efeito antinociceptivo e anti-inflamatÓrio de annona

183
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO JULIANE CABRAL SILVA EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona vepretorum Mart. (ANNONACEAE) EM ROEDORES PETROLINA 2013

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Page 1: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO

SEMIÁRIDO

JULIANE CABRAL SILVA

EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

vepretorum Mart. (ANNONACEAE) EM ROEDORES

PETROLINA

2013

Page 2: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

1

JULIANE CABRAL SILVA

EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

vepretorum Mart. (ANNONACEAE) EM ROEDORES

Dissertação apresentada à Universidade

Federal do Vale do São Franciso, como

parte das exigências do Programa de

Pós-graduação em Recursos Naturais

do Semiárido, para obtenção do título de

Mestre em Recursos Naturais.

Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto

Guedes da Silva Almeida

Co-orientadora: Prof. Dr.ª Rosemairy

Luciane Mendes

PETROLINA

2013

Page 3: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

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Ficha elaborada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas da Univasf. CRB/04-1747.

Silva, Juliane Cabral

S587e Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores / Juliane Cabral Silva. – Petrolina, 2013.

183f.

Dissertação (mestrado)- Universidade Federal do Vale do São Francisco. Recursos Naturais do Semiárido, Petrolina, 2013.

Orientador: Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida.

1. Atividade Antinociceptiva. 2. Atividade Anti-inflamatória.

3. Annonaceae. I. Título. II. Universidade Federal Vale do São

Francisco.

CDD 615.1

Page 4: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

4

Dedico este trabalho a Deus, aos meus pais José

Aparecido da Silva e Verônica Vilar Cabral Silva, ao

meu irmão Josielson Cabral Silva, aos meus

familiares, amigos e ao meu orientador que

acreditaram em mim e me apoiaram em todos os

momentos.

Page 5: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

5

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus e à Nossa Senhora, por guiarem sempre os meus passos

e me darem fortaleza, tornando possível o que era impossível.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida,

escolha perfeita e pelo qual tive a sorte de, imediatamente, me aceitar como

orientanda. Mais do que orientador e amigo você é um exemplo a ser seguido, um

Pesquisador que apesar das adversidades, tudo supera e contribui cientificamente,

“uma verdadeira MÁQUINA”. Obrigada por toda dedicação e ensinamentos.

À minha co-orientadora Rosemairy Luciane Mendes, pela qual tenho um

imenso afeto e admiração, sinônimo de sinceridade e honestidade. Obrigada por

todas as contribuições científicas, por suas horas dedicadas e por toda amizade

construída, a qual quero levar para sempre.

Ao Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido, e a

todos os professores pelos conhecimentos compartilhados, contribuindo na minha

formação.

A todos do Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais

(NEPLAME) e aos meus colegas de laboratório, em especial, Amanda, Ana Paula,

Sarah Raquel, Camila Araújo, Tâmara Diniz, Grasielly Rocha, Raimundo Júnior,

Suzana Rabêlo, Alessandra Pacheco, Larissa Macêdo, Leandra Macêdo e

Viviane Araújo, pelo apoio e amizade.

A Henrique Saraiva, Carlos Wagner, Keidy Costa, Camila Meirelles, Érica

Lavor, Mariana Gama, Heloisa Stefanin, Angelo Amorim, José Roberto Rocha e

Larissa Silveira pela parceria na realização dos meus experimentos.

Ao Professor Dr. Lucindo José Quintans-Júnior, pela oportunidade de

aprender novas técnicas em seu laboratório, ao Professor Dr. Leonardo Bonjardim

pela atenção, e aos colegas pela paciência e técnicas ensinadas.

Ao CRAD/UNIVASF na pessoa do Professor Dr. José Alves de Siqueira

Filho.

Ao pessoal do biotério Leonardo, Euda, Helenildo e Jean, por toda atenção

e compreensão, me recebendo sempre com um sorriso no rosto.

Aos Técnicos: Ana Paula, Amanda, Silvio Alan, Roniere A. Oliveira e

Fernando pela ajuda e compreensão.

Ao Prof. Dr. Fabrício Souza Silva pela ajuda nos ensaios de toxicidade.

Page 6: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

6

À Aline Braga pela imensa compreensão.

A todos os servidores da UNIVASF, em especial Francisca, João Paulo, Sr.

Cícero, Geralda, Juliana, Maria e Neide por toda atenção a mim dedicada, na

realização das suas funções.

Aos colegas de Turma, em especial Fernanda Ribeiro, Camila Araújo e

Tâmara Diniz, pelos momentos de estudo juntas e por toda amizade.

A José Aparecido da Silva e Verônica Vilar Cabral Silva, meus pais, por

todo amor incondicional e valores ensinados. Por me lembrarem sempre que “Deus

me ama, que não estou só, que Deus cuida de mim quando fala por tuas vozes que

me diz: Coragem” (Amor Humano de Deus – Adriana).

Ao meu irmão Josielson Cabral Silva, a quem nem tenho palavras para

expressar o meu amor, apenas agradeço por sua vida, pelas preocupações,

renúncias e sacrifícios que fez para que hoje eu estivesse aqui.

Agradeço às Irmãs Carmelitas e à minha avó pelas orações e atenção, ao

meu avô por me fazer sentir tão importante, à minha cunhada, às minhas madrinhas,

padrinhos, tias, tios, primas e primos por todo apoio.

Aos meus amigos, Mestres e eternos orientadores: Rodrigo Cappato, Ana

Carolina, Antonieta Albuquerque e meus docentes da UPE por sempre me

lembrarem dos meus objetivos e dando forças para que eu jamais desista!

A todos os meus amigos, impossível citar os nomes, pois graças a Deus,

são muitos. Obrigada por todo apoio e compreensão pela minha ausência. Obrigada

por me doarem um pouco de suas famílias. Com vocês tudo se torna mais fácil.

À Comunidade dos Viventes e ao meu Vínculo, pelas orações e partilhas.

Juntos! N’Ele Até o fim!

À Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES), pela bolsa de mestrado.

Por último, para serem destacados por sua total doação, a vocês

camundongos e ratos, sem vocês nada disso teria se concretizado.

Muito obrigada!

Page 7: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

7

“Posso, tudo posso Naquele que me

fortalece

Nada e ninguém no mundo vai me

fazer desistir

Quero, tudo quero, sem medo

entregar meus projetos

Deixar-me guiar nos caminhos que

Deus desejou pra mim”

(Celina Borges)

Page 8: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

8

RESUMO

Para esse estudo, foi selecionada a espécie Annona vepretorum Mart., conhecida

popularmente como araticum, e utilizada na medicina popular para o tratamento de

processos inflamatórios. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antinociceptivo e

anti-inflamatório do extrato etanólico bruto (Av-EtOH – 25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) e do

óleo essencial (Av-OE – 25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) das folhas de A. vepretorum em

roedores, utilizando diferentes modelos experimentais, bem como avaliar a

toxicidade subcrônica de Av-EtOH. Para avaliação da atividade antinociceptiva,

foram realizados os seguintes ensaios: teste de contorções abdominais induzidas

por ácido acético, teste da formalina, testa da placa quente e teste de retirada da

cauda. Para avaliar o efeito anti-inflamatório, foram realizados dois modelos: edema

de pata induzido por carragenina e histamina, e peritonite induzida por carragenina.

Além disso, foi avaliado o efeito antinociceptivo de Av-EtOH em modelos de dor

orofacial induzida por formalina, glutamato e capsaicina. O estudo toxicológico foi

conduzido durante 30 dias, realizando administração diária de Av-EtOH nas doses

de 100 e 400 mg/kg. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados para

avaliação de parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos. Em relação

à atividade antinociceptiva, Av-EtOH e Av-OE demonstraram efeito em todos os

ensaios experimentais e tiveram seus efeitos revertidos quando administrados

juntamente com a naloxona nos testes de formalina e placa quente. Nos modelos de

dor orofacial, Av-EtOH reduziu o comportamento nociceptivo induzido por formalina,

capsaicina e glutamato. Em relação à avaliação da atividade anti-inflamatória,

Av-EtOH e Av-OE também apresentaram resultados satisfatórios em todos os testes.

Com o intuito de mensurar o perfil de segurança de Av-EtOH, foi realizado o estudo

toxicológico subcrônico pré-clínico. A administração diária de Av-EtOH (100 e 400

mg/kg) durante 30 dias não provocou morte em nenhum dos grupos tratados,

indicando baixa toxicidade do extrato. Conclui-se que Annona vepretorum possui

atividades antinociceptiva e anti-inflamatória, corroborando com seu uso na medicina

popular. Além disso, o estudo de toxicidade demonstrou que a espécie apresenta

um perfil de segurança aceitável, o que respalda o desenvolvimento de estudos

farmacológicos e toxicológicos posteriores.

Palavras-chave: Annona vepretorum, Annonaceae, atividade antinociceptiva,

atividade anti-inflamatória, dor orofacial, toxicidade subcrônica.

Page 9: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

9

ABSTRACT

For this study, we selected the species Annona vepretorum Mart., commonly known

in Brazil as araticum, and used in folk medicine for the treatment of inflammatory

processes. The aim of this study was to evaluate the antinociceptive and anti-

inflammatory effects in rodents of crude ethanolic extract (Av - EtOH 25, 50 and 100

mg / kg, p.o.) and essential oil (Av-OE 25, 50 and 100 mg / kg, i.p.) from the leaves

of A. vepretorum, using different experimental models, as well as evaluate the

subchronic toxicity of Av-EtOH. To evaluate the antinociceptive activity were carried

out the tests: acetic acid-induced writhing, formalin, hot plate and tail flick. To assess

the anti-inflammatory effect were performed two models: histamine and carrageenan-

induced hind paw edema, and carrageenan induced peritonitis. Furthermore, we

evaluated the antinociceptive effect of Av-EtOH in models of formalin, capsaicin and

glutamate- induced orofacial nociception. The toxicological study was conducted

during 30 days, performing daily administration of Av-EtOH at doses of 100 and 400

mg/kg. At the end of the study, the animals were euthanized for assessment of

biochemical, hematological and histopathological findings. Regarding the

antinociceptive activity, Av-EtOH and Av-OE showed effects in all experimental tests

and had its effect reversed when administered with naloxone in formalin test and hot

plate. In models of orofacial pain, Av-EtOH reduced the nociceptive behavior induced

by formalin, capsaicin and glutamate. Regarding the assessment of anti-inflammatory

activity, Av-EtOH and Av-OE also obtained satisfactory results in all tests. In order to

measure the safety profile of Av-EtOH, the subchronic toxicology preclinical study

was conducted. The daily administration of Av-EtOH (100 and 400 mg/kg) during 30

days did not cause any death in treated groups, indicating low toxicity of the extract.

In summary, we concluded that Annona vepretorum have antinociceptive and anti-

inflammatory properties, supporting its use in folk medicine. Moreover, the toxicity

study showed that the species has a safety acceptable profile, which supports the

development of pharmacological and toxicological studies later.

Keywords: Annona vepretorum, Annonaceae, antinociceptive activity,anti-

inflammatory activity, orofacial pain, subchronic toxicity.

Page 10: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Foto de Annona vepretorum......................................................................33

Figura 2 - Distribuição fitogeográfica de Annona vepretorum....................................34

Figura 3 - Exsicata de Annona vepretorum coletada em Jaguarari- BA....................55

Figura 4 - Exsicata de Annona vepretorum coletada em Petrolina- PE.....................56

Figura 5 - Camundongo observado no teste de contorções abdominais………........61

Figura 6 - Camundongo observado no teste da formalina. .......................................62

Figura 7 - Animal observado no teste da placa quente. ............................................63

Figura 8 - Animal observado no teste de retirada da cauda......................................64

Figura 9 - Teste de dor orofacial induzida por formalina............................................65

Figura 10 - Volume da pata mensurado utilizando o aparelho pletismômetro no

modelo do edema de pata induzido por carragenina.................................................67

Figura 11 – Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum,

indometacina e morfina no teste de contorções induzidas por ácido acético em

camundongos.............................................................................................................73

Figura 12 - Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum,

indometacina e morfina na primeira e segunda fase do teste da formalina...............74

Figura 13 - Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum e

morfina no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua

administração.............................................................................................................75

Figura 14 - Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum e

morfina no teste de retirada da cauda em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua

administração.............................................................................................................76

Page 11: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

11

Figura 15 – Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum e

morfina na primeira e segunda fase do teste de dor orofacial induzida por

formalina.....................................................................................................................77

Figura 16 – Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum e

morfina no teste de dor orofacial induzido por capsaicina.........................................78

Figura 17 – Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum,

morfina no comportamento nociceptivo orofacial induzido por glutamato.................79

Figura 18 - Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

e indometacina no edema de pata induzida por carragenina em

camundongos.............................................................................................................80

Figura 19 – Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

e indometacina no edema de pata induzida por histamina em

camundongos.............................................................................................................81

Figura 20 - Histologia das patas de camundongos após indução de edema por

carragenina e histamina após tratamentos................................................................82

Figura 21 - Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum

e dexametasona na migração leucocitária na cavidade peritoneal induzida por

carragenina em camundongos...................................................................................84

Figura 22 - Dados de peso dos animais tratados com extrato etanólico bruto de

Anonna vepretorum durante 30 dias .........................................................................85

Figura 23 - Efeito antinociceptivo do óleo essencial de Annona vepretorum,

indometacina e morfina no teste de contorções induzidas por ácido acético em

camundongos.............................................................................................................89

Figura 24 - Atividade antinociceptiva do óleo essencial de Annona vepretorum,

indometacina e morfina na primeira e segunda fase do teste da formalina...............90

Figura 25 - Atividade antinociceptiva do óleo essencial de Annona vepretorum e

morfina, no teste da placa quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua

administração.............................................................................................................91

Page 12: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

12

Figura 26 - Efeito do óleo essencial de Annona vepretorum e dexametasona na

migração leucocitária na cavidade peritoneal induzida por carragenina em

camundongos.............................................................................................................92

Page 13: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os

principais metabólitos secundários da espécie Annona vepretorum

(Annonaceae).............................................................................................................58

Tabela 2 - Identificação das principais classes de constituintes químicos presentes

no extrato etanólico bruto das folhas de Annona vepretorum

(Annonaceae).............................................................................................................71

Tabela 3 Constituintes químicos identificados no óleo essencial das folhas de

Annona vepretorum (Annonaceae)............................................................................72

Tabela 4 - Parâmetros hematológicos do sangue de camundongos tratados com

extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum durante 30 dias (n= 10 por

grupo).........................................................................................................................86

Tabela 5 - Parâmetros bioquímicos obtidos do soro de camundongos tratados com

extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum durante 30 dias (n= 10 por

grupo).........................................................................................................................87

Tabela 6 - Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto

de Anonna vepretorum durante 30 dias (n= 10 por grupo)........................................88

Page 14: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

14

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Aα Fibras do tipo A- alfa

Aβ Fibras do tipo A- beta

Aδ Fibras do Tipo A- delta

AA Ácido araquidônico

AAS Ácido acetilsalicílico

ACTH Corticotropina

AINES Anti-inflamatórios não esteroidais

ALT Alanina aminotrasnferase

AMPc Adenosina monofosfato cíclico

ANOVA Análise de variância

AST Aspartato aminotransferase

ATP Adenosina trifosfato

Av-EtOH Extrato etanólico das folhas de Annona vepretorum

Av-OE Óleo essencial das folhas de Annona vepretorum

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais

CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular média

COX Enzima cicloxigenase

CT Corticosteróides

CRAD Centro de Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga

EDTA Ácido etileno diamino tetra-acético

GC Glicocorticoides

Page 15: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

15

HCM Hemoglobina corpuscular média

HVASF Herbário Vale do São Francisco

IASP International Association for the Study of Pain

ICAM moléculas de adesão intercelular

IFNʏ Interferon Gama

IL Interleucina

iNOS Sintase Induzida pelo Óxido Nítrico

LNRP Limiar Nociceptivo de Retirada da Pata

LOX Enzima lipoxigenase

MORF Morfina

OMS Organização Mundial da Saúde

NLX Naloxona

NMDA N-metil-D-aspartato

NO Óxido nítrico

PAF Fator de ativação plaquetária

PG Prostaglandina

PGE2 Prostaglandina E2

PGF2α Prostaglandina F2α

PI Prostaciclina

PKA Proteína quinase A

PKC Proteína quinase C

PLA2 Fosfolipase A2

PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares

Page 16: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

16

RENISUS Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao

SUS

RGC Receptores de Glicocorticoides Citosólicos

SG Substância Gelatinosa

SUS Sistema Único de Saúde

TGO Transaminase glutâmico oxalacética

TGP Transaminase glutâmico pirúvica

TNF Fator de necrose tumoral

TNF-α Fator de necrose tumoral-α

TRVP-1 Receptor de potencial transitório vaniloide

TX Tromboxano

UNIVASF Universidade Federal do Vale do São Francisco

VCAM-1 Moléculas de Adesão Vascular

VCM Volume corpuscular médio

VR Receptor vaniloide

Page 17: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

17

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ………….…………..........…………….…………………….…..........21

2. OBJETIVOS .…….………………………..........……………………………….…...... 24

2.1. Objetivo geral ..……………….………….……........……………………….…....... .25

2.2. Objetivos específicos .…………………...........……………………..…….…..........25

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .…………………..........……………………….......26

3.1. Produtos naturais ...............……………….….………..........………………...........27

3.2. Considerações sobre família Annonaceae e o gênero Annona .........................29

3.3. Considerações sobre espécies do gênero Annona com atividades

antinociceptiva e anti-inflamatória..............................................................................30

3.4. Considerações sobre a espécie Annona vepretorum .............…………..…........32

3.5. Considerações sobre dor ...................................................................................34

3.5.1 Dor e nocicepção ................……………….….……………….........………........ 34

3.5.2 Nociceptores .......................……………….….……………………..........…....... 36

3.5.3 Vias nociceptivas ...............……………….….……………………….................. 36

3.5.4 Mecanismo da dor central .....………….........……………………………..….......38

3.5.5 Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória .................................................39

3.6. Drogas analgésicas ............................................................................................39

3. 7. Modelos experimentais para avaliação da atividade antinociceptiva.................40

3.7.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético ......................................40

3.7.2. Teste da formalina ………………………………………………………………....41

3.7.3. Teste de Randall-Selitto …………………………………………………………...42

3.7.4. Teste de von Frey ............................................................................................42

3.7.5. Dor orofacial induzida por formalina ................................................................43

Page 18: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

18

3.7.6. Teste da placa quente ……………………………………………………….........44

3.7.7. Teste de retirada da cauda ..............................................................................45

3.8. Considerações sobre inflamação …………………………………………..............45

3.8.1. Eventos vasculares …………………………………………………………..........46

3.8.2. Eventos celulares …………………………………………………………….........47

3.8.3. Mediadores químicos ………………………………………………………...........48

3.9. Drogas anti-inflamatórias ....................................................................................49

3.9.1. Anti-inflamatórios não esteroidais ...................................................................49

3.9.2 Anti-inflamatórios esteroidais............................................................................50

3.10. Modelos experimentais ……………………………………………………….........51

3.10.1. Edema de pata induzido por carragenina .....................................................51

3.10.2. Edema de orelha induzido por óleo de cróton ...............................................52

3.10.3. Peritonite induzida por carragenina ……………………………………….........53

4. PARTE EXPERIMENTAL ……………………………………………….......…..........54

4.1. Material vegetal ..................................................................................................55

4.1.1 Coleta de Annona vepretorum para obtenção do extrato etanólico bruto ........55

4.1.2 Coleta de Annona vepretorum para extração do óleo essencial.......................56

4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de Annona vepretorum............57

4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de Av-EtOH..........57

4.4. Obtenção do óleo essencial das folhas de Annona vepretorum.........................59

4.5. Animais …………………………………………………………………………….…..59

4.6. Testes de atividade antinociceptiva ....................................................................60

4.6.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ......................60

4.6.2. Teste da formalina ………………………………………………………………....61

Page 19: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

19

4.6.3. Teste da placa quente .....................................................................................62

4.6.4. Teste de retirada da cauda ..............................................................................63

4.6.5. Teste de dor orofacial induzida por formalina .................................................64

4.6.6. Teste de dor orofacial induzida por capsaicina ...............................................65

4.6.7. Teste de dor orofacial induzida por glutamato ................................................65

4.7. Testes de atividade anti-inflamatória …………………………………………........66

4.7.1. Edema de pata induzido por carragenina .......................................................66

4.7.2. Edema de pata induzido por histamina ...........................................................67

4.7.3. Migração de leucócitos na cavidade peritoneal ..............................................67

4.8. Toxicidade subcrônica ………………………………………………………….........68

4.8.1. Análise comportamental ………………………………………………………......68

4.8.2. Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos ...................................69

4.9. Análise estatística ………………………………………………………………….....69

5. RESULTADOS ......................................................................................................70

5.1. Triagem fitoquímica ............................................................................................71

5.2. Composição do óleo essencial ...........................................................................71

5.3. Resultados do extrato de Annona vepretorum ...................................................72

5.3.1 Atividade antinociceptiva do extrato de Annona vepretorum............................72

5.3.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ....................72

5.3.1.2 Teste da formalina .........................................................................................73

5.3.1.3 Teste da placa quente ....................... ...........................................................75

5.3.1.4 Teste de retirada da cauda ............................................................................75

5.3.1.5 Teste de dor orofacial induzida por formalina ...............................................76

5.3.1.6 Teste de dor orofacial induzida por capsaicina .............................................77

Page 20: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

20

5.3.1.7 Teste de dor orofacial induzida por glutamato ..............................................78

5.3.2 Atividade anti-inflamatória do extrato de Annona vepretorum..........................79

5.3.2.1 Edema de pata induzido por carragenina .....................................................79

5.3.2.2 Edema de pata induzido por histamina .........................................................80

5.3.2.3 Análise histológica .........................................................................................81

5.3.2.4 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal ............................................84

5.3.3. Toxicidade subcrônica do extrato de Annona vepretorum...............................84

5.3.3.1. Avaliação comportamental dos camundongos .............................................85

5.3.3.2. Parâmetros hematológicos ...........................................................................85

5.3.3.3. Parâmetros bioquímicos ...............................................................................86

5.3.3.4. Análise macroscópica e peso dos órgãos ....................................................87

5.4. Resultados do óleo essencial de Annona vepretorum .......................................88

5.4.1. Atividade antinociceptiva do óleo essencial de Annona vepretorum...............88

5.4.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético.....................88

5.4.1.2 Teste da formalina .........................................................................................89

5.4.1.3 Teste da placa quente ..................................................................................90

5.4.2. Atividade anti-inflamatória do óleo essencial de Annona vepretorum..............91

5.4.2.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal ............................................91

6. DISCUSSÃO..........................................................................................................93

7. CONCLUSÕES....................................................................................................102

REFERÊNCIAS .......................................................................................................104

APÊNDICES ............................................................................................................129

ANEXOS..................................................................................................................181

Page 21: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

21

1. INTRODUÇÃO

Page 22: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

22

1. INTRODUÇÃO

A dor corresponde a uma resposta subjetiva que o organismo apresenta

quando é submetido a algum estímulo potencialmente nocivo. Em tecidos normais,

esse estímulo ativa reações fisiológicas adequadas para evitar uma possível lesão.

Em tecidos ou órgãos que sofreram lesão, a instalação de um processo inflamatório

provoca sensibilização de nociceptores a responderem a estímulos que são inócuos

ou não provocam sensação dolorosa normalmente (SCHAIBLE et al., 2011). Na

maioria das vezes esse tipo de reação configura-se como uma função protetora,

representando, em muitos casos, o único sintoma para o diagnóstico de várias

doenças (OLIVEIRA et al., 2009), porém quando persistente provoca reações

emocionais negativas, tornando-se debilitante e causadora de sofrimento (GRIFFIS

et al., 2006).

Quando se trata de fármacos para o tratamento da dor, abre-se uma lacuna

no que diz respeito ao regime medicamentoso que pode ser estabelecido, tendo em

vista que ainda não dispomos de um analgésico e/ou anti-inflamatório ideal, ou seja,

que não promovam efeitos colaterais potenciais. Embora sejam altamente eficazes,

os analgésicos de ação central geralmente não estão dissociados de efeitos

adversos importantes e os analgésicos de ação periférica também apresentam

efeitos indesejáveis, tais como lesões do trato gastrointestinal e renal (RANG et al.,

2012). Assim, tem-se a necessidade de buscar medidas alternativas para o

desenvolvimento de medicamentos para o combate da dor. Nessa perspectiva, os

produtos naturais são considerados como uma fonte promissora na pesquisa de

moléculas com potencial atividade analgésica e anti-inflamatória.

Uma região com uma rica diversidade de plantas é o Nordeste, cujo bioma é a

Caatinga, estende-se o domínio do semiárido em uma área de 73.683.649 hectares

(BRASIL, 2008). Embora seja a área menos estudada dentre as regiões brasileiras,

merece destaque, pois é o único bioma exclusivamente brasileiro, cujos limites estão

inteiramente restritos ao território nacional. Além disso, possui uma proporção

expressiva de plantas endêmicas, comumente utilizadas pela população por suas

propriedades terapêuticas e possuindo, assim, uma importante fonte de recursos

naturais (LEAL et al., 2005).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Tendo em vista a riqueza do bioma Caatinga, a ampla utilização de plantas

como medicamentos e, na maioria das vezes, a falta de conhecimento científico

sobre os efeitos biológicos de determinadas espécies, torna-se imprescindível

estudos sobre potencialidades terapêuticas das plantas encontradas nessa região.

Uma das plantas encontradas na região e que não possui estudos na

literatura é Annona vepretorum, espécie encontrada no Vale do São Francisco,

pertencente ao gênero Annona, cujas espécies, Annona diversifolia (CARBALLO et

al., 2010) e Annona squamosa (CHAVAN et al., 2010) possuem substâncias

biologicamente ativas com potenciais analgésico e anti-inflamatório.

Portanto, a relevância desse estudo é para a pesquisa na área de recursos

naturais do semiárido, no conhecimento de espécies da família Annonaceae, em

especial do gênero Annona; bem como na descoberta de novas espécies com

potenciais farmacológicos, em especial no tratamento da dor e inflamação.

