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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS Unifal - MG
HERICK ULISSES DE OLIVEIRA
INVESTIGAO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA ENDOCANABINOIDE NA ANTINOCICEPAO INDUZIDA PELA ESTIMULAO ELTRICA
TRANSCUTNEA DO NERVO -TENS
ALFENAS- MG
2015
HERICK ULISSES DE OLIVEIRA
INVESTIGAO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA ENDOCANABINOIDE NA ANTINOCICEPAO INDUZIDA PELA ESTIMULAO ELTRICA
TRANSCUTNEA DO NERVO -TENS
Alfenas/MG
2015
Dissertao apresentada como parte dos requisitos
para obteno do ttulo de Mestre em Cincias
Fisiolgicas pelo Programa Multicntrico em Cincias
Fisiolgicas da Sociedade Brasileira de Fisiologia na
Universidade Federal de Alfenas- UNIFAL/MG.
rea de concentrao: Fisiologia e Farmacologia da
dor
Orientador: Prof. Dr. Giovane Galdino de Souza
Dedico aos meus amores: minha esposa Soraya Oliveira e minha filha Ana Luiza.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela fora em momentos difceis, e por ser sempre meu guia, a Nossa
Senhora Aparecida que intercede e ilumina meus passos, abenoando com seu manto
maternal.
A minha esposa Soraya e minha filha Ana Luiza, que mesmo com a minha
ausncia, incentivaram e me inspiraram em todo percurso. A vocs peo desculpas
pelos momentos impares que perdemos, por dificuldades e receios. Apesar disso
sempre me recepcionaram com um sorriso no rosto e uma energia que me
impulsionava nesse objetivo. Obrigado pelo carinho, amo vocs.
Ao meu pai Valdir, minha me Izabel por serem exemplo de dedicao, unio
e sempre me apoiarem nas decises. Obrigado por disponibilizarem tempo para
ajudar e cuidar da minha famlia em momentos que estive ausente, juntamente com
meus irmos Douglas e Breno, minha cunhada, meu sogro e minha sogra.
A minha V Didi pelas Bnos e pelos ensinamentos de vida e de
simplicidade.
Aos meus primos, tios, tias: em especial a Tia Conceio e Cornlio pela
hospedagem nos perodos que estive em Belo Horizonte. Obrigado pela fora.
Ao amigo e orientador Dr. Giovane Galdino, pela credibilidade, ensinamentos e
por me aceitar nesse seleto grupo, fazendo que eu me dedicasse e gostasse cada vez
mais da pesquisa.
Aos professores do Programa de Ps graduao em Fisiologia e de graduao
em Fisioterapia da UNIFAL, em especial ao Dr. Alexandre Giusti-Paiva, Dra. Fabiana
Giust, Dr. Leonardo Carvalho, Dra Juliana Bassalobre , Dra Silvia Lanziotti , Dr
Marcelo, Dra Josie Resende , pelas dicas e disponibilidade.
Aos amigos e Colaboradores da UFMG Prof. Dr. nio Ferreira, Dr. Jos
Felippe, e Dra. Ana Flvia, pelo trabalho assistencial, dedicao e pela pacincia em
ensinar.
Aos ps-graduandos do laboratrio de Fisiologia da UNIFAL: Vanessa
Veronesi, Vanessa Cardoso, Mara, Ana Cludia, Slvia, Layla, Ana Laura, Luciana,
Merellym, Lidiane, Nathlia, Clarice, Kriss, Tatiane, Dlcio e Wesley e do LABFEX,
em especial a Rafaela Santos, Ana Clara, Gonalves Pedro, Marcelo, Jadina Santos,
Julia Parisi, Ricardo pela convivncia diria, ajuda e amizade.
Aos tcnicos Luiz, Luciana, Jos Reis, Marina Venncio, Luiz Felipe, Joo
Vitrio, Isabel as auxiliares Helena e D Zlia, pela disponibilidade e ateno,
sempre atenciosa Maria Antonieta Nogueira, secretria do PMPGCF da
UNIFAL
Aos amigos que me deram fora em especial eterna Rep. Projak.
Universidade Federal de Alfenas, Coordenao de Aperfeioamento de
Pessoal de Nvel Superior (CAPES) e Fundao de Amparo Pesquisa do Estado
de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo auxlio financeiro.
O saber a gente aprende com os mestres e os livros. A sabedoria, se aprende com a vida e com os humildes
Cora Coralina
http://pensador.uol.com.br/autor/cora_coralina/
RESUMO
A dor patolgica acomete 30% da populao mundial. Visando seu controle, inmeras intervenes so utilizadas, as quais envolvem alm dos meios farmacolgicos, procedimentos no farmacolgicos. Assim, uma estratgia no farmacolgica utilizada tem sido a Estimulao Eltrica Transcutnea do Nervo (TENS), um mtodo que utiliza a corrente eltrica para induzir analgesia. No entanto, os mecanismos envolvidos no efeito antinociceptivo da TENS no esto totalmente elucidados. Com a descoberta do sistema endocanabinide e a partir de estudos que demonstraram seu importante papel na modulao da dor, o presente estudo objetivou investigar o envolvimento desse sistema no efeito antinociceptivo proporcionado pela TENS em nveis perifrico e central. Para tal, foram utilizados camundongos machos Swiss pesando 25 a 30, submetidos a um modelo de dor por meio de clulas tumorais de Ehrlich, injetadas em pata. Em seguida, com o intuito de verificar o efeito antinociceptivo da TENS de baixa e alta frequncia sobre a alodinia mecnica induzida pelas clulas, os animais foram estimulados por ambas as frequncias por 20 minutos, aplicadas por meio de eletrodos em pata posterior direita. A avaliao do limiar nociceptivo foi realizada pelo teste de filamentos de von Frey. J, para avaliar a participao do sistema endocanabinide, foram pr administrados por vias intra plantar (i.pl.), intratecal (i.t.) e intra Substncia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l.), o antagonista para receptores canabinides do tipo 1 (CB1), o AM 251 e o inibidor da enzima responsvel pela degradao de endocanabinide anandamida (AEA), o MAFP. Alm disso, tambm foram realizadas a anlise de Western Blot, para investigar a expresso de receptores CB1 e anlise de imunofluorescncia para quantificar e co-localizar esses receptores. Nossos resultados verificaram que ambas as frequncias utilizadas reverteram de maneira significativa (P < 0.05) a alodinia mecnica induzida pelas clulas do tumor de Ehrlich. Em adio, esse efeito foi revertido pelo AM251 e prolongado pelo MAFP, ambos pr injetados pelas vias i.pl, e i.t. e i.SCPd.l. Somando a esses resultados, o ensaio de Western Blot demonstrou um aumento da expresso de receptores CB1 aps a aplicao da TENS, em ambas as frequncias, em tecido subcutneo de pata e em SCPd.l. aps 3 horas da injeo de clulas de Erlinch. Resultado similar foi encontrado aps a anlise de imunofluorescncia, onde verificou-se um aumento no nmero de receptores CB1 aps a estimulao com a TENS, em corno dorsal da medula espinal e SCPd.l. Assim, o presente estudo conclui que o sistema endocanabinide pode estar envolvido no efeito antinociceptivo induzido pela TENS, tanto de baixa quanto de alta frequncia, em nveis perifrico e central e sugere que esse efeito ocorre pela ativao da via descendente inibitria da dor, principalmente pela liberao de endocanabinides e a ativao dos receptores CB1.
Palavras-chave: Endocanabinide. TENS. Antinocicepo. Alodinia
ABSTRACT
The pathological pain affects 30% of the world population. Aiming their control, many interventions are used, which involving pharmacological and non-pharmacological treatments. Thus, a non-pharmacological strategy used has been Transcutaneous Electrical Nerve Stimulation (TENS), a method that use the electric current to induce analgesia. However, the mechanisms involved in the antinociceptive effect induced by TENS are not fully elucidated. With the discovery of the endocannabinoid system and studies demonstrated that its system have an important role in the modulation of pain, the present study aimed to investigate the involvement of this system in TENS antinociceptive effect at central and peripheral levels. For such, male Swiss mice weighing 25 to 30g, were underwent to a pain model using tumor cells of Ehrlich, injected into the paw. After that, in order to evaluate the analgesic effect of low and high TENS frequency in the mechanical allodynia induced by the cells, the animals were stimulated for both frequencies for 20 minutes, which were applied by electrodes in the right hind paw. The nociceptive threshold was measured by the von Frey hairs test. To evaluate the involvement of the endocannabinoid system, were pre administered by intra plantar (i.pl.), intrathecal (i.t.) and intra dorsolateral Periaqueductal Gray Matter (i.d.l.PAG) via, the antagonist for cannabinoid receptors type 1 (CB1), the AM 251 and the inhibitor of the enzyme responsible for the degradation of the endocannabinoid anandamide (AEA), the MAFP. Furthermore, were also used the Western blot analysis to investigate the expression of CB1 receptors and immunofluorescence analysis to quantify and co-locate these receptors. Our results found that both frequencies used reverted significantly (P < 0.05) the mechanical allodynia induced by Ehrlich tumor cells. In addition, this effect was reversed by AM251 and prolonged by MAFF, both pre injected by i.pl., i.t. and i.d.l.PAG routes. In addition to these results, the Western Blot analysis showed an increase in expression of CB1 receptors after the application of TENS, in both frequencies, in paw subcutaneous tissues and d.l.PAG, 3 hours after injection Erlinch cells. A similar result was found after immunofluorescence analysis, which found an increase in the number of CB1 receptors after stimulation with TENS, in the dorsal horn of the spinal cord and d.l.PAG. Thus, this study concludes that the endocannabinoid system may be involved in the antinociceptive effect induced by TENS, in both low and high frequency, at central and peripheral levels and suggests that this effect occurs by the activation of the descending inhibitory pain pathway, mainly by release of endocannabinoids and activation of CB1 receptors.
Key words: Endocannabinoids. TENS. Antinociception. Allodynia
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Via ascendente da nocicepo................................................... 21
Figura 2- Esquema representativo da teoria do porto modificada............ 23
Figura 3- Via descendente inibitria da dor e principais reas envolvidas no controle descente....................................................................
24
Figura 4- Ilustrao dos possveis caminhos ativados pela TENS de baixa freqncia (TB) ou de alta frequncia (TA)..................................
29
Figura 5- Representao esquemtica do sistema endocanabinide........ 33
Figura 6- Administrao intraplantar das drogas........................................ 40
Figura 7- Via de administrao intratecal................................................... 41
Figura 8- Equipamento estereotxico utilizado no experimento............ 42
Figura 9- Posicionamento do camundongo para cirurgia estereotxica......
