esquistossomose aguda
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ALTERAÇÕES NAS CONCENTRAÇÕES DAS SRAT, CONTEÚDO
DE GSH E ATIVIDADE DA CAT EM PACIENTES COM
ESQUISTOSSOMOSE AGUDA
GINA MICHELLE MACÊDO DA CUNHA
Orientador(a): Profª Drª Ana Claudia Galvão Freire Gouveia
NATAL/ RN
2008
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ALTERAÇÕES NAS CONCENTRAÇÕES DAS SRAT, CONTEÚDO
DE GSH E ATIVIDADE DA CAT EM PACIENTES COM
ESQUISTOSSOMOSE AGUDA
GINA MICHELLE MACÊDO DA CUNHA
Orientador(a): Profª Drª Ana Claudia Galvão Freire Gouveia
NATAL/ RN
2008
Dissertação submetida ao programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da UFRN, como requisito para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, área de concentração Bioanálises e Medicamentos.
Catalogação da Publicação na Fonte
C972a Cunha, Gina Michelle Macêdo da. Alterações nas concentrações das SRAT, conteúdo de GSH e atividade da CAT em pacientes com esquistossomose aguda. – Natal, RN, 2008. 65 f.; Il
Orientador: Ana Claudia Galvão Freire
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
RN/UF CDU 616.995.122 (043.3)
Gina Michelle Macêdo da Cunha
ALTERAÇÕES NAS CONCENTRAÇÕES DAS SRAT, CONTEÚDO
DE GSH E ATIVIDADE DA CAT EM PACIENTES COM
ESQUISTOSSOMOSE AGUDA
Banca Examinadora:
_____________________________________________
Profª Drª Ana Claudia Galvão Freire
Orientadora
_____________________________________________
Profª Drª Francisca Inês de Sousa Freitas
Examinadora externa - UFPB
_____________________________________________
Profª Drª Maria das Graças Almeida
Examinadora interna - UFRN
Natal, 30 de janeiro de 2008
NATAL/ RN
2008
DEDICATÓRIA
A DEUS, que me guia em todos os caminhos da minha vida, aos meus pais, Ana e Hilton, pelo apoio, carinho e dedicação, aos meus irmãos Carolinne e Hilton Neto, pela compreensão, a meu namorado Miguel Adelino, pelo apoio, carinho, amor, compreensão, amizade e dedicação, a minha avó Dulce “in memoriam”, que sempre acreditou em mim e na minha capacidade e a minha Profª orientadora Ana Claudia pela confiança e amizade.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Ana Maria de Macêdo Cunha e Hilton Luiz da Cunha, que sempre me
apoiaram e acreditaram no meu crescimento profissional.
Ao meu namorado Miguel Adelino da Silva Filho, pelo amor, companheirismo, amizade,
confiança, compreensão, e incentivo na busca dos meus objetivos.
Aos meus irmãos, Carolinne Natalle Macêdo da Cunha e Hilton Fernandes da Cunha
Neto, pelo incentivo e apoio.
A minha avó Dulce Carlos da Cunha “in memoriam”, pelo incentivo, apoio e dedicação, e
por sempre ter acreditado em mim e em minha capacidade, e em sempre querer minha
felicidade.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pelo suporte dado durante
todo esse período.
A Aureliana e Edileide, funcionárias da Pós-graduação, pelo suporte dado aos alunos.
À Banca de Qualificação, composta pelos professores Drª Telma Maria Araújo Moura
Lemos e Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, pelas valiosas sugestões, tão
importantes para a melhoria da qualidade final desta dissertação de Mestrado.
A minha orientadora, Profª Drª Ana Claudia Galvão Freire, por acreditar que posso, pela
amizade, dedicação, pelo exemplo de sabedoria, garra e profissionalismo, amiga de todas as
horas em momentos de alegria e tristeza, incentivando sempre a realização de sonhos e a
superação dos obstáculos da vida.
Às alunas de iniciação cientifica, Vanessa Marques de Araújo Silva, Mariana Angélica
Oliveira Bitencourt e Karla Dillany Gomes Bessa, pela ajuda e dedicação na realização
dos experimentos, pela colaboração, amizade e apoio, sem elas não sei o que seria de mim e
deste trabalho. Além da colaboração de Julianne Bezerra Sathler, que com dedicação
participou do início da realização dos experimentos deste trabalho.
A todos os amigos do Laboratório Multidisciplinar (Labmult), em especial a Rand Randall
Martins, Ulisvaldo Brunno de Oliveira Macedo e Francisco Paulo Freire Neto, alunos
do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, pela ajuda e dedicação na
realização deste trabalho, pois eles foram de uma ajuda sem igual, sem eles, não sei o que
seria dos meus resultados.
A Profª Drª Maria das Graças Almeida, do Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas, pela colaboração, ao disponibilizar o Laboratório Multidisciplinar (Labmult)
para a realização dos meus experimentos, além do suporte técnico e científico dados
durante toda a minha parte experimental, sendo um exemplo de determinação na busca do
conhecimento.
A Profª Drª Telma Maria Araújo Moura Lemos, Chefe do Departamento de Análises
Clínicas e Toxicológicas da UFRN, pela contribuição indispensável, durante as análises
bioquímicas do perfil lipídico e da função hepática e renal, disponibilizando o Laboratório
Integrado de Análises Clínicas (LIAC) para o que fosse necessário.
A Profª Drª Tereza Maria Dantas de Medeiros, do Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas, pela colaboração, ao disponibilizar o Laboratório de Hematologia para a
dosagem da hemoglobina.
Às Farmacêuticas-bioquímicas e Funcionários do Laboratório Integrado de Análises
Clínicas (LIAC), pela importante contribuição nas análises bioquímicas e hematológicas
dos pacientes, bem como aos funcionários do DACT pelo apoio dado.
A Aureliana e Edileide, funcionárias da Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da
UFRN, pela disponibilidade em ajudar sempre que necessário.
Aos Laboratórios da Faculdade de Farmácia da UFRN: LABMULT, LIAC, Laboratório de
Parasitologia, Laboratório de Toxicologia, Laboratório de Bioquímica e Laboratório de
Hematologia.
Aos amigos da Vigilância Sanitária de Touros/ RN, em especial a Fausto, Sandra, Ionaldo
e Josafá, pelo apoio, amizade, colaboração e dedicação para a realização deste trabalho.
A Dr Lélio, da SUVISA/ SUVIGE-RN pela colaboração, apoio, sugestões, incentivo, e por
acreditar na importância deste trabalho.
Aos Pacientes do município de Touros/ RN (grupo teste) e aos Alunos do Curso de
Farmácia UFRN (grupo controle) em aceitarem colaborar com esta pesquisa, tornando
possível a realização deste trabalho, além da contribuição para a busca do conhecimento
científico.
A Maria da Luz da Silva Filha, técnica do Laboratório de Parasitologia Clínica da
Faculdade de Farmácia – UFRN, pela sua ajuda e dedicação em estar sempre presente, e
por apoiar na busca de material no laboratório.
A Profª Edna Marques de Araújo Silva, pela amizade, apoio, incentivo e dicas para a
realização deste trabalho.
A Doutoranda Cristiane Fernandes de Assis, pela sua colaboração na idealização do
projeto, participação na fase inicial dos experimentos, sugestões e incentivo para a
realização deste trabalho.
A João Bosco de Medeiros, Bibliotecário da Biblioteca Setorial do Centro de Ciências da
Saúde da UFRN, pela essencial colaboração na correção bibliográfica deste trabalho.
Ao Prof° Dr. Marcos Eugênio Cury de Medeiros, Estatístico, do Departamento de
Estatística da UFRN, pela definição do tamanho da amostra de estudo.
A FAPERN, em especial, pelo apoio financeiro fornecido, viabilizando assim, o trabalho de
campo, desde a coleta das amostras biológicas até a realização de atividades educativas, tão
necessárias ao município de Touros/RN.
Ao CNPq/PPPg, pela concessão da bolsa de estudo, tão importante no incentivo da
realização deste trabalho.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para realização deste trabalho, da mais
simples a mais complexa colaboração, agradeço com o coração repleto de alegria.
RESUMO
A esquistossomose é uma doença milenar causada pelo helminto Schistosoma mansoni e
constitui um problema de saúde pública no Brasil. A lesão granulomatosa, típica da doença,
está associada com o aumento do dano oxidativo através da geração de radicais livres. O
objetivo deste trabalho foi avaliar a ocorrência de alterações nos parâmetros oxidante/
antioxidante que fazem parte do sistema de defesa do organismo, e observar se os mesmos
provocariam estresse oxidativo em indivíduos com esquistossomose. Além disso,
correlacionando com alguns parâmetros bioquímicos e hematológicos. Foram selecionados
dois grupos de estudo, constituídos de indivíduos de ambos os sexos, com faixa etária
compreendida entre 16 e 30 anos. Um grupo controle, formado por indivíduos sem
esquistossomose (n=30) e um grupo teste, formado por indivíduos com esquistossomose
(n=30). A avaliação da peroxidação lipídica no plasma foi realizada por meio da
determinação do malondialdeído e a defesa antioxidante pela dosagem da glutationa
reduzida e determinação da atividade da catalase. Em relação aos parâmetros que avaliam o
estresse oxidativo, os resultados demonstraram uma diminuição do conteúdo de glutationa
reduzida e nenhuma alteração na atividade da catalase, com um aumento nos valores de
malondialdeído. Portanto, os dados encontrados sugerem a ocorrência do estresse oxidativo
nos indivíduos com esquistossomose. Dos parâmetros que avaliam a função hepática,
apenas os níveis de aspartato amino transferase mostraram-se elevados, enquanto ocorreu
uma diminuição da bilirrubina. Não houve uma alteração significativa no perfil lipídico
(p<0.5), entretanto com relação à função renal dos pacientes, houve uma diminuição da
creatinina. A avaliação hematológica, realizada através do hemograma completo e a
dosagem da hemoglobina, mostra eosinofilia nos indivíduos do grupo teste, que pode estar
relacionada com a presença do parasita. As alterações apresentadas sugerem a participação
do estresse oxidativo na fisiopatologia da referida doença.
Palavras-chave: esquistossomose, estresse oxidativo, SRAT/ malondialdeído, glutationa,
exames laboratoriais.
ABSTRACT
Schistosomiasis is an ancient disease caused by helminth Schistosoma mansoni and is a
public health problem in Brazil. The granulomatous lesion, typical of the disease, associates
itself with increase in the oxidative damage through the generation of free radicals. The aim
of this work was to evaluate the occurrence of changes in parameters oxidant / antioxidant
that are part of the human defense system, and observe whether they would cause oxidative
stress in subjects with schistosomiasis. Moreover, correlating with some biochemical and
hematological parameters. Two groups were selected for study, consisting of individuals of
both sexes, aged between 16 and 30 years. A control group, formed by individuals without
schistosomiasis (n = 30) and a test group, formed by individuals with schistosomiasis (n =
30). The evaluation of lipid peroxidation in plasma was performed by determination of
malondialdehyde and antioxidant defense by the quantification of reduced glutathione and
catalase activity. For the parameters that assess oxidative stress, the results showed a
decrease in the content of reduced glutathione and no change in the activity of catalase,
with an increase in the value of malondialdehyde. Therefore, the data found suggest the
occurrence of oxidative stress in subjects with schistosomiasis. Of the parameters that
assess hepatic function, only levels of aspartate aminotransferase have been high, while
there was a decrease of bilirubine. There was a significant change in the lipid profile (p
<0.5), however with regard to the renal function of patients, there was a decrease in
creatinine. The assessment hematological, made through hemogram and the quantification
of hemoglobin, shows increase of eosinophils individuals in the group test, which can be
related to the presence of the parasite. The amendments suggest the involvement of
oxidative stress in the pathophysiology of this disease.
Keywords: schistosomiasis, oxidative stress, SRAT/ malondialdehyde, glutathione,
laboratory analysis.
