hidrólise de sacarose por invertase imobilizada em duolite ... · de sacarose, tempo de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

Hidrlise de Sacarose por Invertase

Imobilizada em Duolite A-568 por Adsoro

e Ligao Cruzada

Bruna Vieira Cabral

UBERLNDIA MG

JULHO DE 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLNDIA

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

Hidrlise de Sacarose por Invertase

Imobilizada em Duolite A-568 por Adsoro

e Ligao Cruzada

Bruna Vieira Cabral

Orientador: Elozio Jlio Ribeiro (UFU)

Co-orientadora: Vicelma Luiz Cardoso (UFU)

Dissertao de mestrado apresentada

ao Programa de Ps-Graduao em

Engenharia Qumica da Universidade

Federal de Uberlndia como parte dos

requisitos necessrios obteno do

ttulo de Mestre em Engenharia

Qumica, rea de concentrao em

Pesquisa e Desenvolvimento de

Processos Qumicos.

UBERLNDIA MG

JULHO DE 2012

DEDICATRIA

Dedico esta dissertao aos meus queridos pais e irmo, pela ajuda, compreenso e amor

incondicional.

AGRADECIMENTOS

Agradeo aos meus pais, Solange e Joselias, que jamais mediram esforos para

tornar meus objetivos mais prximos e meus desejos reais. Ao meu irmo, pelo constante

incentivo. Ao Gustavo, pela presena, pacincia e carinho em cada passo desta caminhada. A

toda minha famlia que atravs de simples gestos me apoiaram e acreditaram no meu esforo.

Ao Prof. Elozio Jlio Ribeiro pela orientao, pacincia e dedicao que tornaram

esta jornada mais suave e empolgante. Pelas palavras certas e carinhosos incentivos que

contriburam imensamente para minha formao pessoal e profissional. Obrigada por cada

dia, cada conversa, cada gesto de confiana, os levarei por toda vida.

Profa. Vicelma Luiz Cardoso, pelo constante esforo na realizao deste trabalho e

pela dedicao intensa em alcanar bons resultados. Pela pacincia e compreenso eu lhe

agradeo.

Profa. Miriam Maria Resende um agradecimento especial, pelos valiosos

ensinamentos e ajuda no fechamento deste trabalho.

A todos os professores da FEQUI que contriburam direta ou indiretamente em

minha formao, contribuindo com informaes valiosas para a realizao deste estudo.

Professora e amiga Lbia que desde sempre contribui para meu crescimento

pessoal e acadmico. Suas palavras doces e incentivadores, desde a graduao, tornaram este

trabalho possvel.

amiga Larissa que tanto ajudou, com pacincia e esforo em cada etapa desta

jornada.

Aos colegas do NUCBIO, que estiveram presentes desde o incio. Obrigada pelos

ensinamentos e momentos compartilhados.

Aos funcionrios da FEQUI: Clo, Roberta, Rodrigo, Silvino e Ceclia pela

colaborao.

Ao CNPq pela concesso da bolsa.

A CAPES, pelo apoio financeiro.

A Dow Brasil S.A pela doao da resina Duolite A-568.

Ao programa de ps-graduao em Engenharia Qumica da Universidade Federal de

Uberlndia, pela oportunidade concedida.

Sumrio

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................... i LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................. iv LISTA DE SMBOLOS ........................................................................................................ viii

RESUMO.................................................................................................................................. ix ABSTRACT .............................................................................................................................. x CAPTULO 1 - INTRODUO ............................................................................................. 1 CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA .................................................................... 3 2.1 Enzimas ............................................................................................................................... 3

2.1.1 Enzimas como Biocatalisadores .................................................................................... 3

2.1.2 Invertase ........................................................................................................................ 7

2.2 Acar Lquido ................................................................................................................... 9 2.2.1 Acar Lquido Invertido ............................................................................................ 10

2.2.2 Propriedades fsico-qumicas do acar lquido e acar lquido invertido ................ 11 2.2.3 Aplicaes do acar lquido invertido ....................................................................... 12 2.2.4 Processos de Fabricao de Acar Lquido Invertido ............................................... 14

2.2.4.1 Inverso cida ...................................................................................................... 14 2.2.4.2 Inverso com Resinas Catinicas ......................................................................... 15 2.2.4.3 Inverso por Via Enzimtica ................................................................................ 15

2.3 Enzimas Imobilizadas ...................................................................................................... 16 2.3.1 Mtodos de Imobilizao de Enzimas ......................................................................... 18

2.3.1.1 Tipos de Imobilizao .............................................................................................. 19

2.3.1.1.1 Imobilizao por reteno fsica ........................................................................ 19

2.3.1.1.2 Ligao a Suportes Insolveis ........................................................................... 20 2.3.1.1.3 Ligao cruzada ................................................................................................. 24

2.4 Suportes para Imobilizao ............................................................................................. 26 2.4.1 Mtodos de ativao do suporte .................................................................................. 28 2.4.2 Imobilizao em Resinas ............................................................................................. 29

2.5 Efeitos da Imobilizao nas Propriedades da Enzima .................................................. 31 2.5.1 Efeitos dos mtodos de imobilizao na cintica e propriedades das enzimas ........... 31

2.6 Reatores para biocatalisadores imobilizados ................................................................. 32 2.6.1 Reatores descontnuos ................................................................................................. 34 2.6.2 Reatores contnuos ....................................................................................................... 35 2.6.3 Influncia de alguns fatores na escolha do reator ........................................................ 36

2.7 Cintica Enzimtica.......................................................................................................... 37 2.7.1 Determinao dos Parmetros Cinticos ..................................................................... 38

2.7.2 Influncia do meio na atividade e estabilidade das enzimas ....................................... 38 2.7.2.1 Influncia do pH ................................................................................................... 38 2.7.2.2 Influncia da temperatura ..................................................................................... 39

2.8 Planejamento Composto Central .................................................................................... 43

CAPTULO 3 MATERIAL E MTODOS ....................................................................... 47

3.1 Enzima e Reagentes .......................................................................................................... 47 3.2 Suporte para Imobilizao............................................................................................... 47 3.3 Substratos .......................................................................................................................... 48 3.4 Unidades Experimentais .................................................................................................. 48

3.4.1 Reator batelada (descontnuo) ..................................................................................... 49

3.4.2 Reator tipo leito fixo (contnuo) .................................................................................. 50

3.5 Determinao da Atividade pelo Mtodo das Taxas Iniciais........................................ 51

3.6 Imobilizao do biocatalisador ........................................................................................ 52

3.6.1 Ativao do suporte ..................................................................................................... 52 3.6.2 Influncia do tempo no processo de imobilizao por adsoro inica ...................... 52

3.6.3 Otimizao do Processo de Imobilizao .................................................................... 52

3.7 Testes em Reator Batelada .............................................................................................. 53 3.7.1 Estudo preliminar para o processo de ligao cruzada ................................................ 53 3.7.2 Estabilidade de invertase imobilizada em Duolite A-568 por adsoro inica e ligao

cruzada em relao ao pH ..................................................................................................... 53

3.7.3 Estabilidade trmica da enzima imobilizada em Duolite A-568 por adsoro inica e

ligao cruzada ..................................................................................................................... 54 3.7.4 Otimizao do processo de ligao cruzada ................................................................ 55 3.7.4.1 Influncia da concentrao de glutaraldedo e tempo de reticulao no processo de

ligao cruzada ..................................................................................................................... 55

3.7.4.2 Influncia da temperatura e do pH na atividade de invertase imobilizada em Duolite

A-568 por adsoro inica e ligao cruzada ....................................................................... 57

3.7.4.3 Estudo da estabilidade de estocagem de invertase imobilizada em Duolite A-568 por

adsoro inica e ligao cruzada ........................................................................................ 58

3.8 Testes em Reator de Leito Fixo ....................................................................................... 59 3.8.1 Imobilizao da invertase em Duolite A-568 por adsoro inica e ligao cruzada . 59

3.8.2 Influncia conjunta da concentrao de sacarose, tempo de residncia e temperatura

na converso de sacarose ...................................................................................................... 59

3.8.3 Estudo da estabilidade operacional da invertase imobilizada em Duolite A-568 por

adsoro inica e ligao cruzada ........................................................................................ 64

CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................... 66 4.1 Condies adotadas para a imobilizao de invertase .................................................. 66

4.2 Atividade da Invertase ..................................................................................................... 66 4.3 Testes em Reator Batelada .............................................................................................. 67

4.3.1 Estudo preliminar para o processo de ligao cruzada ................................................ 67

4.3.2. Estabilidade de invertase imobilizada em Duolite A-568 por adsoro inica e

ligao cruzada em relao ao pH ........................................................................................ 67 4.3.3 Estabilidade trmica da invertase imobilizada em Duolite A-568 por adsoro inica e

ligao cruzada ..................................................................................................................... 69

4.3.4 Otimizao do processo de ligao cruzada ................................................................ 78 4.3.4.1 Influncia da concentrao de glutaraldedo e tempo de reticulao no processo de

ligao cruzada ..................................................................................................................... 78 4.3.4.2 Influncia da temperatura e do pH na atividade de Invertase imobilizada em duolite

A-568 seguida do processo de ligao cruzada .................................................................... 83

4.3.5 Estudo da estabilidade de estocagem de invertase imobilizada em Duolite A-568

seguida do processo de ligao cruzada ............................................................................... 89

4.4 Testes em Reator Tipo Leito Fixo ................................................................................... 90 4.4.1 Influncia conjunta da concentrao de substrato, tempo de residncia e temperatura

na converso de sacarose ...................................................................................................... 90 4.4.2 Estudo da estabilidade operacional da invertase imobilizada ................................... 105