43
Figura 10- Ilustrao do altas Franklin e Paxinos (1997) com a seta indicando a Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral.....
45
Figura 11- Representao da injeo de azul de metileno na SCPd.l......... 45
Figura 12- Teste de excluso do corante Azul de Tripan. Visualizao atravs de microscpio................................................................
47
Figura 13- Aparelho de TENS Neurodyn II (IBRAMED, Brasil).................... 48
Figura 14- Imagem da aplicao da TENS, e o posicionamento dos animais na capela......................................................................................
49
Figura 15- Teste de von Frey filamento: aparato utilizado para colocar os animais durante o experimento....................................................
50
Figura 16 Clculo usado para especificar a mdia do limiar mecnico de retirada da pata.............................................................................
51
Figura 17- Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada da pata....................................................
52
Figura 18- Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada da pata, aps a aplicao da estimulao eltrica transcutnea do nervo.................................
52
Figura 19- Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar
nociceptivo de retirada da pata, ps injeo da droga e a administrao da estimulao eltrica transcutnea do nervo.....
53
Figura 20- Imagens por imunofluorescncia de receptores CB1, mostrando a expresso do receptor em neurnios na SCPd.l. e no corno dorsal da medula espinal............................................................
71
Figura 21- Esquema do envolvimento do sistema endocanabinide na antinocicepo induzida pela TENS de baixa freqncia (TB) ou de alta frequncia (TA), demonstrando esse efeito a partir da via descendente inibitria da dor, especificada pelos locais de atuao.........................................................................................
84
LISTA DE GRFICOS
Grfico 1- Efeito de diferentes concentraes de clulas tumorais de Ehrlich sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata avaliado pelo teste de filamentos de Von Frey............................................................................................
57
Grfico 2- Efeito da TENS de alta e baixa frequncia sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata em gramas , avaliado filamento de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106.......................................................................................
58
Grfico 3- Efeito da TENS de baixa frequncia (A) e alta frequncia (B) apsa injeo i.pl. do AM251 sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106............................................................
60
Grfico 4- Efeito da TENS de baixa frequncia (A) e alta frequncia (B) com a injeo intratecal (i.t.) do antagonista do receptor CB1 (AM251), sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106.......................................................................................
62
Grfico 5- Efeito da TENS de baixa frequncia (A) e alta frequncia (B) com a injeo intra substncia cinzenta periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l.) do antagonista do receptor CB1, AM251 sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106.............................
63
Grfico 6- Efeito da administrao intraplantar (i.p.l) do MAFP (inibidor da enzima que degrada Anandamida) sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106............................................................
65
Grfico 7- Efeito da administrao intratecal (i.t.) do MAFP (inibidor da enzima que degrada Anandamida) sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106............................................................
67
Grfico 8- Efeito da administrao intra substncia cinzenta periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l) do MAFP (inibidor da enzima que degrada Anandamida) sobre o limiar nociceptivo mecnico de
retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106.......................................................................................
68
Grfico 9- Deteco por Western Blot da expresso de receptor CB1 a nvel central (SCP e medula) e na periferia (pata) ps aplicao da TENS de alta ou baixa frequncia..........................................
69
Grfico10- Co-localizao atravs de ensaio de imunofluorescncia de receptores CB1 a nvel supra medular: substncia cinzenta periaquedutal (SCP) e medular aps a aplicao da TENS de alta ou baixa frequncia..............................................................
71
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AC - Adenilil Ciclase
AEA - Anandamida
AM 251 - (N-(peperidina-1-il) -5-(4-iodofenil) -1-(2,4-diclorofenil) -4-metil-1H-pitazole-3-carboixamida)
AM 404 - N- araquidonoilaminofenol
AMPc - Monofosfato cclico de adenosina
ASP - Aspartato
ATP - Trifosfato de Adenosina
CB1 - Receptor para canabinide do tipo 1
CB2 - Receptor para canabinide do tipo 2
CCQ - Receptor de colecistoquinina
DAG - Diacilglicerol
DAGL - Enzima diacilglicerol lipase
DMSO - Dimetilsulfxido ou sulfxido de dimetilo
Ehr - Tumor de Ehrlich
EPM - Erro padro da mdia
FAAH - cido graxo amino hidrolase
g - Gramas
GABA - cido aminobutrico
GLU - Glutamato
Hz - Hertz
i.c.v. - Intra crebro ventricular
i.p. - Intraperitoneal
i.pl. - Intraplantar
i.RVM - Intra regio rostro ventro medial
i.SCP.d.l. - Intra Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral
i.t. - Intratecal
i.v. - Intra venoso
IASP - Associao Internacional para o Estudo da Dor
LPS - Lipopolissacardeo
M - Receptor muscarnicos
m/s - Milissegundo
MAFP - cido metil araquidonil fluorfosfano/ (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5, 8, 11, 14-eicosatetraenil-metil ester fosfofluordrico)
MB - Medida basal
MGL - Monoacilglicerol lipase
mL - Mililitro
Mm - Milmetro
RNA - cido ribonucleico
mRNA - RNA mensageiro
NAPE - N-araquidonoil-fosfatidiletanolamina diacilglicerol
NAPE-PLDN - Fosfolipase D especfica que hidrolisa N-araquidonoil-fosfatidiletanolamina diacilglicerol
NMDA - N-metil D-Aspartato
NRM - Ncleo magno da rafe
NRPG - Ncleo reticular paragigantocelular
PBS - Tampo fosfato salino
PE - Tubo de polietileno
PEA - N-palmitoil-etanolamina
PFA - Paraformaldedo
RIPA - Radioimuno de precipitao
RVM - Regio bulbar rostro ventro medial
s.c. - Subcutneo
SNP - Sistema nervoso perifrico
SCP - Substncia Cinzenta Periaquedutal
SCPv.l. - Substncia cinzenta periaquedutal ventrolateral
SG - Substncia gelatinosa
SNC - Sistema nervoso central
TENS - Estimulao eltrica transcutnea do nervo
THC - 9- tetrahidrocanabinol
VEC - Veculo
VPL - Ventroposterolateral
- Alfa
- Beta
- Delta
l - Microlitro
g - Micrograma
2-AG - 2-Araquidonilglicerol
5HT - Serotonina
5-HT2 / 5-HT3 - Receptores serotoninrgicos
5HTAA - Araquidonoil serotonina
SUMRIO
1 INTRODUAO....................................................................................... 19
2 REVISO BIBLIOGRFICA................................................................. 20
2.1 CONSIDERAES SOBRE A DOR..................................................... 20
2.2 ESTIMULAO ELTRICA TRANSCUTNEA DO NERVO (TENS)... 25
2.3 SISTEMA ENDOCANABINIDE.......................................................... 30
2.3.1 Sistema endocanabinide na modulao da dor............................. 34
3 OBJETIVOS.......................................................................................... 37
3.1 OBJETIVO GERAL................................................................................ 37
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS.................................................................. 37
4 MATERIAIS E MTODOS..................................................................... 38
4.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAO........................................................ 38
4.2 DROGAS............................................................................................... 39
4.3 ADMINISTRAO DAS DROGAS........................................................ 39
4.4 INDUO DO MODELO DE DOR........................................................ 46
4.5 ADMINISTRAO DA ESTIMULAO ELTRICA TRANSCUTNEA DO NERVO (TENS)...............................................................................
47
4.6 AVALIAO DO LIMIAR NOCICEPTIVO............................................. 49
4.7 DELINEAMENTO DO ESTUDO............................................................ 51
4.8 ANLISE DE WESTERN BLOT............................................................ 53
4.9 IMUNOFLUORESCNCIA.................................................................... 54
4.10 ANLISE ESTATSTICA........................................................................ 55
5 RESULTADOS...................................................................................... 56
5.1 EFEITO DA INJEO DO TUMOR DE EHRLICH SOBRE O LIMIAR NOCICEPTIVO MECNICO DE RETIRADA DE PATA........................
56
5.2 EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA TENS DE ALTA E BAIXA FREQUNCIA.......................................................................................
57
5.3 EFEITO DO AM251 NA ANTINOCICEPO INDUZIDA PELA TENS DE BAIXA E ALTA FREQUNCIA.........................................................
59
5.4 EFEITO DO MAFP NA ANTINOCICEPO INDUZIDA PELA TENS DE BAIXA E ALTA FREQUNCIA.........................................................
64
6 DISCUSSO.......................................................................................... 72
7 CONCLUSO........................................................................................ 84
REFERNCIAS..................................................................................... 85
19
1 INTRODUO
A dor um mecanismo adaptativo de carter protetor que proporciona s
diversas espcies garantirem a sobrevivncia, uma vez que, so capazes de
reconhecer estmulos nocivos e desencadear respostas fisiolgicas e
comportamentais adequadas de proteo (WALTERS, 2009). Por outro lado, quando
esse sintoma se torna patolgico, prejudica consideravelmente a qualidade de vida e
estima-se que 30% da populao de um pas sofra com esse sintoma sendo
necessrio intervenes para controla-la. Sendo assim, o tratamento farmacolgico
atualmente o mais utilizado para minimizar os sintomas oriundos da dor, entretanto
esse recurso provoca muitos efeitos colaterais, alguns medicamentos so de difcil
acesso alm de possurem um alto custo financeiro. Nesse contexto, recursos no
farmacolgicos ganham destaque, uma vez que a grande maioria envolve baixo custo
financeiro, boa eficcia analgsica e pouqussimos efeitos colaterais. (PALCE et al.,
2010),
Dentro desses recursos no farmacolgicos, destaca-se a estimulao eltrica
transcutnea do nervo, que devido a sigla derivada do nome em ingls
(Transcutaneous Eletrical Nerve Stimulation) conhecido popularmente como TENS.
A TENS um mtodo no invasivo de fcil aplicabilidade e com resposta analgsica
comprovada (DESANTANA et al., 2009). Alm disso, a TENS consiste na aplicao
de estimulo eltrico a partir de eletrodos prprios colocados sobre a pele e
comumente utilizado no tratamento de dores agudas e crnicas (DESANTANA et al.,
2008).
Em relao a resposta analgsica proporcionada pela TENS, estudos sugerem
que esse efeito est relacionado tanto a nvel central quanto ao perifrico e os
mecanismos neurofisiolgicos so evidenciados principalmente pela liberao de
neurotransmissores endgenos e consequente ativao de seus respectivos
receptores. (VANCE et al., 2014).
No entanto, apesar de diversos estudos salientarem a eficcia analgsica
proporcionada pela TENS, os mecanismos envolvidos que explicam esse efeito
antinociceptivo ainda no esto completamente esclarecidos.
