protein, protein electrophoresis and immunological determinations for schistosomiasis
(ELISA), herpes, syphilis, cysticercosis, toxoplasmosis, cytomegalovirus, Epstein-Barr
virus, human immunodeficiency virus, varicella zoster, Cryptococcus and human cell
lymphotropic virus. These samples were also analyzed in according to Brusky [10]
using NPCR, at the Aggeu Magalhães Research Center in FIOCRUZ, Pernambuco state.
Schistosoma DNA was purified using the illustra tissue & cells genomic Prep
Mini Spin Kit (GE Healthcare, UK) in according to the manufacturer's instructions. The
DNA in CSF samples from patients was extracted and purified which using the illustra
blood genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, UK) in according to the
manufacturer's instructions. Thus, it was quantified in a spectrophotometer and stored at
−20 °C. The thiolated primer used was Schfo17 (5′-GTGCTGGT
GGGTTGACGAGTTC-3′). This primer was specific for S. mansoni [24].
2.2. Synthesis of nanoparticles
Gold nanoparticles were synthesized using Frens method [25]. Initially, 0.01
wt% HAuCl4 • xH2O (100 mL) was boiled under vigorous stirring in a flask. Trisodium
citrate solution (2.5 mL, 1% w/v) was added quickly to the boiling solution, resulting in
a color change from pale yellow to dark red, indicating the formation of AuNPs. Then,
the solution was maintained at boiling temperature for 10 min.
APTES-modified Fe3O4_NPs were obtained according to Gan et al. [26].
Initially, 0.2g Fe3O4_NPs were added to 90 mL ethanol. Subsequently, 2 mL NH4OH
(25%) and 300 µL APTES were added to the previous solution, and stirred overnight.
93
Then, the product was magnetically separated and washed three times with deionized
water to obtain aminated-Fe3O4_NPs.
2.3. Electrode modification
The bare gold electrode (BGE) was polished with sandpaper and deionized water.
Subsequently, BGE was immersed in a piranha solution for 5 min, dried at room
temperature and incubated with 2 L AMB after washing with deionized water. Then,
was added 2 L of equal parts (1:1) of 0.4M EDC and 0.1M NHS on the electrode
surface for a period of 10 min in order to activate AMB carboxylic groups. After, 2 L
aminated-Fe3O4_NPs was dropped on the MBA-EDC/NHS-modified electrode
following incubation for 10 min. Then, the residual protonated amine groups of MBA-
Fe3O4_NPs was modified with AuNPs to obtain (MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs) using the
same EDC/NHS method. Finally, thiolated DNA probe was immobilized on the AuNPs
surface. Figure 1 shows the manufacturing process of the MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-
DNAprobe system. BSA was used in all experiments to avoid non-specific interactions.
2.4. Hybridization analysis
Target DNA was diluted in 10 mM phosphate-buffered saline (PBS) solution (pH
7.4) and heated (3 min at 40˚C) before the experiments. The hybridization was carried
out by simple drop-coating technique using 2L of the target DNA obtained from
human serum and CSF at different concentrations.
2.5. Electrochemical measurements
Electrochemical analyses were performed using a PGSTAT 128N
potentiostat/galvanostat (Autolab, Netherlands) with a three electrode conventional
electrochemical cell. All experiments were performed in the presence of a 10 mM K4[Fe
(CN)6]4-
/K3[Fe(CN)6]3-
solution (1:1) used as a redox probe. BGE was used as work
94
electrode. Platinum wire electrode and Ag/AgCl (saturated KCl) were used as auxiliary
and reference electrodes, respectively. Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS)
experiments were performed at a frequency between 100 mHz and 100 kHz, with an
alternating voltage adjusted to an amplitude of 10 mV. CV analysis were performed in
the range of potentials between +0.7 V and -0.2 V at a scan rate of 50 mV.s-1
. All
electrochemical measurements were performed in triplicate using three different
samples (n = 3).
2.6 Atomic force microscopy measurements
Structural analyses of the system were performed using an atomic force
microscope (SPM-9700, Shimadzu Corporation, Japan) in a noncontact mode in air at
room temperature (approximately 25ºC) [27]. Cantilevers with a silicon AFM probe
(Nanoworld, Japan, resonant frequency = 300 kHz, spring constant = 42 N.m−1
) were
used. The images (512 points per line) were collected with a scan rate of 1.0 Hz in a
scan area of 7.0 × 7.0 µm. To eliminate artifacts, images were obtained from at least two
macroscopically-separated areas on each sample and analyzed using AFM Gwyddion
software [28].
3. Results and Discussion
3.1 Morphological evaluation
Fig. 2a shows MBA modified-BGE surface with the presence of peaks distributed
along of the BGE surface and roughness about 56 nn. Then, after modification of MBA
self-assembled layer with Fe3O4_NPs and AuNPs, it can be observed the presence of
small-dispersed nanoparticles with a heterogeneous distribution on the surface (Fig. 2b).
Subsequently, DNA probe immobilization results in a surface roughness of 84 nm (Fig.
2c), in according to previous results reported in the literature [20, 29]. The interaction
95
between S. mansoni sample and the sensor surface was evaluated and significant
changes in the topography were observed (Fig. 2d). However, the binding of a non-
complementary target does not cause significant changes (Fig. 2e), demonstrating the
specificity of the sensor.
3.2 Voltammetric characterization
Fig. 3a shows the voltammetric response of the stepwise fabrication process of the
sensor. Initially, BGE voltammetric curve showed a characteristic behavior of a process
limited by diffusion of the redox probe. As explained before, BGE was subsequently
modified with MBA, which contains a thiol group enabling its adsorption on the metal
surface and resulting in a self-assembled monolayer [30-33]. In addition, MBA contains
a carboxylic acid functional group that allows a covalent bond with modified
nanoparticles [34]. A decrease of the anodic and cathodic peaks is observed due to
MBA adsorption. After, MBA carboxylic acid moiety was activated using EDC/NHS
coupling reagents. During the reaction, NHS ester group replaced the carboxyl group of
AMB and, thus, provides an increase in the current response due to electrostatic
interactions [35]. After immobilization of the aminated-Fe3O4_NPs on MBA-modified
electrode, it was observed an additional decrease in the amperometric electrode
response. Subsequently, AuNPs is covalently binding to Fe3O4_NPs through EDC/NHS
(Fig. 3a).
Finally, thiol-modified DNA probe was adsorbed on the MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs
to obtain the biosensor. MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe system revealed a
decrease in the amperometric response of the electrode with semi-reversible behavior,
since electron-transfer kinetics of K4[Fe(CN)6]4-
/K3[Fe(CN)6]3-
is perturbed by
hindrance of the electron diffusion (Fig. 3a). Therefore, after oligonucleotide
96
immobilization a decrease of the redox probe penetration is observed. In particular, after
hybridization process with complementary genome a decrease in the anodic and
cathodic peaks was obtained (Fig. 3b) due to the specific interaction. Of note, the
hybridization process on the electrode acts as a mass-transfer blocking layer and hinders
the diffusion of ferricyanide toward the electrode surface [27, 36].