CAPTULO 5 - CONCLUSES ......................................................................................... 102

CAPTULO 6 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS .................................. 102 CAPTULO 7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................... 105 APNDICE ........................................................................................................................... 105

i

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 - Comparao entre as caractersticas das enzimas e dos catalisadores qumicos. ... 4

Tabela 2.2 - Principais classes de enzimas ................................................................................. 6

Tabela 2.3 Algumas propriedades da invertase. ...................................................................... 8

Tabela 2.4 Doura relativa de diversos acares. .................................................................. 12

Tabela 2.5 Vantagens e desvantagens dos diferentes mtodos de imobilizao. .................. 25

Tabela 2.6 - Classificao dos suportes de acordo com a composio. ................................... 27

Tabela 2.7 - Classificao de reatores enzimticos. ................................................................. 33

Tabela 3.1 Caractersticas da resina Duolite A-568 (Rohm Haas). ....................................... 48

Tabela 3.2 - Matriz Planejamento Composto Central do efeito conjunto da concentrao de

glutaraldedo e tempo de reticulao no processo de ligao cruzada............................... 56

Tabela 3.3 - Matriz do Planejamento Composto Central no estudo do efeito conjunto da

temperatura e do pH na atividade de invertase imobilizada na resina Duolite A-568 por

adsoro inica e ligao cruzada. ..................................................................................... 58

Tabela 3.4 Matriz Planejamento Composto Central da influncia conjunta da concentrao

de sacarose, tempo de residncia e temperatura na converso de sacarose em reator tipo

leito fixo. ............................................................................................................................ 60

Tabela 3.5 Comparao entre valores de converso de substrato, em reator tipo leito fixo,

para soluo de sacarose em tampo acetato 10-1

M pH 4 e 5. ........................................... 62


de sacarose, tempo de residncia e temperatura na converso de sacarose em reator tipo

leito fixo. ............................................................................................................................ 63

Tabela 4.1 Resultado preliminar para o processo de ligao cruzada com uso de

glutaraldedo. ..................................................................................................................... 67

Tabela 4.2 Ajustes dos dados experimentais aos modelos de desativao trmica de primeira

ordem e em srie com uma nica etapa para invertase imobilizada em Duolite A-568

seguida pelo processo de ligao cruzada, nas temperaturas 51, 57, 60 e 63 1C. ........ 71

Tabela 4.3 Clculo do tempo de meia vida para cada temperatura estudada na estabilidade

em relao temperatura. .................................................................................................. 76

Tabela 4.4 Atividade enzimtica obtida em cada experimento do planejamento composto

central para a otimizao do processo de ligao cruzada. ................................................ 78

Tabela 4.5 Resultados da regresso mltipla com todos os parmetros referentes

otimizao do processo de ligao cruzada. ...................................................................... 79

ii

Tabela 4.6 Resultados da regresso mltipla com os parmetros significativos aplicados ao

PCC de otimizao do processo de ligao cruzada. ......................................................... 80

Tabela 4.7 Anlise de Varincia (ANOVA) para a resposta de atividade enzimtica aplicada

ao PCC de otimizao do processo de ligao cruzada. .................................................... 81

Tabela 4.8 Matriz com resultados obtidos para avaliar a influncia conjunta da temperatura

e pH na atividade de invertase imobilizada em Duolite A-568 seguida pelo processo de

ligao cruzada. ................................................................................................................. 84

Tabela 4.9 Resultados da regresso mltipla com todos os parmetros aplicada ao PCC para

avaliar a influncia conjunta da temperatura e pH na atividade de invertase imobilizada.85

Tabela 4.10 Resultados da regresso mltipla com os parmetros significativos aplicada ao

PCC para avaliar a influncia conjunta da temperatura e pH na atividade de invertase

imobilizada. ........................................................................................................................ 85

Tabela 4.11 Anlise da varincia (ANOVA) para a resposta de atividade enzimtica

resultante da avaliao da influncia conjunta da temperatura e pH na atividade de

invertase imobilizada. ........................................................................................................ 86

Tabela 4.12 Matriz do Planejamento Composto Central para a influncia conjunta da

concentrao de sacarose, tempo de residncia e temperatura no reator tipo leito fixo. ... 91

Tabela 4.13 Comparao entre valores de converso de substrato, em reator tipo leito fixo,

para soluo de sacarose em tampo acetato pH 4 e 5. ..................................................... 92

Tabela 4.14 Resultados da regresso mltipla com todos os parmetros aplicada ao PCC

para avaliar a influncia conjunta da concentrao de sacarose, tempo de residncia e

temperatura no reator tipo leito fixo. ................................................................................. 93


PCC para avaliar influncia conjunta da concentrao de sacarose, tempo de residncia e


Tabela 4.16 Anlise de Varincia (ANOVA) para valores de converso de sacarose

resultantes da influncia conjunta da concentrao de sacarose, tempo de residncia e



de sacarose, temperatura e tempo de residncia no reator tipo leito fixo. ......................... 99

Tabela 4.18 Resultados da regresso mltipla com todos os parmetros aplicada ao PCC

para avaliar a influncia conjunta da concentrao de sacarose, tempo de residncia e

temperatura no reator tipo leito fixo. ............................................................................... 100

iii


PCC para avaliar a influncia conjunta da concentrao de sacarose, tempo de residncia

e temperatura no reator tipo leito fixo. ............................................................................ 101

Tabela 4.20 Anlise de Varincia (ANOVA) para valores de converso de sacarose



iv

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 - Mecanismo para a formao do complexo ativo invertase-sacarose foi proposto

por Laidler (1958) citado por Marquez (2007). ................................................................... 9

Figura 2.2 Reao de hidrlise de sacarose com formao de glicose e frutose. Fonte:

Adptado (PASCHOALIM, 1990). ..................................................................................... 11

Figura 2.4 Mtodos para imobilizao de enzimas (FISCHER , 2010). ............................... 19

Figura 2.5- Representao de efeito negativo sobre enzima imobilizada e ausncia deste efeito

(Modificao de GUSAN et al., 1997). ............................................................................ 23

Figura 2.6 Representao dos mtodos de ativao. esquerda esto os suportes, nas cores

verde (gluteraldedo), azul (glicidol) e vermelho (epicloridrina) os agentes ativantes e na

superfcie do suporte os grupos reativos que iro reagir com os grupos amino da enzima

(ADRIANO, 2008). ........................................................................................................... 29

Figura 2.7 Tipos de reatores enzimticos (RIBEIRO, 1989). ............................................... 32

Figura 2.8 Representao da variao da constante de velocidade k com a temperatura

absoluta T (BAILEY e OLLIS, 1986)................................................................................ 40

Figura 2.9 Translao da superfcie de resposta da origem para o ponto estacionrio. ........ 46

Figura 3.1 Enzima Invertase (-frutofuranosidase, E.C.3.2.1.26, Grau V, cdigo 9001-57- 4,

da levedura Saccharomyces cerevisae), marca Sigma. ...................................................... 47

Figura 3.2 Resina Duolite A-568 empregada para imobilizao da enzima invertase. ......... 48

Figura 3.3 Foto dos reatores tipo mistura com operao batelada utilizados para realizar as

reaes de hidrlise de sacarose por invertase imobilizada. .............................................. 49

Figura 3.4 Representao esquemtica da unidade experimental do reator tipo batelada

utilizado para realizar a hidrlise de sacarose por invertase imobilizada (FISCHER,

2010). ................................................................................................................................. 50

Figura 3.5 Foto do reator tipo leito fixo utilizado para realizar a converso de sacarose por

invertase imobilizada. ........................................................................................................ 50

Figura 3.6 Representao esquemtica da unidade experimental do reator tipo leito fixo

utilizado para realizar a converso de sacarose por invertase imobilizada (FISCHER,

2010). ................................................................................................................................. 51

Figura 4.1 Influncia do pH na estabilidade de invertase imobilizada em Duolite A-568

seguida pelo processo de ligao cruzada. (Condies de determinao da atividade

enzimtica: Concentrao de sacarose 50 g/L, temperatura: 40 1C e tampo acetato 10-

1M, pH 4,9). ....................................................................................................................... 68

v

Figura 4.2 Perfis de inativao trmica para invertase imobilizada em Duolite A-568

seguida pelo processo de ligao cruzada. Incubao em tampo acetato 10-1

M, pH 4,7 e

temperaturas 51, 57, 60 e 63 1C. ................................................................................... 70

Figura 4.3 - Perfil da desativao trmica a 63 1C para invertase imobilizada em Duolite

A-568 seguida pelo processo de ligao cruzada. Ajuste de modelo matemtico aos dados

experimentais: Equao 2.6 = modelo de desativao trmica de primeira ordem; Equao

2.4 = modelo de desativao trmica em srie em uma nica etapa. ................................ 71













Figura 4.7 Regresso linear da equao de Arrhenius. ......................................................... 77

Figura 4.8 Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo modelo para a

resposta de atividade enzimtica da otimizao do processo de ligao cruzada. ............. 81

Figura 4.9 Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade para a

resposta de valores de atividade enzimtica resultantes da otimizao do processo de

ligao cruzada. ................................................................................................................. 82

Figura 4.10 Superfcie de resposta da influncia conjunta da concentrao de glutaraldedo e

tempo de reticulao na atividade de enzima imobilizada em Duolite A-568 seguida do

processo de ligao cruzada. .............................................................................................. 82

Figura 4.11 Valores experimentais em funo dos valores previstos pelo modelo para a

resposta de atividade enzimtica resultante da avaliao da influncia conjunta da

temperatura e pH na atividade de invertase imobilizada. .................................................. 87

