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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

FACULDADE DE VETERINÁRIA DO CEARÁ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

MAURÍCIO FRANCISCO VIEIRA NETO

EFEITO DA FLUNIXINA MEGLUMINE NA ATIVIDADE ESPERMÁTICA DE

MACHOS OVINOS E CAPRINOS

FORTALEZA - CEARÁ

2017

MAURICIO FRANCISCO VIEIRA NETO

EFEITO DA FLUNIXINA MEGLUMINE NA ATIVIDADE ESPERMÁTICA DE

MACHOS OVINOS E CAPRINOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade

de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará,

como requisito parcial para a obtenção ao título de

Mestre em Ciências Veterinárias.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade

Animal.

Linha de pesquisa: Reprodução de Pequenos

Ruminantes

Orientador: Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo

FORTALEZA - CEARÁ

2017

Aos meus pais, João Alves e Maria Celma,

pelos bons ensinamentos: dedico.

AGRADECIMENTOS

A Deus, soberano Mestre e orquestrador da vida, que me guiou e protegeu em cada passo

dado, e me livrou de cada emboscada que o destino me reservara.

A Nossa Senhora, Maria de Nazaré, por toda a interseção e proteção nesses anos de estrada,

dos 13, ao sair de casa, até aqui. E Que assim permaneça.

A meus pais, “João da Lelé” e Maria Celma, pelos anos de dedicação a mim e minha

formação pessoal e profissional, por todas as abdicações feitas em prol do meu crescimento e

pela formação moral que me concederam

À Universidade Estadual do Ceará, em especial à FAVET, que me permitiu essa capacitação

até atingir o grau de mestre.

A meu Orientador, Professor Airton Alencar, pelas conversas, paciência, ensinamentos,

puxões de orelhas e risadas soltas: muito obrigado, mesmo!

À minha banca, pessoas que considero e respeito: Professor Nunes, Dra. Gorete Flores (uma

flor à parte) e Dra. Aline Maia (o mundo vai ouvir falar muito esse nome).

À equipe que possibilitou a execução de meu experimento: Aderson Martins, Inti Rodrigues,

Jaqueline Leles, Felipe Viana, Érica Araujo, e ao Prof. Dr. Pedro Zione, que me cedeu os

animais para o estudo.

À mãe que cada aluno da Veterinária ganha quando se matricula: Joélia Carlota.

Aos professores da FAVET que me incentivaram nessa estrada: Prof. Claudio Cabral, Lucia

Lopes, Verônica Campello, Vicente José, Janaina Evangelista e Fátima Teixeira.

A todos os meus familiares, em especial Franciane Gomes, Aline Moreira, Franzé Lima e

Nagyla Maria (por último, mas não menos importante).

Aos meus amigos de estrada, destacando: Camila Goersch, Iury Lima, Natália Pereira,

Eduardo Azevedo, Bruno Galvão, Camila Lacerda, Marcio Araripe, Filipe Freitas, Valesca

Lima, Caio Vitor, Graciely Carlos, Monalyza Cadori, Paulo Ricardo, Gleyciane Bezerra,

Victor Lacerda, José Nery, Ana Clara Sarzedas, meus amigos do LFCR e todos os meus

estagiários.

Aos animais, que sempre foram as criaturas mais sinceras que vi no meu caminho.

A todos aqueles que de forma direta ou indireta, com ações ou orações, me desejaram esse

grau atingido: meu cordial obrigado.

RESUMO

A principal causa de infertilidade de machos ovinos e caprinos é a degeneração testicular, um

processo multifatorial que pode ocorrer devido a injúrias térmicas, infecciosas, idade

avançada e diversos outros fatores. É de interesse da produção animal prevenir ou pelo menos

retardar esse processo por intermédio de drogas comerciais. A Flunixina Meglumine é um

anti-inflamatório amplamente utilizado nas biotécnicas reprodutivas em fêmeas, porém pouco

estudada em machos. Assim, este trabalho objetivou avaliar o possível efeito benéfico da

Fluxinina Meglumine sobre a qualidade seminal de machos ovinos e caprinos que apresentem

quadro espermático desfavorável à reprodução. Para tanto, foram selecionados seis bodes com

idade média de sete anos e quatro carneiros com média de oito anos, pertencentes à

Universidade Federal do Ceará, cujo sêmen não atendia aos critérios do Colégio Brasileiro de

Reprodução Animal (CBRA). Foram realizados três exames andrológicos completos em uma

semana, em seguida os animais foram tratados com três doses de Flunixina Meglumine a 2,2

mg/Kg intervaladas em 48 horas a partir do D0. Uma vez por semana o sêmen dos animais foi

avaliado durante o período entre os dias D21 e D35 e uma vez por quinzena no período entre

os dias D49 e D63. Os parâmetros seminais, a circunferência escrotal e o percentual de

espermatozoides com defeitos foram comparados entre o momento antes do tratamento e os

dois que o sucediam, e após a verificação da normalidade, os dados foram avaliados por

ANOVA a 5% de probabilidade. O teste de Tukey foi empregado para as comparações entre

os momentos para cada espécie. Durante o período não ocorreu variação na circunferência

escrotal, no entanto houve melhora significativa nos dados de cinética espermática e na

morfologia dos espermatozoides, com redução de defeitos menores e maiores, que

permaneceu mesmo após cessar o tratamento. Assim, a Flunixina Meglumine apresentou uma

ação benéfica para o sêmen de machos ovinos e caprinos com quadro espermático

desfavorável, o que faz com que o uso do fármaco seja aconselhado em reprodutores hígidos

com indícios de declínio da qualidade seminal por estarem em via de senilidade.

Palavras-Chave: Exame Andrológico. Qualidade Seminal. Farmacoterapia Reprodutiva.

ABSTRACT

The main cause of infertility in male sheep and goats is testicular degeneration, which is a

multifactorial process that may occur due to several injuries, such as thermal, infectious, age-

related or other diverse factors. Preventing or slowing this process is important for animal

production, usually performed with commercial drugs. Flunixin meglumine is an anti-

inflammatory drug widely used in female reproductive biotechniques and with scarce studies

in males. Therefore, this study aimed to evaluate possible beneficial effect of flunixin

meglumine on seminal quality of male sheep and goats with spermatic characteristics

unfavorable for reproduction. In order to do so, six goats with average age of seven years and

four sheep aged eight years from the Federal University of Ceará were selected for not

meeting the criteria established by the Brazilian College of Animal Reproduction (CBRA).

Three complete andrological examinations were performed in a week. Then, animals were

treated with three applications of flunixin meglumine at 2.2mg/kg in intervals of 48h starting

at day zero (D0). Once a week, semen from the animals was collected and evaluated between

the period from D21 to D35 and once every two weeks in the period from D49 and D63.

Seminal parameters, scrotal circumference and percentage of spermatozoids with defects were

compared between the moment before treatment and the other two periods afterwards. After

verification of normality, data was analyzed by ANOVA with 5% of probability and Tukey

test was used to compare between periods in each species. During the experiment, there was

no variation in scrotal circumference. However, there was significant improvement in sperm

cell kinetics and morphology with reduction of minor and major defects, which persisted even

after ceasing the treatment. Therefore, flunixin meglumine presented a beneficial effect on the

semen of male goats and sheep that presented unfavorable spermatic characteristics. These

results indicate the use of this drug for healthy breeders with decline in seminal quality due to

advanced age.

Keywords: Andrological Examination. Seminal Quality. Reproductive Drug Therapy.

LISTA DE FIGURAS

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 1 - Evolução da motilidade espermática em carneiros de acordo

com a idade em semanas ..............................................................

19

Figura 2 - Ocorrência de patologias espermáticas em ovinos jovens de

acordo com a idade em semanas....................................................

19

CAPÍTULO 1

Figura 1 - Diagrama dos eventos ocorridos no experimento utilizando

ovinos e caprinos...……………………………………………..

42

LISTA DE TABELAS – CAPÍTULO 1

Tabela 01 - Parâmetros de motilidade espermática de machos ovinos e

caprinos submetidos ao tratamento com Flunixina

Meglumine .............................................................................

42

Tabela 02 - Circunferência escrotal e parâmetros quantitativos do sêmen

de machos ovinos e caprinos submetidos ao tratamento com

Flunixina Meglumine ...................................................................

43

Tabela 03 - Porcentagem de espermatozoides normais, defeitos menores e

defeitos maiores do sêmen de machos ovinos e caprinos

submetidos ao tratamento com Flunixina Meglumine ............

43

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AINE

COX

IA

IBGE

IM

Kg

mg

PGE

PGF

SPRD

Anti-inflamatório não esteroidal

Ciclo-oxigenase

Inseminação Artificial

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

Intramuscular

Quilograma

Miligrama

Prostaglandina E

Prostaglandina F

Sem Padrão Racial Definido

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 12

2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................... 14

2.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA TESTICULAR.............................................. 14

2.2 TRÂNSITO ESPERMÁTICO EPIDIDIMÁRIO.......................................... 15

2.3 PLASMA SEMINAL DE OVINOS E CAPRINOS .................................... 17

2.4 INFLUÊNCIA DA MATURIDADE SEXUAL SOBRE A QUALIDADE

SEMINAL.......................................................................................................