3.3 Electrochemical impedance spectroscopy characterization
EIS technique provides a complete and detailed view of the electrical
characteristics of the electrode/solution interface [27, 37]. Fig. 4a shows the Nyquist
plots of the stepwise electrode surface modification. A typical Cole-Cole semicircle
with two well-defined regions containing a higher frequency region characterized by the
electron transfer process and a lower frequency region limited by the diffusion process
was obtained [38]. The BGE shows a very small semicircle domain (Fig. 4a) implying a
very low electron-transfer resistance (Ret) of the redox probe. After, Ret was increased
again after electrode modification using negatively charged MBA (Fig. 4a). Then, MBA
acts as an electrostatic barrier that hinder the ability of the redox probe to access the
electrode. EDC:NHS activation and subsequent immobilization of Fe3O4_NPs and
AuNPs provide an additional Ret increase (Fig. 4). The nanoparticles were immobilized
by a simple drop-coating procedure. A new increase in the Ret was obtained after
association between DNA probe and MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-modified gold electrode
(Fig. 4), indicating an obstruction of the electron transfer.
The hybridization process was confirmed after successive blockage of the electron
transfer at the sensor surface after genome recognition. Five different concentrations of
complementary S. mansoni genome (0.5 ng.µL-1
, 0.25 ng.µL-1
, 0.62 ng.µL-1
, 31.3
pg.µL-1
, 15.6 pg.µL-1
and 7.8 pg.µL-1
) were tested (Fig. 4b). A successive increase in
97
the Cole-Cole semicircle is clearly visualized and proportional to the increment of DNA
concentration, suggesting a specific interaction between the sensor and S. mansoni
genome.
The impedance data were fitted to a modified Randles equivalent circuit (Fig. 4c),
which includes the solution resistance (Rsol), electron transfer resistance (Ret), constant
phase element (CPE) and Warburg impedance element (W). Ideally, W and Rsol
represents the bulk properties of the electrolyte solution and diffusion features of the
redox probe in solution and, thus, were not affected by modifications of the electrode
surface. CPE value is related to the ionic charges, surface area, dielectric constant and
thickness of the layer [39]. Ret element depends on the insulating feature at the
electrode/electrolyte interface. In the present study, the changes in Ret were more
pronounced than those in other impedance components. Thus, Ret was used for sensing
the interfacial properties of the developed genosensor for all assembly procedures.
Table 1 shows the equivalent circuit parameters of the fitting curves for all
measurements. The obtained results were consistent with CV curves shown in Fig. 3 and
revealed a different response for each DNA concentration (Fig. 4). After hybridization
process, we observed that the Ret values increased significantly, while a reduction of
CPE values occurred at the same time. Of note, EIS spectra showed higher Ret values
for positive samples than for negative target indicating specific interactions between
evaluated probe and genomic target.
The results presented in Fig. 4 clearly show that DNA probe was capable to
recognize specific genomic target after immobilization as can be seen by the increase of
the Ret. The performance of the modified electrode for detection of S. mansoni genome
was evaluated through the relative variation of Ret (ΔRet). This variation can be
98
calculated according to the following equation: Ret(%)=[(RetPG-RetP)/RetP]×100,
where RetP is the value of the electron-transfer resistance of the MBA-Fe3O4_NPs-
AuNPs-DNAprobe-modified electrode. RetPG is the value of the electron-transfer
resistance of the MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe-genome-modified electrode after
exposing it to contaminated samples.
An impedimetric evaluation was performed for different concentrations of S.
mansoni genome (Fig. 4d). A linear relationship between ΔRet and genome
concentration was found and the detection limit was estimated to be approximately 0.78
pg.µL-1
. ΔRet increases proportionally to S. mansoni genome concentration and
indicates that the modified electrode can sense the interactions between the probe and
genomic target.
In addition, the selectivity of the biosensor was investigated by monitoring
changes in the Ret response by incubating with complementary and non-complementary
genomic sequences. We used non-complementary genomic sequence from
Leishmaniasis as a negative control (0.1 ng.L-1
). The interaction of the biosensor with
a non-complementary genomic sequence (negative control) resulted in insignificant
values of Ret, revealing the selectivity of the bioelectrode.
A brief information of these results is given in Table 2, for fixed concentrations of
genomic target sequence. These results demonstrate that the biosystem retains its
capability to recognize specific target as a clear indication that this system could be used
for specific detection of S. mansoni in clinical samples.
3.4 Detection of S. mansoni in cerebrospinal fluid
As previously explained, we developed a sensor platform capable of recognizing
S. mansoni genome in different biological samples. Therefore, the biosensor was
99
exposed to cerebrospinal fluid (CSF) to evaluate its effectiveness to other samples. The
sensitivity could be observed by the increase of the Cole-Cole semicircle (Fig. 5a) with
linear relationship between Ret and DNA concentration as shown in Fig. 5b. A
correlation coefficient of 0.96 was obtained, indicating that the interactions between
probe and genomic target sequence can be sensed by MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-
DNAprobe system. The detection limit of 0.685 pg. L-1
was estimated from the signal-
to-noise characteristics of these data (S/N = 3). A significant increase in the Ret values
were observed after recognition of positive samples (Table 1). Our detection limits were
superior to previous reports using monoclonal antibodies for specific detection of S.
mansoni [40, 41]. Thus, the sensor platform showed good sensitivity being able to
detect genomic target at low concentrations of genetic material in CSF.
The filling of the recognition sites (Ө) can be calculated by =(1-
Rsystem)/Rhybridization, where RSystem is the Ret of the biosensor and RHybridization is the Ret of
the biosensor after exposure to different concentrations of the genomic target sequence.
Fig. 5c shows a plot of Ө as a function of concentration of the genomic target sequence.
The value of Ө increases with increasing DNA target concentration and is found to be
0.69 (69%) at 5.0 ng.L-1
.
The reproducibility of the genosensor using at least three sensors fabricated
independently at the same conditions was evaluated. An acceptable reproducibility with
a relative standard deviation (R.S.D.) of 4.2% was obtained. Therefore, MBA-
Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe system is a useful platform for the development of
biosensors for specific detection of S. mansoni in CSF and serum samples.
4. Conclusion
100
In this study, electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry
were used for the development of a specific biosensor for S. mansoni. The developed
biosensor showed a good performance for determination of genomic target sequence
from S. mansoni with low limit of detection, specificity and reproducibility. The
developed sensor platform was effective in detecting S. mansoni in different biological
fluids. These results confirmed that this sensing approach provides a rapid, sensitive and
convenient way for detection of S. mansoni.
Acknowledgments
G.S. Santos would like to thank FACEPE for a MSc scholarship. M.D.L. Oliveira and
C.S.A. Andrade would like to CNPq (grant 302885/2015-3 and 302930/2015-9) and
INCT_if.