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADRO
FIGURA 1 - Distribuição geográfica da esquistossomose no mundo.................................17
FIGURA 2 - Gráfico da distribuição da esquistossomose mansônica no estado do Rio Grande do norte.....................................................................................................................19
FIGURA 3 - Ciclo de transmissão da esquistossomose.......................................................21
FIGURA 4 - Diagrama esquemático mostrando os mecanismos de produção de EROs e os sistemas de defesa antioxidante (adaptado do artigo GANDRA, ALVES, MACEDO, 2004).....................................................................................................................................27
FIGURA 5 - Estrutura química do Malondialdeído.............................................................28
FIGURA 6 - Estrutura química da Glutationa Reduzida.....................................................30
FIGURA 7 - Fluxograma esquemático de distribuição das amostras de sangue.................36
FIGURA 8 - Diagrama esquemático da técnica de Kato-Katz............................................44
FIGURA 9 - Concentração do conteúdo de GSH dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.......................................................................................................................................46
FIGURA 10 – Atividade da catalase dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.......................................................................................................................................47
FIGURA 11 – Concentração da molécula oxidante MDA (SRAT) dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.......................................................................................................................................48
FIGURA 12 – Perfil hepático do grupo com esquistossomose do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.......................................................................................................................................51
FIGURA 13 – Concentração das moléculas antioxidante/ oxidante correlacionado com o perfil hepático dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.....................................................................................52
FIGURA 14 – Perfil lipídico do grupo com esquistossomose do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.......................................................................................................................................53
FIGURA 15 – Correlação entre SRAT e o número de ovos por grama de fezes dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.......................................................................................................................................56
FIGURA 16 – Correlação entre o GSH e o número de ovos por grama de fezes dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.......................................................................................................................................57
TABELA 1 - Parâmetros bioquímicos dos pacientes avaliados do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.......................................................................................................................................49
TABELA 2 - Parâmetros hematológicos dos pacientes avaliados do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007.......................................................................................................................................55
QUADRO 1 - Classificação do Perfil Lipídico....................................................................40
LISTA DE ABREVIATURAS
ALT/ TGP - Alanina Amino Transferase
AST/ TGO – Aspartato Amino Transferase
CT – Colesterol Total
CAT – Catalase
CHCM – Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média
Creat - Creatinina
BD – Bilirrubina Direta
BI – Bilirrubina Indireta
BT – Bilirrubina Total
DTNB – Ácido 5,5 ditio-bis (2-nitrobenzóico)
EROs – Espécies Reativas de Oxigênio
Fe - Ferro
GGT – Gama-Glutamil-Transferase
GSH - Glutationa Reduzida
GR - Glutationa Redutase
GPx – Glutationa Peroxidase
GSSG – Glutationa Oxidada
Hb – Hemoglobina
HCM – Hemoglobina Corpuscular Média
HDL – Lipoproteína de Alta Densidade
H2O2 – Peróxido de Oxigênio
IL – Interleucina
LCAT - Lecitina Colesterol Aciltransferase
LDL – Lipoproteína de Baixa Densidade
LIAC – Laboratório Integrado de Análises Clínicas
LPO - Peróxidos de Lipídeo
MDA – Malondialdeído
NADPH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídio Fosfato
O2 - Oxigênio
PCE – Programa de Controle da Esquistossomose
RLO – Radicais Livres de Oxigênio
SOD - Superóxido-dismutase
SRAT – Substâncias Reativas do Ácido Tiobarbitúrico
TBA – Ácido Tiobarbitúrico
TCA – Ácido Tricloroacético
TG – Triglicerídeo
Th 1 – Linfócito T Helper 1
Th 2 – Linfócito T Helper 2
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α
UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Ur – Uréia
VCM – Volume Corpuscular Médio
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 16
1.1. Esquistossomose ................................................................................. 16
1.1.1. Ciclo biológico e transmissão da esquistossomose ...................... 20
1.1.2. Fisiopatologia ............................................................................... 21
1.1.3. Complicações clínicas ou hepáticas ............................................. 24
1.2. Estresse Oxidativo .............................................................................. 25
1.2.1. Mecanismos antioxidantes ........................................................... 26
1.2.2. Alguns parâmetros usados como marcadores do estresse
oxidativo..................................................................................................28
1.2.2.1 Malondialdeído (MDA) ........................................................... 28
1.2.2.2. Catalase (CAT) ....................................................................... 29
1.2.2.3. Glutationa reduzida (GSH)......................................................29
1.3. Estresse oxidativo x esquistossomose.................................................30
1.4. Avaliação laboratorial..........................................................................31
2. OBJETIVOS ........................................................................................... 33
3. METODOLOGIA ................................................................................... 34
3.1. Comitê de Ética em Pesquisa............................................................. 34
3.2 População de Estudo ........................................................................... 34
3.2.1. Grupo Controle.............................................................................34
3.2.2. Indivíduos com a doença..............................................................35
3.3. Procedimentos ...................................................................................35
3.3.1. Coleta do Material Biológico........................................................35
3.3.2. Análises Laboratoriais..................................................................36
3.3.2.1. Avaliação da peroxidação lipídica..........................................36
3.3.2.1.1. Determinação das SRAT..................................................36
3.3.2.2. Avaliação dos parâmetros antioxidantes................................37
3.3.2.2.1. Determinação da Glutationa Reduzida.............................37
3.3.2.2.2. Determinação da atividade da Catalase...............................38
3.3.2.3. Avaliação dos Parâmetros Bioquímicos................................,39
3.3.2.3.1. Determinação da Glicose Sanguínea................................39
3.3.2.3.2. Determinação do Perfil Lipídico......................................39
3.3.2.3.3. Determinação da Função Hepática...................................40
3.3.2.3.4. Determinação da Função Renal........................................41
3.3.2.3.5. Entrega de resultados dos parâmetros bioquímicos..........41
3.3.2.4. Avaliação dos Parâmetros Hematológicos...............................41
3.3.2.4.1. Determinação do Hemograma Completo...........................41
3.3.2.4.2. Determinação da Hemoglobina no Eritrócito.....................41
3.3.2.4.3. Entrega de resultados dos parâmetros hematológic.s.........42
3.3.2.5. Avaliação da Carga Parasitária.................................................43
3.3.3. Análises Estatísticas.......................................................................44
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................... 45
5. CONCLUSÕES ....................................................................................... 58
6. PERSPECTIVAS .................................................................................... 59
REFERÊNCIAS ........................................................................................ 60
ANEXOS ..................................................................................................... 66
APÊNDICES................................................................................................70
INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
1.1. ESQUISTOSSOMOSE
A esquistossomose é uma doença milenar, pois ovos de Schistosoma foram
encontrados em múmias datando de 3.500 a.C. sendo que somente em 1851 foi descoberta
por Theodore Bilhartz ao encontrar o trematódeo nas veias mesentéricas de um camponês
egípcio durante autópsia, espécie hoje denominada como Schistosoma haematobium
(COURA; AMARAL, 2004).
Em 1908, Pirajá da Silva, médico baiano, descreveu a presença do verme e dos ovos
no Brasil a partir de inúmeras autópsias e exames parasitológicos de fezes. A denominação
da espécie encontrada foi classificada em 1907 por Sambon como Schistosoma mansoni
(ANDRADE, 2002).
Em 1915, Lepier identificou os gêneros de caramujos Bulinus e Biomphalaria, na
África, como hospedeiro intermediário do S. haematobium e S. mansoni, respectivamente
(COURA; AMARAL, 2004).
Acredita-se que a introdução da esquistossomose no Brasil ocorreu através do tráfico de
escravos, originário da Costa Ocidental da África, que ingressaram no país pelos portos
de Recife e Salvador como mão-de-obra na cana de açúcar. Daí por diante, houve uma
rápida expansão da doença para outros estados, formando a extensa área de transição
que vai do Rio Grande do Norte a Minas Gerais (BARRETO, 1984, AMARAL;
PORTO, 1994, AMARAL; COURA, 2004).
A esquistossomose, denominada também de esquistossomíase ou bilharziose, é uma
doença causada por um verme (helminto) do gênero Schistosoma, que tem como
hospedeiros intermediários “caramujos de água doce” e que pode evoluir desde formas
assintomáticas até formas clínicas extremamente graves. É conhecida popularmente
como xistossomose, xistose, doença dos caramujos ou ainda, “barriga d’água”
(AMARAL; PORTO, 1994).
Essa doença constitui um problema de saúde pública no Brasil, em particular na Região
Nordeste em virtude dos movimentos migratórios e pela própria condição de vida da
população, acrescida de fatores ambientais específicos, como os relacionados com as
condições gerais do ambiente e do meio aquático onde vivem os moluscos
transmissores, sendo estes, o calor e a temperatura, que influenciam desde a ecdise do
miracídio até a eliminação da cercária, tais fatores favorecem o desenvolvimento da
endemia (LIMA; TIMBÓ, 1999).
É classificada como uma das grandes doenças endêmicas do Brasil e admite-se existirem
mais de seis milhões de indivíduos infectados, sendo considerada a terceira causa de
óbito no âmbito rural (AMARAL; PORTO, 1994, LIMA; TIMBÓ, 1999). Essa
parasitose tem sua origem nas Bacias dos Rios Nilo, na África e na Ásia (PASSOS,
1998).
No mundo, afeta mais que 200 milhões de indivíduos distribuídos em 76 países na
África, Ásia e América. Dentre estes, 20 milhões já apresentam a forma hepatoesplênica da
doença (forma mais grave) e cerca de 100 milhões de pessoas apresentam algumas
manifestações clínicas. Conforme estimativa datada de 1984, um total de 600 milhões de
indivíduos está sob condições de risco em 74 países e territórios distribuídos nos vários
continentes, com exceção da Oceania (Figura 1). Acredita-se que existam no Brasil no
mínimo 2,5 a 10 milhões de portadores de esquistossomose mansônica e cerca de 25
milhões de indivíduos expostos aos riscos de contraí-la (LESCANO et al., 2004, RIBEIRO
et al., 2004). No nordeste do Brasil encontra-se uma alta endemicidade com cerca de 6 a 8
milhões de indivíduos com essa parasitose sobretudo no estados de Pernambuco e Alagoas,
onde a esquistossomose destaca-se como a terceira causa de morte entre as doenças
classificadas como grandes endemias rurais brasileiras (SILVA et al., 2002).
Figura 1: Distribuição geográfica da esquistossomose no mundo.
Fonte: http://www.cdfound.to.it/img/sm2.gif
Sabe-se, atualmente, que a esquistossomose é provocada por seis espécies de
Schistosoma, mas somente o S. mansoni encontrou condições para adaptação nas
Américas, sendo a única espécie encontrada no Brasil (BARRETO, 1984, AMARAL;
PORTO, 1994, AMARAL; COURA, 2004).
Para que os elos da cadeia epidemiológica da esquistossomose se unam e ocorra
transmissão é necessário que o meio ambiente seja propício e que o homem contribua
decisivamente. No Brasil, essas condições são atendidas e por isso a doença é tão
disseminada (AMARAL; PORTO, 1994).
A precariedade da qualidade de vida dos trabalhadores das regiões interioranas se
expressa, entre outras características, pela ausência de moradias adequadas, saneamento
básico deficiente, baixa escolaridade e escasso lazer. Nesse sentido, os rios constituem uma
das poucas opções de lazer e representam um subsídio para o desenvolvimento de muitas
outras atividades como pescar, lavar roupas, utensílios domésticos e, até mesmo, dar banho
em animais (CARVALHO et al., 1998).
Portanto, a manutenção da esquistossomose numa comunidade dependerá de
influências ecológicas diversas, atuando em diferentes ambientes onde se processam as
fases larvárias e adultas do parasita. Acrescenta-se a isso as influências de origem humana
não apenas no terreno biológico, mas também no sócio-econômico (LIMA; TIMBÓ, 1999).
A extensão da esquistossomose no Rio Grande do Norte abrange áreas focalizadas,
distribuídas em 35 dos 166 municípios situados no litoral Leste, correspondendo a uma área
de 9.625 km2 (Figura 2). As espécies de caramujos encontradas no Estado são a
Biomphalaria glabrata e a Biomphalaria straminea, sendo a B. glabrata a mais importante
na transmissão de esquistossomose (Brasil, 1998).
Figura 2: Gráfico da distribuição da esquistossomose mansônica no estado do Rio Grande do norte
Fonte: SES/SUVAM
Os primeiros relatos da esquistossomose no Rio Grande do Norte aconteceram em
1918 e só em 1949 é que foi realizado o primeiro inquérito coproscópico. Em 1975, já de
forma sistematizada, o inquérito teve início na cidade de Touros e em 1976, começaram as
atividades de coproscopia, tratamento e malacologia em 1525 localidades (Brasil, 1998).
O Programa de Controle da Esquistossomose (PCE) atua de forma sistematizada
desde 1996, implementando medidas de controle preconizadas pelo Ministério da Saúde.
ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA
Desde então, as medidas de intervenção ativa desenvolvidas pela Fundação Nacional de
Saúde, estão restritas a 15 dos 36 municípios (Brasil, 1998).
No estado do Rio Grande do Norte, Touros é um dos 15 municípios que participam
do Programa de Controle da Esquistossomose (PCE). A população deste município é de
27.879 habitantes, sendo 7.594 habitantes residentes na região urbana e 20.285 na região
rural. Algumas atividades de controle da doença foram realizadas no ano de 2006, através
da realização de exames coproscópicos em 5.480 pessoas, residentes em 5 localidades do
município. Foram detectados 524 casos positivos da doença, um índice equivalente a
10,79% de pessoas infectadas nesta região. Em seguida, foi realizado o tratamento dos
indivíduos doentes, entretanto as atividades de malacologia não foram realizadas no
município de Touros, em 2006 (RIO GRANDE DO NORTE, 2006).
1.1.1. CICLO BIOLÓGICO E TRANSMISSÃO DA ESQUISTOSSOMOSE
A relação parasito/ hospedeiro, no decorrer do processo evolutivo, passou a
favorecer o S. mansoni, de forma que o homem, hospedeiro definitivo deste helminto,
forneça abrigo e nutrientes aos vermes adultos e ainda atue como fonte disseminadora dos
seus ovos para o meio ambiente através das fezes. Na ocasião em que o homem contamina
o meio com seus dejetos, ao contato com coleções de água doce, o miracídio eclodirá do
ovo e na presença do hospedeiro intermediário, o caramujo do gênero Biomphalaria,
penetrará nas partes moles do planorbídeo, se desenvolvendo a esporocistos que darão
origem as cercárias. Estas penetram ativamente na pele e mucosas do homem, emergem dos
caramujos para infectar águas e, por conseguinte, o homem que se utiliza desta. Uma vez na
corrente sanguínea, as cercárias se transformam em esquistossômulos, que atingem o fígado
e o sistema porta e passam a se alimentar de sangue. Ao alcançarem a forma adulta, ocorre
o acasalamento e posterior migração do casal para as vênulas da veia mesentérica inferior e
para o plexo hemorroidário inferior, iniciando a postura dos ovos que passarão para a luz
intestinal e serão expulsos junto com as fezes (AMARAL; PORTO, 1994).
Quanto à transmissão, sabe-se que o homem doente elimina ovos do Schistosoma
mansoni através das fezes que, em contato com a água doce liberam os miracídios (larvas).
Esses penetram nos caramujos, onde passam por transformações, originando as cercárias
que são introduzidas no organismo humano através da pele de pessoas que estejam
exercendo atividades como lazer, pesca e lavagem de roupa, em rios ou lagoas, dentre
outras atividades. Em seguida, atingem a corrente sanguínea, coração e fígado, onde ocorre
o acasalamento e depois migram para as veias do intestino, onde a fêmea inicia a postura
dos ovos (PASSOS, 1998).