18

2.5 AVALIAÇÃO SEMINAL............................................................................. 19

2.6 ORIGEM DAS PROSTAGLANDINAS SEMINAIS.................................... 22

2.7 AGENTES ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO-ESTEROIDAIS................... 22

2.8 EFEITOS DA FLUNIXINA MEGLUMINE PARA A REPRODUÇÃO

ANIMAL ........................................................................................................

23

3 JUSTIFICATIVA.......................................................................................... 25

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA .......................................................................... 26

5 OBJETIVOS.................................................................................................. 27

5.1 GERAL........................................................................................................... 27

5.2 ESPECÍFICOS................................................................................................ 27

6 CAPÍTULO 1 - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE FLUNIXINA

MEGLUMINE SOBRE AS CARACTERÍSTICAS SEMINAIS DE

MACHOS OVINOS E CAPRINOS ........................................................

28

7 CONCLUSÃO............................................................................................... 44

REFERÊNCIAS ........................................................................................... 45

12

1 INTRODUÇÃO

A região nordeste possui os maiores rebanhos ovino e caprino do Brasil,

contendo, respectivamente, 60,6% e 92,7% dos efetivos do país (IBGE, 2015). Em ovinos, há

predomínio de raças deslanadas, sendo que os mais prevalentes são os animais Morada Nova,

Somalis, Santa Inês, seus respectivos mestiços e animais sem padrão racial definido (SPRD)

(MAIA et al., 2015). As raças caprinas mais comumente encontradas são aquelas de pelo

curto, como as nativas Moxotó, Mambrina e Canindé, e raças exóticas como a Anglo-Nubiana

e seus mestiços.

Bons resultados na criação desses animais são intrinsecamente dependentes da

eficiência reprodutiva dos progenitores, o que está diretamente ligado à capacidade

fecundante de machos e fêmeas, de maneira sincronizada. Quaisquer problemas envolvendo

um ou ambos os progenitores podem acarretar em insucesso no quadro reprodutivo do

rebanho. Assim, inúmeras variáveis podem afetar a reprodução, dentre elas: doenças

infecciosas e metabólicas, fatores nutricionais, estresse térmico, idade, injúrias inflamatórias,

traumas etc.

O desempenho andrológico de reprodutores pode ser comprometido por diversas

patologias, sendo a degeneração testicular a principal causa de subfertilidade dos machos das

espécies domésticas. Essa alteração é atribuída a fatores como intempéries climáticas, estresse

térmico e aumento da temperatura intratesticular, toxinas, inflamações, distúrbios hormonais,

afecções na pele escrotal, assim como traumas e neoplasias testiculares (CAVALCANTE et

al., 2014).

Animais expostos a estresse térmico apresentam diferentes graus de

comprometimento na libido por interferência na produção de testosterona, além de diversas

alterações na morfologia espermática, que comprometem sua fertilidade (ARMENGOL et al.,

2015). Tais indivíduos costumam apresentar redução da espermiogênese, por terem as células

do epitélio germinativo afetadas pelo aquecimento testicular (MOREIRA; MOURA;

ARAUJO, 2001). O plasma seminal desses reprodutores também sofre mudanças em sua

composição, que são observadas através do perfil proteico nos ejaculados, o que pode

comprometer a proteção espermática, maturação e o potencial fecundante espermático

(ROCHA et al., 2015).

A temperatura ambiente é uma variável que sempre deve ser considerada, uma vez

que o animal pode sofrer estresse tanto pela sua termólise insuficiente quanto pela intensidade

dos fatores climáticos, independente de haver adaptação ou não. Isso é mais frequentemente

13

evidenciado em rebanhos de raças exóticas submetidas à criação sem conforto térmico em

ambiente desfavorável (ARMENGOL et al., 2015), mas também pode ser observado em

rebanhos nativos criados em instalações inadequadas.

Assim, a raça ou tipo racial também deve ser considerado. Animais nativos ou

naturalizados sofrem menos efeitos de estresse por fatores ambientais. Na ovinocultura de

corte do nordeste brasileiro tem-se introduzido raças exóticas como a Dorper e a Bergamácia,

com o intuito de promover melhor ganho de peso das crias de ovelhas Santa Inês (MAIA et

al., 2015) e na caprinocultura leiteira, cada vez mais tem-se adicionado genética europeia, em

especial a Saanen, muitas vezes de maneira não orientada.

A idade do animal é um fator limitante para a reprodução, visto que machos muito

jovens, mesmo que já púberes, apresentam baixos índices reprodutivos (VIU et al., 2006;

SOUZA, 2007), enquanto que, em contrapartida, animais idosos também apresentam sêmen

de qualidade progressivamente inferior (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Assim, tem-se

recomendado que a idade limite para a permanência do macho ovino ou caprino na atividade

reprodutiva seja de oito anos (AZEVEDO; CAMPELO, 2004).

O monitoramento da qualidade seminal de reprodutores deve ser realizado através

de exames andrológicos periódicos, onde são também consideradas a libido, a circunferência

escrotal e as patologias espermáticas de ordem maior e menor (CBRA, 2013). Em acréscimo,

visando uma maior fidedignidade nos resultados, programas computadorizados como o

Computer Assisted Sperm Analisys (CASA) são aconselhados para se obter os valores

relativos à cinética espermática (ALVES, 2014).

Por fim, em busca de melhorar os índices produtivos e reprodutivos em machos e

fêmeas tem-se utilizado recursos como o uso de fármacos que reduzam os efeitos das injúrias

sofridas pelos animais, sejam elas de natureza ambiental, nutricional, infecciosa ou mecânica.

A exemplo disso, o anti-inflamatório não-esteroidal (AINE) Flunixina Meglumine vem sendo

amplamente utilizado por prolongar a fase luteal do ciclo estral de fêmeas submetidas a

manipulação reprodutiva por biotecnias, para reduzir a secreção de prostaglandinas uterinas e

aumentar os índices de concepção (CARDOSO, 2009).

O uso desse fármaco em machos é ainda pouco estudado, mas sabe-se que ele tem

capacidade de melhorar e aumentar a taxa de reação acrossomal in vitro em carneiros, o que é

associado à modulação da concentração de prostaglandina E2 - PGE2 (ARCHBALD, 1990).

14

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA TESTICULAR

As gônadas masculinas dos ruminantes são estruturas situadas fora do abdômen,

inseridas no saco escrotal e revestidas pela túnica vaginal, que é uma extensão do peritônio.

Os espermatozoides produzidos deixam os testículos através do ducto eferente, que se

comunica com o ducto deferente, onde parte das secreções das glândulas acessórias é

adicionada ao ejaculado. O restante da secreção que compõe o sêmen é adicionado na porção

pélvica da uretra (HAFEZ; HAFEZ, 2004).

O testículo é um órgão que funciona como glândula endócrina e exócrina, com

duas funções essenciais: a espermatogênese e a produção hormonal (THIBAULT;

LEVASSEUR, 2001). Os túbulos seminíferos produzem de forma cíclica os gametas

masculinos e essa capacidade de produção está intimamente relacionada às dimensões

testiculares e, naturalmente, ao seu volume e peso. O testículo tem capacidade de produzir até

19 milhões de espermatozoides por grama do órgão, diariamente, o que permite que um

carneiro saudável seja capaz de produzir a cada dia o equivalente à quantidade de células

necessárias a dois ejaculados (JONES; DACHEUX, 2007).

O epitélio seminífero tem uma produção constante de células espermáticas

(HAFEZ; HAFEZ, 2004). O tempo total necessário à produção de um espermatozoide a partir

da espermatogônia varia segundo a espécie, sendo de 42 a 53 dias na espécie ovina

(MOREIRA; MOURA; ARAUJO, 2001) e de 50 a 53 na espécie caprina (HAFEZ; HAFEZ,

2004).

Vale ressaltar que o estudo de Moreira, Moura e Araujo (2001) evidenciou que o

estresse térmico interfere negativamente nos primeiros estágios da espermatogênese,

principalmente nas fases de multiplicação das espermatogônias e o início da divisão meiótica.

Isso se reflete no ejaculado, onde podemos encontrar redução do volume, da concentração

espermática, do vigor, da motilidade massal e do percentual de espermatozoides móveis

(COELHO, 2006).

A constância da espermatogênese está relacionada à ação de hormônios, como a

testosterona secretada pelas células de Leydig, ou células intersticiais. Tais secreções são

escoadas e alcançam níveis sistêmicos através das veias testiculares e também vasos linfáticos

(HAFEZ; HAFEZ, 2004).