Assim, o objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito antinociceptivo e

anti-inflamatório do extrato etanólico bruto e do óleo essencial de Annona

vepretorum, além de avaliar o perfil de segurança dessa espécie. Para isso, foi

realizado ensaio toxicidadede subcrônica do extrato e testes farmacológicos que

avaliam atividades antinociceptiva e anti-inflamatória.

Em levantamento bibliográfico realizado nos principais bancos de dados sobre

estudos com plantas medicinais, não foram encontrados registros de estudos

farmacológicos com essa espécie, sendo este estudo pioneiro na busca e

comprovação da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória de Annona vepretorum,

visando assegurar sua utilização e servir de parâmetros para o desenvolvimento de

novos medicamentos fitoterápicos.

Page 24: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

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2. OBJETIVOS

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Investigar a possível atividade antinociceptiva e/ou anti-inflamatória do extrato

etanólico bruto e do óleo essencial de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em

roedores e avaliar possíveis mecanismos de ação envolvidos nos efeitos

evidenciados.

2.2. Objetivos específicos

- Estudar os aspectos farmacológicos de Annona vepretorum;

- Avaliar o potencial antinociceptivo e anti-inflamatório da espécie Annona

vepretorum;

- Avaliar os possíveis mecanismos de ação envolvidos e a participação dos sistemas

de neurotransmissão;

- Avaliar o perfil de segurança, através do estudo de toxicidade subcrônica do

extrato etanólico bruto da espécie;

- Contribuir para o estudo farmacológico da espécie de Annonaceae.

Page 26: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

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3. FUNDAMENTAÇÃO

TEÓRICA

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. Produtos naturais

O reino vegetal é o que tem contribuído de forma mais significativa para o

fornecimento de metabólitos secundários, muitos destes de grande valor agregado

devido às suas aplicações como medicamentos, cosméticos, alimentos e

agroquímicos (PINTO et al., 2002). Plantas medicinais constituem uma das mais

importantes fontes de substâncias ativas com potencial terapêutico e são

frequentemente usadas nos países em desenvolvimento (SCHULZ et al., 2002).

O uso de produtos naturais no combate a diversas enfermidades é prática

antiga. A busca por alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folhas talvez

tenham sido uma das primeiras formas de utilização destes produtos (VIEGAS-

JÚNIOR et al., 2006).

Evidências arqueológicas mostram que o uso de drogas era amplo em

culturas antigas. No mundo moderno, as grandes navegações trouxeram a

descoberta de novos continentes, legando um grande arsenal terapêutico de origem

vegetal (PINTO et al., 2002), enquanto a convivência e o aprendizado com os mais

diferentes grupos étnicos trouxeram valiosas contribuições para o desenvolvimento

da pesquisa em produtos naturais, do conhecimento da relação íntima entre a

estrutura química de um determinado composto e suas propriedades biológicas

(VIEGAS-JÚNIOR et al., 2006).

Constituindo-se muitas vezes o único recurso terapêutico de muitas

comunidades e grupos étnicos, ainda hoje plantas medicinais são comercializadas

em feiras livres, mercados populares e encontradas em quintais residenciais nas

regiões mais pobres do país e até mesmo nas grandes cidades brasileiras (MACIEL

et al., 2002).

É importante mencionar que as plantas, além de seu uso na medicina popular

com finalidades terapêuticas, têm contribuído ao longo dos anos para a obtenção de

vários fármacos, até hoje amplamente utilizados na clínica (CECHINEL-FILHO,

YUNES, 1998); como a morfina e a codeína, obtidas a partir da Papaver somniferum

que promovem analgesia e alterações no humor por atuar, principalmente, nos

receptores opioides μ (HUANG; KUTCHAN, 2000).

Page 28: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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A maioria dos princípios ativos de importância farmacológica encontrada nos

extratos vegetais, de modo geral, é oriunda de uma variedade de metabólitos

secundários que são produzidos para modular seus próprios metabolismos,

possuem uma constituição complexa e podem alcançar alvos terapêuticos de

doenças humanas (FERREIRA; PINTO, 2010).

Enquanto os medicamentos apresentam, em sua quase totalidade, um único

princípio ativo que é responsável pelo seu efeito farmacológico, os extratos vegetais

são constituídos por misturas multicomponentes de substâncias ativas, parcialmente

ativas e inativas, que, muitas vezes, atuam em alvos farmacológicos diferentes

(FERREIRA; PINTO, 2010; ULRICH-MERZENICH et al., 2010).

Os extratos servem ainda como ponto de partida para a obtenção de

compostos sintéticos ou biossintéticos. Existem aqueles que exibem uma atividade

biológica maior ou diferente de seus componentes isolados (VILLAS-BÔAS,

GADELHA, 2007).

Cabe mencionar que cerca de 25% de todas as prescrições médicas nos

Estados Unidos incluem substâncias naturais como princípio ativo, obtidas de

plantas de regiões temperadas e tropicais, o que corresponde ao valor estimado de

900 milhões de dólares na circulação comercial (BRAZ-FILHO, 2010). Em 2000 o

setor faturou US$ 6,6 bilhões nos EUA e US$ 8,5 bilhões na Europa. No Brasil

estima-se que o comércio de fitoterápicos seja da ordem de 5% do mercado total de

medicamentos, avaliado em mais de US$ 400 milhões (PINTO et al., 2002).

O Brasil destaca-se no ranking mundial de países “megadiversos” e é

considerado o país de maior diversidade biológica (PEIXOTO; MORIM, 2003). Abriga

cerca de 19% do total terrestre da diversidade (GIULIETTI et al., 2005), e estima-se

em 49 mil o número de espécies de plantas descritas (SHEPHERD, 2002).

Esse cenário favorece a pesquisa e o desenvolvimento de fitoterápicos no

país. Um grande avanço nesse sentido é a Portaria do Ministério da Saúde de nº

971 de 03 de maio de 2006, que aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas

e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde (SUS). Essa política traz

em suas diretrizes a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais de

Interesse ao SUS (RENISUS). Ainda em 2006, o Decreto Federal de nº 5.813 de 22

de junho de 2006 instituiu a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,

que incentiva as pesquisas e dá diretrizes para implantação de serviços em caráter

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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nacional pelas Secretarias de Saúde dos Estados, Distrito Federal e dos Municípios

(BRASIL, 2006).

Uma região brasileira com uma rica diversidade de plantas é o Nordeste e o

estudo dos usos tradicionais de plantas e seus produtos nessa região têm

aumentado gradualmente. Durante os últimos anos (AGRA et al., 2007;

ALBUQUERQUE et al., 2006). Foi realizada uma investigação etnomedicinal das

plantas conhecidas como medicinais e venenosas no Nordeste do Brasil. De um total

de 483 espécies pertencentes a cerca de 79 famílias, 466 espécies, cerca de 96,5%

são registrados pelo seu uso medicinal (AGRA et al., 2008;2007).

O bioma Caatinga é o principal ecossistema dessa região brasileira, ocupando

os estados da Bahia, Ceará, Piauí, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Paraíba,

Sergipe, Alagoas, Maranhão e Minas Gerais (BRASIL, 2008). Algumas espécies

endêmicas desse bioma possuem atividade antinociceptiva, como Neoglaziovia

variegata (LIMA-SARAIVA et al., 2012) e Amburana cearensis (OLIVEIRA et al.,

2009).Além disso, outras espécies coletadas na região Nordeste também possuem

efeito antinociceptivo e anti-inflamatório (ANDRADE et al., 2012; LIMA et al., 2012).

3.2. Considerações sobre a família Annonaceae e o gênero Annona

Plantas da família Annonaceae estão amplamente distribuídas pelo mundo

todo, mas são predominantes em zonas tropicais (SIQUEIRA et al., 2011). Algumas

espécies dessa família são conhecidas por produzirem diversos derivados

alcaloídicos isoquinolínicos (FECHINE et al., 2002), outras são fragrantes devido à

presença de óleos essenciais que, normalmente, são constituídos de

monoterpenoides, sesquiterpenoides e/ou substâncias aromáticas; algumas têm

importância comercial como o óleo de Cananga (Cananga odorata Hook var.

macrophylla) e o óleo de Ylang-Ylang (Cananga odorata Hook var. genuina) que são

usados em perfumaria (SOUSA et al., 2004). Uma nova classe de substâncias

naturais bioativas, conhecidas como “acetogeninas de anonáceas”, deram um novo

estímulo para o estudo fitoquímico desta família, por apresentarem uma gama de

importantes atividades biológicas tais como: citotóxica, antitumoral, pesticida,

vermicida, abortiva, antimicrobiana, imunossupressora, antiemética, inibidora do

apetite e antimalárica (NASCIMENTO et al., 2003)

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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A família Annonaceae é constituída por árvores, arbustos, e raramente por

arbustos escandentes, que se caracterizam por apresentar flores vistosas,

andróginas, solitárias, ou em inflorescências, axilares ou terminais (PONTES et al.,

2004). Esta é a maior família da ordem Magnoliales, possuindo de 2300-2500

espécies e mais de 130 gêneros. Apenas os gêneros Annona, Rollinia, Uvaria e

Asimina produzem frutos comestíveis (CARBALLO et al., 2010).

Siebra (2009) ao comentar sobre os gêneros da família Annonaceae no Brasil,

baseia-se em Barroso, na obra Annonaceae, esclarecendo que neste país já foram

registrados 29 gêneros, com cerca de 260 espécies, destacando-se o Annona.

O gênero Annona, possui 250 espécies encontradas em território brasileiro

(SIQUEIRA et al., 2011). As quais geralmente são consumidas como fruta fresca, e

também são amplamente utilizadas na medicina popular. Isto, devido à presença de

diferentes classes de metabólitos ativos, como alcaloides isoquinolinicos (SILVA et

al., 2007), acetogeninas (YANG et al., 2009; SANTOS-LIMA et al., 2010), lectinas

(COELHO et al., 2003) e óleos voláteis (SOUSA et al., 2004; SIQUEIRA et al., 2011;

COSTA et al., 2012 ) e flavonoides encontrados nas raízes, folhas, cascas, sementes

e frutos (CARBALLO et al., 2010).

Algumas atividades biológicas descritas de plantas pertencentes a este

gênero são: capacidade anti-oxidante (LIMA et al., 2010; JULIÁN-LOAEZA et al.,

2010), efeito hipotensor (MORITA et al., 2006), hipoglicemiante (GUPTA et al., 2005),

antibacteriano (RAHMAN et al., 2005; VIEIRA et al., 2010), antileishmania

(JARAMILLO et al., 2000), anticonvulsivante (GONZÁLEZ-TRUJANO et al., 2006),

atividade ansiolítica (LÓPEZ-RUBALCAVA et al., 2005), anti-inflamatória (ADZU et

al., 2003a) e analgésica (SOUSA et al., 2007; CARBALLO et al., 2010).

3.3. Considerações sobre espécies do gênero Annona com atividades

antinociceptiva e anti-inflamatória

Ao longo da história o homem tem utilizado diversas formas de tratamento

para o alívio da dor, entre elas, as ervas medicinais são destaque devido ao seu

amplo uso popular (ALMEIDA et al., 2001). Os mais potentes e eficazes fármacos

analgésicos são derivados de plantas, a exemplo da salicinina extraída de Salix alba

e a morfina obtida da Papaver somniferum (VEIGA-JUNIOR et al., 2005).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Algumas espécies do gênero Annona possuem atividade antinociceptiva e

anti-inflamatória, dentre elas, Annona squamosa L., cujas folhas são usadas para o

tratamento de reumatismo e dor no baço. O extrato de éter de petróleo bruto não

saponificado e o óxido de cariofileno isolados do extrato da casca exibiram

atividades analgésicas e anti-inflamatórias significativas (CHAVAN et al., 2010).

O extrato das folhas frescas dessa espécie também é relatado por tais

propriedades. O estudo fitoquímico preliminar mostrou diferença entre os metabólitos

secundários presentes na decocção de folhas frescas e no extrato das folhas secas.

Na decocção foram encontrados compostos fenólicos, cumarinas, compostos

lactônicos, aminoácidos e açúcares redutores, enquanto no extrato foram

encontrados flavonoides, compostos fenólicos, alcaloides, quinonas, cumarinas,

compostos lactônicos, aminoácidos, antocianidinas e açúcares redutores, porém,

neste não houve resultados de atividade analgésica e anti-inflamatória. Os

resultados obtidos com a decocção das folhas frescas permitem a validação do uso

popular (AMADOR et al., 2006).

Annona diversifolia Saff., conhecida no México por muitos nomes locais como

"Ilama" e "Ilama zapote", seus frutos são utilizadas como alimento, mas as suas

folhas são empregadas como anticonvulsivante e analgésico, bem como um agente

anti-inflamatório na medicina tradicional mexicana. Carballo et al. (2010), em seu

estudo reforça a utilização das folhas de A. diversifolia no tratamento da dor e da

inflamação, visto que seus resultados demonstraram capacidade de produzir total

antinocicepção no modelo de dor visceral, e redução parcial da nocicepção artrítica.

As análises indicaram a presença de flavonoides e a participação da palmitona na

sua atividade antinociceptiva.

Annona muricata L., vulgarmente conhecida como graviola, é encontrada na

América Central, América do Sul, incluindo as regiões Norte, Nordeste e Sudeste do

Brasil. Tradicionalmente, as folhas são usadas para dores de cabeça, insônia, cistite,

problemas de fígado, diabetes, hipertensão e como anti-inflamatório. Entre os

constituintes químicos encontrados nessa espécie, os alcaloides e os óleos

essenciais se destacam. Quando realizados testes pré-clínicos através dos modelos

de nocicepção e inflamação, os resultados foram significantes em relação ao

controle, especialmente na dose de 400 mg/kg, confirmando o uso popular (SOUSA

et al., 2010).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Annona glabra, popularmente conhecida no Brasil como araticum-do-brejo e

araticum-bravo, têm demonstrado grande quantidade de compostos químicos, como

alcaloides, acetogeninas e diterpenos em extratos preparados de cascas, caules,

folhas e frutos. Siebra et al. (2009) em sua pesquisa demonstra que o extrato de A.

glabra inibe a migração natural de granulócitos, de forma dependente da dose,

sugerindo potencial anti-inflamatório.

Annona coriacea Mart., popularmente conhecida como araticum, é encontrada

nas regiões Sudeste, Norte e Nordeste do Brasil, especialmente no estado do Ceará.

As folhas são usadas na medicina popular por via oral como carminativa,

estomáquica, anti-reumática e anti-helmíntica e, externamente, em compressas e

bochechos, no tratamento de estomatite, nevralgias e cefaleias. A pesquisa realizada

com o extrato metanólico das folhas desta espécie demonstrou propriedades

analgésica e anti-inflamatória, através dos modelos pré-clínicos de contorções

abdominais, formalina, placa quente, edema de pata e pleurisia induzida por

carragenina (SOUSA et al., 2007).

A raiz e as folhas de Annona senegalensis são vendidas na Nigéria para alívio

da dor, tratamento do câncer e artrite. O extrato metanólico da raiz tem propriedades

anti-inflamatórias e antinociceptiva comprovados através de modelos de nocicepção

e inflamação, podendo justificar o uso tradicional da planta na Nigéria para o

tratamento de reumatismo e outras doenças relacionadas com a dor ( ADZU et al.,

2003b).

3.4. Considerações sobre a espécie Annona vepretorum Mart.

Annona vepretorum Mart. (Annonaceae), é uma espécie predominantemente

tropical, é endêmica do Brasil e com distribuição na Caatinga (Figura 1) (SANTOS et

al., 2012; MAAS et al., 2013).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Figura 1. Foto de Annona vepretorum Mart. (Autor: NEPLAME - Núcleo de Estudos

e Pesquisas de Plantas Medicinais)

Há registro da ocorrência dessa espécie no município de Poço Redondo –

Sergipe, que é totalmente inserido no bioma Caatinga. Nessa região é conhecida

como “Bruteira” (SANTOS et al., 2012), "Araticum" e "Pinha da Caatinga", sendo

amplamente utilizada na nutrição humana. Seus frutos normalmente são

consumidos "in natura" ou utilizados em sucos (COSTA et al., 2012). Além disso,

segundo a população local, as raízes quando maceradas apresentam indicação

contra picada de abelhas, além do emprego como um anti-inflamatório natural

(COSTA et al., 2011). Esta espécie também é encontrada em Jaguarari – Bahia,

Petrolina e Lagoa Grande, cidades do estado de Pernambuco, inseridas no bioma

caatinga (Figura 2).

Estudos prévios realizados com esta espécie descrevem a composição

química e atividade antimicrobiana, antioxidante, tripanozomicida e citotóxica do óleo

essencial das folhas coletadas em Poço Redondo, estado de Sergipe, Nordeste do

Brasil (COSTA et al., 2012; PINTO et al., 2012), porém, não há relatos na literatura

de estudos farmacológicos referentes a esta espécie.

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Figura 2. Distribuição fitogeográfica de Annona vepretorum (Disponível em

http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2013).

3.5. Considerações sobre dor

3.5.1. Dor e Nocicepção

A palavra “dor”, na língua portuguesa, vem do latim: dolore, que significa

sofrimento; e “pain” na língua inglesa, do grego: poiné, pena (FEIN, 2011). A dor é

uma das principais causas do sofrimento humano, levando a incapacidades,

comprometimento da qualidade de vida e repercussões psicossociais e econômicas

que a torna um problema de saúde pública (BOTTEGA; FONTANA, 2010). Gerrits et

al. (2012) mostra que transtornos depressivos e de ansiedade são maiores quando a

dor está presente.

De acordo com a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), o

termo dor conceitua-se como uma experiência sensorial e emocional desagradável,

relacionado à lesão tecidual real ou potencial, ou descritas em termos desse tipo de

dano. Assim, a dor caracteriza-se como uma experiência complexa que envolve

além de transdução de estímulos nocivos ambientais, o processamento emocional

pelo cérebro (JULIUS; BASBAUM, 2001). É uma consequência fisiopatológica de

diversas morbidades e de suas repercussões, mas que na maioria das vezes

configura-se como uma função protetora, representando, em muitos casos, o único

sintoma para o diagnóstico de várias doenças (OLIVEIRA et al., 2009).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Tendo em vista que a dor é um sintoma clinicamente importante de precaução

e, consequentemente, limitação de possíveis danos (WOOLF, 2000), a Agência

Americana de Pesquisa e Qualidade em Saúde Pública e a Sociedade Americana de

Dor a descrevem como o quinto sinal vital, devendo ser avaliado indispensavelmente

junto aos outros sinais vitais: temperatura, pulso, respiração e pressão arterial

(SOUSA, 2002).

Diferente de nocicepção, a dor é mais que uma sensação, é uma experiência,

podendo incorporar componentes sensoriais com influências pessoais e ambientais

importantes. Enquanto, o termo nocicepção refere-se ao estímulo doloroso

propriamente dito, sem levar em consideração o componente emocional, ou seja,

engloba as vias neuroanatômicas, bem como os mecanismos neurológicos e os

receptores específicos que detectam o estímulo lesivo. Sendo assim, uma vez que

os animais não são capazes de expressar verbalmente os componentes subjetivos

da dor, neles não se avalia dor, e sim nocicepção. Logo, termos como dor e

analgesia são empregados para estudos em humanos, enquanto que nocicepção e

antinocicepção são mais utilizados para estudos pré-clínicos, envolvendo animais de

laboratório (KANDEL et al., 2003).

A dor pode ser classificada de acordo com o tipo de lesão e com os

mediadores envolvidos, recebendo as seguintes denominações: neurogênica,

quando ocorre lesão do tecido neuronal; neuropática, quando ocorre a disfunção de

um nervo; psicogênica, que ocorre por fatores psicológicos; ou nociceptiva, quando

ocorre por estimulação excessiva dos nociceptores. Em termos de duração, um

episódio de dor pode ser agudo ou crônico. A dor aguda corresponde à ativação

local de nociceptores induzida por um dano tecidual, sendo que a dor desaparece

até mesmo antes do restabelecimento do tecido lesado (MILLAN, 2002). Já a dor

crônica é aquela que persiste mesmo tendo passado a fase de cura de uma lesão ou

injúria, passando a se repetir ou sustentar-se por período prolongado e não tem

aparentemente nenhuma função fisiológica ou protetora (APKARIAN et al., 2009).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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3.5.2. Nociceptores

Os nociceptores são terminações nervosas livres que respondem a estímulos

nociceptivos, detectando, desse modo, lesão nos tecidos, onde os estímulos

desencadeantes podem ser mecânicos, térmicos ou químicos (MILLAN, 2002).

A função básica dos nociceptores é de transmitir informações aos neurônios

de ordem superior sobre a lesão tecidual ocasionada por estímulos nocivos (FEIN,

2011), e se encontram dispersos por todo o corpo, inervando a pele, músculos,

articulações e órgãos internos (JULIUS; BASBAUM, 2001).

Alguns nociceptores são sensíveis a um estímulo específico, enquanto outros

são sensíveis a vários tipos de estímulos. Estas estruturas são descritas em quatro

classes: mecânicos, térmicos, polimodais e silenciosos. Os nociceptores mecânicos

respondem à pressão intensa, os térmicos respondem às temperaturas extremas,

quentes (> 45 °C) ou frias (< 5 °C) e possuem fibras A mielinizadas. Em conjunto,

esses nociceptores de fibra A δ-β são denominados nociceptores mecanotérmicos.

Os nociceptores polimodais respondem aos estímulos nocivos mecânicos, térmicos

ou químicos, e os nociceptores silenciosos são ativados por estímulos químicos,

mediadores inflamatórios, respondendo a estímulos mecânicos e térmicos somente

depois de serem ativados (FEIN, 2011).

A estimulação destes nociceptores promove uma liberação local de

mediadores químicos, que por sua vez, irão interagir com nociceptores específicos

conduzindo à propagação do sinal doloroso por alteração na permeabilidade da

membrana da fibra nervosa gerando o potencial de ação (JULIUS; BASBAUM, 2001;

GRIFFIS et al., 2006).

3.5.3. Vias nociceptivas

A transmissão do sinal nociceptivo está sujeita a uma variedade de

moduladores que podem atuar de forma facilitatória ou inibitória, desde os

nociceptores até as estruturas cerebrais responsáveis pela percepção da dor

(GEBHART, 2004).

A cascata de eventos que levam à integração dos sinais dolorosos envolve

receptores (nociceptores periféricos), vias ascendentes na medula espinhal, áreas

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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de integração no cérebro (localizadas principalmente no tálamo) e projeções

corticais (para áreas do córtex somatossensorial primário e secundário, bem como

para o córtex insular e cingular) (CALVINO; GRILO, 2006).

Os nociceptores estão associados a fibras aferentes de pequeno diâmetro,

que podem ser mielinizadas (fibras tipo A) ou amielinizadas (fibras tipo C). As fibras

aferentes de primeira ordem, relacionadas com a condução de estímulos dolorosos,

são classificadas de acordo com sua estrutura, diâmetro e velocidade de condução

em três tipos: fibras C, fibras A-beta e fibras A-delta (RANG et al., 2012).

Na percepção da dor, os neurônios aferentes primários que participam da

transmissão da sensação dolorosa envolvem fibras intensamente mielinizadas, de

maior diâmetro (10 μm) e que apresentam maior velocidade de condução (30-100

m/s), caracterizadas como fibras Aβ. Entretanto, a maioria dos nociceptores está

inclusa nas fibras de pequeno (0,4-1,2 μm) e médio diâmetro (2-6 μm), que

constituem respectivamente as fibras C, não mielinizadas, e as fibras Aδ, pouco

mielinizadas (JULIUS; BASBAUM, 2001).

Na medula espinhal, estas fibras nervosas sensoriais liberam

neurotransmissores, tais como aminoácidos (glutamato) e neuropeptídeos. Além

disso, ocorre a liberação de uma variedade de agentes (bradicinina, citocinas,

eicosanóides, serotonina e histaminas), que, agindo sobre os seus próprios

receptores, contribuem para alterar o limiar nociceptivo dessas fibras (CURY et al.,

2011).

Todas as fibras nociceptivas sensoriais primárias fazem conexões sinápticas

com neurônios secundários na substância cinzenta do corno dorsal da medula

espinhal. Os neurônios do corno dorsal, por sua vez, projetam seus axônios e

transmitem a informação nociceptiva para os centros encefálicos, incluindo a

formação reticular, hipotálamo e tálamo que através de neurônios terciários, enviam

o sinal ao córtex cerebral (ALMEIDA et al., 2004).

A informação nociceptiva é transmitida da medula espinhal para o tálamo e

para o córtex por cinco vias ascendentes: os tratos espinotalâmico, espinoreticular,

espinomesencefálico, cervicotalâmico, espinohipotalâmico (PINTO, 2000). Os pontos

de projeções para os neurônios nociceptivos são divididos em quatro categorias. A

categoria principal é composta pelos núcleos localizados no tálamo ventrolateral, o

qual é específico para o toque e nocicepção; estes neurônios convergem pelos

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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axônios do trato espinotalâmico, os quais possuem seus corpos celulares nas

lâminas I, IV e V do corno dorsal (HUNT; MANTYH, 2001).

A segunda categoria inclui pontos de projeções do bulbo e mesencéfalo, estas

áreas recebem informações que convergem através dos tratos espinoreticular e

espinotalâmico. A terceira categoria é composta pelo hipotálamo que recebe

terminações axônicas provenientes tanto diretamente do trato espinotalâmico,

quanto indiretamente do trato espinobraquial-hipotalâmico. Finalmente, a quarta

categoria envolve o complexo amigdaloide, que faz parte da estrutura límbica, este

recebe informações do núcleo parabraquial lateral (CALVINO; GRILO, 2006).

A regulação da dor é explicada pela Teoria da Comporta da Dor, desenvolvida

por Melzak & Wall na década de 60. Constitui-se em um modelo de percepção da

dor no qual há uma regulação da passagem dos impulsos das fibras aferentes

periféricas para o tálamo através dos neurônios de transmissão no corno dorsal. Ela

funciona como uma estação regulatória para a transmissão da dor. Assim, a

percepção da dor se dá pelo somatório da estimulação sensorial e um intenso

controle central. Neurônios inibitórios descendentes ou influxo aferente não-

nociceptivo ativam os neurônios da substância gelatinosa (SG) os quais, por sua

vez, inibem as células transmissoras da dor dificultando a passagem do impulso

doloroso para os centros superiores. Já a estimulação das fibras C, inibe os

neurônios inibitórios da SG permitindo a passagem do impulso doloroso para o

tálamo, constituindo-se então o processo de regulação da passagem do impulso

doloroso para os centros superiores (VITOR et al., 2008).