A instalação da infecção parasitária está na dependência de fatores intrínsecos do
hospedeiro, representados em parte pela resistência natural, assim como de fatores inerentes
ao próprio parasito, constituídos entre outros, por mecanismos protetores específicos às
reações do hospedeiro desenvolvidos por este parasito (ATTA et al., 1981).
Figura 3: Ciclo de transmissão da esquistossomose
Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Schistosoma
1.1.2. FISIOPATOLOGIA
A reação inflamatória, na esquistossomose, pode ser causada por cercárias,
esquistossômulos, vermes mortos e fibrose em torno dos ovos de Schistosoma mansoni
depositados nos tecidos do hospedeiro, porém, a lesão fundamental é a reação
granulomatosa induzida pelos ovos e encontrada principalmente no intestino e no fígado,
que são órgãos vitais, podendo alterar processos metabólicos e afetar as condições físicas
do hospedeiro. A esquistossomose na forma hepatoesplênica pode vir associada a varizes
hemorrágicas no esôfago e hiperesplenismo, podendo a evolução clínica desses pacientes
apresentar-se comprometida por carga parasitária residual ou reinfecção (SILVA et al.,
2002a, RAMOS et al., 2004).
A doença está relacionada à intensidade da infecção: indivíduos expostos a altas
cargas de vermes estão mais propensos a desenvolver a doença e são responsáveis pela
maior contaminação do ambiente com ovos e, assim, com a manutenção da endemicidade.
Os ovos produzidos por vermes adultos presentes no plexo mesentérico e a migração das
larvas são as principais causas da doença em humanos. O embrião vivo, dentro do ovo,
secreta material antigênico continuamente por duas a quatro semanas, induzindo a
sensibilização do hospedeiro e recruta células inflamatórias, formando o granuloma
esquistossomótico. A secreção antigênica cessa apenas quando o embrião, dentro do ovo,
morre (MOTTA; SILVA, 2002).
A patogenia da esquistossomose mansônica depende de uma série de fatores: a
linhagem do parasito, a idade, o estado nutricional e a imunidade do hospedeiro e,
principalmente, a carga parasitária, ou seja, a quantidade de parasitos que infectou o
paciente.
Na fase inicial da doença, o paciente pode apresentar dermatite cercariana,
provocada pela penetração das cercárias. Na forma aguda, os sintomas podem ser
caracterizados por urticária e edema localizados, diarréia mucosa ou muco-sanguinolenta,
febre elevada, anorexia, náusea, vômito, hepatoesplenomegalia dolorosa, manifestações
pulmonares e astenia, perda de peso, tosse, além de complicações como pleurite e
pericardite (MOTTA; SILVA, 2002, KATZ; ALMEIDA, 2003). Essas manifestações
clínicas são decorrentes da presença de TNF-α, IL-1 e IL-6, e também da deposição de
complexos imunes. A melhora da sintomatologia coincide com a produção de IL-10
induzida pelos antígenos de ovos na fase crônica (MACHADO et al., 2004).
A fase aguda tem duração de, aproximadamente, dois meses e desaparece através do
tratamento especifico ou evolui (se não tratada) para a fase crônica, que tem dois estágios
principais: forma intestinal ou hepatointestinal e, a mais grave, forma hepatoesplênica,
representada pelo crescimento e endurecimento do fígado e do baço. Nesta fase, muitos
pacientes permanecem assintomáticos, embora os sintomas possam aparecer em qualquer
época. Um dos mais comuns é a diarréia periódica, às vezes com muco, sangue e tenesmo,
alternando com constipação intestinal (MOTTA; SILVA, 2002, KATZ; ALMEIDA, 2003).
É importante observar que na forma hepatoesplênica da esquistossomose, sem
outras patologias hepáticas associadas, existe apenas um mínimo comprometimento
funcional hepático. Entretanto, devido à hipertensão portal, a hemorragia digestiva alta
decorrente de ruptura das varizes esofagogástricas constitui-se na mais séria complicação e
representa a causa usual de óbitos nesta fase (MACHADO et al., 2002). Nessa fase também
ocorre secreção de IL-4, IL-5 e IL-13, que entre outras funções, induzem a produção de IgE
pelas células B e ativação de eosinófilos, mastócitos e basófilos respectivamente. Tais
citocinas também participam da formação do granuloma e da fibrose hepática, e, portanto,
da patogênese da esquistossomose. A IL-4 estimula a produção de IgE e, juntamente com a
IL-13, a de mastócitos, resultando em aumento da secreção de mediadores da inflamação,
secreção de muco e aumento de contratilidade da musculatura intestinal, facilitando a
expulsão de vermes adultos. Na fase aguda, as manifestações clínicas, são decorrentes da
presença de TNF-α, IL-1 e IL-6 e também da deposição de complexos imunes. A melhora
da sintomatologia coincide com a produção de IL-10 (MACHADO et al., 2004).
Estudos recentes mostram a importância de citocinas na resposta imune humana à
infecção esquistossomótica, e têm especulado sobre evidências de uma dicotomia Th1/Th2,
tanto em modelos experimentais, como no homem. Dentre as citocinas envolvidas na
regulação de respostas Th1 e Th2 na esquistossomose humana, estudos têm demonstrado
que a IL-4 e a IL-10, citocinas reguladoras com atividade inibidora, podem inibir a secreção
de várias outras citocinas, desempenhando um papel importante não somente na regulação
da resposta de células T, mas também como moduladoras da resposta inflamatória aguda
induzida por infecção, inibindo a secreção de IL-1, IL-6 e TNF-α e promovendo a
diminuição da atividade de macrófagos (VALENÇA, 2000).
Acredita-se que as reinfecções pelo Schistosoma mansoni representam um fator
adicional de importância no desenvolvimento da forma hepatoesplênica da doença. A base
desta hipótese deriva da observação de que os indivíduos infectados que migram para fora
da área endêmica não mais desenvolvem a forma hepatoesplênica. Já os que apresentam
esta forma da doença têm melhor prognóstico quando fora da área endêmica e quando
tratados, ou quando a transmissão é interrompida, tendo mais chances de regressão do que
os que permanecem em áreas de transmissão ativa (SANTOS; SOUZA; ANDRADE,
2000).
A quantidade de ovos é útil para avaliar a intensidade da infecção e deve ser
verificada também a viabilidade dos ovos – vivos imaturos (postura com menos de seis
dias), vivos maduros (postura em seis a dezoito dias) e mortos (MOTTA; SILVA, 2002).
1.1.3. COMPLICAÇÕES CLÍNICAS OU HEPÁTICAS
O fígado é o maior órgão visceral do corpo, pesando aproximadamente 1,3 kg no
adulto. Localiza-se abaixo do diafragma e ocupa a maior parte do hipocôndrio direito
(PORTH, 2004).
O tecido hepático é constituído por formações diminutas que recebem o nome de
lobos, compostos por colunas de células hepáticas ou hepatócitos, rodeadas por canais
diminutos (canalículos), pelos quais passa a bile, secretada pelos hepatócitos. Estes
canais se unem para formar o ducto hepático que, junto com o ducto procedente da
vesícula biliar, forma o ducto comum da bile, que descarrega seu conteúdo no duodeno
(VILELA, 2002, PORTH, 2004).
Em indivíduos infectados pelo Schistosoma mansoni, as alterações hepáticas típicas
surgem a partir do início da oviposição e formação de granulomas. A princípio, o fígado
apresenta-se aumentado de volume e bastante doloroso à palpação. Com o efeito
cumulativo das lesões granulomatosas em torno dos ovos, as alterações hepáticas se
tornarão mais severas (MELO, A. L.; COELHO, P. M. Z., 2002).
Já está bem estabelecido que as lesões hepáticas observadas na esquistossomose
mansônica humana, após o octogésimo dia de infecção, variam enormemente de acordo
com a relação hospedeiro-parasita, além dos efeitos que os próprios vermes e/ou ovos vivos
ou mortos, são capazes de induzir, química, mecânica e imunologicamente, no hospedeiro.
Na forma mais comum da esquistossomose hepatoesplênica, conhecida como forma de
Symmers, as lesões fundamentais do fígado são quase exclusivas dos ramos da veia porta,
da rede periductal e do conjuntivo que a circunda (RODRIGUES et al., 1983).
Estudos das dimensões hepáticas na forma hepatoesplênica da esquistossomose
mostram que o fígado tem peso maior que 1,5 Kg em mais de 50%. Patologicamente,
observa-se também, a assimetria dos lobos hepáticos, com aumento do lobo esquerdo e
redução do lobo direito, demonstrados em 81% dos casos (MACHADO et al., 2002). Os
hepatócitos, as células de Kupffer e os sinusóides, em geral, não são atingidos pelo
processo. No entanto, sofrem suas conseqüências de modo secundário (RODRIGUES et al.,
1983). Do ponto de vista histológico, encontramos os granulomas epitelóides envolvendo
os ovos que são depositados nos ramos da veia porta (MACHADO et al., 2002). Ovos
vivos ou mortos podem penetrar nos pequenos ramos da rede periductal, ocluindo muitos
deles e desencadeando a formação de granulomas intravasculares, com a conseqüente
interrupção do fluxo portal a esse nível e alteração da circulação intralobular. Todo esse
processo é sempre acompanhado de uma inflamação crônica granulomatosa. Os vermes
carregados pela corrente embolizam e ocluem ramos de maior calibre e, quando mortos,
produzem lesões, algumas vezes extensas, inicialmente necróticas, depois inflamatórias e
por fim cicatriciais. Devido à trombose portal e ao distúrbio da circulação, os hepatócitos
dos lóbulos circundantes podem entrar em atrofia (RODRIGUES et al., 1983).
Ao se estudar alterações do sistema bilífero intra-hepático nas doenças do fígado,
observou-se que fígados esquistossomóticos apresentavam árvore biliar desarmônica, com
ductos distorcidos e irregularidades em seus contornos, exibindo freqüentemente estenoses
focais curtas e impressões micronodulares. Observou-se ainda nítido paralelismo entre
alterações dos sistemas portal e bilífero (AMARAL et al., 2002). Com o evoluir da doença,
a fibrose periportal progride, acentua-se o obstáculo pré-sinusoidal ao fluxo venoso portal,
contribuindo para o desenvolvimento da hipertenção portal (MACHADO et al., 2002).
1.2. ESTRESSE OXIDATIVO
Define-se como estresse oxidativo uma situação de desequilíbrio entre agentes
oxidantes e antioxidantes em favor dos primeiros. Os dados indicam que o estresse
oxidativo parece ser causado tanto por um aumento da produção de radicais livres como por
uma diminuição nos sistemas de defesa antioxidantes. Este aumento modifica os meios
intra e extracelulares, causando danos às biomoléculas de DNA, lipídios, carboidratos e
proteínas, além de outros componentes celulares, e, portanto também, alteração e prejuízo
das funções vitais, em diversos tecidos e órgãos, tais como músculo, fígado, tecido
vascular, tecido adiposo, e tecido cerebral. Porém, esse efeito do estresse oxidativo varia
em cada indivíduo, dependendo da idade, do estado nutricional e do estado fisiológico
(GATÉ et al., 1999, ALLEN; TRESINI, 2000).
Os radicais livres lesam a célula de modo direto ou danificam as proteínas e os
ácidos nucléicos, tornando-os mais susceptíveis à degradação. Além do seu efeito
citotóxico, atuam como mensageiros das vias de sinalização intracelular das células
inflamatórias. As defesas antioxidantes protegem os tecidos e líquidos corpóreos da lesão
causada pelos oxidantes produzidos pelo metabolismo normal ou pela resposta à
inflamação e as doenças. É oportuno ressaltar que as defesas antioxidantes não conferem
proteção completa contra os radicais livres produzidos pelo organismo durante processos
inflamatórios mais importantes. O equilíbrio entre os radicais livres e as defesas
antioxidantes tende ligeiramente em favor das espécies reativas, de modo que os
antioxidantes possam cumprir suas funções biológicas (KOURY; DONANGELO, 2003).
Em sistemas aeróbicos, é essencial o equilíbrio entre agentes óxido-redutores (como
as Espécies Reativas de Oxigênio - EROs) e o sistema de defesa antioxidante. Esses
agentes são gerados endogenamente como conseqüência direta do metabolismo do O2 e
também em situações não fisiológicas, como a exposição da célula a xenobióticos que
provocam a redução incompleta de O2 ( FERREIRA et al., 1997).
1.2.1. MECANISMOS ANTIOXIDANTES
Por definição, uma substância antioxidante é aquela capaz de inibir a oxidação ou,
então, qualquer substância que, mesmo presente em baixa concentração, comparada ao seu
substrato oxidável, diminui ou inibe a oxidação daquele substrato. Do ponto de vista
biológico, podemos definir antioxidantes como sendo aqueles compostos que protegem os
sistemas biológicos contra os efeitos deletérios dos processos ou das reações que levam a
oxidação de macromoléculas ou estruturas celulares (JORDÃO et al., 1998).
A rede resultante do ataque inespecífico dos radicais livres e agentes oxidantes
ocasiona a perda da integridade celular, função de enzimas e estabilidade do genoma.
Portanto, vários mecanismos antioxidantes estão envolvidos na neutralização destes agentes
deletérios (HENSLEY et al., 2000, MIRANDA et al., 2004). Alguns estudos têm
focalizado sistemas antioxidantes que servem como uma tática de defesa contra radicais
livres gerados pelo hospedeiro. Em condições fisiológicas existem vários mecanismos de
defesa contra a ação dos oxidantes, tais como as enzimas superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), moléculas
contendo tióis, como glutationa reduzida (GSH) e tioredoxina, além de vitaminas (GATÉ et
al., 1999, ANDRADE JÚNIOR et al., 2005). Enzimas antioxidantes são fundamentais no
processo de resposta celular contra espécies reativas de oxigênio (CAMPOS et al., 1995).