15

2.2 TRÂNSITO ESPERMÁTICO EPIDIDIMÁRIO

Os gametas produzidos nas gônadas seguem para a maturação epididimária. De

acordo com Hafez e Hafez (2004), o epidídimo é um órgão dividido em três porções: cabeça,

corpo e cauda. Histologicamente são distintos os três segmentos de ductos epididimários, no

decorrer dos quais os estereocílios vão progressivamente reduzindo em altura. Nos dois

primeiros, ocorre a maturação espermática propriamente dita, enquanto o segmento terminal

destina-se ao armazenamento de espermatozoides, que pode comportar até 80% do número de

células armazenadas no epidídimo (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Para Jones e Dacheux (2007), o

epidídimo do carneiro é capaz de comportar o equivalente a 28 vezes a capacidade de

produção espermática diária do testículo do animal.

É por volta da trigésima semana de vida que o epidídimo e outros segmentos do

trato reprodutivo masculino do ovino passam a influenciar consideravelmente nos aspectos da

função espermática, momento este que antecede o pico de concentração de testosterona na

circulação periférica (SOUZA et al., 2003). Até então, cordeiros podem apresentar células

espermáticas com discreta mobilidade, no entanto a motilidade progressiva só é alcançada

posteriormente (SOUZA, 2007).

Diversas funções são atribuídas ao epidídimo, como a reabsorção de fluídos dos

túbulos seminíferos, promovendo a concentração do sêmen, o transporte dos espermatozoides,

a eliminação das células espermáticas defeituosas, a maturação e o armazenamento dos

gametas masculinos (MURADÁS et al., 2006). A eliminação de espermatozoides defeituosos

é uma importante função deste órgão, também citada por Moreira, Moura e Araújo (2001).

O armazenamento espermático na cauda do epidídimo preserva sua viabilidade

por semanas, desde que haja a manutenção da termorregulação e da atuação da testosterona

(HAFEZ; HAFEZ, 2004). Segundo Muradás et al. (2006), a função de armazenamento é

ilustrada pelo fato dos espermatozoides ejaculados sobreviverem por 24 horas ou mais fora do

epidídimo, enquanto os que são mantidos na cauda do epidídimo (in vivo) permanecem vivos

por mais de 15 dias.

De acordo com Jones e Dacheux (2007), o trânsito espermático epididimário na

espécie ovina pode requerer um período de até 16,4 dias para se completar. No entanto, a

média de dias para esse trânsito costuma ser de 9 a 13 dias, e é nesse percurso que o gameta se

torna maturo (HAFEZ; HAFEZ, 2004). A funcionalidade do epidídimo está relacionada à

manutenção de um metabolismo com baixa atividade espermática, prevenindo a ativação

prematura dos espermatozoides (MURADÁS et al., 2006).

16

Segundo Jones e Dacheux (2007) a manutenção de um baixo pH e a reduzida

concentração de bicarbonato no plasma seminal são asseguradas pelos ductos epididimários.

Contudo, acredita-se que em animais submetidos a estresse térmico ocorre mudança na

composição bioquímica dos ejaculados, tanto nas secreções testiculares como epididimárias,

além da morte de espermatozoides, fatores esses responsáveis pela elevação do pH do fluido

seminal (MOREIRA; MOURA; ARAUJO, 2001).

Durante a passagem dos espermatozoides por este segmento do trato reprodutivo

masculino, ocorre uma série de modificações que configuram a maturação espermática

(JONES; DACHEUX, 2007). É no corpo do epidídimo que eles adquirem potencial para

movimento unidirecional e vigoroso e, ao chegarem à cauda recebem fatores que propiciam a

fertilização, sendo esse o motivo para que os espermatozoides dessa região sejam

naturalmente mais fecundantes que os demais (HAFEZ; HAFEZ, 2004).

É no curso desse trânsito que ocorrem diversas alterações na célula espermática

para que a mesma adquira habilidade fecundante, podendo ser destacadas: desenvolvimento

de potencial para sustentar a motilidade progressiva, alteração dos padrões metabólicos e

organização estrutural de organelas, alterações na cromatina nuclear, mudanças na natureza da

superfície da membrana plasmática, movimento e perda da gota citoplasmática e, em algumas

espécies, podem ocorrer modificações na forma do acrossomo (HAFEZ; HAFEZ, 2004).

É possível que o colesterol excretado pelas células epididimárias contribua para a

maturação dos espermatozoides em trânsito (SAEZ et al., 2011). Segundo Cross (1998), as

mudanças que ocorrem na célula espermática durante o processo de capacitação são

dependentes da forma como o colesterol está arranjado na membrana plasmática. O mesmo

atua ainda na integridade do espermatozoide. O colesterol é um fator decapacitante, que

estabiliza a membrana plasmática espermática durante o trânsito no epidídimo e evita as

interações intermoleculares que levam à capacitação (DAVIS, 1980).

Em diferentes espécies animais, a proporção de colesterol presente na membrana

plasmática do espermatozoide altera durante o trânsito epididimário. Pode ocorrer uma

redução de 50% em ratos (REJRAJI et al., 2006), hamsters (AWANO et al., 1993) e carneiros

(PARKS; HAMMERSTEDT, 1985). Na espécie caprina, o teor de colesterol aumenta durante

essa maturação (RANA et al., 1991) enquanto que, em suínos permanece constante

(NIKOLOPOULOU et al., 1985).

17

2.3 PLASMA SEMINAL DE OVINOS E CAPRINOS

O plasma seminal do ejaculado é o composto resultante das secreções do testículo,

epidídimo, ducto deferente e glândulas sexuais acessórias (vesiculares, bulbouretrais e

próstata) (EVANS; MAXWELL, 1990). Ele desempenha um papel crítico na capacidade de

fertilização dos espermatozoides, já havendo mais de 700 proteínas identificadas em sua

composição. Esse composto contém íons inorgânicos, açúcares, sais orgânicos, lípidos,

enzimas, prostaglandinas, proteínas e vários outros fatores (SOLEILHAVOUP et al., 2014).

As proteínas adicionadas ao plasma seminal durante o percurso do sêmen pelo

trato reprodutivo estão associadas a inúmeros aspectos da função reprodutiva em ruminantes

(BELLIN et al., 1994; SPROTT et al., 2000; MOURA, 2005). Ao longo do desenvolvimento

reprodutivo do carneiro Santa Inês, o perfil proteico do plasma seminal sofre alterações

significativas, refletindo a associações com a função espermática e outros aspectos da

maturidade sexual (SOUZA, 2007).

Essas alterações podem ser mais bruscas quando da ocorrência de insultos, como

no estresse térmico. Nesses casos, foram identificados no plasma seminal elementos como a

proteína Dj-1 (PDJ-1) e a proteína de choque térmico HSP70.3, além da proteína C-reativa,

que é encontrada em casos de dano celular e inflamação. A ocorrência desses fatores é

concomitante a mudanças nos parâmetros do sêmen, o que compromete a proteção

espermática, maturação e potencial fecundante espermático (ROCHA et al., 2015).

No sêmen caprino, naturalmente pode-se encontrar enzimas que interagem com os

fosfolipídios de alguns diluentes seminais. Segundo Gibbons (2002), a EYCE é uma

Fosfolipase A secretada pela glândula bulbouretral que possui atividade coagulante sobre os

lipídios da gema de ovo, um dos principais crioprotetores adicionados a diluentes seminais

nessa espécie. Uma vez na presença de cálcio, essa enzima catalisa e hidrolisa a lecitina da

gema de ovo, produzindo lisolecitina e ácidos graxos, e induzindo no espermatozoide a reação

acrossomal e a descondensação da cromatina.

Outra fração proteica do ejaculado caprino, também originada nas bulbouretrais, é

a SBU III, que interage com diluentes à base de leite, provocando inibição da motilidade,

ruptura do acrossoma e morte celular espermática. O efeito deletério dos diluentes seminais

ricos em lipídios, como os do leite e da gema de ovo, na espécie caprina, é conferido pela

interação entre essas enzimas presentes no ejaculado dessa espécie e os fosfolipídios

adicionados durante a diluição, e pode resultar na morte dos espermatozoides colhidos

(NUNES, 1982).

18

2.4 INFLUÊNCIA DA MATURIDADE SEXUAL SOBRE A QUALIDADE SEMINAL

Em um estudo realizado com biometria testicular e qualidade de sêmen de touros

Nelore em diferentes faixas etárias, foi observado que a partir da puberdade até o início da

vida adulta ocorre um aumento da circunferência escrotal, do peso e do volume testicular

proporcional ao aumento do peso vivo dos animais. Aliado a isso, foi evidenciado, com o

avançar desse período, uma melhoria das características morfológicas dos espermatozoides

obtidos nos ejaculados colhidos durante do experimento. A esse avanço de idade foi

percebido uma simultânea modificação do formato testicular, ficando este gradativamente

mais ovalado (VIU et al., 2006).