20
2 REVISO BIBLIOGRFICA
Os tpicos a seguir, apresentam o embasamento terico e contextualizaes
referentes aos temas de maior relevncia nesse estudo.
2.1 CONSIDERAES SOBRE A DOR
A cincia descreve a dor como uma modalidade sensorial importante na
evoluo do indivduo, cuja principal funo a comunicao de danos estruturais ou
funcionais do corpo, atravs de informaes concernentes localizao e
intensidade dos estmulos nocivos e potencialmente lesivos, de forma que alguma
reao de defesa possa ser tomada, evitando danos maiores e preservando a
integridade do indivduo (MILLAN, 1999).
Assim, a dor foi conceituada, em 1986, pela Associao Internacional para o
Estudo da Dor (IASP), como uma experincia sensorial e emocional desagradvel
que est associada com leses reais ou potenciais ou descrita em termos de tais
leses (MERSKEY, H.; BOGDUK, N, 1994).
Nesse sentido, essa reao pode ser considerada uma experincia subjetiva
complexa, que no envolve apenas a transduo de um estmulo nocivo ambiental,
mas tambm o processamento cognitivo e emocional pelo encfalo (JULIUS;
BASBAUM, 2001).
Nesse contexto, existe uma diferena conceitual quando utiliza-se os termos
nocicepo e dor. O primeiro conceito consiste na recepo e decodificao do
estmulo nocivo por estruturas altamente especializadas do sistema nervoso
denominados: nocieptores. Essas estruturas consistem em terminaes nervosas
livres associadas a fibras aferentes primrias (carreiam estimulo nociceptivo da
periferia medula) com caractersticas distintas (limiar de ativao e sensibilidade)
em relao a outras estruturas nervosas sensoriais. Entre essas fibras aferentes
temos as do tipo C e A, que possuem um menor calibre e esto relacionadas
transduo e conduo do estimulo nocivo, vale ressaltar que as fibras C so
file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_239file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_145
21
amielinizadas (ausncia de mielina, uma camada de revestimento rica em lipdios e
protenas que possuem ndulos de Ranvier o qual, proporcionam aumento da
velocidade de conduo do estimulo pela fibra) e as fibras A apresentam mielina e
possuem uma maior velocidade de conduo do impulso nervoso em relao a fibra
C (JULIUS; BASBAUM, 2001).
Na medula espinal, essas fibras aferentes primrias fazem sinapse com
neurnios de segunda ordem, que por sua vez, ascendem a reas supra-espinhais
por meio tratos neuronais especficos, como por exemplo, o trato espinotalmico.
Assim, os neurnios de segunda ordem faro no tlamo uma segunda sinapse com
neurnios de terceira ordem, os quais enviaro a informao nociceptiva at as reas
especficas do crtex cerebral, onde aspectos como intensidade, localizao e
durao do estmulo nociceptivo sero integrados e componentes afetivos e
emocionais sero interpretados e contextualizados, proporcionando a percepo da
dor (VANDERAH, 2007). Figura 1.
Figura 1- Via ascendente da nocicepo. Fonte: Adaptado de LONG-BALINOT, 2010. Nota: Os axnios das fibras aferentes primrias (C e A) que inervam as regies
perifricas transmitem o impulso nociceptivo at as lminas do corno dorsal da medula espinal, onde neurnios de segunda ordem repassam a informao para tratos neurais ascendentes.
22
Existem tambm as fibras A que so mielinizadas, mais calibrosas e detectam
estmulos incuos aplicados na pele, msculos e articulaes e em condies
fisiolgicas no so relacionadas transmisso dolorosa (JULIUS; BASBAUM,2001).
Em continuidade contextualizao da dor, de acordo com o protocolo de
terminologia bsica proposta pela IASP, existem terminologias que esto diretamente
relacionadas com essa sintomatologia como a hiperalgesia" que um termo
psicofsico utilizado para todas as condies que envolvem aumento da sensibilidade
dor. Como tal, essa definio correlaciona-se com o termo '' sensibilizao " que
uma reduo no limiar nociceptivo e um aumento na resposta a diferentes estmulos
supra limiares. tambm importante ressaltar a terminologia Alodnia, que
mediada pela ativao perifrica de receptores tteis, que tornam-se processadas por
caractersticas nociceptivas, sendo assim, h a percepo da dor em resposta a um
estmulo perifrico normalmente incuo (LOESER, 2008).
Em adio, a dor tambm pode ser classificada como: dor inflamatria (envolve
estruturas somticas, caracterizada por intensa hipersensibilidade); dor visceral
(caracterizada por ser profunda, mal localizada e, frequentemente referida a uma
regio cutnea) e dor neuroptica (envolvendo leses do sistema nervoso)
(SCHAIBLE, 2006).
importante tambm, a caracterizao temporal da dor, fazendo distino entre
dor aguda, que tipicamente surge do trauma de tecidos moles ou inflamao e est
relacionada com um processo adaptativo biolgico para facilitar o reparo tecidual e
cicatricial, ou dor crnica, que persiste alm do perodo esperado de uma doena ou
leso e tem sido arbitrariamente definida como aquela com durao maior que 3 a 6
meses (LAMONT; TRANQUILLI, 2000).
O fenmeno da dor dinmico, uma vez que, ao longo de todo trajeto nervoso,
as aferncias nociceptivas recebem inmeros estmulos excitatrios e inibitrios de
diferentes mecanismos de modulao da dor que podem ocorrer no sistema nervoso
perifrico (SNP) pela ao de neuromediadores como bradicinina, prostaglandina e
serotonina, e no sistema nervoso central (SNC) pela transmisso de
neurotransmissores como noradrenalina, serotonina, encefalina e dopamina (SOUZA,
2009).
Em relao esses mecanismos de modulao da dor, existem teorias como a
Teoria do Porto da Dor, (figura 2) a qual admite existir nos cornos posteriores da
medula espinal um mecanismo neuronal que atua como porto, podendo aumentar
23
ou diminuir impulsos provenientes de fibras aferentes nociceptivas perifricas s
regies supraespinais, ocorrendo ento uma resposta reguladora, mesmo antes de
acontecer a interpretao desse impulso como uma resposta dolorosa (MELZACK;
WALL, 1965; MILLAN, 1999).
De acordo com essa teoria, Melzack e Wall (1965), explicam que a ativao de
nocieptores perifricos e a consequente estimulao das fibras nociceptivas aferentes
que levam esse estimulo at o corno dorsal da medula, mais especificadamente na
lmina II (substncia gelatinosa- SG), pode ser inibida pela ativao de fibras tteis
do tipo A, as quais so muito mielinizadas e conduzem o estmulo mais rapidamente
que as fibras nociceptivas at essa rea da medula, onde iro ativar interneurnios
inibitrios, que por sua vez, iro modular e regular a sinapse entre as fibras aferentes
nociceptivas primarias e os neurnios de segunda ordem responsveis pela
transmisso do estmulo ao SNC, atravs do trato espinotalmico. Dessa maneira, o
estimulo aferente que anteriormente seria nociceptivo passa a ser minimizado e/ou
inibido.
Figura 2- Esquema representativo da teoria do porto da dor. Fonte: Adaptado MELZACK, 1999. Nota: ..... Observa-se as fibras no nociceptivas (A, A) ativando
.......... interneurnios na substncia gelatinosa (SG), os
...........quais inibem os impulsos provenientes das fibras
...........nociceptivas (A e C).
24
Outra teoria que enfatiza a modulao da dor est relacionada ativao a
nvel central de uma via inibitria descendente a partir da Substncia Cinzenta
Periaquedutal (SCP). Essa teoria foi inicialmente estudada por Reynolds (1969), o
qual observou que a estimulao eltrica na substncia cinzenta periaquedutal (SCP),
produzia analgesia intensa em ratos Wistar (TOKADA et al., 2004).
Sendo assim, quando a SCP estimulada, por meio dos prprios estmulos
nocivos ascendentes oriundos tambm do trato espinomesenceflico, ativa um circuito
que excita uma rea do bulbo denominada regio rosto ventro medial (RVM), que
compreende o ncleo magno da rafe (NRM) e o ncleo reticular paragigantocelular
(NRPG), a partir da, por fibras que percorrem o funculo dorsolateral da medula
espinal, formando conexes com interneurnios do corno dorsal na medula. Essas
clulas nervosas atuam modulando estmulos nocieptores ascendentes atravs da
liberao de neurotransmissores (figura 3), de modo que esse sistema inibitrio
descendente possa fazer parte de uma ala de retroalimentao reguladora, atravs
da qual a transmisso pelo corno dorsal controlada de acordo com os estmulos que
alcanam a regio do tlamo (MILLAN, 2002).
Figura 3- Via descendente inibitria da dor e principais reas envolvidas no controle descente. SCP:
Fonte: . adaptado de KANDEL,2000. Nota: .. SCP: substncia cinzenta periaquedutal; NRM: ..................ncleo magno da rafe; DRG: gnglio da raiz dorsal.
25
Alm desses controles endgenos para a modulao da dor, existem tambm
alternativas exgenas como a morfina, iniciada no sculo XIX, um alcalide isolado a
partir do pio, que representou um significativo avano dentro da terapia da dor. A
partir desse advento, com o desenvolvimento de novos analgsicos, e aps o
surgimento da seringa e da agulha em 1846, essas drogas comearam a ser utilizadas
para o controle da dor durante procedimentos cirrgicos e no cirrgicos. No entanto,
devido aos inmeros gastos econmicos e efeitos adversos oriundos da terapia
farmacolgica para o controle da dor, outros tipos de tratamentos, como os
tratamentos no farmacolgicos, tem obtido cada vez mais importncia os quais
destacam a cinesioterapia, hidroterapia, termoterapia e principalmente a estimulao
eltrica transcutnea do nervo (BONICA; LOESER, 2001).
2.2 ESTIMULAO ELTRICA TRANSCUTNEA DO NERVO (TENS)
A utilizao do estmulo eltrico para fins teraputicos, datada inicialmente
em 2.500 A.C., onde h evidncias de que os antigos egpcios usavam peixe
eltrognico para tratar doenas. Posteriormente, o mdico romano Scribonius Largus
creditado como primeiro a documentar a utilizao desses peixes eletrognicos para
esses fins em 46 D.C. Alm disso, com o desenvolvimento de geradores eletrostticos
no sculo XVIII, as pesquisas envolvendo o recurso eltrico aumentaram. Em 1858,
Francis, recebeu uma patente da Associao de estudo dos Cirurgies Dentistas dos
E.U.A, aps desenvolver um instrumento magntico vibratrio com corrente interrupta
que propiciava analgesia em seus procedimentos odontolgicos. Em seu trabalho ele
descreveu 164 extraes de dente indolores realizadas juntamente com a aplicao
dessa corrente. (KANE; TAUB, 1975).
