universidade estadual de santa cruzÀs queridas meninas da iniciação científica, rebeca dálety,...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
LUCIANA CARVALHO LACERDA
FREQUÊNCIA DOS VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA E LEUCEMIA FELINA, FATORES ASSOCIADOS, ACHADOS HEMATOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E
COINFECÇÕES COM Toxoplasma gondii NA MICRORREGIÃO ILHÉUS-ITABUNA BAHIA
ILHÉUS– BAHIA
2015
LUCIANA CARVALHO LACERDA
FREQUENCIA DOS VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA E LEUCEMIA FELINA, FATORES ASSOCIADOS, ACHADOS HEMATOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E
COINFECÇÕES COM Toxoplasma gondii NA MICRORREGIÃO ILHÉUS-ITABUNA BAHIA
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como exigência para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Clínica e Sanidade Animal Orientador: Prof. Dr. Alexandre Dias Munhoz
ILHÉUS – BAHIA 2015
L131 Lacerda, Luciana Carvalho. Frequência dos vírus da imunodeficiência e leu- cemia felina, fatores associados, achados hemato- lógicos, bioquímicos e coinfecções com Toxoplas- ma gondii na microrregião Ilhéus – Itabuna Bahia / Luciana Carvalho Lacerda. – Ilhéus, BA: UESC, 2015. 71f. : il.; anexos. Orientador: Alexandre Dias Munhoz. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadu- al de Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Inclui referências e apêndice.
1. Gato – Doenças. 2. Imunossupressão. 3. Toxoplasma gondii. 4. Vírus. I. Título. CDD 636.80896
LUCIANA CARVALHO LACERDA
FREQUÊNCIA DOS VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA E LEUCEMIA FELINA, FATORES ASSOCIADOS, ACHADOS HEMATOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E
COINFECÇÕES COM Toxoplasma gondii NA MICRORREGIÃO ILHÉUS-ITABUNA BAHIA
Ilhéus – BA, 27/02/2015
___________________________________
Alexandre Dias Munhoz – DSc
UESC/DCAA
(Orientador)
____________________________________
Renata Santiago Alberto Carlos – DSc
UESC/DCAA
___________________________________
Aristeu Vieira da Silva – DSc
UEFS/DCBIO
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela presença constante em minha vida e por mais essa vitória; Aos meus pais Abidias e Mirene, minhas irmãs, Juliana e Tatiana, meus amados sobrinhos Breno e Helena. Agradeço a Deus por me permitir tê-los como minha família, meu porto seguro. Vocês são a razão da minha vida; Ao Rodrigo Pinheiro, agradeço pelo amor, companheirismo e incentivos constantes. Obrigada por me fazer feliz, pelas risadas bobas, por sua tranquilidade e por estar ao meu lado nessa longa caminhada que é a vida; Ao meu orientador, Alexandre Dias Munhoz, pelo carinho e conhecimentos transmitidos. Obrigada pelo constante empenho em transformar seus orientados em profissionais exemplares e éticos; A Aísla Nascimento, Flávia Martoni, Sônia Lopo, Janaína Xavier, Mônia Andrade e Samir Hage pela amizade construída nestes dois anos de convívio intenso. Obrigada pelas tantas caronas, almoços divertidos, pela calma transmitida nos momentos difíceis. Verdadeiros anjos da guarda; Às queridas meninas da Iniciação Científica, Rebeca Dálety, Vanessa Fonseca, Fabiana Barbosa e Jéssica Freitas, tudo com vocês é mais colorido e divertido... Obrigada pela ajuda constante; A Izabela Garcia, pela generosidade no compartilhamento das amostras e por estar sempre disponível nos momentos de dúvidas; Ao Uillian Araújo, pela ajuda nas intermináveis planilhas do Excel; Aos colegas do mestrado e doutorado, Tatiani Harvey, Jamille Rodrigues, Juliana Gromboni, Daniele Rocha, Fábio Carvalho, Rodrigo Bezerra, pela ajuda e por compartilharem suas experiências, dúvidas e conhecimentos ao longo dessa jornada; Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Ciência Animal, pelos ensinamentos transmitidos; Aos funcionários do Hospital Veterinário da UESC que, de alguma forma, contribuíram para essa conquista; A Regina, por ter me acolhido como uma filha, e a Ingrid e Sarah, por fazerem Itabuna um lugarzinho melhor pra se viver. .
“Desistir... eu já pensei
seriamente nisso, mas nunca me levei realmente a sério;
é que tem mais chão nos meus olhos do que o cansaço nas minhas pernas,
mais esperança nos meus passos, do que tristeza nos meus ombros,
mais estrada no meu coração do que medo na minha cabeça.”
Cora Coralina
FREQUÊNCIA DOS VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA E LEUCEMIA FELINA, FATORES ASSOCIADOS, ACHADOS HEMATOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E
COINFECÇÕES COM Toxoplasma gondiiNA MICRORREGIÃO ILHÉUS-ITABUNA BAHIA
RESUMO
Objetivou-se com este estudo determinar as frequências e os fatores associados às
infecções pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV), o vírus da leucemia felina
(FeLV), a presença de alterações hematológicas e bioquímicas, bem como
coinfecções com Toxoplasma gondii nos gatos naturalmente infectados da
microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia, Brasil. Amostras de 201 gatos assintomáticos
foram submetidas aos testes de nested-PCR e ELISA para detecção dos retrovírus.