Quando comparados os quadros seminais de carneiros jovens de um a dois anos

de idade com o de animais mais maduros, de quatro a cinco anos, evidencia-se que nos

animais mais velhos, há uma melhor qualidade seminal, que pode ser evidenciada inclusive

após o descongelamento do sêmen. O ejaculado de animais mais velhos não senis apresenta

melhores parâmetros, como motilidade, integridade de membrana e potencial de membrana

mitocondrial (LYMBEROPOULOS; TSAKMAKIDIS; KHALIFA, 2010). O mesmo é

postulado por Mandiki et al. (1998), onde relatam que a qualidade seminal de carneiros é

superior durante o terceiro ano de vida, quando comparado ao segundo.

Um exemplo de melhoria do potencial reprodutivo com a maturidade sexual foi

observado ao se acompanhar a evolução do quadro seminal de cordeiros Santa Inês, onde

percebeu-se que a produção dos primeiros espermatozoides inicia por volta de 23 semanas de

vida, mas que só em torno das 28 atingem a puberdade (SOUZA; MOURA; LIMA, 2001). É

notório que, mesmo iniciando a produção espermática bastante cedo, a percentagem de

espermatozoides móveis apresenta variações pequenas e graduais até cerca de 23 semanas

(Figura 01), com alterações mais acentuadas após esta fase. Já a motilidade progressiva só

começa a desenvolver-se mais intensamente após 25 semanas de idade e valores acima de

70% de espermatozoides móveis podem ser observados a partir de 30 semanas. Por fim, a

concentração espermática apresenta valores significativos somente às 42 semanas de idade,

quando os animais já são reprodutivamente maduros (SOUZA et al., 2003).

Carneiros muito jovens tem sua fertilidade comprometida por apresentarem um

maior percentual de espermatozóides anormais (Figura 02). Às 15 semanas de vida pode-se

encontrar defeitos em até 88% dos espermatozoides, enquanto às 36 semanas podem

apresentar menos de 16% (SOUZA et al., 2007).

19

Figura 1 – Evolução da motilidade espermática em carneiros de acordo com a idade em

semanas.

Fonte: Adaptado de Souza (2007).

Figura 2 – Ocorrência de patologias espermáticas em ovinos jovens de acordo com a

idade em semanas.

Fonte: Adaptado de Souza (2007).

2.5 AVALIAÇÃO SEMINAL

Segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA), a avaliação da

qualidade seminal é conferida através de exame clínico-andrológico, acompanhado de

espermograma. A colheita de sêmen em pequenos ruminantes pode ser realizada através de

vagina artificial ou eletroejaculação. As características a serem estudadas são o volume do

Idade em semanas

Idade em semanas

Per

cen

tual

de

esp

erm

ato

zoid

es m

óve

is

Per

cen

tual

de

Pat

olo

gias

Esp

erm

átic

as

20

ejaculado, a cor, o aspecto, turbilhonamento, motilidade, vigor e a concentração espermática.

São ainda avaliadas as características morfológicas, por meio de esfregaço corado em lâmina

(CBRA, 2013).

De acordo com Maia (2010), após a colheita, o sêmen deve ser mantido em

banho-maria a uma temperatura constante de 37 °C e imediatamente ocorrer a avaliação

quanto ao volume, aspecto, turbilhonamento, motilidade e vigor espermático. Em acréscimo,

visando uma maior fidedignidade nos resultados, programas computadorizados como o

Computer Assisted Sperm Analisys (CASA) são aconselhados para se obter os valores

relativos à cinética espermática (ALVES, 2014).

O volume do ejaculado é medido em mililitros e, de acordo com CBRA (2013),

sofre influência do método de colheita do sêmen, do regime de serviços, do tempo de

excitação e de outros fatores. Segundo Hafez e Hafez (2004), o volume médio obtido a cada

ejaculação de pequenos ruminantes é em torno de 0,8 a 1,2 mL, mas quando a colheita é

realizada através de métodos como a eletroejaculação pode ocorrer estímulo de glândulas

acessórias, o que aumenta o volume e diluição do ejaculado (RODRIGUES, 2007).

A cor do ejaculado nas espécies ruminantes domésticas varia entre branco e

amarelo-marfim. O aspecto varia de acordo com a concentração de espermatozoides, podendo

ser cremoso grosso ou fino, leitoso, seroso ou aquoso (CBRA, 2013).

O turbilhonamento, ou movimento de massa, é um movimento em forma de ondas

observado em uma gota de sêmen puro, que é resultante da motilidade, do vigor e da

concentração espermática. Essa característica recebe a atribuição de notas através de escores

subjetivos que variam de zero a cinco (COLAS, 1980), onde zero corresponde à ausência de

turbilhonamento e cinco ao turbilhonamento máximo (MAIA, 2010). Isso pode ser feito com

uma gota de sêmen puro sobre uma lâmina de vidro (a 37 °C) e avaliada ao microscópio

óptico com uma ampliação de 100 vezes (MAIA, 2015).

A motilidade, por sua vez, representa o percentual de espermatozoides móveis

visualizados em lâmina. A avaliação da motilidade espermática deve ser feita com uma

pequena gota de sêmen depositada sobre uma lâmina de vidro limpa e aquecida (37 ° C),

diluída com uma gota de solução de citrato de sódio a 2,94% e coberta com lamínula e, em

seguida, examinada sob microscopia óptica (400x). A avaliação é também subjetiva e requer

que preferencialmente três campos sejam analisados por lâmina para que se estime a

percentagem de espermatozoides móveis (MAIA, 2015). Já o vigor representa a intensidade

do movimento espermático e é também classificado através de escores entre um e cinco

(CBRA, 2013).

21

De acordo com o CBRA (2013), a concentração espermática representa o número

de espermatozoides por milímetro (mm) ou centímetro (cm) cúbico (1 cm³ = 1 mL). O

procedimento mais comum para obtê-la é através da contagem de células em câmara de

Neubauer, mas pode-se usar ainda a espectrofotometria ou métodos computadorizados. A

diluição para a mensuração da concentração espermática pode ser variável de 1:100 a 1:400 e

o número total de espermatozoides do ejaculado é calculado pelo produto do volume pela

concentração espermática.

A avaliação das características morfológicas dos espermatozoides é feita a partir

de esfregaços de sêmen observados ao microscópio óptico ou preparação úmida, em

microscópio de contraste de fase ou de interferência diferencial, associados ou não (CBRA,

2013). Segundo Maia (2015), é interessante que a coloração da lâmina com essa finalidade

seja feita com a eosina-nigrosina, contudo, uma alternativa interessante é utilizar o azul de

bromofenol, que se assemelha à eosina-nigrosina na avaliação do porcentual de células e

vivas e mortas e de patologias espermáticas, sendo que se mostra mais eficiente à temperatura

ambiente, além de fornecer lâminas de melhor qualidade para a visualização de alterações de

cabeça espermática e integridade de membrana (MEDEIROS et al., 2006). A morfologia

espermática é determinada ao se avaliar 200 espermatozoides por lâmina e categorizar suas

anomalias em defeitos maiores e defeitos menores (MAIA, 2015).

O Manual do CBRA (2013) descreve que as patologias espermáticas podem ser

enquadradas na classificação de Blom, onde os defeitos são categorizados em maiores ou

menores e são ainda citadas a presença de células de descamação, leucócitos etc. Nesse

modelo de avaliação das células espermáticas, são considerados defeitos de ordem maior

algumas anomalias de cabeça e acrossomo, das peças intermediária e principal e algumas

formas teratológicas.

As patologias relevantes de cabeça e acrossomo são o subdesenvolvimento,

cabeça isolada de formato anormal, contorno anormal da célula, cabeça estreita na base,

piriforme, pequena anormal e as chamadas “pouch formation” (vacuolizações). Na peça

intermediária a gota citoplasmática proximal, peça rudimentar, fibrilação, edema, pseudogota

etc. O único defeito da peça principal considerável nesse modelo de avaliação é a cauda

fortemente dobrada. Toda e qualquer forma teratológica espermática também será considerada

um defeito maior. São considerados defeitos de ordem menor as apresentações de cabeça

delgada, gigante, curta larga e pequena normal (CLGP), cabeça isolada normal, defeitos de

implantação, cauda dobrada (“bent-tail”), gota citoplasmática distal e cauda enrolada na

porção terminal (MIES FILHO, 1987).

22

2.6 ORIGEM DAS PROSTAGLANDINAS SEMINAIS

As prostaglandinas são eicosanoides de síntese induzida, ou seja, cuja presença

não está vinculada ao armazenamento prévio. Sua biossíntese inicia a partir da liberação de

ácidos graxos membranares, como o ácido araquidônico, sob ação da fosfolipase A. Uma vez

que o ácido graxo é liberado, esse sofre ação das ciclooxigenases (COX), originando

prostaglandinas, prostaciclinas e tromboxanos, importantes em processos inflamatórios

(PALERMO-NETO; ARRUDA; MADUREIRA, 2014).