Para proteger-se, a célula possui um sistema de defesa que pode atuar em duas
linhas. Uma delas atua como detoxificadora do agente antes que ele cause lesão. Esta linha
é constituída por GSH, SOD, CAT, GPx e vitamina E. A outra linha de defesa tem a função
de reparar a lesão ocorrida, sendo constituída pelo ácido ascórbico, pela GR e pela GPx),
entre outros. Com exceção da vitamina E (α-tocoferol), que é um antioxidante estrutural da
membrana, a maior parte dos agentes antioxidantes está no meio intracelular. Existem
várias evidências da atividade protetora dos componentes do sistema antioxidante. As
lesões de reperfusão pós-isquemia de coração, rim, fígado e intestino são prevenidas por
SOD, CAT ou allopurinol, sendo este último um bloqueador da produção de O2-., pela via
da xantina-oxidase ( FERREIRA et al., 1997).
Em algumas doenças parasitárias, como a malária, níveis circulantes de alfa-
tocoferol, retinol e de vários carotenóides mostraram estar mais baixos nos pacientes do que
em indivíduos saudáveis. Entretanto, a relação entre infecção parasitária e níveis de
carotenóides depende de múltiplos fatores, em particular o parasita envolvido e o estado
imune dos pacientes. Desta forma, o papel de antioxidantes no desenvolvimento de doenças
e o interesse clínico potencial tem sido avaliar com cautela cada doença individual
(EBOUMBOU, et al., 2005).
Na figura 4, tem-se uma ilustração dos mecanismos de produção de EROs e dos
sistemas de defesa antioxidante.
Figura 4 – Diagrama esquemático mostrando os mecanismos de produção de EROs e os sistemas de defesa antioxidante (adaptado de GANDRA; ALVES; MACEDO, 2004).
1.2.2. ALGUNS PARÂMETROS USADOS COMO MARCADORES DO ESTRESSE
OXIDATIVO
1.2.2.1. MALONDIALDEÍDO (MDA)
O MDA é um dialdeído formado como um produto secundário durante a oxidação
de ácidos graxos poliinsaturados, principalmente o Ácido Araquidônico, sendo, portanto a
molécula que mais reage com o Ácido Tiobarbitúrico (TBA), sendo assim encontrada em
O2 O2- H2O2 H2O
SOD
H2O + O2
e- GSH GSSG
NADPH NADP+
- OHONOO -
Ataque oxidativo
Estruturas celulares
ABPM estrategicamente posicionados
Dano oxidativo ou nitrosativo
Produtos excretáveis não tóxicos
Fe2+
Fe3+NO
Arg
GPx
GPr
Reação de FentonReação não enzimática
Oxido Nitricosintetase
Redução monoeletrônica
CAT
maiores concentrações (RIO; STEWART; PELLEGRINI, 2005). O MDA é facilmente
detectado no plasma sanguíneo e é utilizado como medida da peroxidação lipídica e do
estresse oxidativo (NAVAB et al., 1996). O MDA produzido pela LPO é particularmente
útil para o monitoramento clinico de pacientes sofrendo de hepatite crônica viral, uma vez
que a sua concentração no plasma esta correlacionada com a severidade de doenças. Em
relação à infecção por S. mansoni, EROs são produzidas próximas aos ovos depositados no
fígado e permitem a destruição dos ovos. Entretanto, EROs têm efeitos colaterais
indesejáveis, uma vez que a homeostase redox do fígado é alterada com uma diminuição
nas defesas antioxidantes dos órgãos. No homem, a infecção por o S. mansoni está
associada a níveis aumentados de SRAT e de EROs circulantes (EBOUMBOU, et al.,
2005).
Sobre a estrutura química do MDA, este é um dialdeído de três carbonos, com
grupos carbonil no C-1 e na posição C-3. Existem teorias diferentes sobre os mecanismos
possíveis da formação de MDA, através dos hidroperoxidos sob a forma de ácidos graxos
polinsaturados, com três duplas ligações (triene) ou mais, associado com os fosfolipídeos
(FERNÁNDEZ-LÓPEZ, FERNÁNDEZ; PÉREZ-ÁLVAREZ, 1997).
Figura 5: Estrutura química do Malondialdeido.
1.2.2.2. CATALASE (CAT)
A catalase (CAT) é uma hemoproteína citoplasmática que catalisa a decomposição
do peróxido de hidrogênio (H2O2) a H2O e O2. Esta reação é importante, pois o H2O2 é
nocivo à célula devido a sua capacidade de atacar as cadeias de ácidos graxos insaturados
O
H
HO
presentes nas membranas, além de outras macromoléculas, como as proteínas (BENTHER,
1975).
Essa enzima está presente em animais, plantas, bactérias e fungos. Nos animais e
plantas pode ser encontrada nos peroxissomas e nos procariotos a sua localização é
citoplasmática. Em animais, pode ser encontrada no sangue, medula óssea, mucosas, rins e
fígado e sua atividade é dependente de NADPH. A suplementação de catalase exógena
previne a oxidação da GSH mediada pelo H2O2 em eritrócitos humanos normais, e também
inibe as lesões oxidativas do DNA do timo submetido à sobrecarga de Fe+++ (FERREIRA
et. al., 1997).
1.2.2.3. GLUTATIONA REDUZIDA (GSH)
A glutationa, um tripeptídeo (D-L-glutamil-L-cisteinil-glicina), existe no organismo
em suas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), atuando direta ou indiretamente em
muitos processos biológicos importantes, incluindo a síntese de proteínas, manutenção da
atividade celular, detoxificação de xenobióticos, metabolismo e proteção celular atuando
contra radicais livres (MEISTER, 1991). Esta molécula está presente na maioria das
células, sendo o tiol (-SH) mais abundante no meio intracelular. Sua capacidade redutora é
determinada pelo grupamento -SH, presente na cisteína (FERREIRA et al.,1997).
A glutationa é o mais abundante antioxidante intracelular, presente em todas as
células metabolicamente ativas. Este antioxidante apresenta importante papel na síntese de
proteínas, transporte de aminoácidos, síntese de DNA e RNA, balanço do estado redox,
controle da permeabilidade de íons na membrana plasmática e detoxificação de
xenobióticos pela reação de conjugação catalisada pela glutationa-S-transferase (CHOIN et
al., 1997). Além disso, o GSH pode detoxificar aldeídos reativos (como o malondialdeído)
que são gerados durante a peroxidação lipídica. Se, de fato, grande parte da reação do GSH
é obtida pela indução de suas enzimas, é necessária a manutenção do nível de GSH para
suportar a ação funcional das mesmas (JORDÃO et al., 1998).
Em particular, problemas na sua síntese e metabolismo estão associados a algumas
doenças, nas quais os níveis de glutationa e das enzimas que atuam no seu metabolismo
podem ser bastante significativos no diagnóstico de alguns tipos de câncer, bem como em
outras doenças relacionadas ao estresse oxidativo (HENSLEY et al., 2000).
Figura 6: Estrutura química da Glutationa Reduzida.
A glutationa redutase é uma enzima que não age diretamente na remoção de
espécies radicalares. Porém, é responsável pela regeneração da glutationa a sua forma
reduzida (GSH), na presença de Nicotinamida Adenina Dinucleotídio Fosfato (NADPH),
tendo como objetivo impedir a paralisação do ciclo metabólico da glutationa. Devido a isto
a glutationa em sua forma reduzida tem importância fisiológica na manutenção do
metabolismo antioxidante (ROVER, 2001). Em situações de estresse oxidativo muito
intenso, o GSH pode ser perdido de modo irreversível, permanecendo na forma oxidada e
não sendo novamente reduzido (JORDÃO et al., 1998).
1.3. ESTRESSE OXIDATIVO X ESQUISTOSSOMOSE
O estudo atual está focalizado nos parâmetros sanguíneos associados com o estresse
oxidativo crônico, como espécies reativas de oxigênio tendo papel central na
fisiopatologia da esquistossomose. Enzimas antioxidantes são fundamentais no processo
de resposta celular contra espécies reativas de oxigênio (CAMPOS et al., 1995). Nos
indivíduos infectados por Schistosoma mansoni, os radicais livres de oxigênio (RLO) são
produzidos de imediato com a proximidade dos ovos depositados e lideram a destruição
destes ovos (EBOUMBOU et al., 2005). Como a produção destas substâncias ocorre a
O
NN
HO OH
O
O
OSH
NH2
H
H
nível hepático, pacientes com esquistossomose podem apresentar alterações nos níveis
destas enzimas antioxidantes e moléculas, uma vez que esta patologia afeta
principalmente o fígado.
O metabolismo aeróbico do fígado implica em uma redução basal de EROs que,
em condições normais, são consumidas em proporção similar por mecanismos
antioxidantes. O fenômeno do estresse oxidativo constitui um desequilíbrio entre estes
processos em favor dos pró-oxidantes, condição que pode desencadear uma série de
eventos fisiopatológicos no fígado. As EROs podem danificar de forma direta, alterando
biomoléculas essenciais, com a conseqüente perda de sua função biológica e viabilidade
celular, e bem indiretamente, por ativação das células de Kupffer e outras células
parenquimatosas, de fatores de transcrição redox-sensíveis, que garantem a síntese de
mediadores proinflamatórios, citotóxicos e fibrinogênicos (LOZA et al., 2003).
1.4. AVALIAÇÃO LABORATORIAL
Estudos recentes, tanto em humanos, quanto experimentalmente em roedores,
revelam a existência de alterações no metabolismo lipídico associadas à forma
hepatoesplênica da esquistossomose mansônica, causando diminuição nos níveis de
colesterol total, fosfolipídios, da lipoproteína de alta densidade (HDL) e do triglicerídeo
plasmático, além da redução nos níveis da fração esterificada do colesterol. Pode-se dizer
que o decréscimo na fração esterificada do colesterol está relacionado à diminuição na
atividade de enzimas de origem hepática como a lecitina colesterol aciltransferase (LCAT)
plasmática. Esta enzima é sintetizada pelos hepatócitos e secretada na circulação,
catalisando a esterificação do colesterol na superfície da lipoproteína de alta densidade
(HDL) plasmática, promovendo o efluxo de colesterol dos tecidos periféricos (SILVA et
al., 2002a, SILVA et al., 2002b, RAMOS et al., 2004).
As alterações hepáticas constituem uma das mais importantes manifestações da
esquistossomose e alguns autores encontraram elevação da Gama Glutamil Transferase
(GGT) em pacientes com a forma hepatoesplênica da doença. Essa é uma glicoproteína
ligada à membrana celular responsável por catalisar a reação de grupos glutamil, entre eles
a glutationa, com qualquer dos inúmeros aminoácidos, possibilitando sua captação e
transporte. Também é responsável pela degradação da glutationa, podendo torná-la
disponível como fonte de cisteína para síntese protéica, sobretudo de albumina
(OLIVEIRA, 2000).
A biliverdina e a bilirrubina possuem propriedades pró e antioxidantes, além de
propriedades tóxicas in vitro e in vivo. O aumento da biliverdina é detectado em indivíduos
com necrose hepática e pode ampliar a atividade de certos oncogenes do fígado,
ocasionando câncer. No entanto, em condições normais, a atividade antioxidante da
bilirrubina suplanta sua atividade pró-oxidante. A atividade antioxidante da bilirrubina
ocorre principalmente quando se encontra ligada à albumina sérica, sendo esse complexo
considerado um dos antioxidantes naturais dos fluidos extracelulares (BARREIROS, 2006).
Quanto aos parâmetros hematológicos, o quadro leucocitário periférico tem sido
amplamente estudado na esquistossomose mansônica humana, sendo freqüente a eosinofilia
em pacientes esquistossomóticos (ATTA et al., 1981). Os eosinófilos têm a capacidade de
destruir os esquistossômulos através do mecanismo de citotoxicidade celular depende do
anticorpo (MACHADO et al., 2004).
�
OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL:
Avaliar as alterações nas concentrações das SRAT, conteúdo de GSH e atividade da
CAT no sangue de pacientes com esquistossomose aguda.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
- Avaliar o nível de peroxidação lipídica através da determinação do malondialdeído
plasmático e o consumo da glutationa reduzida em pessoas livres da esquistossomose
(grupo controle) e comparar com os valores obtidos em indivíduos portadores da doença;
- Avaliar a atividade da catalase nos indivíduos doentes comparando com
indivíduos não portadores de esquistossomose;
- Fazer a determinação dos parâmetros hematológicos (hemograma completo) e
bioquímicos (funções hepática e renal e perfil lipídico), correlacionando-os aos marcadores
de estresse oxidativo avaliados;
- Determinar da carga parasitária em amostras de fezes e fazer uma correlação com
os marcadores de estresse oxidativo avaliados;
�
METODOLOGIA
3. METODOLOGIA
3.1. COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
O presente projeto foi submetido à apreciação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
UFRN, protocolo de número 070/06-CEP-UFRN, sendo este aprovado pelo referido
Comitê (ANEXO 1).
3.2. POPULAÇÃO DE ESTUDADA
O estudo caracterizado como caso-controle foi realizado com indivíduos adultos, de
ambos os sexos, faixa etária compreendida entre 16 e 30 anos, portadores de
esquistossomose (fase aguda) e indivíduos livres da doença (indivíduos sadios).
A primeira parte desse trabalho foi selecionar o grupo controle. Para isso, foram
estabelecidos alguns critérios de inclusão, como indivíduos aparentemente saudáveis, não
fumantes, com nenhuma doença de base (hipertensão e diabetes mellitus), gravidez, que
não fazem uso de medicamentos e sem histórico da esquistossomose. Para selecionar os
indivíduos portadores de esquistossomose que participaram da pesquisa, foi aplicado um
questionário para avaliar alguns parâmetros, tais como uso de fumo, bebidas alcoólicas,
presença de outra doença de base (hipertensão e diabetes mellitus), uso de medicamento e
gravidez os quais foram adotados como critérios de exclusão, bem como condições sociais
e econômicas da população do município de Touros-RN e o grau de esclarecimento dos
indivíduos sobre a doença (APÊNDICE 1).