Aps um longo perodo sem grandes estudos a respeito do uso de energia
elctrica para fins teraputicos, esse tema volta a despertar interesse em 1965,
suportado pela hiptese do mecanismo demonstrado por Melzack e Wall (1965), que
idealizaram a teoria das comportas. Essa teoria sugere a importncia da estimulao
de fibras no nociceptivas de maior calibre na modulao da dor. Nesse mesmo
enfoque, Wall e Sweet (1967), usando uma estimulao eltrica percutnea de alta
frequncia (50-100 Hz), observaram o alvio da dor crnica em pacientes. Alm disso,
file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_32
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Reynolds (1969), utilizou a corrente eltrica para estimular a SCP em ratos, concluindo
que a estimulao somente nesse local induziu analgesia, sem que o estmulo fosse
aplicado em todo o crebro.
Atualmente, a TENS tem sido o estmulo eltrico mais utilizado clinicamente com
objetivo de modular a dor. Esse recurso definido pela American Physical Therapy
Association como a aplicao de estmulos eltricos na superfcie cutnea para
controle lgico. A TENS trata-se de um aparelho amplamente utilizado na prtica
clnica fisioteraputica como terapia analgsica simples, o qual tem algumas
vantagens como no ser um tratamento farmacolgico e invasivo, alm de possuir
baixo custo financeiro. (SLUKA et al. 2003).
De acordo com Orange (2003), a TENS um recurso seguro que modula a dor,
favorecendo ao indivduo a execuo de suas atividades de via diria. Sua
aplicabilidade consiste de um estimulador sensitivo, pelo qual os impulsos da corrente
so transmitidos atravs da pele por meio de eletrodos com auxlio de gel a base de
gua para no haver interrupes nessa transmisso.
Segundo Claydon e colaboradores (2011), essa supresso da dor
proporcionada pela TENS, pode ocorrer a nvel perifrico atravs de ativao de
receptores noradrenrgicos do tipo 2A ou de receptores opiidergicos do tipo , os
quais uma vez ativados podem modular a excitabilidade de fibras nociceptivas
aferentes primrias.
Quando verificado a atuao da TENS a nvel medular, aps a aplicao,
principalmente da alta frequncia, h uma reduo da liberao de
neurotransmissores excitatrios como glutamato e substncia P, em ratos com
modelo de inflamao intra articular (joelho) por carragenina. A reduo de glutamato
revertida pelo bloqueio espinal de receptores com a administrao i.t de naltrindole
(antagonista receptor opiides) (SLUKA et al., 2005). No entanto, a nvel supra
medular, a antinocicepo ocorre principalmente pela estimulao da via inibitria
descendente da dor, com consequente ativao de receptores opiides, gabargico,
serotoninrgicos e muscarnicos no corno dorsal da medula (VANCE et al., 2014);
Esse esclarecimento elucidado com o bloqueio dos receptores opiides
(DeSANTANA et al., 2009), dos receptores GABA, de serotonina (5-HT2A e 5-HT3) e
dos receptores colinrgicos (M1 e M3), por meio da injeo i.t. na medula espinal de
ratos, onde verificaram reverso do efeito antinociceptivo proporcionado pela TENS
(RADHAKRISHNAN et al., 2003).
27
Sendo assim, umas das primeiras teorias mais vigentes para justificar o
mecanismo de analgesia proporcionado pela TENS a teoria das comportas. Em
concordncia com essa teoria, estudos sugerem que a TENS estimula as fibras
sensoriais do tipo A e proporciona analgesia atravs da ativao dos interneurnios
inibitrios situados no corno dorsal da medula. Esse processo de reduo ou
minimizao da transmisso da dor conhecido como neuromodulao (YAKSH et
al., 1994; SLUKA; WALSH, 2003).
Dando nfase na analgesia proporcionada pela TENS pela ativao da teoria
das comportas, Woolf e Thompson (1994), sugerem que as caractersticas
eletrofisiolgicas da TENS relacionam-se a parmetros como a frequncia utilizada,
durao do pulso e tempo de aplicao. A alterao desses parmetros pode ativar
de maneira seletiva diferentes fibras nervosas, alm de promover estmulos
musculares que tendem a produzir resultados analgsicos de caractersticas
temporais diferentes, principalmente por meio da ativao de fibras nervosas de maior
dimetro como A e A que tm baixo limiar de ativao a estmulos eltricos quando
comparada com fibras de menor dimetro (A e C) (WOOLF E THOMPSON, 1994).
Alm da teoria das comportas, alguns estudos mostram que a TENS capaz de
ativar o sistema descendente inibitrio da dor e modular a atividade dos neurnios
envolvidos na transmisso de impulsos nociceptivos situados no corno dorsal da
medula pela liberao de opiides endgenos (SLUKA et al., 2003; CARROL et al.,
2005).
Para proporcionar esse efeito, a TENS possui parmetros que so utilizados de
acordo a especificidade do tratamento. Inicialmente, a TENS era classificada em
quatro modalidades: convencional (apresentando baixa intensidade e alta frequncia,
entre 10 a 200 Hz), acupuntura (alta intensidade e baixa freqncia, entre 2 a 4 Hz),
burst (alta intensidade e freqncia entre 70 e 100 Hz, com modulaes de pulso de
0,5ms) e breve-intensa (alta intensidade e freqncia entre 100 e 150 Hz).
Atualmente, h uma tendncia em classific-la em apenas de baixa frequncia
(50Hz) (DESANTANA et al., 2008).
Em relao s essas frequncias, estudos sugerem que quando utilizada a alta
frequncia h uma atuao das fibras A, com consequente ativao da teoria das
comportas a nvel medular (SLUKA et al., 2003). Estudo realizado por Lee e
colaboradores (1985), investigou a inibio de clulas do trato espinotalmico pela
TENS em sete macacos anestesiados. As clulas desse trato eram ativadas por
28
estimulao do nervo fibular comum em uma intensidade supra limiar para fibras C.
As respostas evocadas por essas fibras eram comparadas antes, durante e aps a
aplicao da TENS durante cinco minutos. Em quatorze clulas do trato
espinotalmico, alguns graus de inibio de fibras C ocorriam somente quando a
intensidade da TENS excedia o limiar de fibras A. Para algumas intensidades de
estimulo, pulsos de baixa freqncia, eram mais efetivos que os de alta frequncia.
De acordo com esse trabalho, a TENS era mais efetiva quando aplicada dentro do
campo receptivo dessas clulas e que a ativao de fibras do tipo C, registrada a partir
do nervo perifrico, no foi reduzida em magnitude, e no houve mudanas em sua
latncia devido a TENS. Com isso, a inibio da atividade de clulas do trato
espinotalmico no foi alterada apreciavelmente aps injeo do cloridrato de
naloxona. Esse estudo sugere que a TENS pode produzir inibio no sistema nervoso
central (SNC), por ativarem fibras aferentes A e que os efeitos inibitrios da TENS
nas clulas do trato espinotalmico ocorreu devido a um mecanismo que no
envolvesse liberao de substncias opiides endgenas.
Abrangendo ainda a relao das frequncias na analgesia proporcionada pela
TENS, Salar e colaboradores (1981), demonstraram que a TENS de alta frequncia
aumenta a concentrao de endorfinas na corrente sangunea e no lquido
cefalorraquidiano e metionina-encefalina no liquido cefalorraquidiano, em humanos.
Alm disso, antinocicepo produzida pela TENS de alta frequncia foi inibida
pelo bloqueio de receptores opiides, muscarnicos (M1 e M3) e receptores para
GABA na medula espinal. J, a reduo da hiperalgesia pela TENS de baixa
frequncia foi inibida pelo bloqueio dos receptores opiides, GABAA,
serotoninrgicos (5-HT3) e muscarnicos (M1 e M3) nesse mesmo local (DeSANTANA
et al., 2009; RADHAKRISHNAN et al., 2003, KALRA et al., 2001, SLUKA et al., 1999).
Assim, esses estudos sugerem que a TENS alta e baixa freqncia
proporcionam seus efeitos antinociceptivos pela ativao dos receptores
muscarnicos, e opiides e na medula e receptores e na RVM. Alm disso, a
TENS de baixa frequncia liberta serotonina na medula espinal e ativa os receptores
serotoninrgicos 5HT2 e 5HT3, e a TENS de alta freqncia libera GABA que ativa
receptores GABAA. Contudo, ambas as frequncias, reduziram a sensibilizao
neuronal no corno dorsal da medula e a consequente hiperalgesia (MA E SLUKA,
2001). Em suma, a TENS de alta e baixa frequncia utilizam mecanismos opiides
29
para produzir analgesia pela ativao de neurnios na SCP, na RVM e na medula
espinal (DeSANTANA et al., 2009) (Figura 4).
Figura 4 Ilustrao dos possveis caminhos ativados pela TENS de ....................baixa freqncia (TB) ou de alta frequncia (TA). Fonte: ........Adaptado DESANTANA et al., 2009. Nota: ..........Projees da substncia cinzenta periaquedutal ventrolateral ...........v.......(SCPv.l.) enviam informaes para a medula rostro ventro ....................medial (RVM), que por sua vez envia projees para a medula ....................espinal promovendo a modulao da nocicepo. ....................Receptores envolvidos na antinocicepo produzida pela ....................TENS so listados em cada local. 5HT- serotonina; ASP- ....................aspartato; GABA - cido aminobutrico; Glu- glutamato; M -...................receptor muscarnicos.
Entretanto, vale ressaltar que o bloqueio dos receptores serotoninrgicos ou
noradrenrgicos na medula espinal no alterou a reverso da hiperalgesia produzida
pela TENS de alta frequncia (RADHAKRISHNAN et al., 2003).
Desse modo, novas vias envolvidas na antinocicepo proporcionada pela TENS
podero ainda ser descobertas. Seguindo esse raciocnio, o presente estudo objetivou
30
investigar a participao do Sistema Endocanabinide no efeito antinociceptivo
induzido pela TENS em modelo de dor inflamatria.
2.3 SISTEMA ENDOCANABINIDE
Um dos primeiros indcios do uso teraputico de canabinides foi descrito por
Carolus Linnaeus em 1753, o qual relatou que a folha e a flor da Cannabis sativa eram
utilizadas para uso medicinal h milhares de anos. A Cannabis sativa possui mais de
60 compostos terpenofenlicos denominados canabinides, cujo, o principal princpio
ativo o 9- tetrahidrocanabinol (THC). Esse princpio ativo possui uma caracterstica
lipoflica e por esse motivo acreditavam-se, a princpio, que seu mecanismo de ao
seria proporcionado pela interao e modificao da fluidez da membrana plasmtica.