3.5.4. Mecanismo da dor central

Um dos mecanismos centrais de grande importância na fisiopatologia da dor é

o da transmissão facilitada no corno dorsal e consequentemente para as vias

nociceptivas superiores (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998).

Após a lesão tecidual ou estímulo doloroso, canais iônicos na membrana

plasmática do nociceptor originam um potencial de ação do receptor (FEIN, 2011).

Em seguida, há liberação de neurotransmissores, como substância P, somatotastina,

neurocinina-A, glutamato e aspartato. Essas substâncias estão relacionadas com a

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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ativação de potenciais pós-sinápticos excitatórios e dos receptores N-metil-D-

aspartato (NMDA).

3.5.5. Mecanismo da dor periférica: dor inflamatória

A dor inflamatória ocorre devido à sensibilização dos neurônios nociceptivos

sensoriais primários (CUNHA et al., 2005). Após uma lesão tecidual ou inflamação,

os nociceptores são ativados pela ação de mediadores químicos (VERRI et al.,

2006). Esses mediadores ativam cascatas de segundos mensageiros, influenciando

canais iônicos, enzimas e proteínas de sinalização intracelular nos nociceptores,

levando ao aumento da excitabilidade do neurônio, diminuindo o limiar de disparo e

aumentando a frequência de potenciais de ação produzidos durante uma

estimulação supralimiar (BASBAUM; WOOLF, 1999).

A lesão tecidual inicial resulta na liberação de mediadores pelas células

lesadas, incluindo os prótons H+, serotonina, bradicinina, histamina e óxido nítrico

(NO). Posteriormente, a ativação do processo inflamatório induz a via do ácido

araquidônico, resultando na produção de prostaglandinas e leucotrienos e, por fim,

as células do sistema imune são recrutadas, liberando ainda outros mediadores,

incluindo fatores de crescimento e citocinas como interleucina-1 (IL-1) e fator de

necrose tumoral-α (TNF-α) (KIDD; URBAN, 2001).

3.6. Drogas analgésicas

O alívio ou o cessar da dor é obtido pelo uso de analgésicos. A ação

analgésica central pode ser mediada através da inibição dos receptores da dor

central, enquanto o efeito analgésico periférico pode ser mediado através da inibição

da cicloxigenase (COX) e/ou lipoxigenase, além de outros mediadores inflamatórios

(CHAVAN et al., 2010).

Os analgésicos de ação central, opioides, a exemplo da morfina, incluem

fármacos capazes de aliviar a dor por atuarem em receptores de superfície celular

denominados de receptores opioides (QUINTÃO et al., 2011). Estudos

farmacológicos confirmaram, por clonagem dos receptores, que existem três tipos

principais de receptores de opioides, chamados de μ, κ e δ que medeiam os

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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principais efeitos farmacológicos dos opiáceos (STEIN et al., 2009). A morfina e a

maioria de seus análogos exercem seus efeitos analgésicos atuando principalmente

nos receptores μ (MERRER et al., 2009).

Os opioides, como a morfina, são os fármacos usados para o tratamento mais

eficaz para a maioria dos tipos de dor. Infelizmente, o uso de opioides é limitado

pelos seus efeitos secundários, o potencial de dependência e o desenvolvimento de

tolerância (MORGAN; CHRISTIE, 2011). Alguns dos efeitos secundários são:

constipação, náusea, vômito, sedação, depressão respiratória e retenção urinária

(QUINTÃO et al., 2011).

Em geral, os anti-inflamatórios não-esteroidais inibem, de forma variável,

ambas as isoformas da COX em suas doses terapêuticas. Deste modo, passaram a

ser caracterizados de acordo com sua capacidade de inibição da COX-1 e 2

(KUMMER; COELHO, 2002). Apesar de sua eficácia em uma ampla gama de

condições de dor e inflamação, a administração de AINES em longo prazo pode

induzir úlceras gastrointestinais, sangramentos e desordens renais devido à inibição

não seletiva das isoformas constitutiva (COX-1) e induzível (COX-2) da enzima

cicloxigenase (COX) (TAPIERO et al., 2002). A COX é a enzima responsável pela

metabolização do ácido araquidônico em precursores das prostaglandinas. Estes

são depois processados em prostaglandinas biologicamente ativas, sendo a

prostaglandina E2 (PGE2) a mais relevante para a indução da dor inflamatória

(CHOPADE; MULLA, 2010).

Por outro lado, os coxibes, inibidores seletivos de COX-2, apesar da reduzida

toxicidade gastrointestinal, têm sido associados a efeitos cardiovasculares adversos,

como aumento da ocorrência de infarto do miocárdio e acidentes vasculares

encefálicos (DOGNÉ et al., 2005), devido ao desequilíbrio de fatores pró-

trombóticos, podendo levar à agregação plaquetária e vasoconstrição (KUMMER;

COELHO, 2002).

3. 7. Modelos experimentais para avaliação da atividade antinociceptiva

3.7.1. Contorções abdominais induzidas por ácido acético

O teste de contorções abdominais é um modelo químico de nocicepção que

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se baseia na contagem das contorções da parede abdominal seguidas de torção do

tronco e extensão dos membros posteriores, como resposta reflexa à irritação

peritoneal e à peritonite produzidas pela injeção intraperitoneal de uma solução de

ácido acético 0,9% (WHITTLE, 1964).

Este teste é sensível à avaliação de drogas analgésicas, no entanto, pode ser

visto como um modelo geral, não seletivo, para estudos de drogas antinociceptivas

(COUTO et al., 2011), uma vez que a irritação local produzida pela injeção

intraperitoneal do ácido acético provoca a liberação de uma variedade de

mediadores, tais como a substância P, bradicininas, prostaglandinas, bem como das

citocinas pró-inflamatórias tais como IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α (PINHEIRO et al.,

2011). Alguns investigadores têm associado este método com a liberação de

prostanoides, em geral, níveis elevados de PGE2 e PGF2α, bem como produtos da

lipoxigenase em fluidos peritoneais (VERMA et al., 2005).

3.7.2. Teste da formalina

O teste da formalina é um método de avaliação comportamental utilizado para

medir a efetividade de agentes antinociceptivos (HUNSKAAR; HOLE, 1987;

RANDOLPH; PETERS, 1997). Este modelo de dor está associado à lesão tecidual,

no qual se quantifica a resposta comportamental provocada pela injeção subcutânea

de formalina diluída na pata traseira do animal (DUBUISSON; DENNIS, 1977;

MARTINS et al., 2006).

A vantagem deste teste sobre outros métodos de nocicepção é a possibilidade

de avaliar dois tipos diferentes de dor ao longo de um período prolongado de tempo

e, assim, permite o teste de analgésicos com diferentes mecanismos de ação

(RANDOLPH; PETERS, 1997).

As respostas comportamentais à formalina seguem um padrão bifásico

composto de uma fase inicial aguda (primeira fase), e por um período mais

prolongado (segunda fase) de atividade comportamental aumentada, que pode durar

até cerca de uma hora. O período entre as fases é denominado intervalo de

quiescência (DUBUISSON; DENNIS, 1977, MARTINS et al., 2006).

A primeira fase inicia-se imediatamente após a injeção de formalina e se

estende pelos primeiros 5 minutos (dor neurogênica ou aguda), estando relacionada

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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com a estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes do tipo C e,

em parte, das fibras do tipo Aδ e está associada à liberação de aminoácidos

excitatórios, óxido nítrico e substância P. A segunda fase ocorre entre 15 e 30

minutos após a injeção de formalina e está relacionada com a liberação de vários

mediadores pró-inflamatórios, como bradicinina, prostaglandinas e serotonina, entre

outros. O intervalo de quiescência entre a primeira e a segunda fase é resultado de

uma inibição da transmissão nociceptiva através de circuitos supra-espinhais e

espinhais (HUNSKAAR; HOLE, 1987).

3.7.3. Teste de Randall-Selitto

O modelo experimental desenvolvido por Randall & Selitto (1957) é um

método para avaliação da hipernocicepção bastante utilizado, que se fundamenta na

indução de hiperalgesia através de pressão crescente na pata do animal. Este teste

é baseado no princípio de que a inflamação diminui o limiar de reação à dor e que

essa redução pode ser modificada por analgésicos narcóticos e não-narcóticos.

Neste ensaio experimental, um agente flogístico é injetado no tecido

subplantar de uma das patas traseiras, e é medido o tempo de latência da retirada

da pata a partir da pressão exercida. O reflexo de retirada da pata é considerado

representativo do limiar hipernociceptivo, ou seja, a força necessária aplicada à pata

para que induza uma resposta aversiva a um estímulo nocivo (Limiar Nociceptivo de

Retirada da Pata - LNRP). A força necessária para que esse animal exiba tal

resposta é registrada em gramas. O LNRP é avaliado antes e após a administração

dos estímulos hiperalgésicos ou inflamatórios, que variam de acordo com o

experimento (RANDALL; SELITTO, 1957).

3.7.4. Teste de von Frey

O uso de filamentos de von Frey é um método utilizado para avaliar a

sensibilidade tecidual ao estímulo mecânico, sendo bastante utilizado clinicamente.

Entretanto, tal método passou a ser utilizado também para experimentos

laboratoriais, no sentido de avaliar a influência de drogas sobre a sensibilidade

nociceptiva em animais. Além disso, essa técnica foi transformada em um método

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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eletrônico, usado primeiramente em humanos (JENSEN et al., 1986), e

posteriormente em ratos e camundongos (CUNHA et al., 2004).

Os experimentos são realizados com um anestesiômetro eletrônico, que

consiste em um transdutor de pressão adaptado a um contador digital de força

expressa em gramas (g). O contato do transdutor de pressão com a pata é realizado

através de uma ponta descartável de polipropileno. Os animais são colocados em

caixas de acrílico durante 15-30 minutos para adaptação. O assoalho da caixa é feito

de arame não maleável na forma de rede. As alterações nos limiares nociceptivos

são avaliadas exercendo-se uma pressão linearmente crescente no centro da planta

da pata do animal até a produção de uma resposta caracterizada como sacudida

(flinches) da pata estimulada. Os estímulos são repetidos por até seis vezes, em

geral até o animal apresentar três medidas similares com uma clara resposta de

flinch após a retirada da pata. A intensidade de hipernocicepção é quantificada como

a variação na pressão obtida subtraindo-se a média de três valores, expressos em

gramas (força), observada antes do procedimento experimental (0 hora) da média de

três valores, em gramas (força), após a administração dos estímulos, que variam de

acordo com o experimento (JENSEN et al., 1986).

Os modelos experimentais baseados em testes mecânicos permitem a

avaliação do aumento da sensibilidade do nociceptor a estímulos inócuos (alodinia)

ou nocivos (hiperalgesia). Porém, além de estímulo de nociceptores de fibras Aδ e

nociceptores de fibras C, também podem ser ativados mecanorreceptores,

resultando em estímulos inespecíficos que nem sempre refletem a neurofisiologia da

nocicepção. Particularmente, o teste de von Frey, é usado para avaliar através do

estímulo mecânico inócuo e crescente (alodinia mecânica) a sensibilidade tecidual

provocada pela incisão (LE BARS et al., 2001).

3.7.5. Dor orofacial induzida por formalina

A região orofacial é uma área densamente ocupada pelo nervo trigêmeo e,

muitas vezes, é sítio frequente de dores referida e crônica. Alterações clínicas no

território trigeminal, como aumento de sensibilidade cutânea e hiperalgesia,

observadas em cefaleias primárias e dores orofaciais em geral, são muito sugestivas

de anormalidades no sistema nociceptivo trigeminal (PERLA, 2007).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Entre os modelos nociceptivos experimentais de dores orofaciais e cefálicas,

o teste da formalina é um dos mais relevantes em termos de aplicabilidade

experimental e clínica, quando se estuda dores agudas (PERLA, 2007). Ele avalia a

nocicepção trigeminal por meio da aplicação de estímulo químico (administração

subcutânea de uma solução de formalina) na região orofacial. Este modelo constitui

uma adaptação do teste da formalina administrada na superfície plantar de animais

(DUBUISSON; DENNIS, 1977, RABOISSON; DALLEL, 2004). Contudo, vale

ressaltar que para uma avaliação mais detalhada dos receptores envolvidos no

mecanismo de ação do produto natural a ser testado, este ensaio experimental pode

ser realizado com a aplicação de outros agentes químicos, como por exemplo,

glutamato e capsaicina (SILVA, 2011). As principais respostas comportamentais que

caracterizam a dor e que são observadas nesse modelo experimental são: medida

do tempo ou do número de reflexos de autolimpeza (grooming) dirigidos ao local da

injeção de formalina; vocalização espontânea; tremores vigorosos do corpo

(shaking) associados ao ato de lamber as patas dianteiras e proteger vigorosamente

a face; e trismo (PERLA, 2007).

Assim como no teste da aplicação de formalina subplantar, os parâmetros

indicativos de dor para este modelo também podem ser observados imediatamente

após a aplicação do agente químico e, posteriormente, após o período de

quiescência. Segundo Dubuisson & Dennis (1977), a dor, no modelo nociceptivo

trigeminal, é inicialmente resultante da reação inflamatória gerada pela ligação da

formalina às proteínas teciduais, por meio da formação de pontes primárias de

carbono (propriedade fixadora do tecido). Tal reação inflamatória na área de injeção

persiste por período relativamente longo. A resposta inicial (primeira fase)

possivelmente decorre da estimulação direta dos nociceptores, enquanto que a

segunda fase do teste deve-se à inflamação e sensibilização central.

3.7.6. Teste da placa quente

O teste da placa quente (hot plate) avalia o tempo em que os animais

permanecem sobre uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5 ºC) até reagirem ao

estímulo térmico com o comportamento de levantar ou lamber as patas (TITA et al.,

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2011). As aferições são realizadas nos tempos de 30, 60, 90 e 120 minutos após a

administração das substâncias a serem analisadas.

O modelo experimental foi inicialmente descrito por Woolfe & Macdonald

(1944) como modelo específico para a detecção de substâncias analgésicas de

efeito central. Embora o uso de analgésico central e periférico responda pela inibição

do número de contrações provocadas por estímulos químicos que levam à dor,

apenas os analgésicos centrais aumentam o tempo de resposta no teste da placa

quente. Este modelo utiliza a temperatura como estímulo nociceptivo. Dessa forma,

os nociceptores (fibras C e Aδ, principalmente) são estimulados após a ativação dos

receptores vaniloides, especificamente os receptores do tipo VR-1, que possuem

limiar de ativação em 43 ºC, e os receptores do tipo VRL-1, que possuem limiar de

ativação em 52 ºC. Estes últimos são importantes na avaliação da resposta a

estímulos térmicos nocivos, pois são responsáveis pela resposta em decorrência do

aumento da temperatura (JULIUS; BASBAUM, 2001; BENEDITO, 2009).

3.7.7. Teste de retirada da cauda

O teste de retirada da cauda (tail-flick) é sensível para identificar a atividade

de compostos presentes em extratos vegetais ou isolados a partir desses, além de

sintéticos, cujos mecanismos sejam semelhantes aos promovidos pelos analgésicos

opioides (OLIVEIRA et al., 2008).

Este ensaio experimental consiste na aplicação de uma fonte radiante de

calor na cauda do animal como estimulo nociceptivo térmico, provocando seu

movimento de retirada (OLIVEIRA et al., 2009). Um aumento no tempo de reação é

geralmente considerado como um parâmetro importante para avaliar a atividade

antinociceptiva central, caracterizando-se por uma nocicepção aguda não

inflamatória. Sendo assim, substâncias que atuam em nível central, como a morfina,

são capazes de suprimirem respostas de neurônios espinhais ao estímulo térmico

nocivo na cauda, aumentando o tempo de latência (FISCHER et al., 2008).

3.8. Considerações sobre inflamação

O conceito de inflamação ou flogose é originado do grego phologosis e do

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latim flamma, cujo significado é oriundo das características morfofisiológicas,

significando assim área em chamas. Na clínica, quatro sinais principais da

inflamação são conhecidos: rubor, dor, calor e tumor. A perda de função, quinto

sinal clínico, foi posteriormente adicionada por Virchow. Estes sinais são tipicamente

mais proeminentes na inflamação aguda do que na crônica (COTRAN, 2006).

A inflamação é uma reação do tecido vascularizado a estímulos endógenos

ou exógenos que podem provocar dano celular, podendo haver a prevenção ou

progressão da mesma pelo isolamento ou destruição do agente lesivo. O processo

inflamatório abrange uma série de fenômenos que se originam não só por agentes

infecciosos, como também por agentes físicos, químicos, isquemia e interações

antígeno – anticorpo (FLOWER et al., 2005).

A resposta inflamatória pode ser dividida em aguda e crônica, divisão essa

baseada na duração e características patológicas da reação inflamatória. A

inflamação aguda apresenta relativamente, rápido início e uma duração

relativamente curta (horas a dias) caracterizando-se por vasodilatação, exsudação

de fluido ou exsudato rico em proteínas com formação de edema, migração de

células (primariamente neutrófilos) para o sítio lesado e, em alguns casos, ativação

da cascata de coagulação (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004).

Já a inflamação crônica tem longa duração e está associada com a presença

de linfócitos e macrófagos, proliferação de vasos sanguíneos, fibroses e tecidos

necrosados. O processo inflamatório compreende dois eventos que ocorrem

simultaneamente durante o curso evolutivo (eventos vasculares e celulares)

(BRASILEIRO-FILHO, 2007).

3.8.1. Eventos vasculares

Ao iniciar o processo inflamatório, os vasos sanguíneos sofrem alterações,

que promovem a passagem de proteínas plasmáticas e células da circulação para o

local da lesão ou da infecção (KUMAR et al., 2005).

Os sinais da inflamação se desenvolvem rapidamente logo após a lesão,

resultando na vasodilatação e extravasamento de células (ALLER et al., 2007;

SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). A vasoconstricção é um contribuinte

primário e é iniciada através da liberação de catecolaminas, contudo, células

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lesadas que secretam prostaglandinas também contribuem para essa redução no

calibre dos vasos (ALLER et al., 2007). A vasodilatação segue a vasoconstricção

inicial sendo revertida após 10 a 15 minutos da lesão, sendo mediada por produtos

endoteliais e fatores derivados de mastócitos como leucotrienos, prostaglandinas e,

particularmente, histamina (ALLER et al., 2007). O edema é provocado pelo

aumento da permeabilidade vascular, que promove extravasamento de fluido rico em

proteínas, de alto peso molecular, do compartimento intravascular para o interstício

(ALLER et al., 2007; KUMAR et al., 2005).

3.8.2. Eventos celulares

A vasodilatação e a exsudação plasmática são acompanhadas pela

marginação, adesão e migração de leucócitos para sítios de inflamação, processo

esse crucial para as funções destas células tanto na imunidade inata quanto na

adaptativa (VAN MIERT, 2002).

A migração de neutrófilos, monócitos e células “natural killer” é, comumente,

iniciada em respostas inatas, a partir da geração local de mediadores inflamatórios,

como quimiocinas e algumas citocinas específicas (NOURSHARGH; MARELLI-

BERG, 2005). A migração dos leucócitos do compartimento vascular para o tecido

extravascular é mediada por interações adesivas específicas entre os leucócitos e

as células endoteliais. A sequência de eventos neste processo envolve marginação e

captura dos leucócitos livres circulantes do lúmen vascular; rolamento, ativação,

adesão firme e extensão na superfície do endotélio; passagem através da barreira

das células endoteliais ou diapedese e transmigração (WAGNER; ROTH, 2000).

Os grupos de moléculas de adesão de maior importância são as selectinas

(E, P e L- selectinas), uma vez que medeiam à adesão fraca, acompanhada do

rolamento e, em seguida, a adesão firme dos leucócitos, fenômeno intercedido por

imunoglobulinas e integrinas β-2 presentes na superfície dos leucócitos, cuja

expressão pode ser aumentada após a ativação do leucócito por mediadores

inflamatórios como as citocinas. Seguida a adesão firme, ocorre ligação estável

mediada por imunoglobulinas, principalmente molécula de adesão intercelular-1,

moléculas de adesão intercelular-2, molécula de adesão de célula endotelial e

plaquetas que estão presentes no endotélio, denominadas de integrinas β-2

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(WAGNER; ROTH, 2000).

O recrutamento das células inflamatórias para os locais da lesão envolve,

além das moléculas de adesão celular descritas, interações combinadas de diversos

tipos de mediadores solúveis que parecem desempenhar um papel essencial na

coordenação do processo inflamatório (ROBERTSII; MORROW, 2003).

3.8.3. Mediadores químicos

Para que ocorra este processo, muitos mediadores químicos apresentam-se

envolvidos, podendo ser de origem tissular, como as aminas vasoativas, fator de

ativação plaquetária (PAF), eicosanoides, citocinas, radicais livres superóxidos,

óxido nítrico (NO) e neuropeptídeos; ou ainda de origem plasmática, como os

sistemas de coagulação, do complemento, das cininas e fibrinolítica (RANG et al.,

2012).

Estes por sua vez, são responsáveis pelos eventos vasculares, permitindo

assim a vasodilatação, a estase vascular e o aumento da permeabilidade capilar;

garantindo ainda a migração de leucócitos da circulação para o tecido inflamado e

coordenando as múltiplas respostas de defesa local. Alguns desses mediadores

apresentam a capacidade de estimular neurônios sensoriais locais, contribuindo para

o surgimento da nocicepção (ROTH et al., 2009).

Contudo, é possível que a inflamação ultrapasse certos níveis, sendo assim,

permite que quantidades suficientes de mediadores endógenos entrem na circulação

sistêmica, se disseminando na corrente sanguínea e provocando múltiplas reações,

chamadas de resposta de fase aguda que incluem o desenvolvimento da febre, a

perda do apetite, aumento do ciclo de sono, diminuição da atividade motora, a

redução da libido e a diminuição do comportamento de alerta (ROTH et al., 2009).

Dentre as citocinas liberadas no momento do trauma, destaca-se o fator de

necrose tumoral (TNF-α) que promove a liberação de outras citocinas, destacando-

se a interleucina 1-beta (IL-1β) e a interleucina 8 (IL-8). A IL-1β, por sua vez,

promove a ativação da enzima cicloxigenase (COX) responsável pela produção de

prostaglandinas - PGs, prostaciclinas - PIs e tromboxanos – TXs, enquanto a IL-8

atua na liberação local de aminas simpatomiméticas (BASBAUM; JULIUS, 2006;

VERRI et al., 2006).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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3.9. Drogas anti-inflamatórias

3.9.1. Anti-inflamatórios não esteroidais

Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) são as drogas mais comumente

prescritas no mundo todo, apresentam atividade analgésica, antipirética e anti-

inflamatória, apresentam-se como um grupo heterogêneo de compostos que embora

não estejam relacionados quimicamente compartilham de ações terapêuticas e

efeitos colaterais (GILMAN et al., 2006).

Os fármacos inclusos nessa classe são classificados de acordo com sua

origem química, em sete grandes grupos: os salicilatos; derivados do paraminofenol

(paracetamol); derivados do ácido acético; fenamatos; derivados do ácido

propiônico; ácidos enólicos (oxicans); e derivados da pirazolona. Cada um deles

apresenta subgrupos que proporcionam uma variedade de produtos no mercado

farmacêutico (GILMAN et al., 2006).

Apesar do mecanismo de ação dos AINEs não ser completamente elucidado,

sabe-se que seu principal mecanismo de ação é inibir a síntese de prostaglandinas,

fato esse importante, contudo, não único no fenômeno da inflamação (RANG et al.,

2012).

Estes fármacos inibem o sítio ativo da enzima cicloxigenase, levando a não

formação de prostanoides, combatendo assim a inflamação, a dor e a febre.

Contudo, apresentam efeitos adversos principalmente no trato gastrointestinal, na

função renal e na agregação plaquetária, que tornam limitados o uso dessas drogas

(RANG et al., 2012). A maior parte desses fármacos não inibe a atividade das

lipoxigenases podendo levar ao desvio do catabolismo do ácido araquidônico para

esta via, promovendo a formação de leucotrienos e levando à continuidade do

processo inflamatório por outros mecanismos (BASBAUM; JULIUS, 2006).

Apesar da inibição da COX ser o principal mecanismo de ação dos AINES,

essa classe de drogas pode ainda exercer outros efeitos, justificando assim, a

eficiente ação de alguns fármacos, com fraca ação antiprostaglandinas. Entretanto, a

extensão na qual esses mecanismos adicionais são importantes, varia de droga para

droga e seus efeitos terapêuticos ainda são incertos (LEES et al., 2004).

Em geral, esses fármacos inibem de forma variável as isoformas COX-1 e

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COX-2 em suas doses terapêuticas, sendo então caracterizados de acordo com sua

capacidade de inibição dessas respectivas enzimas. Se em sua dose terapêutica, o

agente inibe apenas a isoforma COX-2, sem interferência na atividade COX-1,

denominam-se agente inibidor específico COX-2, os coxibes, como por exemplo, o

firocoxibe. Os fármacos que tem especificidade parcial para COX-2 são chamados

seletivos COX-2, e são exemplos o carprofeno e o meloxicam (LEES et al., 2004).

A partir de descobertas denominaram a COX-1 como fisiologicamente

constitutiva, agindo como citoprotetora gástrica e mantenedora da homeostase renal

e plaquetária e, a COX-2 ou indutiva, a qual expressava-se apenas em situações de

trauma tissular e inflamação (YAKSH et al., 2001; PERAZELLA et al., 2001;). Surge

então, a ideia de que inibidores específicos da COX-2 impediriam o processo

inflamatório sem os efeitos colaterais indesejáveis. No entanto, evidências da

presença de COX-2 em determinados tecidos humanos e de animais também

envolvidas com a homeostase, pôs em discussão a segurança e até que ponto o uso

de agentes anti-inflamatórios com inibição específica desta isoforma apresentaria

realmente vantagens sobre os não seletivos (DOGNÉ et al., 2005).

3.9.2. Anti-inflamatórios esteroidais

Os corticoesteroides (CT) são fármacos amplamente utilizados pelas suas

conhecidas propriedades anti-inflamatórias e imunossupressoras, no tratamento de

diversas patologias, tais como as doenças reumatológicas, auto-imunes,

respiratórias e no processo de transplantação de órgãos (PATRICIO et al., 2006).

