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Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Determinação de Parâmetros Físico-Químicos em Laranjas ‘Valência’ por Métodos Não-
Destrutivos
Karla Rodrigues Borba
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição para obtenção do título de Mestre em Alimentos e Nutrição. Área de Concentração: Ciência de Alimentos. Orientador: Prof. Dr. Marcos David Ferreira Coorientador: Dra. Poliana Cristina Spricigo
Araraquara 2016
Determinação de Parâmetros Físico-Químicos
em Laranjas ‘Valência’ por Métodos Não-Destrutivos
Karla Rodrigues Borba
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição para obtenção do título de Mestre em Alimentos e Nutrição. Área de Concentração: Ciência de Alimentos. Orientador: Prof. Dr. Marcos David Ferreira Coorientador: Dra. Poliana Cristina Spricigo
Araraquara 2016
Determinação de Parâmetros Físico-Químicos em Laranjas ‘Valência’ por Métodos Não-
Destrutivos
Karla Rodrigues Borba
i
Dedico à minha família e ao meu amor Ricardo Verhaeg.
ii
Agradecimentos
Ao professor Dr. Marcos David Ferreira pela orientação ao longo de todo o
mestrado.
À Dra. Poliana Cristina Spricigo pela confiança, amizade e coorientação.
Ao professor Dr. Luiz Alberto Colnago pelos ensinamentos.
Aos analistas, bolsistas e estagiários da Embrapa Instrumentação pelo apoio
durante a realização dos experimentos. Em especial: Joana, Silviane,
Milene, Gabrielle e Karla.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP.
À Embrapa Instrumentação pela infraestrutura.
À empresa Citrosuco pelas laranjas fornecidas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES,
pela bolsa concedida.
À Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pelo
auxílio financeiro processo 13/23479-0.
Obrigada!
iii
Resumo
Objetivo: Alguns atributos em sua composição química e física, como teor de sólidos solúveis (SST), pH (potencial hidrogeniônico), ácidos orgânicos, açúcares e cor são utilizados como parâmetros na aferição da qualidade de frutas. Os métodos utilizados, nos dias atuais, para a análise da qualidade destes produtos são invasivos, que demandam tempo, muitas amostras, reagentes e geram resíduos. Técnicas não destrutivas, como a espectroscopia no infravermelho e de ressonância magnética nuclear, têm sido propostas para avaliar qualidade em frutas e hortaliças. Este projeto teve como objetivo: desenvolver um modelo de calibração, a partir da espectroscopia de infravermelho de médio e próximo, e ressonância magnética com o auxílio das ferramentas quimiométricas PCA (análises de componentes principais) e PLS (Regressão em mínimos quadrados parciais) com a utilização do programa computacional Pirouette versão 4.5, para estimar parâmetros físico-químicos da qualidade de laranjas da variedade ‘Valência’. Métodos: Foram coletadas um total de 450 laranjas de cultivo comercial no interior de São Paulo, transportadas para a Embrapa Instrumentação, São Carlos, SP e em laboratório foram selecionadas, higienizadas e sanitizadas. Em seguida foram realizadas análises espectroscópicas de infravermelho médio (MIR) e próximo (NIR) e de ressonância magnética nuclear (RMN). Logo após realizadas as análises não destrutivas as laranjas foram analisadas com métodos de referência para os parâmetros de qualidade. Os sinais espectroscópicos foram processados e os modelos de predição foram construídos. Com os sinais de NIR e MIR foram desenvolvidos modelos PLS para determinação de: SST, pH, massa fresca, vitamina C, ácido cítrico e açucares. Para os sinais de decaimento de RMN foram construídos modelos para SST, pH e massa fresca. Resultados: Para a predição de SST o modelo PLS – NIR mostrou melhor resultado, com SEP 0,74 °BRIX e coeficiente de correlação de 0,75. O parâmetro que apresentou melhor aplicação com a técnica de RMN-dt foi para determinação de massa fresca, com SEP 21,41 gramas e r = 0,82. A determinação do pH foi mais precisa com o modelo PLS-MIR, onde observou-se SEP de 0,20 e r = 0,86. Para a predição de vitamina C e ácido cítrico tanto o NIR quanto o MIR resultaram em modelos com aplicabilidade. O modelo mais preciso foi o desenvolvido com sinas de MIR, com coeficiente de correlação de Pearson (r) de 0,81 e erro quadrático médio de predição (RMESP) de 7,51 para vitamina C e 0,82 e 3,36 para ácido cítrico. Em relação a predição de açúcares o NIR não resultou em modelos precisos. Todavia, a utilização de MIR para a predição de sacarose, glicose e açúcares totais apresentaram baixos erros de predição 11,69, 7,79 e 24,28 (g L-1) e coeficientes de correlação de forte a moderado. Conclusão: A aplicação de espectroscopia na determinação de parâmetros de qualidade mostrou-se uma possível alternativa na análise de qualidade de laranjas sem que seja necessária a destruição das amostras. Palavras-chave: Espectroscopia. Infravermelho, ressonância magnética nuclear. Qualidade de laranja intacta. Quimiometria. PLS.
iv
Abstract
Objective: Some attributes in their chemical and physical composition, as soluble solids content (SSC), pH (hydrogen potential), organic acids, sugars and color are used as parameters in measuring the quality of fruit. The methods used nowadays, to analyze the quality of these products are invasive, requiring time, many samples, reagents and generate waste. Non-destructive techniques such as infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance, have been proposed to evaluate quality in fruits and vegetables because they allow rapid implementation of measurements without sample preparation. This project aimed to: develop a calibration model by near ande mid-infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance with the aid of chemometric tools PCA (principal component analysis) and PLS (regression in partial least squares) with use of the computer program Pirouette version 4.5, to estimate physical-chemical parameters of quality oranges from ‘Valencia’ variety. Methodology: A total of 450 commercial cultivation oranges were collected in São Paulo, transported to Embrapa Instrumentation, São Carlos/SP, and in laboratory were selected, cleaned and sanitized. Then spectroscopic analysis near (NIR) and mid-infrared (MIR), and nuclear magnetic resonance (NMR) were made. After performed the non-destructive analysis, the oranges were analyzed with reference methods for quality parameters. Spectroscopic data were processed and prediction models were developed to determinith MIR and NIR signal PLS models were developed to determine SSC, pH, fresh weight, vitamin C, citric acid and sugars. For the NMR signal decay models were constructed to SSC, pH and fresh weight. Results: For SSC prediction PLS model - NIR showed better results, with RMSEP (mean squared prediction error) 0.74 °BRIX and 0.75 correlation coefficient. The parameter that showed better application with DT- NMR technique was to determine fresh weight with RMSEP 21.41 grams and r = 0.82. The determination of pH was more accurate with the PLS-MIR model where there was RMSEP 0.20 and r = 0.86. For the prediction of vitamin C and citric acid as both the MIR NIR models resulted in applicability. The most accurate model was developed with MIR, with Pearson's correlation coefficient (r) of 0.81 and RMESP of 7.51 for vitamin C and 0.82 and 3.36 for Citric acid. Regarding the prediction of sugars NIR did not result in accurate models. However, the use of MIR for the prediction of sucrose, glucose and total sugars were low prediction errors 11.69, 7.79 and 24.28 (g L-1) and strong correlation coefficients to moderate.Conclusion: The application of spectroscopy to determining quality parameters proved to be a viable alternative in quality analysis oranges without destruction of samples. Key-words: Spectroscopy; Infrared, nuclear magnetic resonance; orange quality intact; chemometrics; PLS.
v
Lista de Abreviaturas e Siglas
ATR (Reflectância Total Atenuada, do inglês Attenuated total reflectance)
°BRIX (Unidade do teor de sólidos solúveis)
CEAGESP (Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais de São Paulo)
CIE (Comission Internationale de l'Éclairage)
CLAE (Cromatografia líquida de alta eficiência)
FAO (Food and Agricultural Organization)
FT (Transformada de Fourier)
IAC (Instituto agronômico de Campinas)
IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística)
MIR (Infravermelho médio, do inglês Middle Infrared)
NIR (Infravermelho próximo, do inglês Near Infrared)
PC (Componente principal, do inglês Principal components)
PCA (Análise por componentes principais, do inglês Principal component
analysis)
PIB (Produto Interno Bruto)
PLS (Regressão por mínimos quadrados parciais, do inglês Partial least
squares)
r: Coeficiente de correlação de Pearson
r cal: Coeficiente de correlação de Pearson para calibração
r Val: Coeficiente de correlação de Pearson para validação
RMN (Ressonância magnética nuclear)
RMN-dt (Ressonância magnética nuclear no domínio do tempo)
RMSEC (Erro padrão da calibração, do inglês Standart error of calibration)
RMSEP (Erro padrão da predição, do inglês Standart error of prediction)
RMSEV (Erro padrão da validação, do inglês Standart error of validation)
RPD (Desvio do resíduo de predição, do inglês Standart derivation ratio)
SST (Teor de sólidos solúveis)
USDA (United States Departament of Agriculture)
vi
Lista de Tabelas e Quadros
Capítulo 1. Página Tabela 1. Número amostral utilizados nos conjuntos de calibração com validação interna e de predição.
28
Tabela 2. Resultados da caracterização das amostras de laranja. 32 Tabela 3. Análise estatística dos conjuntos de calibração com validação interna e predição: média, desvio padrão e intervalo de dados.
38
Tabela 4. Estatística dos modelos PLS de calibração construídos com os sinais analíticos de NIR e MIR para os parâmetros vitamina C e ácido cítrico.
39
Tabela 5. Estatística dos modelos de predição para NIR e MIR para os parâmetros vitamina C e ácido cítrico.
40
Tabela 6. Estatística dos modelos PLS de calibração construídos com os sinais analíticos de NIR e MIR para os parâmetros sacarose, glicose, frutose, açúcares totais e redutores (g L-1).
42
Tabela 7. Estatística dos modelos de predição PLS- MIR para os parâmetros sacarose, glicose, frutose, açúcares totais e redutores.
43
Capítulo 2. Tabela 1. Número amostral utilizados nos conjuntos de calibração com validação interna e de predição.
56
Tabela 2. Resultados da caracterização das amostras de laranja. 61 Tabela 3. Análise estatística dos conjuntos de calibração com validação interna e predição: média, desvio padrão e intervalo de dados.
62
Tabela 4. Resultados dos modelos PLS construídos com os sinais analíticos de NIR, MIR e RMN.
69
Tabela 5. Resultados da validação externa (predição) dos modelos PLS construídos com os sinais analíticos de NIR, MIR e RMN.
70
vii
Lista de Figuras
Capítulo 1. Página Figura 1. Espectro de NIR originais (A) com a divisão dos conjuntos de varáveis; (B) espectros NIR com aplicação de SNV e 1ª derivada (25); espectros de MIR originais (C) com a divisão dos conjuntos de variáveis; (D) espectros MIR normalizados e com a aplicação de 1ª derivada (5).
35
Capítulo 2. Figura 1. Gráfico do potencial de modelagem das variáveis de MIR depois da PCA.
63
Figura 2. Análise de componentes principais realizada para SST, pH e massa com 4 classes de colheitas pré-definidas.
64
Figura 3. PCA com decaimentos de RMN com duas classes de SST. 65 Figura 4. Decaimento CPMG de duas laranjas com teor de sólidos solúveis (SST) distintos.
66
Figura 5. Análise de componentes principais das amostras de laranja com os espectros de (A) RMN com as duas classes de massa fresca, (B) NIR com as duas classes de SST e (C) MIR com as duas classes de pH.
67
Figura 6. Espectros de MIR de laranjas com diferentes valores de pH. 69 Figura 7: Gráficos dos valores medidos pelas análises de referência e preditos pelos modelos PLS. (A) PLS - NIR para SST, (B) PLS - MIR para pH e (C) PLS - RMN para massa fresca.
71
viii
Sumário
Página
Resumo Iii
Abstract Iv
Lista de Abreviaturas, Siglas e Sinônimos V
Lista de Tabelas e Quadros Vi
Lista de Figuras Vii
Introdução 9
Capítulo 1. Aplicação de espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) para determinação de teor de vitamina c, ácido cítrico e açúcares em laranja ‘Valência’ intacta
22
Introdução 25
Material e Métodos 27
Resultados e Discussão 32
Conclusões 43
Referências 44
Capítulo 2. Aplicação das técnicas não-destrutivas de espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) e de ressonância magnética nuclear no domínio do tempo (RMN-dt) para determinação de parâmetros de qualidade em laranjas.
50
Introdução 53
Material e Métodos 56
Resultados e Discussão 60
Conclusões 73
Referências 74
Considerações Finais 80
Referências 82
9
Introdução
As atividades da agroindústria brasileira representam cerca de 30%
do Produto Interno Bruto (PIB), que é a soma de todos os bens e serviços
produzidos no país. Neste contexto, 35% da mão de obra do Brasil está
relacionada com este ramo de atividade, que incluem, dentre outras, etapas
de pós-colheita, processamento e distribuição. Dentro da agroindústria, a
fruticultura tem forte participação, abrangendo 11,5% do PIB agrícola e 3,45
% do PIB nacional (1).
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas no mundo, ficando atrás
apenas da China e Índia (2). A laranja é a fruta de maior produção nacional,
onde a maior parte da produção é direcionada a produção de suco (3). A
maior parte das laranjas produzidas no Brasil vai para a produção de suco,
que no cenário mundial detém 50% da produção e exporta 98% do que
produz apresentando 85% de participação no mercado mundial (4).
Fruta, não climatérica, que pertence ao gênero Citrus, dentro da
família Rutaceae (5). Dentre as variedades de laranja cultivadas destaca-se
a variedade ‘Valência’ que apresenta frutos ovalados, com casca
ligeiramente grossa, tem suco de coloração amarelo forte e adocicado (6).
Os frutos dessa variedade são destinados tanto para o consumo in natura
quanto para preparo de suco em indústrias.
O controle da qualidade da fruta garante que o produto final satisfaça
as exigências e requisitos do mercado. Produtos hortícolas são classificados
de acordo com parâmetros internos e externos. Alguns atributos em sua
composição química e física, como acidez total titulável, pH, teor de sólidos
10
solúveis, textura, cor e valores nutritivos são utilizados como parâmetros de
qualidade, além de serem importantes, também, na determinação do ponto
de maturação do fruto (7).
Muitos desses parâmetros de qualidade apresentam metodologias de
análise complexas e demoradas, como por exemplo, a quantificação de
açúcares e ácido orgânicos. Um dos métodos para se obter o teor destes
parâmetros é a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a
qual requer tempo, reagentes e mão de obra especializada. Além da
necessidade de um número amplo de amostras e de destruição delas.
Por sua vez, o teor de sólidos solúveis (SST) é um parâmetro químico
de qualidade importante e comumente utilizado na avaliação de laranjas (4).
Tanto em frutas climatéricas, quanto em não climatéricas, como a laranja, o
ponto de colheita é definido pelo teor de sólidos solúveis. O balanço de
açúcares e ácidos contidos na polpa da fruta conferem o sabor que pode ser
agradável ou não ao consumidor. Nos frutos cítricos como a laranja, os
requisitos de qualidade são baseados, principalmente, em cor e teor de
sólidos solúveis (8).
Na agroindústria o teor de sólidos solúveis é utilizado desde a
colheita, participam da formação do valor do produto colhido, para o controle
da matéria-prima, processo e qualidade do produto final. É um atributo que,
de acordo com as propostas da Agenda 2015 de Coordenação e contratos
do setor de citros, pode ser usados como parâmetro para pagamentos de
agricultores (4). Portanto, é imprescindível um monitoramento minucioso
desse parâmetro de qualidade. Laranjas com teor de sólidos solúveis abaixo
11
de 10° BRIX não podem ser comercializadas, sendo que o ideal é que as
laranjas estejam na faixa de 10° a 13° BRIX que caracteriza sucos
adocicados (9).
A análise de SST é rotineiramente realizada em refratômetros.
Contudo, apenas 85% do resultado de sólidos solúveis obtido por um
refratômetro é de fato açúcar, sendo o restante composto por ácidos
orgânicos, vitaminas, fenólicos, dentre outros (7). A realização de análises
específicas de açúcar resultaria em um valor mais exato da quantidade de
açúcar no fruto. Porém essas análises requerem acesso a equipamento,
demanda alta de tempo e mão de obra. Portanto, não seriam acessíveis em
grande escala de processamento.