5. References
[1] S. Tomczyk, K. Deribe, S.J. Brooker, H. Clark, K. Rafique, S. Knopp, J. Utzinger, G. Davey,
Association between footwear use and neglected tropical diseases: a systematic review and
meta-analysis, PLoS Negl Trop Dis, 8 (2014) e3285.
[2] R.G. Scholte, L. Gosoniu, J.B. Malone, F. Chammartin, J. Utzinger, P. Vounatsou, Predictive
risk mapping of schistosomiasis in Brazil using Bayesian geostatistical models, Acta Trop, 132
(2014) 57-63.
[3] T.C. Favre, A.P. Pereira, L.C. Beck, A.F. Galvao, O.S. Pieri, School-based and community-
based actions for scaling-up diagnosis and treatment of schistosomiasis toward its elimination
in an endemic area of Brazil, Acta Trop, 149 (2015) 155-162.
[4] C.H. King, Parasites and poverty: the case of schistosomiasis, Acta Trop, 113 (2010) 95-104.
[5] W. Tavares, L.A.C. Marinho, Rotinas de diagnóstico e tratamento das doenças infecciosas e
parasitárias, 2 ed., São Paulo, 2007.
101
[6] B. Ministério da saúde, Guia de vigilância epidemiológica, in: S.d.V.e. Saúde. (Ed.)Brasília,
2009.
[7] T.C. Ferrari, P.R. Moreira, A.S. Cunha, Clinical characterization of neuroschistosomiasis due
to Schistosoma mansoni and its treatment, Acta Trop, 108 (2008) 89-97.
[8] T.C. Ferrari, P.R. Moreira, Neuroschistosomiasis: clinical symptoms and pathogenesis,
Lancet Neurol, 10 (2011) 853-864.
[9] G. Harter, H. Frickmann, S. Zenk, D. Wichmann, B. Ammann, P. Kern, B. Fleischer, E.
Tannich, S. Poppert, Diagnosis of neuroschistosomiasis by antibody specificity index and semi-
quantitative real-time PCR from cerebrospinal fluid and serum, J Med Microbiol, 63 (2014) 309-
312.
[10] I.S. Bruscky, F.L. de Melo, Z.M. de Medeiros, F.F. Albuquerque, L.B. Wanderley, C. da
Cunha-Correia, Nested polymerase chain reaction in cerebrospinal fluid for diagnosing spinal
cord schistosomiasis: A promising method, J Neurol Sci, 366 (2016) 87-90.
[11] J.T. Coulibaly, N.K. N’Goran, J. Utzinger, M.J. Doenhoff, E.M. Dawson, A new rapid
diagnostic test for detection of anti-Schistosoma mansoni and anti-Schistosoma haematobium
antibodies, Parasites & Vectors 6(2013).
[12] J. Clerinx, E. Bottieau, D. Wichmann, E. Tannich, M. Van Esbroeck, Acute schistosomiasis in
a cluster of travelers from Rwanda: diagnostic contribution of schistosome DNA detection in
serum compared to parasitology and serology, J Travel Med, 18 (2011) 367-372.
[13] P. Kara, C. Cavusoglu, S. Cavdar, M. Ozsoz, Direct electrochemical genosensing for multiple
point mutation detection of Mycobacterium tuberculosis during the development of rifampin
resistance, Biosens Bioelectron, 24 (2009) 1796-1800.
[14] A.C.H. Castro, E.G. Franc, L.F. de Paula, M.M.C.N. Soares, L.R. Goulart, J.M. Madurro, A.G.
Brito-Madurrosince, Preparation of genosensor for detection of specific DNA sequence of the
102
hepatitis B virus is possible convert the hybridization into a measurable electric signal. ,
Applied Surface Science 314 (2014) 273-279.
[15] A. Bonanni, M. del Valle, Use of nanomaterials for impedimetric DNA sensors: a review,
Anal Chim Acta, 678 (2010) 7-17.
[16] A. Guiseppi-Elie, L. Lingerfelt, Impedimetric Detection of DNA Hybridization: Towards
Near-Patient DNA Diagnostics, Topics in Current Chemistry, 260 (2005) 161-186.
[17] C. Xu, J. Xie, D. Ho, C. Wang, N. Kohler, E.G. Walsh, J.R. Morgan, Y.E. Chin, S. Sun, Au-
Fe3O4 dumbbell nanoparticles as dual-functional probes, Angew Chem Int Ed Engl, 47 (2008)
173-176.
[18] F. Li, X. Han, S. Liu, Development of an electrochemical DNA biosensor with a high
sensitivity of fM by dendritic gold nanostructure modified electrode, Biosens Bioelectron, 26
(2011) 2619-2625.
[19] W. Wu, Q. He, C. Jiang, Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface
functionalization strategies, Nanoscale Res Lett, 3 (2008) 397-415.
[20] R. Das, M.K. Sharma, V.K. Rao, B.K. Bhattacharya, I. Garg, V. Venkatesh, S. Upadhyay, An
electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane
modified screen printed electrode, J Biotechnol, 188 (2014) 9-16.
[21] T. Rolim, J. Cancino, V. Zucolotto, A nanostructured genosensor for the early diagnosis of
systemic arterial hypertension, Biomed Microdevices, 17 (2015) 3.
[22] S. Liu, J. Liu, L. Wang, F. Zhao, Development of electrochemical DNA biosensor based on
gold nanoparticle modified electrode by electroless deposition, Bioelectrochemistry, 79 (2010)
37-42.
[23] R.D. Zysler, E. Lima Jr, M.V. Mansilla, H.E. Troiani, M.L.M. Pisciotti, P. Gurman, A. Lamagna,
L. Colombo, A New Quantitative Method to Determine the Uptake of SPIONs in Animal Tissue
103
and Its Application to Determine the Quantity of Nanoparticles in the Liver and Lung of Balb-c
Mice Exposed to the SPIONs, J. Biomed,Nanotechnol, 9 (2013) 142-145.
[24] F.G. Abath, F.L. Melo, R.P. Werkhauser, L. Montenegro, R. Montenegro, H.C. Schindler,
Single-tube nested PCR using immobilized internal primers., Biotechniques, 33 (2002).
[25] G. Frens, Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold
suspensions, Nature Phys. Sci, 241 (1973) 20-22.
[26] N. Gan, H. Jin, T. Li, L. Zheng, Fe(3)O(4)/Au magnetic nanoparticle amplification strategies
for ultrasensitive electrochemical immunoassay of alfa-fetoprotein, Int J Nanomedicine, 6
(2011) 3259-3269.
[27] M.D. Oliveira, C.A. Andrade, M.T. Correia, L.C. Coelho, P.R. Singh, X. Zeng, Impedimetric
biosensor based on self-assembled hybrid cystein-gold nanoparticles and CramoLL lectin for
bacterial lipopolysaccharide recognition, J Colloid Interface Sci, 362 (2011) 194-201.
[28] D. Necas, P. Klapetek, C. Anderson, Gwyddion, 2008.
[29] H.Y. Park, M.J. Schadt, L. Wang, I.I. Lim, S., O.N. Njoki, S.H. Kim, M.Y. Jang, J. Luo, C.J.