São agentes que simulam os esteroides hormonais endógenos produzidos no córtex

adrenal: o cortisol (glicocorticoide) e a aldosterona (mineralocorticoide). Os

glicocorticoides são regulados primariamente pela corticotropina (ACTH), enquanto

que os mineralocorticoides são regulado pelo sistema renina-angiotensina e

possuem propriedades de retenção de sal (FINAMOR et al., 2002).

Glicocorticoides (GC) são os mais eficazes anti-inflamatórios disponíveis,

suplantando os não-esteroides. Empregam-se em doses equipotentes e são

clinicamente classificados conforme sua duração de ação. A menor atividade

mineralocorticoide é vantajosa por evitar retenção de fluido. Os glicocorticoides são

capazes de induzir a maturação celular (pneumócito tipo II), diferenciação celular

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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(linhagens da crista neural) ou mesmo a morte celular por apoptose, o que permite

seu uso no tratamento de tumores, especialmente os de linhagem hematopoiética

(LONGUI, 2007).

A maioria dos efeitos anti-inflamatórios dos glicocorticoides é mediada via

receptores de glicocorticoides citosólicos (RGC), que são encontrados em cada

célula do corpo e exercem uma variedade de ações fisiológicas afetando cada

sistema do organismo (KIM et al., 2009). Os glicocorticoides são capazes de inibir

citocinas pró-inflamatórias, como as interleucinas IL-2 e IL-12, o interferon gama

(IFN-γ) e o fator de necrose tumoral (TNF-α), bem como moléculas de adesão, como

a lipocortina-1, moléculas de adesão vascular (VCAM-1) e moléculas de adesão

intercelular (ICAM), ou ainda enzimas, como a sintase induzida pelo óxido nítrico

(iNOS), a ciclooxigenase (COX-2) e a fosfolipase A2 (PLA2) (LONGUI, 2007).

Seus excelentes efeitos terapêuticos como anti-inflamatório e

imunossupressor são, frequentemente, acompanhados por graves e, algumas vezes,

irreversíveis efeitos colaterais, como diabetes mellitus, úlcera péptica, síndrome de

Cushing com supressão do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, osteoporose, atrofia

cutânea, psicose, glaucoma, entre outras, ficando o uso dos GC limitado por estes

efeitos colaterais (SCHACKE et al., 2002).

3.10. Modelos experimentais

3.10.1. Edema de pata induzido por carragenina

A injeção subcutânea de carragenina na pata de ratos ou camundongos induz

aumento agudo e progressivo do volume da pata injetada. Este edema é

proporcional à intensidade da resposta inflamatória, constituindo um parâmetro útil

na avaliação da atividade anti-inflamatória de novos compostos.

Após a medida do volume basal de ambas as patas traseiras, os animais são

tratados com o extrato da planta medicinal nas doses escolhidas em testes

preliminares; com o veículo ou com a droga padrão. Após uma hora dos tratamentos,

os animais recebem uma injeção s.pl. de carragenina (1-2 %) em uma das patas

traseiras. Após a injeção, mede-se o volume das patas e repete-se a medida a cada

hora até completar 5 h da injeção de carragenina.

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Para a medida do volume das patas, imerge-se a pata até o maléolo lateral

em um hidropletismômetro elétrico. Este aparelho mede o volume de líquido

deslocado e o traduz de forma digital. O valor do edema é obtido pela subtração do

volume da pata injetada com salina do volume da pata injetada com o estímulo

inflamatório (LAPA et al., 2003).

O modelo experimental demonstra um elevado grau de reprodutibilidade. A

resposta inflamatória induzida pela carragenina é caracterizada por uma resposta

bifásica com formação de edema acentuado resultante da produção rápida de vários

mediadores inflamatórios, tais como histamina, serotonina e bradicinina (primeira

fase), e subsequentemente liberação de prostaglandinas e óxido nítrico (segunda

fase), com pico em 3 h, produzido por isoformas indutíveis de COX-2 e de óxido

nítrico sintase (iNOS), respectivamente (THOMAZZI et al., 2010).

3.10.2. Edema de orelha induzido por óleo de cróton

O modelo de edema induzido na orelha de camundongos por óleo de cróton

pesquisa a atividade de agentes anti-inflamatórios de uso tópico, mas também a

administração sistêmica de anti-inflamatórios esteroidais. O anti-inflamatório e o

extrato são aplicados topicamente nas orelhas direitas de camundongos e, após 1

hora, período de absorção, aplica-se topicamente na mesma orelha cróton diluído

em acetona, enquanto a outra orelha é tratada apenas com o veículo. Após 4 horas,

sacrifica-se os animais por deslocamento cervical, retira-se fragmentos de cada

orelha e pesa-se os fragmentos em balança analítica. O edema induzido é medido

pela diferença de peso entre as orelhas (LAPA et al., 2003).

O edema de orelha induzido por aplicação tópica de óleo de cróton envolve a

ativação da fosfolipase A2, com consequente biosíntese de prostaglandinas e

leucotrienos (FURSTENBERGER; MARKS, et al., 1980). O efeito edematogênico

deste agente flogístico é determinado pela presença, no óleo, de ésteres de forbol

que estimulam diretamente proteínas quinase C, ativando as vias de sinalização

celular por elas controladas (HARA et al., 1992).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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3.10.3. Peritonite induzida por carragenina

A peritonite induzida pela injeção i.p de carragenina é um modelo de

inflamação amplamente utilizado na pesquisa de drogas anti-inflamatórias (LAPA et

al., 2003). A injeção intraperitoneal de carragenina leva à migração de leucócitos

para o local da inflamação (ZHANG et al., 2011).

A quantificação dos leucócitos através de uma câmara de Neubauer permite

avaliar a influência de drogas neste parâmetro da resposta inflamatória, sendo

particularmente sensíveis+9 a anti-inflamatórios esteroidais. A presença dos

mediadores inflamatórios também podem ser avaliados e dosados no exsudato

inflamatório obtido do peritônio (LAPA et al., 2003).

Considerando a ascensão da fitoterapia no Brasil nas últimas décadas e a

necessidade da busca de moléculas com atividade analgésica e/ou anti-inflamatória

que garantam uma terapia eficaz e segura para o tratamento da dor e inflamação, o

presente trabalho realizou a avaliação da atividade farmacológica do extrato da

espécie Annona vepretorum Mart., abordando aspectos de atividade antinociceptiva

e anti-inflamatória.

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4. PARTE EXPERIMENTAL

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4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. Material vegetal

4.1.1 Coleta de Annona vepretorum Mart. para obtenção do extrato etanólico bruto

As folhas de Annona vepretorum Mart. foram coletadas no município de

Jaguarari, estado da Bahia, em junho de 2008, cujas coordenadas geográficas são:

latitude 10º03’00,00’’’ longitude 040º06’33,60’’ e altitude 689 m. O material botânico

foi identificado pelo biólogo Dr. José Alves de Siqueira Filho do Centro de Referência

para Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). Uma exsicata da

espécie está depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) da

Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) sob o código #946

(Figura.3).

Figura 3. Exsicata de Annona vepretorum coletada em Jaguarari-BA.

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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4.1.2 Coleta de Annona vepretorum para extração do óleo essencial

As folhas de Annona vepretorum foram coletadas no município de Petrolina,

estado de Pernambuco, em março de 2012, cujas coordenadas geográficas são:

latitude 09º19’37,50’’’ longitude 040º33’01,40’’ e altitude 385 m. O material botânico

foi identificado pelo biólogo Dr. José Alves De Siqueira Filho do Centro de

Referência para Recuperação de Áreas Degradadas da Caatinga (CRAD). A

exsicata da espécie está depositada no Herbário Vale do São Francisco (HVASF) na

Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF) com o código #18350

(Figura 4).

Figura 4. Exsicata de Annona vepretorum coletada em Petrolina-PE.

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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4.2. Obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de Annona vepretorum

O material vegetal foi dessecado em estufa com ar circulante à temperatura

média de 40 ºC durante três dias. Após a secagem e completa estabilização

(eliminação de água, inativação de enzimas, etc.) o material foi pulverizado em

moinho, obtendo-se um material vegetal seco e pulverizado (1400 g).

Este material seco e pulverizado foi submetido à maceração exaustiva com

etanol 95% em um percolador. Foram realizadas várias extrações com intervalos de

72 horas entre cada extração. A solução foi filtrada e concentrada no evaporador

rotatório a uma temperatura de 50 ºC sob vácuo.

Após evaporação do solvente em rotavapor, obteve-se o extrato etanólico

bruto de Annona vepretorum (Av- EtOH). A partir de 1.400 g do pó seco das folhas

foi obtido 600 g do extrato etanólico bruto (42,86% de rendimento em relação ao

peso seco da planta).

4.3. Avaliação fitoquímica preliminar dos constituintes químicos de Av-EtOH

Esta triagem procura sistematizar ou rastrear os principais grupos de

constituintes químicos que compõem um extrato vegetal. É um exame rápido e

superficial através de reagentes de coloração ou precipitação que revela a presença

de metabólitos secundários em um extrato. A triagem fitoquímica preliminar, com

vistas ao estabelecimento da possível natureza química dos compostos existentes

foi realizada com o extrato etanólico bruto. Os metabólitos secundários foram

testados baseados nos já encontrados em outras espécies do mesmo gênero.

Foram realizados testes para as classes específicas de constituintes

químicos, tais como saponinas, esteroides, alcaloides, flavonoides e taninos. Os

extratos foram avaliados em placas cromatográficas de sílica gel com suporte de

alumínio, aplicados com micropipeta e eluídos em diferentes sistemas de solventes,

conforme descrito por Wagner e Bladt (1996), procurando-se evidenciar os principais

grupos do metabolismo secundário (Tabela 1).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Tabela 1. Sistemas de eluição e reveladores utilizados para caracterizar os

principais metabólitos secundários da espécie Annona vepretorum (Annonaceae).

Classe química Sistema eluente Padrão Revelador

Alcaloides gerais

Tolueno:acetato de

etila:dietilamina

(70:20:10)

Yoimbina

Quinina Dragendorff

Antocianinas

Acetato de etila:ácido

fórmico:ácido acético

glacial:água

(100:11:11:26)

Azul de metileno Anisaldeído sulfúrico

Antraquinonas

agliconas

Éter de Petróleo:acetato

de etila:ácido fórmico

(75:25:1)

Antraquinona

Ácido

fosfomolíbdico/

H2SO4 etanólico

10%

Flavonoides

Acetato de etila:ácido

fórmico:ácido acético

glacial:água

(100:11:11:26)

Rutina

Quercetina NEU

Cumarinas

Tolueno:éter etílico

(1:1 saturado com ácido

acético 10%)

Escopoletina KOH etanólico 10%

Derivados

antracênicos

Acetato de

etila:metanol:água

(100:13,5:10)

Aloína KOH etanólico 10%

Lignanas Clorofórmio:metanol:água

(70:30:4) Estrato de linhaça Vanilina fosfórica

Naftoquinonas Tolueno:ácido fórmico

(99:1)

Biflorina

Lapachol

KOH etanólico 10%

Saponinas

Clorofórmio:ácido

acético:metanol:água

(64:32:12:8)

Saponina Anisaldeído

sulfúrico

(WAGNER; BLADT, 1996).

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Continuação

Classe química Sistema eluente Padrão Revelador

Taninos

condensados

Acetato de etila:ácido

acético glacial:ácido

fórmico:água

(100:11:11:26)

Catequina

Epicatequina

Vanilina

clorídrica

Taninos

hidrolisáveis

n-Butanol:acetona:tampão

fosfato

(40:50:10)

Ácido gálico

Ácido tânico

Sulfato de ferro

amoniacal ( 1%)

Triterpenos e

esteroides

Tolueno:clorofórmio:etanol

(40:40:10)

Lupeol

Sitosterol

Lieberman-

Burchard

Xantinas

Acetato de

etila:Metanol:água

(100: 13,5: 10)

Cafeína Iodo- KI-HCl

Adaptado de Wagner; Bladt, 1996.

4.4. Obtenção do óleo essencial das folhas de Annona vepretorum

Para obtenção do óleo essencial, as folhas frescas de Annona vepretorum

(549,0 g) foram cortadas e submetidas à hidrodestilação durante 2 h num aparelho

tipo Clevenger. Obteve-se o óleo essencial das folhas (Av-OE), com percentual de

rendimento de 0,3664%.

A análise do óleo foi feita em espectrômetro de massa (QP-5050) equipado

com um cromatógrafo em fase gasosa (GC-17A), para a identificação e

quantificação do óleo essencial estudado. Os dados foram obtidos e processados

com um software específico.

4.5. Animais

Foram utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus) de ambos os

sexos, pesando entre 30-40 g e ratos (Rattus novergicus) Wistar machos, albinos,

pesando entre 200-250 g, todos procedentes do Biotério Setorial da UNIVASF,

Campus Petrolina. Antes dos experimentos, todos os animais foram

randomicamente mantidos em gaiolas de polipropileno com ventilação e temperatura

(22 ± 2 °C) controladas, em um ciclo claro-escuro de 12 horas, com a fase de luz

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iniciando às 6:00 e terminando às 18:00 horas, com livre acesso à ração tipo

“pellets” (Labina®) e água (disponível em frascos de plástico com bicos apropriados).

Os animais foram privados de alimento 12 horas antes dos experimentos e

para adaptação, eles foram transferidos do Biotério para o laboratório de fisiologia 48

horas antes do experimento. Durante este período, os animais foram manipulados

apenas para limpeza das caixas. Todos os procedimentos foram conduzidos de

acordo com os princípios éticos na experimentação animal, sendo aprovados pela

Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Vale do

São Francisco - UNIVASF sob o número 0004/261011.

4.6. Testes de atividade antinociceptiva

4.6.1. Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Este teste foi realizado de acordo com o método descrito por Collier et al.

(1968) com modificações. Os camundongos foram divididos em seis grupos com

seis animais cada. A nocicepção foi induzida por ácido acético via intraperitoneal

(i.p.) em um volume de 0,1 mL/10 g.

Os animais foram tratados com Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg), ou com

veículo (Salina) administrados por via oral (v.o.) 1 hora antes do agente nociceptivo.

Para o óleo essencial, os animais foram tratados com Av-OE (25, 50 e 100

mg/kg) administrados por via intraperitoneal (i.p.) 30 minutos antes do agente

nociceptivo.

Indometacina (20 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) foram usados como drogas

padrões, sendo administradas por i.p. 30 minutos antes do agente indutor da dor.

Após a injeção do ácido acético, o número de contorções abdominais (Figura

5) (uma resposta consistindo de contração da parede abdominal, rotação pélvica,

seguida de extensão dos membros posteriores) foi registrado entre 5 - 15 minutos

após administração (QUEIROZ et al., 2010).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Figura 5. Camundongo observado no teste de contorções abdominais após a

injeção do ácido acético. (Autor: NEPLAME)

4.6.2. Teste da formalina

O método usado foi similar ao descrito por Hunskaar & Hole (1987). A solução

de formalina (2,5% em salina 0,9%) foi administrada por via subplantar na pata

posterior direita, em um volume de 20 μL/pata (SANTOS et al., 2010).

Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho

montado em três lados para permitir a visão das patas, e o tempo (em segundos)

gasto lambendo e mordendo a pata injetada foi medido como um indicador de dor

(Figura 6). Esta resposta foi mensurada durante 5 minutos (primeira fase, dor

neurogênica) e entre 15 - 30 minutos após a injeção da formalina (segunda fase, dor

inflamatória) (ALMEIDA et al., 2011).

Os animais receberam veículo (salina, v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg,

v.o.) e Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.), indometacina (20 mg/kg, i.p.) e morfina (10

mg/kg, i.p.), administrados 1 hora antes da injeção de formalina (n= 6 por grupo).

Para avaliação do envolvimento de receptores opioides no efeito do extrato e

do óleo essencial foi administrado um antagonista do receptor opioide, a naloxona

(1,5 mg/kg, i.p), trinta minutos antes da administração do extrato (100 mg/kg), óleo

essencial (100 mg/kg) ou morfina (10 mg/kg).

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Figura 6. Camundongo observado no teste da formalina. (Autor: NEPLAME)

4.6.3. Teste da placa quente

Os camundongos foram divididos em cinco grupos (n=6). Esses foram pré-

selecionados no aparelho de placa quente (Insight, Brasil), na temperatura de 55 ±

0,5 °C. Animais que apresentaram um tempo de reação (definido como latência para

levantar ou lamber as patas) maior que vinte segundos foram excluídos. Os

camundongos selecionados foram pré tratados com veículo (v.o.), Av-EtOH (25, 50,

100 mg/kg, v.o.), Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) ou morfina (10 mg/kg, i.p.).

Cada animal foi colocado sobre a placa quente mantida a 55 ºC (Figura 7) e a

latência foi medida em 30, 60, 90 e 120 min após a administração do veículo,

extrato, óleo essencial ou morfina (ALMEIDA et al., 2011). Um tempo de corte de 20

s foi escolhido para indicar completa analgesia e para proteger o animal de lesão

tecidual. A latência foi medida para cada animal. Para avaliação do envolvimento de

receptores opioides no efeito do extrato, naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) foi administrada

30 minutos antes do extrato (100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg).

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Figura 7. Animal observado no teste da placa quente. (Autor: NEPLAME)

4.6.4. Teste de retirada da cauda

A resposta antinociceptiva a estímulos térmicos foi avaliada com o teste de

retirada da cauda (Analgesímetro Tail Flick, Insight, Brasil) (D’AMOUR, SMITH,

1941). Ratos foram divididos em cinco grupos de seis animais cada, e cada animal

foi colocado em um contensor (tubo de acrílico, com ventilação) apropriado, com a

superfície dorsal da cauda posicionada no estímulo térmico (Figura 8).

O aquecimento foi aplicado no terço distal da cauda e consistiu em focar um

feixe de luz, a 50 °C na cauda destes ratos. O tempo, em segundos, para remover a

cauda do feixe é considerado como o tempo de latência, que é medido

automaticamente por um registrador ligado ao aparelho. Cada ensaio foi encerrado

após 7 segundos para minimizar a probabilidade de danos à pele. A latência de

retirada da cauda foi medida antes e 30, 60, 90 e 120 minutos após a administração

do veículo (v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) ou de morfina (10 mg/kg, i.p.)

(NAKAMOTO et al., 2010). Portanto, quanto mais tempo ficar a cauda do animal sob

o feixe de luz, maior a atividade analgésica da substância em estudo.

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Figura 8. Animal observado no teste de retirada da cauda. (Autor: NEPLAME)

4.6.5. Teste de dor orofacial induzida por formalina

O método usado foi similar ao descrito por Luccarini et al. (2006), com

modificações. A solução de formalina (2,0% em salina 0,9%) foi administrada no

lábio superior direito (área perinasal), em um volume de 20 μL (s.c.) (QUINTANS-

JÚNIOR et al., 2010).

Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho

montado em três lados, e o tempo (em segundos) gasto friccionando a área injetada

com as patas posteriores e/ou anteriores foi medido como um indicador de

nocicepção (Figura 9). Esta resposta foi mensurada durante 5 minutos (primeira

fase, dor neurogênica) e entre 15 - 30 minutos após a injeção da formalina (segunda

fase, dor inflamatória).

Tratamentos com veículo (salina, v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) e

morfina (10 mg/kg, i.p.) foram realizados 1 hora antes da injeção de formalina (n= 6

por grupo).

Para avaliação do envolvimento de receptores opioides no efeito do extrato foi

administrado um antagonista do receptor opioide, a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.), trinta

minutos antes da administração do extrato (100 mg/kg) ou morfina (10 mg/kg).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

65

Figura 9. Teste de dor orofacial induzida por formalina. (Autor: NEPLAME)

4.6.6. Teste de dor orofacial induzida por capsaicina

Os camundongos foram divididos em cinco grupos (n = 6). Tratamentos com

veículo (etanol, dimetilsulfóxido, água destilada 1:1:8, v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100

mg/kg, v.o.) e morfina (10 mg/kg, i.p.) foram realizados 1 hora antes da injeção de

capsaicina.

A capsaicina foi dissolvida no veículo e injetada (20 µL, 2,5 µg, s.c) no lábio

superior direito (área perinasal). Os camundongos foram colocados em uma câmara

com um espelho montado em três lados, e o tempo (em segundos) gasto

friccionando a área injetada com as patas posteriores e/ou anteriores foi medido

entre 10 – 20 minutos após a injeção da capsaicina (QUINTANS-JÚNIOR et al.,

2010).

4.6.7. Teste de dor orofacial induzida por glutamato

Os camundongos foram divididos em cinco grupos (n = 6). Tratamentos com

veículo (salina, v.o.), Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) e morfina (10 mg/kg, i.p.)

foram realizados 1 hora antes da injeção de glutamato.

O glutamato foi administrado (20 µL, 25 µM, s.c) no lábio superior direito (área

perinasal). Os camundongos foram observados em uma câmara com um espelho

montado em três lados, e o tempo (em segundos) gasto friccionando a área injetada

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

66

com as patas posteriores e/ou anteriores foi medido durante 15 minutos após a

injeção do glutamato (QUINTANS JÚNIOR et al., 2010).

4.7. Testes de atividade anti-inflamatória

4.7.1. Edema de pata induzido por carragenina

A atividade anti-inflamatória foi estudada usando o modelo de edema de pata

induzido por carragenina 2%, injetada em um volume de 20 µL/animal na região

subplantar da pata direita do camundongo (WINTER et al., 1962).

Camundongos foram divididos em seis grupos de seis animais cada. Os

animais foram pré-tratados com Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.), salina (veículo,

v.o.) ou indometacina (20 mg/kg, i.p.) 1 h antes da injeção da carragenina ou salina.

O volume da pata foi mensurado imergindo-a até a altura do tornozelo,

utilizando o aparelho pletismômetro (PanLab LE 7500, Espanha) antes (VA, basal)

da administração intraplantar da carragenina e 1, 2, 3, 4 e 5 h após (VB) (Figura 10),

como descrito anteriormente (HUANG et al., 2012). A inibição do edema foi

calculado por (VB-VA)/VA, onde VA é o volume da pata direita anterior à injeção da

carragenina, e VB é o volume da pata direita após a injeção da carragenina.

Finalmente, os animais foram sacrificados e todas as patas direitas foram

dissecadas. Cada amostra foi colocada em parafina, seccionada a 5 μm e corados

com hematoxilina e eosina para análise histológica.

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

67

Figura 10. Volume da pata mensurado utilizando o aparelho pletismômetro no

modelo do edema de pata induzido por carragenina. (Autor: NEPLAME)

4.7.2. Edema de pata induzido por histamina

O edema no camundongo foi induzido por injeção de 100 μg/pata de

histamina (CAVALHER-MACHADO et al., 2008). Camundongos foram divididos em

três grupos de seis animais cada. Os animais foram pré-tratados com Av- EtOH (100

mg/kg, v.o.), veículo (salina, v.o.) 1 h antes da injeção de histamina ou salina. O

volume foi mensurado antes da injeção intraplantar de histamina ou salina (VA,

basal) e 30, 60, 90 e 120 min após (VB) (SULEYMAN et al., 1999). A inibição do

edema de pata foi calculada como descrito no teste do edema de pata induzido por

carragenina. Os animais foram sacrificados e todas as patas direitas foram

dissecadas para análise histológica.

4.7.3. Migração de leucócitos na cavidade peritoneal

Camundongos foram divididos em cinco grupos de seis animais cada. A

migração de leucócitos foi induzida por injeção de carragenina (1%, i.p., 0,25 mL)

(ANDRADE et al., 2012) na cavidade intraperitoneal 1 hora depois da administração

de Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.), veículo (salina, v.o.). Para a dexametasona

(2 mg/kg, i.p.) e Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) a solução de carragenina foi

administrada 30 minutos depois (BASTOS et al., 2007). A migração de leucócitos foi

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

68

avaliada 4 horas após o estímulo, sendo os animais eutanasiados e as células da

cavidade peritoneal foram colhidas com 3 mL de solução salina contendo 1 mM de

EDTA. Imediatamente, uma breve massagem foi realizada, e em seguida foi

coletado o fluido peritoneal, que foi centrifugado (3000 rpm por 6 min) em

temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e 300 µL de EDTA foi

adicionado ao precipitado, do qual foi retirado uma alíquota de 10 µL. Foi adicionado

200 µL de solução de Turk à alíquota e o total de células foi contado em uma

câmara de Neubauer, em um microscópio óptico. Os resultados foram expressos

como número de leucócitos/mL (MELO et al., 2011).

4.8. Toxicidade subcrônica

Na investigação da toxicidade subcrônica, os camundongos foram divididos

em três grupos de 5 machos e 5 fêmeas (n = 10). O grupo controle recebeu veículo

(salina). Os demais receberam doses diárias de Av-EtOH de 100 mg/kg e 400 mg/kg

por via oral. Os animais foram observados durante 30 dias para avaliar a presença

de morte e sinais de toxicidade. Outros parâmetros tais como: peso corporal,

consumo de alimento e água foram avaliados diariamente, durante todo o estudo.

4.8.1. Análise comportamental

Para a realização da análise comportamental foram avaliados alguns

parâmetros específicos (piloereção, ptose palpebral, contorções abdominais,

convulsões, catatonia, tremores, paralisia das patas dianteiras, sedação, ambulação

aumentada, resposta ao toque diminuída, movimentação intensa das vibrissas,

agressividade, estereotipia e analgesia), após a administração de Av-EtOH. No

primeiro dia, tais parâmetros foram avaliados nos tempos de 0,5, 1, 2, 3 e 4 h após

administração do extrato. Nos demais dias, a avaliação comportamental foi feita

diariamente até o último dia da toxicidade subcrônica seguindo metodologia descrita

por Almeida et al. (1999).