Outro parâmetro de qualidade utilizado para avaliação de citros é o
potencial hidrogeniônico (pH). O pH, juntamente com o SST, é uma
propriedade significativa no suco de laranja podendo afetar a aceitação pelo
consumidor. A escala de pH designa as concentrações de H+ presentes na
solução (10), representando a intensidade das soluções ácidas com valores
abaixo de 6 ou alcalinas com valores de pH acima de 6.
Além de propriedades físico-químicas, as propriedades nutricionais
também apresentam grande importância na avaliação da qualidade dos
frutos. Atualmente, existe a tendência de buscar uma alimentação mais
saudável com alimentos naturais (11), classificações e avaliações a partir de
parâmetros nutricionais, como teor de ácido ascórbico, podem aumentar a
valoração de laranjas, principalmente na indústria de suco. O ácido
ascórbico, molécula de ácido orgânico que apresenta capacidade
12
antioxidante (12), não é sintetizado pelo organismo humano, tornando
essencial sua ingestão. As frutas cítricas, apesar de apresentarem baixas
concentrações, são consideradas boas fontes de ácido ascórbico devido a
seu alto consumo diário (7). O ácido cítrico, outro ácido orgânico com
capacidade antioxidante, também está presente nos constituintes do suco de
laranja. Essa molécula proporciona um sabor ácido e refrescante no suco
(12).
Juntamente com os ácidos orgânicos, os açúcares são utilizados
como critério de avaliação do “flavor” das frutas. “Flavor”, em inglês, é
utilizado para designar o conjunto de características do paladar e do olfato
dos alimentos. (7), representando o aroma e sabor da fruta. Os açúcares
são os principais componentes do teor de sólidos solúveis em laranjas (13) e
são responsáveis pela doçura do fruto. O teor de açúcar geralmente
aumenta, por meio de processos biossintéticos, com o amadurecimento das
frutas (7).
Atualmente, os métodos mais utilizados para a análise da qualidade
de frutas são destrutivos. Esse tipo de metodologia destrutiva requer
despesas mais elevadas com amostras e reagentes, além de demandar
muito tempo para análise e mão de obra. Métodos não destrutivos, onde a
manipulação da amostra é a mínima possível, representam uma alternativa
para analisar e garantir o controle de qualidade de frutas e hortaliças. Esse
tipo de metodologia requer quantidade inferior de amostras, garante que
sejam feitas análises em um mesmo lote ao longo do período pós-colheita,
são análises muito rápidas (levando no máximo 1 ou 2 minutos)
13
demandando menos mão de obra. Também, pode apresentar as
seguintes vantagens: 1) possibilita o monitoramento e análise instantânea de
parâmetros de qualidade em campo tornando possível desenvolver melhores
estratégias de colheita; 2) durante a etapa de distribuição a utilização de
métodos não destrutivos pode ser uma ferramenta útil para os distribuidores
e consumidores, possibilitando verificar com rapidez e facilidade se o
produto atende as características desejadas (14).
Técnicas não destrutivas, como a espectroscopia no infravermelho,
médio (MIR) e próximo (NIR) e de ressonância magnética nuclear (RMN),
têm sido propostas para avaliar características representativas de qualidade
em frutas, pois permitem rápida execução das medições, com potencial para
estimar vários atributos de qualidade simultaneamente além da possibilidade
de repetir as medições nas mesmas amostras (15,16). Para as regiões do
infravermelho é possível realizar medidas em amostras em todos os estados
da matéria como, gases, líquidos e sólidos (17).
A espectroscopia no infravermelho e de ressonância magnética
nuclear, aliadas com técnicas quimiométricas, podem ser uma alternativa
para desenvolvimento de métodos de análises rápidos e precisos de
parâmetros de qualidade complexos. Desta forma, com grande potencial
para monitoramento da qualidade de produtos vegetais em linhas de
processamento. A espectroscopia é o estudo da interação da radiação
eletromagnética com a matéria, essa radiação pode ser dividida (18) em
regiões de energia.
14
A radiação de infravermelho corresponde à parte do espectro
eletromagnético situada entre a região do visível e das micro-ondas,
subdivido em infravermelho próximo (4000 – 12500 cm-1), infravermelho
médio (400 – 4000 cm-1) e distante (100 – 400 cm-1) (18). O comprimento de
onda de uma absorção depende das massas relativas dos átomos, das
constantes de força das ligações e da geometria das moléculas (19). Desta
forma, essa técnica detecta a radiação que é absorvida pelas ligações
moleculares. A utilização da espectroscopia no infravermelho para
determinação de composição de alimentos está relacionada quase que
exclusivamente à região no infravermelho médio e próximo, (20).
Para que as moléculas absorvam a radiação de infravermelho, capaz
de variar a amplitude de um de seus movimentos, vibracional ou rotacional,
é necessário que ocorram variações no momento dipolo, que pode ser
ocasionado pelo movimento vibracional ou rotacional. Somente nessas
condições o campo elétrico alternado da radiação é capaz de interagir com a
molécula (21). Durante a vibração ou rotação de uma molécula homonuclear
(O2, N2 ou Cl2) não ocorre variação no momento de dipolo, portanto essas
moléculas não absorvem radiação no infravermelho (17,22).
O instrumento que obtém o espectro de absorção no infravermelho de
um composto é chamado de espectrômetro de infravermelho (ou apenas
espectrofotômetro) (23). Existem alguns tipos de espectrofotômetro, os dois
mais utilizados em laboratórios químicos são os dispersivo e o de
transformada de Fourier (FT). Apesar dos dois apresentarem espectros
quase idênticos, os espectrofotômetros FT produzem os espectros muito
15
mais rapidamente do que os dispersivos e são, atualmente, o principal
instrumento empregado para medidas no infravermelho (19,23).
A utilização de instrumentos com FT apresenta algumas vantagens,
uma delas é o fato dos instrumentos com FT possuírem poucos elementos
ópticos e não apresentarem fendas que atenuem a radiação. Com isso, a
potência radiante que atinge o detector é muito maior do que com
instrumentos dispersivos e a razão sinal/ruído observada é maior (23,24).
Os espectros de NIR são complexos, pois contém informações de
sobretons e suas combinações. Isso torna os espectros na faixa NIR muito
mais sobrecarregados o que dificulta a atribuição de bandas específicas de
absorção (25,26) e pode tornar difícil a interpretação de espectros de
misturas complexas como frutas e vegetais. Levando a necessidade de
recorrer a métodos estatísticos multivariados para gerar modelos utilizando
muitos comprimentos de onda (27).
As principais aplicações da espectroscopia na região do infravermelho
próximo (NIR) se encontram na análise quantitativa e qualitativa de materiais
industriais e agrícolas e no controle de processos (20). Sendo que a grande
desvantagem dessa técnica é a baixa sensibilidade dos constituintes em
menores concentrações (22,28) e pelo fato da difusão de luz ser maior na
faixa NIR, alguns fatores como a estrutura física do produto e a presença de
água na amostra podem influenciar na aquisição dos espectros (25).
Muitos estudos mostraram a viabilidade e eficiência na utilização do
infravermelho próximo (NIR) na predição da qualidade interna de frutas.
Modelos de calibração, a partir da análise dos espectros obtidos por
16
infravermelho próximo, foram desenvolvidos para estimar firmeza e sólidos
solúveis, de forma não destrutiva, em pêssegos (29) e citros (14,30–32).
A região do infravermelho médio (MIR) é a principal região da
espectroscopia vibracional. Espectros de MIR fornecem informações de
frequência de vibrações moleculares fundamentais (33), que envolvem o
estado fundamental e o primeiro estado vibracional excitado (34). Essa
técnica permite a identificação de moléculas orgânicas e a caracterização de
grupos funcionais, tais como polissacarídeos (26).
No início a região de MIR era aplicada para análise qualitativa de
compostos orgânicos, relacionada principalmente à identificação de ligações
moleculares. Com o desenvolvimento de espectrofotômetros com FT houve
um aumento no número e tipo de aplicações da espectroscopia na região do
MIR (34). Passando, a partir desse momento, a ser usado também para
análise quantitativa de amostras complexas por absorção (15).
Com maior resolução, os espectros obtidos na região do MIR
apresentam picos bem definidos, facilitando a interpretação de seus sinais.
Sua faixa espectral é bastante útil para a identificação de compostos, aonde
pequenas diferenças na estrutura e na constituição das moléculas resultam
em mudanças significativas do perfil e na distribuição dos picos de absorção,
tornando possível a identificação de um composto orgânico comparando seu
espectro com banco de dados pré-existentes (35).
A técnica de MIR tem se mostrado adequada no auxílio em análises
de qualidade de alimentos. Nos últimos anos vem crescendo o número de
pesquisas sobre MIR na avaliação de produtos alimentícios. Isso se deve
17
pela versatilidade para desenvolver novos procedimentos de medida não
invasivos, rápidos e preditivos associados a métodos estatísticos
multivariados.
Apesar do espectro de infravermelho médio (MIR) ser o mais utilizado
na química orgânica, pois fornece informações diversas que auxiliam na
análise da composição das moléculas químicas, existem ainda poucos
estudos que relatam o uso de MIR para determinar composição de frutas e
hortaliças intactas (36,37).
Métodos com espectroscopia de MIR são aplicados com sucesso para
estimar a composição de várias amostras de alimentos, principalmente de
produtos líquidos como sucos (38). Snyder et al., 2014, determinou a
composição percentual no suco de uva, Macedo (2013) identificou e
quantificou adulteração em leite bovino, Allendorf, Subramanian, and
Rodriguez-Saona (2012) monitoraram variações químicas decorrentes do
processo de oxidação em óleos comestíveis e quantificaram o teor de ácidos
graxos, Rodriguez-Saona (2011) quantificou carotenóides em suco de
tomates e (43) analisou amostras de suco de tomate e conseguiu
determinar o teor de sólidos solúveis, pH, glicose, frutose e viscosidade.
Todavia, ainda existem poucos estudos de modelos com MIR para
avaliar a qualidade de frutas e hortaliças intactas, pois relaciona-se a
capacidade de penetração das ondas, a qual está muitas vezes relacionada
a espessura da casca (24) . Skoog et al. (2002) afirmam ser possível realizar
medidas de amostras com MIR em muitos estados, inclusive o sólido.
18
Ao comparar a utilização da técnica de MIR e NIR na análise de
ácidos orgânicos (ácido cítrico e ácido málico) e açúcares (sacarose, frutose
e glicose) em amostras liofilizadas de maracujá De Oliveira et al. (2014)
encontrou que modelos de MIR tiveram melhores resultados do que aqueles
construídos com NIR.
Outra técnica espectroscópica que pode ser uma opção não
destrutiva de análise de qualidade é a ressonância magnética nuclear
(RMN). Proposta por Wolfgang Pauli, 1924, ao constatar que certos núcleos
atômicos apresentavam propriedades magnéticas, ou seja, comportavam-se
como pequenos imãs e que a exposição destes a um campo magnético
deveria levar a um desdobramento de seus níveis de energia (44).
A espectroscopia de RMN se fundamenta no registro da interação da
radiação eletromagnética na região de rádio frequência, 4 a 900 MHz, com
núcleos atômicos (22). Os núcleos absorvem radiação eletromagnética
quando expostos a um campo magnético intenso. A técnica de RMN permite
a observação de núcleos com momento magnético nuclear ou spin ≠ 0 (45).
A espectroscopia de RMN pode ser subdividida em aplicações em alta
e baixa resolução. Espectrômetros de baixo campo (ou baixa resolução),
também chamada de RMN no domínio do tempo (RMN-dt) vêm sendo
utilizados para análise de qualidade em laboratórios (40). A rapidez na
análise sem necessidade de destruição da amostra e possibilidade de se
realizar análises sem preparo da amostra, além da facilidade na execução,
são as principais vantagens dos espectrômetros de baixo campo sobre os
métodos convencionais de análise (40). A técnica de RMN vem sendo
19
aplicada na análise de alimentos como na determinação de adulteração em
leites (46) e azeites (47) e também na análise de parâmetros de qualidade
em frutas como SST em ameixas (48) e atributos sensoriais (48) e qualidade
físico-química (50) em laranjas.
As técnicas de espectroscopia geram sinais com muitas variáveis e,
portanto, são dependentes de técnicas estatísticas apropriadas para o
processamento destes sinais (51). É necessário o desenvolvimento de
modelos de calibração que tornem possível a determinação do
comportamento de um sistema como um todo.
Para isso a quimiometria é utilizada, onde são aplicados métodos
matemáticos e estatísticos com a finalidade de delinear procedimentos
experimentais para encontrar a máxima informação química relevante com
os dados obtidos (52). Com essa técnica se torna possível o
desenvolvimento de modelos que possam predizer propriedades a partir da
análise de outras.
Com o crescente aumento de estudos de técnicas instrumentais mais
sofisticadas para análises internas de alimentos se tornou possível, e
necessário, métodos mais complexos para tratamento dos dados, que
possam relacionar os sinais obtidos com os resultados desejados. Na
técnica do Infravermelho, a bandas que aparecem nos espectros são
resultados de sobreposições e combinações de bandas de absorção, que
geram um alto índice de sinais, para a leitura, ou determinação das
concentrações dos componentes, destes sinais existe a necessidade de
utilizar técnicas quimiométricas por análise multivariada (23).
20
Dentre as diversas áreas da quimiometria podemos citar quatro
principais: planejamento e otimização de experimentos, pré-tratamentos
matemáticos, métodos de classificação e métodos de regressão ou
calibração multivariada. De uma maneira geral, calibração multivariada é
composta por três etapas: calibração, predição e validação (53).
A regressão em mínimos quadrados parciais (do inglês, Partial Least
Squares) é um método, de calibração multivariada, muito utilizado em
quimiometria. Com ele é possível calibrar para o componente desejado
enquanto modelagem implícita das outras fontes de variação (53). O PLS é
um método matemático baseado em uma relação linear entre as variáveis
instrumentais (X) e as variáveis de interesse (Y) (54). Na construção dos
modelos PLS, X e Y são decompostas simultaneamente em uma soma de h
variáveis latentes. Onde X é uma matriz n x p onde n é o numero de
amostras e p o número de variáveis de medida (absorbância em
determinados comprimentos de ondas, por exemplo) e Y é um vetor da
propriedade de interesse a ser medida pelo modelo (52,55).
A análise de componentes principais (do inglês, Principal Component
Analysis) é a base dos métodos de calibração, é uma maneira de identificar
a relação entre características extraídas de dados, muito útil, quando os
vetores de características têm muitas dimensões. A PCA é uma técnica de
estatística multivariada que transforma um conjunto de variáveis originais em
outro conjunto de variáveis da mesma dimensão, denominadas de
componentes principais (56). A primeira componente principal (PC1) é o
arranjo que melhor representa a distribuição dos dados e a segunda
21
componente principal (PC2) é traçada no sentido ortogonal à primeira, com o
objetivo de descrever a maior porcentagem possível da variação não
explicada pela PC1 (55). Cada componente principal é uma combinação
linear de todas as variáveis originais, são independentes entre si e são
estimados com o propósito de reter o máximo de informação da variação
total contida nos dados (56).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a utilização de técnicas não
destrutivas, como tecnologia da espectroscopia de infravermelho médio e
próximo e de ressonância magnética nuclear, associadas a ferramentas
quimiométricas na análise dos padrões de qualidade interna de frutas
inteiras, utilizando como modelo a laranja. Para tanto foi realizada a
associação, por métodos quimiométricos, dos sinais obtidos pela
espectroscopia de infravermelho médio (MIR), próximo (NIR) e de
ressonância magnética nuclear (RMN) com medidas físico-químicas: teor de
sólidos solúveis, pH, teor de ácido ascórbico, teor de ácido cítrico, açúcares
totais e redutores obtidos de laranjas ao longo do período pós-colheita e
desenvolvidos modelos de calibração, aplicando a regressão por mínimos
quadrados parciais (PLS), para estimar essas características físico-químicas.
22
Capítulo 1.
Aplicação de espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio
(MIR) para determinação de teor de vitamina c, ácido cítrico e açúcares
em laranja ‘Valência’ intacta.