Figura 4.12 Distribuio dos resduos em torno da reta que indica normalidade para a

resposta de atividade enzimtica resultante da avaliao da influncia conjunta da

temperatura e pH na atividade de invertase imobilizada. .................................................. 87

vi

Figura 4.13 - Superfcie de resposta da influncia da temperatura e do pH na atividade

enzimtica de invertase imobilizada em Duolite A-568 seguida do processo de ligao

cruzada. .............................................................................................................................. 88

Figura 4.14 Estabilidade de estocagem de invertase imobilizada. Estocagem a 4 2C em

tampo acetato 0,1 M, pH 4,9; testes em reator tipo cesta (batelada), meio reacional:

40C, soluo de sacarose 50 g/L (tampo acetato 0,1 M, pH 4,9). .................................. 90

Figura 4.15 Valores preditos em funo dos valores observados para valores de converso

de substrato resultantes da influncia conjunta da concentrao de sacarose, tempo de

residncia e temperatura no reator tipo leito fixo. ............................................................. 95

Figura 4.16 Distribuio dos resduos relativa para valores de converso de substrato



Figura 4.17 Superfcie de resposta da influncia da concentrao de sacarose e do tempo de

residncia na converso de substrato por invertase imobilizada em Duolite A-568 seguida

do processo de ligao cruzada. ......................................................................................... 97

Figura 4.18 Superfcie de resposta da influncia da concentrao de sacarose e da

temperatura na converso de substrato por invertase imobilizada em Duolite A-568

seguida do processo de ligao cruzada............................................................................. 97

Figura 4.19 Superfcie de resposta da influncia do tempo de residncia e da temperatura na

converso de substrato por invertase imobilizada em Duolite A-568 seguida do processo

de ligao cruzada. ............................................................................................................. 98

Figura 4.20 Valores preditos em funo dos valores observados para valores de converso

de substrato resultantes da influncia conjunta da concentrao de sacarose, tempo de

residncia e temperatura no reator tipo leito fixo. ........................................................... 102

Figura 4.21 Distribuio dos resduos relativa para valores de converso de substrato



Figura 4.22 Superfcie de resposta da influncia da concentrao de sacarose e do tempo de

residncia na converso de substrato por invertase imobilizada em Duolite A-568 seguida

do processo de ligao cruzada. ....................................................................................... 103

Figura 4.23 Superfcie de resposta da influncia da concentrao de sacarose e da

temperatura na converso de substrato por invertase imobilizada em Duolite A-568

seguida do processo de ligao cruzada........................................................................... 104

vii

Figura 4.24 Superfcie de resposta da influncia do tempo de residncia e da temperatura na

converso de substrato por invertase imobilizada em Duolite A-568 seguida do processo

de ligao cruzada. ........................................................................................................... 105

Figura 4.25 Estabilidade operacional da invertase imobilizada na hidrlise de sacarose em

reator de leito fixo em regime contnuo. Condies experimentais: soluo de sacarose

700 g/L (tampo acetato pH 5), tempo de residncia igual a 95,3 min e temperatura igual

a 38C. ............................................................................................................................. 106

viii

LISTA DE SMBOLOS

Beta - formas anomricas da enzima -galactosidase

Alfa - formas anomricas da enzima -galactosidase

1 Relao entre a atividade da enzima no estado E1 e a atividade da enzima

nativa E0

2 Relao entre a atividade da enzima no estado E2 e a atividade da enzima

nativa E0

E1 Atividade da enzima no estado E1

E2 Atividade da enzima no estado E2 k1 Coeficiente de velocidade de desativao de primeira ordem do estado E0

para E1

k2 Coeficiente de velocidade de desativao de primeira ordem do estado E0

para E2

t1/2 Tempo de meia-vida (min)

kd Constante cintica desativao trmica

A Fator de freqncia para a reao

Ea Energia de ativao do processo de ativao trmica da enzima (kJ/mol)

R Constante da lei dos gases

T Temperatura absoluta

A/A0 Atividade relativa da enzima

U Atividade de invertase solvel - grama de acar redutor produzido por

litro, por minuto, por grama de invertase em p comercial

US Atividade de invertase imobilizada - grama de acar redutor por litro,

minuto, grama de suporte

a Fator de freqncia para a reao

Ed Energia de ativao do processo de desativao trmica da enzima

R2 Coeficiente de correlao

t t de student

Nvel de significncia

(V-Vmodelo

)2

Somatria dos quadrados dos desvios

Alfa de ortogonalidade

X1 Varivel estudada 1

X2 Varivel estudada 2

Xn Valor da varivel no experimento na forma codificada

X0 Valor real da varivel no ponto central

X+1 Valor real da varivel no nvel superior

X-1 Valor real da varivel no nvel inferior

Fcalc Valor calculado do teste F para um conjunto de pontos experimentais

FT Valor tabelado do teste F de estatstica para hipteses

ix

RESUMO

Neste trabalho estudou-se a hidrlise de sacarose por invertase de Saccharomyces cerevisiae

imobilizada por adsoro inica em resina de troca inica Doulite A-568 seguida pelo

processo de ligao cruzada com uso de glutaraldedo. Esta combinao de processos de

imobilizao levou a um aumento da atividade e estabilidade da enzima invertase. O intervalo

de estabilidade da invertase imobilizada em relao ao pH foi entre 3 e 6, em tampo acetato

10-1

M. Foi verificada uma forte dependncia da estabilidade do biocatalisador imobilizada em

relao temperatura. A estabilidade trmica da enzima foi estudada na faixa de 51 a 631C.

O modelo de desativao trmica de primeira ordem descreveu de forma significativa a

cintica de desativao trmica da enzima imobilizada em todas as temperaturas estudadas.O

valor da energia de ativao de desativao trmica de invertase de Saccharomyces cerevisiae

imobilizada foi 373,73 kJ/mol ou 89,32 kcal/mol, utilizando uma concentrao inicial de

sacarose de 50 g/L em soluo tampo acetato pH 4,9, com tempo de meia vida igual a 8,08

horas para a temperatura de 511C. Ao otimizar o processo de ligao cruzada atravs de um

Planejamento Composto Central (PCC), a concentrao de glutaraldedo e tempo de

reticulao que maximizaram a atividade enzimtica, foram respectivamente, 0,6 g/L e 6

horas. A temperatura e pH em que a invertase imobilizada em Duolite A-568 seguida pelo

processo de ligao cruzada apresentou maior atividade foram respectivamente, 50C e pH

tampo acetato 4, valores obtidos atravs de um novo PCC. O biocatalisador imobilizado

manteve sua atividade aps 60 dias de armazenamento, em tampo acetato 10-1

M pH 4,9 a 4

2C, indicando a manuteno da estabilidade na estocagem. A influncia da concentrao de

sacarose, do tempo de residncia e da temperatura na converso da sacarose em reator de leito

fixo, operando em regime contnuo, com escoamento ascendente foi estudada empregando um

Planejamento Composto Central (PCC). A melhor condio para converso de sacarose foi:

concentrao de sacarose igual a 700 g/L, tempo de residncia de 95,3 minutos e temperatura

de 381C atingindo a converso de 98,7%. A enzima imobilizada, manteve sua atividade

durante 73,58 horas de operao em reator de leito fixo, com vazo de alimentao de soluo

de sacarose de 700 g/L, tempo de residncia de 95,3 min e temperatura de 381C.

Palavras-chave: invertase, hidrlise de sacarose, acar invertido, imobilizao, Duolite A-

568, reator de leito fixo.

x

ABSTRACT

In this work was studied the sucroses hydrolysis by invertase of Saccharomyces cerevisiae

immobilized by adsorption and cross-linking with glutaraldehyde, using as carrier the ion

exchange resin Duolite A568. This combination of immobilization procedures has led to an

increase of activity and stability of the invertase.The influence of pH on the stability of

invertase with the cross-linking process was studied for the range of 3 to 7, and the biocatalyst

was stable in the range of 3 to 6. The thermal stability of enzyme was studied in the range of

51 to 63C. The thermal deactivation model of first order described significantly the kinetics

of thermal deactivation from immobilized enzyme at all temperatures studied. The activation

energy of thermal deactivation process from invertase immobilized was 373.73 kJ/mol or

89.32 kcal/mol with times of half life from 8.08 hours in 51 1C. The optimization of cross-

linking process was studied by a Central Composite Design (CCD), where the glutaraldehyde

concentration and time of cross-linking processes that maximized the enzyme activity were

respectively 0.6 g/L and 6 hours. The temperature and pH of maximum activity for the

immobilized enzyme were respectively 50 1C and 4. It was studied by a Central Composite

Design (CCD).The immobilized enzyme kept its activity after 60 days of storage, in acetate

buffer pH 4.9 in 4 2C. The influence of sucrose concentration, residence time and

temperature in the sucroses conversion in fixed bed reactor, operating in continuous duty,

with upflow was studied by a Central Composite Design (CCD). The best condition for the

sucroses conversion was: 700 g/L of sucrose concentration, 95.3 min of residence time and

temperature equal to 38 1C, reaching a conversion of 98.7%. The immobilized enzyme

kept its activity during 73.58 hours by operation in fixed bed reactor, 700 g/L of sucrose

concentration, 95.3 min of residence time and 38 1C.

Keywords: invertase, sucrose hydrolysis, invert sugar, immobilization, Duolite A-568, fixed

bed reactor.