(WILSON; NICOLL, 2002).
No entanto, Howlett (1984), demonstrou que os canabinides possuam um
outro meio de atuao. Atravs da cultura de neuroblastoma observou que havia uma
diminuio da quantidade de AMPc (Adenosina Monofosfato Cclico), um mediador
intracelular caracterizado como um segundo mensageiro que regula muitos aspectos
da funo celular, incluindo enzimas envolvidas no metabolismo energtico, diviso e
diferenciao celular, transporte de ons etc. (HADLEY, 1988). Sugerindo assim, que
a ao dos canabinides fosse por meio de receptores acoplados a protena G.
(HOWLETTET al., 2004).
Novos estudos direcionaram para esse achado e a existncia do sistema
canabinide endgeno foi inicialmente investigada em 1988, por meio da tcnica de
radioimunoensaio realizada em crebros de ratos, que demonstrou a ligao
consistente de um canabinide exgeno a um receptor associado a um sistema de
segundo mensageiro, por meio da protena G. Alm disso, a saturabilidade dessa
ligao consistente com valores reportados para canabinides (DEVANE et al.,
1988).
Logo em seguida, Matsuda e colaboradores (1990), relataram a clonagem e
expresso de um DNA complementar, a partir do crebro de ratos, que codificou um
receptor acoplado a protena G, o qual apresentava todas as propriedades
direcionadas para canabinides (natureza hidrofbica, envolvimento com a protena
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G, e maior responsividade para canabinides psicoativos). A partir dessa descoberta,
sugeriu-se ento, a relao de canabinides com a superfamlia dos receptores
acoplados protena G, o qual negativamente acoplado ao Adenilil Ciclase (AC),
podendo inibir a converso do ATP (Trifosfato de Adenosina) em Monofosfato cclico
de adenosina (AMPc) e, consequentemente, inibir a abertura de canais de clcio
voltagem-dependente (MATSUDA et al., 1990).
A partir de ento, ocorreu a descoberta do primeiro receptor canabinide, o qual
foi descrito como receptor para canabinide do tipo 1 (CB1). Dogrul e colaboradores
(2012), verificaram que a expresso do CB1 mais significativa no sistema nervoso
central (SNC), principalmente nas regies cerebrais envolvendo crtex, hipocampo,
amigdala, gnglios basais, substncia negra reticular, globo plido e cerebelo. Alm
disso, so encontrados tambm em reas que esto envolvidas na transmisso e
modulao da dor, como na SCP, bulbo rostro ventromedial e no corno dorsal da
medula.
No entanto, estudos mostram que h existncia desses receptores tambm na
periferia, mais precisamente na glndula adrenal, tecido adiposo, corao, fgado,
pulmo, prstata, tero, ovrio, testculo, medula ssea, timo e tal dispem-se
preferencialmente pr-sinapticamente nos axnios e terminais de neurnios,
mediando a inibio da libertao de neurotransmissores (HOHMANN; HERKENHAM,
1999; GUINDON, 2009).
Com novos estudos e investigaes desse sistema, foi descoberto
posteriormente um segundo receptor para canabinide (CB2), localizado
principalmente em regies do sistema imune responsveis pela produo e regulao
de clulas imunes (mastcitos, clulas B, clulas T4 e T8, e macrfagos), como em
bao, amigdalas e timo (PERTWEE; ROSS, 2002; VAN SICKLE et al 2005).
Alm disso, estudos utilizando ferramentas farmacolgicas e genticas apontam
para a existncia de outros receptores canabinides, entretanto so necessrios mais
trabalhos para sustentar essa hiptese. (DOGRUL et al., 2012).
Com a descoberta dos receptores canabinides, questionamentos para
possveis ligantes endgenos ficaram em aberto. Nesse contexto, foi isolado o
primeiro endocanabinide" a partir de tecido cerebral, descrito como Anandamida
(AEA). Logo em seguida, outros endocanabinides foram isolados, principalmente o
2-Araquidonilglicerol (2-AG). (DEVANE et al., 1992, MECHOULAM et al., 1995).
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Ambos AEA e 2-AG se ligam aos receptores para canabinides do tipo CB1 e CB2,
apresentando diferentes afinidades e eficcias (HOWLETT, 2002).
Esses endocanabinides so caracterizados como molculas de sinalizao
para lpidos endgenos sintetizados na membrana celular (DI MARZO, 2008).
Segundo Jin e colaboradores (2009), diferentes enzimas esto envolvidas na sntese
de AEA e 2-AG. Estudos anteriores salientavam que a clivagem enzimtica de
endocanabinides fosse somente de um precursor fosfolpide, o N-araquidonoil-
fosfatidiletanolamina (NAPE), que quando hidrolisado por uma fosfolipase D
especfica (NAPE-PLD) originava a AEA. No entanto, camundongos Knockout NAPE-
PLD no mostraram dficit na produo de AEA, sugerindo possivelmente que outras
enzimas possam estar envolvidas na biossntese desse endocanabinide (LEUNG et
al., 2006; LIU et al., 2008).
Em relao a biossntese do 2-AG, esse sintetizado a partir da hidrlise do seu
precursor diacilglicerol (DAG) pela enzima diacilglicerol lipase (DAGL) (BISOGNO,
2003).
Esse processo de biognese de endocanabinides regulado mediante fatores
intrnsecos como a despolarizao da membrana, aumento no nvel de clcio
intracelulares e o estmulo nos receptores para canabinides. (DI MARZO, 2008).
Em conjunto, os endocanabinides possuem propriedades canabimimeticas e
aps sintetizados ligam ou ativam um ou mais subtipos de receptores (AEA
preferencialmente a CB1). Desse modo, eles esto envolvidos em diferentes funes
fisiolgicas, como a regulao da ingesto alimentar, imunomodulao, inflamao,
analgesia, comportamentos e outras (DI MARZO; DE PETROCELLIS, 2006).
Em suma, a partir da sua sntese no neurnio pssinptico, os
endocanabinides so liberados na fenda sinptica de acordo com o aumento de
clcio intracelular. Logo em seguida, ativam os receptores CB1 e CB2 no neurnio pr-
sinpticos, por meio de um mecanismo de sinalizao retrograda, restringindo a
atividade neuronal, com consequente inibio de alguns neurotransmissores, como o
glutamato. Aps ativarem seus receptores, a AEA e 2-AG so removidos da fenda
sinptica e direcionadas para dentro do neurnio ps e pr-sinptico, por meio de uma
protena de membrana com funo recaptadora (SAITO et al., 2010).
Depois de recapturados aos seus respectivos neurnios, os endocanabinides
sero metabolizados. O metabolismo desses endocanabinides (AEA e 2-AG)
ocorrem atravs de hidrlise enzimtica, pela ao da cido graxo amino hidrolase
33
(FAAH) e pela monoacilglicerol lipase (MGL) (GIUFFRIDA et al., 2001; KARLSSON et
al., 1997) (Figura 5).
Em adio, estudos verificaram que a administrao de inibidores da FAAH e
de MGL, promoveu aumento da expresso de endocanabinides (AEA e 2-AG
respectivamente). Alm da administrao desses inibidores enzimticos, antagonistas
e agonistas de receptores para canabinides podem auxiliar em estudos a respeito da
ativao desse sistema e as diversas funes por ele desempenhada (HOWLETT,
2002).
Figura 5 - Representao esquemtica do sistema endocanabinide. Fonte: .......Adaptado de Sato et al., 2010. Nota: ........AEA: Anandamida/ 2- AG: 2 Araquidonilglicerol / FAAH: cido Graxo ..................Aminohidrolase / MGL: Monoacilglicerol Lipase/ TRPV1: Receptor Vanilide ..................de Potencial Transitrio do Tipo 1 / CB1-CB2: Receptores canabinides tipo ..................1 e tipo 2.
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2.3.1 Sistema endocanabinide na modulao da dor
Os receptores para canabinides e endocanabinides, bem como as enzimas
que controlam sua sntese e degradao, esto localizados em vrios nveis do neuro-
eixo, envolvendo estruturas tanto da periferia quanto do SNC (Hohmann, 2002).
Sendo assim, Tsou e colaboradores (1998) descrevem a localizao dos
endocanabinides e seus respectivos receptores na via de modulao da dor,
principalmente em locais como como SCP, NMR, ncleo reticular paragigantocelular
e corno dorsal da medula espinal.
A participao desse sistema nessas regies tambm foi relatada por Martin e
colaboradores (1996), aps administrarem por via intravenosa, o agonista canabinide
WIN 55,212-2, que suprimiu a atividade de neurnios presentes no ncleo
ventroposterolateral (VPL) do tlamo, evocada por estmulo nocivo mecnico aplicado
de maneira gradual sobre a pata em ratos.
Alm disso, a analgesia induzida por estresse, em um modelo de estmulo
eltrico aplicado nas patas de ratos, foi correlacionada com o aumento da expresso
de 2-AG e AEA, principalmente na SCP (HOHMANN et al., 2005).
Outras reas de modulao do impulso nociceptivo, como o NMR e o ncleo
paragigantocelular, tm demostrado considervel importncia na analgesia frente a
agonistas canabinides sintticos, uma vez que, a administrao direta desses
agonistas nessas reas, aumentou a latncia da retirada da cauda no teste tail-flick,
correlacionando esse efeito antinocicepo. No entanto, a administrao desses
agonistas na regio ventrolateral ou anterior da SCP no alterou a latncia de retirada
da cauda (MARTIN et al.,1998).
Em adio, estudos eletrofisiolgicos tambm tm auxiliado a desvendar a
participao dessas reas no mecanismo da antinocicepo induzida por essas
substncias. Esses registros tm fornecido uma evidncia direta que os canabinides
exgenos podem modular as clulas ON OFF, situadas no bulbo rostro ventromedial
(RVM) do tronco enceflico, as quais aumentam ou inibem o impulso nociceptivo
(MENG; JOHANSEN, 2004).
Meng e colaboradores (1998), demonstraram tambm que a antinocicepo
produzida em ratos aps a administrao i.v. de WIN55,212-2 (agonista do receptor
canabinide), foi bloqueada nos animais que receberam uma pr microinjeo na
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RVM de muscimol (agonista do receptor GABAA) quando comparado ao grupo
controle, formado por animais que no receberam o muscimol. Sugerindo uma
interao entre os sistemas gabargico e canabidinoidrgico na via descendente da
dor, uma vez que quando ativado o sistema gabargico, no h atividade
canabinoidrgica. Alm disso, estudos tem demonstrado que os receptores CB1
inibem a ao inibitria do GABA na SCP, facilitando a ativao da via descendente
da dor.