3.2.1. GRUPO CONTROLE
Neste projeto, foram avaliados alguns parâmetros de estresse oxidativo em 30
(trinta) indivíduos adultos não portadores da doença, de ambos os sexos, alunos da
Faculdade de Farmácia da UFRN. A amostra utilizada foi o sangue obtido por punção
venosa. Além disso, foram feitas também análises de alguns parâmetros bioquímicos e o
hemograma completo.
3.2.2. INDIVÍDUOS COM A DOENÇA
Foi feita uma amostragem por conveniência pelas dificuldades de encontrar
pacientes não tratados e com isso não foi possível determinar o universo de pacientes com a
doença. Dessa maneira, foram selecionados 30 (trinta) indivíduos adultos, de ambos os
sexos, portadores de Esquistossomose, residentes no Município de Touros-RN. Estes
indivíduos foram submetidos à coleta de sangue por punção venosa e foram avaliados os
marcadores de estresse oxidativo propostos, além de alguns parâmetros bioquímicos e
hematológicos.
3.3. PROCEDIMENTOS
3.3.1. COLETA DO MATERIAL BIOLÓGICO
Foram colhidos 20 mL de amostras de sangue de ambos os grupos, no período de
abril de 2006 a fevereiro de 2007. A coleta foi realizada com material descartável, pela
manhã, após um período de 12 horas de jejum, conforme recomendações para a avaliação
da atividade da catalase, quantificação dos níveis séricos de MDA, GSH, exames
bioquímicos e hematológicos. Em seguida, as amostras foram distribuídas em tubos com
anticoagulante (EDTA 5% para MDA, CAT e hemograma e Heparina Sódica para GSH e
hemoglobina) ou sem (dosagens bioquímicas), e submetidas a procedimentos específicos
para cada análise, como mostrado na Figura 7. Todas as informações sobre a natureza deste
estudo, seus riscos e benefícios foram previamente transmitidas aos pacientes, para a
aquisição do termo de consentimento (APÊNDICE 2).
Figura 7: Fluxograma esquemático de distribuição das amostras de sangue.
3.3.2. ANÁLISES LABORATORIAIS
As análises do GSH, CAT e MDA, foram realizadas no Laboratório Multidisciplinar
LabMult, da Faculdade de Farmácia da UFRN. As análises Bioquímicas foram
desenvolvidas no Laboratório Integrado de Análises Clínicas (LIAC), o Hemograma no
Laboratório de Bioquímica Clínica e a Hemoglobina no Laboratório de Hematologia, todos
da Faculdade de Farmácia e pertencentes ao Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas / UFRN, de acordo com o POP e normas especificados pelo fabricante.
3.3.2.1. AVALIAÇÃO DA PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA
3.3.2.1.1. Determinação das SRAT
A técnica utilizada para determinar a concentração do MDA determinada
colorimetricamente o produto de reação entre o TBA e o malondialdeído produzido durante
a quebra da reação entre lipídios peroxidados (DAHLE; HILL; HOLMAN, 1962, YAGI,
1982).
Para a realização desta técnica foram colhidos 5 mL de sangue total (com
anticoagulante EDTA 5%), centrifugado por 5 min. a 3000 rpm (1348 g), a 4°C. Após a
centrifugação, 300 μL do plasma foi colocado em um tubo de eppendorff e acrescentado
600 μL de TCA 30%. O mesmo foi agitado por 1 min. e, então, acrescentado 600 μL TBA
0,73%, sendo novamente agitado por mais 1 minuto. A amostra foi aquecida em banho-
maria a 100°C durante 1 hora, em seguida centrifugado por 10 min. a 825 g, a 4°C. Logo
após, o sobrenadante foi separado em tubo de ensaio para a leitura em absorbância de 535
nm (Shimadzu – UV mod. 1650 PC, Shimadzu Inc., Tokio/ Japão)
Para a realização do branco, foi feito o mesmo procedimento utilizado para a
amostra, mas sem a utilização de 300 μL plasma, e sim de 300 μL de água destilada.
O cálculo para a determinação da atividade do malondialdeído foi:
[SRAT] μmol/L = Absorbância em 535 nm x Diluição
ε
Onde:
- Diluição = 5
- ε = coeficiente de extinção molar (ou coeficiente de absorção molar) = 0,156 em 535 nm.
3.3.2.2. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ANTIOXIDANTES
3.3.2.2.1. Determinação da Glutationa Reduzida
A glutationa tem como princípio reagir com o DTNB, formando um tiolato (TNB)
de cor amarelada, mensurável a absorbância de 412 nm (BEUTLER, 1963).
Para realizar a determinação da glutationa reduzida coletou-se 5 mL de sangue total
(colhidos com o anticoagulante heparina sódica), deste pipetou-se 200 μL em 800 μL de
TCA 12%, e o mesmo foi centrifugado por 5 min., a 1348 g, a 4ºC. Foi colocado, então,
100 μL do sobrenadante em 1,9 mL de solução Tampão Fosfato / NaCl (PM = 58,5,
140mM, pH = 7,4), sendo o mesmo agregado a 200 μL de DTNB, para posterior leitura a
412 nm. Em seguida, o branco foi preparado sem o sangue, centrifugado e submetido às
mesmas condições da amostra para posterior leitura a 412 nm (Shimadzu – UV mod. 1650
PC, Shimadzu Inc, Tokio/ Japão).
O cálculo para a determinação da atividade da Glutationa reduzida foi:
Mmol GSH-1 (mM) = A412 x Diluições
14,1
Onde:
- A412 = Absorbância a 412 nm.
- Diluições = 20 (1,9mL/ 0,1 mL cubeta)
- 14,1 = é o coeficiente de extinção molar (pH 8,0; pH 7,9 = 13,6) do ânion tiolato.
3.3.2.2.2. Determinação da atividade da Catalase - CAT (E.C. 1.11.1.6)
A técnica quantifica a velocidade de decomposição do peróxido de hidrogênio
(H2O2) a oxigênio (O2) e água (H2O) pela enzima catalase através do decréscimo de
absorbância a 230 nm (ε = 0,071 mM-1. cm-1) a 37ºC (BEUTLER, 1984).
Para realizar a determinação da catalase houve a necessidade de se preparar um
hemolisado do sangue. Assim, coletou-se aproximadamente 5 mL de sangue total (colhidos
com o anticoagulante EDTA 5%), sendo o mesmo centrifugado a 936 g por 10 min para
separar o plasma das hemácias. O plasma foi usado para medir as SRAT. Após a separação
do plasma os eritrócitos foram lavados com solução Tampão Fosfato/ NaCl (PM = 58,5,
140mM, pH = 7,4) e centrifugado a 1348 g por 10 min., a 4°C. Depois, transferiu-se 200μL
do precipitado para um tubo contendo 1,8 mL de solução de β-mercaptoetanol. O tubo foi
levado ao freezer por aproximadamente 20 min., sendo esse procedimento realizado 3
vezes. Em seguida, o tubo foi centrifugado por 40 min. a 11050 g, a 4 °C e o sobrenadante
obtido foi utilizado para a determinação da atividade da catalase.
Para isso, colocou-se 0,10 μL do sobrenadante em 1,99mL de Solução de β-
mercaptoetanol, e 20 μL desta solução foram transferidos para a cubeta de leitura, em um
meio de reação contendo Tris 1M / EDTA (5 mM, pH 8,0), e Peróxido de hidrogênio a 50%
(H2O2 10 mM).
Para a preparação do branco, preparou-se um pool do sobrenadante das amostras e
destes 20 μL foram colocados na cubeta de leitura, em um meio de reação contendo Tris
1M / EDTA (5 mM, pH 8,0).
As amostras foram lidas no SHIMADZU (Shimadzu – UV mod. 1650 PC,
Shimadzu –Inc., Tokio/ Japão) em absorbância 230nm.
O cálculo para a determinação da atividade da catalase foi:
CAT (U/mg de Hb) = �A230 x Diluições 39,5 x TE x Hb
- �A412 = Variação da absorbância a 230 nm por minuto.
- Diluição = 2,4 x 106
- 39,5 = é o coeficiente de extinção molar
- TE = tomado de ensaio
- Hb = hemoglobina em g/dL
3.3.2.3. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
3.3.2.3.1. Determinação da Glicose Sanguínea
A determinação da concentração da glicose sanguínea foi determinada por método
enzimático colorimétrico, utilizando-se kits de reagentes da Labtest® Glicose PAP. As
leituras foram realizadas em Analisador Bioquímico RA – 50 Bayer®, Dublin-Irlanda,
sendo considerado como valor de referência da glicemia normal o intervalo entre 70 a 99
mg/dL, de acordo com o kit utilizado.
3.3.2.3.2. Determinação do Perfil Lipídico
A determinação das concentrações plasmáticas do Colesterol Total (CT), da
Lipoproteína de alta densidade (HDL) e do Triglicerídeo (TG), foram realizadas por
método enzimático colorimétrico, utilizando-se reagentes da Labtest®. Para a determinação
da Lipoproteína de baixa densidade (LDL), se utiliza a fórmula: LDL = CT – HDL +
(TG/5), quando o triglicerídeo for < 400mg/dl. As leituras foram realizadas em Analisador
Bioquímico RA – 50 Bayer®, Dublin-Irlanda, cujos valores de referência estão citados no
Quadro 1.
Quadro 1: Classificação do Perfil Lipídico.
PARÂMETROS VALOR DE REFERÊNCIA (mg/dl)
CATEGORIA
Colesterol Total < 200 200-239 ≥ 240
Ótimo Limítrofe
Alto HDL < 40
> 60 Baixo Alto
Triglicerídeos < 150 150 – 199 200 – 499 ≥ 500
Ótimo Limítrofe
Alto Muito Alto
LDL < 100 100 – 129 130 – 159 160 – 189 ≥ 190
Ótimo Desejável Limítrofe
Alto Muito Alto
Fonte: NCEP III, 2001.
3.3.2.3.3. Determinação da Função Hepática
A determinação das concentrações séricas da Aspartato Amino Transferase (AST),
da Alanina Amino Transferase (ALT), e da Gama-Glutamil-Transferase (GGT), foram
realizadas utilizando kits Labtest®. As leituras foram realizadas em Analisador Bioquímico
RA – 50 Bayer®, Dublin-Irlanda. As concentrações sanguíneas de ALT e AST foram
avaliadas por método cinético UV-IFCC, tendo como valores de referência considerados
normais de 10 a 37 U/L em mulheres, e de 11 a 39 U/L em homens para a ALT e de 13 a 49
U/L em mulheres e de 14 a 50 U/L em homens para a AST. Já a concentração de GGT foi
determinada pelo método Szasz modificado com valores de referência considerados
normais que são de 5 a 27 U/L para mulheres e de 7 a 45 U/L para homens, de acordo com
o kit utilizado.
3.3.2.3.4. Determinação da Função Renal
A função renal foi avaliada pela concentração de uréia e de creatinina, ambas
utilizando kits de reagentes Labtest®, sendo a uréia avaliada por método colorimétrico e a
creatinina por método cinético. As leituras foram realizadas no aparelho Analisador
Bioquímico RA – 50 Bayer®, Dublin-Irlanda. Os valores de referência considerados
normais são de 15 a 40 mg/dl para a uréia e de 0,4 a 1,3 mg/dl para a creatinina.
3.3.2.3.5. Entrega de resultados dos parâmetros bioquímicos
Todos os resultados dos parâmetros bioquímicos foram entregues aos indivíduos em
forma de formulários padronizados no setor que se realizou os exames (ANEXO 2).
3.3.2.4. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS
3.3.2.4.1. Determinação do Hemograma Completo
Para a realização do hemograma completo, foram colhidos 4 mL de sangue com
EDTA 5% (anticoagulante) e o mesmo foi lido por equipamento automatizado ABX 60
DIAGNOSTICS (ABX, LTDA., Montpellier, França). Assim, foram obtidos os resultados
da série eritrocitária, da série leucocitária, e das plaquetas. A contagem diferencial das
células sanguíneas foi feita em microscópio ótico, onde se obteve a contagem global das
células sanguíneas.
3.3.2.4.2. Determinação da Hemoglobina no Eritrócito
A hemoglobina no eritrócito foi determinada com a finalidade de utilizar a mesma
nos cálculos da Catalase (CAT), podendo também correlacioná-la com os resultados
obtidos. Foram utilizados nesta análise a solução de Drabkin (reagente de cor) e o padrão
de hemoglobina Labtest®. As leituras foram realizadas no Espectrofotômetro COLEMAN-
395-UV - Brasil. Nesse método, os compostos de hemoglobina, com exceção da
sulfahemoglobina, são rapidamente convertidos a cianometahemoglobina, sob a ação do
cianeto e ferrocianeto de potássio (VAN KAMPEN; ZIJLSTRA, 1961).
Para a determinação da concentração de hemoglobina, foram colhidos 4 mL de
sangue com heparina sódica (anticoagulante) e retirados 20μL para a reação com 5mL da
solução de Drabkin. Após 10 minutos, à temperatura ambiente, a leitura foi realizada em
um comprimento de onda de 540nm, contra um branco reativo. O cálculo final da
concentração de hemoglobina foi realizado utilizando-se um fator de calibração, obtido
através da curva padrão de hemoglobina comercial (Labtest®). A concentração de
hemoglobina foi expressa em mg/mL.
O cálculo para a determinação do valor da hemoglobina é:
Hb = Fc x Abs(AM)
Onde:
- Hb = a concentração da hemoglobina no eritrócito
- Fc = Fator de calibração
- Abs(AM) = Absorbância da amostra medida no espectrofotômetro pelo comprimento de
onda de 540nm.
O cálculo para o fator de calibração é:
Fc = [ ] padrão Abs padrão
3.3.2.4.3. Entrega de resultados dos parâmetros hematológicos
Todos os resultados dos parâmetros hematológicos foram entregues aos indivíduos em
forma de formulários padronizados no setor que se realizou os exames (ANEXO 3).