A síntese de prostaglandinas é possibilitada quando da maior liberação de

precursores, e isso pode ocorrer em processos degenerativos, onde ocorre maior

disponibilização de fosfolipídios devido ao desprendimento do epitélio seminífero

(CAVALCANTE et al., 2014)

O ejaculado de carneiros e bodes é naturalmente rico em diferentes tipos de

prostaglandinas produzidas principalmente pelas vesículas seminais, sendo as séries E e F as

mais comuns, e a diminuição da concentração de algumas delas está associada à redução da

fertilidade do reprodutor (MARLEY et al., 1997). Em contrapartida, um aumento na

concentração de prostaglandina E2 é associado a uma menor taxa de reação acrossomal por

parte do espermatozoide ovino, o que reduz a fertilidade do reprodutor (ARCHBALD et al.,

1990).

A adição de prostaglandina F2α ao plasma seminal pode causar redução da

fertilidade em touros e coelhos, visto que pode causar danos acrossomais e a liberação

precoce de transaminases e lactato desidrogenase. Já em ovinos, é observado que não ocorre

liberação de enzimas transaminases, fato este relacionado à resistência dessa espécie ao

agente (FAYED, 1996). Em equinos, a adição de prostaglandina ajuda a manter a motilidade

espermática e é uma ferramenta útil em animais idosos (ŞEN; AKÇAY, 2015).

2.7 AGENTES ANTI-INFLAMATÓRIOS NÃO-ESTEROIDAIS (AINES)

Os agentes anti-inflamatórios são fármacos capazes de reduzir os efeitos

conferidos pelas injúrias inflamatórias que afetam o organismo dos animais, através da

inibição de enzimas que atuam na via do ácido araquidônico. Dentro dessa classe de drogas,

há os Anti-Inflamatórios Não-Esteroidais (AINES). A exemplo desta categoria, temos a

Flunixina Meglumine, que possui potente ação analgésica, anti-inflamatória e anti-

endotoxêmica, que atua em distúrbios musculoesqueléticos (TASAKA, 2014).

23

De acordo com Andrade (2008), o efeito anti-inflamatório conferido pelos AINES

ocorre em virtude da inibição da via cicloxigenase (COX), o que impede o metabolismo do

ácido araquidônico. A enzima apresenta duas isoformas principais, sendo a COX-1

constitutiva dos tecidos e a COX-2 uma enzima de síntese induzida, produzida principalmente

pelos macrófagos e células envolvidas no processo inflamatório. Durante a fisiopatologia do

processo inflamatório, ao agir sobre o ácido araquidônico a COX origina prostaglandinas,

prostaciclinas e tromboxanos (ALENCAR; ROCHA; PINHEIRO, 2005).

AINES que atuam apenas sobre a COX-2 são classificados como COX-seletivos,

enquanto aqueles que inibem indiscriminadamente tanto a COX-1 quanto a COX-2, são

denominados COX não seletivos, e causam a maioria de seus efeitos colaterais (TASAKA,

2014). A maior parte desses efeitos indesejáveis está relacionada ao trato gastrintestinal e ao

sistema renal (ALENCAR; ROCHA; PINHEIRO, 2005).

A Flunixina Meglumine é classificada como um ácido aminonicotínico, não-

esteroidal e COX não seletivo (ALENCAR; ROCHA; PINHEIRO, 2005). A dose terapêutica

anti-inflamatória recomendada para o uso desse fármaco varia de acordo com a espécie, mas

em fêmeas caprinas a administração de a 1,1 a 2,2 mg/Kg, por via oral, intramuscular ou

intravenosa, costuma ser suficiente para suprimir a síntese de prostaglandinas inflamatórias

(KÖNIGSSON et al., 2003).

Por ser um AINE COX não seletivo, sua utilização deve ser cautelosa, pois o uso

indiscriminado da Flunixina Meglumine pode ser associado efeitos colaterais como alterações

renais e problemas gastrintestinais, uma vez que atua indiscriminadamente nas isoformas da

enzima (TASAKA, 2014).

2.8 EFEITOS DA FLUNIXINA MEGLUMINE NA REPRODUÇÃO ANIMAL

Na esfera reprodutiva, a maioria dos estudos que envolvem o uso de Flunixina

Meglumine está relacionada a seus efeitos em fêmeas e sua atuação tanto em nível de útero

quanto de ovário. No entanto, há pouco conhecimento científico acerca de sua atuação nas

gônadas masculinas (ARCHBALD et al., 1990).

Segundo Cardoso (2009), durante a manipulação do trato reprodutivo de fêmeas

bovinas ocorre liberação de PGF2α pelo endométrio, que pode comprometer as taxas de

prenhez. Quando elas são submetidas a biotecnias reprodutivas (a exemplo da transferência de

embriões) ocorre maior estímulo a tal liberação, que é responsável por reduzir o percentual da

taxa de prenhez.

24

Em um estudo onde foi avaliada a influência do uso de Flunixina Meglumine em

ovelhas submetidas à inseminação artificial (IA) por fixação cervical, viu-se que quando o

inseminador era hábil e causava mínima manipulação do trato reprodutor feminino, o uso da

droga não causa incremento significativo na taxa de prenhez alcançada (RASSABA, 2007).

Em éguas foi descrito um aumento nas taxas de prenhez quando utilizada a

Flunixina Meglumine concomitante ao cio, independente de se realizar a inseminação

artificial ou a monta natural (RISCO et al., 2009) o que, provavelmente, seja devido à redução

na liberação de PGF2α, que também ocorre nessa espécie. A literatura mostra resultados

distintos quando se estuda o efeito de inibidores da síntese de prostaglandinas sobre a taxa de

prenhez em bovinos, mas o uso da Flunixina Meglumine já é considerado um dos fatores

determinantes para o sucesso de biotecnias reprodutivas na espécie (CARDOSO, 2009). O

uso desse AINE é aconselhado em protocolos de sincronização de estro de fêmeas bovinas,

pois a redução do número de inseminações para se obter uma concepção, reduzindo ainda, as

despesas com repetições de protocolos (GUZELOGLU et al., 2007).

Além da redução na liberação de prostaglandinas, a Flunixina Meglumine atua

também no corpo lúteo, causando o prolongamento da fase luteínica do ciclo estral, que pode

ser evidenciado em ovelhas tratadas com o fármaco (AKÉ-LÓPEZ et al., 2005).

No tocante à atuação da Flunixina Meglumine sobre a qualidade seminal a

literatura apresenta pouco material científico. Em um estudo do efeito da droga sobre a

atividade espermática de carneiros foi sugerido que há uma relação inversa entre a

concentração plasmática de prostaglandina (PGE2) no sêmen e a reação acrossomal

espermática in vitro. Tendo em vista que o medicamento é capaz de reduzir tal concentração,

pode influenciar na qualidade seminal nesse parâmetro e favorecer a reprodução da espécie in

vitro (ARCHBALD et al., 1990).

25

3 JUSTIFICATIVA

A Flunixina Meglumine é um potente anti-inflamatório usado na clínica

veterinária para tratamento de distúrbios musculares, cólica em equinos, diarreia em bezerros

recém-nascidos e na Síndrome MMA (mastite-metrite-agalaxia) em suínos. No que diz

respeito à reprodução animal, há uma gama de informações acerca do uso da droga em fêmeas

de diferentes espécies (CARDOSO, 2009; RISCO et al., 2009; AKÉ-LOPEZ et al., 2005).

Contudo, há poucos trabalhos com o uso deste princípio ativo em machos das espécies ovina e

caprina, a exemplo do trabalho de Archbald et al. (1990), com o efeito do uso do anti-

inflamatório sobre a qualidade seminal de ovinos. Há necessidade de se estudar o efeito da

droga sobre as características seminais e adequar uma dose e protocolo de administração a

pequenos ruminantes, com a finalidade de melhorar a qualidade reprodutiva dos machos

dessas espécies. O uso do fármaco em reprodutores, já realizado por clínicos de campo, tem

surtido resultados satisfatórios. Até mesmo na atividade reprodutiva, há relatos da melhora do

quadro espermático de machos após algum estresse que venha interferir na atividade

testicular. Uma vez estabelecido um protocolo e corroborado o efeito benéfico, a droga pode

ser empregada na reversão de quadros seminais desfavoráveis à reprodução e no incremento

prévio do potencial reprodutivo de machos ovinos e caprinos, antes de iniciar a estação de

monta.

26

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

A Flunixina Meglumine tem ação benéfica sobre o sêmen de ovinos e caprinos,

promovendo uma melhoria nas características seminais de reprodutores saudáveis que

apresentem um quadro espermático desfavorável à reprodução devido à senilidade.

27

5 OBJETIVOS

5.1 GERAL

Avaliar o efeito da Fluxinina Meglumine sobre a qualidade seminal de machos

ovinos e caprinos que apresentem quadro espermático desfavorável à reprodução em virtude

da senilidade.

5.2 ESPECÍFICOS

1. Verificar a qualidade do quadro espermático de ovinos e caprinos submetidos ao

tratamento com Flunixina Meglumine através de exames clínico-andrológicos;

2. Verificar se a dose 2,2 mg/Kg de Flunixina Meglumine favorece a reversão de um quadro

de baixa qualidade seminal;

3. Verificar se a droga causa redução no número de patologias espermáticas dos ejaculados;

4. Verificar se ocorre alguma mudança nos parâmetros de cinética espermática, após o uso da

droga.