Testes sorológicos foram realizados para a detecção da presença do T. gondii. Uma
entrevista semiestruturada foi aplicada aos proprietários em busca de informações
sobre os hábitos dos animais com vistas à determinação dos fatores associados às
infecções.Os dados foram tabulados e analisados pelos programas EPIINFO 3.5.2 e
Bioestat 5.0. As variáveis com plausibilidade biológica foram submetidas à
correlação de Spearman (p≤ 0,2) para determinação da colinearidade, e
posteriormente compuseram o modelo preliminar da regressão logística não
condicional. Os valores hematimétricos e bioquímicos dos animais positivos para FIV
ou FeLV foram comparados aos valores dos animais negativos através do teste t
student ou Mann-Whitney, com intervalo de confiança de 95%. A prevalência total
foi de 6% (12/201) e 3% (6/201) para FIV e FeLV, respectivamente. Não houve
coinfecções entre os retrovírus. A sorologia revelou coinfecções entre T. gondii e FIV
ou FeLV positivos de 75% (9/12) e 50% (3/6), respectivamente. Verificou-se como
risco de infecção para o FIV o contato com outros gatos e região periurbana. Para o
FeLV não foram observados fatores associados à infecção. Os parâmetros
hematológicos não apresentaram diferenças estatísticas significativas. Entre as
análises bioquímicas, valores de bilirrubina total, direta e indireta foram
estatisticamente significativos entre os animais FIV positivos e os animais negativos.
Os resultados comprovam a presença dos dois retrovírus na região, distribuídos de
maneira heterogenia, sendo os animais FIV positivos mais predispostos a alterações
laboratoriais.
Palavras-chave: gatos, imunossupressão, retrovírus
FREQUENCY OF IMMUNODEFICIENCY VIRUS AND FELINE LEUKEMIA, ASSOCIATED FACTORS, HEMATOLOGICAL FINDINGS, AND BIOCHEMICAL,
COINFECTIONS WITH Toxoplasma gondii IN THE MICROREGION ILHÉUS-ITABUNA BAHIA
ABSTRACT
The objective of this study was to determine the frequency and factors associated
with infection by feline immunodeficiency virus (FIV), the feline leukemia virus
(FeLV), the presence of hematological and biochemical changes, as well as co-
infections with Toxoplasma gondii in cats naturally infected the Ilhéus-Itabuna
microregion, Bahia, Brazil. Samples of 201 asymptomatic cats were submitted to
tests of nested-PCR and ELISA for detection of retroviruses. Serologic tests were
performed to detect the presence of T. gondii. A semi-structured interview was
applied to the owners for information about animal habits in order to determine the
factors associated with infections. Data were tabulated and analyzed by EPIINFO
3.5.2 and 5.0 Bioestat programs. Variables with biological plausibility were submitted
to Spearman correlation (p ≤ 0.2) to determine the collinearity, and later composed
the preliminary model of unconditional logistic regression. The hematological and
biochemical values of animals positive for FIV or FeLV were compared to the values
of the negative animals by student t test or Mann-Whitney test, with a 95%
confidence interval. The overall prevalence is 6% (12/201) and 3% (6/201) for FIV
and FeLV, respectively. There was no coinfection among retroviruses. Serology
showed coinfection of T. gondii and FIV or FeLV positive 75% (9/12) and 50% (3/6),
respectively. It was found as a risk of infection for FIV contact with other cats and
peri-urban region. For FeLV were unobserved factors associated with infection.
Hematologic parameters did not present significant differences. Among the
biochemical analysis, total direct and indirect bilirubin values were statistically
significant between the FIV positive animals and the negative animals. The results
demonstrated the presence of both retroviruses in the region, distributed
heterogeneous manner, with positive FIV most predicts to laboratory findings.
Keywords: cats, immunosuppression, retroviruses
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação do DNA pró-viral do FIV, apresentando no centro os três genes principais (gag, pol e env) e os genes acessórios (vife rev), ladeado pelas LTR nas exterminadas 5’e 3’(DUNHAM; GRAHAM, 2005, adaptado).................................................................
16
Figura 2 - Representação esquemática do DNA pró-viral do FeLV. Os LTR presentes nas extremidades, flanqueando os genes gag, pol e env (DUNHAM; GRAHAM, 2005, adaptado)..............................................
23
Figura 3 - Resultado da nested-PCR para FIV apresentando um produto de 239 pb. Coluna: 1- marcador molecular; 2- controle positivo; 3- controle negativo; 4, 5- amostras positivas..........................................
44
Figura 4 - Resultado da nested-PCR para FeLV apresentando um produto de 601 pb. Coluna: 1-marcador molecular; 2- controle positivo; 3- controle negativo; 4, 5, 6- amostras positivas......................................
45
Figura 5 - Resultado de animais positivos pelo ELISA através da detecção dos anticorpos contra o FIV e a detecção do antígeno FeLV. A: reação positiva para o FIV. B: reação positiva para o FeLV............................
45
Figura 6 - Resultado da PCR para o GAPDH. Colunas: 1- marcador molecular; 2- controle negativo; 3, 4, 5, 6, 7, 8- amostras positivas.....................
45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação dos estágios do FeLV de acordo com os diferentes métodos de diagnóstico.....................................................................
26
Tabela 2 - Frequência do FIV e FeLV no mundo, métodos de diagnóstico utilizados e tipo de população de gatos selecionada..........................
31
Tabela 3 - Frequência do FIV e FeLV no Brasil, métodos de diagnóstico utilizados e tipo de população de gatos selecionada..........................
32
Tabela 4 -
Primers utilizados nas PCRs para FIV, FeLV e GAPDH. Descrito a sequência de oligonucleotídeos, a região de origem do DNA pró-viral e o tamanho do produto amplificado...........................................
40
Tabela 5 - Diagnóstico do vírus da imunodeficiência felina pelas técnicas ELISA e nested-PCR em gatos domiciliados da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA..........................................................................................
43
Tabela 6 - Diagnóstico do vírus da leucemia felina pelas técnicas ELISA e nested-PCR em gatos domésticos da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA........................................................................................................
44
Tabela 7 - Fatores com plausibilidade biológica associados às infecções pelo FIV em gatos da microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia........................
46
Tabela 8 - Fatores com plausibilidade biológica associados às infecções pelo FeLV em gatos da microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia.....................