Zhong, Fabrication of Magnetic Core@Shell Fe Oxide@Au Nanoparticles for Interfacial
Bioactivity and Bio-separation, Langmuir, 23 (2007) 9050-9056.
[30]I.Navratilova,P.Skladal,The immunosensors for measurement of 2,4-dichlorophenoxyacetic
acid based on electrochemical impedance spectroscopy, Bioelectrochemistry, 62 (2004) 11-18.
[31] A.J. Bard, L.R. Faulkner, Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications, 2 ed.,
New York, 2000.
[32] J.G. Guan, Y.Q. Miao, Q.J. Zhang, Review impedimetric biosensors, J. Biosci. Bioeng, 97
(2004) 219-226.
[33] E. Katz, I. Willne, Probing Biomolecular Interactions at Conductive and Semiconductive
Surfaces by Impedance Spectroscopy: Routes to Impedimetric Immunosensors, DNA-Sensors,
and Enzyme Biosensors, Electroanal, 15 (2003) 913-947.
104
[34] H. Wang, H. Ohnuki, H. Endo, M. Izumi, Preparation of Amperometric Glucose Biosensor
Based on 4-Mercaptobenzoic Acid, Physics Procedia, 14 (2011) 2-6.
[35] P. Geng, X. Zhang, W. Meng, Q. Wang, W. Zhang, L. Jin, Z. Feng, Z. Wu, Self-assembled
monolayers-based immunosensor for detection of Escherichia coli using electrochemical
impedance spectroscopy, Electrochimica Acta, 53 (2008) 4663-4668.
[36] M.P. Costa, C.A. Andrade, R.A. Montenegro, F.L. Melo, M.D. Oliveira, Self-assembled
monolayers of mercaptobenzoic acid and magnetite nanoparticles as an efficient support for
development of tuberculosis genosensor, J Colloid Interface Sci, 433 (2014) 141-148.
[37] M.D.L. Oliveira, M.L. Nogueira, M.T.S. Correia, L.C.B.B. Coelho, C.A.S. Andrade, Detection
of dengue virus serotypes on the surface of gold electrode based on Cratylia mollis lectin
affinity, Sensors and Actuators B: Chemical, 155 (2011) 789-795.
[38] B.A. Boukamp, A Package for Impedance/Admittance data analysis Solid State lonics 19
(1986) 136-140.
[39] F.B. Diniz, G.F. De Andrade, C.R. Martins, W.M. De Azevedo, A comparative study of epoxy
and polyurethane based coatings containing polyaniline-DBSA pigments for corrosion
protection on mild steel, Progress in Organic Coatings, 76 (2013) 912-916.
[40] J. Nie, Y. Zhang, H. Wang, S. Wang, G. Shen, Superhydrophobic surface-based magnetic
electrochemical immunoassay for detection of Schistosoma japonicum antibodies, Biosens
Bioelectron, 33 (2012) 23-28.
[41] M. Shohayeb, H. Arida, G.A.M. Mersal, M. El-Badawy, Development of a Nanotechnology-
Based Screen-Printed Biosensor for Detection of Schistosoma Mansoni Antibodies, Int. J.
Electrochem. Sci, 11 (2016) 1337-1344.
105
Table 1
Values of the equivalent circuit elements from fitted impedance results.
Modified electrode [Genomic target sequence] RCT/kΩ*
Q/F* n*
Bare gold electrode - 0.15 1.63 0.36
MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs_DNA probe - 0.75 7.47 0.72
Serum Sample
Genosensor 7.8 pg.µL-1 1.08 6.92 0.73
Genosensor 15.6 pg.µL-1 1.19 6.78 0.73
Genosensor 31.3 pg.µL-1 1.46 4.52 0.78
Genosensor 0.62 ng.µL-1 1.55 5.85 0.77
Genosensor 0.25 ng.µL-1 2.02 5.53 0.75
Genosensor 0.5 ng.µL-1 2.70 3.98 0.79
CSF Sample
Genosensor 0.5 pg.µL-1 2.09 3.59 0.77
Genosensor 5.0 pg.µL-1 2.22 3.87 0.76
Genosensor 50 pg.µL-1 2.27 3.63 0.78
Genosensor 0.5 ng.µL-1 2.43 2.98 0.82
Sensor_DNA control negative - 0.72 8.51 0.71
*Values of the equivalent circuit elements from fitted impedance results.
Table 2
Relative charge transfer variation from impedance data.
Condition Before* After
1 After2 After
3
Serum Sample CSF Sample
Ret/K 0.75 2.70 2.43 0.71
∆Ret (%) - 260.0 224.0 30.6
Sensor response before interaction with genomic target sequence; 1-after recognition of
complementary genomic target sequence; 2-after recognition of genomic target specific from
CSF and, 3-after contact with non-complementary genomic target sequence.
106
Figure Caption
Figure 1. Schematic representation of the surface modification.
Figure 2. AFM images of the stepwise modification process: a) MBA b) MBA-
Fe3O4_NPs-AuNPs; c) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe; d) MBA-Fe3O4_NPs-
AuNPs-DNAprobe- DNA target; e) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe-CSFgenome
and, f) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe-negative control.
Figure 3. Cyclic voltammograms of the stepwise modification process (a) and CVs at
different stages of biorecognition process (b): BGE (―), MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-
DNAprobe (―), MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-probe-genome (―). Cyclic voltammetry
scan was initiated at - 0.2 V vs. Ag/AgCl in positive direction at 50 mV.s−1
.
Figure 4. (a) Nyquist plots of the stepwise modification and immobilization process:
() BGE, ( ) MBA, ( ) MBA-EDC/NHS, ( ) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs, ( ) MBA-
Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe and ( ) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe-genome.
(b) Biosensor response when exposed to different concentrations of target genomic
DNA and a negative control: ( ) BGE, ( ) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs, ( ) MBA-
Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe, ( ) Biosensor-genome (7.8 pg.L-1
), ( ) Biosensor-
genome (15.6 pg.L-1
), ( ) Biosensor-genome (31.3 pg.mL-1
), ( ) Biosensor-genome
(0.62 ng.L-1
), ( ) Biosensor-genome (0.25 ng.L-1
), ( ) Biosensor-genome (0.5 ng.L-
1), and ( ) Biosensor-negative control, (―) the solid lines represent the simulation
107
results. (c) Equivalent circuit. (d) Ret% as a function of different concentrations of
genomic target sequence.
Figure 5. (a) Nyquist plots of the biosensor when exposed to different concentrations of
DNA genome obtained from CSF: ( ) BGE, ( ) MBA-Fe3O4_NPs-AuNPs-DNAprobe,
( ) Biosensor-genome (0.5 pg.µL-1
), ( ) Biosensor-genome (5.0 pg.µL-1
), ( )
Biosensor-genome (50.0 pg.µL-1
), ( ) Biosensor-genome (0.5 ng.µL-1
). Ret% (b) and
Ө (c) as function of different concentrations of S. mansoni genome obtained from CSF.