3.3.2.5. AVALIAÇÃO DA CARGA PARASITÁRIA
A avaliação da carga parasitária foi feita pelo método de Kato-katz. Esse é um
método direto, qualitativo e quantitativo, que tem como finalidade permitir a visualização e
contagem de ovos por grama de fezes presente no individuo parasitado com o Schistosoma
mansoni fornecendo um indicador seguro para se avaliar a intensidade da infecção e a
eficácia do tratamento. Para isso, utiliza-se uma solução diafanizadora (DIAFIX), fixadora e
clarificante. Essa técnica consiste em uma simplificação do método de Kato, introduzida
por Katz e col. Sobre uma pequena amostra de fezes colocada sobre papel absorvente
deposita-se uma tela de nylon que comprimida com auxílio da espátula fará com que parte
das fezes passe através de suas malhas. Estas são recolhidas com a espátula e comprimidas
no orifício de uma placa perfurada, que já deverá estar sobre uma lâmina, até que este se
encontre cheio. Retirar o excesso de fezes com a lateral da espátula. Levantar a placa
perfurada, inclinando, inicialmente, uma das extremidades e retirá-la de modo a permanecer
sobre a lâmina de vidro um cilindro de amostra fecal. Sobre este cilindro é colocada uma
lâmina de celofane, previamente embebida em solução de DIAFIX. A lâmina é em seguida
invertida sobre uma superfície lisa e pressionada de modo a espalhar uniformemente o
material entre lâmina e lamínula evitando o extravasamento das fezes. Aguarda-se 30
minutos para a clarificação do esfregaço fecal e examina-se ao microscópio. A referida
técnica está ilustrada na Figura 8. A lâmina assim preparada conserva-se por cerca de um
ano, sendo utilizada para identificação de ovos de helmintos como o Schistosoma mansoni
(CHAVES et al., 1979).
Figura 8: Diagrama esquemático da técnica de Kato-Katz.
3.3.3. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Na avaliação estatística dos resultados foi empregado teste t não pareado, para
amostras paramétricas e independentes (parâmetros bioquímicos e avaliação do estresse
oxidativo). O grau de significância adotado foi de p < 0,05. Os dados foram tabulados
através do programa Microsoft Excel (Microsoft Corporations Inc., 2002); para análise
Amostra
Tela de nylon
Suporte
Clarificação
Leitura
estatística, Graphpad Instat 3.01 (Graphpad Software Inc., 2004) e geração dos gráficos
através do programa Prism 4 for Windows (Graphpad Software Inc., 2004).
RESULTADOS E
DISCUSSÃO
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A GSH pode ser considerada um dos agentes mais importantes do sistema de defesa
antioxidante da célula, protegendo-a contra a lesão resultante da exposição a agentes
oxidantes. Concentrações baixas de GSH têm sido reportadas em algumas doenças e estão
associadas à maior risco de estresse oxidativo e da ocorrência de infecções oportunistas.
Esse decréscimo do GSH pode refletir o aumento na produção de antioxidantes num grau
que excederia a capacidade de detoxificação do GSH (JORDÃO JÚNIOR et al., 1998).
A Figura 9 mostra o conteúdo da molécula antioxidante (GSH) entre os grupos
estudados. Observamos nesta figura que houve diferença estatística significante entre os
grupos, que mostra uma diminuição da GSH nos indivíduos com esquistossomose (grupo
teste) (110,00 ± 26,46 vs. 55,91 ± 36,47 μmol/L), de aproximadamente 50%. Uma das
funções da GSH é prevenir efeitos deletérios da oxidação, inibindo o início da
lipoperoxidação, seqüestrando radicais livres, destruindo os mesmos (FERREIRA;
MATSUBARA, 1997, RODRIGUES et al., 2003).
Um excesso de agentes oxidantes e deficiência de GSH sugerem uma condição de
estresse oxidativo. Sendo, portanto, a depleção da GSH um forte indicativo de
estabelecimento de estresse oxidativo, já que esta é consumida no combate a níveis
elevados de radicais peróxidos pelo sistema glutationa peroxidase (FERREIRA;
MATSUBARA, 1997, GANDRA; ALVES; MACEDO, 2004).
* Teste t de Student, p < 0,05.
LEGENDA: Controle: indivíduos sem esquistossomose; Teste: indivíduos com esquistossomose.
Figura 9 - Concentração do conteúdo de GSH dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Os resultados são expressos em média ± DP (p < 0,05).
CONTROLE TESTE0
30
60
90
120
150
*
GS
H (
μmol
/L)
Quanto a Figura 10, que mostra a atividade da enzima catalase, observa-se que não
houve diferença estatística significante entre os grupos estudados (2389,674 ± 915,9039 vs.
2398,259 ± 915,7844 U/mg de Hb). Isso pode ter ocorrido, provavelmente, devido à catalase
só ser ativada ou liberada quando há um excesso na concentração de H2O2, pois em
quantidades menores, a glutationa peroxidase supre o papel de transformar o peróxido de
hidrogênio em água. Isto significa dizer que, na maioria das vezes, a presença da catalase é
importante para proteger o organismo, em casos acentuados de estresse oxidativo
(URBINA et al., 2004, ANDRADE JÚNIOR et al., 2005).
Gharib (1999) e Abdallahi (1999) mostraram que portadores de esquistossomose na
fase crônica, tiveram uma diminuição da atividade da catalase, não tendo ocorrido o mesmo
no presente estudo, provavelmente por estes indivíduos estarem na fase aguda da doença.
* Teste t de Student, p < 0,05.
LEGENDA: Controle: indivíduos sem esquistossomose; Teste: indivíduos com esquistossomose.
Figura 10 - Atividade da catalase dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Os resultados são expressos em média ± DP (p < 0,05).
CONTROLE TESTE0
100
200
300
CA
T U
/mg
de
Hb
A Figura 11 mostra a concentração da molécula oxidante MDA (SRAT) entre os
grupos estudados. Os resultados revelaram um aumento de SRAT no grupo de indivíduos
doentes, em relação ao grupo controle (4,72 ± 0,59 vs. 5,73 ± 0,91 nmol/mL). O aumento
observado no presente trabalho está de acordo com os resultados descritos por FACUNDO
et al., 2004, DEL RIO; STEWART; PELLEGRINI, 2005, EBOUMBOU et al., 2005, onde
mostram uma associação entre o Schistosoma mansoni e níveis elevados de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRAT) e espécies reativas de oxigênio (EROs).
* Teste t de Student, p < 0,05.
LEGENDA: Controle: indivíduos sem esquistossomose; Teste: indivíduos com esquistossomose.
Figura 11 – Concentração da molécula oxidante MDA (SRAT) dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Os resultados são expressos em média ± DP (p < 0,05).
CONTROLE TESTE0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
*
SR
AT
(n
mo
l/m
L)
O perfil bioquímico entre os grupos estudados está apresentado na Tabela 1, onde se
pode observar que os valores de AST encontram-se estatisticamente elevados no grupo
teste, em comparação ao grupo controle (22,11 ± 6,70 vs. 30,76 ± 9,55 U/L). O mesmo não
ocorrendo com a bilirrubina total (1,06 ± 0,36 vs. 0,82 ± 0,29 mg/dL) e indireta (0,64 ±
0,23 vs. 0,48 ± 0,23 mg/dL) e a creatinina (0,91 ± 0,34 vs. 0,69 ± 0,17 mg/dL), uma vez
que esses parâmetros encontram-se diminuídos quando comparados ao grupo controle.
A doença cursa com um processo inflamatório crônico, que pode levar a lesões em
locais distantes. A diminuição da creatinina pode ter ocorrido devido a antígenos
parasitários e complexos antígeno-anticorpo, que tendem a se depositar em certos órgãos.
Esses imunocomplexos são capazes de desencadear reações inflamatórias, e nos rins se
depositam no glomérulo, levando ao aparecimento de lesões (REY, 2001).
O fato de não terem ocorrido alterações nos outros parâmetros bioquímicos desses
indivíduos pode ser justificado por estarem os mesmos na fase aguda da doença. Além
disso, não existe uma relação entre uma elevada carga parasitária e alterações bioquímicas
(AMARAL et al., 2002).
Tabela 1 – Parâmetros bioquímicos dos pacientes avaliados do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Os resultados são expressos em média ± DP (p < 0,05).
Analitos CONTROLE TESTE
Média ± Média ± AST (U/L) 22,11 6,70 30,76 * 9,55 ALT (U/L) 20,18 14,99 26,06 16,10 Glicose (mg/dL) 75,90 7,38 72,42 10,99 Colesterol (mg/dL) 173,97 32,19 176,79 58,86 HDL (mg/dL) 41,45 8,10 37,38 10,53 LDL (mg/dL) 112,72 28,71 113,25 47,46 Triglicérides (mg/dL) 99,24 82,21 88,58 62,99 Uréia (mg/dL) 24,41 7,33 25,14 6,34 Creatinina (mg/dL) 0,91 0,34 0,69 * 0,17 GGT (U/L) 22,58 16,26 25,68 14,44 Bilirrubina total (mg/dL) 1,06 0,36 0,82 * 0,29 Bilirrubina direta (mg/dL) 0,41 0,20 0,35 0,25 Bilirrubina indireta (mg/dL) 0,64 0,23 0,48 * 0,23
* Teste t de Student, p < 0,05
LEGENDA: AST (Aspartato Amino Transferase), ALT (Alanina Amino Transferase), HDL (Lipoproteína de alta densidade), LDL (Lippoproteína de baixa densidade), GGT (Gama-Glutamil Transferase). Valores de referência: AST e ALT de 10-37 U/L para mulher e de 11-39 U/L para homem, Colesterol total, inferior a 200 mg/dL, HDL ≥ 60 mg/dL, LDL < 100 mg/dL, Triglicerídeos < 150 mg/dL, Uréia 15 a 40 mg/dL, Creatinina 0,4 a 1,3 mg/dL, GGT de 7-45 U/L, BilirrubinaTotal até 1,2 mg/dL, Bilirrubina Direta até 0,4 mg/dL.
Em relação ao perfil hepático, mostrado na Figura 12, pode-se observar que o grupo
de pacientes com esquistossomose apresentou valores aumentados de AST (30,76 ± 9,55
U/L) em relação ao grupo controle (22,11 ± 6,70 U/L). Tal fato não foi observado ao
analisar a ALT (26,06 ± 16,10 vs. 20,18 ± 14,99 U/L) e a GGT (22,58 ± 16,26 vs. 25,68 ±
14,44 U/L).
Sugere-se que o aumento da AST está relacionado com a presença de um possível
dano hepático provocado pelo parasita nos indivíduos com a doença, mostrando que o
fígado desses indivíduos pode está comprometido (ALVES JÚNIOR et al., 2003).
AMARAL et al., em 2002, relataram que a GGT pode estar aumentada em
indivíduos que estejam na forma hepatoesplênica da doença. Entretanto, são necessários
novos estudos para entender o mecanismo responsável pelo aumento de GGT nessa forma
clínica da doença. No presente trabalho, esse aumento não foi observado, uma vez que
todos os indivíduos estão na fase aguda da doença segundo diagnóstico clínico obtido na
localidade. Isso mostra que os resultados encontrados estão de acordo com a literatura.
Além disso, no trabalho acima citado, sugere-se que a ALT pode estar aumentada devido à
quantidade de ovos depositados pelo parasita, não tendo correlação com o aumento da
GGT.
Nos indivíduos portadores da doença, observa-se uma depleção nos níveis de
bilirrubina total e indireta quando comparado ao grupo controle. Isto poderia ter relação
com o papel antioxidante desta molécula, pois a possível condição de estresse oxidativo
causada pela esquistossomose levaria a um maior consumo da bilirrubina ao tentar
combater os radicais livres. O mesmo não foi observado para a bilirrubina direta, que se
mostrou sem alterações relevantes. Outro fator importante seria uma menor oferta de
grupamentos heme refletida em valores menores de hemoglobina neste grupo, o que foi
mostrado na Tabela 2, corroborando os resultados encontrados em outros trabalhos
(GANDRA; ALVES; MACEDO, 2004).
* Teste t de Student, p < 0,05
LEGENDA: ALT (Alanina Amino Transferase), AST (Aspartato Amino Trasferase), GGT (Gama-Glutamil Transferase), BT (Bilirrubina Total), BD (Bilirrubina Direta), BI (Bilirrubina Indireta). Valores de referência: AST e ALT de 10 - 37 U/L para mulher e de 11-39 U/L para homem, GGT de 7-45 U/L, BT até 1,2 mg/dL, BD até 0,4 mg/dL.
Figura 12 – Perfil hepático do grupo com esquistossomose do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Os resultados são expressos em média ± DP (p < 0,05).
0
10
20
30
40
50
CONTROLETESTE
ALT(U/L)
AST(U/L)
GGT(U/L)
BTx10(mg/dL)
BD x 10(mg/dL)
BI x 10(mg/dL)
*
*
*
A Figura 13 mostra uma relação entre o perfil hepático com o MDA (molécula
utilizada como indicador de peroxidação lipídica) e com o GSH (molécula utilizada como
parâmetro antioxidante). Observa-se nesta figura, no grupo de indivíduos com a doença, um
aumento nas concentrações de AST, em relação ao grupo controle. Apesar de não ter sido
observado um aumento da ALT no presente trabalho, estudos anteriores sugerem que a
elevada carga parasitária seja um dos mecanismos de elevação da ALT na esquistossomose
mansônica (AMARAL et al., 2002).
Uma elevada carga parasitária irá produzir MDA e conseqüentemente irá provocar
uma condição de estresse oxidativo, isso poderá estar levando ao dano hepático
evidenciado pelo aumento de AST. Ao mesmo tempo, a GSH estará sendo requisitada para
o local com o objetivo de proteger o organismo dos radicais livres formados ao redor dos
ovos. Assim, a glutationa será consumida, justificando os níveis diminuídos encontrados
(EL-SHENAWY, SOLIMAN, ABDEL, 2006).