47
Tabela 9 - Modelo preliminar da regressão logística não-condicional dos fatores associados à infecção pelo FIV em gatos da microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia.........................................................................
48
Tabela 10 - Modelo final da regressão logística não-condicional dos fatores associados à infecção pelo FIV em gatos da microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia....................................................................................
48
Tabela 11 - Valores médios e desvio padrão dos parâmetros hematológicos dos gatos FIV positivos, FeLV positivos e negativos da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA........................................................
49
Tabela 12 - Valores médios e desvio padrão das análises bioquímicas dos gatos FIV positivose negativos da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA......................................................................................................
50
Tabela 13 - Valores médios e desvio padrão das análises bioquímicas dos gatos FeLV positivos e negativos da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA......................................................................................................
50
LISTA DE ANEXOS E APÊNDICES
Anexo A Entrevista estruturada para determinação dos fatores associados às infecções pelos vírus da imunodeficiência felina e leucemia felina...............................................................................
69
Anexo B Protocolo de extração do DNA genômico.................................... 70
Anexo C Protocolo da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Toxoplasma gondii........................................................................
71
Apêndice A Tabela de colinearidade das variáveis com plausibilidade biológica para as infecções dos vírus da imunodeficiência felina e leucemia felina............................................................................
72
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................. vii
ABSTRACT ............................................................................................................. viii
1INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 14
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 15
2.1 Objetivo geral ................................................................................................................................................ 15
2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................................................... 15
3REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 15
3.1Vírus da imunodeficiência felina (FIV) ................................................................................................... 15
3.1.1 Vírus ........................................................................................................................................... 15
3.1.2 Subtipos ..................................................................................................................................... 17
3.1.3 Transmissão .............................................................................................................................. 17
3.1.4 Patogenia ................................................................................................................................... 18
3.1.5 Estágios Clínicos ...................................................................................................................... 19
3.1.6 Alterações Laboratoriais .......................................................................................................... 22
3.2Vírus da leucemia felina (FeLV) ............................................................................................................... 23
3.2.1 Vírus ........................................................................................................................................... 23
3.2.2 Subtipos ..................................................................................................................................... 24
3.2.3 Transmissão .............................................................................................................................. 25
3.2.4 Patogenia ................................................................................................................................... 25
3.2.5 Categorias da Infecção pelo FeLV ........................................................................................ 25
3.2.6 Alterações Laboratoriais .......................................................................................................... 29
3.3 Prevalência .................................................................................................................................................. 29
3.4 Diagnóstico ................................................................................................................................................. 33
3.5 Tratamento................................................................................................................................................... 34
3.6 Coinfecções................................................................................................................................................. 36
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 37
4.1 Local de Realização do Estudo .............................................................................................................. 37
4.2Coleta do Material Biológico .................................................................................................................... 37
4.3 Coleta de Dados ......................................................................................................................................... 37
4.4Análise Hematológica e Bioquímica ...................................................................................................... 38
4.5 Sorologia para FIV e FeLV ....................................................................................................................... 38
4.7 Realização da Reação em Cadeia da Polimerase .............................................................................. 39
4.7.1 Reação em Cadeia da Polimerase para detecção do DNA pró-viral do FIV .................. 40
4.7.2 Reação em Cadeia da Polimerase para detecção do DNA pró-viral do FeLV ............... 41
4.7.3 Reação em Cadeia da Polimerase para o GAPDH ............................................................ 41
4.8 Revelação dos produtos da Reação em Cadeia da Polimerase .................................................... 42
4.9 Sorologia para Toxoplasma gondii ....................................................................................................... 42
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 43
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 51
7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 55
REFERÊNCIAS .................................................................................................. 56
ANEXOS............................................................................................................. 69
APÊNDICE ......................................................................................................... 72
14
1INTRODUÇÃO
O vírus da imunodeficiência felina (FIV) e o vírus da leucemia felina (FeLV)
são dois retrovírus clinicamente importantes que afetam a saúde de gatos
domésticos e de felinos selvagens em todo o mundo (COURCHAMP et al., 1997;
FILONI et al., 2012). Sua distribuição varia consideravelmente dependendo da
região de estudo e da população felina avaliada (LEVY et al., 2008; GLEICH et al,
2009).Os fatores associados à infecção pelo FIV e/ou FeLV estão diretamente
relacionados com as vias de transmissão do vírus e a susceptibilidade do hospedeiro
(COURCHAMP et al., 1998; HARTMANN, 2011).
Os gatos disseminam os retrovírus através da saliva infectada, seja pela
mordida ou comportamento social (LUTZ; JARRETT, 1987; BURKAHARD; DEAN,
2003), perpetuando duas doenças de alta morbidade entre os animais susceptíveis.
Os sinais clínicos variam dependendo do estágio de infecção, os mais severos são
quadros de anemia não regenerativa, desordens proliferativas como linfomas e
leucemias e distúrbios neurológicos (HOSIE et al., 2009; GREGGS et al., 2011).
Durante a fase de imunossupressão induzida pelo FIV e/ou FeLV, o
hospedeiro fica predispondo a infecções secundárias, algumas com potencial
zoonótico (BENDINELLI et al., 1995). Toxoplasma gondii é relatado como um grave
agente oportunista em felinos infectados pelos retrovírus, e esse protozoário
desempenha papel importante na saúde pública, podendo causar má formações
fetais e morte de pacientes humanos imunodeprimidos (LUCAS et al., 1998; HILL,
DUBEY, 2002)
Atualmente os testes sorológicos e moleculares são os mais utilizados na
rotina devido o fácil acesso e custo. O uso conjunto das técnicas permite o
reconhecimento de um maior número de gatos positivos em diferentes estágios de
infecção (TORRES et al., 2005; LITTLE et al., 2011).