CAPTULO 1

INTRODUO

O acar invertido uma soluo mais densa comparada sacarose, capaz de

minimizar a cristalizao e o crescimento de micro-organismos. Corresponde a uma mistura

de acares em soluo, constituda principalmente de glicose, frutose e sacarose residual,

sendo 20% mais doce que a sacarose alm de diminuir a temperatura de congelamento devido

a sua afinidade com gua. A hidrlise da sacarose, cujo produto o acar invertido, pode ser

catalisada por enzimas, por cidos ou por resinas trocadoras de ctions (CADENA et al.,

2010). A obteno de acar invertido por via enzimtica apresenta como vantagem a

obteno de um produto de maior qualidade quando comparado ao obtido por hidrlise cida

(EMREGUL, SUNGUR e AKBULUT, 2006).

A invertase ou -D-frutofuranosidase (E.C.3.2.1.26) catalisa a reao de hidrlise da

sacarose produzindo uma mistura equimolar de glicose e frutose. A enzima invertase pode ser

obtida de diferentes micro-organismos. A maioria das pesquisas referentes a esta enzima

estudam, principalmente, invertase extracelular. Saccharomyces cerevisiae uma fonte de

invertase bastante conhecida, contendo duas formas desta enzima. Uma delas intracelular e

pobre em carboidrato, a outra corresponde a invertase extracelular rica em carboidrato, sendo

esta ltima a mais utilizada em indstrias de bebidas e alimentos (KARKAS e ONAL, 2012).

O uso de catalisadores relativamente caros como enzimas, requer um efetivo

reaproveitamento capaz de tornar o processo economicamente vivel (FREITAS et al., 2011).

O uso de enzimas solveis como catalisadores em processos industriais limitado pelo seu

alto custo de produo e baixa estabilidade de estocagem. Assim o uso de enzimas em sua

forma livre torna sua recuperao e reuso ao final do processo invivel economicamente

(KOTWAL e SHANKAR, 2009). A utilizao de biocatalisadores em escala industrial pode

ser aumentada caso estes sejam imobilizados e mantenham-se ativos (VUJCIC et al., 2011).

O processo de imobilizao tem sido amplamente empregado para facilitar o uso de

biocatalisadores em processos industriais, em substituio a processos enzimticos com

tcnicas convencionais de imobilizao (CADENA et al., 2011). A imobilizao de enzimas

apresenta vantagens em relao as aplicaes comerciais, j que biocatalisadores imobilizados

so facilmente separados do produto ao final da reao, so facilmente reutilizados, podem ser

usados repetida e continuamente e apresentam um potencial aumento na estabilidade trmica

e em relao ao pH (ANSARI e HUSAIN, 2012). Enzimas imobilizadas apresentam um

Captulo 1 Introduo 2

2

enorme potencial como catalisadores em processos qumicos ligados a indstria e a medicina.

Oferecem uma distinta vantagem sobre catalisadores clssicos devido a sua alta especificidade

e alta eficincia cataltica a baixas temperaturas (VUJCIC et al., 2011).

Diferentes mtodos de imobilizao tm sido estudados, sendo que escolha de um

processo de imobilizao para uma dada enzima depende de fatores essenciais do processo,

tais como os substratos utilizados, os tipos de reaes e as configuraes do reator, exigindo

um projeto adequado para atender s necessidades da reao (DALLA-VECCHIA et. al.,

2004). Adsoro fsica em suportes insolveis, encapsulamento, ligao cruzada com uso de

agentes bi ou multifuncionais, so alguns mtodos conhecidos de imobilizao de enzimas

(VUJCIC et al., 2011).

Diante do amplo uso da invertase em indstrias alimentcias, diversos estudos foram

feitos referentes sua imobilizao em diferentes suportes, objetivando analisar sua

estabilidade enzimtica e seu potencial de reuso. Um dos principais fatores a seleo de um

suporte adequado para fixao da enzima. Assim o mtodo escolhido deve atender a duas

necessidades, a cataltica, expressa em produtividade, rendimento, estabilidade e seletividade

e a no-cataltica, relativa ao controle do processo (AZODI, FALAMAKI e MOHSENIFAR,

2011).

A imobilizao por adsoro inica envolve a exposio da soluo enzimtica ao

suporte sob condies apropriadas, como, pH da soluo, tipo de solvente, fora inica da

soluo, concentrao enzimtica, temperatura e tempo de contato. A fraca interao entre

enzima e suporte durante o processo de adsoro resulta no desprendimento da enzima,

enquanto fortes interaes podem causar alteraes conformacionais na enzima adsorvida

(RAJ et al., 2012).

A ativao do suporte com o uso do glutaraldedo uma das tcnicas de imobilizao

de enzimas mais populares. A metodologia bastante simples e eficiente, capaz de aumentar a

estabilidade atravs da formao de ligaes multipontuais. O agente glutaraldedo tem sido

bastante usado para introduzir ligaes cruzadas intermoleculares em protenas ou modificar

protenas adsorvidas em suportes contendo grupos aminos (MATEO et al., 2007).

A combinao de mtodos de imobilizao de enzimas como, por exemplo, a ligao

inica seguida de ligao cruzada entre as molculas da enzima com glutaraldedo, realizada

para melhorar a estabilidade da protena imobilizada e para obter enzimas imobilizadas com

maior atividade (MATEO et al., 2000a).

Captulo 1 Introduo 3

3

Logo, baseando-se nas consideraes expostas, o objetivo geral desse trabalho foi

estudar o processo de hidrlise de sacarose por invertase imobilizada em Duolite A-568 por

adsoro inica e ligao cruzada.

Como objetivos especficos dessa dissertao podem ser citados:

- Avaliar a estabilidade da enzima imobilizada em relao a temperatura e ao pH em

funo do tempo;

- Estudar a influncia da concentrao de glutaraldedo e do tempo de reticulao no

processo de ligao cruzada em funo da atividade enzimtica;

- Analisar a influncia conjunta da temperatura e pH na atividade do biocatalisador

imobilizado;

- Avaliar a estabilidade a estocagem de invertase imobilizada;

- Avaliar a converso de sacarose em acar invertido utilizando invertase imobilizada

em reator de leito fixo;

- Avaliar a estabilidade operacional em processo contnuo, empregando reator de leito

fixo, da enzima imobilizada na converso de sacarose.

CAPTULO 2

REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 Enzimas

2.1.1 Enzimas como Biocatalisadores

As enzimas, importantes componentes do metabolismo de todos os seres vivos, tm a

capacidade de promover e acelerar reaes qumicas. Essas protenas especiais so teis

inclusive na indstria, no apenas na rea de alimentos, mas em muitos outros setores

(MUSSATO, FERNANDES e MILAGRES, 2009).

Na indstria para a obteno de produtos e intermedirios de interesse comercial, so

empregados catalisadores qumicos que so poucos versteis, exigem altas temperaturas para

que a reao atinja razovel velocidade e possuem baixa especificidade, oferecendo assim

produtos de composio qumica mista que requerem uma etapa posterior de purificao. As

principais vantagens do uso de enzimas como catalisadores nestas reaes so a reduo do

custo final do processo devido ao consumo menor de energia, reduo na formao de

subprodutos indesejveis (elevada especificidade que resulta em maior rendimento do

processo), obteno de produtos biodegradveis e reduo da quantidade de resduos

(KRAJEWSKA, 2004).

Neste contexto, o enfoque biotecnolgico vem se apresentando como uma opo

interessante para a explorao de enzimas em diversos tipos de reaes. As enzimas utilizadas

nos setores industriais so na sua grande maioria produzidas por micro-organismos. A

tecnologia enzimtica apareceu na rea de investigao durante a dcada de 1960, com a

imobilizao de enzimas para utilizao em processos qumicos (KRAJEWSKA, 2004).

Desde ento, os processos enzimticos tem sido aplicados em diversos setores, incluindo

construo de biosensores, terapia enzimtica, sntese enzimtica de compostos bioativos,

obteno de novos biopolmeros, processos em indstrias tradicionais como curtumes, papel e

celulose, txtil, cosmticos entre outras aplicaes.

Todas as enzimas so protenas com exceo de um pequeno grupo de molculas

catalticas de RNA (ribozimas) (GALVO, 2004). Existem inmeras diferenas entre

catalisadores qumicos e enzimas (Tabela 2.1). A utilizao das enzimas na indstria

vantajosa, j que so naturais, no txicas e especficas para determinadas aes. Alm disso,

Captulo 2 Reviso Bibliogrfica 4

4

so capazes de alterar as caractersticas de variados tipos de resduos, contribuindo para

reduzir a poluio ambiental.

Tabela 2.1 - Comparao entre as caractersticas das enzimas e dos catalisadores qumicos.

Caracterstica Enzimas Catalisadores qumicos

Especificidade ao substrato Alta Baixa

Natureza da estrutura Complexa Simples

Sensibilidade

temperatura Alta Baixa

Condies de reao Suaves Drstica (geralmente)

Custo de obteno Alto Moderado

Consumo de energia Baixo Alto

Formao de subprodutos Baixa Alta

Separao

catalisador/produto Difcil e cara* Simples

Atividade em temperatura

ambiente Alta Baixa

Presena de cofatores Sim No

Estabilidade Baixa* Alta

Energia de ativao Baixa Alta

Velocidade de Reao Alta Baixa

* enzimas solveis. Enzimas imobilizadas podem ser facilmente separadas e apresentam alta

estabilidade (ZANIN e MORAES, 2004).

Fonte: ZANIN e MORAES, 2004.