Artigo enviado para publicação em 10 de junho de 2016 para a revista
Postharvest Biology and Technology: An International Journal.
ISSN:0925-5214
23
Aplicação de espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio
(MIR) para determinação de teor de vitamina C, ácido cítrico e açúcares
em laranja ‘Valência’ intacta.
BORBA,K.R.a, SPRICIGO,P.C.b; FERREIRA, M.D.c
aDepartment of Food and Nutrition, School of Pharmaceutical Sciences, São Paulo State University-
UNESP, Rodovia Araraquara – Jaú, Km 1, Araraquara-SP, 14801-902, Brazil. bDepartment of Plant Science, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, University of São
Paulo, Avenida Pádua Dias, 11, Piracicaba-SP, 13418-900, Brazil. cEmbrapa Instrumentação, Rua XV de Novembro, 1452, São Carlos-SP, 13561-206, Brazil.
RESUMO
Técnicas de espectroscopia como infravermelho podem ser utilizadas
como ferramentas para análises não destrutivas da qualidade interna de
frutas. Os métodos convencionais de análise de qualidade são em sua
grande maioria destrutivas e demandam muito tempo e recurso. Este estudo
avaliou e comparou as técnicas de espectroscopia de infravermelho próximo
(NIR) e médio (MIR) juntamente com a utilização de calibração multivariada
na determinação de vitamina C, ácido cítrico e açúcares totais e redutores.
Os sinais dos espectros obtidos foram analisados e utilizados para a
construção de modelos de predição por regressão de mínimos quadrados
parciais (PLS). Na construção dos modelos de regressão as laranjas foram
dividas em dois conjuntos de dados: conjunto de calibração e validação
interna e o de validação externa. Os sinais de NIR e MIR foram obtidos por
técnica de reflectância e processados para diminuir o ruído. Para a predição
de vitamina C e ácido cítrico tanto o NIR quanto o MIR resultaram em
modelos com aplicabilidade. O modelo mais preciso foi o desenvolvido com
sinas de MIR, com coeficiente de correlação de Pearson (r) de 0,81 e erro
quadrático médio de predição (RMESP) de 7,51 para vitamina C e 0,82 e
3,36 para ácido cítrico. Em relação a predição de açúcares o NIR não
24
resultou em modelos precisos. Todavia, a utilização de MIR para a predição
de sacarose, glicose e açúcares totais apresentaram baixos erros de
predição 11,69, 7,79 e 24,28 (g L-1) e coeficientes de correlação de forte a
moderado. Desta forma, é possível concluir, que técnicas de infravermelho
podem ser aplicadas para determinação de parâmetros de qualidade interna
em laranjas de forma não destrutiva.
Palavas-chave: análise não destrutiva; qualidade; quimiometria; PLS.
ABSTRACT
Spectroscopic techniques such as infrared may be used as tools for
non-destructive analyses of the inner quality of fruits. Conventional quality
evaluation methods are mostly destructive and require excessive amounts of
resources and time. This study evaluated and compared the near-infrared
(NIR) and mid-infrared (MIR) spectroscopic techniques through multivariate
calibration in order to determine vitamin C, citric acid, and total and reducing
sugars in oranges. The acquired spectra signals were analyzed and used to
build up prediction models based on partial least squares (PLS) regression.
To assemble the regression models, oranges were divided into two data sets:
calibration plus internal validation set as well as external validation set. The
NIR and MIR signals were acquired by reflectance and then processed to
reduce noise. For predicting vitamin C and citric acid, both NIR and MIR
resulted in applicable models. The most accurate model relied upon MIR
signals and presented Pearson's correlation coefficient (r) of 0.81 as well as
root-mean-square error of prediction (RMSEP) of 7.51 for vitamin C. For citric
acid, r and RMSEP values were 0.82 and 3.36, respectively. Concerning
25
sugar prediction, NIR did not lead to accurate models. However, MIR
presented low prediction errors (11.69, 7.79, and 24.28 g L-1) as well as
strong to moderate correlation coefficients for the predictions of sucrose,
glucose, and total sugars. Therefore, it is possible to conclude that infrared
techniques can be applied to determine inner quality parameters of oranges
in a non-destructive fashion.
Key-words: Non-destructive analyses; quality; chemometrics; PLS.
1. Introdução
A laranja é considerada a principal espécie de citros no mundo em
função de sua importância comercial e industrial. O Brasil é, mundialmente,
o maior produtor de laranja, com aproximadamente 25,2% da produção
mundial (1,2). A maior parte da produção é direcionada a produção de suco,
para 2015/16, a safra é estimada em 16,7 milhões de toneladas (3). A
qualidade da fruta tem enorme significância no grau de aceitabilidade pelo
consumidor e envolve parâmetros sensoriais, físicos, valores nutritivos e
constituintes químicos (4).
Devido as suas inúmeras propriedades nutricionais o consumo de
laranja é importante na alimentação diária (5). O conteúdo de ácido
ascórbico é um dos mais importantes critérios na avaliação do valor
nutricional de laranjas (6), pois se trata de um ácido orgânico que apresenta
capacidade antioxidante (7) e não é sintetizado pelo ser humano, desta
forma, havendo a necessidade de sua ingestão durante a dieta. O ácido
cítrico, também apresenta capacidade antioxidante, sendo o ácido orgânico
26
presente no suco de laranja o qual proporciona a característica ácida e
refrescante (7).
Os açúcares também apresentam grande importância na qualidade
de laranjas, e representam 85% do teor de sólidos solúveis que é
comumente utilizado para classificação durante a comercialização de citros
(8). Os principais açúcares presentes no suco de laranja são a sacarose e os
açúcares redutores frutose e glicose. O balanço entre açúcares e ácidos
orgânicos contidos na polpa da fruta confere o sabor que pode ser agradável
ou não ao consumidor (9).
Os métodos analíticos convencionais para determinação destes
parâmetros são destrutivos e necessitam de tempo, reagentes, pessoal
treinado e geram resíduos. Além disso, por se tratar de uma técnica
destrutiva as análises são feitas em um número limitado de amostras, que
podem não ser representativo da variação real existente no conjunto total
(10).
A técnica de espectroscopia de infravermelho tem mostrado boa
aplicabilidade para análises de parâmetros de qualidade de frutas. As
maiores vantagens da utilização de infravermelho próximo (NIR) e médio
(MIR) estão no fato de ser uma análise rápida, levando alguns segundos, e
de se tratar de um método não destrutivo (10). Além de tornar possível, junto
com ferramentas quimiométricas, a determinação de vários parâmetros
simultaneamente.
Vários estudos utilizaram a técnica de infravermelho para determinar
parâmetros internos de qualidade em frutas. Por exemplo, com a utilização
27
de NIR na determinação de SST e acidez de forma não destrutiva em laranja
(11,12) pêssego (13) e maçã (14). Ainda com NIR outros estudos
determinaram vitamina C em maçãs (14) e laranjas (15). A técnica de MIR
não vem sido utilizada para análise de frutas intactas, essa técnica ainda
está restrita para análise de polpas e sucos de frutas. Por exemplo, na
análise de açúcares totais e redutores em polpa de maracujá e damasco
(16).
Ainda não existem estudos comparativos entre a utilização de NIR e
MIR em análise de parâmetros internos de laranjas intactas. O objetivo deste
estudo foi utilizar técnicas de NIR e MIR em conjunto com o método
quimiométrico de regressão de mínimos quadrados parciais (PLSR) para
desenvolver modelos para determinação da qualidade interna, ácido
ascórbico, cítrico e açúcares, de laranjas do cultivar ‘Valência’ intactas.
2. Material e métodos
2.1 Material vegetal
As laranjas (Citrus sinensis) do cultivar ‘Valência’ foram colhidas em 3
etapas durante a safra de 2015 (no início, meio e final da safra), em cultivo
comercial no interior de São Paulo, Brasil. Em laboratório, as frutas foram
sanitizadas, selecionadas por ausência de defeitos e doenças e
armazenadas sob 12° C ± 1,5 e 90% ± 5 de UR. Um total de 407 laranjas
foram colhidas, onde 327 frutas foram utilizadas para a construção dos
modelos de determinação e 80 laranjas foram utilizadas exclusivamente para
caracterização das amostras. Os conjuntos de calibração com validação
interna e de validação externa estão apresentados na tabela 1.
28
Tabela 1: Número amostral utilizados nos conjuntos de calibração com validação
interna e de predição.
Método Parâmetro Cal + Validação interna (n) Validação externa (n)
NIR Ácidos orgânicos 228 98 Açúcares 140 60 MIR Ácidos orgânicos 229 98 Açúcares 139 60
Caracterização das amostras
A frutas do conjunto de caracterização foram analisadas quanto sua
massa fresca, diâmetro equatorial, coloração da casca, teor de sólidos
solúveis (SST) e potencial hidrogeniônico (pH).
Os frutos foram pesados individualmente em balança eletrônica Marte
AS 2000C, com precisão de 0,01 g, os valores foram expressos em gramas.
Foram realizadas medidas do diâmetro transversal, que corresponde à
medida equatorial, com o auxílio de um paquímetro digital modelo Mitutoyo
com exatidão de ± 0,02 mm.
Com a utilização do colorímetro, HunterLab MiniScan XE Plus, com
amostras avaliadas no sistema L, a* e b* (color space) proposto pela
Comission Internationale de l'Éclairage (CIE), foi feita a análise da coloração
da casca dos frutos para sua caracterização, com duas medições na região
equatorial de cada fruto. Os resultados foram expressos em ângulo hue (oh).
O SST foi quantificado inserindo-se alíquotas de 2 – 3 mL das
amostras processadas de cada laranja. A análise foi realizada em triplicata
em refratômetro de bancada Atago RX-5000cx, os resultados foram
expressos em °BRIX (17). A medida do pH foi realizada pela imersão do
29
eletrodo do equipamento QX 1500 QUALSTRON em 20 mL da amostra
extraída de cada laranja.
2.3 Infravermelho próximo (NIR)
Para obtenção dos os espectros de NIR as laranjas foram analisadas
por reflectância pelo espectrômetro de infravermelho comercial, modelo
Spectrum 100N (Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT). Os espectros foram
coletados na região entre 4000-10000 cm-1 com resolução de 32 cm-1 e 32
varreduras cada para melhorar a relação sinal-ruído. A análise foi realizada
em triplicata através do contato da região equatorial da fruta inteira com o
cristal do equipamento.
2.4 Infravermelho médio (MIR)
Os espectros de MIR foram coletados pelo espectrômetro Agilent
Cary 630 FTIR na região entre 650-4000 cm-1 com resolução de 16 cm-1 e
64 varreduras, para melhorar a relação sinal-ruído. Quatro espectros foram
adquiridos através do contato da região equatorial da fruta inteira com casca,
com o cristal do acessório de reflectância total atenuada (ATR, do inglês
Attenuated total reflectance). Para a construção dos modelos foi utilizado a
média dos 4 espectros.
2.2 Análises de referência
As análises químicas de referência foram realizadas para
posteriormente desenvolver modelos de regressão que correlacionam os
resultados de referência com os sinais espectroscópicos das análises de
NIR e MIR.
30
Ácido ascórbico e cítrico
Os ácidos L-ascórbico e cítrico foram determinados por técnica de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), adaptado de KELEBEK
(2009), por meio do cromatógrafo líquido modelo Varian com coluna Agilent
C18 (2,5x25mm, 5micro m), detector Ultravioleta-Visível ajustado para leitura
a 254nm (ácido L-ascórbico) e 214nm (ácido cítrico) e tampão fosfato
(molaridade) pH 2,5 como fase móvel. A vazão da fase móvel foi de 1,0 mL
min-1 e o volume de injeção de 20 µL. Foi utilizado o ácido L - ascórbico
(pureza >= 99%) obtido de Sigma Life Science como padrão e o ácido cítrico
(≥99,5%) da marca Babsynth produtos para laboratório Ltda.
Após a extração do suco, as amostras foram levadas a volume
conhecido com ácido metafofosfórico 3% (m/v), filtradas em unidades
filtrantes descartáveis teflon hidrofílico (porosidade de 0,45 µm) e protegidas
da luz para evitar a degradação dos ácidos orgânicos. As análises foram
realizadas em duplicatas.
Açúcares totais e redutores
As análises de açúcares totais e redutores foram realizadas pela
técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), adaptado de
KELEBEK (2009), com cromatógrafo líquido modelo Varian equipado com
coluna Amino HPX 87H e detector de índice de refração (IR). A coluna foi
mantida a temperatura ambiente (25°C), utilizando-se como fase móvel o
ácido sulfúrico (H2SO4 0,5 mM) com vazão de 0,6 mL min-1 com volume de
injeção de 20 µL para cada amostra.
31
As amostras do suco de cada laranja foram extraídas e armazenadas
sob temperatura de -28°C. Previamente às análises as amostras foram
descongeladas, diluídas na razão 1:10 com água ultrapura (Milli- Q®) e
filtradas em unidades filtrantes descartáveis de teflon hidrofílico de
porosidade 0,45 µm. Foram utilizadas sacarose (pureza ≥ 99%), D – glicose
(pureza ≥ 99,5%) e D – frutose (pureza ≥ 99%) da marca Sigma Life Science
como padrões.
2.5 Processamento dos dados
As análises quimiométricas foram realizadas pelos softwares Origin
8.1 (OriginLab, Northampton, MA, USA) e Pirouette v.4.5) Infometrix, Inc.
Bothell – WA).
Os espectros de NIR foram centrados na média e realizados os pré-
processamento: Variação Normal Padrão (SNV) e derivada de primeira
ordem com janela de 21 pontos. Os sinais espectroscópicos de MIR foram
centrados na média, normalizados (0-1) e foi aplicada a primeira derivada
com 5 pontos de janela.
Foi feita a regressão por mínimos quadrados parciais (PLS), para isso
foram construídas matrizes onde os sinais analíticos (espectros) referentes
ao infravermelho próximo e médio foram utilizados para a construção da
matriz X, contendo as variáveis independentes. A matriz Y foi construída
com os dados obtidos pelas análises químicas de referência, com dados
relacionados as variáveis dependentes. A regressão por mínimos quadrados
parciais foi feita para obtenção da correlação entre os espectros e os dados
de qualidade dos frutos. Para a construção dos modelos PLS de cada
32
parâmetro de qualidade o conjunto total de dados foi dividido,por meio de
algoritimo randômico, em dois grupos. Um grupo destinado a construção do
modelo PLS de calibração e validação interna com teste de validação interna
cruzada leave-one-out, com 70% dos dados totais e o outro grupo foi
utilizado na construção do modelo PLS de validação externa contendo 30%
dos dados totais.
A avaliação dos modelos foi feita a partir da análise dos coeficientes
de correlação de Pearson (r) da calibração (r Cal), validação (r Val) e predição
(R), assim como, dos erros quadráticos médios de calibração (RMSEC),
validação (RMSEV) e predição (RMSEP); e no desvio do resíduo de
predição (RPD).
3. Resultados e discussão
Caracterização das amostras
Os dados estatísticos relativos à caracterização das amostras de
laranjas provenientes de floradas distintas estão sumarizados na tabela 2 . A
colheita de laranjas em primeira e quarta florada, da mesma safra, permitiu a
observação de uma grande amplitude na variação de massa fresca,
diâmetro e coloração externa dos frutos. Essas variações em frutos da
mesma safra são comuns, e relacionam-se diretamente com os estados
nutricionais e hormonais das plantas, e com as condições ambientais
durante o desenvolvimento da laranja (19).
Tabela 2: Resultados da caracterização das amostras de laranja.
Média ± dp Intervalo
Massa (g) 188,04 ± 41,28 93,72 - 282,23
Diâmetro (mm) 71,17 ± 4,18 63,80 - 80,38
Coloração flavedo (°hue) 91,99 ± 10,07 76,00 - 108,62
SST (°BRIX) 8,18 ± 1,03 4,80 - 11,48
pH 3,47 ± 0,39 3,47 - 4,23 *dp= desvio padrão da média
33
Os valores de massa fresca estão próximos aos descritos por
ARRUDA e colaboradores (2009) em estudos conduzidos em pomares
brasileiros para descrever a qualidade físico-química de laranjas ‘Valência’.