Tendo em vista a severidade das doenças induzidas pelos vírus da
imunodeficiência felina e da leucemia felina, e a ausência de informações sobre
essas infecções no Nordeste do Brasil (que tem um contingente de
aproximadamente 3 milhões de gatos), a realização de estudos observacionais, se
justificam, para uma melhor compreensão da dinâmica da infecção por estes
agentes em gatos domésticos da região.
15
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Determinar as frequências do vírus da imunodeficiência felina e do vírus da
leucemia felina e os fatores associados às infecções em felinos domésticos da
microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia.
2.2 Objetivos específicos
Estimar a frequência das infecções por FIV e FeLV em gatos domésticos na
microrregião de estudo;
Associar a presença do FIV e/ou FeLV com as infecções por Toxoplasma
gondii;
Determinar os fatores associados à infecção;
Avaliar o padrão hematológico e bioquímico dos animais infectados
naturalmente pelo FIV e/ou FeLV .
3REVISÃO DE LITERATURA
3.1Vírus da imunodeficiência felina (FIV)
3.1.1 Vírus
Descoberto por Pedersen e colaboradores em 1986, o vírus da
imunodeficiência felina (FIV) foi isolado pela primeira vez em um gato com sorologia
negativa para FeLV e que apresentava sinais clínicos característicos de uma
síndrome de desordem imunológica (PEDERSEN et al., 1987). Pertencente à família
Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e gênero Lentivirus, o FIV é considerado
um importante modelo para estudo da patogênese das infecções pelo vírus da
16
imunodeficiência humana (HIV), uma vez que possuem características biológicas
semelhantes e promovem desordens clínicas e imunológicas similares (PEDERSEN
et al., 1989; DEAN et al., 1996; BURKHARD; DEAN, 2003).
O FIV possui como material genético duas moléculas de RNA de fita simples
que pela ação da enzima transcriptase reversa e de outras enzimas dão origem a
cópias de DNA. Esse DNA pró-viral integra-se ao DNA cromossômico do hospedeiro
capacitando o vírus a se replicar junto à célula infectada. A presença desta enzima e
a inserção do DNA pró-viral no genoma são característica diferenciais dos retrovírus,
promovendo a persistência desses vírus no seu hospedeiro (JARRETT, 1999;
HOSIE et al., 2009).
O DNA pró-viral é constituído por duas regiões de longas repetições terminais
(LTR) que estão envolvidos na replicação viral, flanqueando três genes principais -
gag, pol e env - e outros dois genes acessórios - rev e vif (Figura 1) (BENDINELLI et
al., 1995).
Figura 1 - Representação do DNA pró-viral do FIV. No centro os três genes principais (gag, pol e env) e os genes acessórios (vif e rev), ladeado pelas LTR nas exterminadas 5’e 3’ (DUNHAM; GRAHAM, 2008, adaptado).
O gene gag codifica proteínas estruturais internas do vírus que incluem as
proteínas da matriz (p15), capsídeo (p24) e do nucleocapsídeo (p10). O gene pol é
responsável por enzimas envolvidas na replicação e integração, como a
transcriptase reversa, protease, dUTPase e integrase, que são importantes para a
virulência do vírus. O gene env codifica a proteína de superfície (gp95) e a proteína
transmembranosa (gp41) do envelope viral, as quais determinam a diversidade viral
(TALBOTT et al., 1989; DUNHAM; GRAHAM, 2008; HOSIE et al., 2009).
Os Lentivírus possuem genes acessórios como o rev e vif que codificam
proteínas não estruturais relevantes na regulação da expressão viral, replicação e
patogenicidade (BENDINELLI et al., 1995). Esses genes acessórios permitem uma
17
replicação do vírus de forma mais eficiente, mantendo um padrão de transcrição
autônomo, independente da divisão celular, tornando o FIV um vírus mais
especializado que o FeLV (COLLADO et al., 2012).
3.1.2 Subtipos
Análises filogenéticas das sequências do gene env, região V3-V5,
identificaram cinco subtipos do FIV - A, B, C, D e E (HOSIE et al., 2009). Estudos
posteriores conseguiram a mesma classificação utilizando a região p17-p24 do gene
gag (HOHDATSU et al.,1998). Essas glicoproteínas que o gene env codificam estão
envolvidas na determinação do tropismo celular, atividade de fusão célula-vírus, e
também são alvos primários da resposta imunológica (BENDINELLE et al.,1995).
Os subtipos A, B e C são os mais distribuídos em todo o mundo sendo
possível encontrar os diferentes isolados em um mesmo continente, no entanto, é
evidente que existe um agrupamento geográfico (HOHDATSU et al.,1998; CAXITO
et al., 2006). O vírus do subtipo D foi identificado no Japão e Vietnã e o subtipo E na
Argentina e Japão (SODORA et al., 1994; KAKINUMA et al., 1995; PECORARO et
al., 1996). Estudos apontam para dois novos isolados, o subtipo F (DUARTE;
TAVARES, 2006) e o subtipo U-Nzenv (HAYWARD; RODRIGO, 2010).
No Brasil, estudos de caracterização molecular realizados nos Estados de
Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul (CAXITO et al., 2006;
LARA et al., 2007; MARTINS et al., 2008; TEIXEIRA et al., 2011; SILVA et al., 2014),
identificaram apenas o subtipo B, entretanto, Marçola e colaboradores (2013) com
base em estudos no Distrito Federal, sugere a possível existência de um novo
subtipo devido a divergência genética encontrada com os outros isolados.
3.1.3 Transmissão
A principal forma de transmissão do FIV é através da inoculação do vírus por
ferimentos de mordedura durante lutas por território/comida e no acasalamento,
logo, devido ao comportamento natural, gatos machos adultos são mais susceptíveis
de serem infectados (BURKAHARD; DEAN, 2003; DUNHAM; GRAHAM, 2008).
Estudos demonstraram a presença do FIV na glândula salivar já na primeira semana
após infecção (MATTEUCCI et al., 1993).