Para atuar corretamente, as enzimas precisam de condies especficas, pois so

ativas apenas em uma faixa estreita de acidez-alcalinidade e so sensveis a mudanas nesse

fator e na temperatura do meio. Os micro-organismos so a principal fonte de enzimas de

aplicao industrial, mas diversas podem ser obtidas de animais (pancreatina, tripsina,

quimotripsina, pepsina, renina e outras) ou vegetais (papana, bromelina e outras). Hoje,

porm, como possvel modificar geneticamente os micro-organismos para que fornea

qualquer enzima, a tendncia substituir as produzidas por vegetais e animais pelas de origem

microbiana.

Segundo Mariotto (2006), as principais caractersticas das enzimas so:


5

- Produtos naturais biolgicos;

- Apresentam alto grau de especificidade;

- Reaes com enzimas so baratas e seguras;

- Apresentam mecanismo de turnover, desempenham a mesma funo

consecutivamente, sem serem consumidas no processo;

- So altamente eficientes, acelerando a velocidade das reaes de 108 a 1011

vezes;

- So econmicas, reduzindo a energia de ativao necessria reao;

- No so txicas.

As enzimas apresentam essencialmente trs propriedades principais: estabilidade,

atividade e especificidade (BAILEY e OLLIS, 1986; GALVO, 2004):

Estabilidade: a capacidade de uma enzima depende de sua estrutura nativa, a qual

mantida por meio de foras de interao (pontes de hidrognio e ligaes de sulfeto, foras de

Van der Waals, interaes apolares e inicas). Alteraes no ambiente reacional podem

debilitar essas interaes, alterando a estrutura tridimensional nativa e ocasionando perda

parcial ou total da sua funcionabilidade biolgica. Assim a estabilidade pode ser afetada por

variao de temperatura, pH e presena de solventes polares.

Atividade: esta propriedade de uma enzima atuar na diminuio da energia de

ativao requerida para transformar um substrato em produto, aumentando a velocidade de

reao. A capacidade cataltica da enzima reside no seu stio ativo e este compreende um

nmero pequeno de aminocidos. O stio ativo uma estrutura complexa cuja configurao

permite alojar a molcula de substrato na posio correta para que os grupos funcionais da

enzima efetuem sua transformao qumica.

Especificidade: a especificidade define a afinidade de uma enzima por grupos

especficos em um determinado substrato. Esta uma propriedade imprescindvel das enzimas

enquanto catalisadores. Duas caractersticas estruturais so determinantes na especificidade da

enzima: o substrato possui ligaes qumicas que podem ser atacadas pelos grupos funcionais

do stio ativo da enzima e o substrato possui grupos funcionais que se unem enzima,

permitindo seu correto alinhamento no stio ativo para que a reao possa ocorrer.


6

A Comisso de Enzimas (CE) da Unio Internacional de Bioqumica (IUB) coloca

todas as enzimas em seis grandes classes (Tabela 2.2), cada uma delas comportando

subclasses conforme o tipo de reao catalisada.

Tabela 2.2 - Principais classes de enzimas

Classe da enzima Tipo de reao catalisada Atuao

Oxidorredutases

Reaes de oxidao-

reduo ou transferncia de

eltrons

CH-OH

C=O

C=O-

CH-NH2

CH-NH-

NADH, NADPH

Transferases Transferem grupos

funcionais entre molculas

Grupos com um carbono

Grupos aldedo ou cetona

Grupos acil

Grupos glicosil

Grupos fosfatos

Grupos contendo enxofre

Hidrolases Reaes de hidrlise

steres

Ligaes glicosdicas

Ligaes peptdicas

Outras ligaes C-N

Anidridos cidos

Liases

Catalisam a quebra de

ligaes covalentes e a

remoo de molculas de

gua, amnia e gs

carbnico

=C=C=

=C=O

=C=N-

Isomerases

Transferncia de grupos

dentro da mesma molcula

para formar ismeros

racemases

Fonte: MARIOTTO, 2006.


7

Em relao ao cataltica das enzimas o primeiro ponto a considerar a grande

diferena de tamanho entre a enzima e seus substratos. Segundo DALLA-VECCHIA et al.,

(2004), as enzimas esto sujeitas inativao por fatores qumicos, fsicos e biolgicos, seja

quando estocadas ou durante o uso. O investimento energtico para a sntese de uma molcula

protica justifica-se pela obteno de uma estrutura muito precisa, com reentrncias de forma

apropriada e com grupos qumicos localizados em posies exatas para servir catlise.

2.1.2 Invertase

Uma das enzimas com aplicabilidade industrial a -frutofuranosidase (E. C.

3.2.1.26). Tambm chamada invertase no s catalisa a hidrlise de sacarose formando uma

mistura de glicose e frutose, mas em algumas condies tambm capaz de catalisar a

transfrutosilao para produzir frutooligossacardeos (FOS) como a kestose (GF2), nistose

(GF3) e 1F frutofuranosilnistose (GF4) (NGUYEN et al., 2005). Ashokkumar, Kayalvizhi e

Gunasekaran, (2001), afirmam que a -frutofuranosidase (E.C.3.2.1.26) catalisa a hidrlise da

sacarose em quantidades equimolares de frutose e glicose, processo conhecido como inverso.

Invertase um biocatalisador potencialmente til na produo de xaropes com alto

teor de frutose e glicose a partir da sacarose como matria-prima (RUBIO, RUNCO e

NAVARRO, 2002). Tomatoni e Vitolo (2007) destacaram o uso da invertase na produo de

xarope de frutose usando invertase imobilizada em um biorreator de membrana. O xarope de

frutose empregado como adoante em indstrias alimentcias e farmacuticas e tambm

usado para obter frutose cristalina (ASHOKKUMAR, KAYALVIZHI e GUNASEKARAN,

2001). Merecem ser lembrados, tambm, outros usos da invertase, como, em produtos para

higiene bucal com o objetivo de evitar a formao das placas dentrios, na hidrlise da

rafinose, no preparo de meios de cultivo para a propagao de micro-organismos no

produtores de invertase e em biosensores (SAID e PIETRO, 2004).

A invertase encontrada em leveduras, sobretudo na espcie Saccharomyces

cerevisiae (sua principal fonte), invertebrados, vertebrados, algas verdes, bactrias, vegetais e

fungos. A principal fonte de invertase industrial so as leveduras, 80% das enzimas so

extracelulares e os 20% restantes so intracelulares. Algumas propriedades da invertase

extracelular e intracelular esto apresentadas na Tabela 2.3 (GSCON et al., 1981).


8

Tabela 2.3 Algumas propriedades da invertase.

Propriedades Invertase extracelular Invertase intracelular

Massa molecular (kDa) 270 135

Carboidrato (%) 50 3

Atividade especfica (U/mg de protena) 2700 2900

Km [mM] (sacarose) 26 25

pH - estabilidade 3,0 7,5 6,0 9,0

pH timo - atividade 3,5 5,5 3,5 5,5

U = micromol sacarose hidrolisado por minuto.

Fonte: GSCON, NEUMANN e LAMPEN, 1981.

Invertase de levedura geralmente apresenta uma faixa de estabilidade ao pH que

varia de 3,5 a 5,5, podendo ser utilizadas a 65-70C se a soluo de sacarose for concentrada.

Invertase imobilizada pode ser utilizada para a inverso da sacarose em larga escala, com

rendimento de 80% quando uma soluo a 50% introduzida em um reator contendo 1L da

enzima imobilizada, com fluxo de 6 L/h, a 40C. (UHLIG, 1990).

Isoformas distintas da invertase existem no vacolo, citoplasma e apoplasma das

clulas de plantas. As isoformas cidas (pH timo entre 4,5 a 5,5) esto presentes no vacolo

e apoplasto, enquanto que as Isoformas de invertases neutras e alcalinas (pH timo 8,0) esto

localizadas no citoplasma (HAIDER e HUSAIN, 2008).

O mecanismo de ao da invertase no totalmente conhecido, mas estudos com a

enzima tm sugerido o envolvimento de um nion carboxilato e uma histidina residual na

atividade cataltica. Um mecanismo para a formao do complexo ativo invertase-sacarose foi

proposto por Laidler (1958) citado por Marquez (2007), o qual est representado na Figura

2.1. Pode-se observar a influncia do pH no mecanismo de ligao do stio ativo da invertase

com grupos cidos e bsicos.


9

Figura 2.1 - Mecanismo para a formao do complexo ativo invertase-sacarose foi proposto

por Laidler (1958) citado por Marquez (2007).

Neste mecanismo mostrado na Figura 2.1 observa-se que as formas carregadas

eletricamente so ativas. Assim existe um pH no qual a concentrao da forma ativa

mxima, sendo este considerado como pH timo, acarretando a atividade mxima (CABRAL,

1989).

A invertase tem sido estudada principalmente em sua forma imobilizada, diante das

vantagens apresentadas pelo mtodo em relao a sua forma solvel. De acordo com BAGAL

et al.; (2006), a invertase imobilizada pode ser usada em biosensores de sacarose, muito

importante para indstrias de alimentos e bebidas. A adio de invertase ao suco de fruta

promove aumento de teores de glicose e frutose. A hidrlise da sacarose a 30 - 40C reduz

custos de produo quando se utiliza invertase imobilizada, devido reutilizao deste

biocatalisador e o uso de um processo contnuo (TOMATONI e VITOLO, 2007).

2.2 Acar Lquido

O acar lquido uma soluo de acar em gua, podendo ser constitudo apenas

por um acar ou uma mistura de dois ou mais acares. O acar lquido pode ser formado

por sacarose, glicose ou frutose, ou ainda uma mistura destes trs acares e finalmente por


10

glicose enriquecida com frutose (DAVIS e PRINCE, 1955; MARIGNETTI e MANTOVANI,

1979/80).