* Teste t de Student, p < 0,05.
LEGENDA: ALT (Alanina Amino Transferase), AST (Aspartato Amino Trasferase), MDA (Malondialdeído), GSH (Glutationa Reduzida). Valores de referência: AST e ALT de 10 - 37 U/L para mulher e de 11-39 U/L para homem.
Figura 13 – Concentração das moléculas antioxidante/ oxidante correlacionado com o perfil hepático dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN e Natal/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Os resultados são expressos em média ± DP (p < 0,05).
0
25
50
75
100
125
150CONTROLE
TESTE
ALT(U/L)
AST(U/L)
MDA(nmol x10/mL)
GSH(μmol/L)
*
*
*
A Figura 14 expressa o perfil lipídico dos pacientes portadores de esquistossomose
em relação ao grupo controle. Entre os grupos teste e controle não foram observadas
diferenças para os parâmetros utilizados.
Em virtude desses indivíduos estarem na fase aguda da doença, provavelmente, não
apresentaram alterações no perfil lipídico, uma vez que estudos anteriores relatam alteração
apenas na forma hepatoesplênica da esquistossomose (SILVA et al., 2002b, FLAMME et
al., 2007 ).
Teste t de Student, p < 0,05.
LEGENDA: CT (Colesterol Total), HDL (Lipoproteína de Alta Densidade), LDL (Lipoproteína de Baixa Densidade), TRIG (Triglicerídeo). Valores de referência: CT inferior a 200 mg/dL, HDL ≥ 60 mg/dL, LDL < 100 mg/dL, TRIG < 150 mg/dL.
Figura 14 – Perfil lipídico do grupo com esquistossomose do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Os resultados são expressos em média ± DP (p < 0,05).
0
50
100
150
200
250 CONTROLETESTE
CTmg/dL
HDLmg/dL
LDLmg/dL
TRIGmg/dL
mg
/dL
A Tabela 2 mostra os valores médios obtidos para os diferentes parâmetros do
eritrograma, leucograma e plaquetas, a partir da coleta do sangue periférico dos indivíduos
dos grupos estudados.
Em relação ao eritrograma, o grupo de indivíduos com esquistossomose apresentou o índice
hematimétrico CHCM (concentração de hemoglobina corpuscular média) abaixo dos
valores de referência quando comparados ao grupo controle (32,36 ± 1,22 vs. 31,06 ± 0,80
g/dL). Apesar dos resultados não caracterizarem um quadro anêmico nos pacientes com
esquistossomose, observa-se uma tendência de diminuição no aporte de grupamento heme,
o que também se reflete em menores concentrações séricas de bilirrubina total e indireta,
como mostrado anteriormente na Tabela 1. Isso poderia evidenciar um quadro adaptativo
ao curso da doença.
Em relação aos outros parâmetros do eritrograma, encontrados para os indivíduos
doentes, todos estão dentro dos padrões de normalidade.
Com relação ao leucograma, os resultados do presente estudo mostraram valores
médios elevados para leucócitos (5558,62 ± 1138,46 vs. 7985,71 ± 1809,79 mm3) e
eosinófilos (2,66 ± 2,21 vs. 9,94 ± 7,11 %) nos indivíduos com esquistossomose, em
relação ao grupo controle. Sobre os leucócitos, Atta et al. (1981), fazendo uma revisão
sobre a esquistossomose constatou em seus experimentos, que estas células tendem a
aumentar com a evolução da infecção. Além disso, pode-se sugerir uma relação desse
aumento com o estresse oxidativo, uma vez que as EROs são liberadas pelos neutrófilos e
eosinófilos na tentativa de destruir os ovos, in vitro (FELDMAN, DANNENBERG
JÚNIOR, SEED, 1990).
Vale ressaltar, que os valores elevados de eosinófilos encontrados nos hemogramas
realizados sugerem a presença de enteroparasitas nos indivíduos, visto que os mesmos
consomem ferro do organismo, componente interno da hemoglobina (KATSURAGAWA et
al., 2004). Além disso, os eosinófilos têm a capacidade de destruir os esquistossômulos
através do mecanismo de citotoxicidade celular dependente do anticorpo, se mostrando em
valores médios elevados (MACHADO et al., 2004). Um outro fator importante sobre estas
células é que as mesmas estão presentes em situação de estresse oxidativo, pois produzem
grandes quantidades de EROs quando ativados, participando também da destruição de
ovos, sendo este último fato relatado no trabalho de Atta e col. (ATTA et al., 1981,
PEREIRA, 1996).
Observou-se também, um aumento no número das plaquetas (230034,48 ± 50664,50
vs. 267588,24 ± 40857,56 mil/ mm3) dos indivíduos doentes, em relação ao grupo controle.
Isso pode ter ocorrido devido a uma inflamação por formação de granuloma, pois os
mesmos atraem para a região necrosada, plaquetas, juntamente com leucócitos e
macrófagos, sendo esse fato demonstrado em qualquer fase da doença em que o indivíduo
se encontre, independente do grau de lesão hepática (SOARES et al., 2007).
Tabela 2 – Parâmetros hematológicos dos pacientes avaliados do município de Touros/ RN e do grupo controle de Natal/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Os resultados são expressos em média ± DP (p < 0,05).
Analitos CONTROLE TESTE
Média ± Média ± Hematócrito (%) 39,18 4,58 41,26 3,82 Hemoglobina (g/dL) 14,39 2,52 13,48 2,74 Hemácias (milhões/mm3) 4,40 0,49 4,61 0,44 VCM (fL) 89,00 4,05 89,71 3,87 HCM (pg) 28,86 1,72 27,84 1,51 CHCM (g/dL) 32,36 1,22 31,06 * 0,80 Leucócitos (mm3) 5558,62 1138,46 7985,71 * 1809,79 Blastos (%) 0,00 0,00 0,00 0,00 Mielócitos (%) 0,00 0,00 0,00 0,00 Metamielócitos (%) 0,00 0,00 0,00 0,00 Bastões (%) 1,00 0,00 1,00 0,00 Segmentados (%) 58,22 6,71 47,94 11,69 Eosinófilos (%) 2,66 2,21 9,94 * 7,11 Basófilos (%) 0,00 0,00 0,00 0,00 Linfócitos (%) 32,48 1,41 36,82 8,95 Linfócitos atípicos (%) 0,00 0,00 0,00 0,00 Monócitos (%) 4,86 2,13 4,27 1,79
Plaquetas (mil/mm3) 230034,48 50664,50267588,24
* 40857,56
* Teste t de Student, p < 0,05
LEGENDA: VCM (Volume Corpuscular Médio), HCM (Hemoglobina Corpuscular Média), CHCM (Concentração de Hemoglobina) Valores de referência: Hematócrito de 36 a 47 % , Hemoglobina de 11 a 16 g/dL, Hemácias de 4 a 5,6 106/mm3, VCM de 82 a 96 fL, HCM de 27 a 32 pg, CHCM de 32 a 36 g/dL, Leucócitos 4.000 a 11.000 /mm3, Plaquetas 150 a 450 103/mm3, Eosinófilos 1 a 5 %.
A Figura 15 mostra a relação do MDA com o número de ovos depositados pelo
parasita, por grama de fezes. Observa-se um aumento do MDA, de acordo com o aumento
da quantidade de ovos eliminados nas fezes dos indivíduos infectados.
Trabalhos anteriores corroboram os resultados encontrados, pois relatam que as
espécies reativas de oxigênio (EROs) são produzidas nas proximidades dos ovos
depositados no fígado, num processo de inflamação granulomatosa, permitindo assim, a
destruição dos mesmos (ABDALLAHI et al., 1999, EBOUMBOU et al., 2005).
Sabe-se, ainda, que as EROS atraem para o local, algumas células de defesa, como
macrofágos e eosinófilos, além de moléculas e enzimas antioxidantes, com esta mesma
função. Entretanto, as EROs apresentam também, efeitos deletérios, uma vez que o estado
redox do fígado é alterado com uma diminuição das defesas antioxidantes no organismo
(FELDMAN; DANNENBERG JÚNIOR; SEED, 1990, EBOUMBOU et al., 2005).
LEGENDA: SRAT (Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico)
Figura 15 – Correlação entre SRAT e o número de ovos por grama de fezes dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Significativos para *p < 0,05 de acordo com o teste de correlação Spearmann.
0 50 100 1503
4
5
6
7
8
*
Ovos/g de fezes
SR
AT
(n
mo
l/m
L)
Os resultados mostrados na Figura 16 mostram a correlação negativa do GSH com o
número de ovos depositados pelo parasita por grama de fezes. É possível verificar uma
tendência da diminuição do GSH, apesar deste dado não se mostrar estatisticamente
significativo. Alguns trabalhos relatam que a expressão das enzimas antioxidantes pode ser
afetada por vários fatores, como processos inflamatórios, algumas doenças e estados de
imunodeficiência, isso por haver um desbalanço entre os radicais livres, presentes em altas
quantidades e poucos antioxidantes suficientemente formados para destruí-los (ZELCK;
VON JANOWSKY, 2003, HANNA et al. 2005).
Abdallahi et al., 1999, mostraram que células inflamatórias liberam EROS ao redor
dos ovos, tão logo alguns granulócitos estejam presentes. Ao mesmo tempo, a atividade de
enzimas seqüestradoras de H2O2, como catalase e glutationa peroxidase diminuem
drasticamente, como também os estoques de glutationa reduzida, no fígado.
Portanto, sugere-se que quanto maior a carga parasitária, a reação inflamatória é
intensificada, conseqüentemente, ocorre uma tendência de diminuição dos níveis de GSH,
como mostrado na Figura 16.
LEGENDA: GSH (Glutationa Reduzida)
Figura 16 – Correlação entre o GSH e o número de ovos por grama de fezes dos pacientes avaliados no município de Touros/ RN, no período de abril de 2006 a fevereiro de 2007. Significativos para *p < 0,05 de acordo com o teste de correlação Spearmann.
0 50 100 1500
50
100
150
Ovos / g de fezes
GS
H (
μm
ol/
L)
CONCLUSÕES
5. CONCLUSÕES
Diante do exposto, observou-se que os indivíduos com a doença possuem alterações
nos níveis de alguns parâmetros do estresse oxidativo (MDA e GSH), entretanto o mesmo
não foi observado em relação à CAT.
A peroxidação lipídica demonstrada pelo aumento de MDA, assim como a
diminuição de GSH sugerem um possível quadro de estresse oxidativo no grupo de
indivíduos com esquistossomose (grupo teste).
Além disso, apresentam alterações significativas em parâmetros bioquímicos nos
níveis de bilirrubina total e indireta, AST e creatinina; e em parâmetros hematológicos
como o CHCM, leucócitos, eosinófilos e plaquetas.
Os resultados sugerem uma forte associação entre a carga parasitária e a intensidade
de lipoperoxidação lipídica nesses indivíduos.
Ao compararmos os resultados obtidos nesse estudo com os encontrados na
literatura, verificou-se que os mesmos foram compatíveis, concluindo-se assim que a
metodologia utilizada na padronização da extração e dosagem de moléculas e enzimas dos
indivíduos do grupo controle e do grupo teste foi adequada.
Os achados encontrados nesse trabalho reforçam a possibilidade do estresse
oxidativo contribuir para a patologia associada ao Schistosoma mansoni.
PERSPECTIVAS
6. PERSPECTIVAS
Pretende-se elaborar novas atividades educativas para aplicação no Município de
Touros/RN, tanto para a comunidade, como também para os profissionais da área de saúde,
através de filmagem, peça teatral com fantoches, entre outras.
A continuação deste estudo, também é uma perspectiva para nosso grupo de
pesquisa, já que foram quantificadas algumas substâncias que avaliam o estresse oxidativo
dos pacientes ainda no curso da doença. Portanto, pretende-se realizar as mesmas técnicas,
avaliações e comparações nos pacientes após o tratamento, e assim, estudar todo o
andamento do estresse oxidativo em pacientes com esquistossomose, tratados e não
tratados. Além disso, é de grande relevância verificar os parâmetros bioquímicos e
hematológicos de indivíduos na fase crônica da doença.
Como o sistema imune tem uma participação na fisiopatologia da esquistossomose,
seria interessante avaliar o perfil imunológico nas duas fases da doença.
Uma outra perspectiva desse trabalho é estudar outros índices que avaliam o
estresse oxidativo, como a determinação da atividade da superóxido dismutase e glutationa
peroxidase, que podem reforçar os resultados obtidos.
Pode-se também, avaliar se uma suplementação com antioxidantes de defesa
secundária como as vitaminas E e C, diminuiria a situação de estresse dos indivíduos com
esquistossomose.
REFERÊNCIAS
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ROVER, L. J.; HOEHR, N. F.; VELLASCO, A. P. Sistema antioxidante envolvendo o ciclo metabólico da glutationa associado a métodos eletroanalíticos na avaliação do estresse oxidativo. Quim. Nova, Campinas – SP, v. 24, n. 1, p. 112-119, 2001. Disponível em: < http://www.scielo.br/pdf/qn/v24n1/4458.pdf> Acesso em: 01 ago. 2006.
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VALENÇA, P. L .F. “Esquistossomose mansoni humana: Influência da IL-10 no fenótipo celular do granuloma in vitro”. Rio de Janeiro, Fiocruz, 2000.
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YAGI, K. Lipid peroxides in biology and medicine. New York: Academic Press, 1982.