18
A transmissão intra-uterina de múltiplos isolados (A, B e C) já foi
demonstrada, ocorrendo uma variabilidade entre eles na prevalência da transmissão
e na distribuição das cargas pró-virais nos tecidos fetais (ROGERS;HOOVER, 2002).
Na natureza, Medeiros et al. (2012) encontraram evidencias de transmissão entre
mães FIV-positivas e filhotes, além de relatar leitegadas de tamanho menor e
presença de abortos. Acredita-se que a transmissão vertical em animais
naturalmente infectados ocorra apenas durante a fase de viremia (BURKHARD;
DEAN, 2003).
Durante o processo de nascimento, via colostro ou através dos cuidados de
enfermagem da mãe, há um grande risco de exposição desses filhotes ao FIV
(O’NEIL et al., 1996). Sellon et al. (1994) demonstraram experimentalmente a
transmissão do FIV através do leite em gatas com infecção aguda. Apesar da
disseminação venérea não estar bem documentada na natureza, gatos infectados
experimentalmente por inoculação do vírus no nariz, boca, vagina e reto
apresentaram a doença (HOSIE et al., 2009).
3.1.4 Patogenia
Após a exposição, a replicação viral ocorre primeiramente nas glândulas
salivares e nos gânglios linfáticos regionais. Estudos demonstram a presença do
vírus nos tecidos salivares e linfáticos já na primeira semana após a inoculação,
sugerindo que representem locais de início da migração e replicação do FIV
(MATTEUCCI et al., 1993). Os linfócitos T CD4 (T-helper), são as células alvos do
FIV em tecidos como timo, medula óssea, gânglios linfáticos, baço, tonsilas e
linfonodos do intestino, só depois o vírus atinge órgãos como o pulmão, fígado e rins
(BEEBE et al., 1994). A liberação de novas particulas virais, pico da viremia, ocorre
dentro de 8 a 12 semanas após a infecção (DUNHAM; GRAHAM, 2008).
Estudos da cinética das infecções pelo FIV demonstram que apesar do
tropismo por linfócitos T CD4, o receptor primário deste vírus é o CD134, sendo
possível infectar células negativas para o determinante antigênico CD4, desde que
essas sejam positivas para o CD134, tais como células CD8, linfócitos B, células
dentríticas, monócitos e macrófagos (BEEBE et al., 1994; DEAN et al., 1996;
BURKHARD; DEAN, 2003).
19
Tal como o HIV, FIV é conhecido por ser altamente citopático para linfócitos T,
promovendo o declínio na porcentagem de células T CD4 e uma diminuição da
razão CD4/CD8 (JARRETT, 1999). Possíveis explicações para essa perda lenta e
progressiva dos linfócitos T CD4, não se baseiam apenas na destruição dessas
células infectadas frente à resposta imune ou induzidas pelo próprio vírus, é possível
que ocorra alterações na cinética da renovação dessa linhagem, levando ao
bloqueio da atividade mitótica das células progenitoras linfoides (TORTEN et al.,
1991, LEVY et al., 2008).
Torten et al. (1991) demonstraram a progressão da disfunção imune
provocada pelo FIV, onde nos primeiros 6 meses após a infecção, os gatos
apresentaram uma diminuição no número de linfócitos CD4 circulantes, porem
permaneciam com a capacidade de resposta frente a uma substância imunogênica,
essa resposta eficiente não foi mais observada num prazo de 25-44 meses pós-
infecção.
Nos estágios avançados da doença ocorre um deslocamento das células alvo
de linfócitos T para monócitos/macrófagos, possivelmente devido à rápida morte dos
linfócitos T, enquanto que os macrófagos são menos susceptíveis aos efeitos
citopáticos do FIV. Por conseguinte, acredita-se que a replicação nos macrófagos
deva ser importante para a persistência da infecção (BEEBE et al., 1994).
Ao longo do tempo, ambos os linfócitos CD4 e CD8 diminuem gradualmente e
a resposta imune mediada por células é mais afetada do que a imunidade humoral
(HOFMANN-LEHMANN et al., 1997). Condições inflamatórias crônicas, neoplásicas
e infecções por organismos intracelulares são mais comuns do que as infecções
controladas pelos anticorpos (BENDINELLI et al., 1995; LEVY et al., 2008).
A resposta humoral também está presente logo no início da infecção, com a
presença de altos títulos de anticorpos neutralizantes dirigidos para as principais
proteínas do núcleo e para glicoproteínas do envelope do FIV e tendem a
permanecer elevado durante todo o tempo de vida do animal infectado (TOZZINI et
al., 1993; HOSIE et al., 2009).
3.1.5 Estágios Clínicos
Apesar de o FIV possuir um tropismo celular muito mais amplo que o HIV, a
doença induzida nos gatos domésticos é semelhante em vários aspectos à
20
imunodeficiência humana (BENDINELLI et al., 1995). O curso da infecção pelo FIV
pode ser estimado através da observação dos sinais clínicos apresentados pelo
paciente, quantificação da carga viral e resposta imunológica frente ao vírus, através
da contagem de células T CD4, e sua razão CD4 / CD8 (GOTO et al., 2002;
BURKHARD; DEAN, 2003).
Fase Aguda
Durante a fase inicial da infecção pelo FIV alguns gatos apresentam febre,
apatia, anorexia transitória e linfadenopatia generalizada, devido à estimulação
generalizada das células T e B nos centros germinativos dos gânglios linfáticos,
entre a terceira e sexta semana pós-infecção (PEDERSEN et al., 1989; CALLANAN
et al., 1992). Entretanto essa fase pode passar despercebida pelos proprietários,
uma vez que os sinais clínicos são discretos, o que dificulta o estabelecimento
precoce do diagnóstico (ZANUTTO et al., 2011).
Através da forte resposta celular e humoral induzida pelo FIV, a carga viral
plasmática diminui definindo o fim da fase aguda da infecção (HOSIE et al., 2009).