O acar lquido de sacarose produzido a partir da dissoluo do acar refinado

granulado em gua at obter uma soluo de 67,5 Brix. Caso o acar usado no seja branco,

a soluo pode adquirir uma colorao amarelada obrigando a passagem do produto em

carvo vegetal (DAVIS e PRINCE, 1955; MARIGNETTI e MANTOVANI, 1979/80).

Os acares na forma lquida apresentam vantagens em relao ao acar a granel

como facilidade do manuseio e dosagem, espao reduzido para a armazenagem, reduo das

perdas, custos e mo de obra, melhora na sanitizao, alm das propriedades microbiolgicas

conhecidas e da grande variao possvel nas propores de diferentes misturas de acares.

As desvantagens deste produto so: a baixa solubilidade da sacarose, a susceptibilidade ao

ataque microbiano e a necessidade de equipamentos especiais para armazenagem e manuseio

(DAVIS e PRINCE, 1955; MARIGNETTI e MANTOVANI, 1979/80; BRUDER e MOROZ,

1981). Os acares lquidos tm aplicaes variadas. Sendo utilizados como matria-prima

em biscoitos, produtos assados e de confeitaria, enlatados, bebidas, como: aguardente,

refrigerantes, cervejas e sucos de frutas, laticnios, sorvetes, manteiga e indstria de frutas

geladas. A baixa viscosidade aliada s propriedades umectantes permite o emprego desta

matria-prima em gelias, bolos, produtos contendo gelatina e doces aerados. (DAVIS e

PRINCE, 1955; MARIGNETTI e MANTOVANI, 1979/80).

2.2.1 Acar Lquido Invertido

O desenvolvimento das indstrias de alimentos e bebidas, que so as principais

consumidoras do acar lquido invertido, impulsionou o interesse por este produto (JUNK,

NELSON e SHERRILL,1947; DAVIS e PRINCE, 1955). O acar lquido contendo uma

mistura em diferentes propores de frutose, glicose e sacarose, conhecido como invertido.

As misturas de acares presentes no xarope invertido deram ao produto caractersticas nicas

como: alta higroscopicidade, resistncia a cristalizao e doura que permitiram a longa vida

deste produto no mercado.

O acar invertido produzido pela hidrlise da molcula de sacarose em soluo. A

quebra da sacarose ocorre na ligao entre o ncleo de piranose e furanose, com a liberao

de uma molcula de glicose e uma de frutose (MARIGNETTI e MANTOVANI, 1979/80). A

reao de hidrlise est representada na Figura 2.2.


11

Figura 2.2 Reao de hidrlise de sacarose com formao de glicose e frutose. Fonte:

Adptado (PASCHOALIM, 1990).

A mistura de acares obtida aps a inverso denominada de acar lquido

invertido, pois ocorre uma inverso do poder ptico rotatrio da soluo. Um feixe de luz

polarizada ao atravessar uma soluo de sacarose pura desvia o feixe de luz para a direita,

aps a hidrlise a soluo equimolar de glicose e frutose obtida, passa a desviar o feixe de luz

para a esquerda.

A inverso da sacarose uma estratgia usada na fabricao de bombons com

recheio pastoso. Durante o processo de fabricao, o bombom recheado com uma pasta de

sacarose, gua e invertase. At a sua venda, ocorrer, no interior do bombom, a inverso da

sacarose com formao de uma mistura de glicose e frutose. Esses acares de seis carbonos

so mais solveis em gua do que o de doze carbonos e, ento, como conseqncia de sua

dissoluo na gua, existente na pasta, a mistura passa a ser mais doce e ter uma consistncia

lquida. A doura relativa da mistura de iguais propores dos dois monossacardeos, glicose

e frutose, maior do que a doura da sacarose sacarose (CHEMELLO, 2006).

2.2.2 Propriedades fsico-qumicas do acar lquido e acar lquido invertido

O xarope invertido com maior valor comercial aquele em que 55% da sacarose

convertida em glicose e frutose possibilitando trabalhar com 76,5% de slidos solveis, sem

riscos de cristalizao (RODRIGUES et al., 2000).

A solubilidade da sacarose a 20C 67,1%. Este valor estabelece a mxima

concentrao permitida para evitar a cristalizao durante a armazenagem e o transporte. Os

acares lquidos contendo glicose e frutose podem ser produzidos com alto contedo de


12

slidos devido a alta solubilidade da frutose. A glicose apesar de ser o menos solvel dos

acares quando comparado com a sacarose e a frutose, pode permanecer em soluo por

longos perodos de tempo, mesmo em condies de saturao.

A viscosidade das solues de acares uma propriedade importante para a

indstria, pois est diretamente relacionada fluidez do xarope, determinando as condies de

estocagem, o projeto de equipamentos, de bombas e das tubulaes. O xarope contendo

acar invertido contm maior teor de slidos se comparado com o xarope contendo apenas

sacarose, portanto sua viscosidade maior. Porm, se comparados dois xaropes com a mesma

concentrao de slidos, o xarope de sacarose ter maior viscosidade j que constitudo por

molculas maiores que a glicose e a frutose (DAVIS e PRINCE, 1955).

O acar invertido extremamente higroscpico devido presena de frutose, sendo

capaz de absorver gua mesmo em umidades relativas inferiores a 60%. Esta propriedade

permite que o mesmo seja empregado em produtos alimentcios e no alimentcios, j que a

umidade do alimento pode ser regulada atravs da quantidade de acar invertido dosado

(DAVIS e PRINCE, 1955; MOROZ et al.,1973).

O ndice de qualidade do produto est diretamente relacionado com sua utilidade,

sendo a cor do acar um indicador deste. A cor muito forte uma caracterstica indesejada

no produto, sendo influenciada pela temperatura e tempo aplicados durante a inverso de

sacarose e o pH da soluo. Perodos de aquecimento longos durante o processo de inverso e

valores de pH neutros favorecem a formao de cor (DAVIS e PRINCE, 1955).

As solues contendo at 10% de sacarose so mais doces que o acar invertido,

enquanto que acima de 10% o xarope invertido mais doce (MOROZ et al., 1973). A doura

relativa de vrios componentes est representada na Tabela 2.4 a seguir:

Tabela 2.4 Doura relativa de diversos acares.

Acares Doura relativa

Frutose 1,1 a 1,8

Sacarose 1,0

Acar invertido 0,9

Glicose 0,7

Fonte: PASCHOALIM, 1990.

2.2.3 Aplicaes do acar lquido invertido


13

O acar invertido lquido apresenta algumas caractersticas especficas como:

higroscopicidade, solubilidade, resistncia cristalizao, viscosidade, doura, atividade

redutora e estabilidade. A sacarose pode sofrer hidrlise aps a sua adio em bebidas ou

outros alimentos com carter cido, demonstrando assim a maior estabilidade deste xarope em

relao sacarose (MOROZ et al., 1973).

Na indstria de panificao o xarope invertido escolhido em relao sacarose

devido a sua habilidade em absorver a umidade, apesar de que a sacarose tambm pode ser

utilizada j que invertida durante a fermentao (DAVIS e PRINCE, 1955; MARIGNETTI

e MANTOVANI, 1979/80; GROVES, 1998).

A produo de cookies tambm utiliza o acar invertido, em que reduz a

cristalizao de sacarose, influencia positivamente no tempo de prateleira, na cor e na

diminuio de quebras do produto (MOROZ et al., 1973).

Outra aplicao do acar lquido invertido em produtos confeitados. Utiliza-se

entre 0 10% de acar invertido em balas, fondants e entre 15-25% em doce de leite,

caramelo, nougat, marshmallow e gelias a base de Agar. A adio de pequenas quantidades

de acar lquido invertido durante a fabricao de produtos assados, como bolos, melhora a

cremosidade dos acares e gorduras, assim como a rpida e uniforme distribuio dos

ingredientes. (MOROZ et al., 1973).

Se comparado o acar invertido com o acar cristal, o invertido apresenta diversos

benefcios, tais como (MARQUEZ, 2007):

- Melhoria do controle do processo de fabricao e da manuteno de condies

higinicas nas indstrias alimentcias;

- Alta pureza qumica evitando a gerao de precipitados indesejveis em funo

de elevados teores de ferro, cobre ou clcio;

- Alto controle microbiolgico, devido menor atividade de gua, dispensando a

necessidade de pasteurizao por parte do cliente;

- Menor espao necessrio para a estocagem;

- Economia de despesas operacionais para o tratamento de acar cristal, como

gastos com energia, gua e vapor;

- Elimina a necessidade de investimentos em equipamentos para a dissoluo e

filtrao do acar;

- Reduo das perdas, menor poluio e gastos com seu controle.


14

Alm destes benefcios, em diversas aplicaes industriais o acar invertido

apresenta propriedades mais interessantes se comparado soluo de sacarose, tais como

(MARQUEZ, 2007):

- Apresenta maior higroscopicidade, retendo umidade mesmo em ambientes

muito secos;

- Maior solubilidade, atuando como inibidores de cristalizao e reduzindo

custos com frete;

- Reduz o ponto de congelamento, propriedade til em produtos que so

conservados em congeladores;

- Em produtos com baixo teor de gordura, sua utilizao evita que esses

comecem a quebrar e secar;

- Possui viscosidade baixa, conferindo plasticidade a sorvetes, cremes e

fondants;

2.2.4 Processos de Fabricao de Acar Lquido Invertido

A inverso da sacarose para produo do acar invertido pode ser realizada em

meio cido a quente, em resina de troca catinica fortemente cida ou por ao da enzima

invertase (MOROZ et al., 1973; MARIGNETTI e MANTOVANI, 1979/80). O processo

enzimtico pode ocorrer pela adio direta da enzima ou pela imobilizao da mesma em

suportes inertes (AKGOL et al., 2001; RODRIGUES, 2000). A inverso pode ser realizada

diretamente em uma soluo de sacarose ou em alimentos contendo este acar

(RODRIGUES et al., 2000).