108
Fig.1
Fig. 2
109
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
-6
-4
-2
0
2
4
6
Cu
rren
t (
A)
Potential (V)
Fig.3a
-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
Cu
rren
t (
A)
Potential (V)
Fig. 3b
110
0.0 5.0x102
1.0x103
1.5x103
2.0x103
2.5x103
3.0x103
0.0
2.0x102
4.0x102
6.0x102
8.0x102
1.0x103
-Z"(o
hm
)
Z' (ohm)
Fig. 4a
0.0 7.0x102
1.4x103
2.1x103
2.8x103
3.5x103
4.2x103
0.0
3.0x102
6.0x102
9.0x102
1.2x103
1.5x103
-Z"(
oh
m)
Z'(ohm)
Fig. 4b
111
Fig. 4c
0.01 0.1 1
50
100
150
200
250
300
R
CT(%
)
Genome concentration
Fig. 4d
112
0.0 8.0x102
1.6x103
2.4x103
3.2x103
4.0x103
0.0
4.0x102
8.0x102
1.2x103
1.6x103
-Z
´´(o
hm
)
Z´(ohm)
Fig. 5a
113
1 10 100
170
180
190
200
210
220
230
R
CT(%
)
CSF (pg.L-1)
Fig. 5b
1 10 100
0.65
0.66
0.67
0.68
0.69
0.70
Concentration
Fig. 5c
114
ANEXO A – Pedido de Patente
DETECÇÃO ELETROQUÍMICA DA ESQUISTOSSOMOSE UTILIZANDO
PARTÍCULAS MAGNÉTICAS DECORADAS COM PARTÍCULAS DE OURO
Pedido depositado sob o númeno: BR 10 2015 007805 6
115
116
ANEXO B – Normas da Revista
SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL
An international journal devoted to research and development of chemical
transducers
AUTHOR INFORMATION PACK
TABLE OF CONTENTS
• Description p.1
• Audience p.2
• Impact Factor p.2
• Abstracting and Indexing p.2
• Editorial Board p.2
• Guide for Authors p.4
ISSN: 0925-4005
DESCRIPTION
Sensors & Actuators, B: Chemical is an interdisciplinary journal dedicated to covering
research and development in the field of chemical sensors, actuators and microsystems.
The scope of the journal encompasses, but is not restricted to, the following areas:
• Sensing principles and mechanisms
• New materials development (transducers and sensitive/recognition components)
• Fabrication technology
AUDIENCE
Academic and Industrial Researchers in Analytical Chemistry and Instrument
Development
IMPACT FACTOR
117
2014: 4.097 © Thomson Reuters Journal Citation Reports 2015
ABSTRACTING AND INDEXING
Analytical Abstracts
Cambridge Scientific Abstracts Chemical Abstracts Compendex
Computer and Control Abstracts
Current Contents Metals Abstracts EIC/Intelligence
Electrical and Electronics Abstracts Engineered Materials Abstracts Engineering Index
FIZ Karlsruhe PASCAL/CNRS Physics Abstracts
Science Citation Index
Scopus
EDITORIAL BOARD
Editors
Z. Brzozka, Warsaw University of Technology, Warsaw, Poland
Electrochemical and optical (bio) sensors and their biomedical applications,
miniaturized analytical devices based on microfluidics principle, Lab-on-a-Chip devices
and their applications, fabrication technology of microfluidic devices and systems, new
biosensing principles.
R.E. Gyurcsányi, Budapest University of Technology and Economics, Budapest,
Hungary
Electrochemical sensors (ion-selective electrodes, amperometric (bio) sensors,
nanopore, ultramicroelectrodes and ion-channel mimetic sensing), Optical sensors
(optodes and surface plasmon resonance biosensors), Affinity biosensors, Mass-
sensitive transducers, Nano (bio) chemical sensors and sensor miniaturization, Selective
synthetic receptors (nucleic acid analogs, aptamers, molecularly imprinted polymers,
ionophores, etc.), Biomedical and environmental application of sensors.
J.-H. Lee, Korea University, Seoul, South Korea
118
1) Oxide semiconductor gas sensors - The enhancement of gas sensing characteristics by
the morphological design/control of oxide nanostructures (gas sensors using oxide
nanowires, nanofibers, nanopowders, nanosheets, and hierarchical nanostructures); The
control of gas selectivity and response by loading or doping noble metal catalysts or
oxide additives; Preparation of oxide nanostructures for gas sensor applications via the
physico-chemical routes (sol-gel method, hydrothermal method, solvothermal method,
thermal evaporation, sputtering, atomic layer deposition and so on); Gas sensing
mechanism 2) Gas sensors using solid electrolytes, Automotive exhaust gas sensors
(oxygen sensors, air-to-fuel ratio sensors, automotive hydrocarbon sensors, automotive
NOx sensors using solid electrolytes such as yttria stabilized zircona and gadolinia-
doped ceria).
R. Moos, Universität Bayreuth, Bayreuth, Germany
Exhaust gas sensors, Solid state gas sensor materials, Solid state gas sensor principles,
Solid state gas sensor technology and Solid state gas sensor modeling; Solid state
electrochemical sensors; Conductometric or impedancemetric sensors of framework-
based materials (zeolites, MOF); Transducer technology, LTCC, HTCC, hot plates;
Chemical sensors for harsh environments.
R. Narayanaswamy
1) Optical Chemical sensors and Biuosensors: development, applications and
analytical instrumentation. New materials, devices, nano materials for optical
chemical sensing, for
environmental, biochemical and industrial applications; 2) Colorimetric and
Fluorescence based sensing systems. Nanoparticles, molecularly imprinted polymers
and other novel materials in sensors;
3) Surface Plasmon Resonance sensors and sensing systems: devices and
instrumentation; 4) Mass sensitive devices, applications and instrumentation, e.g. SAW,
BAW, QCM, QMB, etc.
D. Papkovsky, University College Cork, Cork, Ireland
119
1) Optochemical sensors; Optical Oxygen sensors; Biological applications of optical
oxygen sensing and imaging; 2) Probes for chemical and biological analytes;
Intracellular probes; Sensors for analysis of cellular function; 3) Nano sensors and
biosensors, Fluorescence spectroscopy; Time-resolved Flourescence, Phosphorescence
Porphyrins.
G. Rivas, Universidad Nacional de Cordoba (Argentina), Cordóba, Argentina
Biosensors and biomedical applications: biomarkers sensors; enzymatic biosensors;
DNA biosensors; hybridization and DNA damage biosensors; immunosensors;
aptasensors. Sensing principles. Nanobiotechnology and Nanobiomedicine:
nanomaterials for the development of (bio) sensors, carbon nanotubes, graphene,
metallic and magnetic nanoparticles. Neurotransmitters sensors. Modified electrodes.
Flow Injection Analysis.
Y. Shimizu, Nagasaki University, Nagasaki, Japan
Semiconductor gas sensors, Gas sensors by employing organic materials and/or
inorganic materials, Gas sensing principle mechanism, New gas sensor meaterials,
Humidity sensors.