Page 69: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

69

4.8.2. Análises de parâmetros hematológicos e bioquímicos

Para a avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos do sangue, foi

utilizada a metodologia descrita por Vasconcelos et al. (2007) e Araújo et al. (2008)

com modificações. O sangue foi retirado através do plexo braquial para análise

laboratorial dos parâmetros hematológicos: contagem de eritrócitos (106/mm3),

hemoglobina (g/dL), hematócrito (%), volume corpuscular médio (VCM, μ3),

hemoglobina corpuscular média (HCM, g), concentração de hemoglobina

corpuscular média (CHCM,%), leucócitos (103/mm3), linfócitos (%), monócitos (%) e

plaquetas (103/mm3). Os parâmetros bioquímicos analisados em amostras de soro

foram glicose (mg/dL), colesterol (mg/dL), triglicérides (mg/dL), AST/TGO (U/L),

ALT/TGP (U/L), uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL). Para a determinação dos

parâmetros hematológicos foi utilizado analisador de hematologia Horiba ABX-

Pentra 60, já para os parâmetros bioquímicos foi utilizado um analisador semi-

automático Bioplus (BIO-200).

4.9. Análise estatística

Os dados obtidos foram analisados através do programa GraphPad Prism,

versão 5.0, e expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m). Diferenças

estatisticamente significativas entre os grupos foram calculadas pela aplicação de

uma análise de variância (ANOVA) one-way seguido do teste de Tukey ou Dunnett,

ou pelo teste t de Student não pareado, conforme exigido pelo protocolo

experimental. Foram considerados significativos valores de p < 0,05.

Page 70: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

70

5. RESULTADOS

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

71

5. RESULTADOS

5.1. Triagem fitoquímica

A análise fitoquímica preliminar (Tabela 2) demonstrou reação positiva para a

presença de fenóis, esteroides, terpenos e flavonoides. No entanto, o extrato

etanólico apresentou reação negativa para a presença de alcaloides.

Tabela 2. Identificação das principais classes de constituintes químicos presentes no

extrato etanólico bruto das folhas de Annona vepretorum (Annonaceae).

Classe química Av-EtOH

Alcaloides -

Cumarinas +

Derivados antracênicos +

Flavonoides e taninos +

Lignanas +

Mono e diterpenos +++

Naftoquinonas +

Triterpenos e esteroides ++

(-): ausência do constituinte, (+) leve presença do constituinte, (++): moderada presença do

constituinte, (+++): intensa presença do constituinte.

5.2. Composição do óleo essencial

A caracterização química do óleo essencial das folhas de A. vepretorum

(Tabela 3) permitiu identificar 93,67% dos constituintes que compõem a amostra.

Dentre os compostos identificados, 53,7% trata-se de monoterpenos, enquanto que

46,3% correspondem a sesquiterpenos. E-ocimeno, biciclogermacreno, germacreno

D, limoneno, espatulenol e α-pineno configuram-se como sendo os constituintes

majoritários de Av-OE, representando 83,55% da composição química total do óleo

essencial.

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

72

Tabela 3. Constituintes químicos identificados no óleo essencial das folhas de

Annona vepretorum (Annonaceae).

tR (min) IR Constituintes químicos (%)

5,80 933 α-Pineno 8,92

6,20 948 Canfeno 1,68

6,97 977 β-Pineno 0,88

7,34 990 β-Mirceno 1,22

7,79 1006 α-Felandreno 0,73

8,45 1024 p-Cimeno 0,62

8,59 1028 Limoneno 9,65

8,87 1036 Z-Ocimeno 1,07

9,27 1047 E-Ocimeno 25,56

15,66 1210 M = 152 (não identificado) 4,01

23,08 1387 M = 168 (não identificado) 1,21

24,37 1418 E-Cariofileno 1,97

26,89 1481 Germacreno D 14,61

27,50 1496 Biciclogermacreno 15,63

28,55 1523 δ-Cadineno 0,80

30,69 1579 Espatulenol 9,18

32,97 1639 M = 220 (não identificado) 1,11

33,55 1655 α-Cadinol 1,15

tR: tempo de retenção, IR: índice de retenção, (%): composição relativa.

5.3. Resultados da atividade farmacológica do extrato de Annona vepretorum

5.3.1 Atividade antinociceptiva do extrato de Annona vepretorum

5.3.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Os resultados mostrados na Figura 11 demonstram que o pré-tratamento com

Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) foi capaz de inibir as contorções induzidas por

ácido acético quando comparados com grupo controle (p<0,01). As porcentagens de

inibição foram de 61,75%, 81,08% e 91,89%, respectivamente. Indometacina e

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

73

morfina apresentaram 92,90% e 100%, respectivamente, de redução de contorções

quando comparados com o controle. Não houve diferença estatística entre as doses

de Av-EtOH quando comparadas entre si (p>0,05).

0

5

10

15

20Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Indometacina 20 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

*

*

** *

mero

de c

on

torç

ões

Figura 11. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), indometacina (20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no

teste de contorções abdominais. Valores são expressos em média ± erro padrão da

média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA

seguido pelo teste de Tukey).

5.3.1.2 Teste da formalina

O tratamento com Av-EtOH nas doses de 25 e 100 mg/kg (v.o.) produziu uma

atividade antinociceptiva significante comparada ao grupo controle em ambas as

fases (p<0,05) (Figura 12). Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) reduziu em 55,22%;

64,18% e 65,30%, respectivamente, o tempo de lambida da pata na primeira fase,

bem como em 66,36%; 3,98% e 82,27%, respectivamente, na segunda fase do teste

da formalina. A droga de referência indometacina reduziu somente na segunda fase

do teste, enquanto que a morfina inibe ambas as fases do estímulo da dor (p<0,05).

Não houve diferença significativa (p>0,05) entre as doses de Av-EtOH na primeira

fase, enquanto na segunda fase apresentou diferença estatística (p<0,05) entre as

doses de 25 e 100 mg/kg de Av-EtOH quando compradas a dose de 50 mg/kg de

Av-EtOH, tendo em vista que esta dose não apresentou efeito antinociceptivo na

segunda fase.

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

74

O pré-tratamento com a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) reverteu a atividade

antinociceptiva do extrato, na dose de 100 mg/kg e da morfina (10 mg/kg) na

primeira fase deste ensaio, desta forma não houve diferença estatística quando

comprados ao controle e entre si (p>0,05).

Primeira fase

0

10

20

30

40

50

60Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Indometacina 20 mg/kg

Morfina 10 mg/kg* *

*

*Morfina + Naloxona

Av-EtOH + Naloxona

a)

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Segunda fase

0

10

20

30

40

50

60

70Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Indometacina 20 mg/kg

Morfina 10 mg/kg*

* *

*

Morfina + Naloxona

Av-EtOH + Naloxona

* *

b)

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Figura 12. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), indometacina (20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Av-

EtOH (100 mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5

mg/kg) na primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo

controle (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

75

5.3.1.3 Teste da placa quente

No teste da placa quente, os animais tratados com morfina (10 mg/kg, i.p.)

demonstraram um aumento evidente no tempo de latência em 30, 60, 90 e 120 min

(p<0,05). Os grupos tratados com Av-EtOH (25 e 100 mg/kg, v.o.) mostraram um

aumento na latência em 90 min. O grupo tratado com Av-EtOH (50 mg/kg, v.o.) não

mostrou aumento significativo no tempo de latência. O efeito da morfina e Av-EtOH

100 mg/kg foram revertidos pela naloxona (Figura 13).

30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Morfina + Naloxona

Av-EtOH + Naloxona

***

*

**

Tempo (min)

Latê

ncia

(s)

Figura 13. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Av-EtOH (100 mg/kg) + naloxona

(NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) no teste da placa

quente em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração. Valores são expressos

em média ± erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do

grupo controle (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).

5.3.1.4 Teste de retirada da cauda

Av-EtOH administrado na dose de 50 mg/kg (v.o) induziu um aumento

significativo (p<0,05) no tempo de reação estímulo térmico na cauda quando

comparado ao grupo controle, nos tempos de 30 e 60 min após sua administração.

O grupo tratado com morfina (10 mg/kg, i.p.) apresentou um aumento significativo na

resposta de latência em 30, 60, 90 e 120 min (Figura 14).

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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30 60 90 1200

1

2

3

4

5

6Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

* * **

*

Tempo

Latê

ncia

(s)

Figura 14. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste de retirada da cauda

em 30, 60, 90 e 120 minutos após sua administração. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo

controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).

5.3.1.5 Teste de dor orofacial induzida por formalina

O tratamento com Av-EtOH nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg (v.o.) produziu

uma atividade antinociceptiva significante comparada ao grupo controle em ambas

as fases (p<0,05) (Figura 15). Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) reduziu em

47,89%; 47,53% e 47,28 %, respectivamente, o tempo de fricção com as patas

posteriores e/ou anteriores na área injetada, bem como 22,09%; 44,75% e 40,14%,

respectivamente, na segunda fase do teste de dor orofacial induzida por formalina.

A droga de referência morfina reduziu em ambas as fases o estímulo da dor

(p<0,05). As doses de Av-EtOH quando comparadas entre si não houve diferença

siginificativa (p>0,05).

O pré-tratamento com a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) reverteu parcialmente a

atividade antinociceptiva do extrato, na dose de 100 mg/kg na primeira fase do

presente ensaio. O efeito da morfina (10 mg/kg) também foi revertido pela naloxona

em ambas as fases.

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Primeira fase

0

25

50

75

100Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Morfina+ Naloxona

Av-EtOH + Naloxona

* * * **

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Segunda fase

0

25

50

75

100

125Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

Morfina + Naloxona

Av-EtOH+ Naloxona

* ***

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Figura 15. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Av-EtOH (100 mg/kg) + naloxona

(NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) na primeira e segunda

fase do teste de dor orofacial induzida por formalina. Valores são expressos em

média ± erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo

controle (ANOVA seguido pelo teste de Tukey).

5.3.1.6 Teste de dor orofacial induzida por capsaicina

O tratamento com Av-EtOH nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg (v.o.) produziu

uma atividade antinociceptiva significante comparado ao grupo controle (p<0,05),

reduzindo em 60,67%; 77,62% e 82,77% respectivamente, o tempo de fricção com

as patas posteriores e/ou anteriores na área injetada (Figura 16). As doses de

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Av-EtOH quando comparadas entre si não houve diferença siginificativa (p>0,05). A

droga de referência morfina reduziu o estímulo da dor (p<0,05), inibindo em 86,44%

a nocicepção.

0

10

20

30

40

50

60

70Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Morfina 10 mg/kg*

* * *Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Figura 16. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste de dor orofacial

induzida por capsaicina. Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n

= 6. * p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo

teste de Tukey).

5.3.1.7 Teste de dor orofacial induzida por glutamato

O tratamento com Av-EtOH nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg (v.o.) produziu

uma atividade antinociceptiva significante comparada ao grupo controle (p<0,05),

reduzindo em 31,15%; 29,60% e 39,99% respectivamente, o tempo de fricção com

as patas posteriores e/ou anteriores na área injetada (Figura 17). As doses de Av-

EtOH quando comparadas entre si não houve diferença siginificativa (p>0,05). A

droga de referência morfina reduziu o estímulo da dor (p<0,05), inibindo em 79,62%

a nocicepção.

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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0

10

20

30

40

50Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

* **

*

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Figura 17. Efeito antinociceptivo do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no teste de dor orofacial

induzida por glutamato. Valores são expressos em média ± erro padrão da média,

n = 6. * p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo

teste de Tukey).

5.3.2 Atividade anti-inflamatória do extrato de Annona vepretorum

5.3.2.1 Edema de pata induzido por carragenina

Para determinar o possível efeito anti-inflamatório de Av-EtOH, o modelo de

edema de pata induzido por carragenina em camundongos foi realizado. Quando a

carragenina foi usada como indutor de edema (Figura 18), Av-EtOH (25, 50 e 100

mg/kg, v.o.) inibiu significativamente (p<0,05) o edema de pata em 1 e 2 h, mas

não foi significativo em 3, 4 e 5 h após o estímulo. Além disso, a droga controle,

indometacina (20 mg/kg, i.p.), mostrou inibição do edema (p<0,05) durante as 5 h de

realização do experimento.

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

80

0 1 2 3 4 50.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8Salina

Salina + Carr

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Indometacina

* *

* ** *

*

Tempo (horas)

Vo

lum

e d

o e

dem

a (

mL

)

Figura 18. Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e Indometacina (20 mg/kg) sobre o edema de pata

induzida por carragenina. Valores são expressos em média ± erro padrão da média,

n = 6. * p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (salina+ histamina)

(ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).

5.3.2.2 Edema de pata induzido por histamina

O edema inflamatório induzido por histamina foi significativamente reduzido

por Av-EtOH 100 mg/kg, v.o. em 30 e 60 min (p<0,05), como mostrado na Figura

19.

Page 81: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

81

0 30 60 90 1200.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5Salina

Salina + Histamina

Av-EtOH 100 mg/kg

**

Tempo (min)

Vo

lum

e d

o e

dem

a (

mL

)

Figura 19. Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 100 mg/kg) sobre o edema de pata induzida por histamina. Valores são

expressos em média ± erro padrão da média, n = 6. * p<0,05 significativamente

diferente do grupo controle (salina+ histamina) (ANOVA seguido pelo teste de

Dunnett).

5.3.2.3 Análise histológica

A análise histológica mostrou a presença de infiltrado com edema subcutâneo

nos grupos onde a inflamação foi induzida por carragenina. Entretanto, no grupo

tratado com 25 mg/kg de Av-EtOH e Indometacina (20 mg/kg) o infiltrado foi menos

intenso quando comparados aos demais grupos.

No grupo onde a inflamação foi induzida por histamina e tratados com 100

mg/kg de Av-EtOH, o processo inflamatório foi menos intenso do que no grupo

controle (Figura 20).

Page 82: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

82

Page 83: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

83

Figura 20. Histologia das patas de camundongos após indução de edema por

carragenina e histamina após tratamentos. A) Grupo controle (salina + carragenina);

B) Av-EtOH 25 mg/kg + carragenina; C) Av-EtOH 50 mg/kg + carragenina; D) Av-

EtOH 100 mg/kg + carragenina; E) Indometacina + carragenina; F) Histamina +

salina; G) Histamina + Av-EtOH 100 mg/kg. As setas mostram infiltração de

neutrófilos nos tecidos das patas, aumento original, 100x (A-C; E-G) e 400x (D).

Page 84: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

84

5.3.2.4 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal

Av-EtOH (25, 50 e 100 mg/kg, v.o) administrado 1 h antes da injeção de

carragenina (1%, i.p., 0.25 mL) inibiu a migração de leucócitos (p<0,05) quando

comparado ao grupo controle (Figura 21). As doses de Av-EtOH quando compradas

entre si apresentou diferença estatística (p<0,05) entre as doses de 25 e 100 mg/kg.

A droga de referência dexametasona (2 mg/kg, i.p.) também promoveu redução

significante na migração de leucócitos (p<0,05).

0

5

10

15

20

25

30

35Controle

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Dexametasona 2 mg/kg*

*

* *Leu

cit

os x

10

6 /

ml

Figura 21. Efeito anti-inflamatório do extrato etanólico bruto de Annona vepretorum

(Av-EtOH 25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no ensaio migração de

leucócitos na cavidade peritoneal. Valores são expressos em média ± erro padrão da

média, n = 6. * p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA

seguido pelo teste de Tukey).

5.3.3. Toxicidade subcrônica do extrato de Annona vepretorum

A administração do extrato etanólico de Annona vepretorum nas doses de 100

e 400 mg/kg, por via oral, durante 30 dias de tratamento não ocasionou mortes,

indicando baixa toxicidade do extrato. Em relação ao peso corporal (Figura 22),

consumo de água e ração, não houve diferença estatística quando comparados com

o grupo controle.

Page 85: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

85

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

25

30

35

40 Controle

Av-EtOH 100 mg/kg v.o.

Av-EtOH 400 mg/kg v.o.

Dias

Peso

co

rpo

ral

(g)

Figura 22. Dados de peso dos animais tratados com extrato etanólico bruto de

Anonna vepretorum (Av-EtOH 100 e 400 mg/kg, v.o) e solução salina 0,9% durante

30 dias (n= 10 por grupo).

5.3.3.1. Avaliação comportamental dos camundongos

Na avaliação comportamental foi observado piloereção, movimento intenso

das vibrissas, analgesia, resposta ao toque diminuído, respiração forçada e

diminuição da força para agarrar na dose de 400 mg/kg, comportamentos não

observados nos demais grupos.

5.3.3.2. Parâmetros hematológicos

É possível observar que os resultados dos parâmetros hematológicos

(eritrócitos, hemoglobina, hematócritos, concentração de hemoglobina corpuscular

média (CHCM), basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos, monócitos, neutrófilos e

plaquetas) após a administração de 100 mg/kg e 400 mg/kg v.o, de Av-EtOH não

apresentaram diferença significativa, exceto no volume corpuscular médio (VCM) e

Page 86: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

86

hemoglobina corpuscular média (HCM) que apresentaram diferença estatística

(p<0,05) na dose de 400 mg/kg, cujo significado clínico deste aumento está sendo

investigado. Os resultados estão expressos na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4. Parâmetros hematológicos do sangue de camundongos tratados com

extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum (Av-EtOH 100 e 400 mg/kg, v.o) e

solução salina 0,9% durante 30 dias (n= 10 por grupo).

Parâmetros Grupos

Controle 100 mg/kg 400 mg/kg

Eritrocitos(106/mm3) 8,72 ± 0,17 8,66 ± 0,16 9,03 ± 0,15

Hemoglobina (g/dL) 13,93 ± 0,23 13,68 ± 0,35 13,98 ± 0,20

Hematocrito (%) 41,90 ± 0,71 41,55 ± 1,20 41,94 ± 0,80

VCM (μ3) 48,00 ± 0,26 47,80 ± 0,72 46,40 ± 0,30*

HCM (μg) 15,99 ± 0,17 15,77 ± 0,19 15,50 ± 0,14*

CHCM (%) 33,23 ± 0,30 32,96 ± 0,26 33,47 ± 0,31

Basófilos (%) 40,00 ± 0,40 38,64 ± 0,24 35,13 ± 0,24

Eosinófilos (%) 0,26 ± 0,10 0,84 ± 0,33 0,30 ± 0,09

Leucócitos(103/mm3) 4,88 ± 1,02 6,86 ± 1,09 6,92 ± 0,92

Linfócitos (%) 82,55 ± 2,23 82,10 ± 0,88 84,24 ± 1,00

Monócitos(%) 2,70 ± 0,48 4,43 ± 0,51 3,42 ± 0,46

Neutrofilos (%) 14,10 ± 2,09 12,17 ± 0,60 11,61 ± 0,73

Plaquetas(103/mm3) 569,30 ± 41,57 608,70 ± 32,90 562,60 ± 30,78

Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student

p< 0,05, comparado ao controle.

5.3.3.3. Parâmetros bioquímicos

Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados não mostraram

diferenças significativas entre o grupo controle e o grupo experimental na dose de

100 mg/kg, v.o de Av-EtOH. O grupo de 400 mg/kg, v.o. apresentou diferença

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

87

estatística apenas nos valores dos triglicerídeos (p<0,05). Os resultados estão

expressos na Tabela 5 abaixo.

Tabela 5. Parâmetros bioquímicos obtidos do soro de camundongos tratados com

extrato etanólico bruto de Anonna vepretorum (Av-EtOH 100 e 400 mg/kg, v.o) e

solução salina 0,9% durante 30 dias (n= 10 por grupo).

Parâmetros

Grupos

Controle 100 mg/kg 400 mg/kg

Glicose (mg/dL) 198,30 ± 11,21 193,30 ± 11,11 173,00 ± 10,39

Colesterol (mg/dL) 93,13 ± 5,16 87,50 ± 3,66 112,60 ± 20,27

Triglicerídeos (mg/dL) 177,50 ± 9,25 189,80 ± 8,51 268,40 ± 33,34*

AST/TGO (U/L) 136,10 ± 76,71 197,00 ± 22,07 178,70 ± 32,42

ALT/TGP (U/L) 49,98 ± 10,14 58,26 ± 14,66 88,08 ± 33,37

Albumina (g/dL) 2,55 ± 0,36 2,23 ± 0,06 2,27 ± 0,22

Ureia (mg/dL) 60,25 ± 2,63 58,20 ± 2,44 55,30 ± 5,49

Creatinina(mg/dL) 0,96 ± 0,10 1,39 ± 0,37 1,03 ± 0,28

Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student

p< 0,05, comparado ao controle.

5.3.3.4. Análise macroscópica e peso dos órgãos

Na análise macroscópica dos órgãos, apenas um animal tratado com Av-EtOH

400 mg/kg, apresentou o pulmão com aspecto mais pálido e enrijecido. Nos demais,

não houve alterações. Não houve diferença significativa nos pesos dos órgãos

quando comparados ao controle (Tabela 6).

Page 88: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

88

Tabela 6. Peso dos órgãos de camundongos tratados com extrato etanólico bruto de

Anonna vepretorum (Av-EtOH 100 e 400 mg/kg, v.o) e solução salina 0,9% durante

30 dias (n= 10 por grupo).

Parâmetros Grupos

Controle Após 100 mg/kg Após 400 mg/kg

Coração (g) 0,14 ± 0,01 0,13 ± 0,00 0,14 ± 0,01

Pulmão (g) 0,19 ± 0,01 0,19 ± 0,00 0,24 ± 0,03

Fígado (g) 1,36 ± 0,10 1,41 ± 0,06 1,44 ± 0,06

Estômago (g) 0,45 ± 0,03 0,42 ± 0,04 0,44 ± 0,03

Rim (g) 0,30 ± 0,02 0,37 ± 0,02 0,35 ± 0,02

Baço (g) 0,10 ± 0,00 0,11 ± 0,01 0,10 ± 0,00

Pâncreas (g) 0,16 ± 0,01 0,19 ± 0,01 0,21 ± 0,01

Ovário (g) 0,03 ± 0,00 0,06 ± 0,02 0,01 ± 0,00

Testículo (g) 0,13 ± 0,02 0,16 ± 0,00 0,17 ± 0,01

Valores são expressos em média ± erro padrão da média. Teste t de Student p<

0,05.

5.4. Resultados da atividade farmacológica do óleo essencial de Annona

vepretorum

5.4.1. Atividade antinociceptiva do óleo essencial de Annona vepretorum

5.4.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético

Os resultados mostrados na Figura 23 demonstram que o pré-tratamento com

Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, v.o.) 1 h antes, foi capaz de inibir as contorções

induzidas por ácido acético quando comparados com grupo controle (p<0,05). As

porcentagens de inibição foram de 88,75%; 88,15% e 99,40%, respectivamente. Não

houve diferença estatística entre as doses de Av-EtOH quando comparadas entre si

(p>0,05). Indometacina e morfina apresentaram 91,26% e 100%, respectivamente,

de redução de contorções quando comparados com o controle.

Page 89: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

89

0

10

20

30Controle

Av-EO 25 mg/kg

Av-EO 50 mg/kg

Av-EO 100 mg/kg

Indometacina 20 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

***

* *

mero

de c

on

torç

ões

Figura 23. Efeito antinociceptivo do óleo essencial de Annona vepretorum (Av-OE

25, 50 e 100 mg/kg), indometacina (20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), no teste de

contorções abdominais. Valores são expressos em média ± erro padrão da média,

n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo

teste de Tukey).

5.4.1.2 Teste da formalina

O tratamento com Av-OE nas doses de 25, 50 e 100 mg/kg (i.p.) produziu

uma atividade antinociceptiva significante comparada ao grupo controle em ambas

as fases (p<0,05) (Figura 24). Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) reduziu em 39,83%;

25,50% e 20,50%, respectivamente, o tempo de lambida da pata na primeira fase,

bem como 92,8%; 82,00% e 91,00%, respectivamente, na segunda fase do teste da

formalina. As doses de Av-EtOH quando comparadas entre si, não houve diferença

estatística entre 50 mg/kg e 100 mg/kg (p>0,05) em ambas as fases.

As drogas de referência indometacina e morfina inibiram ambas as fases do

teste de formalina (p<0,05).

O pré-tratamento com a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) reverteu a atividade

antinociceptiva do extrato, na dose de 100 mg/kg e da morfina (10mg/kg) na primeira

fase do presente ensaio.

Page 90: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

90

0

10

20

30

40

50

60

70Controle

Av-OE 25 mg/kg

Av-OE 50 mg/kg

Av-OE 100 mg/kg

Indometacina 20 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

*

**

*

*

Primeira Fase

Morf + Nal

Av-OE+ Nal

*

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

0

25

50

75

100

125Controle

Av-OE 25 mg/kg

Av-OE 50 mg/kg

Av-OE 100 mg/kg

Indometacina 20 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

**

* *

*

Segunda fase

Morf + Nal

OE + Nal

*

*

Tem

po

de l

am

bid

a (

s)

Figura 24. Efeito antinociceptivo do óleo essencial de Annona vepretorum (Av-OE

25, 50 e 100 mg/kg), indometacina (20 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Av-EtOH (100

mg/kg) + naloxona (NLX 1,5 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) na

primeira e segunda fase do teste da formalina. Valores são expressos em média ±

erro padrão da média, n = 6. * p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle

(ANOVA seguido pelo teste de Tukey).

5.4.1.3 Teste da placa quente

No teste da placa quente (Figura 25), os animais tratados com morfina

(10 mg/kg, i.p.) demonstraram um aumento evidente no tempo de latência em 30,

60, 90 e 120 min. O grupo tratado com Av-OE (50 mg/kg, i.p.) mostrou aumento no

tempo de latência em 30, 90 e 120 min, já o grupo tratado com Av-OE (100 mg/kg,

Page 91: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

91

i.p.) mostrou aumento no tempo de latência em 60 e 90 min. O grupo tratado com

Av-OE (25 mg/kg, i.p.) não mostrou aumento significativo do tempo de latência.

30 60 90 1200

5

10

15

20Controle

Av-OE 25 mg/kg

Av-OE 50 mg/kg

Av-OE 100 mg/kg

Morfina 10 mg/kg

*

***

**

**

*

Morfina + NLX

Av-OE + NLX

Tempo (min)

Tem

po

de l

atê

ncia

(s)

Figura 25. Efeito antinociceptivo do óleo essencial de Annona vepretorum (Av-OE

25, 50 e 100 mg/kg), morfina (10 mg/kg), Av-OE (100 mg/kg) + naloxona (NLX 1,5

mg/kg) e morfina (10 mg/kg) + naloxona (1,5 mg/kg) no teste da placa quente em 30,

60, 90 e 120 minutos após sua administração. Valores são expressos em média ±

erro padrão da média, n = 6. *p < 0,05 significativamente diferente do grupo controle

(ANOVA seguido pelo teste de Tukey).