28

6 CAPÍTULO 1

Effect of the administration of Flunixine Meglumine on seminal caracteristics of sheep

and goats males.

Efeito da administração de Flunixina Meglumine sobre as características seminais de machos

ovinos e caprinos.

Artigo Submetido ao periódico: Semina: Ciências Agrárias

Qualis do Periódico: B1

Data de Submissão: 11/04/2017

Aceito para publicação em: 04 de Agosto de 2017.

29

Effect of Flunixin Meglumine administration on seminal characteristics of male sheep

and goat

Efeito da administração de Flunixina Meglumine sobre as características seminais de

machos ovinos e caprinos

Maurício Francisco Vieira Neto1*

; Inti Campos Salles Rodrigues2; Jaqueline da Silva Leles

2;

Érica Pinto de Araújo3; Aderson Martins Viana Neto

4; Felipe Viana de Carvalho

5; Maria

Gorete Flores Salles6; Airton Alencar de Araújo

7

Abstract: Testicular degeneration is a multifactorial process increasing the concentration of

prostaglandins in seminal plasma. Both increase and decrease of these hormones tend to

promote loss of seminal quality. Flunixin meglumine is a potent anti-inflammatory drug

capable of modulating the production of prostaglandins and is widely used in female

reproduction. However, it is rarely used in males with the same objective. Therefore, this

study aimed to evaluate the effects of this drug on seminal quality of male lambs and goats

with spermatic characteristics unfavorable for reproduction. To this end, a total of 15 breeding

animals were evaluated, of which six goats and four sheep with poor seminal quality were

selected according to the criteria established by the Brazilian College of Animal Reproduction

(CBRA). Three semen samples were collected from each animal. Then, the flunixin

meglumine treatment was initiated and ejaculates were collected at two different periods after

the drug was administered (from day 21 until day 35 and from day 49 to day 63).

Macroscopic and microscopic parameters were assessed in semen samples and scrotal

circumference and percentages of sperm pathologies were measured and compared between

the three periods. Data with normal distribution were analyzed using ANOVA at 5%

probability, and comparisons between periods within the same species were performed using

the Tukey test. An improvement was observed in the analyses of mass motility, percentage

motility, and sperm vigor. Scrotal circumference had no variation. Concerning sperm

pathologies, an increase in the number of normal spermatozoids was observed due to a

significant reduction in minor and major defects, and the latter remained low even after the

treatment was finished. Therefore, flunixin meglumine presented beneficial effects on seminal

parameters of male goats and lamb with unfavorable spermatic characteristics. These findings

indicate this drug may be used in the treating of males with testicular injuries or of breeders

with reduced seminal quality due to advanced age.

Key words: Andrology. Animal Reproduction. Prostaglandins. Seminal Quality.

1 Discente de Mestrado, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, PPGCV, Universidade Estadual do Ceará,

UECE, Fortaleza, CE, Brasil. E-mail: [email protected] 2 Mestres Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, PPGCV, UECE, Fortaleza, CE, Brasil. E-mail:

[email protected]; [email protected] 3 Discente de Mestrado, Programa de Pós-Graduação em Zootecnia, PPGZ, Universidade Federal do Ceará, UFC, Fortaleza,

CE, Brasil. E-mail: [email protected] 4 Discente de Doutorado, Programa de Doutorado Integrado em Zootecnia, PDIZ, UFC, Fortaleza, CE, Brasil. E-mail:

[email protected] 5 Discente de Graduação em Medicina Veterinária, UECE, Fortaleza, CE, Brasil. E-mail: [email protected] 6 Profa Adjunta, Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira, UNILAB, Redenção, CE, Brasil. E-

mail: [email protected] 7 Prof. Associado, Universidade Estadual do Ceará, UECE, Fortaleza, CE, Brasil. E-mail: [email protected]

*Author for corresponsdence

30

Resumo: A degeneração testicular é um processo multifatorial que leva ao aumento das

prostaglandinas no plasma do ejaculado, sendo que tanto seu acréscimo quanto a redução

baixam a qualidade seminal. A Flunixina Meglumine é um potente anti-inflamatório, capaz de

modular a produção de prostaglandinas, amplamente difundido na reprodução de fêmeas, mas

pouco utilizado em machos para esse fim. Por isso, esse trabalho buscou avaliar o efeito deste

fármaco sobre a qualidade seminal de machos ovinos e caprinos que apresentem quadro

espermático desfavorável à reprodução. Para tanto, um total de 15 reprodutores pertencentes à

Universidade Federal do Ceará foram avaliados, dos quais foram selecionados seis bodes e

quatro carneiros com sêmen de baixa qualidade, segundo os critérios do Colégio Brasileiro de

Reprodução Animal (CBRA). Foram realizadas três colheitas prévias de cada animal,

aplicado o tratamento com Flunixina Meglumine e, em seguida, foram colhidos ejaculados de

dois momentos posteriores à aplicação do fármaco (do D21 ao D35 e do D49 ao D63). Os

parâmetros espermáticos de natureza macro e microscópica, assim como a circunferência

escrotal e o percentual de patologias espermáticas foram comparados entre os três momentos

e os dados de distribuição normal foram avaliados por ANOVA a 5% de probabilidade e as

comparações entre os momentos dentro de cada espécie quando significativa foram feitas pelo

teste de Tukey. Houve melhora na motilidade massal, motilidade percentual e vigor

espermático. Não ocorreu variação da circunferência escrotal e, no tocante às patologias

espermáticas, observou-se um aumento no número de espermatozoides normais, devido a uma

redução significativa de defeitos menores e maiores, sendo que estes permaneceram menores

mesmo após cessar a influência do tratamento. Assim, a Flunixina Meglumine mostrou uma

ação benéfica sobre os parâmetros seminais de machos ovinos e caprinos com quadro

espermático desfavorável, sugerindo a indicação do fármaco para o tratamento de machos que

passaram por injúrias testiculares diversas ou reprodutores com declínio da qualidade seminal

devido à idade avançada.

Palavras-chave: Andrologia. Prostaglandinas. Qualidade Seminal. Reprodução Animal.

Introduction

Adult lamb presents better seminal parameters at four or five years of age than at one

or two years of age (LYMBEROPOULOS; TSAKMAKIDIS; KHALIFA, 2010). Mandiki et

al. (1998), reported better spermatic quality in 3-year-old lambs than in 2-year-old lamb.

However, several conditions can weaken sperm quality and homeostasis in the reproductive

tract, such as nutritional disorders, thermal stress, infectious and parasitic diseases and

advanced age (MOREIRA, MOURA; ARAUJO, 2001; ARMENGOL et al., 2015).

Testicular degeneration is the main cause of infertility in males (ALVES, 2016) and

is caused by factors influencing testicular thermoregulation and, consequently, the gonadal

germinal epithelium (SANTOS; SIMPLÍCIO, 2000). During degeneration, tissues release

membrane phospholipids, which, due to the activity of phospholipase-A, generate a number

of fatty acids. The most important of them is arachidonic acid, which becomes the main cause

31

for prostaglandins in presence of cyclooxygenases (COX). Prostaglandins, a type of

eicosanoid, are interesting to pharmacology due to their important biological functions, such

as inflammatory processes, local blood flow and reproduction (PALERMO-NETO et al.,

2014).

These eicosanoids are also found in seminal plasma. Lamb and goat ejaculates are

filled with different types of eicosanoids, but the reduction of some of the prostaglandins

levels is associated with low fertility in reproducers (MARLEY et al., 1997). However, an

uncontrolled increase is also harmful, as exemplified in a study reported by Archbald et al.

(1990), in which the level of E2 prostaglandin was inversely linked to the capacity of

acrosome reaction of lamb sperm cells.

Experimentally, the addition of F2α prostaglandin in seminal plasma may cause

fertility reduction in bulls and rabbits, due to acrosomal damage and early release of

transaminases and lactate dehydrogenase. On the other hand, in lambs, there was no release of

transaminases enzymes, which is related to this species’ resistance to the eicosanoid (FAYED,

1996). In horses, the addition of this prostaglandin helps to maintain sperm motility and is a

helpful resource for older animals (CEBİ ŞEN; AKCAY, 2015).

Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAI) are useful pharmaceuticals for

modulation of prostaglandin production since they inhibit COX (TASAKA, 2014). One

prostaglandin, Flunixin Meglumine, has stood out due to its modulation activity in the

production of PGF2α, which has been useful to extend the luteal phase in the estral cycle of

sheep (AKÉ-LOPEZ et al., 2005) and to assist biotechniques, such as embryo transfer in

bovines (CARDOSO, 2009) and to improve pregnancy rates in reproductive protocols of

heifers (GUZELOGLU et al., 2007).