A nvel medular, quando investigado por meio de um ensaio de
imunofluorescncia, observou-se a presena expressiva do receptor CB1,
principalmente nas lminas I e II da medula espinal, sugerindo a importncia dessa
rea como um stio de atuao dos endocanabinides, com consequente funo de
modulao do processamento nociceptivo (FARQUHAR-SMITH et al., 2000).
Borsani e colaboradores (2007), sugerem que esse a AEA, assim como
receptor CB1, tambm esto envolvidos na modulao da dor a nvel medular, uma
vez que o aumento da expresso de c-fos (um marcador da ativao neuronal) no
corno dorsal da medula, induzida pelo teste da formalina (teste algesimtrico
caracterizado pela injeo de um agente lgico na pata de roedores, os quais
respondem lambendo a pata testada), foi reduzido pelo pr-tratamento com o AM 404
(inibidor da recaptao de Anandamida).
Alm disso, Petrosino e colaboradores, (2007), encontraram um aumento dos
nveis de AEA e 2-AG tanto na medula espinal quanto em regies supra medulares
como o ncleo dorsal da rafe, SCP e RVM, aps induo de neuropatia em ratos.
Sugerindo que esses endocanabinides so regulados positivamente durante uma
constrio do nervo citico.
Perifericamente, um estudo utilizando a tcnica de imunohistoquimica,
demonstrou a existncia de receptores de canabinides tanto CB1 quanto CB2 na pele
humana, mais precisamente em algumas estruturas como: fibras nervosas da pele,
mastcitos, glndulas sudorparas e clulas sebceas. Sugerindo a presena desse
sistema a esse nvel (STNDER et al., 2005).
Ao investigar antinocicepo, Mitrirattanakul e colaboradores (2006) tambm
evidenciaram o envolvimento do sistema endocanabinide a nvel perifrico. Isso foi
demonstrado aps a induo de neuropatia em ratos, onde receptores para
canabinides e seus ligantes endgenos apresentaram uma maior expresso no
gnglio da raiz dorsal dos nervos perifricos ipsilateral leso.
file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_95
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Romero e colaboradores (2013), demonstraram que endocanabinides (AEA e
N-palmitoil-etanolamina - PEA) promoveram antinocicepo perifrica pela ativao
de receptores CB1 e CB2. Alm disso, os autores verificaram que esse efeito est
relacionado com a ativao do sistema noradrenrgico endgeno, por meio da
ativao de receptores adrenrgicos perifricos pela liberao de noradrenalina
endgena. Para isso, foi demonstrado que, os antagonistas de adrenoceptores
seletivos (2C rauwolscine; propranolol) e no seletivos (2- ioimbina; 1
prazosina) promoveram um bloqueio dessa antinocicepo induzida pela AEA e PEA.
Assim, sabendo que o sistema endocanabinide tem um papel importante na
antinocicepo, esse estudo investigar a hiptese de sua participao na
antinocicepo induzida pela TENS.
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3 OBJETIVOS
Nesse captulo delinearemos os objetivos propostos para esse estudo
3.1 OBJETIVO GERAL:
- Investigar a participao do sistema endocanabinides na antinocicepo
...induzida pela TENS de alta e baixa frequncia em modelo de dor.
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:
a) Investigar farmacologicamente a participao de receptores para
.......canabinides do tipo 1 e de endocanabinides no efeito antinociceptivo
.......induzido pela TENS de alta e baixa frequncia;
b) ..Avaliar a expresso de receptores canabinides do tipo 1 ao nvel perifrico
......e central aps a aplicao da TENS em modelo de hiperalgesia inflamatria;
c) Verificar a co-localizao de receptores canabinides do tipo 1 ao nvel
......perifrico e central aps a aplicao da TENS em modelo de hiperalgesia
......inflamatria.
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4 MATERIAIS E MTODOS
Esse projeto foi aprovado e conduzido de acordo com a Comisso de tica no
Uso de Animais (CEUA), da Universidade Federal de Alfenas (UNIFAL) / Minas
Gerais/ Brasil, sob o protocolo n: 557/2014.
4.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAO
Para a realizao dos experimentos utilizamos camundongos macho Swiss,
pesando entre 25 e 30 g, provenientes do biotrio central da Universidade Federal de
Alfenas (UNIFAL). Esses animais foram mantidos em condies controladas de
temperatura (232C) e luminosidade (ciclo claro/escuro de 12 horas, luzes acesas s
7:00h), com livre acesso rao e gua antes dos experimentos. Os animais foram
transferidos do biotrio para a sala de ambientao no mnimo dois dias antes dos
experimentos e agrupados em um nmero mximo de 4 a 6 animais por caixa.
Os experimentos foram realizados aproximadamente entre 7:00 e 15:30 horas
em sala silenciosa, mantendo o controle da temperatura a 23C. Para isso, a medida
basal do limiar nociceptivo era realizada as 8:00, em seguida administrado i.pl. o tumor
de Ehrlich e aps duas horas e meia os camundongos eram anestesiados para
aplicao da TENS, por vinte minutos. Os limiares nociceptivos seguintes foram
mensurados aproximadamente s 11:30, 13:30 e 15:30, que equivalem
respectivamente terceira, quinta e stima hora aps a injeo do modelo de dor.
Os animais foram divididos em grupos homogneos e subdivididos em:
Controles (caracterizado por injeo intraplantar (i.pl.) de salina ou veculo (VEC) e
com Clulas (caracterizado pela injeo i.pl. do Tumor de Ehrlich conforme protocolo
descrito adiante). Tambm foram utilizados grupos similares aos descritos
anteriormente, porm estes receberam drogas pr-injetadas pelas vias; i.pl., intratecal,
(i.t.), ou intra Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l.), o
antagonista do receptor para canabinide do tipo 1 (CB1) ou o inibidor do cido graxo
amino hidrolase (FAAH).
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4.2 DROGAS
Para a investigao da participao de receptores canabinides e
endocanabinides na antinocicepo induzida pela TENS foram utilizadas as
seguintes drogas:
- AM 251 (N-(peperidina-1-il) -5-(4-iodofenil) -1-(2,4-diclorofenil) -4-metil-1H-
pitazole-3-carboixamida) (TOCRIS - USA): Antagonista para o receptor CB1. Diludo
em soluo salina (0,9%) com 2% de DMSO.
- 15; 30; 60 l (i.pl.);
- 0,5; 1,0; 2,0 l (i.t.);
- 0,5; 1,0; 2,0 l - (i.SCPd.l.)
- MAFP (cido metil araquidonil fluorfosfano/ (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5, 8, 11, 14-
eicosatetraenil-metil ester fosfofluordrico) (TOCRIS - USA): inibidor do cido graxo
amino hidrolase (FAAH). Diludo em salina (0,9%) com 3% de lcool.
- 0,5; 1,0; 2,0 l (i.pl.);
- 0,25; 0,50; 1,0 l (i.t.);
- 0,1; 0,2; 0,4 l (i.SCPd.l.)
4.3 ADMINISTRAO DAS DROGAS:
As drogas utilizadas nesse estudo foram administradas em trs diferentes vias:
- Via intraplantar (i.pl.): Essa via foi utilizada para verificar a participao ao
nvel perifrico do receptor CB1 e endocanabinides na antinocicepo induzida pela
TENS. Para esse procedimento foi utilizada uma seringa hipodrmica com agulhas
13 x 0.4 mm (BD, Brasil), pela qual as drogas foram injetadas na regio plantar da
pata direita do animal, no volume de 0,05 ml. Para os grupos controle, foram
administrados soluo salina (0.9%), ou seu respectivo veculo diluente, no mesmo
volume. Para tal procedimento, os animais foram anestesiados com isoflurano 2%,
por meio de um sistema de analgesia inalatria utilizando um vaporizador calibrado, a
pata direita foi previamente limpa com lcool etlico (70%) e cuidadosamente
posicionada para a administrao da droga conforme demonstrado na figura 6:
40
Figura 6- Administrao intraplantar das drogas.
Fonte: ......Do autor
- Via intratecal, (i.t.): Essa via foi utilizada para verificar o possvel envolvimento de
endocanabinides e do receptor CB1 na antinocicepo induzida pela TENS a nvel
medular. Previamente administrao das drogas, foi realizado tricotomia na regio
dorsal (lombar), ento, os animais foram anestesiados por inalao de isoflurano (2%)
(CRISTLIA, Brasil), atravs de um sistema de analgesia inalatria utilizando um
vaporizador calibrado. Para tal administrao, os animais foram posicionados de
forma que a palpao dos espaos intervertebrais fosse facilitada (figura 7). Logo em
seguida, uma injeo no volume de 5 l, foi feita atravs de uma agulha 13 x 0,3 mm,
acoplada a uma seringa hipodrmica (BD, Brasil) diretamente no espao
subaraquinide, entre a quinta e a sexta vrtebra lombar (HYLDEN; WILCOX ,1980)
Esse volume foi o mesmo administrado, tanto para as drogas quanto para seus
respectivos veculos diluentes.
Previamente a esse procedimento e com o objetivo de assegurar a
administrao correta das drogas, foi realizado um treinamento prvio para o
aprimoramento dessa tcnica com a injeo de 0,5 l de lidocana (2%). Como
resposta positiva da administrao i.t., observava-se a paralisia dos membros
posteriores dos animais (RADHAKRISHNAN et al., 2003).
41
Figura 7 - Via de administrao intratecal. Fonte:....... Do autor Nota: Mostrando o posicionamento do animal e ..................o local da injeo de acordo com Hylden ..................e Wilcox (1980).
- Via Intra Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l.): A escolha
dessa via foi com a finalidade de investigar o possvel envolvimento supra-medular de
endocanabinides e do receptor CB1 na antinocicepo induzida pela TENS. Para
tal, foi realizada uma neurocirurgia estereotxica, que baseia-se inicialmente no
deslocamento tridimensional de um ponto obedecendo coordenadas determinadas,
que permitem a projeo espacial deste ponto (bregma), e a localizao precisa de
qualquer estrutura por ele representada. usada quando se deseja atuar
especificadamente sobre uma determinada estrutura enceflica. Para isso, a cirurgia
foi realizada com auxlio de um aparelho estereotaxico digital (STOELTING CO,
WOOD DALE, USA). (Figura 8)
42
Figura 8- Equipamento de estereotxico utilizado no ...............experimento
Fonte: ....do autor
Para a realizao do procedimento cirrgico (estereotaxia) e a microinjeo das
drogas, os animais foram previamente anestesiados com uma soluo contendo
quetamina (0,5 ml), xilasina (0,25 ml) e salina (3,0 ml), injetadas intraperitonealmente
(i.p.) em um volume de 0,1 ml/kg. Aps confirmada anestesia, foi realizada uma
tricotomia da regio superior da cabea do animal, que permanecia posicionado e
fixado no estereotxico por meio de duas barras auriculares (figura 9).