5.4.2. Atividade anti-inflamatória do óleo essencial de Annona vepretorum

5.4.2.1 Migração de leucócitos na cavidade peritoneal

Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, v.o) administrado 1 h antes da injeção de

carragenina (1%, i.p., 0.25 mL) inibiu a migração de leucócitos (p<0,05) quando

comparado ao grupo controle (Figura 26). As doses de Av-OE quando comparadas

entre si, houve diferença estatística (p<0,05) entre as doses de 25 mg/kg e 50

mg/kg, bem como entre 25 mg/kg e 100 mg/kg; entretanto não houve diferença

estatística entre as doses de 50 mg/kg e 100 mg/kg.

A droga de referência dexametasona (2 mg/kg, i.p.) também promoveu

redução significante na migração de leucócitos (p< 0,05).

Page 92: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

92

0

5

10

15

20

25

30

35Control

Av-OE 25 mg/kg

Av-OE 50 mg/kg

Av-OE 100 mg/kg

Dexametasona 2 mg/kg

*

* **L

eu

cit

os x

10

6 /

ml

Figura 26. Efeito anti-inflamatório do óleo essencial de Annona vepretorum (Av-OE

25, 50 e 100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg) no ensaio migração de leucócitos na

cavidade peritoneal. Valores são expressos em média ± erro padrão da média, n = 6.

* p<0,05 significativamente diferente do grupo controle (ANOVA seguido pelo teste

de Tukey).

Page 93: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

6. DISCUSSÃO

Page 94: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

94

6. DISCUSSÃO

Pela primeira vez na literatura, os dados reportados nesse estudo indicam

que o extrato etanólico bruto de Annona vepretorum (Av-EtOH), bem como o óleo

essencial das folhas dessa espécie (Av-OE), apresenta perfis de resposta

antinociceptiva e anti-inflamatória frente a diferentes modelos que utilizam estímulos

químicos e térmicos. Esse padrão de atividade provavelmente está relacionado com

a diversidade de constituintes químicos que foram identificados na análise

fitoquímica preliminar do extrato (Tabela 2) e na composição do óleo (Tabela 3).

Dentre estes constituintes, as atividades farmacológicas estão

correlacionadas à presença de flavonoides no extrato, que podem inibir certos

estágios da inflamação, incluindo a formação de granulação e aumento da

permeabilidade capilar observado no início do processo inflamatório. Além disso,

não produz ulcerogenicidade, efeito colateral observado nas drogas anti-

inflamatórias clássicas. No óleo essencial, há presença de sesquiterpenos que

exercem seus efeitos antiflogísticos por intervirem em mecanismos da reação

imunológica, como o sistema complemento (CARVALHO, 2004).

O teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético tem sido

utilizado como um modelo clássico para avaliar o potencial antinociceptivo e anti-

inflamatório de novos agentes analgésicos e anti-inflamatórios (MOHAMAD et al.,

2010). De fato, esse ensaio configura-se como sendo um modelo não seletivo para

avaliação do efeito antinociceptivo de substâncias, extratos vegetais ou outros

produtos de origem natural. Isso porque a aplicação intraperitoneal de uma solução

de ácido acético induz à produção e/ou liberação de vários mediadores envolvidos

com o processo inflamatório e de neurotransmissão álgica, podendo ser citados:

substância P, bradicinina, prostaglandinas (em especial, PGI2), citocinas pró-

inflamatórias (IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α), entre outros. Por sua vez, esses

neurotransmissores acabam estimulando os nociceptores periféricos e os neurônios

sensitivos, possibilitando a transmissão do potencial de ação de uma célula para

outra, caracterizando a sensação dolorosa (LE BARS et al., 2001).

O extrato etanólico (Av-EtOH) reduziu significativamente o número de

contorções abdominais provocadas pela aplicação do ácido acético na região

intraperitoneal. Os resultados apresentados na figura 11 demonstraram que o grupo

controle apresentou 14,80 ± 2,08 contorções, 10 minutos após a aplicação do ácido

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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acético. Quando os animais foram previamente tratados com 25, 50 e 100 mg/kg de

Av-EtOH, o número de contorções foi reduzido de maneira estatisticamente

significante. Quando tratados com Av-OE (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) as porcentagens

de inibição foram de 88,75; 88,15 e 99,40%, respectivamente, sugerindo que Av-

EtOH e Av-OE provavelmente apresentem agentes antinociceptivos por esse ensaio

experimental.

O teste da formalina é um método de avaliação utilizado para mensurar a

efetividade comportamental de agentes antinociceptivos (HUNSKAAR; HOLE, 1987;

RANDOLPH, PETERS 1997). A vantagem desse método em relação aos outros é a

possibilidade de avaliar dois tipos diferentes de dor ao longo de um período

prolongado de tempo e, assim, permite avaliar agentes antinociceptivos com

diferentes mecanismos de ação (LE BARS et al., 2001; RANDOLPH, 1997). As

respostas comportamentais à formalina seguem um padrão bifásico composto de

uma fase inicial aguda (primeira fase) que dura alguns minutos e reflete o

componente neurogênico de nocicepção, sendo produzida principalmente pelo uso

de analgésicos opióides, e por um período mais prolongado (segunda fase), que

pode durar até cerca de uma hora. O período entre as fases é denominado intervalo

de quiescência (MARTINS et al., 2006). Substâncias que atuam eminentemente por

mecanismos centrais, como os analgésicos opioides, reduzem a nocicepção em

ambas as fases. Por outro lado, substâncias que atuam por mecanismos periféricos,

como os anti-inflamatórios não esteroidais, reduzem em geral a nocicepção durante

a segunda fase do teste. Sendo assim, Av-EtOH e Av-OE foram capazes de diminuir

a nocicepção em ambas as fases no teste da formalina, embora esse efeito tenha

sido mais proeminente na segunda fase do teste.

Com o intuito de comprovar o envolvimento de mecanismos centrais no efeito

antinociceptivo de Av-EtOH e Av-OE, o teste da placa quente foi realizado. Assim,

analisando os resultados apresentados nas figuras 12 e 24, foi observado que Av-

EtOH (25 e 100 mg/kg, v.o.) e Av-OE (50 e 100 mg/kg, i.p.) aumentaram o tempo de

permanência dos animais sobre a placa metálica previamente aquecida, fornecendo

evidências de ação central, uma vez que esse padrão de resposta trata-se de um

reflexo predominantemente espinal, sendo considerado, portanto, um modelo de

avaliação da ação central de drogas analgésicas (NEMIROVSKY et al., 2001). Este

teste associa a estimulação térmica com a neurotransmissão central, em que o calor

fornecido desencadeia a ativação dos nociceptores (fibras Aδ e C) pela condução do

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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impulso ao longo do corno dorsal da medula espinhal e, posteriormente, aos centros

corticais (PINHEIRO et al., 2011).

O teste de retirada da cauda foi realizado com Av-EtOH. Este, quando

administrado na dose de 50 mg/kg (p.o.) promoveu um aumento significativo do

tempo de reação ao estímulo térmico, em comparação com o grupo controle, nos

tempos de 30 e 60 minutos. Por envolver estímulo térmico, um aumento no tempo

de reação durante o teste é considerado um parâmetro para avaliar a atividade

antinociceptiva central (RUJJANAWATE et al., 2003). Portanto, a ponta da cauda é

caracterizada como sendo uma região de nocicepção aguda e não inflamatória.

Substâncias que agem em nível central, como a morfina, são capazes de suprimir

respostas dos neurônios da coluna vertebral ao estímulo térmico nocivo na cauda,

aumentando o tempo de latência (FISCHER et al., 2008).

Para confirmar o envolvimento de receptores opioides no efeito do extrato e

do óleo essencial, a naloxona (1,5 mg/kg, i.p.) foi administrada 15 minutos antes da

administração de Av-EtOH e Av-OE (100 mg/kg) e morfina (10 mg/kg), sendo o

efeito da morfina e Av-EtOH revertido na primeira fase do teste da formalina,

enquanto o efeito de Av-OE foi revertido parcialmente na primeira fase deste teste.

No teste de placa quente, o efeito da morfina, Av-EtOH e Av-OE foram revertidos. A

naloxona é um antagonista não seletivo de receptores opioides. Dessa forma,

sugere-se que o efeito antinociceptivo do extrato e do óleo pode estar sendo

mediado pela ativação desses receptores.

Ainda investigando o efeito antinociceptivo do extrato, foi realizado o modelo

de dor orofacial, termo definido pela Academia Americana de Dor Orofacial como

condições de dor que estão associadas com os tecidos duros e moles da cabeça,

face, pescoço, e todas as estruturas intra-orais. A sensação de dor orofacial das

estruturas intra-orais e da cabeça e face é transmitida para o sistema nervoso

centra, pelo nervo trigêmeo (FAN et al., 2012). Dessa forma, o modelo de dor

orofacial induzido por formalina, capsaicina e glutamato é ferramenta útil para o

estudo dos processos nociceptivos na região trigeminal (RABOISSON; DALLEL,

2004).

O uso de formalina na região orofacial (lábio superior direito) induz uma

resposta nociceptiva bifásica (LUCCARINI et al., 2006). A primeira fase ou aguda (0-

5 min) corresponde à ativação direta dos nociceptores, predominatemente fibras do

tipo C, liberando neuropeptídeos como a substância P, bradicinina e glutamato

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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(SHIBATA et al., 1989, TJOLSEN et al., 1992). A segunda fase, inflamatória (15-30

min) é caracterizada pela sensiblização central dos nociceptores e neurônios de

segunda ordem e liberação de óxido nítrico, aminoácidos excitatórios (glutamato e

aspartato), prostaciclinas e prostaglandinas (PGE2), e leucotrienos, que mais tarde

irão estimular a medula espinhal (HENRY et al., 1999, BONJARDIM et al., 2011). A

primeira e segunda fase são inibidas por drogas de ação central, como opiáceos,

enquanto a segunda fase deveria ser inibida também por fármacos anti-inflamatórios

não-esteroidais, os quais não são eficazes na inibição dos mediadores inflamatórios,

como leucotrienos, na dor orofacial (LINDENMEYER et al., 2010).

Os resultados do presente estudo mostraram que AV-EtOH reduziu o tempo

de fricção com as patas posteriores e/ou anteriores na área injetada em ambas as

fases, sugerindo que o extrato tem atividade antinociceptiva central e periférica, de

forma semelhante à morfina, droga padrão utilizada neste modelo. Para confirmar o

envolvimento de receptores opioides nesse efeito, a naloxona também foi utilizada,

revertendo parcialmente a atividade antinociceptiva do extrato na dose de 100 mg/kg

na primeira fase do presente ensaio, enquanto o efeito da morfina (10 mg/kg) foi

revertido pela naloxona em ambas as fases.

Como os receptores vaniloides (TRPV1) também estão envolvidos na

nocicepção orofacial, contribuindo na integração e detecção dos estímulos térmicos

e químicos nos neurônios sensoriais periféricos, tais como fibras do tipo C e Aδ

(CATERINA; JULIUS, 2001), o modelo de dor orofacial induzida por capsaicina foi

utilizado.

A capsaicina, responsável pela característica picante da pimenta, se

assemelha a sensação de calor excitando seletivamente terminações nervosas

nociceptivas, causando intensa dor se injetada (CATERINA; JULIUS, 2001, RANG et

al., 2012). Com a ativação de TRPV1 pela capsaicina há um influxo de Ca2+ (VOGT-

EISELE et al., 2007) e liberação de neuropeptídeos, tais como taquicininas,

substância P, calcitonina, aminoácidos excitatórios (glutamato e aspartato), óxido

nítrico e outras substâncias pró-inflamatórias a partir de terminais periféricos para

transferir o estímulo doloroso através do nervo trigêmeo (HONDA et al, 2008).

Av-EtOH foi capaz de reduzir o efeito nociceptivo da capsaicina, sugerindo

sua ação antagonista dos receptores vaniloides.

A nocicepção orofacial ainda foi induzida por glutamato, um aminoácido

excitatório encontrado tanto nos terminais centrais e periféricos do trigêmeo, como

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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também nos neurônios do gânglio da raiz dorsal (QUINTANS-JUNIOR et al., 2010).

O glutamato é liberado a partir de fibras aferentes sensibilizadas pelo nervo ou lesão

do tecido ou pela resposta a estímulos nocivos (LAM et al., 2005). Os principais

mecanismos utilizados pelos agonistas dos receptores de glutamato para provocar

dor incluem a liberação intracelular de Ca2+, a ativação de mediadores celulares, e a

abertura de canais iônicos (MILLAN et al., 1999). Além disso, o glutamato

combinado com outros mediadores e citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β)

atuam sinergicamente na excitabilidade neuronal (MILLAN, 1999;. BERNARDINO et

al., 2005). Os resultados do presente estudo mostraram que Av-EtOH inibiu a

nocicepção causada pelo glutamato.

O efeito antinociceptivo de Av-EtOH observado na segunda fase do teste da

formalina (nocicepção inflamatória) e no teste de dor orofacial induzida por formalina

tornou-se um indicativo de que Av-EtOH pode produzir efeito antinociceptivo através

de mecanismos periféricos, possivelmente por meio da inibição da síntese ou

liberação de prostaglandinas, mediado pela inibição da cicloxigenase (COX), ou por

outra via inflamatória. Para confirmar a possível atividade anti-inflamatória de Av-

EtOH, foram realizados os modelos de edema da pata induzido por carragenina e

histamina e o teste de peritonite induzida por carragenina. O óleo essencial também

apresentou efeito na segunda fase do teste da formalina, para confirmação da sua

possível atividade anti-inflamatória foi realizado o teste de peritonite.

O teste de edema de pata induzido por carragenina é um modelo

experimental amplamente utilizado para triagem de substâncias ou extratos vegetais

de caráter anti-inflamatório e tem sido frequentemente utilizado para avaliar o efeito

antiedematogênico de produtos naturais, como plantas medicinais, exibindo um

elevado grau de reprodutibilidade (THOMAZZI et al., 2010).

A formação do edema produzido pela administração intraplantar da

carragenina é um evento bifásico, que é avaliado durante 1-5 horas. A primeira fase

(1 ou 1,5 horas) é predominantemente caracterizada pela formação de um edema

não fagocítico, enquanto que a segunda fase (2-5 horas) é caracterizada por um

aumento da formação do edema, que permanece por até 5 horas (KHAN et al.,

2009). Av-EtOH administrado 1 h antes da injeção de carragenina, inibiu

significativamente o edema em 1 e 2 h, ou seja, na fase inicial do teste. Esta fase

normalmente é ocasionada pela ação de mediadores pró-inflamatórios, tais como

histamina, serotonina e bradicinina, sobre a permeabilidade vascular (ZHU et al.,

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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2011), que é subsequentemente mantida pela liberação de prostaglandinas e de

óxido nítrico (segunda fase), com pico máximo no tempo de 3 horas. Para confirmar

a ação anti-inflamatória, também foi induzido o edema de pata por histamina na fase

inicial do teste. Os resultados mostraram que o edema induzido por histamina foi

significativamente reduzido pela administração de Av-EtOH.

A resposta inflamatória induzida por carragenina tem sido associada à

infiltração de neutrófilos (DAWSON et al., 1991). O estudo histológico mostrou a

presença de infiltrado com edema subcutâneo, inclusive nos grupos tratados com

Av-EtOH, porém, estes sinais foram menos intensos quando comparados ao

controle. Esta infiltração de neutrófilos provavelmente tenha ocorrido entre 2-5

horas, onde o efeito do extrato não foi significativo.

Para melhor caracterizar o efeito anti-inflamatório de Av-EtOH, foi realizado o

teste de peritonite induzida por carragenina, que objetiva investigar a migração dos

leucócitos para a cavidade peritoneal. A inflamação produzida por este modelo é

lenta e prolongada, o que torna possível avaliar a saída de líquido intersticial, bem

como migração de células, além da presença de citocinas, enzimas e mediadores

químicos, tal como o NO, PGE2, IL-1β, IL-6 e TNF-α, utilizando diferentes agentes

flogísticos (LORAM et al., 2007). Estes mediadores são capazes de recrutar

leucócitos, tais como neutrófilos, em vários modelos experimentais.

Sendo assim, Av-EtOH e Av-OE inibiram a migração de leucócitos. Esse

efeito provavelmente se dá pelo envolvimento de mecanismos de inibição da síntese

de mediadores inflamatórios, cujo envolvimento na migração celular está bem

estabelecido.

Embora seja amplo o uso de plantas medicinais para o tratamento de várias

doenças, pouco é conhecido sobre a toxicidade e segurança (JOTHY et al., 2011).

Para determinar a segurança dos medicamentos e dos produtos vegetais para uso

humano, a avaliação toxicológica é realizada em vários modelos experimentais para

prever a toxicidade e fornecer diretrizes para a seleção de uma dose segura. A

maior concordância geral de toxicidade em animais, com o ser humano, são

alterações hematológicas, gastrointestinais e cardiovasculares (OLSON et al., 2000).

O presente estudo mostra que o extrato etanólico bruto de Annona

vepretorum administrado por via oral na dose de 100 mg/kg durante 30 dias não

provocou sinais de toxicidade nos animais, enquanto na dose de 400 mg/kg houve

pequenas alterações de comportamento, nos parâmetros hematológicos e

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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bioquímicos. Ambas as doses não ocasionaram mortes após os 30 dias de

tratamento, indicando baixa toxicidade do extrato.

Uma vez que as alterações no peso corporal têm sido utilizadas como um

indicador de efeitos adversos de fármacos e produtos químicos (TOFOVIC,

JACKSON, 1999; RAZA et al., 2002, TEO et al., 2002), todos os dias foi realizada a

verificação do peso corporal, não havendo diferença estatística quando comparados

com o grupo controle. Além disso, não houve alterações significativas no consumo

de água e ração nos grupos tratados quando comparados ao controle.

Nos ensaios de toxicidade também são observados os efeitos sobre o

comportamento, tais como: agressividade, ambulação aumentada, contorções

abdominais, convulsões, estereotipia, movimentação intensa das vibrissas,

piloereção, defecação, paralisia das patas dianteiras, analgesia, tremores, catatonia,

ptose palpebral, resposta ao toque diminuída e sedação, como possíveis sinais de

toxicidade (ALMEIDA, 2006). No presente estudo foi observado piloereção,

movimento intenso das vibrissas, analgesia, resposta ao toque diminuída, respiração

forçada e diminuição da força para agarrar, comportamentos não observados nos

demais grupos.

O sistema hematopoiético é um dos sistemas mais sensíveis para avaliar a

toxicidade das drogas em seres humanos e animais (RAHMAN et al., 2001). É

possível observar que os resultados dos parâmetros hematológicos (eritrócitos,

hemoglobina, hematócritos, CHCM, basófilos, eosinófilos, leucócitos, linfócitos,

monócitos, neutrófilos e plaquetas) após a administração de Av-EtOH não

apresentaram variação significativa, exceto no volume corpuscular médio e

hemoglobina corpuscular média que apresentou diferença estatística, cujo

significado clínico deste aumento está sendo investigado.

Em relação aos parâmetros bioquímicos, os resultados não mostraram

diferenças significativas em relação ao grupo controle e o grupo experimental na

dose de Av-EtOH. O grupo de 400 mg/kg, v.o. apresentou diferença estatística

apenas nos valores dos triglicerídeos (p < 0,05). Porém, embora a alteração nos

níveis de ALT e AST não tenham sido estatisticamente significativas nos grupos

tratados, esse perfil de resposta pode ser fisiologicamente relevante. Esses

parâmetros são importantes, visto que os resultados elevados de ALT e AST no

sangue indicam alterações nas funções hepáticas, sendo a concentração de ALT

alta do soro o primeiro sinal de lesões no fígado (HILALY et al., 2004). A creatinina é

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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conhecida como um bom indicador da função renal, seu aumento significa que há

dano nos néfrons (LAMEIRE et al., 2005).

Na análise macroscópica dos órgãos, apenas um animal tratado com Av-

EtOH, apresentou o pulmão com aspecto mais pálido e enrijecido. Não houve

diferença significativa nos pesos dos órgãos quando comprados ao controle.

Sendo assim, o estudo de toxicidade subcrônica indica baixa toxicidade do

extrato etanólico bruto de Annona vepretorum, porém, estudos posteriores com

diferentes metodologias são necessários para determinar um melhor perfil de

segurança desse extrato.

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102

7. CONCLUSÕES

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

103

7. CONCLUSÕES

Diante dos resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que o

extrato etanólico bruto e o óleo essencial obtidos das folhas de Annona vepretorum

apresentaram efeitos antinociceptivo e anti-inflamatório relevantes. Av-EtOH

demonstrou efeito antinociceptivo envolvendo mecanismos centrais e periféricos,

provavelmente relacionados aos receptores opioides. Além disso, a redução da

migração leucocitária provocada pela administração de Av-EtOH comprova o efeito

anti-inflamatório dessa espécie, onde este efeito pode também estar envolvido com

mecanismos que inibem a síntese ou liberação de mediadores pró-inflamatórios. Av-

OE também demonstrou esse padrão de resposta.

No que diz respeito à investigação do potencial antinociceptivo de Av-EtOH

em modelos de dor orofacial, a espécie em estudo mostrou-se promissora, uma vez

que apresentou efeito significativo em todos os testes realizados, especialmente no

modelo de nocicepção orofacial induzida por capsaicina. Esses resultados

demonstram que Av-EtOH pode estar atuando através de receptores opioides, via

glutamatérgica e, principalmente, sobre receptores vaniloides.

Em relação ao perfil de segurança de A. vepretorum, pode-se observar

que Av-EtOH não foi capaz de provocar mortes nos animais submetidos ao ensaio

de toxicidade subcrônica. Além disso, apenas algumas alterações hematológicas e

bioquímicas foram verificadas ao final do estudo, sendo que a importância clínica

dessas alterações ainda está sendo investigada. Dessa forma, essa espécie pode

ser considerada, a priori, de baixa toxicidade, o que respalda a continuidade de

estudos farmacológicos, toxicológicos e fitoquímicos.

Todos os resultados apresentados nesse trabalho são inéditos para a espécie

em estudo, destacando-se a contribuição do mesmo para o estudo farmacológico e

toxicológico de plantas do bioma caatinga, em especial às espécies da família

Annonaceae. Além disso, os resultados apresentados nesse estudo corroboram com

a utilização da espécie na medicina popular, estimulando o desenvolvimento de

novas pesquisas com valor tecnológico agregado, objetivando o desenvolvimento de

produtos tecnologicamente obtidos e elaborados para utilização na prática clínica.

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104

REFERÊNCIAS

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SILVA, J.C. Efeito antinociceptivo e anti-inflamatório de Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) em roedores.

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Page 129: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

129

APÊNDICES

Page 130: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

130

APENDICE A – Artigo I

Artigo I:

MODELOS EXPERIMENTAIS PARA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTINOCICEPTIVA DE PRODUTOS NATURAIS: UMA REVISÃO

Page 131: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

131

RESUMO

O interesse em investigar plantas com atividade analgésica reside no fato de que as

mesmas têm uma vasta aplicação em vários processos patológicos. Devido à baixa

eficácia e expressivos efeitos adversos apresentados pela maioria dos fármacos

disponíveis no mercado farmacêutico para este fim, surge o grande interesse dos

pesquisadores na descoberta de novos protótipos de fármacos provenientes de

plantas da flora brasileira. Vários modelos in vivo são utilizados na pesquisa de

compostos com atividade analgésica. Várias das técnicas descritas, utilizadas para

um screening da atividade antinociceptiva são gerais e independem do composto a

ser ensaiado. O objetivo desta revisão é apresentar os fundamentos dos principais

métodos de avaliação da atividade antinociceptiva de uma substância ou extrato

vegetal. A pesquisa foi realizada nas bases de dados PubMed, Scopus, Web of

Science e Science Direct, usando diferentes combinações das seguintes palavras

chave: experimental models, pain, medicinal plants, natural products e

antinociceptive activity. Apesar de, na maioria das vezes, não se chegar ao

Page 132: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

132

mecanismo de ação definitivo da substância ou extrato da planta em estudo, esses

modelos experimentais são de grande importância e representam o ponto de partida

para a caracterização farmacológica de novos compostos capazes de interferir com

o curso da dor.

PALAVRAS-CHAVE: Plantas medicinais, Dor, Nocicepção, Modelos experimentais,

Revisão.

ABSTRACT

The interest in investigating plants with analgesic activity resides in the fact that they

have a wide application in various pathological processes. Because of low efficacy

and significant side effects produced by the majority of drugs available on the

pharmaceutical market for this purpose, there is the great interest of researchers in

discovering new prototype drugs from plants of the Brazilian flora. Several in vivo

models are used in the search for compounds with analgesic activity. Several of the

techniques described, used for a screening of antinociceptive activity are general and

independent of the compound being tested. The aim of this review is to present the

fundamentals of the main methods for assessing the antinociceptive activity of a

substance or plant extracts. This literature search was performed through specialized

search databases PubMed, Scopus, Web of Science and Science Direct using

different combinations of the following keywords: experimental models, pain,

medicinal plants, natural products and antinociceptive activity. Although in most

cases not reach the definitive mechanism of action of the substance or plant extract

under study, these experimental models is of great importance and represents the

Page 133: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

133

starting point for the pharmacological characterization of new compounds capable of

interfering with the course of pain.

KEYWORDS: Medicinal plants, Pain, Nociception, Experimental models, Review.

INTRODUÇÃO

A dor crônica é um sério problema de saúde pública, não somente em termos

do sofrimento humano, mas também por causa de seu grande impacto

socioeconômico. A prevalência da dor crônica pode variar de 12 a 55% da

população. Essas variações são atribuídas a diferentes definições de dor crônica, o

tipo de população estudada e a metodologia usada na pesquisa (Vieira et al., 2012).

Quando se trata de fármacos para o tratamento da dor, abre-se uma lacuna

no que diz respeito ao regime medicamentoso que pode ser estabelecido, tendo em

vista que ainda não dispomos de um fármaco analgésico e/ou antiinflamatório ideal,

ou seja, que não promovam efeitos colaterais potenciais. Embora sejam altamente

eficazes, os analgésicos de ação central geralmente não estão dissociados de

efeitos adversos importantes. Adicionalmente, os analgésicos de ação periférica

também apresentam efeitos indesejáveis, tais como lesões do trato gastrointestinal e

renal (Rang et al., 2012). Assim, tem-se a necessidade de buscar medidas

alternativas para o desenvolvimento de medicamentos para o combate da dor.