However, there are few papers in the literature analyzing this drug for reproductive

purposes in males. Archbald et al. (1990) reported that its use in lambs can improve the

capacity of acrosomal reactions, associated with PGE reduction. However, there is still little

information on its impact on seminal quality. Therefore, considering the importance of the

effects of prostaglandin in sperm activity and the lack of research involving the use of

Flunixin Meglumine in the reproduction of male lamb and goats, the present study intends to

evaluate the effect of this drug on the seminal quality of males of these species presenting

spermatic characteristics unfavorable for reproduction.

Material and Methods

32

This experiment was approved by the Animal Use Ethics Committee (CEUA) of the

University of the State of Ceará (UECE), process number 0533077/2016.

Location of experiment execution

This study was executed in the Goats and Sheep sector of the Department of Animal

Science, Federal University of Ceará (UECE). It is located in the Pici Campus, in the city of

Fortaleza - Ceará, Brazil. It lies at the geographical coordinated of 3°44'33.44"S latitude and

38°34'42.54"W longitude, and at an average altitude of 15.5 meters above sea level. The local

climate is Aw type (tropical with dry winter), according to the Köppen’s classification. The

rainy season occurs from January to March and has average annual rainfall of 1338 mm, and

average ambient temperature between 26 and 28 ºC.

Experimental animals

From a total of 15 reproducers, 10 half-breed males with no defined standard breed

were selected based on their sperm picture. Every animal was evaluated, but only those with

no ideal characteristics for reproduction were chosen. The criteria for this selection were

recommended by the Manual of the Brazilian College of Animal Reproduction (CBRA,

2013). Four adult lambs were selected, averaging 8 years of age and 45 kg. Six adult goats

were also selected, averaging 7 years of age and 45 kg. Animals were kept in individual stalls

and were given elephant grass (Pennisetum purpureum Schum) roughage as base feeding

along with 18% crude protein to fulfill NRC (2007) recommendations. Water and mineral salt

were also provided ad libitum.

Before selection, all individuals were submitted to clinical and laboratory exams to

guarantee health and to verify adaptability to the imposed conditions. No sick animals or

animals with any indication of physical or laboratory pathologies, in any of their systems,

were selected.

Previous andrological evaluation

In the week prior to treatment, the selected reproducers were submitted to clinical-

andrological exams and spermograms. Samples were collected every 72 hours using the

electroejaculation method, which consists of a 12 V device sending stimulation currents

33

between 200 mA and 300 mA at intervals of 2 to 5 seconds. During the experiment, before

each sample collection, animals went through quick clinical evaluations and their scrotal

circumferences were measured. All semen samples were evaluated for macroscopic aspects

(volume, color, and aspect) and microscopic aspects (mass motility, vigor, and percentage of

mobile sperm). Kinetic sperm parameters were measured by an experienced evaluator who

had worked with semen assessments for 27 years.

According to CBRA, adequate semen parameters for both goats and lambs are sperm

motility, equal or superior to 80%; vigor, higher or equal to 3; and percentage of

morphologically normal sperm, equal to or higher than 80%. For lambs, the acceptable

volume is about 0.5 to 3 mL; mass motility, equal or higher than 3; sperm concentration, from

1 to 3 billion per mL; and a total of 3 to 5 billion sperm per ejaculate. The same parameters

for goats are volume, from 0.5 to 1.5 ml; mass motility, equal to or higher than 4;

concentration, between 2 and 5 billion sperm per ml; and a total of 3 to 5 billion sperm per

ejaculate.

Sperm concentration was measured in a Neubauer chamber, using 1:400 dilution in a

formalin-saline solution. Microscopic slides to analyze morphological alterations were

prepared using bromophenol as a blue dye (MEDEIROS et al., 2011). Sperm morphology and

the percentages of major and minor defects were evaluated by counting 200 sperm cells per

slide for each ejaculate, according to the Blom classification (CBRA, 2013).

Drug administration

Flunixin Meglumine was applied to all animals intramuscularly. The first application

(D0) occurred after the third previous sample of semen was collected (Figure 1).

Administration of the drug occurred at two time periods: first, each animal received a

2.2 mg dose of Flunixin Meglumine per kg of live weight every 48 hours (D0, D2, and D4).

Twelve days after the third application (D16), the second period of the treatment began, in

which three 1.1 mg per kg of live weight doses were applied to each reproduction animal in a

one-week interval (D16, D23, and D30), which intended to maintain the results reached.

34

Figure 1. Diagram of the experiment, containing events that occurred to both goats and

lambs.

Week Monday Tuesday Wednesday Thursday Friday Saturday Sunday

1st

C C

2nd D0= C e

A D2= C e A

D4= C e

A

3rd

4th

D16= A’

5th

D21= C D23= A’

6th

D28= C D30= A’

7th

D35= C

8th

9th

D49= C

10th

11th

D63= C

*C: weekly collection; A: Dose application of 2.2 mg Kg-1

Flunixin Meglumine; A’: Dose

application of 1.1 mg Kg-1

.

Post-treatment sperm collection and assessment

Sample collection was resumed on D21, following the same evaluation and

collection methods used before Flunixin Meglumine applications.

Five samples, always on Mondays (D21, D28, D35, D49, and D63), were acquired

after treatment began to verify the seminal picture of the animals. The first three sample

collections coincided with the period in which applications of 1.1 mg Kg-1

of live weight were

being applied. The collective performance was monitored and assessed so the term of drug

effect on seminal quality could be measured. The time interval between collections on D35

and D49 was two weeks long, considered the second period after treatment, and no drug

applications happened during this time.

Statistical analysis

For this experiment, a systematic sampling by senility was used to select animals

with inferior sperm characteristics than those recommended by CBRA (2013) so male lambs

and goats could be andrologically evaluated.

35

Experimental delineation consisted of a 2x4 factorial, in which two species were

studied (goat and lamb) with evaluation of seminal characteristics data at three different

periods: before drug application, at the first period after application (from D21 to D35) and in

the second period (from D49 to D63).

The data, expressed in averages and standard mistakes, were submitted to a Shapiro-

Wilk normality test. Those showing non-normal distribution, even after transformed (log

(x+1)), were analyzed by the Kolmogorov-Smirnov non-parametric test. Data in which

normality was achieved were assessed by ANOVA testing (at 5% probability) and, when

significant, comparisons between periods within each species were made by the Tukey’s test.

Results and Discussion

The 17-day period, between the last day of treatment (D4) and the first post-

treatment collection (D21), was defined with the intention of providing enough time for sperm

already present in the tail of the epididymis to complete transit in the organ, allowing the

evaluation to be performed on sperms in seminiferous tubules during treatment. According to

Jones e Dacheux (2007), the literature states the maintenance period of sperm cells in

epididymal ducts is up to 16.4 days long when transformations of maturity occur.

Parameters of mass motility (MM), the percentage of mobile sperm (%) and vigor

were evaluated (Table 1) and show a considerable increase in all aspects from D21 to D35,

with significant variation (P<0.05), regardless of the species. In Lambs, this improvement was

no longer sustained after treatment. In goats, on the other hand, improvement remained after

drug application, with exception to sperm motility, which decreased significantly.

36

Table 1. Sperm motility parameters in goat and lamb males submitted to Flunixin Meglumine

treatment.

Species Periods MM (0-5) Motility percentage

of mobile sperm (%) Vigor (0-5)

Lamb

Before 2.06 + 0.67a 36.67 + 7.26

a 2.39 + 0.36

a

D21 – D35 3.55 + 0.29b 61.00 + 2.33

b 3.65 + 0.17

b

D49 – D63 2.58 + 0.68a 36.67 + 8.03

a 2.75 + 0.38

a

Goats

Before 2.50 + 0.31a 48.82 + 6.16

a 2.82 + 0.22

a

D21 – D35 3.50 + 0.21b 65.28 + 2.98

b 3.72 + 0.14

b

D49 – D63 3.83 + 0.19 b 58.75 + 5.91

a 3.79 + 0.18

b

Regardless of species

Before 2.35 + 0.30a 44.61 + 4.80

a 2.67 + 0.19

a

D21 – D35 3.52 + 1.17b 63.75 + 2.10

b 3.70 + 0.10

b

D49 – D63 3.42 + 0.29b 51.39 + 5.27

a 3.44 + 0.21

b

*Lowercase letters indicate statistical variation in the Tukey test (p<0.05) within each sub-column.

When individually evaluated, species mass motility and vigor parameters remained

similar in both periods after treatment, with a significant reduction (p<0.05) only in motility.

Results for sperm motility (MM, mobile % and strength) after the drug application are close

to what is considered “acceptable” by the CBRA (2013) for seminal quality evaluations in

male lamb and goats.

Scrotal circumference showed no significant alterations at the different times in

either for species, which demonstrates the lack of influence of the drug on this parameter

during experimentation periods (Table 2). Goat results obtained in the present study are

similar to those found by other authors studying native goats from the northeast region of

Brazil (SANTOS; SIMPLÍCIO, 2000). However, for lambs, the results obtained in this study

are inferior to those obtained by Maia et al. (2011) in half-breeds.