M. Tokeshi, Hokkaido University, Sapporo, Japan
Lab-on-a-Chip, MicroTAS, Biochip and Biosensor, Microfabrication and
Nanofabrication, Biomedical
Applications, Bioanalytical Chemistry, Highly sensitive Detection Methods.
U. Weimar, Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Tübingen, Germany
Chemical sensor systems, data processing of chemical sensor systems, related pattern
recognition and multi-component analysis, electronic noses, application of chemical
sensor systems.
GUIDE FOR AUTHORS
120
Aims and Scope
Sensors & Actuators, B: Chemical is an interdisciplinary journal dedicated to covering
research and development in the field of chemical sensors, actuators, micro- and
nanosystems.
The scope of the journal encompasses, but is not restricted to, the following areas:
• Sensing principles and mechanisms
• New materials development (transducers and sensitive/recognition components)
• Fabrication technology including nanotechnology
• Actuators
• Optical devices
• Electrochemical devices
• Mass-sensitive devices
• Gas sensors
• Biosensors
• Bio-MEMS
• Analytical microsystems
• Environmental
• Process control
• Biomedical applications
• Signal processing
• Sensor and sensor-array chemometricsμTAS - Micro Total Analysis Systems
Microsystems for the generation, handling and analysis of (bio)chemical information.
The special section of Sensors & Actuators, B: Chemical on μTAS is dedicated to
contributions concerning miniaturised systems for (bio)chemical synthesis and analysis,
also comprising work on Bio-MEMS, Lab-on-a-chip, biochips and microfluidics.
121
Topics covered by the μTAS section include:
• Lab-on-a-chip
• Physics and chemistry of microfluidics
• Microfabrication technology for μTAS
• Analytical chemical aspects
• Detectors, sensors, arrays for μTAS
• μTAS applications
• DNA analysis
• Microinstrumentation
• Microsystems for combinatorial chemistry
Types of paper
Sensors and Actuators B: Chemical, welcomes full length research papers and review
articles, and short communications. Full length papers should in general not exceed
5000 words or about 12 printed pages including tables and diagrams. Short
communications should not exceed 2000 words or 4 printed pages. For all contributions
the acceptance criteria are quality, originality, and scientific and technological relevance
to the field. An adequate referencing to the state-of-the-art is essential.
BEFORE YOU BEGIN
Ethics in publishing
For information on Ethics in publishing and Ethical guidelines for journal
publication see https://www.elsevier.com/publishingethics and
https://www.elsevier.com/journal-authors/ethics.
Conflict of interest
All authors are requested to disclose any actual or potential conflict of interest
including any financial, personal or other relationships with other people or
122
organizations within three years of beginning the submitted work that could
inappropriately influence, or be perceived to influence, their work. See also
https://www.elsevier.com/conflictsofinterest. Further information and an example of a
Conflict of Interest form can be found at:
http://service.elsevier.com/app/answers/detail/a_id/286/supporthub/publishing.
Submission declaration and verification
Submission of an article implies that the work described has not been published
previously (except in the form of an abstract or as part of a published lecture or
academic thesis or as an electronic preprint, see
https://www.elsevier.com/sharingpolicy), that it is not under consideration for
publication elsewhere, that its publication is approved by all authors and tacitly or
explicitly by the responsible authorities where the work was carried out, and that, if
accepted, it will not be published elsewhere in the same form, in English or in any other
language, including electronically without the written consent of the copyright-holder.
To verify originality, your article may be checked by the originality detection service
CrossCheck https://www.elsevier.com/editors/plagdetect.
Changes to authorship
Authors are expected to consider carefully the list and order of authors before
submitting their manuscript and provide the definitive list of authors at the time of the
original submission. Any addition, deletion or rearrangement of author names in the
authorship list should be made only before the manuscript has been accepted and only if
approved by the journal Editor. To request such a change, the Editor must receive the
following from the corresponding author: (a) the reason for the change in author list and
(b) written confirmation (e-mail, letter) from all authors that they agree with the
addition, removal or rearrangement. In the case of addition or removal of authors, this
includes confirmation from the author being added or removed.
Only in exceptional circumstances will the Editor consider the addition, deletion or
rearrangement of authors after the manuscript has been accepted. While the Editor
considers the request, publication of the manuscript will be suspended. If the manuscript
123
has already been published in an online issue, any requests approved by the Editor will
result in a corrigendum.
Article transfer service
This journal is part of our Article Transfer Service. This means that if the Editor feels
your article is more suitable in one of our other participating journals, then you may be
asked to consider transferring the article to one of those. If you agree, your article will
be transferred automatically on your behalf with no need to reformat. Please note that
your article will be reviewed again by the new journal. More information about this can
be found here: https://www.elsevier.com/authors/article-transfer-service.
Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing
Agreement' (for more information on this and copyright, see
https://www.elsevier.com/copyright). An e-mail will be sent to the corresponding author
confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal Publishing Agreement'
form or a link to the online version of this agreement.
Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles including
abstracts for internal circulation within their institutions. Permission of the Publisher is
required for resale or distribution outside the institution and for all other derivative
works, including compilations and translations (please consult
https://www.elsevier.com/permissions). If excerpts from other copyrighted works are
included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and
credit the source(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in
these cases: please consult https://www.elsevier.com/permissions.
For open access articles: Upon acceptance of an article, authors will be asked to
complete an 'Exclusive License Agreement' (for more information see
https://www.elsevier.com/OAauthoragreement). Permitted third party reuse of open
access articles is determined by the author's choice of user license (see
https://www.elsevier.com/openaccesslicenses).
Author rights
124
As an author you (or your employer or institution) have certain rights to reuse your
work. For more information see https://www.elsevier.com/copyright.
Role of the funding source
You are requested to identify who provided financial support for the conduct of the
research and/or preparation of the article and to briefly describe the role of the
sponsor(s), if any, in study design; in the collection, analysis and interpretation of data;
in the writing of the report; and in the decision to submit the article for publication. If
the funding source(s) had no such involvement then this should be stated.
Funding body agreements and policies
Elsevier has established a number of agreements with funding bodies which
allow authors to comply with their funder's open access policies. Some authors
may also be reimbursed for associated publication fees. To learn more about existing
agreements please visit https://www.elsevier.com/fundingbodies.
Open access
This journal offers authors a choice in publishing their research:
Open access
• Articles are freely available to both subscribers and the wider public with permitted
reuse
• An open access publication fee is payable by authors or on their behalf e.g. by their
research funder or institution
Subscription
• Articles are made available to subscribers as well as developing countries and patient
groups through our universal access programs (https://www.elsevier.com/access).
• No open access publication fee payable by authors.
125
Regardless of how you choose to publish your article, the journal will apply the same
peer review criteria and acceptance standards.
For open access articles, permitted third party (re)use is defined by the following
Creative Commons user licenses:
Creative Commons Attribution (CC BY)
Lets others distribute and copy the article, create extracts, abstracts, and other revised
versions, adaptations or derivative works of or from an article (such as a translation),
include in a collective work (such as an anthology), text or data mine the article, even
for commercial purposes, as long as they credit the author(s), do not represent the author
as endorsing their adaptation of the article, and do not modify the article in such a way
as to damage the author's honor or reputation.
Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs (CC BY-NC-ND)
For non-commercial purposes, lets others distribute and copy the article, and to include
in a collective work (such as an anthology), as long as they credit the author(s) and
provided they do not alter or modify the article.
The open access publication fee for this journal is USD 3100, excluding taxes. Learn
more about
Elsevier's pricing policy: https://www.elsevier.com/openaccesspricing.
Green open access
Authors can share their research in a variety of different ways and Elsevier has a
number of green open access options available. We recommend authors see our green
open access page for further information (http://elsevier.com/greenopenaccess). Authors
can also self-archive their manuscripts immediately and enable public access from their
institution's repository after an embargo period. This is the version that has been
accepted for publication and which typically includes author-incorporated changes
suggested during submission, peer review and in editor-author communications.
126
Embargo period: For subscription articles, an appropriate amount of time is needed for
journals to deliver value to subscribing customers before an article becomes freely
available to the public. This is the embargo period and it begins from the date the article
is formally published online in its final and fully citable form.
This journal has an embargo period of 24 months.
Language (usage and editing services)
Please write your text in good English (American or British usage is accepted,
but not a mixture of these). Authors who feel their English language manuscript
may require editing to eliminate possible grammatical or spelling errors and to
conform to correct scientific English may wish to use the English Language
Editing service available from Elsevier's WebShop
(http://webshop.elsevier.com/languageediting/) or visit our customer support site
(http://support.elsevier.com) for more information.
Submission
Our online submission system guides you stepwise through the process of entering your
article details and uploading your files. The system converts your article files to a single
PDF file used in the peer-review process. Editable files (e.g., Word, LaTeX) are
required to typeset your article for final publication. All correspondence, including
notification of the Editor's decision and requests for revision, is sent by e-mail.
Please sunmit your article via http://www.elsevier.com/locate/snb
Referees
Authors are required to submit the names, addresses and e-mail addresses of five
potential reviewers who could objectively review their manuscripts if asked to do so by
the journal editors. The editor retains the sole right to decide whether or not the
suggested reviewers are used. Please note that if no reviewer names are submitted,
publication of your manuscript may be delayed.
127
PREPARATION
Use of word processing software
It is important that the file be saved in the native format of the word processor used. The
text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as
possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the article.
In particular, do not use the word processor's options to justify text or to hyphenate
words. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc. When preparing
tables, if you are using a table grid, use only one grid for each individual table and not a
grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces, to align columns. The
electronic text should be prepared in a way very similar to that of conventional
manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier:
https://www.elsevier.com/guidepublication). Note that source files of figures, tables and
text graphics will be required whether or not you embed your figures in the text. See
also the section on Electronic artwork.
To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the 'spell-check' and
'grammar-check' functions of your word processor.
Article structure
Subdivision - numbered sections
Divide your article into clearly defined and numbered sections. Subsections should be
numbered
1.1 (then 1.1.1, 1.1.2, ...), 1.2, etc. (the abstract is not included in section numbering).
Use this numbering also for internal cross-referencing: do not just refer to 'the text'. Any
subsection may be given a brief heading. Each heading should appear on its own
separate line.
Introduction
128
State the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a
detailed literature survey or a summary of the results.
Material and methods
Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already published
should be indicated by a reference: only relevant modifications should be described.
Results
Results should be clear and concise.
Discussion
This should explore the significance of the results of the work, not repeat them. A
combined Results and Discussion section is often appropriate. Avoid extensive citations
and discussion of published literature.
Conclusions
The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section,
which may stand alone or form a subsection of a Discussion or Results and Discussion
section.
Appendices
If there is more than one appendix, they should be identified as A, B, etc. Formulae and
equations in appendices should be given separate numbering: Eq. (A.1), Eq. (A.2), etc.;
in a subsequent appendix, Eq. (B.1) and so on. Similarly for tables and figures: Table
A.1; Fig. A.1, etc.
Vitae
Include in the manuscript a short (maximum 100 words) biography of each author.
Essential title page information
129
• Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems.
Avoid abbreviations and formulae where possible.
• Author names and affiliations. Please clearly indicate the given name(s) and family
name(s) of each author and check that all names are accurately spelled. Present the
authors' affiliation addresses (where the actual work was done) below the names.
Indicate all affiliations with a lower- case superscript letter immediately after the
author's name and in front of the appropriate address. Provide the full postal address of
each affiliation, including the country name and, if available, the e-mail address of each
author.
• Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all stages of
refereeing and publication, also post-publication. Ensure that the e-mail address is given
and that contact details are kept up to date by the corresponding author.
• Present/permanent address. If an author has moved since the work described in the
article was done, or was visiting at the time, a 'Present address' (or 'Permanent address')
may be indicated as a footnote to that author's name. The address at which the author
actually did the work must be retained as the main, affiliation address. Superscript
Arabic numerals are used for such footnotes.
Abstract
A concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the purpose
of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is often
presented separately from the article, so it must be able to stand alone. For this reason,
References should be avoided, but if essential, then cite the author(s) and year(s). Also,
non-standard or uncommon abbreviations should be avoided, but if essential they must
be defined at their first mention in the abstract itself.
Highlights
Highlights are mandatory for this journal. They consist of a short collection of bullet
points that convey the core findings of the article and should be submitted in a separate
130
editable file in the online submission system. Please use 'Highlights' in the file name and
include 3 to 5 bullet points (maximum
85 characters, including spaces, per bullet point). See
https://www.elsevier.com/highlights for examples.
Keywords
Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using American
spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for
example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly
established in the field may be eligible. These keywords will be used for indexing
purposes.
Abbreviations
Define abbreviations that are not standard in this field in a footnote to be placed on the
first page of the article. Such abbreviations that are unavoidable in the abstract must be
defined at their first mention there, as well as in the footnote. Ensure consistency of
abbreviations throughout the article.
Acknowledgements
Collate acknowledgements in a separate section at the end of the article before the
references and do not, therefore, include them on the title page, as a footnote to the title
or otherwise. List here those individuals who provided help during the research (e.g.,
providing language help, writing assistance or proof reading the article, etc.).
Math formulae
Please submit math equations as editable text and not as images. Present simple
formulae in line with normal text where possible and use the solidus (/) instead of a
horizontal line for small fractional terms, e.g., X/Y. In principle, variables are to be
presented in italics. Powers of e are often more conveniently denoted by exp. Number
131
consecutively any equations that have to be displayed separately from the text (if
referred to explicitly in the text).
Footnotes
Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively throughout the article.
Many word processors can build footnotes into the text, and this feature may be used.
Otherwise, please indicate the position of footnotes in the text and list the footnotes
themselves separately at the end of the article. Do not include footnotes in the Reference
list.
Artwork Electronic artwork General points
• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.
• Embed the used fonts if the application provides that option.