Nessa perspectiva, os produtos naturais encaixam-se como uma fonte promissora

na pesquisa de moléculas com potencial atividade analgésica.

Há um crescente interesse mundial por produtos derivados da biodiversidade

e, nesse aspecto, o Brasil é privilegiado, sendo detentor de grande diversidade

Page 134: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

134

biológica, com inúmeras espécies vegetais com potencial medicinal (Dutra, 2009).

Esse cenário favorece a pesquisa e o desenvolvimento de fitoterápicos no país. Um

grande avanço nesse sentido é a Portaria do Ministério da Saúde de nº 971 de 03 de

maio de 2006, que aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas e

Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde (SUS). Essa política traz em

suas diretrizes a elaboração da Relação Nacional de Plantas Medicinais de

Interesse ao SUS (RENISUS). Ainda em 2006, o Decreto Federal de nº 5.813 de 22

de junho de 2006 instituiu a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,

que incentiva as pesquisas e dá diretrizes para implantação de serviços em caráter

nacional pelas Secretarias de Saúde dos Estados, Distrito Federal e dos Municípios

(Brasil, 2006).

Considerando a ascensão da fitoterapia no Brasil nas últimas décadas e a

necessidade da busca de moléculas com atividade analgésica que garantam uma

terapia eficaz e segura para o tratamento da dor, o objetivo deste trabalho foi

demonstrar, através de uma revisão bibliográfica, os mecanismos envolvidos com o

processo da dor, bem como os ensaios experimentais comumente empregados para

avaliação da atividade antinociceptiva de produtos naturais.

Mecanismos Fisiopatológicos da Dor

De acordo com a Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP), o

termo dor conceitua-se como uma experiência sensorial e emocional desagradável,

relacionado à lesão tecidual real ou potencial, ou descritas em termos desse tipo de

dano. Assim, a dor caracteriza-se como uma experiência complexa que envolve

além de transdução de estímulos nocivos ambientais, o processamento emocional

Page 135: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

135

pelo cérebro (Julius & Basbaum, 2001). É uma consequência fisiopatológica de

diversas morbidades e de suas repercussões, mas que na maioria das vezes

configura-se como uma função protetora, representando, em muitos casos, o único

sintoma para o diagnóstico de várias doenças (Oliveira et al., 2009).

Diferente de nocicepção, a dor é mais que uma sensação, é uma experiência,

podendo incorporar componentes sensoriais com influências pessoais e ambientais

importantes. Enquanto isso, o termo nocicepção refere-se ao estímulo doloroso

propriamente dito, sem levar em consideração o componente emocional, ou seja,

engloba as vias neuroanatômicas, bem como os mecanismos neurológicos e os

receptores específicos que detectam o estímulo lesivo. Sendo assim, uma vez que

os animais não são capazes de expressar verbalmente os componentes subjetivos

da dor, neles não se avalia dor, e sim nocicepção. Logo, termos como dor e

analgesia são empregados para estudos em humanos, enquanto que nocicepção e

antinocicepção são mais utilizados para estudos pré-clínicos, envolvendo animais de

laboratório (Kandel et al., 2003).

A dor pode ser classificada de acordo com o tipo de lesão e com os

mediadores envolvidos, recebendo as seguintes denominações: neurogênica,

quando ocorre lesão do tecido neuronal; neuropática, quando ocorre a disfunção de

um nervo; psicogênica, que ocorre por fatores psicológicos; ou nociceptiva, quando

ocorre por estimulação excessiva dos nociceptores. Em termos de duração, um

episódio de dor pode ser agudo ou crônico. A dor aguda corresponde à ativação

local de nociceptores induzida por um dano tecidual, sendo que a dor desaparece

até mesmo antes do restabelecimento do tecido lesado. Já a dor crônica provocada

por uma lesão tecidual ou doença, geralmente ultrapassa o tempo de recuperação

Page 136: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

136

do organismo, sendo um importante fator de incapacidade e sofrimento (Millan,

2002).

Os nociceptores são terminações nervosas livres, não especializadas, que

respondem a estímulos nociceptivos, detectando, desse modo, lesão nos tecidos,

onde os estímulos desencadeantes podem ser mecânicos, térmicos ou químicos

(Millan, 2002). Assim, o potencial antinociceptivo de um produto natural, por

exemplo, pode ser medido pelo seu poder de aumentar o limiar de excitação dessas

terminações nervosas ao estímulo doloroso, ou então, fazer com que os

nociceptores não percebam ou não respondam ao estímulo doloroso promovido.

Na percepção da dor, os neurônios aferentes primários que participam da

transmissão da sensação dolorosa envolvem fibras intensamente mielinizadas, de

maior diâmetro (10 µm) e que apresentam maior velocidade de condução (30-100

m/s), caracterizadas como fibras Aβ. Entretanto, a maioria dos nociceptores está

inclusa nas fibras de pequeno (0,4-1,2 µm) e médio diâmetro (2-6 µm), que

constituem respectivamente as fibras C, não mielinizadas, e as fibras Aδ, pouco

mielinizadas (Julius & Basbaum, 2001).

O principal neurotransmissor excitatório em todos os nociceptores é o

glutamato, embora as fibras sejam também sensibilizadas por outras substâncias

químicas endógenas liberadas no ambiente tecidual em condições anormais. Dentre

elas destacam-se a acetilcolina, bradicinina, histamina, serotonina, leucotrienos,

substância P, neuropeptídeo Y, purinas, íons K+, prostaglandinas, tromboxano,

citocinas (interleucinas e TNF-α) e prótons (H+). Neste sentido, grande parte da

ativação das fibras nociceptivas se dá por receptores específicos acoplados à

cascata de segundos mensageiros intracelulares e canais iônicos (Luiz, 2007).

Page 137: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

137

Considerando o envolvimento de diferentes vias de sinalização no processo

da dor, faz-se necessário a utilização de modelos experimentais que diferenciem

uma possível atividade antinociceptiva de um produto natural por mecanismos

centrais, envolvendo mediadores imediatos; ou por mecanismos periféricos,

envolvendo mediadores produzidos mais tardiamente, principalmente aqueles que

são liberados durante o processo inflamatório.

METODOLOGIA

A pesquisa bibliográfica foi realizada em agosto de 2012 através de consultas

a artigos científicos publicados em periódicos especializados na área de produtos

naturais. Esta pesquisa na literatura foi realizada nas bases de dados PubMed,

Scopus, Web of Science e Science Direct, usando diferentes combinações das

seguintes palavras chave: experimental models, pain, medicinal plants, natural

products e antinociceptive activity. Para a elaboração deste artigo, as referências

encontradas na pesquisa foram estudadas em detalhe.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nesta seção nós apresentamos algumas considerações sobre os principais

métodos utilizados para avaliação da atividade antinociceptiva de produtos naturais,

seus fundamentos, vantagens e desvantagens de cada método. Para detalhes dos

modelos experimentais mais utilizados, as referências originais devem ser

consultadas. Abaixo, são apresentados os principais modelos experimentais

estudados: contorções abdominais induzidas por ácido acético, teste da formalina,

Page 138: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

138

teste de Randall-Selitto, teste de Von Frey, dor orofacial induzida pela formalina,

teste da placa quente e teste de retirada da cauda.

Contorções abdominais induzidas por ácido acético

O teste de contorções abdominais é um modelo químico de nocicepção que

se baseia na contagem das contorções da parede abdominal seguidas de torção do

tronco e extensão dos membros posteriores, como resposta reflexa à irritação

peritoneal e à peritonite produzidas pela injeção intraperitoneal de uma solução de

ácido acético 0,9% (Whittle, 1964).

Este teste é sensível à avaliação de drogas analgésicas, no entanto, pode ser

visto como um modelo geral, não seletivo, para estudos de drogas antinociceptivas

(Couto et al., 2011). Uma vez que o ácido acético induz indiretamente a liberação de

mediadores endógenos, tais como bradicinina, serotonina e capsaicina, estimulando

neurônios periféricos, representados principalmente por fibras C, que são sensíveis

aos mediadores inflamatórios (Deraedt et al., 1980; Marchioro et al., 2005).

A liberação de prostaglandina via ação da ciclooxigenase sobre o ácido

araquidônico também está envolvida. O grupo de pesquisa de Deraedt et al. (1980)

descreveu a quantificação de prostaglandinas por radioimunoensaio no exsudato

peritoneal, obtidos após injeção intraperitoneal de ácido acético, observando-se altos

níveis de prostaglandinas PGE2 e PGF2 durante os primeiros 30 minutos após sua

administração.

Page 139: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

139

Teste da formalina

O teste da formalina é um método de avaliação comportamental utilizado para

medir a efetividade de agentes antinociceptivos (Hunskaar & Hole, 1987; Randolph,

1997). Este modelo de dor está associada à lesão tecidual, no qual se quantifica a

resposta comportamental provocada pela injeção subcutânea de formalina diluída na

pata traseira do animal (Dubuisson & Dennis, 1977; Martins et al., 2006).

A vantagem deste teste sobre outros métodos de nocicepção é a

possibilidade de avaliar dois tipos diferentes de dor ao longo de um período

prolongado de tempo e, assim, permite o teste de analgésicos com diferentes

mecanismos de ação (Randolph, 1997).

As respostas comportamentais à formalina seguem um padrão bifásico

composto de uma fase inicial aguda (primeira fase), e por um período mais

prolongado (segunda fase) de atividade comportamental aumentada, que pode durar

até cerca de uma hora. O período entre as fases é denominado intervalo de

quiescência (Dubuisson & Dennis, 1977, Martins et al., 2006).

A primeira fase inicia-se imediatamente após a injeção de formalina e se

estende pelos primeiros 5 minutos (dor neurogênica ou aguda), estando relacionada

com a estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes do tipo C e,

em parte, das fibras do tipo Aδ e está associada à liberação de aminoácidos

excitatórios, óxido nítrico e substância P. A segunda fase ocorre entre 15 e 30

minutos após a injeção de formalina e está relacionada com a liberação de vários

mediadores pró-inflamatórios, como bradicinina, prostaglandinas e serotonina, entre

outros. O intervalo de quiescência entre a primeira e a segunda fase é resultado de

Page 140: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

140

uma inibição da transmissão nociceptiva através de circuitos supra-espinhais e

espinhais (Hunskaar & Hole, 1987).

Teste de Randall-Selitto

O modelo experimental desenvolvido por Randall & Selitto (1957) é um

método para avaliação da hipernocicepção bastante utilizado, que se fundamenta na

indução de hiperalgesia através de pressão crescente na pata do animal. Este teste

é baseado no princípio de que a inflamação diminui o limiar de reação à dor e que

essa redução pode ser modificada por analgésicos narcóticos e não-narcóticos.

Neste ensaio experimental, um agente flogístico é injetado no tecido

subplantar de uma das patas traseiras, e é medido o tempo de latência da retirada

da pata a partir da pressão exercida. O reflexo de retirada da pata é considerado

representativo do limiar hipernociceptivo, ou seja, a força necessária aplicada à pata

para que induza uma resposta aversiva a um estímulo nocivo (Limiar Nociceptivo de

Retirada da Pata - LNRP). A força necessária para que esse animal exiba tal

resposta é registrada em gramas. O LNRP é avaliado antes e após a administração

dos estímulos hiperalgésicos ou inflamatórios, que variam de acordo com o

experimento (Randall & Selitto, 1957).

Teste de von Frey

O uso de filamentos de von Frey é um método utilizado para avaliar a

sensibilidade tecidual ao estímulo mecânico, sendo bastante utilizado clinicamente.

Entretanto, tal método passou a ser utilizado também para experimentos

laboratoriais, no sentido de avaliar a influência de drogas sobre a sensibilidade

nociceptiva em animais. Além disso, essa técnica foi transformada em um método

Page 141: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

141

eletrônico, usado primeiramente em humanos (Jensen et al., 1986), e

posteriormente em ratos e camundongos (Cunha et al., 2004).

Os experimentos são realizados com um anestesiômetro eletrônico, que

consiste em um transdutor de pressão adaptado a um contador digital de força

expressa em gramas (g). O contato do transdutor de pressão com a pata é realizado

através de uma ponta descartável de polipropileno. Os animais são colocados em

caixas de acrílico durante 15-30 minutos para adaptação. O assoalho da caixa é

feito de arame não maleável na forma de rede. As alterações nos limiares

nociceptivos são avaliadas exercendo-se uma pressão linearmente crescente no

centro da planta da pata do animal até a produção de uma resposta caracterizada

como sacudida (flinches) da pata estimulada. Os estímulos são repetidos por até

seis vezes, em geral até o animal apresentar três medidas similares com uma clara

resposta de flinch após a retirada da pata. A intensidade de hipernocicepção é

quantificada como a variação na pressão obtida subtraindo-se a média de três

valores expressos em gramas (força) observada antes do procedimento

experimental (0 hora) da média de três valores em gramas (força) após a

administração dos estímulos, que variam de acordo com o experimento (Jensen et

al., 1986).

Os modelos experimentais baseados em testes mecânicos permitem a

avaliação do aumento da sensibilidade do nociceptor a estímulos inócuos (alodinia)

ou nocivos (hiperalgesia). Porém, além de estímulo de nociceptores de fibras Aδ e

nociceptores de fibras C, também podem ser ativados mecanorreceptores,

resultando em estímulos inespecíficos que nem sempre refletem a neurofisiologia da

nocicepção. Particularmente, o teste de von Frey, é usado para avaliar através do

Page 142: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

142

estímulo mecânico inócuo e crescente (alodinia mecânica) a sensibilidade tecidual

provocada pela incisão (Le Bars et al., 2001).

Dor orofacial induzida por formalina

A região orofacial é uma área densamente ocupada pelo nervo trigêmeo e,

muitas vezes, é sítio frequente de dores referida e crônica. Alterações clínicas no

território trigeminal, como aumento de sensibilidade cutânea e hiperalgesia,

observadas em cefaleias primárias e dores orofaciais em geral, são muito sugestivas

de anormalidades no sistema nociceptivo trigeminal. (Perla, 2007).

Entre os modelos nociceptivos experimentais de dores orofacial e cefálicas, o

teste da formalina é um dos mais relevantes em termos de aplicabilidade

experimental e clínica, quando se estuda dores agudas (Perla, 2007). Ele avalia a

nocicepção trigeminal por meio da aplicação de estímulo químico (administração

subcutânea de uma solução de formalina) na região orofacial. Este modelo constitui

uma adaptação do teste da formalina administrada na superfície plantar de animais

(Dubuisson & Dennis, 1977; Raboisson & Dallel, 2004). Contudo, vale ressaltar que

para uma avaliação mais detalhada dos receptores envolvidos no mecanismo de

ação do produto natural a ser testado, este ensaio experimental pode ser realizado

com a aplicação de outros agentes químicos, como por exemplo, glutamato e

capsaicina (Silva, 2011).

As principais respostas comportamentais que caracterizam a dor e que são

observadas nesse modelo experimental são: medida do tempo ou do número de

reflexos de autolimpeza (grooming) dirigidos ao local da injeção de formalina;

vocalização espontânea; tremores vigorosos do corpo (shaking) associados ao ato

Page 143: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

143

de lamber as patas dianteiras e proteger vigorosamente a face; e trismo (Perla,

2007).

Assim como no teste da aplicação de formalina subplantar, os parâmetros

indicativos de dor para este modelo também podem ser observados imediatamente

após a aplicação do agente químico e, posteriormente, após o período de

quiescência. Segundo Dubuisson & Dennis (1977), a dor, no modelo nociceptivo

trigeminal, é inicialmente resultante da reação inflamatória gerada pela ligação da

formalina às proteínas teciduais, por meio da formação de pontes primárias de

carbono (propriedade fixadora do tecido). Tal reação inflamatória na área de injeção

persiste por período relativamente longo. A resposta inicial (primeira fase)

possivelmente decorre da estimulação direta dos nociceptores, enquanto que a

segunda fase do teste deve-se à inflamação e sensibilização central.

Teste da placa quente

O teste da placa quente (hot plate) avalia o tempo em que os animais

permanecem sobre uma chapa metálica aquecida (55 ± 0,5 ºC) até reagirem ao

estímulo térmico com o comportamento de levantar ou lamber as patas (Tita et al.,

2011). As aferições são realizadas nos tempos de 30, 60, 90 e 120 minutos após a

administração das substâncias a serem analisadas.

O modelo experimental foi inicialmente descrito por Woolfe & Macdonald

(1944) como modelo específico para a detecção de sustâncias analgésicas de efeito

central. Embora o uso de analgésico central e periférico responda pela inibição do

número de contrações provocadas por estímulos químicos que levam à dor, apenas

os analgésicos centrais aumentam o tempo de resposta no teste da placa quente.

Este modelo utiliza a temperatura como estímulo nociceptivo. Dessa forma, os

Page 144: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

144

nociceptores (fibras C e Aδ, principalmente) são estimulados após a ativação dos

receptores vaniloides, especificamente os receptores do tipo VR-1, que possuem

limiar de ativação em 43 ºC, e os receptores do tipo VRL-1, que possuem limiar de

ativação em 52 ºC. Estes últimos são importantes na avaliação da resposta a

estímulos térmicos nocivos, pois são responsáveis pela resposta em decorrência do

aumento da temperatura (Julius & Basbaum, 2001; Benedito, 2009).

Teste de retirada da cauda

O teste de retirada da cauda (tail-flick) é sensível para identificar a atividade

de compostos presentes em extratos vegetais ou isolados a partir desses, além de

sintéticos, cujos mecanismos sejam semelhantes aos promovidos pelos analgésicos

opióides (Oliveira et al., 2008).

Este ensaio experimental consiste na aplicação de uma fonte radiante de

calor na cauda do animal como estimulo nociceptivo térmico, provocando seu

movimento de retirada (Oliveira et al., 2009). Um aumento no tempo de reação é

geralmente considerado como um parâmetro importante para avaliar a atividade

antinociceptiva central, caracterizando-se por uma nocicepção aguda não-

inflamatória. Sendo assim, substâncias que atuam em nível central, como a morfina,

são capazes de suprimir respostas de neurônios espinhais ao estímulo térmico

nocivo na cauda, aumentando o tempo de latência (Fischer et al., 2008).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A utilização de modelos experimentais como os que foram demonstrados

neste trabalho é de fundamental importância para a descoberta de novos fármacos,

particularmente de analgésicos, visto que estes só podem ser comercializados após

a realização de ensaios farmacológicos pré-clínicos que atestem sua eficácia e

Page 145: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

145

segurança. Esses testes representam o início para a caracterização de novas

drogas, capazes de interagir com os mediadores da dor e/ou inflamação, fornecendo

assim um ponto de partida para a elucidação das vias de efeito antinociceptivo

envolvidas, atendendo às necessidades da terapia farmacológica para este tipo de

agravo à saúde.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do

Estado de Pernambuco (FACEPE) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro, bem como à Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas de mestrado

concedidas.

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Page 150: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

150

APENDICE B – Artigo II

Artigo II:

ANTINOCICEPTIVE AND ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITIES OF THE

ETHANOLIC EXTRACT OF ANNONA VEPRETORUM MART.

(ANNONACEAE)

Page 151: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

151

ARTIGO II

Artigo submetido à:

Revista: Phytotherapy Research

Título: Antinociceptive and Anti-inflammatory Activities of the Ethanolic

Extract of Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) in Rodents

Autores: Juliane Cabral Silva, Camila de Souza Araújo, Sarah Raquel Gomes de Lima-

Saraiva, Raimundo Gonçalves de Oliveira-Junior, Tâmara Coimbra Diniz, Carlos Wagner de

Souza Wanderley, Raimundo Campos Palheta Júnior, Rosemairy Luciane Mendes, Adriana

Gibara Guimarães, Lucindo José Quintans Júnior e Jackson Roberto Guedes da Silva

Almeida.

Page 152: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

152

Antinociceptive and Anti-inflammatory Activities of the Ethanolic

Extract of Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) in Rodents

Juliane Cabral Silva,1 Camila de Souza Araújo,

1 Sarah Raquel Gomes de Lima-

Saraiva,1 Raimundo Gonçalves de Oliveira-Junior,

1 Tâmara Coimbra Diniz,

1 Carlos

Wagner de Souza Wanderley,1 Raimundo Campos Palheta Júnior,

1 Rosemairy Luciane

Mendes,1 Adriana Gibara Guimarães,

2 Lucindo José Quintans Júnior

2 and Jackson

Roberto Guedes da Silva Almeida1,1

1Center for Studies and Research of Medicinal Plants, Federal University of San Francisco

Valley, Postal Code 56.304-205, Petrolina, Pernambuco, Brazil

2Department of Physiology, Federal University of Sergipe (DFS/UFS), Postal Code 49.100-

000, São Cristóvão, Sergipe, Brazil

Short title: Biological properties of Annona vepretorum

1 Correspondence to: Jackson Roberto Guedes da Silva Almeida, Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais, Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina,

Pernambuco, Brazil. Tel/fax + 55-87-21016862. E-mail: [email protected]

Page 153: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

153

Annona vepretorum Mart. (Annonaceae) is a native tree from Caatinga biome, popularly

known as “araticum” and “pinha da Caatinga”. In this study, we investigated the effects

of the crude ethanolic extract (Av-EtOH) in models of pain and inflammation in rodents.

The evaluation of antinociceptive activity was carried out by the acetic acid-induced

writhing, formalin, hot plate and tail flick tests, while paw edema induced by

carrageenan or histamine, and leukocyte migration to the peritoneal cavity were used

for anti-inflammatory profile. Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o) significantly

reduced the number of writhing (p < 0.01) and decreased (p < 0.01) the paw licking time

in both phases of the formalin test. In the hot plate and tail flick tests, this extract

increased the reaction time, consequently reduced painful behavior. The effects in the

formalin and hot plate tests were antagonized by naloxone. Av-EtOH inhibited

significantly (p < 0.01) the increase in the edema volume after administration of

carrageenan and histamine. In the peritonitis test, acute pre-treatment with Av-EtOH

inhibited leukocyte migration. Thus, Av-EtOH has significant antinociceptive and anti-

inflammatory properties, which are related probably with the activation of opioid

receptors and inhibition of release of mediators of the inflammatory process.

Keywords: antinociceptive effect; anti-inflammatory effect; pain, inflammation, Annonaceae;

Annona vepretorum

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154

INTRODUCTION

The Caatinga biome (semi-arid vegetation) is a highly threatened biome covering a vast area

in Northeastern Brazil and is the source of many few studied natural resources (Albuquerque

and Andrade, 2002). Many medicinal plants species from the Caatinga are widely known and

used in folk medicine and for commercial manufacturing of phytotherapeutic products. Few

ethnobotanical and pharmacological studies have been undertaken in this region, however, in

spite of the great cultural and biological diversity to be found there (Albuquerque et al.,

2007). In the Brazilian Northeastern, the Caatinga has fundamental importance in the lives of

people that inhabit this region because it offers a wide variety of animals and plants that are

used for food, fuel, building materials and medicinal purposes (Almeida et al., 2010).

Plants of the family Annonaceae are formed by trees and shrubs and can be found in

tropical and subtropical regions (Fechine et al., 2002). It is the largest family of the

Magnoliales order, having about 2300-2500 species and over 130 genera (Carballo et al.,

2010). Many species of Annonaceae are usually consumed as fresh fruits, they are also widely

used in folk medicine for antiparasitic, antitumoral and treatment of intestinal diseases (Habib

and Waheed 2013; Araya et al., 2004). Several reports have characterized the

pharmacological activity of these plants because of their bioactive compounds (mainly

alkaloids and flavonoids) found in roots, leaves, bark, seeds and fruits (Carballo et al., 2010).

Annona L. belongs to the Annonaceae family and comprises approximately 175

species of trees and shrubs. Economically, this genus is the most important of the Annonaceae

family due to its edible fruits and medicinal properties (Dutra et al., 2012). Some studies have

demonstrated that species of the genus Annona have pharmacological properties mainly

antinociceptive (Hamid et al., 2012; Carballo et al., 2010) and anti-inflammatory activities

(Foong and Hamid, 2012).

Page 155: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

155

Annona vepretorum is endemic of Brazil (Caatinga biome), popularly known as

“araticum” and “pinha da Caatinga” and is widely used in the human nutrition. The fruits are

usually consumed “in natura” or used in juices. Previous study of this species described the

chemical composition and bioactivity of the essential oil from the leaves collected in Poço

Redondo, state of Sergipe, Northeastern Brazil (Costa et al., 2012).

Considering the large consumption in our region and scarcity of chemical and

pharmacological studies about this species, this study evaluated the antinociceptive and anti-

inflammatory properties of the ethanolic extract from Annona vepretorum in experimental

models of pain and inflammation.

MATERIALS AND METHODS

Plant Material. The leaves of A. vepretorum were collected in Jaguarari, Bahia, Brazil, in

October of 2010. The plant was identified by R. Mello Silva, a botanist from Centro de

Referência para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD). The voucher sample (#946) was

deposited in the Herbarium Vale do São Francisco (HVASF) from Federal University of San

Francisco Valley.

Preparation of the plant extract. The leaves of A. vepretorum were dried in an oven at 40 ◦C

for three days. The material dried and pulverized (1400 g) was macerated with ethanol

(EtOH) 95% at room temperature for 72 h. The EtOH solution was concentrated under

vacuum yielding 600 g of crude ethanol extract of Annona vepretorum (Av-EtOH).

Page 156: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

156

Animals. Adult male Swiss mice (30-40 g) and rats (200-250 g), were randomly housed in

appropriate cages at 22 ± 2 °C on a 12 h light/dark cycle (lights on at 6:00 a.m.) with access to

food and water ad libitum. Animals were allowed to have a period of acclimation before any

experimentation. They were used in groups of six animals each. All nociception tests were

carried out by the same visual observer. Experimental protocols and procedures were

approved by the Federal University of San Francisco Valley Animal Care and Use Committee

by number 0004/261011.

Acetic acid-induced writhing in mice. This test was performed using the method described

by Collier et al. (1968) with modifications. Mice were divided into six groups of six animals

each. Nociception was induced by intraperitoneal (i.p.) injection of acetic acid (0.9% v/v) in a

volume of 0.1 ml/10 g. Animals were treated with the Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg), or

with vehicle (saline) given by orally administered (p.o.) 1 h before the nociceptive agent.