Semen volume of goats showed a significant increase (p<0.05) between D21 and

D35, and between D49 and D63. This increase may be due to the behavior of this species

during the electroejaculation collecting process since they feel more discomfort during the

process, which can interfere with drug activity. The volume increase is probably due to a

higher quantity of secretion in the accessory glands, which may have occurred when

electrostimulation was performed (RODRIGUES, 1997). Results from the first moment post-

treatment are close to those found by Santos and Simplício (2000) in goats and by Maia et al.

37

(2011) in lambs and were in agreement with CBRA recommendations (2013) for andrological

exams in these species.

Table 2. Scrotal circumference (SC) and quantitative sperm parameters of male goats and lambs,

submitted to Flunixin Meglumine treatment.

Species Periods SC (cm) Volume

(mL)

Concentration (106

Sptz/mL)

Total

(106 Sptz)

Lamb

Before 30.39 + 0.64 0.53 + 0.06 1028.89 + 429.81a 608.67 + 262.10

a

D21 –

D35 30.03 + 0.46 0.86 + 0.17 3028.00 + 612.94

b 2846.00 + 725.86

b

D49 –

D63 30.08 + 0.55 0.52 + 0.05 3195.00 + 1327.30

b 1807.33 + 857.22

b

Goats

Before 26.52 + 0.68 0.77 + 0.09a 716.91 + 204.86

a 553.74 + 152.10

a

D21 –

D35 26.83 + 0.68 0.72 + 0.06

a 186.67 + 26.61

b 136.78 + 21.97

b

D49 –

D63 26.75 + 0.96 1.12 + 0.17

b 650.21 + 127.35

a 603.54 + 94.29

a

Regardless

of species

Before 27.86 + 0.61 0.69 + 0.07 824.90 + 197.24 572.75 + 131.6 a

D21 –

D35 27.97 + 0.55 0.77 + 0.07 1201.43 + 337.14 1104.56+354.02

b

D49 –

D63 27.86 + 0.76 0.92 + 0.13 1498.47 + 514.18 1004.81 + 307.93

b


Sperm concentration and total number of sperm per ejaculate presented significant

increase (p<0.05) between the period before and both periods after application, but reduced

once again after the second moment, which probably happened because male goats had

presented an important increase in seminal plasma quantity during this period, probably due

to the collection method (RODRIGUES, 1997), which resulted in lower sperm concentration.

Both species significantly increased (p<0.05) percentage of normal sperm between

the period before and the period after the first treatment. (Table 3). However, the percentage

of normal lamb sperm showed significant reduction between D49 and D63, coming close to

results presented before drug application. In goats, at the period between D49 and D63, the

percentage of normal cells showed no significant decrease, rather stayed close to the numbers

shown between D21 and D35, which suggests prolonged drug activity for this parameter in

goats. This also shows the same evolution seen in sperm motility parameters.

Major defects were significantly reduced in both species after Flunixin Meglumine

applications. The reduction was maintained until the period between D49 and D63 when drug

38

applications ceased. According to Moreira et al. (2001), these defects are mainly originated at

a testicular level and the obtained results suggest this drug might act in the final

spermatogenesis phases. This may also explain the maintenance of the condition even after

interrupting drug reinforcements.

Table 3. Percentage of normal sperm, minor defects and major defects of semen of male goats and

lambs, submitted to Flunixin Meglumine treatment.

Species Periods Normal (%) Major defects (%) Minor defects (%)

Lamb

Before 67.11 + 2.38a 9.89 + 1.15

a 23.00 + 2.40

a

D21 – D35 85.95 + 1.84b 2.10 + 0.76

b 11.95 + 2.00

b

D49 – D63 68.75 + 5.18a 3.17 + 0.81

b 28.08 + 4.67

a

Goats

Before 73.74 + 1.82a 6.59 + 0.61

a 19.68 + 1.60

a

D21 – D35 87.47 + 3.27b 1.64 + 0.34

b 10.89 + 3.22

b

D49 – D63 84.79 + 0.73b 1.83 + 0.32

b 13.38 + 0.76

b

Regardless of

species

Before 71.44 + 1.60a 7.73 + 0.64

a 20.83 + 1.34

a

D21 – D35 86.93 + 2.18b 1.80 + 0.34

b 11.27 + 2.17

b

D49 – D63 79.44 + 2.49c 2.28 + 0.36

b 18.28 + 2.28

a


Percentage of minor defects significantly reduced (p<0.05) between the period before

and the first period after the application. However, results obtained from all evaluations

increased once again when applications ceased. Therefore, minor defects reduction at the

period between D21 and D35 was followed by an increase during the period from D49 to

D63. These results are similar when analyzed without regarding the species. According to

Moreira et al. (2001), minor defects can be primarily originated in the epididymis, therefore,

at the end of treatment, improvement can be interrupted and continuous flow of sperm may

present new increase in defect proportions.

The post-treatment results shown here indicate a significant improvement of seminal

characteristics related to sperm motility and quantitative numbers of semen, and to normal

sperm and minor and major defects. Seminal characteristics were recovered from

unsatisfactory to nearly accepted values according to CBRA (2013).

Flunixin meglumine is a potent nonsteroidal anti-inflammatory commonly used in

39

the treatment of inflammatory processes of several origins (TASAKA, 2014), however, up to

now, there was no knowledge regarding the beneficial activity it may cause on male seminal

quality. In the reproductive sphere, its use is reported in studies related to female bovine,

reducing PGF2α production, increasing pregnancy rates in heifers (GUZELOGLU et al. 2007)

and increasing in vitro production of embryos (KIM et al. 2014).

In males, we found only one citation in which this drug was used for lambs and it

resulted in prostaglandin (PGE) reduction and increase of acrosomal reaction in sperm

(ARCHBALD et al. 1990). However, the authors reported no results of the activity on

seminal characteristics of sperm motility.

The positive effects of Flunixin Meglumine were observed accidentally for the first

time when researchers were treating animals with arthritis and submitted them to semen

collection in an artificial vagina. In such study, improvements in seminal characteristics were

repeatedly observed. Thus, throughout time, we obtained clinical experience in fertility

recovery of males going through senility, as well as recovery of males under thermal testicular

stress impact due to high ambient temperatures. Since the use of this drug improved fertility

of the males cited above, we decided to elaborate this research.

The beneficial effect can be explained based on the biochemical activity of Flunixin

Meglumine. Phospholipases and prostaglandins are known to be intimately connected to

inflammatory and degenerative processes and to increase concentrations in these situations

(HUDSON et al. 2016; YANG et al., 2017). In the reproductive field, the inflammatory

process of the endometrium in postpartum can be exemplified: the COX-2 enzyme is

responsible for mobilization of arachidonic acid for PGE production (HUDSON et al. 2016).

Similar activity may take place in the epididymis, involving an inflammatory or local

degenerative process, which begins cascade activation for PGE formation by phospholipase

A1 activity, which in turn, degrades membrane phospholipids of epididymal cells and releases

arachidonic acid, which, through COX-2 activity, is transformed into prostaglandins

(HUDSON et al. 2016). COX-2 inhibition using Flunixin Meglumine reduces the

concentration of prostaglandins in the epididymis.

The epididymis is an important forerunner organ for fertilization capability in sperm

and provision of motility, due to the production of several proteins throughout it

(DACHEUX; DACHEUX; DRUART, 2016). Therefore, in degenerative processes due to

40

senility or other damage, this organ provides an unfavorable environment for a full production

of viable sperm. Flunixin Meglumine activity in the epididymis enables the formation of a

satisfactory environment for sperm viability, which explains, in this study, the improvement

in the seminal quality of animal after drug application.

Conclusions

Based on the “in vitro” evaluation results of this study, we may report on the

beneficial impact of Flunixin Meglumine on seminal parameters of male goats and lambs

containing unfavorable sperm frames.

This benefit takes place mainly in the improvement of motility parameters (mass

motility, mobile cell % and strength), as well as in parameters linked to male fertility, such as

increase of normal cells and reduction of altered sperms.

Therefore, this drug can be indicated for male adult goats and lambs with testicular

injuries or for reproducers facing a decline in seminal quality due to advanced age. Additional

studies are required to evaluate “in vivo”, i.e. after natural mount or artificial insemination, the

fertility of males treated with this drug.

Acknowledgements:

Special thanks to Professor Ph.D. Pedro Zione, who is responsible for the Lamb and

Goat sector of the Federal University of Ceará, for providing the animals used in this

experiment.

41

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44

7 CONCLUSÃO

Reprodutores saudáveis e bem alimentados que apresentem baixo desempenho andrológico

podem ser tratados com protocolos utilizando Flunixina Meglumine na dose de 2,2 mg/kg,

sendo o seu efeito mais duradouro em caprinos que em ovinos. É aconselhável o uso droga em

machos com indícios de degeneração testicular devido à senilidade, o que confere melhores

índices de cinética espermática e redução do percentual de alterações morfológicas,

incrementando e prolongando a eficiência reprodutiva desses animais.

45

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