• Aim to use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times New
Roman, Symbol, or use fonts that look similar.
• Number the illustrations according to their sequence in the text.
• Use a logical naming convention for your artwork files.
• Provide captions to illustrations separately.
• Size the illustrations close to the desired dimensions of the published version.
• Submit each illustration as a separate file.
A detailed guide on electronic artwork is available on our website:
https://www.elsevier.com/artworkinstructions.
You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given
here.
132
Formats
If your electronic artwork is created in a Microsoft Office application (Word,
PowerPoint, Excel) then please supply 'as is' in the native document format.
Regardless of the application used other than Microsoft Office, when your electronic
artwork is finalized, please 'Save as' or convert the images to one of the following
formats (note the resolution requirements for line drawings, halftones, and line/halftone
combinations given below):
EPS (or PDF): Vector drawings, embed all used fonts.
TIFF (or JPEG): Color or grayscale photographs (halftones), keep to a minimum of 300
dpi.
TIFF (or JPEG): Bitmapped (pure black & white pixels) line drawings, keep to a
minimum of 1000 dpi. TIFF (or JPEG): Combinations bitmapped line/half-tone (color
or grayscale), keep to a minimum of
500 dpi.
Please do not:
• Supply files that are optimized for screen use (e.g., GIF, BMP, PICT, WPG); these
typically have a low number of pixels and limited set of colors;
• Supply files that are too low in resolution;
• Submit graphics that are disproportionately large for the content.
Non-electronic artwork
Provide all illustrations as high-quality printouts, suitable for reproduction (which may
include reduction) without retouching. Number illustrations consecutively in the order
in which they are referred to in the text. They should accompany the manuscript, but
should not be included within the text. Clearly mark all illustrations on the back (or - in
133
case of line drawings - on the lower front side) with the figure number and the author's
name and, in cases of ambiguity, the correct orientation. Mark the appropriate position
of a figure in the article.
Color artwork
Please make sure that artwork files are in an acceptable format (TIFF (or JPEG), EPS
(or PDF), or MS Office files) and with the correct resolution. If, together with your
accepted article, you submit usable color figures then Elsevier will ensure, at no
additional charge, that these figures will appear in color online (e.g., ScienceDirect and
other sites) regardless of whether or not these illustrations are reproduced in color in the
printed version. For color reproduction in print, you will receive information regarding
the costs from Elsevier after receipt of your accepted article. Please indicate your
preference for color: in print or online only. For further information on the preparation
of electronic artwork, please see https://www.elsevier.com/artworkinstructions.
Figure captions
Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to
the figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a
description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum
but explain all symbols and abbreviations used.
Tables
Please submit tables as editable text and not as images. Tables can be placed either next
to the relevant text in the article, or on separate page(s) at the end. Number tables
consecutively in accordance with their appearance in the text and place any table notes
below the table body. Be sparing in the use of tables and ensure that the data presented
in them do not duplicate results described elsewhere in the article. Please avoid using
vertical rules.
References
Citation in text
134
Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list
(and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full. Unpublished
results and personal communications are not recommended in the reference list, but may
be mentioned in the text. If these references are included in the reference list they should
follow the standard reference style of the journal and should include a substitution of the
publication date with either 'Unpublished results' or
'Personal communication'. Citation of a reference as 'in press' implies that the item has
been accepted for publication.
Reference links
Increased discoverability of research and high quality peer review are ensured by online
links to the sources cited. In order to allow us to create links to abstracting and indexing
services, such as Scopus, CrossRef and PubMed, please ensure that data provided in the
references are correct. Please note that incorrect surnames, journal/book titles,
publication year and pagination may prevent link creation. When copying references,
please be careful as they may already contain errors. Use of the DOI is encouraged.
Web references
As a minimum, the full URL should be given and the date when the reference was last
accessed. Any further information, if known (DOI, author names, dates, reference to a
source publication, etc.), should also be given. Web references can be listed separately
(e.g., after the reference list) under a different heading if desired, or can be included in
the reference list.
References in a special issue
Please ensure that the words 'this issue' are added to any references in the list (and any
citations in the text) to other articles in the same Special Issue.
Reference management software
135
Most Elsevier journals have their reference template available in many
of the most popular reference management software products. These include
all products that support Citation Style Language styles (http://citationstyles.org), such
as Mendeley (http://www.mendeley.com/features/reference-manager) and Zotero
(https://www.zotero.org/), as well as EndNote (http://endnote.com/downloads/styles).
Using the word processor plug-ins from these products, authors only need to select the
appropriate journal template when preparing their article, after which citations and
bibliographies will be automatically formatted in the journal's style. If no template is yet
available for this journal, please follow the format of the sample references and citations
as shown in this Guide.
Users of Mendeley Desktop can easily install the reference style for this journal by
clicking the following link:
http://open.mendeley.com/use-citation-style/sensors-and-actuators-b-chemical
When preparing your manuscript, you will then be able to select this style using the
Mendeley plug- ins for Microsoft Word or LibreOffice.
Reference formatting
There are no strict requirements on reference formatting at submission. References can
be in any style or format as long as the style is consistent. Where applicable, author(s)
name(s), journal title/book title, chapter title/article title, year of publication, volume
number/book chapter and the pagination must be present. Use of DOI is highly
encouraged. The reference style used by the journal will be applied to the accepted
article by Elsevier at the proof stage. Note that missing data will be highlighted at proof
stage for the author to correct. If you do wish to format the references yourself they
should be arranged according to the following examples:
Reference style
Text: Indicate references by number(s) in square brackets in line with the text. The
actual authors can be referred to, but the reference number(s) must always be given.
136
Example: '..... as demonstrated [3,6]. Barnaby and Jones [8] obtained a different result
....'
List: Number the references (numbers in square brackets) in the list in the order in
which they appear in the text.
Examples:
Reference to a journal publication:
[1] J. van der Geer, J.A.J. Hanraads, R.A. Lupton, The art of writing a scientific article,
J. Sci. Commun.
163 (2010) 51–59. Reference to a book:
[2] W. Strunk Jr., E.B. White, The Elements of Style, fourth ed., Longman, New York,
2000. Reference to a chapter in an edited book:
[3] G.R. Mettam, L.B. Adams, How to prepare an electronic version of your article, in:
B.S. Jones, R.Z. Smith (Eds.), Introduction to the Electronic Age, E-Publishing Inc.,
New York, 2009, pp. 281–304. Reference to a website:
[4] Cancer Research UK, Cancer statistics reports for the UK.
http://www.cancerresearchuk.org/
aboutcancer/statistics/cancerstatsreport/, 2003 (accessed 13.03.03).
Journal abbreviations source
Journal names should be abbreviated according to the List of Title Word
Abbreviations:
http://www.issn.org/services/online-services/access-to-the-ltwa/.
AUTHOR INQUIRIES
You can track your submitted article at https://www.elsevier.com/track-submission. You
can track your accepted article at https://www.elsevier.com/trackarticle. You are also
welcome to contact Customer Support via http://support.elsevier.com.