Indomethacin (20 mg/kg) and morphine (10 mg/kg) in vehicle were used as reference drugs

and given by i.p. 30 min before algogen agent. Following the injection of acetic acid, the

number of abdominal constrictions (a response consisting of contraction of the abdominal

wall, pelvic rotation followed by hind limb extension) occurring between 5 and 15 min after

injection (Queiroz et al., 2010).

Formalin test. The method used was similar to that described by Hunskaar and Hole (1987).

A formalin solution (2.5% in 0.9% sterile saline; 20 µl/paw subplantar) was injected into the

right hind paw of the mice (Santos et al., 2010). Mice were observed in the chambers with a

mirror and the amount of time (in seconds) spent licking and biting the injected paw was

Page 157: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

157

measured as an indicator of pain. Responses were measured for 5 min after formalin injection

(first phase, neurogenic) and 15-30 min after formalin injection (second phase, inflammatory)

(Almeida et al., 2011). Treatments with vehicle (saline, p.o.), Av-EtOH (25, 50 and 100

mg/kg, p.o.), indomethacin (20 mg/kg, i.p.) and morphine (10 mg/kg, i.p.) were given 1 h

prior to formalin injection (n= 6 per group). For evaluation of the involvement of opioid

receptors in the effect of the extract, naloxone (1.5 mg/kg, i.p.), an opioid receptor antagonist,

was administered 30 minutes before administration of the extract (100 mg/kg) or morphine.

Hot plate test. Mice were divided into six groups of six mice each. Mice were pre-selected on

the hot plate apparatus (Insight, Brazil) at 55 ± 0.5 °C. Animals showing a reaction time

(defined as the latency for licking the hind feet or jumping) greater than 20 s were discarded.

Selected mice were pre-treated with vehicle (p.o.), Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.), or

morphine (10 mg/kg, i.p.). Each animal was placed on the heated surface of the plate

maintained at 55 ◦C and the latency to a discomfort reaction (licking of the paws or jumping)

was recorded at 30, 60, 90 and 120 min after the administration of the vehicle, extract and

morphine (Almeida et al., 2011). A cut-off time of 20 s was chosen to indicate complete

analgesia and to avoid tissue injury. The latencies for paw licking or jumping were recorded

for each animal. For evaluation of the involvement of opioid receptors in the effect of the

extract, naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) was administered 30 minutes before administration of the

extract (100 mg/kg) and morphine.

Tail Flick. The antinociceptive response against thermal stimuli was assessed with the tail-

flick test (Analgesiometer, Insight, Brazil) (D’Amour and Smith, 1941). Rats were divided

into five groups of six rats each and each rat was placed in a ventilated tube with the tail

Page 158: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

158

positioned in radiant thermal stimulation of the dorsal surface of the tail. The heating was

applied to distal third of the tail and consist focus a beam of light at 50 °C in the tail of rats.

The time, in seconds, taken to remove the tail of the beam is regarded as the reaction time,

which is measured automatically by a recorder coupled to the apparatus. Each trial was

terminated after 7 s to minimize the probability of skin damage. The tail-flick latency was

measured before and 30, 60, 90 and 120 min after administration of vehicle (p.o.), Av-EtOH

(25, 50 and 100 mg/kg, p.o.), or morphine (10 mg/kg, i.p.) (Nakamoto et al., 2010).

Therefore, the longer delay with the animal's tail under the effect of beam higher analgesic

activity.

Carrageenan-induced hind paw edema in mice. The anti-inflammatory activity was studied

using the paw edema model induced by 2% carrageenan, injected at volume of 20 µl/animal

into the subplantar region of the right hind paw of the mice (Winter et al., 1962). Mice were

divided into six groups of six animals each. Mice were pre-treated with Av-EtOH (25, 50 and

100 mg/kg, p.o.), saline (vehicle, p.o.) or indomethacin (20 mg/kg, i.p.) 1 h before

carrageenan injection or saline injection. The mice pedal volume up to the ankle joint was

measured using plethysmometer (PanLab LE 7500, Spain) before (VA, baseline) the

intraplantar administration of carrageenan and 1, 2, 3, 4 and 5 h after (VB), as described

previously (Huang et al., 2012). The inhibition of the edema paw was calculated by (VB-

VA)/VA, where VA is the volume of the right hind paw before carrageenan injection, and VB

is the volume of the right hind paw after carrageenan injection. Finally, the animals were

sacrificed and all of right hind paw were dissected. Each sample was embedded in paraffin

wax, sectioned at 5 µm and stained with hematoxylin–eosin for histological analysis.

Page 159: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

159

Histamine-induced hind paw edema in mice. The edema in mice was induced by injecting

100 µg/paw of histamine (Cavalher-Machado et al., 2008). Mice were divided into three

groups of six animals each. Animals were pre-treated with Av-EtOH (100 mg/kg, p.o.),

vehicle (saline, p.o.) 1 h before histamine injection or saline. The volume was measured

before the intraplantar injection of histamine or saline (VA, baseline) and 30, 60, 90 and 120

min after (VB) (Suleyman et al., 1999). The inhibition of paw edema was calculated as

described in carrageenan induced paw test. The animals were also sacrificed and all of right

hind paw were dissected for histological analysis.

Leukocyte migration to the peritoneal cavity. Mice were divided into five groups of six

animals each. The leukocyte migration was induced by injection of carrageenan (1%, i.p.,

0.25 ml) (Andrade et al., 2012) into the peritoneal cavity of mice 1 h after administration of

Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.), or with vehicle (saline, p.o.) 0.5 h after injection of

dexamethasone (2 mg/kg, i.p.) (Bastos et al., 2007). The leukocyte migration was evaluated 4

h after stimulus, when the animals were euthanized and the peritoneal cavity cells were

harvested with 3 ml saline containing 1 mM EDTA. Immediately, a brief massage was done

for further fluid collection, which was centrifuged (3000 rpm for 6 min) at room temperature.

The supernatant was disposed and saline was added to the precipitate. An aliquot of 10 μl

from this suspension was dissolved in 200 μl of Turk solution and the total cells were counted

in a Neubauer chamber, under optic microscopy. The results were expressed as the number of

leukocytes/ml (Melo et al., 2011).

Statistical analysis. The results were presented as the mean ± standard error of the mean

(SEM) and the statistical significance was determined using an analysis of variance

Page 160: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

160

(ANOVA) followed by Dunnett’s test. Groups of data of histamine-induced hind paw edema

in mice were analyzed using unpaired Student’s t-test. Values were considered significantly

different at p < 0.05. All analysis was performed using by GraphPad Prism 5.0 program

(Graph Pad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA).

RESULTS

Acetic acid-induced writhing in mice

The results shown in Fig. 1 demonstrated that the pre-treatment with Av-EtOH (25, 50 e 100

mg/kg, p.o.) 1 h before, was capable of inhibiting the abdominal writhing induced by the

intraperitoneal administration of the acetic acid when compared with control group (p < 0.01).

The inhibitions of writhes in percentage were 61.75, 81.08 and 91.89. Indomethacin and

morphine produced a 92.90% and 100%, respectively, of reduction in acetic acid-induced

writhing when compared to the control.

INSERT FIGURE 1

Formalin test

The treatment with Av-EtOH at doses of 25 and 100 mg/kg (p.o.) produced a significant

antinociceptive activity compared to the control group in both the early and late phases (p <

0.05) (Fig.2). Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o.) decreased by 55.22, 64.18 and 65.30%,

respectively, the paw licking time in the first phase, as well as 66.36, 3.98 and 82.27%,

respectively, in the second phase of the formalin test. The reference drug indomethacin

Page 161: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

161

suppressed only the second phase of the formalin test, while morphine inhibited both phases

of the pain stimulus (p < 0.05). The pre-treatment with naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) reversed the

antinociceptive activity of the extract at dose of 100 mg/kg in the first phase of this test. The

effect of morphine (10 mg/kg) was also reversed by naloxone.

INSERT FIGURE 2

Hot plate test

In the hot plate test (Fig. 3), the animals treated with morphine (10 mg/kg, i.p.) demonstrated

a marked increase in latency at 30, 60, 90 and 120 min. The ones treated with the Av-EtOH

(25 and 100 mg/kg, p.o.) showed a marked increase in latency at 60 and 90 min. The one

treated with Av-EtOH (50 mg/kg, p.o.) did not shown significantly behavioral changes. The

effect of morphine and Av-EtOH was reverted by naloxone.

INSERT FIGURE 3

Tail Flick

The Av-EtOH administrated at dose of 50 mg/kg (p.o) induced a significant increase in the

reaction time to thermal stimuli when compared to the control group at 30 and 60 min. The

group treated with morphine (10 mg/kg, i.p.) caused a significant increase in the response

latency time at 30, 60, 90 and 120 min (Fig. 4).

Page 162: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

162

INSERT FIGURE 4

Carrageenan-induced hind paw edema in mice

To determine the possible anti-inflammatory effects of Av-EtOH, carrageenan-induced hind

paw edema models were performed in mice. When carrageenan was used as inductor of

edema (Fig. 5), Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o) administered 1 h before carrageenan

injection, inhibited significantly (p < 0.01) the increase in the edema volume at 1 and 2 h, but

not in 3, 4 and 5 h after stimuli. Moreover, control drug, indomethacin (20 mg/kg, i.p.),

showed the highest inhibition of edema volume (p < 0.01) during 5 h.

INSERT FIGURE 5

Histamine-induced hind paw edema in mice

The inflammatory edema induced by histamine was significantly attenuated by Av-EtOH 100

mg/kg, p.o. in 30 min and 60 min (p < 0.05), as shown in Fig. 6.

INSERT FIGURE 6

Histological examination

Page 163: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

163

Histological analysis showed the presence of intense inflammatory infiltrate with

subcutaneous edema in the groups where inflammation was induced by carrageenan and

treated with 50 and 100 mg/kg of Av-EtOH. However, the group treated with 25 mg/kg of

Av-EtOH the infiltrate was less intense. In the group where inflammation was induced by

histamine and treated with 100 mg/kg of Av-EtOH the inflammatory process was less intense

than in the control group (Fig. 7).

INSERT FIGURE 7

Leukocyte migration to the peritoneal cavity

Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o) administered 1 h before injection of carrageenan (1%,

i.p., 0.25 ml) inhibited leukocyte migration (p < 0.01) when compared to control group (Fig.

8). The reference drug dexamethasone (2 mg/kg, i.p.) promoted significant reduction in

leukocyte migration (p < 0.01).

INSERT FIGURE 8

DISCUSSION

For the first time in the literature, our data indicate that crude ethanolic extract (Av-EtOH)

obtained from the leaves of Annona vepretorum possess antinociceptive and anti-

inflammatory profiles in different nociceptive responses generated by a chemical or thermal

noxious stimulus.

Page 164: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

164

The acetic acid-induced writhing test in mice has long been used as a classic model for

the assessment of analgesic or anti-inflammatory properties of new agents (Mohamad et al.,

2010). In fact, it is a non-selective model for antinociceptive studies, since an intraperitoneal

injection of acetic acid triggers the release of a variety of mediators such as substance P,

bradykinins, prostaglandins especially PGI2 as well as pro-inflammatory cytokines such as IL-

1, IL-6, IL-8 and TNF-α, stimulating the peripheral nociceptor and sensitive neurons that were

responsive to the inflammatory mediators (Le Bars et al., 2001).

The ethanolic extract (Av-EtOH) significantly reduced the acetic acid-induced

writhing in mice. The acetic acid produced 14.80 ± 2.08 writhes in the control group for 10

min after the injection. The groups previously treated with 25, 50 and 100 mg/kg of Av-EtOH

exhibited a significant reduction in the number of writhings of 61.75, 81.08 and 91.89%,

respectively. Our results have shown that Av-EtOH possess a potent antinociceptive activity

in this method.

The formalin test is an evaluation method used to measure the behavioral effectiveness

of antinociceptive agents (Hunskaar and Hole, 1987; Randolph, 1997). The advantage of this

assay over other methods of nociception is the possibility to evaluate two different types of

pain over a prolonged period of time and thus allows the testing of analgesics with different

mechanisms of action (Le Bars et al., 2001; Randolph, 1997). The behavioral response to

formalin followed a biphasic pattern composed of an initial acute phase (first phase), and for a

longer period (second phase) and the period between phases is called the quiescent interval

(Martins et al. 2006). Drugs which act mainly centrally, such as narcotic analgesics, inhibit

both phases, while peripherally acting drugs, such as indomethacin, only inhibit the late

phase. Av-EtOH inhibited both phases of the formalin-induced nociception, but its effect was

more prominent in the second phase.

Page 165: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

165

Seeking a possible central involvement in the antinociceptive effect of Av-EtOH, hot

plate and tail flick assays were conducted. The increase in latency of Av-EtOH on hot plate

show provide evidences of its central effect since this is predominantly a spinal reflex and

considered as central model for centrally-acting analgesic drugs (Nemirovsky et al., 2001).

This test, on thermal stimulation is associated with central neurotransmission in what the heat

activates nociceptors (Aδ and C fibers) by driving the momentum of the dorsal horn of the

spinal cord and subsequently to cortical centers (Pinheiro et al., 2011).

In tail flick test, the Av-EtOH administrated at dose of 50 mg/kg (p.o) caused a

significant increase in the reaction time to thermal stimuli as compared to the control group at

30 and 60 min. This test consists of a thermal stimulus, an increase in the reaction time is

considered to be a parameter for evaluating central antinociceptive activity (Rujjanawate et

al., 2003). Therefore, tail flick is characterized by an acute nociception and non-

inflammatory. Substances which act at central level, such as morphine, are able to suppress

responses of spinal neurons to noxious thermal stimulus in the tail, increasing the latency time

(Fischer et al., 2008).

To confirm of the involvement of opioid receptors in the effect of the extract,

naloxone (1.5 mg/kg, i.p.) was administered 30 minutes before administration of the extract

(100 mg/kg) and morphine, being the effect of morphine and Av-EtOH reverted in the

formalin and hot plate tests. As naloxone is a non-selective opioid receptor antagonist, it is

suggested that this antinociceptive effect of the extract is mediated by activation of opioid

receptors (Lewanowitsch et al., 2006).

The inhibition on the second-phase (inflammatory nociception) of the formalin test in

mice, suggested that Av-EtOH can produce antinociceptive action through the inhibition of

COX and consequently prostaglandin synthesis, or other inflammatory pathway. To confirm

Page 166: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

166

the possible anti-inflammatory activity of Av-EtOH, the carrageenan-induced paw edema

model in mice was performed.

The carrageenan-induced paw edema is an animal model widely employed for the

screening of anti-inflammatory compounds or extracts and has frequently been used to assess

the anti-edematogenic effect of natural products, as medicinal plants, and exhibits a high

degree of reproducibility (Thomazzi et al., 2010).

Edema formation produced by carrageenan administration in paw is a biphasic event,

during 1-5 h. The initial phase (1 or 1.5 h) is predominantly a non-phagocytic edema followed

by a second phase (2-5 h) with increased edema formation that remained up to 5 h (Khan et

al., 2009). Av-EtOH (25, 50 and 100 mg/kg, p.o) administered 1 h before carrageenan

injection, inhibited significantly (p < 0.01) the increase in the edema volume at 1 and 2 h,

initial phase. This phase has been induced due to the action of mediators such as histamine,

serotonin and bradykinin on vascular permeability (Zhu et al., 2010), which is subsequently

sustained by the release of prostaglandins and nitric oxide (second-phase) with peak at 3 h. To

confirm the anti-inflammatory action in the initial phase, histamine-induced paw edema was

conducted. Our results showed that the edema induced by histamine was significantly

inhibited by Av-EtOH 100 mg/kg, p.o. in 30 min and 60 min (p < 0.05).

Then, the method of leukocyte migration to the peritoneal cavity was performed

seeking a best characterization of the anti-inflammatory effect of Av-EtOH. The inflammation

produced by this model is slow and prolonged, making it possible to evaluate the leakage of

liquid, as well as cell migration, besides the participation of cytokines, enzymes, and chemical

mediators, such as nitric oxide, prostaglandin E2, IL-1β, IL-6 and TNF-α, by utilizing

different phlogistic agents (Loram et al., 2007). These mediators are able to recruit

leukocytes, such as neutrophils, in several experimental models. Av-EtOH (25, 50 and 100

Page 167: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

167

mg/kg, p.o) administered 1 h before injection of carrageenan (1%, i.p., 0.25 ml) inhibited the

leukocyte migration (p < 0.01). A possible mechanism is an inhibition of the synthesis of

many inflammatory mediators whose involvement in the cell migration is well-established.

In summary, the present study has demonstrated that crude ethanolic extract of A.

vepretorum has significant antinociceptive and anti-inflammatory properties, which are

related probably with the activation of opioid receptors and inhibition of release of mediators

of the inflammatory process, such as prostaglandins, histamine and neutrophils.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by grants from the Brazilian agencies CAPES, CNPq and

FACEPE. The authors wish to express their thanks to R. Mello Silva of Centro de Referência

para Recuperação de Áreas Degradadas (CRAD) for botanical identification of the plant

material.

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0

5

10

15

20Control

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Indomethacin 20 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

**

**

****

**

Nu

mb

er

of

wri

thin

gs

Page 173: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

173

Figure 1. Effect of ethanol extract of A. vepretorum (Av-EtOH), indomethacin and morphine on acetic acid

induced writhing test in mice. Values are mean ± S.E.M. **p < 0.01, significantly different from control; ANOVA

followed Dunnett’s test (n = 6, per group).

First phase

0

10

20

30

40

50

60Control

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Indomethacin 20 mg/kg

Morphine 10 mg/kg** **

**

**Morph + NLX

Av-EtOH + NLX

a)

Lic

kin

g t

ime (

s)

Second phase

0

10

20

30

40

50

60

70Control

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Indomethacin 20 mg/kg

Morphine 10 mg/kg**

** **

**

Morph + NLX

Av-EtOH + NLX

** **

b)

Lic

kin

g t

ime (

s)

Figure 2. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH), indomethacin, morphine, morphine +

naloxone (Morph + NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Av-EtOH + NLX (100 mg + 1.5 mg/kg) on formalin test in mice.

Values are mean ± S.E.M.; **p < 0.01, significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n =

6, per group).

Page 174: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

174

30 60 90 1200

5

10

15

20Control

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Morphine 10 mg/kg

Morph + NLX

Av-EtOH + NLX

*

**

*

***

**

****

Time (min)

Late

ncy t

ime (

s)

Figure 3. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH), morphine, morphine + naloxone (Morph +

NLX; 10 mg + 1.5 mg/kg) and Av-EtOH + NLX (100 mg + 1.5 mg/kg) on hot plate test in mice. Values are mean ±

S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per

group).

30 60 90 1200

1

2

3

4

5

6Control

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Morphine

* * **

*

Time

Late

ncy t

ime (

s)

Figure 4. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH) and morphine (10 mg/kg) on tail flick test in

rats. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, significantly different from control; ANOVA followed Dunnett’s test

(n = 6, per group).

Page 175: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

175

0 1 2 3 4 50.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8Saline

Saline + Carr

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Indomethacin

** **

** **** **

*

Hours

Vo

lum

e o

f ed

em

a (

ml)

Figure 5. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH) and indomethacin (20 mg/kg) on carrageenan-

induced hind paw edema in mice. Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, **p < 0.01, significantly different from

control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).

0 30 60 90 1200.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45Saline

Saline + Histamine

Av-EtOH 100 mg/kg

**

Time (min)

Vo

lum

e o

f ed

em

a (

ml)

Figure 6. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH) on histamine-induced hind paw edema in mice.

Values are mean ± S.E.M.; *p < 0.05, significantly different from control; unpaired Student’s t-test (n = 6, per

group).

Page 176: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

176

Figure 7. Histology of rat paw edema induced by carrageenan after treatments. (A) control group (saline +

carrageenan), (B) Av-EtOH 25 mg/kg + carrageenan, (C) Av-EtOH 50 mg/kg + carrageenan, (D) Av-EtOH 100

mg/kg + carrageenan, (E) Indomethacin + carrageenan, (F) Histamine + saline, (G) Histamine + Av-EtOH 100

mg/kg. ) The arrows head shows neutrophil infiltration of paw tissues (Original magnification, 100X (A-C; D-G)

and 400X (D).

Page 177: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

177

0

5

10

15

20

25

30

35Control

Av-EtOH 25 mg/kg

Av-EtOH 50 mg/kg

Av-EtOH 100 mg/kg

Dexamethasone 2 mg/kg**

**

** **Leu

co

cyte

s x

10

6 /

ml

Figure 8. Effect of ethanolic extract of A. vepretorum (Av-EtOH) and dexamethasone on leukocytes migration

into the peritoneal cavity induced by carrageenan in mice. Values are mean ± S.E.M.; **p < 0.01, significantly

different from control; ANOVA followed Dunnett’s test (n = 6, per group).

Page 178: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

178

APENDICE C – Carta de submissão

Page 179: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

179

APENDICE D – Certificado

Page 180: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

180

APENDICE E – Resumo

AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE ORAL SUBCRÔNICA DO EXTRATO ETANÓLICO

DAS FOLHAS DE Annona vepretorum (ANNONACEAE) EM CAMUNDONGOS

Silva. J.C1, Lavor. E.M

1, Silva. M.G

1, Lima-Saraiva. S.R.G

2, Oliveira-Junior. R.G

1, Vieira. H.S

1, Diniz.

T.S1, Silva. F.S

1, Mendes. R.L

1, Almeida. J.R.G.S

1

1: Universidade Federal do Vale do São Francisco, 56.304-205, Petrolina-PE, Brasil.

2: Universidade Federal de Pernambuco, 50.740-521, Recife-PE, Brasil.

Introdução: Annona vepretorum é uma espécie pertencente à família Annonaceae, popularmente conhecida na região Nordeste do Brasil como araticum ou pinha da Caatinga. A avaliação da toxicidade possibilita caracterizar os efeitos sobre funções orgânicas importantes, tais como: locomoção, comportamento, sistema respiratório, dentre outros. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a toxicidade subcrônica do extrato etanólico de A. vepretorum (Av-EtOH) visando à obtenção de parâmetros de segurança. Metodologia: A planta foi coletada no município de Jaguarari-BA, e uma exsicata (#946) foi depositada no Herbário HVASF. Foram utilizados 30 camundongos subdivididos em 3 grupos (n=10), que receberam solução salina e o extrato nas doses de 100 e 400 mg/kg, via oral, respectivamente, diariamente, durante 30 dias. Todos os animais foram observados em relação ao aparecimento de efeitos tóxicos, e diariamente foram medidos o consumo de ração e água. Posteriormente, os animais foram anestesiados com quetamina e xilazina, e o sangue foi coletado pelo plexo braquial para a avaliação de parâmetros hematológicos e bioquímicos [1]. Em seguida, os órgãos (coração, pulmão, fígado, estômago, rins, pâncreas, baço, ovário e testículo) foram coletados, pesados e analisados macroscopicamente [2]. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética da UNIVASF (Protocolo 0004/261011). Resultados: após 30 dias de tratamento, não houve morte dos animais nos grupos tratados com o extrato nas doses de 100 e 400 mg/kg, via oral. Na triagem toxicológica foi observado piloereção, movimento intenso das vibrissas, analgesia, resposta ao toque diminuído, respiração forçada e diminuição da força para agarrar na dose de 400 mg/kg, comportamentos não observados nos demais grupos. Não houve diferença significativa quanto ao peso corporal, consumo de líquido e ração, nem peso dos órgãos quando comparados ao grupo controle. Os exames hematológicos mostraram redução significativa (p< 0.05) de MCV, MCH no grupo tratado com Av-EtOH na dose de 400 mg/kg. Quanto aos exames bioquímicos, houve aumento significativo (p< 0.05) do nível de triglicerídeos no grupo tratado com Av-EtOH 400 mg/kg. Na avaliação macroscópica dos órgãos, apenas um animal tratado com Av-EtOH 400 mg/kg, apresentou o pulmão com aspecto mais pálido e enrijecido. Nos demais, não houve alterações. Conclusão: Os dados mostram que não houve sobrecarga hepática ou renal, e que Av-EtOH na dose de 100 mg/kg, via oral, apresentou-se seguro, não havendo nenhum indício de toxicidade quando ingerido diariamente, por 30 dias. Estudos histopatológicos deverão ser realizados posteriormente para avaliação de alterações microscópicas nos órgãos.

Agradecimentos: CAPES, CNPq, FACEPE Referências: 1. Araújo, A.A.S., et al. (2008). Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 44: 707-715. 2. Okoye, T.C., et al. (2012). Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 5: 277-282. Sessão Científica: etnofarmacologia, farmacologia e toxicologia.

Page 181: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

181

ANEXOS

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182

ANEXO A – Aprovação do comitê de ética

Page 183: EFEITO ANTINOCICEPTIVO E ANTI-INFLAMATÓRIO DE Annona

183

ANEXO B – Tabela de triagem comportamental

Triagem Farmacológica (Modelo retirado de Almeida et al., 1999)

PLANTA UTILIZADA:_______________________ DOSES:_____________DATA:____/_____/_____

VIA DE ADMINISTRAÇÃO:_____________________ANIMAIS:______________________________

RESPONSÁVEL TÉCN.:_______________________________ GRUPOS:________________________

ATIVIDADE FARMACOLÓGICA

Quantificação dos efeitos

(0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito presente, (++) efeito intenso

até 30` 1h 2h 3h 4h

1 - SNC

a - Estimulante

Hiperatividade

Irritabilidade

Agressividade

Tremores

Convulsões

Piloereção

Movimento intenso das vibrissas

Outras_____________________

b - Depressora

Hipnose

Ptose

Sedação

Anestesia

Ataxia

Reflexo do endireitamento

Catatonia

Analgesia

Resposta ao toque diminuído

Perda do reflexo corneal

Perda do reflexo auricular

c - Outros comportamentos

Ambulação

Bocejo excessivo

Groming

Rearing

Escalar

Vocalizar

Sacudir a cabeça

Contorções abdominais

Abdução das patas do trem posterior

Pedalar

Estereotipia

2 - SN AUTÔNOMO

Diarréia

Constirpação

Defecação aumentada

Respiração forçada

Lacrimejamento

Micção

Salivação

Cianose

Tono muscular

Força para agarrar

3 - MORTE

obs.:_________________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________