Fase Assintomática
Segue-se um período de meses a anos, em que a infecção é assintomática.
Fatores que influenciam a duração da fase assintomática incluem a patogenicidade
do isolado infectante, exposição a agentes patogênicos secundários, e a idade do
gato no momento da infecção (HARTMANN, 2011).
Durante este tempo, ocorre à disfunção progressiva sistema imune (LEVY et
al., 2008). Ishida et al. (1992) demonstraram que cerca de um terço dos gatos
naturalmente infectados pelo FIV na fase assintomática desenvolvem doenças
debilitantes em 2 anos, diferente do que foi observado por Hofmann-Lehmann et al.
(1997) em gatos experimentalmente infectados que tiveram uma sobrevida superior
a 6 anos.
A presença de animais assintomáticos dificulta o diagnóstico e o tratamento.
As células possuem o DNA viral, porem são negativas para o RNA viral, portanto,
são efetivamente invisíveis para terapia farmacológica e vigilância imunológica,
persistindo como fonte para a reativação viral (MURPHY et al., 2012).
21
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
Neste estágio uma alta carga viral está presente uma vez que há um declínio
de linfócitos T CD4 e T CD8, onde o sistema imune já não consegue eliminar o vírus
de maneira eficiente (GOTO et al., 2002). Este estágio terminal é geralmente
caracterizado por uma linfadenopatia persistente, infecções crônicas secundárias,
neoplasias e distúrbios neurológicos (PEDERSEN et al., 1989; ISHIDA et al., 1992),
que aparecem por volta dos 4 a 6 anos de idade (ISHIDA et al., 1992; HOSIE et al.,
2009).
Os sinais clínicos surgem como resultado direto do vírus ou como
consequência da síndrome da imunodeficiência que se associa a infecções
secundárias que incluem o complexo respiratório felino, toxoplasmose, candidíase,
hemoplasmas e demodicose, agravando o quadro clínico rapidamente (BENDINELLI
et al., 1995). Achados usuais como perda de peso, estomatite, gengivite, diarreia
geralmente estão presentes (PEDERSEN et al., 1989). Vale ressaltar que os sinais
clínicos são muito inespecíficos, e uma alta porcentagem de animais com
manifestações sugestivas de infecção pelo FIV ou por FeLV são negativos para
ambos os retrovírus (ARJONA et al., 2000).
Apesar do FIV não ser considerado um vírus indutor de neoplasias, é sabido
que gatos infectados tem maior probabilidade de desenvolver linfomas e outras
doenças mieloproliferativas (CALLANAN et al., 1996; MAGDEN et al., 2011). As
doenças neurológicas também acontecem numa parcela pequena de gatos e
provocam alterações como demência, comportamento psicótico, atraso nos reflexos
pupilares e ataxia (PEDERSEN et al., 1989; PHILLIPS et al., 1994).
Apesar de existirem diferentes maneiras de dividir os estágios clínicos da FIV,
ainda há dificuldade em fazê-lo, uma vez que não existe uma distinção clara entre as
fases em gatos naturalmente infectados, e nem todas as fases são evidentes. Além
disso, gatos com alta carga viral e sinais clínicos graves podem recuperar-se
totalmente com cuidados adequados e voltar a uma fase assintomática, diferente do
que acontece com pessoas infectadas pelo HIV (GOTO et al., 2002; HARTMANN,
2011).
A associação entre os subtipos e as manifestações clínicas ainda não está
totalmente esclarecida, especula-se que devido aos diferentes tropismos celulares
22
apresentado pelos isolados do FIV, a patogenicidade e os sinais clínicos também
deverão se manifestar de formas distintas (BURKHARD; DEAN, 2003).
3.1.6 Alterações Laboratoriais
É comum a presença de citopenia como um reflexo direto do próprio vírus no
sangue periférico ou de doenças concomitantes, além das anormalidades
provocadas na medula óssea, diminuindo o número de células progenitoras e assim
alterando toda a cinética de produção das diferentes linhagens (LINENBERGER;
ABKOWITZ; 1995). Um efeito direto na granulopoiese também foi sugerido por
Callanan et al. (1992) em animais acompanhados por um período de 12 meses que
apresentavam episódios de neutropenia e linfopenia.
Eventualmente pode ocorrer neutropenia na fase aguda muitas vezes
associada a uma leve a moderada leucopenia que dura alguns dias à semanas
antes de desaparecer completamente (PEDERSEN, et al., 1989; LINEMBERGER;
ABKOWITZ, 1995). O desenvolvimento da fase terminal da infecção pelo FIV muitas
vezes é anunciado pelo reaparecimento de leucopenia associada a neutropenia e
linfopenia, e anemia moderada à severa, bem como, trombocitopenia devido a
destruição periférica das plaquetas (SHELTON et al., 1990).
Com relação a alterações bioquímicas, Hofmann-Lehmann et al. (1997),
observaram aumento dos valores de glicose e proteínas totais, sugerindo uma
mudança no metabolismo energético e uma hipergamaglobulinemia,
respectivamente; e uma diminuição nos níveis de colesterol no início da infecção e
aumento dos valores de triglicerideos na fase terminal da doença, alteração estas
atribuída ao metabolismo lipídico que sofre influência nas infecções. Devido à
estimulação desequilibrada da resposta humoral, muitos animais apresentem
deposição de imunocomplexos nos rins alterando valores de uréia e creatinina
(HOSIE et al., 2009).
23
3.2Vírus da leucemia felina (FeLV)
3.2.1 Vírus
O vírus da leucemia felina partilha da mesma família e subfamília do FIV,
porém pertence ao gênero Gammaretrovirus. Partículas virais foram isoladas pela
primeira vez em 1964 por William Jarrett em um grupo de gatos com linfoma
(JARRETT et al., 1964). O FeLV foi descrito como um vírus semelhante ao vírus da
leucemia de murinos (MuLV), indicando uma possível incorporação do MuLV ao
genoma de algum ancestral do gato dando origem ao enFeLV (FeLV endógeno) e
ao FeLV exógeno presente na natureza (GREGGS et al., 2011; WILLETT; HOSIE,
2013).