Esses resultados estão de acordo também com aqueles de massa fresca
descritos por Magwaza et al. (2013), que avaliaram qualidade de laranjas
‘Valência’ por meio de espectroscopia (NIR). Por sua vez, Bai et al. (2016)
obtiveram valores de até 153 g por fruto em pomares americanos, o que se
diferencia dos resultados aferidos neste presente estudo. Em relação à
classificação de laranjas pelo seu diâmetro equatorial as laranjas utilizadas
pertenciam as classes 3 (80 – 93 mm), 6 ( 70 – 80 mm) 12 ( 56 – 63 mm), de
acordo com a classificação feita a partir de padrões determinados pelo
CODEX (23).
A avaliação da coloração externa está de acordo com os valores de
ºhue apresentados por Arruda et al. (2009) e Miranda et al. (2015). O ângulo
ºhue foi utilizado como parâmetro para acompanhar a coloração da casca,
podendo variar de 0° a 360°. Resultados de coloração entre 60° e 150°
representam frutos de com flavedos amarelados até verdes,
respectivamente (25). Neste estudo, frutos com ângulo de 76º foram os mais
amarelados nas coletas entre floradas, enquanto que frutos que
apresentaram ângulo de 109º foram os mais esverdeados.
O teor de sólidos solúveis, medida indireta do grau de doçura do suco
(26) apresentou amplitude e valor médio de acordo com o encontrado na
literatura (11,19).
34
O pH é um importante parâmetro de qualidade, principalmente para o
suco de laranja, ele, juntamente com os valores de acidez titulável, fornece
informação da acidez da fruta. Observa-se que a média de pH foi de 3,47,
valores de pH acima de 3,5 podem caracterizar frutas menos ácidas,
enquanto que aquelas com pH abaixo desse valor caracterizam frutos ácidos
(27).
Espectros de NIR e MIR
A Figura 1 apresenta os espectros de reflectância do NIR sem
processamento e com a aplicação de centralização na média, SNV e
primeira derivada com 25 pontos de janela. Também são mostrados os
espectros de MIR sem pré-processamentos e após centralização na média,
normalização (0-1) e aplicação da primeira derivada com 5 pontos de janela.
Nota-se que os processamentos corrigiram os problemas de variação da
linha de base e espalhamento de luz dos espectros e também evidenciaram
os picos antes sobrepostos, notadamente nos espectros de NIR.
35
Figura 1: Espectro de NIR originais (A) com a divisão dos conjuntos de varáveis;
(B) espectros NIR com aplicação de SNV e 1ª derivada (25); espectros de MIR originais (C)
com a divisão dos conjuntos de variáveis; (D) espectros MIR normalizados e com a
aplicação de 1ª derivada (5).
Os modelos PLS com espectros de NIR foram construídos com dois
conjuntos diferentes de variáveis: NIR 1, onde o intervalo de 6400 a 5600
cm-1 foi excluído, pois essa região apresenta ruídos e sobreposições de
absorção de moléculas sem correlação com os parâmetros de qualidade
analisados; NIR 2, exclusão das variáveis dos intervalos entre 10000 – 9600
cm-1 (região característica da absorção de RNH2), 6400-5600 cm-1 e 4400-
4000cm-1 (região de absorção de N-H) (28,29).
Nos dois conjuntos de variáveis para NIR observam-se dois picos
acentuados nos sinais. O primeiro ocorre em 7000 cm-1 e o segundo ocorre
em 5000 cm-1, caracterizando regiões do estiramento assimétrico do OH e
36
combinações de dobragens (30). Essas regiões estão relacionadas,
principalmente, a absorção de água e ácidos orgânicos, e são consideradas
regiões de importância para as análises de vitamina C e ácido cítrico.
Para os espectros de MIR dois conjuntos de variáveis também foram
testados: MIR 1, utilizando-se todas as 450 variáveis, sem exclusão; MIR 2,
variáveis dos intervalos de 3656 a 4000 cm-1 e 2777 a 1773 cm-1 foram
excluídas. Pois nessas regiões existem ruídos aleatórios os quais podem
influenciar a correlação entre os sinais espectroscópicos com as medidas de
referência (28,31).
O grupo hidroxila (O-H), que está presente em moléculas como álcool,
ácidos orgânicos e água, tem forte absorção no intervalo de 3200 a 3600 cm-
1(32). O intervalo entre 1790 e 1706 cm-1 é associado ao estiramento dos
grupos C=O e C=C (28) e as bandas entre 1500 e 900 cm-1 são dominadas
por grupos de estiramento C-C e C-O (33). Mais especificamente, as regiões
no intervalo de 1650 e 1850 cm-1 são associadas ao grupo carbonila (34),
encontrados nos aldeídos e cetonas, constituintes de moléculas de
monossacarídeos (35). Yang e colaboradores, (2002), analisando soluções
de vitamina C observaram uma forte correlação entre os picos entre 3500-
3000 cm-1 e 17500 – 1000 cm-1 com as diferentes concentrações do ácido.
O pico de absorção localizado entre X e Y cm-1 é característico de
moléculas com ligações C-H, esse tipo de ligação é característico de
lipídeos. No caso da técnica de MIR a taxa de penetração da radiação é
muito baixa, pouco micrometros diferente da técnica de NIR que pode
penetrar de 2-3 mm na amostra (10). Portanto os modelos de predição irão
37
correlacionar os atributos do suco com alguns constituintes da casca do
fruto, como por exemplo a composição de óleos essenciais, por isso a
importância em manter as regiões de absorção do espectro de MIR
características de lipídeos.
Análises de referência
Os valores de média, desvio padrão e amplitude dos dados para cada
um dos parâmetros analisados nos conjuntos de calibração com validação
interna e predição estão apresentados na tabela 3. Os resultados mostram a
grande amplitude de variação de cada parâmetro avaliado e utilizado para o
conjunto de calibração e de predição na construção dos modelos de
regressão. Tal amplitude é essencial para que os modelos apresentem
aplicabilidade, uma vez que a regressão precisa ser calibrada com amostras
que representem a variação real existente (36,37).
As médias de cada parâmetro químico nos conjuntos de calibração
com validação interna e predição de NIR e MIR não apresentaram
diferenças significativas (p>0,05). Portanto, os conjuntos apresentaram
valores de média e amplitude equivalentes.
38
Tabela 3: Análise estatística dos conjuntos de calibração com validação
interna e predição: média, desvio padrão e intervalo de dados.
Calibração e Validação
interna Predição
Parâmetro Método N Média ± dp Intervalo
N Média ± dp Intervalo
Vit C (mg 100 mL-1
) NIR 230 41,25 ±14,65 17,56 – 107,46
99 44,07 ±18,02 17,56 – 114,40
MIR 229 40,92 ±14,81 17,56 – 114,40
99 42,10 ±14,98 21,54 – 107,46
Ácido cítrico (g L-1
) NIR 230 11,56 ±6,25 4,10 – 40,25
99 12,27 ±7,13 4,25 – 40,25
MIR 229 11,47 ±6,31 4,10 – 40,25
99 12,00 ±6,47 4,90 – 40,25
Sacarose (g L-1
) NIR 140 52,09 ±17,83 23,63 – 113,07
- - -
MIR 139 52,84 ±16,83 21,80 – 92,98
60 53,43 ±18,79 23,63 – 113,06
Glicose (g L-1
) NIR 140 43,83 ±11,29 25,04 – 77,09
- - -
MIR 139 44,60 ±11,07 25,35 – 77,09
60 44,61 ±10,63 25,35 – 65,20
Frutose (g L-1
) NIR 140 38,71 ±8,38 24,15 – 65,60
- - -
MIR 139 39,22 ±8,32 24,15 – 65,60
- - -
Totais (g L-1
) NIR 140 134,65 ±34,92 77,98 – 223,63
- - -
MIR 139 136,38 ±33,51 72,30 – 216,73
- - -
Redutores (g L-1
) NIR 140 82,55 ±19,16 49,51 – 137,43
- - -
MIR 139 83,83 ±18,86 49,51 – 137,43 60 84,34 17,87 50,66 – 118,61
N: universo amostral; dp: desvio padrão.
Modelos PLS para vitamina C e ácido cítrico
Os resultados estatísticos dos modelos PLS desenvolvidos com os
sinais de NIR e MIR para determinação dos parâmetros vitamina C e ácido
cítrico estão apresentados na Tabela 4.
. A precisão e aplicabilidade dos modelos foram avaliadas
observando-se os valores dos erros (RMSEC e RMSEV) e do coeficiente de
correlação de Pearson, onde modelos mais adequados são aqueles com
menores erros e forte correlação.
39
Tabela 4: Estatística dos modelos PLS de calibração construídos com os
sinais analíticos de NIR e MIR para os parâmetros vitamina C e ácido cítrico.
Calibração e validação interna
Parâmetro Método Intervalo de onda (cm-1
) N F RMSEV Rval RMSEC Rcal
Vit C NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000 (NIR1)
230 9 8,65 0,74 7,63 0,81
(mg 100 mL-1
) NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2)
230 10 10,72 0,72 8,93 0,82
MIR 4000 – 500 (MIR1) 229 10 9,72 0,75 8,26 0,84
MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2)
229 10 10,34 0,78 8,97 0,82
Ácido Cítrico NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000
(NIR1) 230 7 3,72 0,76 3,43 0,81
(g L-1
) NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2)
230 8 4,19 0,77 3,73 0,83
MIR 4000 – 500 (MIR1) 229 8 3,68 0,81 3,42 0,85
MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2)
229 10 3,79 0,80 3,28 0,86
RMSEV e RMSEC = erros quadráticos médios da validação e calibração; r Val e r Cal = coeficiente de
correlação de Pearson da validação e calibração; n = universo amostral; F = fatores.
A escolha dos número de fatores foi feita a partir da observação dos
valores de RMSEC e RMSEV, onde o número de fator adequado foi o que
apresentou menores valores de erros (38).
Com a aplicação de NIR os modelos desenvolvidos com as variáveis
do grupo NIR 1 apresentaram menores RMSEV, que foram de 8,65 para
vitamina C e 3,72 para o ácido cítrico, em relação ao conjunto NIR2 que
apresentou RMSEV de 10,72 e 4,19 para os mesmos parâmetros. Para os
RMSEV dos modelos PLS-MIR foram observados valores menores para
vitamina C e ácido cítrico (9,72 e 3,68) quando utilizados os conjuntos MIR1
de variáveis. Todos os modelos de calibração com validação interna
apresentaram forte correlação, r > 0,70. A escolha do número de fatores foi
feita a partir da observação dos valores de RMSEC, RMSEV e RMSEP,
onde o número de fator adequado foi o que apresentou os menores valores
de erro (38).
40
Os resultados estatísticos da etapa de predição estão apresentados
na tabela 5. As duas técnicas apresentaram resultados adequados durante a
etapa de predição. Porém, a técnica de NIR tem como característica
espectros mais sobrecarregados, contendo muitas combinações de
absorções com picos não bem definidos. Essa característica pode ter
dificultado a correlação entre os sinais e os parâmetros de qualidade
(10,36,39).
Tabela 5: Estatística dos modelos de predição para NIR e MIR para os
parâmetros vitamina C e ácido cítrico.
Predição
Parâmetro Método Intervalo de onda n F RMSEP R RPD
Vit C NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000 (NIR1)
99 9 13,42 0,69 1,37
(mg 100 mL-1
) NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2)
99 9 9,49 0,71 1,32
MIR 4000 – 500 (MIR1) 99 5 9,21 0,76 1,60
MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2)
99 9 7,51 0,81 1,63
Ácido Cítrico NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000 (NIR1)
99 9 4,77 0,74 1,50
(g L-1
) NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2)
99 7 3,88 0,75 1,35
MIR 4000 – 500 (MIR1) 99 8 3,70 0,78 1,68
MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2)
99 8 3,36 0,82 1,83
RMSEP = erros quadráticos médios de predição; r = coeficiente de correlação de Pearson da predição; n = universo amostral; F = fatores; RPD = desvio do resíduo de predição.
A utilização da técnica de NIR para determinar ácido cítrico e vitamina
C em laranjas intactas vem sido avaliada em alguns estudos. Como no
trabalho realizado por Miyamoto e colaboradoes (1998) para determinação
de ácido cítrico de laranjas intactas com NIR onde os modelos PLS
desenvolvidos apresentaram correlação de Pearson de 0,83. Em outro
estudo, Pissard e colaboradores (2013) desenvolvendo modelos para
determinação de vitamina C em maçãs utilizando NIR obtiveram r = 0,89.
41
A técnica de MIR mostrou os melhores modelos, com RMSEP = 7,51
e r = 0,81 para vitamina C e RMSEP = 3,36 e r de 0,82 para ácido cítrico.
Além disso, estes modelos resultaram em RPD dentro da faixa de 1,50 -
2,00 que determina o poder de discriminação de valores altos e baixos (10).
No caso de MIR, não existem outros estudos sobre sua utilização em
análises não destrutivas em laranjas.
Modelos PLS açúcares
Para determinação de açúcares os modelos construídos com os
dados de NIR não foram validados para a etapa de predição, apresentando
baixa correlação (r < 0,70) e RMSEV elevados para todos os parâmetros
tabela 6. A técnica de MIR se mostrou apropriada para determinação de
sacarose, glicose e açúcares totais. Os modelos de calibração
desenvolvidos com a utilização dos espectros do conjunto MIR1 para
sacarose, glicose e açúcares totais apresentaram as correlações mais fortes
(0,75, 0,70 e 0,72, respectivamente) e RMSEV mais baixos (11,12, 7,76 e
23,15 g L-1, respectivamente) quando comparados com os resultados dos
modelos de pra MIR2.
42
Tabela 6: Estatística dos modelos PLS de calibração construídos com os sinais analíticos de NIR e MIR para os parâmetros sacarose, glicose, frutose, açúcares totais e redutores (g L
-1).
Calibração e validação interna
Parâmetro Método Intervalo de onda (cm-1
) N F RMSEV Rval RMSEC Rcal
Sacarose NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000 (NIR1)
140 7 14,25 0,56 12,64 0,70
NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 8 14,49 0,67 12,57 0,71
MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 7 11,12 0,75 9,21 0,84
MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 6 11,94 0,70 10,65 0,78
Glicose NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000 (NIR1)
140 2 10,02 0,35 9,80 0,34
NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 3 10,76 0,36 10,50 0,43
MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 6 7,96 0,70 6,92 0,79
MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 6 8,82 0,65 7,85 0,75
Frutose NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000 (NIR1)
140 3 7,75 0,15 7,62 0,26
NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 3 8,39 0,05 8,20 0,21
MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 6 6,42 0,64 5,68 0,74
MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 10 6,84 0,63 5,30 0,80
Totais NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000 (NIR1)
140 3 30,28 0,40 26,91 0,46
NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 3 31,32 0,41 30,58 0,47
MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 6 23,15 0,72 20,48 0,80
MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 6 25,55 0,67 22,73 0,76
Redutores NIR 10000 – 6500 e 5600 – 4000 (NIR1)
140 3 17,40 0,26 16,98 0,35
NIR 9060 - 6400 e 5600 – 4400 (NIR2) 140 3 18,72 0,30 18,28 0,33
MIR 4000 – 500 (MIR1) 139 6 14,11 0,57 12,38 0,77
MIR 3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 139 6 15,42 0,62 13,76 0,73
RMSEV e RMSEC = erros quadráticos médios da validação e calibração; r Val e r Cal = coeficiente de correlação de Pearson da validação e calibração; n = universo amostral; F = fatores.
Após a validação externa os melhores modelos foram os construídos
com as variáveis MIR 2, onde apresentaram valores de erro de predição
mais baixos e forte correlação, tabela 7. Mesmo com a utilização de MIR na
análise da fruta intacta para determinação de parâmetros internos de frutas
ainda sendo pouco difundida, esta técnica apresentou bons resultados. O
modelo para determinação de sacarose, com RMSEP = 11,69 e r = 0,78,
apresentou RPD de 1,60 mostrando seu poder em separar amostrar com
alta concentração de sacarose de amostras com baixa concentração.
43
Tabela 7: Estatística dos modelos de predição PLS- MIR para os parâmetros
sacarose, glicose, frutose, açúcares totais e redutores.