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Figura 9- Posicionamento do camundongo para ..................cirurgia estereotxica. Fonte: .....,.Do autor. Nota: ........Lateralmente cabea em amarelo as ................. barras auriculares de fixao
Aps posicionados, os animais foram ento submetidos a um implante craniano
de cnula-guia (26-gauge) de 7 mm de comprimento, sendo essa posicionada com
ngulo de 26, SCPd.l. A cnula foi fixada ao crnio do animal por meio de um cimento
acrlico auto polimerizante incolor clssico (JET- SO PAULO/ BRASIL). As
coordenadas estereotxicas para implantao da cnula-guia na SCPd.l. foram
definidas de acordo com o Atlas de Franklin e Paxinos (1997) (figura 10): Antero
posterior (AP)= - 4,1 mm; lateral (L)= -1,4 mm e ventral (V)= -2,3 mm, ao Bregma.
Uma cnula de menor dimetro (mandril) foi inserido dentro da cnula-guia para evitar
problemas com obstruo e para reduzir contaminao.
Logo aps a estereotaxia, os camundongos receberam administrao de 0,1
ml, intra muscular (i.m) de pentabitico (17 mg / 1ml de salina) e cetoprofeno
(0,1ml/10g) sub cutnea (s.c.) e foram devidamente colocados em caixas individuais
at a recuperao total ps cirrgica de cinco dias.
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O procedimento de microinjeo das drogas i.SCPd.l. foi realizado no 5 ou 6
dia aps o procedimento cirrgico. A agulha de injeo (33-gauge), cujo comprimento
ultrapassa em 1,0 mm a ponta da cnula-guia, foi inserida dentro da mesma para a
infuso. A agulha de injeo foi conectada, por meio de tubo de polietileno (PE-10),
microseringa Hamilton Company (EUA) de 5 l. Em seguida foi injetado 0,2 l
durante um perodo de 45 segundos. O fluxo de infuso da droga foi confirmado pelo
movimento de uma pequena bolha de ar no tubo de polietileno antes, durante e depois
da microinjeo (NUNES-DE-SOUZA et al, 2000).
Aps o trmino do experimento todos os animais receberam injeo central de
0.2 l de uma soluo de 1% de azul de metileno, pelos mesmos procedimentos
descritos para a injeo de drogas. Logo em seguida, os animais foram anestesiados
com 1 ml de Tribromoetanol 2,5% (TBE), perfundidos transcardialmente com soluo
de formalina (10%) e em seguida decapitados. Seus crebros foram removidos e
colocados em recipientes contendo soluo de formalina (10%) e posteriormente,
utilizando o micrtomo (criostato SLEE - MNT), foram cortados em seces coronais
ao longo do trajeto da cnula. A inspeo da localizao correta da injeo foi
realizada atravs visualizao da disperso do azul de metileno na rea de interesse,
que indica local correto da injeo central de drogas (Figura 11). Os animais cujo as
injees no atingiram a SCPd.l., de acordo com Atlas de Franklin e Paxinos (1997),
foram excludos do estudo.
45
Figura 10- Ilustrao do altas Franklin e Paxinos (1997). Fonte:........ Atlas FRANKLIN; PAXINOS (1997)
Nota: ......... Seta indicando a Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral
Figura 11- Representao da injeo de azul de metileno ................. na SCPd.l.
Fonte: ......Do autor
46
4.4 INDUO DO MODELO DE DOR
Para esse procedimento foi utilizado o tumor de Ehrlich, um carcinoma mamrio
de camundongo fmea, caracterizado por ser uma neoplasia transplantvel de origem
epitelial maligna, transplantado pela primeira vez por Paul Ehrlich (EHRLICH;
APOLAND, 1905).
Esse tumor bem utilizado em estudos experimentais in vivo. Para tal,
importante o conhecimento prvio da quantidade e caractersticas das clulas
tumorais que sero inoculadas, a rapidez no desenvolvimento da neoplasia j que a
forma asctica atinge seu pico de proliferao no stimo dia, enquanto na forma slida
seu pico ocorre no dcimo quarto. Desse modo, tais caractersticas peculiares desse
tumor proporcionam uma vantagem sobre os demais modelos utilizados. (SILVA,
2006).
O tumor de Ehrlich induzido pelo transplante de clulas tumorais procedentes
de outro animal com a neoplasia desenvolvida, podendo ser inoculado diretamente no
peritnio do animal receptor, desenvolvendo a forma asctica, ou diretamente por via
subcutnea ou coxim plantar, desenvolvendo, assim, a forma slida do tumor de
Ehrlich (RAMALHO et al., 2010).
Para o preparo das clulas tumorais que foram utilizadas nesse trabalho,
realizou-se primeiramente a lavagem e a contagem das clulas. O mtodo de
inoculao empregado foi proposto por Dagli e colaboradores (1992). Para tal, foram
retirados 3,0 ml de fluido ascstico de um camundongo pr-inoculado a 7 dias com o
tumor de Ehrlich na cavidade peritoneal. Esse fluido foi centrifugado at a obteno
de um lquido denso e claro, correspondente a uma suspenso celular com o mnimo
de fibrina e hemcias. Seguiu-se, ento, a contagem das clulas tumorais.
O nmero total de clulas foi determinado mediante contagem em microscpio
ptico de campo claro, modelo NIKON H550L, com auxlio de cmara de Neubauer.
O teste de excluso do Azul de Tripan determinou a viabilidade das clulas tumorais.
Foram consideradas vivas as clulas que excluram o corante (figura 12) . (RAMALHO
et al. 2010).
47
A B
Figura 12- Teste de excluso do corante Azul de Tripan atravs de microscpio. Fonte: .......Do autor Nota: ........A: utilizando objetiva 4X, observa-se o campo visual de um quadrante da cmara de ..................Neubauer contendo as clulas (hipocoradas). B: imagem ampliada 20X evidenciando as ..................clulas tumorais.
Aps esse procedimento realizou-se a diluio das clulas para a injeo i.p.l.,
do padro para crescimento slido do tumor de Ehrlich na pata direita de cada animal
avaliado, na concentrao de 2,5x106 de clulas vivas em um volume de 0,05 ml.
A injeo das clulas ou veculo (salina estril), foi realizada com animais
anestesiados com isoflurano (2%), aps a medida basal do limiar nociceptivo (mtodo
detalhado no item 3.7).
4.5 ADMINISTRAO DA ESTIMULAO ELTRICA TRANSCUTNEA DO
........NERVO (TENS)
A estimulao eltrica nas patas dos camundongos com a TENS foi realizada
atravs de um aparelho da marca Neurodyn II (IBRAMED, Brasil) figura 13.
48
Figura 13- Aparelho de TENS Neurodyn II (IBRAMED, ..................Brasil).
Fonte : ......Do autor
Este aparelho foi previamente calibrado com os seguintes parmetros: 130 Hz
para a estimulao de alta frequncia e 4 Hz para a estimulao de baixa, com
durao do pulso de 100 m/s. (MA; SLUKA, 2001). O limite para a intensidade
sensorial foi considerada imediatamente abaixo do limiar motor (SLUKA et al.,1998).
O aparelho utilizado apresenta 4 pares de eletrodos, que permite uma estimulao em
at 4 animais simultaneamente.
Para a aplicao da TENS, os animais foram levemente anestesiados com
isoflurano (2%) e posicionados em uma capela, com sistema de anestesia por meio
de um vaporizador calibrado. Previamente estimulao eltrica, a pata direita foi
lavada com lcool etlico (70%) para fixao de eletrodos autocolantes. O tempo de
estimulao pela TENS foi de 20 minutos, a qual ocorreu por meio de dois eletrodos,
especialmente adaptados (tamanho de 1 cm2) sendo um fixado na regio dorsal e
outro na regio plantar da pata direita (DESANTANA et al., 2009) (figura 14).
49
Figura 14- .Imagem da aplicao da TENS, e o posicionamento dos ....................animais na capela. Fonte: ........ Do autor. Nota: ...........Indicando pela seta, os eletrodos autocolantes especialmente ....................adaptados
Imediatamente aps a TENS, os animais foram colocados em suas respectivas
divisrias do aparato de von Frey, por aproximadamente 15 min, antes do teste
nociceptivo (SLUKA et al., 1998).
importante ressaltar, que cada animal dos diferentes grupos foram
submetidos ao mesmo tempo TENS, assegurando que a mesma dosagem de
anestsico fosse igual para cada grupos. Esse procedimento foi realizado trs horas
aps a injeo do modelo de dor.
4.6 AVALIAO DO LIMIAR NOCICEPTIVO
O limiar nociceptivo foi avaliado durante a fase clara. Inicialmente, os animais foram
mantidos nas suas caixas na sala de comportamento por 30 minutos para se
ambientarem. Em seguida, foram colocados em caixas individuas de vidro, (figura
15A) posicionadas sobre uma grade de metal, a qual permitiu a avaliao do limiar
nociceptivo mecnico (figura 15B).
50
Os limiares nociceptivos foram avaliados por meio do teste de von Frey
filamento, o qual realiza uma presso mecnica, por meio de filamentos de diferentes
espessuras (figura 15C), aplicada de forma perpendicular com fora suficiente para
curv-los, na superfcie plantar da pata posterior direita de cada animal. Esse teste
foi realizado com base no descrito por Chaplan et al (1994), porm com algumas
modificaes, como as espessuras de filamentos distintas. Nesse experimento, foram
utilizados seis filamentos de forma crescente ou decrescente de: 0,07g, 0,16g, 0,4g,
0,6g, 1,0g, 1,4g e 2,0g.
A B
C
Figura 15- Teste de von Frey filamento. Fonte: .......Do autor Nota: ,,,,,,,,A e B aparato utilizado para colocar os animais durante o ..................experimento. A: viso completa das caixas dispostas sobre a ,,,,,,,,,,,,,,,,,,mesa; B: viso inferior da grade de metal e ..................posicionamento dos camundongos; C: os filamentos ..................utilizados e em destaque uma amostra do ..................posicionamento desse filamento durante a aplicao do ..................estmulo.