O FeLV possui como material genético duas moléculas de RNA de fita
simples. O RNA é transcrito em DNA (pró-vírus) pela transcriptase reversa e é
integrado ao genoma celular. O pró-vírus contém sequências repetidas (LTR) nas
extremidades 3’e 5’ com função regulatória e de controle da expressão dos genes
virais (DUNHAM; GRAHAM, 2008). Entre as LTRs encontram-se os genes gag, pol e
env. O gene gag codifica proteínas do capsídeo (p27), da matriz (p15c) e do
nucleocapsídeo (p10), opol codifica proteínas envolvidas na replicação viral, a
transcriptase reversa e a integrase, o env codifica proteínas do envelope viral, a
proteína transmembranosa (p15E) e a proteína de superfície (gp70) (Figura 2)
(JARRETT, 1999; LUTZ, et al., 2009).
Figura 2 - Representação esquemática do DNA pró-viral do FeLV. Os LTR presentes nas extremidades, flanqueando os genes gag, pol e env(DUNHAM; GRAHAM, 2008, adaptado).
Por ser um vírus mais simples que o FIV, o FeLV utiliza de outros
mecanismos para sua manutenção além da presença da enzima transcriptase
24
reversa. Esse vírus tem predileção por células que estão em processo de divisão
ativa, tais como células da medula óssea e do intestino delgado (COLLADO et al.,
2012). Além de induzir uma evasão imune através de modificações funcionais e
estruturais de uma parte das proteínas expressas pelo gene gag, sendo estas
menos reconhecidas pelos anticorpos, permitindo desta maneira que o vírus persista
sem obstáculos no seu hospedeiro (ROJKO; OLSEN, 1984; JARRETT, 1999).
3.2.2 Subtipos
A grande variabilidade do FeLV na natureza normalmente está associado com
doença grave, entretanto, esse vírus é essencialmente não-patogênico. Uma das
razões para essa patogenicidade é a alta frequência de mutações no gene env, que
codifica as proteínas de superfície, determinando variações biológicas virais como o
reconhecimento e afinidade a receptores celulares, cinética da replicação e/ou o
potencial patogênico da variante (OVERBAUGH; BANGHAM, 2001). Outro motivo é
a recombinação com genes do vírus endógeno (JARRETT, 1999). Os vírus
endógenos (enFeLV) são transmitidos horizontalmente, sendo estes, sequencias
incompletas que podem expressar proteínas virais de tempos em tempos, porém
sozinhos não dão origem a vírus viáveis (ROKJO; OLSEN, 1984; GREGGS et al.,
2011).
O FeLV-A é o subtipo mais encontrado em gatos naturalmente infectados,
sendo considerado a forma transmissível do FeLV, que recombinando-se com
sequências do enFeLV originando o subtipo-B (ROKJO; OLSEN, 1984, DUNHAM;
GRAHAM, 2008). O FeLV-C surge a partir das mutações no gene env do FeLV-
A,possivelmente devido uma resposta a pressão seletiva por parte do hospedeiro,
seja para escapar da resposta imune adaptativa ou devido a disponibilidade de
receptor nos tecidos em que o vírus se replica (STEWART et al., 2012). O subtipo-T
apresenta aproximadamente 96% de similaridade com o subgrupo A e surge a partir
de mutações na sequência da SU (gene env) do FeLV-A (DONAHUE et al., 1991).
Acredita-se que o surgimento dessas variantes do FeLV ocorra devido a
mecanismos de fuga do sistema imune, favorecendo a evolução na patogênese da
doença no hospedeiro (LAURING et al., 2001).
25
3.2.3 Transmissão
O FeLV é transmitido horizontalmente através da saliva e de secreções
oronasais. A disseminação é favorecida pelo comportamento social dos felinos,
como hábitos de higiene mútua, no contato materno e na partilha de acessórios de
comida e água (LUTZ; JARRETT, 1987; GOMES-KELLER et al., 2006). Outros
fluidos corporais como fezes e urina, podem se tornar vias importantes de
transmissão em gatos que se apresentam no período de viremia (GOMES-KELLER
et al. 2009).
Fêmeas virêmicas podem infectar seus filhotes por via transplacentária ou
pela lactação. Os gatos que escapam da infecção via útero e leite, podem se infectar
durante os cuidados de limpeza realizados pela mãe (HARDY et al., 1976; ROJKO;
OLSEN, 1984).
3.2.4 Patogenia
Após a exposição, o vírus inicia a replicação nas células mononucleares do
tecido linfóide da orofaringe, que perdura de 2 a 7 dias. Através da via linfática e
sanguínea os vírus se difundem pelo organismo alcançando a medula óssea,
infectando células em processo de divisão. Nessa fase, que dura de 2 a 4 semanas,
a competência do sistema imune do animal é que determinará o curso final da
doença, caso não consiga debelar a infecção novos vírus serão produzidos e a
viremia será instalada atingindo todos os tecidos, podendo assim ser eliminado para
o ambiente (ROJKO; OLSEN, 1984, LUTZ; JARRETT, 1987).
A idade da exposição ao vírus aparece como um fator importante para o
desenvolvimento da infecção, animais com idade entre 2 à 8 meses tem 85% de se
tornarem FeLV-positivos(LUTZ et al., 2009).
3.2.5 Categorias da Infecção pelo FeLV
Uma das características marcantes do FeLV em relação a outros retrovírus
felinos é que o curso da infecção vai depender da resposta imunológica apresentada
pelo hospedeiro diante desse vírus. Se os mecanismos imunes induzidos
26
extinguirem o vírus antes da medula óssea ser infectada há uma grande chance da
infecção ser eliminada (HARDY et al., 1976; JARRETT,1999).