Predição
Parâmetro Intervalo de onda (cm-1
) N F RMSEP R RPD
Sacarose 4000 – 500 (MIR1) 60 8 14,45 0,62 1,28
3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 60 10 11,69 0,78 1,60
Glicose 4000 – 500 (MIR1) 60 8 9,45 0,61 1,35
3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 60 6 7,79 0,68 1,35
Totais 4000 – 500 (MIR1) 60 8 28,61 0,60 1,14
3656 – 2777 e 1773 – 500 (MIR2) 60 9 24,28 0,70 1,38
RMSEP = raiz média do erro padrão da predição; r = coeficiente de correlação de Pearson da predição; n
= universo amostral; F = fatores; RPD = desvio do resíduo de predição.
4. Conclusões
A aplicabilidade das técnicas espectroscópica NIR e MIR para
determinar vitamina C, ácido cítrico e açúcares em laranjas intactas foi
avaliada. Assim como, o desempenho de calibração e de predição dos
modelos PLS desenvolvidos com diferentes regiões do espectro. Em relação
à determinação de açúcares, a técnica de NIR não resultou em modelos
precisos. Já a utilização de MIR para a predição de sacarose, glicose e
açúcares totais apresentaram baixos erros de predição 11,69, 7,79 e 24,28
(g L-1) e coeficientes de correlação de forte a moderado.
A partir dos resultados obtidos no presente trabalho pode ser
apontado que as técnicas de NIR e MIR mostraram-se métodos adequados
para determinação de vitamina C e ácido cítrico em laranjas intactas. A
técnica de MIR apresentou resultado mais preciso, representado por
menores valores de RMSEP e correlações mais fortes para vitamina C e
para ácido cítrico.
44
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a agência brasileira FAPESP (processo
projeto 13/23479-0) e a CAPES pelo suporte financeiro para esse trabalho.
Referências
1. CitrusBR. Associação Nacional dos Exportadores de Sucos Cítricos.
2011. A Indústria Brasileira de suco de laranja.
http://www.citrusbr.com/noticias/?id=267491. (accessed 10.03.16).
2. FAO. Faostat Agriculture Data [Internet]. Food and Agriculture
Organization. 2015 [cited 2015 Jan 10]. Available from:
http://faostat.fao.org
3. USDA. United States Departament of Agriculture [Internet]. 2015 [cited
2015 Dec 10]. Available from: http://www.usda.gov
4. Kader AA. Postharvest Technology of Horticultural Crops. trird.
University of California. Agriculture ans Natural Resources; 2002.
5. César, T.B., Urzedo, R.L., Araújo, M.S.P., Aptekmann, N.P. 2010.
Suco de laranja reduz o colesterol em juice in normolipidemic subjects.
Rev Nutr. 23, 779–89.
6. Jun-fangl XIA, Xiao-yu LI, Pei-wu LI, Xiao-xia MAQD. ScienceDi rect
Application of Wavelet Transform in the Prediction of Navel Orange
Vitamin C Content by Near-Infrared Spectroscopy. 2007; 1067–73.
7. Yahia EM, Organelas-Paz JDJ, Gonzalez-Aquilar GA. Nutricional and
health-promoting properties of tropical and sub-tropical fruits. In:
Postharvest biology and technology of tropical and subtropical fruits. 3a
ed. Cambridge: Woodhead Publishing Limited; 2011.
45
8. Neves MF et al. O Retrato da Citricultura Brasileira. [Internet]. Ribeirão
Preto; 2010. Available from:
http://www.citrusbr.com/download/biblioteca/Apresentacao_Marcos_Fa
va_evento_valor.pdf
9. Spoto MFH, Regiano-D’arce MAB, Oetterer M. Fundamentos de
ciência e tecnologia de alimentos. 1a ed. Barueri: Manole; 2006.
10. Nicolai BM, Beullens K, Bobelyn E, Peirs A, Saeys W, Theron KI, et al.
Nondestructive measurement of fruit and vegetable quality by means of
NIR spectroscopy: A review. Postharvest Biol Technol. 2007
Nov;46(2):99–118.
11. Cayuela JA, Weiland C. Intact orange quality prediction with two
portable NIR spectrometers. Postharvest Biol Technol.
2010;58(2):113–20.
12. Gómez AH, He Y, Pereira AG. Non-destructive measurement of
acidity, soluble solids and firmness of Satsuma mandarin using
Vis/NIR-spectroscopy techniques. J Food Eng. 2006 Nov;77(2):313–9.
13. Nascimento PAM, Carvalho LC, Cunha-Junior LC, Pereira FMV,
Teixeira GHA. Robust PLS models for soluble solids content and
firmness determination in low chilling peach using near-infrared
spectroscopy (NIR). Postharvest Biol Technol. 2016;111:345–51.
14. Pissard A, Fernández Pierna JA, Baeten V, Sinnaeve G, Lognay G,
Mouteau A, et al. Non-destructive measurement of vitamin C, total
polyphenol and sugar content in apples using near-infrared
spectroscopy. J Sci Food Agric. 2013;93(2):238–44.
46
15. Jun-Fangl XIA, Xiao-Yu LI, Pei-Wu LI, Xiao-Xia MAQD. Application of
Wavelet Transform in the Prediction of Navel Orange Vitamin C
Content by Near-Infrared Spectroscopy. 2007;6(September):1067–73.
16. De Oliveira GA, De Castilhos, Renard CMGCF, Bureau S. Comparison
of NIR and MIR spectroscopic methods for determination of individual
sugars, organic acids and carotenoids in passion fruit. Food Res Int.
Elsevier B.V.; 2014 Jun;60:154–62.
17. AOAC. Official Methods of analysis of the Association of Analytical
Chemists International. 14a ed. Washington; 1992.
18. Kelebek H, Selli S, Canbas A, Carabaroglu T. HPLC determination of
organic acids, sugars, phenolic compositions and antioxidant capacity
of orange juice and orange wine made from a Turkish cv. Kozan.
Microchem J. Elsevier B.V.; 2009;91(2):187–92.
19. Tadeo FR, Cercós M, Colmenero-Flores JM, Iglesias DJ, Naranjo MA,
Ríos G, et al. Molecular Physiology of Development and Quality of
Citrus. Advances in Botanical Research. 2008. p. 147–223.
20. Arruda MCD, Fischer IH, Zanette MM, Lourenço B. Qualidade físico
química de frutos de laranja Valência provenientes de cultivos orgânico
e convencional. 2009;
21. Magwaza LS, Opara UL, Terry LA, Landahl S, Cronje PJR, Nieuwoudt
HH, et al. Evaluation of Fourier transform-NIR spectroscopy for
integrated external and internal quality assessment of Valencia
oranges. J Food Compos Anal. 2013 Aug;31(1):144–54.
47
22. Bai J, Baldwin E, McCollum G, Plotto A, Manthey J, Widmer W, et al.
Changes in Volatile and Non-Volatile Flavor Chemicals of “Valencia”
Orange Juice over the Harvest Seasons. Foods. Multidisciplinary
Digital Publishing Institute; 2016 Jan;5(1):4.
23. CODEX. CODEX ALIMENTARIUS STANDARD 245 - 2004. 2004 p. 2–
7.
24. Miranda M, Spricigo PC, Ferreira MD. Mechanical damage during
harvest and loading affect orange postharvest quality. Eng Agrícola.
Associação Brasileira de Engenharia Agrícola; 2015;35(1):154–62.
25. McGuire RG. Reporting of objective colour measurements.
HortScience. 1992;27(12):1254–5.
26. Kader AA. Quality and Safety Factors: Definition and Evaluation for
Fresh Horticultural Crops. In: (ANR) U of CA and NR, editor.
Postharvest Technology of Horticultural Crops. Third. 2002. p. 535.
27. Ting SV. Distribution of soluble components and quality factors in the
edible portion of citrus fruits. J Sci Hortic. 1969;32:515–9.
28. Yang H, Irudayaraj J. Rapid determination of vitamin C by NIR, MIR
and FT-Raman techniques. J Pharm Pharmacol. 2002
Sep;54(9):1247–55.
29. Sun DW, Lin M, Rasco BA, Cavinato AG, Al-Holy M. Infrared
Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control. Infrared
Spectrosc Food Qual Anal Control. 2009;119–43.
48
30. Osborne B, Fearn T, Hindle P. Practical NIR spectroscopy with
applications in food and beverage analysis. second. Harlow UK:
Addison-Wesley Longman Ltd; 1993.
31. Sun DW. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and Control.
Infrared Spectrosc Food Qual Anal Control. 2009;xi – xiii.
32. Sun DW, Huang Y, Rasco BA, Cavinato AG. Infrared Spectroscopy for
Food Quality Analysis and Control. Infrared Spectrosc Food Qual Anal
Control. 2009;355–75.
33. Pavia DL, Kris GS, Lampman GM, Vyvyan JR. Introdução à
espectroscopia. 1a ed. Cengage Learning; 2010. 716 p.
34. Dufour É. Principles of Infrared Spectroscopy. Infrared Spectrosc Food
Qual Anal Control. 2009;
35. Nelson DL, Cox M. Lehninger – Princípios de Bioquímica. 3a ed. São
Paulo: Sarvier; 2002. 1009 p.
36. Nicolai BM, Defraeye T, De Ketelaere B, Herremans E, Hertog
MLATM, Saeys W, et al. Nondestructive measurement of fruit and
vegetable quality. Annual review of food science and technology. 2014.
285-312 p.
37. Flores DWM. Sistemas não invasivos para classificação de laranjas
por meio de parâmetros físico-químicos. [Dissertação] Universidade de
São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”; 2015.
38. Geladi P, Kowalski BR. Partial least-squares regression: a tutorial. Anal
Chim Acta. 1986; 185:1–17.
49
39. Bobelyn E, Serban A-S, Nicu M, Lammertyn J, Nicolai BM, Saeys W.
Postharvest quality of apple predicted by NIR-spectroscopy: Study of
the effect of biological variability on spectra and model performance.
Postharvest Biol Technol. 2010 Mar;55(3):133–43.
40. Miyamoto, K., Kawauchi, M., Fukuda, T. 1998. Classification of high
acid fruits fruits by partial least squares using the near infrared
transmittance spectra of intact satsuma mandarins. J. Near Infrared
Spectrosc. [Internet]. 6, 267. Available from:
http://www.impublications.com/content/abstract?code=J06_0267.
50
Capítulo 2.
Aplicação e comparação das técnicas não destrutivas de
espectroscopia de infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) e de
ressonância magnética nuclear no domínio do tempo (RMN-dt) para
determinação de parâmetros de qualidade em laranjas.
51
Aplicação das técnicas não destrutivas de espectroscopia no
infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) e de ressonância magnética
nuclear no domínio do tempo (RMN-dt) para determinação de
parâmetros de qualidade em laranjas.
Karla Rodrigues Borba1 Poliana Cristina Spricigo2
Luiz Alberto Colnago3 Marcos David Ferreira 4
1Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP, Araraquara – Brasil. 2Universidade de São Paulo – USP, Piracicaba – Brasil 3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa, São Carlos – Brasil. 4Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa, São Carlos – Brasil.
RESUMO
Técnicas de espectroscopia como infravermelho – próximo e médio -
e ressonância magnética nuclear, podem ser utilizadas para analisar a
qualidade de frutas intactas. O teor de sólidos solúveis (SST) e pH são
alguns dos principais parâmetros utilizados na determinação de qualidade
em laranjas. Este estudo avaliou as técnicas de espectroscopia de
infravermelho próximo (NIR), médio (MIR) e de ressonância magnética
nuclear (RMN-dt) juntamente com a utilização de calibração multivariada
para determinação rápida de SST, pH e massa fresca em laranjas intactas.
Os sinais dos espectros obtidos foram analisados e utilizados para a
construção de modelos de predição por regressão de mínimos quadrados
parciais (PLS). Na construção dos modelos de regressão as laranjas foram
divididas em dois conjuntos de dados, conjunto de calibração e validação
52
interna e o de validação externa. Os sinais de NIR e MIR foram obtidos por
técnica de reflectância e os sinais de decaimento do RMN-dt por sequência
de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG). Para a predição de SST o modelo
PLS – NIR mostrou melhor resultado, com SEP 0,74° BRIX e r de 0,75. A
determinação de massa fresca foi mais adequada com a aplicação da
técnica de RMN-dt, com SEP 21,41 gramas e r = 0,82. Para a determinação
do pH o modelo PLS-MIR foi mais preciso, onde observou-se SEP de 0,20 e
r = 0,86. De acordo com os resultados obtidos a aplicação das técnicas de
NIR, MIR e RMN para a determinação de SST, pH e massa fresca mostrou-
se uma alternativa pertinente para a análise não destrutiva de qualidade em
laranjas.
Palavras-chave: Citrus sinensis; quimiometria; sólidos solúveis; pH; massa
fresca.
ABSTRACT
Spectroscopic techniques such as infrared - near and medium - and
nuclear magnetic resonance can be used to analyze the quality of intact fruit.
The soluble solids (TSS) and pH are some of the main quality parameters in
oranges. This study evaluated and compared the near infrared spectroscopy
technique (NIR), medium (MIR) and nuclear magnetic resonance (NMR dt)
with the use of multivariate calibration for rapid determination of TSS, pH and
fresh weight in intact oranges . The signs of the spectra obtained were
analyzed and used to build regression models for prediction of partial least
squares (PLS). In the construction of the regression models oranges were
divided into two sets of data and internal calibration set and validation
53
external validation. The signals NIR and MIR were obtained by reflectance
technique and decay of the NMR signal DT by sequence Carr-Purcell-
Meiboom-Gill (CPMG). For SST prediction PLS model - NIR showed better
results, with EPS 0.74 ° BRIX and r 0.75. The determination of fresh mass
was more suitable to the application of NMR-dt technique, SEP 21.41 grams
and r = 0.82. To determine the pH-MIR PLS model is more accurate where
there was SEP r = 0.20 and 0.86. According to the results of the application
of NIR techniques, NMR and MIR for the determination of TSS, pH and fresh
weight showed a relevant alternative for the nondestructive examination
quality oranges.
Keywords: Citrus sinensis; chemometrics; Soluble solids; pH; fresh pasta
1. Introdução
O Brasil é o maior produtor de laranja do mundo, responsável por
aproximadamente 25,2% da produção mundial (1,2). A laranja pode ser
destinada tanto ao consumo in natura quanto para o processamento de
suco, sendo que grande parte da produção nacional é direcionada a
produção de suco. O consumo de laranja, assim como das demais frutas,
está diretamente relacionado a sua qualidade. A qualidade dos frutos de
laranja depende de atributos como acidez total titulável, pH, teor de sólidos
solúveis, textura, cor e valores nutritivos (3).
O teor de sólidos solúveis (SST) é um indicador de qualidade
amplamente adotado no setor industrial. Trata-se de uma referência de
qualidade desde a colheita do fruto - onde assume o papel de ferramenta de
decisão do ponto de colheita - até como parâmetro de valoração das
54
laranjas. O conteúdo de sólidos solúveis tem efeito direto nas propriedades
físicas e reológicas do suco de laranja, e juntamente com as características
de temperatura dos processos e a distribuição e tamanho das partículas de
sua matéria-prima, é fundamental no desenvolvimento de seus produtos
derivados (4). Outro parâmetro de qualidade utilizado para avaliação de
citros é o potencial hidrogeniônico (pH). A escala de pH designa as
concentrações de H+ presentes na solução (5), representando a intensidade
das condições ácidas ou alcalinas do meio. A concentração de ácidos em
produtos cítricos tem envolvimento direto com a qualidade dos frutos e seus
derivados, e em balanço adequado com o conteúdo de sólidos solúveis,
proporciona o sabor desejado pelos consumidores (6)
O controle da qualidade é etapa chave para que o produto final
satisfaça as exigências do consumidor e requisitos do mercado (6). Os
métodos analíticos convencionais para determinação de SST e pH em sua
maioria são métodos destrutivos. A necessidade da destruição da amostra
limita o número de frutos que compõe o universo amostral, onde a
representação da variação real existente no conjunto total pode ficar
comprometida (7). Além disso, as análises convencionais demandam
elevado tempo e mão de obra para a execução da extração e sua
determinação, o que pode onerar o sistema de garantia de qualidade (6).