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ANEXOS
ANEXO 1
ANEXO 2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
LABORATÓRIO INTEGRADO DE ANÁLISES CLÍNICAS – LIAC
PACIENTE: _______________________________ IDADE: _____ REGISTRO: _____
INDICAÇÃO CLÍNICA: _______________________ LEITO: _____ ENF: _____
EXAMES BIOQUÍMICOS NO SANGUE
Resultado Referências normais GLICEMIA DE JEJUM 70-100 mg/dL
COLESTEROL Inferior a 200 mg/dL COLESTEROL HDL ≥ 60 mg/dL COLESTEROL LDL < 100 mg/dL
TRIGLICERIDES < 150 mg/dL ALT M: 10-37 U/L
H: 11-39 U/L AST M: 10-37 U/L
H: 11-39 U/L UREIA 15-40 mg/dL
CREATININA 0,4-1,3 mg/dL OUTROS
Gama GT 7-45 U/L BILIRRUBINA TOTAL até 1,2 mg/dL BILIRRUBINA DIRETA até 0,4 mg/dL
BILIRRUBINA INDIRETA
-
________________________________________ Farmacêutico-Bioquímico/ CRF
ANEXO 3
LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS (LIAC) UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PACIENTE: ............................................................................................... SEXO: ........... DATA DE NASC. ___/___/___ IDADE ........... MÉDICO: ...........................................................................................................................
HEMOGRAMA MATERIAL: SANGUE
ERITROGRAMA: Hematocrito .......................................................% (36,00 a 47,00) Hemoglobina .....................................................g/dL (11,50 a 16,00) Hemácias ...........................................................milhões mm3 (4,00 a 5,60) Volume Corpuscular Médio (VCM).................fl (82,00 a 96,00) Hemoglobina Corp. Media (HCM) ..................pg (27,00 a 32,00) Concentração Hemoglobina (CHCM)..............g/dl (32,00 a 36,00)
Leucócitos.........................................................../mm3 (4,000 a 11,000)
Blastos...................................................%.........0/mm3 0 a 0 0 a 0 Mielócitos..............................................%.........0/mm3 0 a 0 0 a 0 Metamielócitos.......................................%.........0/mm3 0 a 1 0 a 110 Bastões...................................................%.........../mm3 1 a 5 40 a 550 Segmentados..........................................%.........../mm3 54 a 62 2,1600 a 6,820 Eosinofilos.............................................%.........../mm3 1 a 5 40 a 550 Basófilos................................................%.........../mm3 0 a 1 0 a 110 Linfócitos...............................................%.........../mm3 20 a 40 800 a 4,400 Linfócitos atípico...................................%............/mm3 0 a 1 0 a 110 Monócitos.............................................%............./mm3 3 a 10 120 a 1,100
HEMATOSCOPIA SV=................................................................................................................................... SB=................................................................................................................................... SP=...................................................................................................................................
Contagem de plaquetas...........................................mil/mm3 (150,00 a 450,00) ______________________________________________________________________
APÊNDICES
APÊNDICE 1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
QUESTIONÁRIO APLICADO NO MUNICIPIO DE TOUROS
Registro n°: __________ Data: _____/_____/_____ Datas das coletas: Amostras de fezes ____________________________________________________ Amostras de sangue ____________________________________________________
I) Identificação 1.1. Nome: _______________________________________________________________ 1.2. Idade: ________ 1.3. Sexo: F ( ) M ( ) 1.4. Naturalidade: ___________________ 1.5. Endereço:______________________________________________________________ 1.6. Bairro: ___________________ 1.7. Telefones para contato: __________________ 1.8. Grau de escolaridade: analfabeto( ) 1° grau ( ) 2 ° grau ( ) 3 ° grau ( ) 1.9. Condição socioeconômica da família: Profissão ocupação funcional: _________________ Está trabalhando? Sim( ) Não( )
Local de trabalho:________________________ *Perto de rio ou lagoa Sim( ) Não( ) Renda mensal: ( ) até 1 salário mínimo ( ) de 1 a 2 salários mínimos ( ) mais de 2 salários mínimos
II) Do meio familiar 2.1. Quantas pessoas moram na mesma casa: 1 a 3( ) 4 a 6( ) mais de 6( ) 2.2. Possui animal ? Sim( ) Não( ) Qual? Gato( ) Cão( ) Pássaro( ) Outros( ) 2.3. Tipo de habitação: Alvenaria( ) Taipa( ) Telhado( ) Sem telhado( ) Piso( ) Sem piso( ) Outros( ) 2.4. Água: encanada( ) poço( ) 2.5. Luz: Sim( ) Não( ) 2.6. Tipo de água ingerida: Ruim( ) CAERN( ) fervida/filtrada( ) mineral( ) 2.7. Como é desprezado o lixo de casa? Enterra( ) Queima( ) Recolhido( ) 2.8. Tem banheiro em casa? Sim( ) Não( ) *Tem sanitário? Sim( ) Não( )
III) Do exame físico: 3.1. Já teve alguma parasitose? Sim( ) Qual? ____________________ Não( ) 3.2. Já fez exame de fezes alguma vez? Sim ( ) Não ( ) 3.3. Já fez ou faz uso de medicamento para “verme” ? Sim( ) Qual? __________ Não( ) 3.4. Toma algum medicamento? Sim ( ) Qual? __________ Não ( ) 3.5. Está grávida? Sim ( ) Não ( ) * É fumante? Sim ( ) Não ( ) 3.6. Consome bebida alcoólica? Sim ( ) Freqüência? __________ Não ( ) 3.7. Tem Diabetes? Sim ( ) Não ( ) 3.8. Tem Hipertensão? Sim ( ) Não ( ) 3.9. Tem alguma outra doença? Sim ( ) Qual? __________ Não ( )
IV) Hábitos: 4.1. N° banhos/dia: ( )1 ( )2 ( )mais de 2 4.2. Usa toalhas de outras pessoas ? Sim( ) Não( ) 4.3. Corta as unhas? Sim( ) Não( ) * Rói as unhas? Sim( ) Não( ) 4.4. Anda sempre calçado? Sim ( ) Não ( ) 4.5. Protege os alimentos das moscas e baratas? Sim( ) Não( ) 4.6. Lava as mãos antes das refeições? Sim( ) Não( ) 4.7. Lava as mãos após ir ao banheiro? Sim( ) Não( )
V) Sinais e sintomas:5.1. Já eliminou ou elimina vermes? Sim( ) Não( ) 5.2.Sente: mal-estar? Sim( ) Não( ) cólicas abdominais ou dores na barriga? Sim( ) Não( ) dores nos músculos? Sim( ) Não( ) prurido (coceira) ? Sim( ) Onde? __________ Não( ) 5.3. Apresenta: fraqueza? Sim( ) Não( ) tonturas? Sim( ) Não( ) náuseas e vômitos? Sim( ) Não( ) prisão se ventre? Sim( ) Não( ) diarréia? Sim( ) Não( ) febre e calafrios? Sim( ) Não( ) tosse? Sim( ) Não( ) manchas na pele (pano branco)? Sim( ) Não( ) palidez? Sim( ) Não( ) vermelhidão na pele? Sim( ) Onde? __________ Não( ) falta de apetite? Sim( ) Não( ) perda de peso? Sim( ) Não( ) barriga grande? Sim( ) Não( )
VI) Questões relacionadas à esquistossomose:6.1. Já ouviu falar da Esquistossomose ou Barriga d’água? Sim ( ) Não ( ) 6.2. Já teve Esquistossomose ou Barriga D’água? Sim ( ) Quantas vezes? _____ Não ( ) 6.3. Conhece alguém que tem a doença? Sim ( ) Quantas pessoas? ______ Não ( ) 6.4. Costuma freqüentar rios ou lagoas como atividade de lazer? Sim ( ) Não ( ) 6.5. Sabe como se contamina? Sim ( ) Não ( ) 6.6. Já viu um caramujo? Sim ( ) Não ( ) 6.7. Sabe como se prevenir? Sim ( ) Não ( ) 6.8. Sabe como se trata? Sim ( ) Não ( )
OBSERVAÇÕES:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
APÊNDICE 2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS TOXICOLÓGICAS
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do projeto: Alterações nos mecanismos de defesa antioxidante (enzimas e moléculas) de pacientes com esquistossomose. Responsável pela pesquisa: Ana Claudia Galvão Freire
OBJETIVOS: 1. OBJETIVO GERAL:
Avaliar os níveis de malondialdeído (MDA), catalase (CAT) e glutationa reduzida (GSH) no sangue de pacientes com esquistossomose, comparando com os valores em indivíduos saudáveis. 2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: - Saber quais as alterações que ocorrem nas moléculas pró-oxidantes e antioxidantes em pacientes com esquistossomose.
- Fazer uma comparação da ação de algumas enzimas e moléculas (catalase, glutationa reduzida, e malondialdeído) produzidas pelo fígado entre pessoas sadias (grupo controle) e indivíduos com esquistossomose.
- Verificar o que foi modificado na ação das enzimas presentes no fígado, no indivíduo com esquistossomose.
PROCEDIMENTO: 1. Escolha dos indivíduos saudáveis (grupo controle) que estão dentro dos parâmetros desejados,
através de seleção na Faculdade de Farmácia da UFRN. 2. Escolha dos indivíduos que possuem esquistossomose na fase aguda e estão dentro dos parâmetros
desejados, através de dados da Secretaria Municipal de Saúde do município de Touros/RN, contidos nos prontuários médicos e aplicação de questionário.
3. Assinatura do termo de consentimento pelos os indivíduos escolhidos para a realização da pesquisa, autorizando que este nada tem contra em colaborar com a mesma.
4. Coleta das amostras de sangue em indivíduos sadios (grupo controle) e em indivíduos com esquistossomose, para medição de parâmetros bioquímicos necessários na pesquisa. Bem como, coleta de fezes para a realização do método de Kato-katz após o tratamento, para verificação de erradicação do parasita no indivíduo tratado.
5. Realização de exames que beneficiem estes indivíduos, como avaliação da função hepática em exames como TGO, TGP, e Gama-GT e realização de exame parasitológico de fezes após o tratamento.
6. Orientação aos indivíduos do município sobre a prevenção e tratamento da esquistossomose. 7. Palestras sobre a esquistossomose e outras doenças parasitárias de uma maneira geral, mostrando as
medidas de prevenção, como ocorre a contaminação e como deve ser o diagnóstico e tratamento.
RISCOS: As atividades propostas neste projeto oferecem o mínimo de risco à saúde dos indivíduos envolvidos na pesquisa. Dessa forma, podendo ser considerados os riscos referentes ao procedimento de coleta, tais como: hematomas, sangramentos e desmaios referentes à coleta do material biológico. Caso seja comprovado algum dano ou prejuízo decorrente da pesquisa, o sujeito será devidamente indenizado ou ressarcido. BENEFÍCIOS: Os benefícios deste trabalho, serão a identificação e confirmação do Schistosoma mansoni, bem como de outros parasitas através da realização de novos exames parasitológicos de fezes realizados após o tratamento dos pacientes. Além disso, serão feitos outros exames relacionados à doença, que avaliam o funcionamento hepático, será realizada também uma palestra educativa de orientação sobre prevenção e tratamento da esquistossomose e de outras parasitoses, pela mestranda Gina Michelle Macêdo da Cunha. CONFIDENCIAL DO ESTUDO: Os participantes do trabalho de pesquisa em questão terão a garantia do sigilo das informações geradas com as análises, até o limite permitido por lei. Além dos pesquisadores
envolvidos, apenas os componentes do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte poderão, em algum momento, ter acesso aos resultados da pesquisa, se necessário. Cada indivíduo será registrado e terá um número de identificação, o que garante o sigilo dos dados obtidos. Dessa forma, aidentidade do paciente não será revelada em qualquer relatório ou publicação científica resultante deste estudo. DANO E/ OU RESSARCIMENTO ADVINDO DA PESQUISA: Em caso de dano devidamente comprovado, resultante desta pesquisa, o sujeito será devidamente indenizado pela instituição responsável, sendo a pesquisa suspensa caso necessário. Em caso de gastos devidamente comprovados, resultantes da pesquisa, o sujeito será devidamente ressarcido. PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA: O participante do projeto de pesquisa poderá desistir da colaboração em qualquer etapa e por qualquer motivo, sem que haja nenhuma penalidade ou prejuízo ao mesmo. CONSENTIMENTO PARA PARTICIPAÇÃO: Declaro que os responsáveis pela pesquisa informaram os riscos e benefícios do projeto de pesquisa a ser realizado e que após ter lido e compreendido as informações deste documento, estou disposto a participar de livre e espontânea vontade do estudo, sabendo que posso, a qualquer momento desistir de participar da pesquisa. Assim autorizo a utilização das informações obtidas com finalidade de desenvolver a pesquisa citada, como também a publicação do trabalho de forma escrita, podendo utilizar inclusive minhas informações. Concedo também o uso das informações para utilização em ensino e divulgação nos jornais e/ ou revistas científicas, desde que mantenham o sigilo sobre meu nome e identificação.
Nome do paciente: __________________________________________________________ Testemunha: ______________________________________________________________ Assinatura do paciente: ______________________________________________________
Natal, _____/______/______
COMPROMISSO DO INVESTIGADOR: Como coordenadora e responsável pelo projeto de pesquisa “ALTERAÇÕES NOS MECANISMOS DE DEFESA ANTIOXIDANTE (ENZIMAS E MOLÉCULAS) DE PACIENTES COM ESQUISTOSSOMOSE”, declaro que expliquei aos pacientes todos os procedimentos necessários para a realização do referido trabalho. Comprometo-me a cumprir o que foi acordado com os mesmos sobre os riscos e benefícios da pesquisa, de acordo com as normas estabelecidas na Resolução 196/96-CNS, procurando manter a integridade e bem estar dos indivíduos participantes neste projeto.
______________________________________ Assinatura do pesquisador responsável
Av. Gal. Cordeiro de Farias, s/n, Petrópolis, Natal/RN Telefone: 3215-4229
e-mail: [email protected]
Comitê de Ética em Pesquisa Universidade Federal do Rio Grande do Norte Telefone: 3215-3135