Algumas matrias primas podem ser utilizadas na fabricao de acar invertido

como, por exemplo, o melado de cana e beterraba, tmaras, uvas e xarope de milho por

isomerizao enzimtica (MOROZ et al., 1973; MARIGNETTI e MANTOVANI, 1979/80).

Desde 1951, em que se iniciou a produo de acar invertido na Irlanda, novas tcnicas de

fabricao do acar lquido invertido tm sido descritas na literatura. Algumas delas so

apresentadas a seguir.

2.2.4.1 Inverso cida

A inverso cida o mtodo mais antigo e mais econmico para produzir acar

invertido a partir da sacarose, em que o cido age como um catalisador da reao.


15

A concentrao dos reagentes e do cido, a temperatura e o tempo de reao so as

principais variveis que controlam a inverso qumica. A inverso cida pode gerar um

produto altamente colorido, em que o aumento da temperatura e reduo do pH causam um

aumento da velocidade de inverso (RODRIGUES et al., 2000). Este tipo de inverso resulta

em um produto de qualidade inferior, alm do inconveniente de utilizar altas temperaturas e

agentes corrosivos que comprometem a segurana dos operrios e a manuteno dos

equipamentos (AKGOL et al., 2001). Existe ainda a necessidade da neutralizao final do

produto e a gerao de subprodutos, como furfurais e outros aromticos indesejveis, alm de

oligossacardeos por reao de polimerizao (VICENTE, 2000). Geralmente o problema de

neutralizao resolvido adicionando cal ao xarope, o que provoca incrustaes nos

equipamentos, alm de ocasionar perda de aucares no armazenamento devido presena de

sais insolveis de clcio.

2.2.4.2 Inverso com Resinas Catinicas

A inverso com resinas de troca inica outra tcnica para a produo do acar

invertido. Segundo VICENTE (2000), este mtodo foi desenvolvido e patenteado por

HUGHES em 1952, para a produo contnua de xaropes de acar invertido. A operao

contnua e o xarope de sacarose passa atravs de uma coluna vertical contendo ons

hidrognio necessrios para a inverso. O meio cido promovido pela resina catinica pode

causar degradao do acar resultando em hidroximetilfurfural com a subseqente formao

de cor no xarope (RODRIGUES et al., 2000). O grau de inverso depende do tempo de

contato, temperatura, concentrao de ons hidrognio na resina, grau de reticulao e

porosidade da resina (MOROZ et al., 1973). A eficincia da inverso da sacarose reduz com a

exausto da resina, que pode ser regenerada com cido sulfrico ou clordrico (MOROZ et al.,

1973; BRUDER e MOROZ, 1981, PASCHOALIM, 1990).

A mudana de cor durante o processo de inverso, em meio cido ou com resina

catinica, pode ser reduzida mantendo o pH e a temperatura baixos. O teor de cinzas do

acar invertido funo da qualidade do acar e da gua utilizados (MARIGNETTI e

MANTOVANI, 1979/80).

2.2.4.3 Inverso por Via Enzimtica


16

A produo do acar lquido invertido pode ser realizada ainda atravs de um

terceiro processo, a hidrlise enzimtica. A hidrlise catalisada pela enzima invertase produz

um xarope de alta qualidade com baixas concentraes de hidroximetilfurfural e sem

desenvolvimento de cor. Os mtodos enzimticos empregam as enzimas livres ou

imobilizadas. (CHEN et al., 2000; ALMEIDA et al., 2005).

Este processo utilizado quando se deseja produzir pequenas quantidades de xarope

e um produto com caractersticas especiais de aroma e cor, os quais poderiam ser prejudicados

pela hidrlise cida (MOROZ et al., 1973; PASCHOALIM, 1990). O processo de inverso

enzimtica apresenta vantagens em relao ao mtodo cido. Na inverso enzimtica no

ocorre alterao na cor do produto ou no flavor do xarope, menos corrosivo aos

equipamentos da planta e por ser um mtodo mais brando no decompe os carboidratos e

no h a formao de compostos indesejveis, como o furfural. O produto apresenta baixo

teor de cinzas, pois no ocorre a utilizao de cido para a inverso, nem de base para a

neutralizao (MOROZ et al., 1973; MARIGNETTI e MANTOVANI, 1979/80; GROVES,

1998; RODRIGUES et al., 2000).

2.3 Enzimas Imobilizadas

Biocatalisadores, enzimas ou clulas, tm sido amplamente utilizadas em diversos

processos, seja em escala laboratorial ou industrial. H muitos anos, esforos intensivos tm

sido empreendidos no somente no desenvolvimento de biocatalisadores com propriedades

superiores, mas tambm na elucidao de tcnicas que permitam o seu uso repetido ou em

processos contnuos. Apesar destes esforos intensivos, amplamente documentados na forma

de publicaes tcnicas e registros de patentes, poucos processos baseados em tcnicas de

imobilizao, seja de enzimas ou de clulas, foram implementados em escala industrial

(CANILHA, CARVALHO e SILVA, 2006).

De acordo com a 1 Conferncia em Engenharia de Enzimas (Henniker, Estados

Unidos, 1971), biocatalisadores imobilizados, enzimas ou clulas, so catalisadores

fisicamente confinados ou localizados em uma regio definida do espao, com reteno de

suas atividades catalticas, e que podem ser utilizados repetida ou continuamente

(KATCHALSKI-KATZIR e KRAEMER, 2000).

A imobilizao um processo que pode ser definido como o movimento no

independente das clulas ou enzimas na parte aquosa do sistema, por estarem alojadas dentro


17

ou na superfcie do agente imobilizador (TAMPIOM e TAMPIOM, 1988). A imobilizao

pode ser definida tambm como a fixao de enzimas ou clulas vivas em um ambiente, de

maneira que sua atividade cataltica no seja afetada negativamente (CANTARELLI, 1989).

O uso em processo contnuo, o aumento da estabilidade e o reaproveitamento do

biocatalisador so as principais vantagens propiciadas pela imobilizao (CARVALHO,

CANILHA e SILVA, 2006).

A dificuldade em se recuperar a enzima do meio reacional ao final da catlise, aliada

instabilidade e frequente inadequabilidade para uso em determinados solventes e/ou

condies de pH, temperatura e exposio a agentes desnaturantes, podem ser superadas por

meio da imobilizao. A enzima imobilizada pode ser reutilizada e normalmente mais

estvel em relao enzima livre, com a vantagem adicional de possibilitar a utilizao de

processo contnuo (CANILHA, CARVALHO e SILVA, 2006).

As enzimas imobilizadas possuem vrias vantagens sobre as enzimas livres

(BERGAMASCO et al., 2000; AKGOL et al., 2001; GRSEL et al., 2003; GMEZ et al.,

2005; SZYMANSKA et al., 2007), tais como:

- Processos com enzimas imobilizadas podem ser conduzidos preferencialmente

de modo contnuo, usando leitos fixos ou fluidizados, por serem facilmente controlados;

- Reutilizao sem um significativo decrscimo da atividade;

- possvel usar alta dosagem de enzima por volume de reator, comparada ao

uso de enzimas livres;

- Os produtos so facilmente separados do meio reacional;

- Em alguns casos a estabilidade e a atividade so aumentadas pela imobilizao;

- Esta tcnica permite a reduo do capital operacional j que a vida til de uma

enzima imobilizada suficientemente longa.

As principais desvantagens da imobilizao so: a possvel perda da atividade

enzimtica durante o processo de imobilizao e os efeitos difusionais devido ao transporte do

substrato e do produto ao stio ativo da enzima imobilizada (RIBEIRO, 1989;

BAYRAMOGLU et al., 2003).

O primeiro trabalho sobre imobilizao de enzimas data do incio do sculo XX,

quando Nelson e Griffin (1916) adsorveram invertase em carvo ativado e alumina, com

reteno de atividade na inverso de sacarose.


18

2.3.1 Mtodos de Imobilizao de Enzimas

O mtodo e o tipo de suporte a serem empregados em um determinado processo de

imobilizao devem ser estabelecidos empiricamente, recaindo a escolha do binmio suporte-

mtodo sobre aquele que apresentar maior reteno de atividade. A escolha do mtodo de

imobilizao e do tipo de suporte depender basicamente de dois fatores. Primeiramente, das

caractersticas peculiares do material biolgico, e em seguida das condies de uso do sistema

imobilizado. Diante da variabilidade destes fatores, pode-se afirmar que no existe um

mtodo geral de imobilizao e nem um suporte universal, adequados para qualquer processo

(CORCORAN, 1985; VITOLO, 2001).

De acordo com Brena e Batista-Vieira (2006), o histrico do desenvolvimento dos

procedimentos de imobilizao pode ser dividido em trs fases: a) 1815: uso emprico para

produo de cido actico e tratamento de guas residuais; b) 1960: produo de L-

aminocidos e isomerizao da glicose atravs de imobilizao de uma enzima; c) 1985-1995:

imobilizao de mltiplas enzimas, incluindo cofatores regeneradores e imobilizao de

clulas para a produo de L-aminocidos a partir de ceto-cidos em reatores de membrana.

Mas ainda na dcada de 1970, a enzima penicilina-G-acilase passou a ser imobilizada e

utilizada na produo de cido amino-penicilnico (6-APA), que precursor de penicilinas

semi-sintticas. Isso aconteceu na Inglaterra e, ao mesmo tempo nos Estados Unidos, quando

teve incio a produo de xarope de alto teor de frutose a partir da isomerizao de glicose

com a enzima glicose ismeras imobilizada. Estes processos esto plenamente ativos e

comprovam a eficincia da utilizao de enzimas imobilizadas (UHLIG, 1998).