Uma alternativa no controle de qualidade direcionado aos frutos de
laranja é a aplicação de técnicas de espectroscopia no infravermelho e de
ressonância magnética nuclear. Estas técnicas possibilitam análises de
qualidade rápidas, não destrutivas e que não demandam a preparação de
55
amostras (7). Sendo assim, o monitoramento da qualidade de produtos
vegetais em linhas de processamento pode ser aperfeiçoado, permitindo
amostragens de alta confiabilidade em menor espaço de tempo.
A faixa do infravermelho é dividida em três regiões: infravermelho
próximo (4000 – 12500 cm-1), infravermelho médio (400 – 4000 cm-1) e
distante (100 – 400 cm-1) (8). Estudos mostraram aplicabilidade da técnica
de NIR para análise de sólidos solúveis, de forma não destrutiva, em
pêssegos (9) e citros (10–13). A técnica de MIR foi aplicada com sucesso
para estimar a composição de várias amostras de alimentos, principalmente
de produtos líquidos como sucos, leites e óleos (14–17).
A espectroscopia de RMN estuda a interação da radiação
eletromagnética na região de rádio frequência, 4 a 900 MHz, com núcleos
atômicos (18). Os núcleos absorvem radiação eletromagnética quando
expostos a um campo magnético intenso, a técnica de RMN permite a
observação de núcleos com momento magnético nuclear ou spin ≠ 0 (19).
Essa técnica pode ser subdividida em aplicações em alta e baixa
resolução. Espectrômetros de baixo campo (ou baixa resolução) vêm sendo
utilizados para análise de qualidade em laboratórios (20). Neste caso, as
medidas são baseadas principalmente no tempo de relaxação e por isso, a
técnica também é conhecida como RMN no domínio do tempo (RMN-dt)
(21). Esse método de análise vem sido aplicado a diferentes tipos de
alimentos e finalidades. Como adulteração em leites (22) e azeites (23) e na
análise de parâmetros de qualidade em frutas como SST em ameixas
56
(PEREIRAa et al. 2013) e atributos sensoriais (FLORES et al. 2016) e
qualidade físico-química (26) em laranjas.
O objetivo deste estudo foi utilizar técnicas espectroscópicas de
infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR) e ressonância magnética nuclear
(RMN) em conjunto com o método quimiométrico de regressão de mínimos
quadrados parciais (PLS) para desenvolver modelos para determinação de
SST, pH e massa fresca em laranjas intactas do cultivar ‘Valência’.
2. Material e métodos
2.1 Amostras
Laranjas do cultivar ‘Valência’ - de primeira e quarta florada - foram
colhidas em 4 etapas durante a safra de 2015/2016 em cultivo comercial no
interior do estado de São Paulo, Brasil. Um total de 535 laranjas foi colhido,
onde 80 laranjas foram utilizadas para a caracterização do conjunto amostral
e o restante utilizado para a construção dos modelos PLS. Os conjuntos de
calibração com validação interna e de validação externa estão apresentados
na tabela 1. As frutas foram sanitizadas, selecionadas por ausência de
defeitos e doenças e armazenadas sob temperatura controlada em câmara-
fria a 12 ±1 °C e 90% UR.
Tabela 1: Número amostral utilizados nos conjuntos de calibração com validação
interna e de predição.
Método Cal + Validação interna (n) Validação externa (n)
NIR
MIR
RMN
311
311
282
134
134
122 NIR: Infravermelho próximo, MIR: infravermelho médio e Cal: calibração.
57
2.2 Caracterização das amostras
Um conjunto de laranjas (n = 80) foi utilizado para a caracterização
das amostras. Essas frutas foram analisadas quanto ao diâmetro equatorial
e coloração do flavedo (casca).
O diâmetro equatorial foi determinado com o auxílio de paquímetro
digital modelo Mitutoyo com exatidão de ± 0,02 mm, e os resultados foram
expresso em mm.
A coloração do flavedo foi aferida com colorímetro, HunterLab
MiniScan XE Plus, com amostras avaliadas no sistema L*, a* e b* (color
space) proposto pela Comission Internationale de l'Éclairage (CIE), com
duas medições na região equatorial de cada fruto. Os resultados foram
expressos em ângulo hue (oh).
2.3 Infravermelho próximo (NIR) e médio (MIR)
Para obtenção dos os espectros de NIR as laranjas foram analisadas
por reflectância pelo espectrômetro de infravermelho comercial, modelo
Spectrum 100N (Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT). Os espectros foram
coletados na região entre 4000-10000 cm-1 com resolução de 32 cm-1 e 32
varreduras cada para melhorar a relação sinal-ruído. A análise foi realizada
em triplicata através do contato da região equatorial da fruta inteira com
casca com o cristal do equipamento.
Os espectros de MIR foram coletados pelo espectrômetro Agilent
Cary 630 FTIR na região entre 650-4000 cm-1 com resolução de 16 cm-1 e
64 varreduras, para melhorar a relação sinal-ruído. Quatro espectros foram
adquiridos por do contato da região equatorial da fruta inteira com casca,
58
com o cristal do acessório de reflectância total atenuada (ATR, do inglês
Attenuated total reflectance). Para a construção dos modelos foi utilizado a
média dos 4 espectros.
2.4 Ressonância magnética nuclear no domínio do tempo
(RMN-dt)
As laranjas foram analisadas com espectrômetro de RMN (Spinlock
Magnetic Resonance Solution, Cordoba, Argentina) equipado com um ímã
permanente, campo magnético estático (B0), de 0,23 T (9 MHz para 1H), com
10 cm de diâmetro e 10 cm de comprimento. A sequência CPMG
desenvolvida por Carr-Purcell-Meibom-Gill foi utilizada, onde a sequência de
pulsos gerou um decaimento exponencial com tempo de relaxação
transversal (T2). Os parâmetros da CPMG foram: pulsos de 90° e 180°, com
um total de 1500 ecos com 8 varreduras para a aquisição dos sinais. A
análise foi realizada em condições controladas de temperatura (21 ± 1 °C).
2.5 Análises de referência
As análises químicas de referência foram realizadas para desenvolver
os modelos de regressão que correlacionam os sinais analíticos
(espectroscópicos) com os resultados de referência.
Massa fresca
Os frutos foram pesados individualmente em balança eletrônica Marte
AS 2000C, com precisão de 0,01 g. Os valores foram expressos em gramas.
Teor de sólidos solúveis
59
O teor de sólidos solúveis foi quantificado inserindo-se alíquotas de 2
– 3 mL das amostras processadas, em triplicata, em refratômetro de
bancada Atago RX-5000cx. Os resultados foram expressos em ºBrix (AOAC
1992 - método 932.12).
Potencial hidrogeniônico
A medida foi realizada com a imersão do eletrodo do equipamento QX
1500 QUALSTRON em 20 mL do suco de laranja extraído de cada amostra.
2.6 Processamento dos dados
Os sinais analíticos de NIR, MIR e RMN em conjunto com os dados
de referência foram analisados com a utilização dos programas
computacionais Origin 8.1 (OriginLab, Northampton, MA, USA) e Pirouette
v.4.5) Infometrix, Inc. Bothell – WA. Foram realizadas análise de
componentes principais (PCA) e regressão por mínimos quadrados parciais
(PLS).
A análise de componentes principais (PCA) foi realizada com a
finalidade de detectar característica de separação do conjunto total de
laranjas em grupos distintos, assim como separação das laranjas com
utilização dos sinais espectroscópicos. E também para observar quais
variáveis espectroscópicas apresentavam maior correlação com os valores
de referência.
Os espectros de NIR foram centrados na média, foi aplicada a
variação normal padrão (SNV) e a primeira derivada com 25 pontos. Nos
dados de MIR foi aplicada a centralização na média, normalização (0-1) e
60
primeira derivada com 5 pontos. Já os dados de RMN foram normalizados
(0-1) e suavizados com o filtro Savitzky-Golay (21).
Para a aplicação da regressão por mínimos quadrados parciais (PLS)
foram construídas matrizes onde os sinais analíticos (espectros) de NIR,
MIR e RMN-dt foram utilizados para a construção da matriz X, contendo as
variáveis independentes. A matriz Y foi construída com os dados obtidos
pelas análises químicas de referência, que são as variáveis dependentes. A
aplicação do PLS nas matrizes X e Y foi realizada para obtenção da
correlação entre os espectros e os dados de qualidade dos frutos. Para a
construção dos modelos PLS de cada parâmetro de qualidade o conjunto
total de dados foi dividido aleatoriamente em dois grupos. Onde 70% dos
dados formaram o grupo de calibração e validação interna (com teste de
validação interna cruzada leave-one-out) os outros 30% formaram o conjunto
de validação externa (ou predição).
A aplicação do método de PLS resulta em valores que possibilitam a
avaliação da precisão e aplicabilidade dos modelos construídos. Esses
resultados são: coeficientes de correlação de Pearson (r) da calibração (r
Cal), validação (r Val) e predição (r), assim como, os erros quadráticos médios
da calibração (RMSEC), validação (RMSEV) e predição (RMSEP).
3. Resultados e discussão
3.1 Caracterização das amostras
Os resultados da caracterização das amostras de laranjas estão
apresentados na tabela 2. De acordo com padrões de diâmetro equatorial
determinados pelo CODEX as laranjas utilizadas neste estudo pertenciam as
61
classes 3 (80 – 93 mm), 6 ( 70 – 80 mm) 12 ( 56 – 63 mm) (28). A grande
variação no diâmetro e coloração deve-se a utilização de laranjas de
floradas distintas.
Tabela 2: Resultados da caracterização das amostras de laranja.
Média ± dp Intervalo
Diâmetro (mm) 71,17 ± 4,18 63,80 - 80,38
Coloração flavedo (°hue) 91,99 ± 10,07 76,00 - 108,62
Dp = desvio padrão
Observando a amplitude de variação do ângulo hue pode-se observar
que foram utilizados frutos desde mais verdes (76,00°) até frutos com
coloração amarela acentuada (108,62°). Esses valores estão de acordo com
os valores do ângulo hue apresentados por Arruda et al. (2009) e Miranda et
al. (2015). A variação da cor da casca de laranja está relacionada com os
diferentes estádios de maturação dos frutos em cada período de colheita.
Esta alta variabilidade torna o universo amostral efetivamente representativo,
sendo reflexo da variação real existente no campo.
3.2 Análises de referência
Para que os modelos de regressão desenvolvidos apresentem
aplicabilidade é necessário que o conjunto utilizado na calibração e predição
apresente amplitude mais próxima da variação real existente (7,26). Os
resultados das análises químicas de referência, tabela 3, mostram uma
grande amplitude de variação para os parâmetros pH e massa fresca
avaliados e utilizados para a criação dos modelos PLS nos conjuntos de
calibração/validação interna e de predição.
62
Tabela 3: Análise estatística dos conjuntos de calibração com validação
interna e predição: média, desvio padrão e intervalo de dados.
Calibração e Validação Predição
Parâmetro Método N Média ± dp Intervalo N Média ± dp Intervalo
NIR 312 8,18± 1,03 4,80 - 11,48
134 8,18± 1,12 4,50 - 10,95
SST (° BRIX) MIR 311 8,18± 1,03 5,46 - 11,48
134 8,17± 1,14 4,50 - 11,13
RMN 282 8,25± 1,04 4,50 - 11,13
122 7,96± 1,05 4,80 - 10,34
NIR 312 3,61± 0,40 2,67 - 4,79
134 3,57± 0,42 2,73 - 4,97
pH MIR 311 3,59± 0,42 2,76 - 4,97
134 3,60± 0,37 2,72 - 4,15
RMN 282 3,6± 0,41 2,67 - 4,97
122 3,63± 0,38 2,70 - 4,79
Massa fresca (g) NIR 312 195,91± 40,12 93,72 - 282,69
134 194,95± 40,18 100,33- 286,49
MIR 311 194,99± 40,98 93,72 - 286,49
134 196,99± 38,22 100,33 - 282,69
RMN 282 194,15± 40,08 93,72 - 286,49
122 200,21± 37,40 106,33 - 270,26
SST = teor de sólidos solúveis; N = universo amostral; dp = desvio padrão.
No caso dos sólidos solúveis a variação da qualidade das amostras
diferiu da relatada em trabalhos similares (30,31). A alta incidência de
chuvas durante o período de cultivo das laranjas pode ter influenciado os
frutos deste conjunto. O teor de SST do suco das laranjas depende do
estádio de maturação em que os frutos foram colhidos, das condições
climáticas em que se desenvolveram e da diferença entre as cultivares (32).
O pH médio foi de 3,60, caracterizando frutos menos ácidos de acordo com
TING (1969). Para este autor, valores de pH acima de 3,5 são parâmetro
para identificação de frutos cítricos relativamente menos ácidos.
Os resultados de massa fresca apresentaram amplitude de variação
de 93,72 até 286,69 g. Estes valores estão próximos aos encontrados por
ARRUDA e colaboradores (2009) em estudos da qualidade físico-química de
laranjas ‘Valência’ e de Magwaza e colaboradores (2013) ao avaliar por meio
de NIR a qualidade de laranjas da mesma variedade.
63
Os valores médios de todos os parâmetros não apresentaram
diferença significativa (p < 0,05) entre as técnicas diferentes, sinalizando que
os conjuntos de calibração e predição apresentavam-se equivalentes.
3.3 Análise de Componentes Principais (PCA)
A análise de componentes principais com os espectros de MIR
mostrou o potencial de modelagem de cada variável (figura 1), com os
valores da potência de modelagem de cada uma das 450 variáveis foi
possível realizar a seleção delas. Quanto mais próximo de 1 maior o
potencial daquela variável no modelo. Foi realizada a exclusão das variáveis
dos intervalos de 3656 a 4000 cm-1 e 2777 a 1773 cm-1, pois está região de
absorção resultou em potenciais de modelagem abaixo de 0,4, portanto, não
apresentam relação com os parâmetros de qualidade avaliados.
Figura 1: Gráfico do potencial de modelagem das variáveis de MIR depois da PCA.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Po
de
r d
e m
od
ela
ge
m
Nْ mero de onda (cm-1)
Excluídas
64
Foi realizada a PCA para os parâmetros de referência (SST, pH e
massa) onde as amostras foram classificadas de acordo com o período de
colheita (colheita1, 2, 3 e 4) com a finalidade de observar se ocorreria uma
separação das amostras para esses parâmetros devido ao ponto de
maturação da fruta. Diferentes pré-processamentos foram aplicados,
buscando obter melhor separação entre as classes. Os melhores resultados
foram obtidos com a centralização na média, que padroniza e facilita a
visualização dos dados (NICOLAI, 2007). Na figura 2 é possível observar
que o período da colheita não separou totalmente as amostras e que a
componente principal 1 foi responsável por explicar 99,9% da variação
encontrada no modelo.
Figura 2: Análise de componentes principais realizada para SST, pH e massa com 4 classes
de colheitas pré-definidas.
Para a PCA realizada com os sinais espectroscópicos foram criadas
classes para os parâmetros SST, pH e massa fresca. A análise realizada
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
-100 -50 0 50 100
PC
2 (
0.1
%)
PC 1 (99.9%)
Colheita 1
Colheita 2
Colheita 3
Colheita 4
65
com os decaimentos de RMN para o parâmetro teor de sólidos solúveis
mostrou que a CP 1 separou as classes 1 e 2 em dois grupos com 91,6% de
explicação da variação. Onde a classe 1 correspondeu a amostras abaixo da
média (8,25° BRIX) de SST e a classe 2 foi composta por frutos que
apresentaram valores acima ou iguais a média (Figura 3). A separação das
classes não foi mais acentuada, pois a amplitude de variação de SST do
conjunto total de amostras não abrangeu toda variantes necessárias para
isto fosse possível. Com isso algumas amostras exibiam similaridades
mesmo estando em classes distintas.
Figura 3: Gráfico de scores da PCA realizada com os sinais de decaimento de RMN com duas
classes de SST.
