rio 2012 mirnas e cels tronco katlinbmassirer€¦ · 30/07/12 3 células tronco! hematopoiética!...

30/07/12

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MicroRNAs e células-‐tronco

Katlin B. Massirer Lab. de Regulação de RNA e microRNAs em Doenças Humanas

Rio-‐Julho 2012

[email protected]

Centro de Biologia Molecular e Engenharia Gené5ca

Graduação -‐ Farmácia -‐ Análises Clínicas

Mestrado -‐ Farmácia -‐ Biologia Molecular-‐RNA

Doutorado -‐ Biologia/Bioinformá5ca C. elegans miRNAs Pós – doc -‐ Med Regenera5va CTE, RBP, Bioinformá5ca

Lab: RBP, miRNA Doenças humanas

Lab. de Regulação de RNA e microRNAs em Doenças

Humanas

RBP

poliA RBP

RBP

Quais os componentes de complexos que ligam RNA? Quais os alvos e RBPs?

Lab. de Regulação de RNA e microRNAs em Doenças

Humanas

RBP

CTE

neurônios

neurônios

neurô

nios

neurô

nios

poliA RBP

RBP

Quais os componentes de complexos que ligam RNA? Quais os alvos e RBPs?

eIF4E

Sam68

Sarcomas

TET EWS

Translocação

QKI

Ataxias

ATXN2

PEM/SN

FXS

FMRP

TLS/FUS

hnRNP A2

FXTAS

DM

MBNL

SMN

SMA

OPMD PABN1

CUGBP1

FOX3

Argonautes

NOVA

Auto-imunidade

POMA

LIN28 FOX2

Câncer

Doenças neurológicas

Atrofias musculares

Células-tronco

ALS

TDP-43

hnRNP A1 SF2/ASF hnRNP K

DMPK

Proteínas de ligação a RNA e processos celulares

Figure 7-‐5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

“Central Dogma”


“Central Dogma” – passos de regulação


“Central Dogma”-‐ expandido

Transcrição Reversa

RNA polimerase Dependente de RNA

RNAs não-‐codificantes

Estrutura gênica

hYp://nitro.biosci.arizona.edu/courses/eeb600a-‐2003/lectures/lecture24/lecture24.html

7-‐methylguanylate cap

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Regulação de mRNAs-‐alvo específicos

~22nt - miRNAs!3’UTR

5’ 3’ seed

microRNAs: Descoberta e regulação Descoberta dos miRNAs em C. elegans

Regulação de mRNAs-‐alvo específicos

~22nt - miRNAs!3’UTR

Nature, 2000!

Cell, December 1993!

5’ 3’ seed

microRNAs: Descoberta e regulação

Processamento em miRNA precursor

RNaseIII! RNaseIII!

Drosha/DGCR8!

núcleo

citoplasma

Biogênese e processamento de microRNAs

miRNA primário CAP poliA

miRNA primário

Processamento em miRNA precursor

RNaseIII! RNaseIII!

Ago-RISC!!

RNaseIII! RNaseIII!

Dicer!

Maturação em miRNAs 22nt

Regulação específica de mRNAs-‐alvo

~22nt miRNAs!5’ 3’ seed

3’UTR

núcleo

citoplasma

CAP poliA

Biogênese e processamento de microRNAs

Drosha/DGCR8!

let-7 miRNA!

Nív

el P

rote

ico

Proteína!LIN-41!

Desenvolvimento larval!

L3! L4!L2! L1!

5’UUAUACAACC CUACCUCA3’ 5’UUAUACAACC CUGCCUC3’!GUU! A!

AU!

AUU!

AU!

lin-41 3’ UTR!let-7 RNA! 3’UUGAUAUGUUGG GAUGGAGU5’ 3’UUGAUAUGUUGG GAUGGAGU5’!

Slack et al., 2000; Reinhart et al., 2000!

miRNAs inicialmente descrito: regulação por inibição da tradução

miRNAs exercendo: regulação por degradação de mRNAs-‐alvo

Bagga et al., Cell 2005!

Organismo: C. elegans

Northern acrilamida-‐ microRNA sonda seq complementar a let-‐7 ~22nt

Northern agarose-‐ alvo do miRNA sonda seq complementar a lin-‐14

Northern acrilamida-‐ controle no gel rRNA de ~120nt

Northern agarose-‐ controle membrana sonda seq complementar a eg-‐2

Northern agarose-‐controle no gel


stages of larval!Development-!

Larva:!

stages of larval!Development-!

Larva:!

miRNAs exercendo: regulação por degradação de mRNAs-‐alvo

Organismo: C. elegans

Northern acrilamida-‐ microRNA sonda seq complementar a let-‐7 ~22nt


Northern acrilamida-‐ controle no gel rRNA de ~120nt

Northern agarose-‐ controle membrana sonda seq complementar a eg-‐2

Northern agarose-‐controle no gel


Bagga et al., Cell 2005!

miRNAs exercendo regulação por degradação de mRNAs-‐alvo

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Células tronco!hematopoiética!

miR-181!

miR-142!miR-223!

Célula B!

Célula T!

Células - CTE!

Células diferenciadas!!

!miRNAs!

específicos!

Pluripotência de células-tronco! Hematopoiese!

(Houbaviy et al., 2003; Suh et al., 2004, 2011)! (Chen et al., 2004)!

let-7!

Funções dos microRNAs

let-7!

LIN-‐28 é altamente expressa em CTE (proteína de ligação a RNA)

LIN-‐28 inibe let-‐7 em CTE

Gregory, 2008!

LIN-‐28 inibe let-‐7 em CTE

Gregory; 2008!

Perfil de miRNA CTE X iPSCs (reprogramação não é perfeita)

Chin et al, 2009

CTE

neurônios

neurônios

neurônios

neurônios

CTE – diferenciação neuronal

Shi et al., 2007

Perfil de miRNAs em CTE e céls derivadas qPCR miRNA • hYp://www.systembio.com/microrna-‐research/expression-‐profiling/stem-‐cell-‐collec5on/technical-‐details • Biocat

Perfil de miRNAs

Morissey et al, 2011

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Expressão de miRNAs gerando teratoma (miR-‐302/miR307)

Morrisey 2011 Morrisey 2011

Supressão de Hdac2 por VPA é essencial para a reprogramação por miRNAs

Resumo: Reprogramação em iPSCs por miRNAs

Chang & Gregory 2011

Banco público de miRNAs: miRBase.org

miRBase.org informação detalhada sobre cada miRNA

Predição de alvos de miRNAs

Exemplo: TargetScan

Predição de alvos de miRNAs

Exemplo: TargetScan – conservação da ligação de let-‐7

Perfil esperado de um profissional no lab

• Tenha iniciativa- seja pró-ativo

• Seja responsável

• Apaixone-se pelo que faz

• Saiba do que está falando – leia artigos, estude os protocolos, entenda ferramentas de bioinformática

•  Seja crítico: biologia molecular, celular, embriologia, • bioquímica, epigenética • Saiba inglês - muito bem

• Aproveite seu tempo!

Stem Cell Core Lab (UCSD) Muotri Lab (UCSD) – CTE e iPSC

Adriana Franco Paes Leme Pasquinelli Lab (UCSD)- microRNA Yeo Lab (UCSD)-CLIP/sequenciamento

Agradecimento/Colaborações

Anete Pereira de Souza Ana Maria Azeredo-Espin

Lab: Ricardo Paixão (bioinformática)

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