A imobilizao pode afetar a estabilidade, o pH, a temperatura tima, as constantes

cinticas e a mxima velocidade de reao da enzima (DANISMAN et al., 2004; ERGINER

et al., 2000). A imobilizao pode oferecer uma estabilidade adicional para uma variedade de

enzimas sendo que essa influenciada pelo nmero de laos formados entre a enzima e o

suporte, a natureza dos laos (covalentes, no-covalentes), o grau de aprisionamento das

molculas de enzima na matriz e as condies de imobilizao (DANISMAN et al., 2004;

CAO, 2005).

Vrias tcnicas podem ser aplicadas para imobilizar ou confinar as enzimas em

suportes slidos, estando baseadas em mecanismos fsicos e qumicos. Entre os mtodos de

imobilizao esto: reteno fsica, que consiste no aprisionamento das molculas da enzima

em matriz polimrica, microcpsula ou membrana; a imobilizao por ligao da enzima a um


19

material insolvel, e pelo uso de um reagente multifuncional por ligaes cruzadas (HAIDER

e HUSAIN, 2008), conforme pode ser verificado na Figura 2.4.

Figura 2.4 Mtodos para imobilizao de enzimas (FISCHER , 2010).

2.3.1.1 Tipos de Imobilizao

2.3.1.1.1 Imobilizao por reteno fsica

O aprisionamento consiste em separar o biocatalisador do meio reacional por meio

de um envoltrio semipermevel. O material da pelcula envolvente deve possuir porosidade

adequada para reter o biocatalisador e, ao mesmo tempo, deixar a passagem livre para

molculas de baixa massa molar. A imobilizao por aprisionamento tem como vantagens

principais: o mesmo processo pode ser usado para imobilizar enzimas, clulas ou organelas;

facilidade de preparao da membrana envolvente semipermevel; a disponibilidade no

mercado dos materiais para confeccionar o suporte; o biocatalisador uma vez envolto pela

membrana fica protegido do ataque de hidrolases (sobretudo de proteases) e/ou de inibidores

de alta massa molar; o procedimento de imobilizao no afeta seriamente a estrutura

macromolecular do biocatalisador. Entretanto, apresenta como principais desvantagens a no


20

recuperabilidade do suporte e de no poder ser usado para aprisionar enzimas que atuam sobre

substratos de alta massa molar. Esse mtodo inclui encapsulao (em gel e em fibras) e a

microencapsulao (ROSEVEAR, KENNEDY e CABRAL, 1987).

A encapsulao consiste na reteno fsica da enzima nas cavidades internas de uma

matriz slida porosa constituda geralmente por polmeros entrecruzados como

poliacrilamida, gelatina, alginato, carragenana, resinas de poliuretano e silanos. As principais

vantagens da encapsulao de enzimas referem-se grande rea superficial para contato do

substrato e da enzima no interior de um volume relativamente pequeno, e possibilidade de

imobilizao simultnea de diferentes enzimas em uma nica etapa. Como principais

desvantagens, tm-se: a restrio de que os biocatalisadores podem ser aplicados somente

com substratos de baixa massa molecular; a possvel inativao da enzima durante o

procedimento de imobilizao; a alta concentrao de enzima necessria para garantir a

encapsulao e, os possveis efeitos de difuso de substratos e/ou produtos no interior da

matriz porosa (HANEFELD, GARDOSSI e MAGNER, 2009; LOPEZ-GALLEGO et al.,

2005; VILLENEUVE et al., 2000).

Uma tcnica de imobilizao denominada microencapsulao consiste em aprisionar

a enzima em membranas polimricas semipermeveis, com grande superfcie de contato.

um sistema limitado para substrato com baixa massa molecular, pois este precisa atravessar a

membrana para ter acesso enzima. H uma grande vantagem na utilizao desta tcnica; a

enzima no interage quimicamente com o polmero evitando, assim, a desnaturao. Contudo,

h a possibilidade de haver incorporao da enzima na parede da membrana (DALLA-

VECCHIA et al., 2004; MARIOTTI, 2000).

2.3.1.1.2 Ligao a Suportes Insolveis

Pode ser dividido em cinco categorias de acordo com o tipo de interao enzima-

suporte (adsoro fsica, ligao inica, ligao metlica, ligao covalente e ligaes

cruzadas e co-cruzadas).

O mtodo de ligao a suportes insolveis pode ser dividido em adsoro fsica,

ligao metlica, ligao covalente e ligao inica:

- Adsoro fsica: o mtodo mais simples e o mais empregado para imobilizao

de enzimas. As principais vantagens deste processo de imobilizao so a facilidade e a

simplicidade do processo e, alm disso, a estrutura conformacional da enzima pouco

alterada. A adsoro da enzima dependente do pH, da natureza do solvente, fora inica,


21

concentrao de enzimas e temperatura. O controle dessas variveis requerido para a

adsoro otimizada e reteno da atividade, devido ligao fraca entre suporte e enzima.

Embora este tipo de imobilizao seja fcil de executar, os mecanismos envolvidos

na unio suporte/enzima so complexos, pois envolvem vrios tipos de ligaes no

covalentes atuando simultaneamente, a saber, pontes de hidrognio, foras de Van der Waals,

interaes dipolo-dipolo, foras eletrostticas e foras hidrofbicas. Todas estas ligaes so

rompidas com facilidade atravs da variao do pH, da fora inica, temperatura e da natureza

do solvente. A fraqueza da interao suporte/enzima o fator responsvel pela fragilidade

apresentada por este tipo de sistema imobilizado. Para que o mesmo seja estvel

indispensvel que as condies de adsoro da enzima ao suporte sejam idnticas s do

sistema reacional no qual se utilizar o sistema imobilizado. Caso a interao suporte/enzima

seja de natureza essencialmente inica, uma ligeira mudana do pH ou da fora inica do

meio de reao ser suficiente para causar a dessoro da protena (DALLA-VECCHIA et

al., 2004; JEGANNATHAN et al., 2008).

No trabalho de DSouza e Godbole (2002) a invertase foi imobilizada em casca de

arroz por adsoro seguida de ligao cruzada utilizando 2% de glutaraldedo. Como a casca

de arroz possui slica obteve timas caractersticas de estabilidade. Oosterom et al., (1998)

tambm utilizou a adsoro seguida da ligao cruzada para imobilizar a enzima -

galactosidase em uma resina de troca inica tipo Duolite S-761 para utilizar na sntese de

galactosdios.

- Ligao metlica: Neste mtodo usa-se um metal de transio como ativador da

superfcie do suporte, permitindo o acoplamento direto da enzima. Tambm um mtodo de

simples preparao e fora de ligao intermediria. Mantm a atividade da enzima, porm a

estabilidade operacional obtida, quando se trabalha com substratos de alta massa molecular,

baixa, devido aos metais envolvidos (ZANIN e MORAES, 2004).

- Ligao covalente: A imobilizao por ligao covalente baseia-se na ativao de

suportes com a insero de grupos reativos que reagem com os grupos nucleoflicos da

enzima. Esta tcnica no comum como o mtodo de adsoro fsica, mas apresenta a

vantagem de evitar o fenmeno de dessoro. A seleo das condies para a imobilizao

por ligao covalente mais difcil que em outros mtodos de ligao em suportes.

necessrio conhecer a densidade dos grupos ativos por unidade de rea do suporte e a sua

geometria para reduzir a formao do complexo enzima-suporte inativo. Este mtodo pode

tambm afetar a estrutura ativa da enzima, devido alterao do centro ativo. Suas principais

vantagens so a maior resistncia do biocatalisador quanto variao de pH, temperatura e


22

influncia de solventes orgnicos; os derivados preparados podem ser empregados em

diversas conformaes de reatores, como fluxo contnuo, empacotado, tanque agitado e leito

fluidizado e, a carga de enzima permanece constante aps a etapa de imobilizao

(JEGANNATHAN et al., 2008; MATEO et al., 2007; FREITAS et al., 2011 ).

Amaya-Delgado, Hidalgo-Lara e Montes-Horcasistas, (2005) imobilizaram invertase

covalentemente em nylon-6, a qual foi estvel em uma ampla faixa de pH e temperatura

similar a da enzima livre e Coutinho Filho, Ribeiro e Maugeri Filho, (2005) imobilizaram

invertase em slica de porosidade controlada, a qual mostrou ser um excelente suporte para

imobilizao desta enzima.

-Ligao inica: O princpio envolvido no mtodo de imobilizao por ligao

inica baseia-se na atrao da enzima pelo suporte slido, que contm resduos para troca

inica. A principal diferena entre a adsoro fsica e a ligao inica a energia envolvida

entre a enzima e o suporte, pois as ligaes inicas so mais fortes do que as foras de Van

der Waals ou ligaes de hidrognio, porm mais fracas do que a ligao covalente

(FERNANDES et al., 2006).

O procedimento deste mtodo feito da mesma forma que no processo de adsoro

fsica. Como desvantagem, neste mtodo tambm pode haver a liberao da enzima pelo

suporte, por variaes de pH e fora inica do meio, visto que para este mtodo h total

dependncia destes. As vantagens so: possibilidade de reutilizao do suporte, baixo custo,

simplicidade do mtodo, disponibilidade de suportes, pouca mudana conformacional na

enzima, devido ao carter inico d

hidrólise de sacarose por invertase imobilizada em duolite ... · de sacarose, tempo de...

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