A separação verificada na tabela 2 pode ser atribuída a diferentes
tempos de decaimentos CPMG obtidos por RMN-dt em laranjas contendo
teores de sólidos solúveis distintos. Quanto maior o teor de SST em um
sistema menor será o tempo de decaimento CPMG (PEREIRA, 2014), pois
-0,6
-0,4
-0,2
-1E-15
0,2
0,4
0,6
-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2
PC
2 (
6,5
%)
PC 1 (91,6%)
Classe 1
Classe 2
66
altera a viscosidade da água dentro do sistema ou fruta. Isso é observado na
Figura 4 onde temos o tempo de decaimento CPMG dependente do tempo
de relaxação transversal (T2) para duas laranjas distintas, uma com alto teor
de SST (11,13° BRIX) e outra com baixo (4,5° BRIX).
Figura 4: Decaimento CPMG de duas laranjas com teor de sólidos solúveis (SST) distintos.
A Figura 5 apresenta a Análise de Componentes Principais de NIR-
SST, MIR-pH e RMN-massa. Na figura 4A, temos a PCA obtida com os
sinais de RMN para o parâmetro de qualidade massa fresca dos frutos. Na
classe 1 foram representadas as laranjas que apresentavam massa fresca
acima da média (194 g) enquanto que a classe 2 compreendeu aquelas
abaixo ou iguais a média. Observou-se que a componente principal 1 é
responsável por explicar 91,6% da variação do modelo. Os sinais das
amostras apresentaram-se similares, ou seja, a distribuição das amostras, a
partir dos tempos de decaimentos CPMG, não apresentou separação em
laranjas com mais ou menos massa fresca.
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Inte
nsid
ad
e
Tempo (µs)
4.5° BRIX
11.13° BRIX
67
Figura 5: Análise de componentes principais das amostras de laranja com os espectros de (A) RMN com as duas classes de massa fresca, (B) NIR com as duas classes de SST e (C) MIR com as duas classes de pH.
-0,6
-0,4
-0,2
-1E-15
0,2
0,4
0,6
-1,5 -0,5 0,5 1,5
PC
2 (
6.5
%)
PC 1 (91.6%)
A
Classe 1
Classe 2
-0,03
-0,02
-0,01
0
0,01
0,02
0,03
-0,06 -0,01 0,04 0,09
PC
2 (
14
,6%
)
PC 1 (80.1%)
B
Classe 1
Classe 2
-0,03
-0,02
-0,01
0
0,01
0,02
0,03
-0,03 -0,01 0,01 0,03
PC
2 (
31
.3%
)
PC 1 (37.8%)
C
Classe 1
Classe 2
68
Os resultados da PCA feita com os espectros de Infravermelho
próximo, figura 4B, não mostrou separação das amostras nas classes pré-
definidas. A classe 1 representou as laranjas com SST acima da de 8,18°
BRIX e as amostras da classe 2 foram compostas por frutos com SST
abaixo ou igual a média. A CP 1 foi responsável por explicar 80,1% da
variação total encontrada.
A PCA com os espectros de MIR com classificação para o valor de pH,
figura 4C, mostrou uma tendência de separação entre as classes com pH
acima e abaixo da média (3,59), classe 1 e 2 respectivamente. Porém, a
componente principal 1 explica uma porcentagem pequena da variação,
37,8%. Na figura 6 estão os espectros de MIR de laranja com altos valores
de pH (4,9 e 4,7) e amostras com baixos valores (2,7 e 2,74), observa-se
que os picos de absorbância são mais intensos nos espectros de amostras
que apresentavam sucos mais ácidos. Laranjas com menor pH apresentam
uma maior concentração de íons H+ do que aquelas com valores mais altos
de pH, menos ácidas.
69
Figura 6: Espectros de MIR de laranjas com diferentes valores de pH.
3.4 Modelos PLS NIR, MIR e RMN: SST, pH e massa fresca
Os resultados dos modelos PLS desenvolvidos para cada parâmetro
com as diferentes técnicas não destrutivas estão descritos na Tabela 4.
Nota-se que os modelos PLS apresentaram forte correlação de Pearson (0,7
> rVal < 0,9) entre os valores preditos pelo modelo e os medidos pelas
análises de referência.
Tabela 4: Resultados dos modelos PLS construídos com os sinais analíticos de NIR, MIR e RMN.
Calibração e validação interna
Parâmetro Método N Fatores RMSEC r Cal RMSEV r Val
NIR 312 10 0,76 0,81 0,67 0,76
SST (°BRIX) MIR 311 10 0,75 0,69 0,87 0,55
RMN 282 5 0,82 0,63 0,87 0,55
NIR 312 7 0,26 0,78 0,27 0,74
pH MIR 311 9 0,20 0,88 0,22 0,86
RMN 282 4 0,28 0,73 0,29 0,70
NIR 312 8 24,53 0,80 26,44 0,75
Massa fresca (g) MIR 311 8 24,24 0,81 25,83 0,78
RMN 282 5 22,93 0,82 23,90 0,80
SST = Sólidos solúveis totais; RMSEV e RMSEC = erros quadráticos médios de validação e calibração; r Val e r Cal =
coeficiente de correlação de Pearson da validação e calibração; n = universo amostral.
0 100 200 300 400 500
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Abso
rbâ
ncia
Nْ mero de onda (cm-1)
2,70
4,90
4,70
2,74
70
Na etapa de calibração apenas os modelos MIR e RMN para sólidos
solúveis não apresentaram coeficiente de correlação forte (acima de 0,70).
Porém, como os resultados dos erros quadráticos médios de validação
interna foram baixos foi realizada a etapa de predição (ou validação
externa).
Os resultados da validação externa dos modelos desenvolvidos estão
na tabela 5. É possível observar os valores de erros quadráticos médios de
predição e coeficiente de correlação, dois resultados importantes para
avaliação dos modelos de predição.
Tabela 5: Resultados da validação externa (predição) dos modelos PLS construídos
com os sinais analíticos de NIR, MIR e RMN.
Predição
Parâmetro Método N Fatores RMSEP R
NIR 134 10 0,74 0,75
SST (°BRIX) MIR 134 10 0,96 0,55
RMN 122 5 0,86 0,61
NIR 134 7 0,25 0,80
pH MIR 134 9 0,20 0,86
RMN 122 4 0,27 0,72
NIR 134 8 28,02 0,73
Massa (g) MIR 134 8 25,55 0,76
RMN 122 5 21,41 0,82
SST = Sólidos solúveis totais; SEP = erro padrão da predição; r = coeficiente de correlação de Pearson da predição; n = universo amostral.
Para cada parâmetro uma técnica distinta resultou em um modelo
mais preciso e com maior correlação. A Figura 5 mostras os gráficos dos
valores preditos pelos modelos e os valores medidos pelas análises de
referência para os modelos mais precisos para cada parâmetro de
qualidade.
71
Figura 5: Gráficos dos valores medidos pelas análises de referência e preditos pelos
modelos PLS. (A) PLS - NIR para SST, (B) PLS - MIR para pH e (C) PLS - RMN para massa fresca.
4 5 6 7 8 9 10 11 12
5
6
7
8
9
10
Pre
dic
ted
(°B
RIX
)
Measured (°BRIX)
2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
Pre
dic
ted
(p
H)
Measured (pH)
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
100
120
140
160
180
200
220
240
260
Pre
dic
ted
(g
)
Measured (g)
72
Em relação à determinação de SST a aplicação de NIR resultou em
um modelo de predição com RMSEP mais baixo, 0,74º BRIX, e em uma
correlação mais forte com r 0,75. Outros estudos demonstram a
aplicabilidade desta técnica em determinar o teor de sólidos solúveis em
frutas intactas. LIU e colaboradores (2010), Pissard (2013), SÁNCHEZ
(2012) e FLORES (2015) avaliaram a técnica de NIR na construção de
modelos para determinar conteúdo de açúcar em laranjas intactas e
obtiveram resultados positivos, assim como o deste estudo. Utilizando outros
modelos vegetais, Nascimento e colaboradores (2016) desenvolveram um
modelo robusto para predição de SST em pêssegos, com RMSEP = 1,02 e
coeficiente de correlação de 0,67. Oliveira (2014) avaliou a aplicação de
NIR para determinar SST em tomates e damascos intactos.
Mesmo apresentando coeficientes de correlação moderados (0,55 e
0,61) as técnicas de MIR e RMN apresentaram modelos com erros baixos.
Deste modo, essas técnicas apresentaram aplicabilidade na análise de
qualidade de frutas intactas. Flores e colaboradores (2016) aplicando RMN-
dt construíram modelos com poder de aplicação na classificação de laranjas
intactas em duas classes de SST e Pereira e colaboraderes (2013) e Zion e
colaboradores (1995) classificaram ameixas intactas de acordo com seu teor
de doçura (utilizando o valor de SST).
Para a determinação do potencial hidrogeniônico os três métodos
avaliados apresentaram modelos de predição com valores baixos de
RMSEP e forte correlação entre os sinais espectrais e os valores de
73
referência. Resultando assim em modelos de regressão com fortes
correlações e precisão.
Dentre os métodos, a técnica de MIR apresentou o melhor resultado
na determinação do pH de laranjas intactas. Os modelos PLS – MIR
desenvolvidos para esse parâmetro possuem erro de predição de 0,20 e
uma forte correlação de 0,86. Poucos estudos existem com a aplicação de
MIR para determinar atributos de qualidade em frutas intactas. Estes
resultados estão de acordo com o encontrado por FLORES (2015), onde
determinou o pH por MIR em laranjas ‘Valência’ e ‘Hamlin” intactas.
Em relação aos modelos para determinar a massa fresca das
laranjas, as três técnicas se mostraram adequadas. Contudo, a aplicação de
RMN resultou em um modelo de regressão com RMSEP mais baixo, 21,41
gramas, forte correlação de Pearson, r = 0,82. A utilização destes modelos
para determinação da massa fresca pode ser útil em uma linha de produção
onde apenas uma leitura poderia resultar na determinação de todos os
parâmetros ao mesmo tempo, sem a necessidade de se realizar a pesagem
separadamente.
4. Conclusões
Para cada determinação de qualidade em laranjas intactas - SS, pH e
massa fresca - uma técnica distinta de espectroscopia obteve os melhores
resultados. Para a determinação do teor de sólidos solúveis a aplicação de
NIR foi mais adequada (RMSEP = 0,74° BRIX e r = 0,75). Para pH o modelo
com menor RMSEP (0,20) e maior correlação (0,86) foi aquele construído
com o MIR, enquanto que para a determinação de massa fresca a RMN se
74
mostrou mais adequada com RMSEP de 21,41 gramas e r 0,82 . Os
modelos PLS desenvolvidos resultaram em alta correlação e valores de
erros baixos
A aplicação das técnicas de NIR, MIR e RMN na determinação de
SST, pH e massa fresca mostrou-se uma alternativa na análise de qualidade
não destrutivas de laranjas intactas.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
de São Paulo (FAPESP - 13/23479-0) e a Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro.
Referências
1. CitrusBR. Associação Nacional dos Exportadores de Sucos Cítricos.
2011. A Indústria Brasileira de suco de laranja.
http://www.citrusbr.com/noticias/?id=267491. (accessed 10.03.16).
2. FAO. Faostat Agriculture Data [Internet]. Food and Agriculture
Organization. 2015 [cited 2015 Jan 10]. Available from:
http://faostat.fao.org
3. Kader AA. Postharvest Technology of Horticultural Crops. trird.
University of California. Agriculture ans Natural Resources; 2002.
4. Falguera V, Ibarz A. Juice Processing: Quality, Safety and Value-
Added Opportunities. CRC Press; 2014.
5. Nelson DL, Cox M. Lehninger – Princípios de Bioquímica. 3a ed. São
Paulo: Sarvier; 2002. 1009 p.
6. Kimball D. Citrus Processing [Internet]. New York: Springer
Netherlands; 1991.
75
7. Nicolai BM, Beullens K, Bobelyn E, Peirs A, Saeys W, Theron KI, et al.
Nondestructive measurement of fruit and vegetable quality by means of
NIR spectroscopy: A review. Postharvest Biol Technol. 2007
Nov;46(2):99–118.
8. Dufóur É. Principles of Infrared Spectroscopy. Infrared Spectrosc Food
Qual Anal Control. 2009.
9. Betemps DL, Fachinello JC, Galarça SP, Machado NP, Remorini D,
Massai R, et al. Espectroscopia do visível e infra-vermelho próximo
para estimar sólidos solúveis e firmeza de polpa em função da época
de colheita em pêssegos. Semina Ciências Agrárias. 2014 Jun
23;35(3):1257.
10. Cayuela Sánchez JA. Citrus Internal Quality Predictions by NIR
Spectroscopy. 2008;
11. Kawano S, Fujiwara T. Determination Content in Satsuma Mandarin
Near Infrared ( NIR ) Transmittance. J Japanese Soc Hortic Sci.
1993;62(2):465–70.
12. Guthrie JA, Walsh KB, Reid DJ, Liebenberg CJ. Assessment of internal
quality attributes of mandarin fruit. 1. NIR calibration model
development. Aust J Agric Res. 2005;56(4):405.
13. Gómez AH, He Y, Pereira AG. Non-destructive measurement of
acidity, soluble solids and firmness of Satsuma mandarin using
Vis/NIR-spectroscopy techniques. J Food Eng. 2006 Nov;77(2):313–9.
76
14. Duarte IF, Barros A, Delgadillo I, Almeida C, Gil AM. Application of
FTIR spectroscopy for quantification of sugars in mango juice as a
function of ripening. J Agric Food Chem. 2002;50:3104–11.
15. Snyder AB, Sweeney CF, Rodriguez-Saona LE, Giusti MM. Rapid
authentication of concord juice concentration in a grape juice blend
using Fourier-Transform infrared spectroscopy and chemometric
analysis. Food Chem [Internet]. 2014 Mar;147:295–301. Available
from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814613014052
16. Rodriguez-Saona LE, Allendorf ME. Use of FTIR for rapid
authentication and detection of adulteration of food. Annu Rev Food
Sci Technol. 2011 Jan;2:467–83.
17. Cadavid AS. Multicomponent Quality Control Analysis for the Tomato
Industry Using Portable Mid-Infrared (MIR) Spectroscopy THESIS. The
Ohio State University; 2014.
18. Skoog DA. Princípios de Análise Instrumental. 5a ed. Bookman, editor.
2002.
19. Gil VMS. Ressonância magnética nuclear: fundamentos, métodos e
aplicações. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian; 1987. 1012 p.
20. Macedo PS. APLICAÇÃO DE IMAGENS DIGITAIS E TÉCNICAS
ESPECTROANALÍTICAS COMBINADAS COM QUIMIOMETRIA
PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ADULTERAÇÃO EM
LEITE BOVINO. Universidade Federal de São Carlos (UFSCar); 2013.
21. Colnago LAC, Forato LA, Bernardes Filho R. Análise da Qualidade de
Frutas por Ressonância MAgnética Nuclear. In São Carlos; 2011.
77
22. Santos PM. Desenvolvimento da técnica de precessão livre no estado
estacionário para aumento da razão sinal ruído em espectros de RMN
de alta resolução. INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS. 2009.
23. Santos S. Desenvolvimento de Métodos de RMN para Controle de
Qualidade de Produtos Farmacêuticos e Agrícolas. 2014;
24. Pereira FMV, Carvalho ADS, Cabeça LF, Colnago LA. Classification of
intact fresh plums according to sweetness using time-domain nuclear
magnetic resonance and chemometrics. Microchem J [Internet] 2012.
25. Flores DWM, Colnago LA, Ferreira MD, Spoto MHF. Prediction of
Orange juice sensorial attributes from intact fruits by TD-NMR.
Microchem J. 2016;128:113–7.
26. Flores DWM. Sistemas não invasivos para classificação de laranjas
por meio de parâmetros físico-químicos [Dissertação Mestrado] -
Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”; 2015.
27. AOAC. Official Methods of analysis of the Association of Analytical
Chemists International. 14a ed. Washington; 1992.
28. CODEX. CODEX ALIMENTARIUS STANDARD 245 - 2004. 2004 p. 2–
7.
29. Miranda M, Spricigo PC, Ferreira MD. Mechanical damage during
harvest and loading affect orange postharvest quality. Eng Agrícola.
Associação Brasileira de Engenharia Agrícola; 2015;35(1):154–62.