51
Durante o teste, foram realizadas 3 medidas do limiar nociceptivo em cada
animal, separadas por intervalos de 3 minutos e a mdia das 3 medidas foi descrita
como o limiar mecnico de retirada de pata em gramas (g) (figura16).
Figura 16: Clculo usado para especificar a mdia do limiar ...................mecnico de retirada da pata
Fonte: Do Autor
Em cada animal, o limiar nociceptivo mecnico foi avaliado antes da injeo
i.pl. do tumor de Ehrlich, descrita como medida basal (MB) e, em seguida nos
intervalos de 3, 5, 7 e 24 horas aps a injeo das clulas.
4.7 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Inicialmente, com o intuito de selecionar a melhor concentrao de clulas do
tumor de Ehrlich que melhor reproduziria alodinia mecnica, foi realizado um
experimento com 3 concentraes diferentes dessas clulas (1.25 x106, 2.5 x 106,, 5.0
x106,)
Antes da injeo i.pl. das clulas, os animais foram submetidos a uma medida
basal (MB). O limiar nociceptivo de retirada da pata foi mensurado na primeira hora
aps a induo i.pl. das clulas at o decimo quinto dia que corresponde a 360 horas
conforme figura 17.
52
Figura 17 Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada ....................da pata. Fonte: .........Do autor Nota: .......... MB: medida basal; i.pl.: injeo intra plantar; Ehr: Tumor de Ehrlich
Posteriormente, com a concentrao escolhida de 2,5 x106 clulas, foi realizado
o experimento para verificar o efeito da TENS na antinocicepo. Duas horas e meia
aps a injeo, os animais foram anestesiados e mantidos com isoflurano a 2%,
colocados em uma capela e os eletrodos fixados diretamente na pata para a aplicao
da TENS por 20 minutos. Aps esse procedimento, os camundongos foram
transferidos para caixas individuas de vidro, posicionadas sobre uma grade de metal
onde permaneceram por quinze minutos para aclimatao e em seguida foi realizada
a avaliao do limiar nociceptivo mecnico de acordo com Sluka et al., (1998). As
medidas subsequentes foram realizadas 5, 7 e 24 horas aps a induo i.pl. do tumor
de Ehrlich conforme figura 18.
Figura 18- Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada da pata. Fonte: ........Do autor Nota: .........Aps a aplicao da estimulao eltrica transcutnea do nervo. MB: medida basal; i.pl.: ....................injeo intra plantar; Ehr: Tumor de Ehrlich; TENS: Estimulao eltrica ....................transcutnea do nervo.
Seguindo o protocolo utilizado anteriormente, foi investigado o envolvimento do
sistema endocanabinide na antinocicepo induzida pela TENS por meio da
administrao via i.pl. ou i.t. ou i.SCPd.l. de AM251 ou MAFP. Para a injeo i.pl., a
53
drogas foram administradas 20 minutos antes do incio da TENS. J, para aas
administraes i.t. ou i.SCPd.l., as drogas foram injetadas imediatamente antes do
incio da aplicao da TENS. Na sequncia foram avaliados os limiares nociceptivos
na quinta, stima e vigsima quarta hora aps a induo do tumor de Ehrlich
conforme, figura 19:
Figura 19 Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada da pata (g), Fonte: ........Do autor. Nota:.......... Aps injeo da droga e a administrao da estimulao eltrica transcutnea do nervo. ...................MB:medida basal; i.pl. injeo intra plantar; Ehr: Tumor de Ehrlich; TENS: ...................Estimulao eltrica transcutnea do nervo; AM251: antagonista CB1; MAFP: ...................inibidor da FAAH.
4.8 ANLISE DE WESTERN BLOT
Esse procedimento foi utilizado para determinar a expresso de receptores CB1
aps a aplicao da TENS. Para tanto, os animais ainda anestesiados foram
sacrificados por decaptao e seus respectivos crebros, medulas e patas, foram
retirados e homogeneizados em homogeneizador de tecidos tipo Turrax (MARCONI,
Brasil) em tampo RIPA de lise e um cocktail de inibidores de proteases (SIGMA
FAST, Sigma). Ento, foi utilizada a proporo de aproximadamente 0,0200 g de
SCP isolada, 0,0030 g de tecido medular (regio lombar) e 0,0500 g de tecido da
regio plantar da pata direita para 200 l de tampo de lise enriquecido. Aps o
processamento, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos e o
sobrenadante foi aliquotado em tubos de polipropileno (1,5 ml, EPPENDORF,
54
BRASIL) e congelado a -80C para posterior utilizao. A quantidade de protenas das
amostras foi mensurada de acordo com o mtodo de Lowry (LOWRY et al., 1951).
Posteriormente, as amostras foram ento diludas em tampo de amostra (4X
TRIS HCl/SDS pH=6.8, 3% Glycerol, 1% SDS, 0.6% -mercaptoetanol, Azul de
Bromofenol). Para a separao, foram aplicados 50 g de protena em gel de SDS-
PAGE (sodio dodecil (lauril) sulfate-poliacrilamida). Para o gel de separao,
utilizado poliacrilamida em concentrao de 7,5% e 4%.
Desse modo, aps serem separadas em gel, as protenas foram transferidas
para uma membrana de nitrocelulose (MILLIPORE, USA) com poro de 0,45 m de
dimetro. A qualidade da transferncia monitorada atravs da colorao da
membrana com soluo de Ponceau 0,3%. A membrana foi ento lavada em agua
miliqui e colocada por 1 hora em soluo de bloqueio (TBS-Tween 0,1% com 2,5% de
leite em p desnatado). Aps o bloqueio, a membrana foi incubada overnight com o
anticorpo primrio especfico: CB1 (N-15): sc- 10066 (SANTA CRUZ, USA).
Em seguida, a membrana foi lavada com TBS contendo 0.3% de Tween 20 (TBS-
T) por 5 minutos (por trs vezes) e incubada por duas horas com o anticorpo
secundrio conjugado a peroxidase (HRP) (1:2000 anti-rabbit IgG-HRP, SANTA
CRUZ, EUA). Aps o perodo de incubao a membrana foi novamente lavada em
TBS-T (5 minutos por trs vezes). Ento, as bandas proteicas de interesse (53-60
kDa) foram detectadas por uma reao de quimioluminescncia (kit ECL plus
Amersham Biosciences do Brasil Ltda) de acordo com a intensidade da densidade
ptica de imunorreatividade atravs de um software. Foram utilizados no processo de
corrida e transferncia o sistema Mini Protean III-Tetracell e Mini Trans-Blot
Electrophoretic Transfer Cell, ambos da BIO-RAD, USA.
4.9 IMUNOFLUORESCNCIA
Com a finalidade de mostrar a presena da localizao de receptores CB1, a
nvel central, aps a aplicao da TENS, foi realizado ensaio de imunofluorescncia
em seces da regio medular lombar e SCP.
Duas horas aps a TENS, os animais foram anestesiados i.p. com
Tribromoetanol 2,5% (TBE) - (0,1ml/kg) e perfundidos transcardialmente com soluo
55
salina seguida por 4% de paraformaldedo (PFA) em tampo fosfato 0,1 M (PBS, pH
7,4). Os crebros, as medulas, foram removidos e ps-fixados durante 2 h, em PFA a
4% e armazenada durante 48 h em 30% de sacarose para crioproteo.
Seces coronais (40 mm) das amostras foram obtidas num criostato e lavadas
em PBS 0,1 M. Logo aps, foram incubadas em glicina 0,1 M, e novamente lavadas e
incubadas durante 1 h em 5% de soro bovino (BSA, Sigma) e PBS 0,1 M, pH 7,4
contendo 0,4% de Triton X-100. Em seguida, as seces foram incubadas durante 24
horas em uma mistura anticorpo primrio policlonal de cabra anti-CB1 (diludo 1:200,
SANTA CRUZ, USA) diluda em PBS + BSA a 5% + 0,4% de Triton. Aps incubao
no anticorpo primrio, as seces de tecido foram lavadas em PBS e incubou-se
sequencialmente com Alexa 488 donkey anti-goat IgGs (1:1000; Invitrogen) por 1 h
(CASAROTTO et al., 2012).
Aps o processo de imunofluorescncia, as seces foram lavadas em PBS.
Subsequentemente, os cortes foram montados em lminas gelatinizadas e cobertas
com lamelas usando Fluoromount. As seces foram analisadas por microscpio de
fluorescncia e as imagens capturadas pela cmera digital (both from Zeiss). A
contagem, apesar de serem realizadas com o auxlio do software de anlise de
imagem computadorizada, foi realizada manualmente.
4.10 ANLISE ESTATSTICA
Os resultados foram apresentados com a mdia + EPM. Para o tratamento estatstico
dos dados oriundos dos experimentos comportamentais, foi utilizada a anlise de
varincia Two way (ANOVA) e para os dados oriundos dos experimentos
biomoleculares (imunofluorescncia e western blot), foi utilizada a anlise de varincia
de uma via (ANOVA), ambos teste foram seguidos pelo teste de Bonferroni para
comparaes mltiplas, sendo considerados estatisticamente significativos valores de
P
56
5 RESULTADOS
Nesse capitulo descrevemos os resultados encontrados com os experimentos
comportamentais e com os ensaios moleculares.
5.1 EFEITO DA INJEO DO TUMOR DE EHRLICH SOBRE O LIMIAR
........NOCICEPTIVO MECNICO DE RETIRADA DE PATA
Inicialmente, utilizamos trs concentraes diferentes de clulas tumorais de
Ehrlich com a finalidade de escolher aquela que melhor reproduz uma resposta
nociceptiva.
De acordo com o grfico 1, observa-se que as trs concentraes pr-
determinadas de clulas (1,25x106 ou 2,5x106 ou 5.0x106) promoveram uma alodinia
mecnica, a qual perdurou por mais de 360 horas. Entretanto, somente a
concentrao de 2,5x106 promoveu alodinia nas primeiras 72 horas iniciais. Entre as
horas iniciais que equivale s mensuraes da primeira at a vigsima quarta hora,
no houve significncia estatstica em relao intensidade da alodnia mecnica
entre elas.
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Grfico 1 Efeito de diferentes concentraes de clulas tumorais de Ehrlich sobre o limiar .................nociceptivo mecnico de retirada da pata, avaliado pelo teste de filamentos de Von .................Frey. Nota: .......Os dados representam a mdia + E.P.M. da medida do limiar nociceptivo. MB: medida .................basal do limiar nociceptivo; i.p.l.: injeo intraplantar de 0,05 ml; EHR: EHRLICH; .................CONTROLE: injeo de salina 0.9%; h: horas. Representaes de significncia: .................***(P
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compostos po