30. Liu Y, Sun X, Ouyang A. Nondestructive measurement of soluble solid
content of navel orange fruit by visible–NIR spectrometric technique
78
with PLSR and PCA-BPNN. LWT - Food Sci Technol. Elsevier Ltd;
2010 May;43(4):602–7.
31. Arruda MC, Fischer IH, Zanette MM, Lourenço B. Qualidade físico
química de frutos de laranja Valência provenientes de cultivos orgânico
e convencional. 2009;
32. Serciloto CM, Castro PRC, Tavares S. Efeitos de mbta [cloridrato de
n,n-dietil-2-(4-metilbenziloxi) etilamina] na produtividade e na
qualidade dos frutos da laranjeira “pêra” (Citrus sinensis L. Osbeck).
Rev Bras Frutic. 2008 Sep;30(3):596–603.
33. Ting SV. Distribution of soluble components and quality factors in the
edible portion of citrus fruits. J Sci Hortic. 1969;32:515–9.
34. Magwaza LS, Opara UL, Terry LA, Landahl S, Cronje PJR, Nieuwoudt
HH, et al. Evaluation of Fourier transform-NIR spectroscopy for
integrated external and internal quality assessment of Valencia
oranges. J Food Compos Anal. 2013 Aug;31(1):144–54.
35. Liu Y, Gao R, Hao Y, Sun X, Ouyang A. Improvement of Near-Infrared
Spectral Calibration Models for Brix Prediction in “Gannan” Navel
Oranges by a Portable Near-Infrared Device. Food Bioprocess
Technol. 2010 Oct 15;5(3):1106–12.
36. Pissard A, Fernández Pierna JA, Baeten V, Sinnaeve G, Lognay G,
Mouteau A, et al. Non-destructive measurement of vitamin C, total
polyphenol and sugar content in apples using near-infrared
spectroscopy. J Sci Food Agric. 2013;93(2):238–44.
79
37. Sánchez MT, De la Haba MJ, Serrano I, Pérez-Marín D. Application of
NIRS for Nondestructive Measurement of Quality Parameters in Intact
Oranges During On-Tree Ripening and at Harvest. Food Anal Methods.
2012 Aug 17;6(3):826–37.
38. Nascimento PAM, Carvalho LC de, Cunha-Júnior LC, Pereira FMV,
Teixeira GHA. Robust PLS models for soluble solids content and
firmness determination in low chilling peach using near-infrared
spectroscopy (NIR). Postharvest Biol Technol. 2016;111:345–51.
39. de Oliveira GA, Bureau S, Renard CM-GC, Pereira-Netto AB, de
Castilhos F. Comparison of NIRS approach for prediction of internal
quality traits in three fruit species. Food Chem. Elsevier Ltd; 2014 Jan
15;143:223–30.
40. Zion B, Chen P, McCarthy MJ. Nondestructive quality evaluation of
fresh prunes by NMR spectroscopy. J Sci Food Agric. 1995;67(4):423–
9.
80
Considerações Finais
Este estudo resultou na comprovação de que as técnicas
espectroscópicas podem ser uma forma alternativa aplicável e rápida
para analisar parâmetros de qualidade em laranjas intactas. Sendo que
cada técnica mostrou maior adequabilidade para uma determinada
análise de qualidade.
A aplicabilidade das técnicas espectroscópica de NIR e MIR para
determinar vitamina C, ácido cítrico e açúcares em laranjas intactas foi
avaliada. Assim como, o desempenho de calibração e de predição dos
modelos PLS desenvolvidos com diferentes regiões do espectro. Em
relação à determinação de açúcares, a técnica de NIR não resultou em
modelos precisos. Já a utilização de MIR para a predição de sacarose,
glicose e açúcares totais apresentaram baixos erros de predição 11,69,
7,79 e 24,28 (g L-1) e coeficientes de correlação de forte a moderado.
A partir dos resultados obtidos pode ser apontado que as técnicas de
NIR e MIR mostraram-se métodos adequados para determinação de
vitamina C e ácido cítrico em laranjas intactas. A técnica de MIR
apresentou resultado mais preciso, representado por menores valores de
RMSEP e correlações mais fortes para vitamina C e para ácido cítrico.
A aplicação das técnicas de NIR, MIR e RMN na determinação de
SST, pH e massa fresca foi e mostrou-se uma possível alternativa na
análise de qualidade de laranjas sem que seja necessária a destruição
das amostras. Os modelos PLS desenvolvidos para estes parâmetros
resultaram em alta correlação e valores de erros baixos.
81
Cada uma das técnicas se mostrou mais apropriada a um parâmetro
distinto. Para determinar o teor de sólidos solúveis a aplicação de NIR se
mostrou mais adequada (RMSEP = 0,74 °BRIX e r = 0,75), para pH o
modelo com menor RMSEP (0,20) e maior correlação (0,86) foi aquele
construído com o MIR e para a determinação de massa fresca a RMN se
mostrou mais adequada com RMSEP de 21,41 gramas e r de 0,82 .
82
Referências
1. IBGE. Levantamento sistemático de produção agrícola [Internet]. 2013.
Available from: www . ibge . gov . br
2. FAO. Faostat Agriculture Data [Internet]. Food and Agriculture
Organization. 2015 [cited 2015 Jan 10]. Available from:
http://faostat.fao.org
3. USDA. United States Departament of Agriculture [Internet]. 2015 [cited
2015 Dec 10]. Available from: http://www.usda.gov
4. Neves MF et al. O Retrato da Citricultura Brasileira. [Internet]. Ribeirão
Preto; 2010. Available from:
http://www.citrusbr.com/download/biblioteca/Apresentacao_Marcos_Fa
va_evento_valor.pdf
5. Swingle WT. The Botany of Citrus and Its Wild Relatives. In: 2a ed.
Berckley: University of California; 1967. p. 190–430.
6. IAC. CITROS: principais informações e recomendações de cultivo.
2005;
7. Chitarra MIF, Chitarra AB. Pós-colheita de frutas e hortaliças: fisiologia
e manuseio. 2a EDIÇÃO. Lavras: FAEPE, editor. 2005; 2005. 783 p.
8. Spoto MFH, Regiano-D’arce MAB, Oetterer M. Fundamentos de
ciência e tecnologia de alimentos. 1a ed. Barueri: Manole; 2006.
9. Ramalho ASTM. QUALIDADE A SER UTILIZADO COMO PADRÃO
NA CADEIA DE COMERCIALIZAÇÃO DE LARANJA PÊRA Citrus
sinensis L . Osbeck. [Dissertação] Escola Superior de Agricultura Luiz
de Queiroz (ESALQ); 2005.
83
10. Nelson DL, Cox M. Lehninger – Princípios de Bioquímica. 3a ed. São
Paulo: Sarvier; 2002. 1009 p.
11. CitrusBR. Associação nacional dos exportadores de sucos cítricos
[Internet]. 2016 [cited 2016 Feb 11]. Available from:
http://www.citrusbr.com/laranjaesuco/?ins=16
12. Yahia EM, Organelas-Paz J, Gonzales-Aguiar GA. Nutricional and
health-promoting properties of tropical and sub-tropical fruits. In:
Postharvest biology and technology of tropical and subtropical fruits. 3a
ed. Cambridge: Woodhead Publishing Limited; 2011.
13. Kelebek H, Selli S, Canbas SA, Carabaroglu T. HPLC determination of
organic acids, sugars, phenolic compositions and antioxidant capacity
of orange juice and orange wine made from a Turkish cv. Kozan.
Microchem J. Elsevier B.V.; 2009;91(2):187–92.
14. Cayela Sánchez JA. Citrus Internal Quality Predictions by NIR
Spectroscopy. Glob Sci Books. 2008;(1):77–82.
15. Sun D-W, Huang Y, Rasco BA, Cavinato AG. Infrared Spectroscopy
Food Qual Anal Control. 2009;355–75.
16. Huang H, Yu H, Xu H, Ying Y. Near infrared spectroscopy for on/in-line
monitoring of quality in foods and beverages: A review. J Food Eng.
2008;87(3):303–13.
17. Coates J. Vibrational spectroscopy: Instrumentation for infrared and
Raman spectroscopy. 2a ed. Analytical Instrumentation Handbook.
1997.
84
18. Dufour É. Principles of Infrared Spectroscopy. Infrared Spectrosc Food
Qual Anal Control. 2009;
19. Rodriguez-SaonaL et al. Fourier Transform Infrared (FTIR)
Spectroscopy. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis and
Control. 2009. 145-178 p.
20. De Oliveira GA, De Castilhos, Renard CMGCF, Bureau S. Comparison
of NIR and MIR spectroscopic methods for determination of individual
sugars, organic acids and carotenoids in passion fruit. Food Res Int.
Elsevier B.V.; 2014 Jun;60:154–62.
21. Skoog DA, West DM, F.J. H, Crouch SR. Fundamentos de Química
Analítica. 8a ed. Norte-Americana, Thomson Learning SP, editor.
2006.
22. Skoog DA. Princípios de Análise Instrumental. 5a ed. Bookman, editor.
2002.
23. Pavia DL, Kris GS, Lampman GM, Vyvyan JR. Introdução à
espectroscopia. 1a ed. Cengage Learning; 2010. 716 p.
24. De Oliveira GA. DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS DE
QUALIDADE DO MARACUJÁ (Passiflora edulis f. Flavicarpa) POR
ESPECTROSCOPIA MID E NIR E CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA.
[Dissertação] Universidade Federal do Paraná; 2014.
25. Nicolai BM, Beullens K, Bobelyn E, Peirs A, Saeys W, Theron KI, et al.
Nondestructive measurement of fruit and vegetable quality by means of
NIR spectroscopy: A review. Postharvest Biol Technol. 2007
Nov;46(2):99–118.
85
26. Bellon-Maurel V, McBratney A. Near-infrared (NIR) and mid-infrared
(MIR) spectroscopic techniques for assessing the amount of carbon
stock in soils – Critical review and research perspectives. Soil Biol
Biochem. 2011 Jul;43(7):1398–410.
27. Holl JM. Basic Atomic and Molecular Spectroscopy. Cambridge: Royal
Society of Chemistry; 2002.
28. Ciurczak EW, Burns DA. Handbook of near-infrared analysis. 3a ed.
New York: CRC Press Taylor & Francis Group; 2007. 189-205 p.
29. Betemps DL, Fachinello JC, Galarça SP, Machado NP, REMORINI D,
Massai R, et al. Espectroscopia do visível e infra-vermelho próximo
para estimar sólidos solúveis e firmeza de polpa em função da época
de colheita em pêssegos. Semina Ciências Agrárias. 2014 Jun
23;35(3):1257.
30. Kawano S, Fujiwara T. Determination Content in Satsuma Mandarin
Near Infrared (NIR) Transmittance. J Japanese Soc Hortic Sci.
1993;62(2):465–70.
31. Guthrie JA, Walsh KB, Reid DJ, Liebenberg CJ. Assessment of internal
quality attributes of mandarin fruit. 1. NIR calibration model
development. Aust J Agric Res. 2005;56(4):405.
32. Gómez AH, He Y, Pereira AG. Non-destructive measurement of
acidity, soluble solids and firmness of Satsuma mandarin using
Vis/NIR-spectroscopy techniques. J Food Eng. 2006 Nov;77(2):313–9.
33. Shiroma-Kian C, De Nardo T, Halim Y, Francis D, Rodriguez-Saona L.
Rapid and simultaneous determination of lycopene and beta-carotene
86
contents in tomato juice by infrared spectroscopy. J Agric Food Chem.
2009 Feb 25;57(4):1105–12.
34. Ferreira DS. Aplicação de espectroscopia no infravermelho e análise
multivariada para previsão de parâmetros de qualidade em soja e
quinoa.[Tese] Universidade Estadual de Campinas; 2013.
35. Correa A C. Avaliação do uso de espectroscopia no infravermelho para
controle e garantia da qualidade da mistura biodiesel/diesel usando
cartas de controle multivariadas.[Monografia] Universidade Federal do
Rio Grande do Sul; 2012.
36. Dos Santos CAT, Lopo M, Páscoa RNMJ, Lopes JA. A review on the
applications of portable near-infrared spectrometers in the agro-food
industry. Appl Spectrosc. 2013 Nov;67(11):1215–33.
37. Brás L. P., Bernadino S. A., Lopes J. A., & Menezes JC. Multiblock
PLS as an proach to compare and combine NIR and MIR spectra in
calibrations of soybean flour. Chemom Intell Lab Syst. 2005;75:91–9.
38. Duarte IF, Barros A, Delgadillo I, Almeida C, Gil AM. Application of
FTIR spectroscopy for quantification of sugars in mango juice as a
function of ripening. J Agric Food Chem. 2002;50:3104–11.
39. Snyder AB, Sweeney CF, Rodriguez-Saona LE, Giusti MM. Rapid
authentication of concord juice concentration in a grape juice blend
using Fourier-Transform infrared spectroscopy and chemometric
analysis. Food Chem [Internet]. 2014 Mar;147:295–301. Available
from: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0308814613014052
87
40. Macedo PS. APLICAÇÃO DE IMAGENS DIGITAIS E TÉCNICAS
ESPECTROANALÍTICAS COMBINADAS COM QUIMIOMETRIA
PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ADULTERAÇÃO EM
LEITE BOVINO. [Tese] Universidade Federal de São Carlos (UFSCar);
2013.
41. Allendorf M, Subramanian A, Rodriguez-Saona L. Application of a
Handheld Portable Mid-Infrared Sensor for Monitoring Oil Oxidative
Stability. J Am Oil Chem Soc [Internet]. 2012 Jan 2;89(1):79–88.
Available from: http://link.springer.com/10.1007/s11746-011-1894-9
42. Rubio-Diaz DE, FrancisS DM, Rodriguez-Saona LE. External
calibration models for the measurement of tomato carotenoids by
infrared spectroscopy. J Food Compos Anal. Elsevier Inc.; 2011
Feb;24(1):121–6.
43. Cadavid AS. Multicomponent Quality Control Analysis for the Tomato
Industry Using Portable Mid-Infrared (MIR) Spectroscopy THESIS. The
Ohio State University; 2014.
44. Tipler PA, Llewellwn RA. Física moderna. 3a ed. LTC R de janeiro:,
editor. 2006. 515 p.
45. Gil VMS. Ressonância magnética nuclear: fundamentos, métodos e
aplicações. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian; 1987. 1012 p.
46. Santos PM. Desenvolvimento da técnica de precessão livre no estado
estacionário para aumento da razão sinal ruído em espectros de RMN
de alta resolução. [Dissertação] INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO
CARLOS. 2009.
88
47. Santos MDS. Desenvolvimento de Métodos de RMN para Controle de
Qualidade de Produtos Farmacêuticos e Agrícolas. [Tese]
Universidade de São Paulo; 2014.
48. Pereira FMV, Carvalho ADS, Cabeça LF, Colnago LA. Classification of
intact fresh plums according to sweetness using time-domain nuclear
magnetic resonance and chemometrics. Microchem J [Internet].
Elsevier B.V.; 2013;108:14–7. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.microc.2012.12.003
49. Flores DWM, Colnago LA, Ferreira MD, Spoto MHF. Prediction of
Orange juice sensorial attributes from intact fruits by TD-NMR.
Microchem J. 2016;128:113–7.
50. Flores DWM. Sistemas não invasivos para classificação de laranjas
por meio de parâmetros físico-químicos. [Dissertação] Universidade de
São Paulo Escola Superior de Agricultura “ Luiz de Queiroz ”; 2015.
51. Nicolai BM, Defraeye T, De Ketelaere B, Herremans E, Hertog
MLATM, Saeys W, et al. Nondestructive measurement of fruit and
vegetable quality. Annual review of food science and technology. 2014.
285-312 p.
52. Lavine BK. Chemometrics. Anal Chem. 1998 Jun;70(12):209–28.
53. Romía MB, Bernárdez MA. Infrared Spectroscopy for Food Quality
Analysis and Control. Infrared Spectroscopy for Food Quality Analysis
and Control. 2009. 51-82 p.
54. Geladi P, Kowalski BR. Partial least-squares regression: a tutorial. Anal
Chim Acta. 1986;185:1–17.
89
55. Beebe KR, Randy JP, Seasholtz MB. Chemometrics: A practical guide.
New York; 1998.
56. Varella CAA. Análise Multivariada Aplicada as Ciências Agrárias:
Análise de componentes principais. Universidade Federal do Rio de
Janeiro (UFRJ); 2008.