De acordo com os resultados encontrados por Torres et al. (2005),
empregando o PCR em tempo real para a quantificação de DNA pró-viral nos
diferentes estágios da doença comparando os resultados obtidos com o do teste
para antígeno p27; juntamente com trabalhos de Hofmann-Lehmann et al. (2008)
que correlacionaram a quantificação de DNApró-viral, RNA viral, antigenemia (p27) e
isolamento viral, sugeriram a seguinte classificação para as diferentes categorias da
infecção pelo FeLV (Tabela 1).
Tabela 1 - Classificação dos estágios do FeLV de acordo com os diferentes testes.
Resultado exposição ao FeLV
Antígeno p27 no sangue
Vírus na cultura de
tecido
RNA viral no sangue
DNA proviral
no sangue Doença
Abortiva Negativo Negativo Negativo Negativo Não
Regressiva Negativo
ou Transiente
Variável
Negativo
ou Transiente
Positiva Não
Progressiva Positiva Positivo Positiva Positiva Sim
Atípica Variável Positivo Variável Variável Não
Adaptado de Levy et al., 2008.
Infecção Abortiva
Após a exposição ao vírus, alguns gatos imunocompetentes podem montar
uma resposta humoral e celular capaz de eliminar o vírus antes mesmo que ocorra a
integração ao genoma do hospedeiro. Nos testes realizados ocorre ausência de
DNA pró-viral, RNA viral, antígeno p27, do vírus em tecidos após exposição
(TORRES et al., 2005; HOFMANN-LEHMANN et al., 2008).
As infecções abortivas provavelmente advém de gato exposto a baixas doses
do FeLV (MAJOR et al., 2010), porém ainda é desconhecido quantas vezes essa
situação realmente ocorre na natureza, uma vez que parece pouco provável que os
animais consigam eliminar o vírus de todas as suas células (HARTMANN, 2011).
27
Infecção Regressiva
Uma vez infectado o tecido linfóide da orofaringe, o vírus se espalha
sistemicamente atigindo a medula óssea. Durante esta fase os gatos têm resultados
positivos para testes que detectam antígeno livre no plasma (por exemplo ELISA),
porém o sistema imunológico monta uma resposta suficiente para impedir a
progressão da doença, e a antigenemia acaba dentro de semanas à meses
(HARTMANN, 2011).
Entretanto, o sistema imune não pode eliminar completamente o vírus do
corpo, uma vez que as informações para a replicação do vírus (DNA pró-viral) estão
presentes nas células progenitoras da medula óssea. Esta condição tem sido
chamada de "infecção latente". A base molecular de latência é a integração de uma
cópia do genoma viral (pró-vírus) no DNA cromossômico celular. Embora o DNA pró-
viral fique presente no genoma celular, ele não é traduzido em proteínas, e não são
formadas partículas virais infecciosas (HARTMANN, 2011). Este estado de latência
pode ser revertido, ou talvez nunca exista, e sim, uma presença muito baixa da
carga de RNA viral que não consiga ser detectado pelos testes (HOFMANN-
LEHMANN et al., 2008).
Essa fase é caracterizada por uma antigenemia transitória (RNA viral
transiente), seguido pelo estabelecimento de baixa à moderada carga de DNA pró-
viral (HOFMANN-LEHMANN et al., 2008).
Infecção Progressiva
Quando o sistema imunológico do animal não consegue deter a infecção, ela
progride com uma replicação intensa do vírus nos diferentes tecidos. Esses animais
permanecem persistentemente infectados pelo resto de suas vidas, com presença
do DNA pró-viral e RNA viral (HOFMANN-LEHMANN et al., 2008).
Infecções progressivas e regressivas podem ser distinguidas por testes
repetidos para antígenos do vírus em sangue periférico. Gatos com infecção
regressiva irão se tornar negativos, enquanto os gatos infectados progressivamente
permanecerão positivos (HARTMANN, 2011).
O prognóstico de gatos persistentemente virêmicos é reservado, destes, 70-
90% terão morrido dentro de 18 meses à 3 anos (HARDY et al., 1976). No trabalho
28
de Addie et al. (2000), seis dos sete animais positivos para FeLV morreram dentro
de dois anos.
Infecção Atípica:
Observada em 10% dos gatos infectados experimentalmente. É caracterizada
por uma persistente replicação viral em locais atípicos (glândulas mamarias, bexiga,
olhos). Nesses animais, testes que detectam o antígeno podem ter resultado fraco
positivo ou podem alternar entre resultados positivos e negativos, uma vez que a
produção de antígenos pode ser baixa ou intermitente (LEVY et al., 2008).
Os animais persistentemente virêmicos apresentam como sinais clínicos
principais: doenças imunossupressivas severas, anemias não regenerativas e
neoplasias (JARRETT, 1999; HOFMANN-LEHMANN et al., 1997).
As infecções pelo FeLV induzem a um estado de imunossupressão mais
severo que o FIV, predispondo a infecções secundárias e a piora do quadro clínico
do animal. Esta se deve a perda progressiva dos linfócitos T e B, e especula-se que
o vírus também cause uma desordem mieloproliferativa, com produção de neutrófilos
ineficientes, além de impedir que os linfócitos sofram mitoses devido à ação da
p15E, proteína do envelope viral, que tem atividade imunossupressora (LAFRADO et
al., 1987; GREGGS et al., 2011).
Normalmente os quadros de anemia são acompanhados por uma diminuição
de todas as linhagens celulares, devido a alterações na função das células
infectadas ou expressão de antígenos na superfície levando a destruição
imunomediada (HARTMANN et al., 2011).
Os linfomas e as leucemias ocorrem com maior frequência nos animais FeLV
positivos, porém qualquer doença citoproliferativa pode estar associada. Acredita-se
que o desenvolvimento desses tumores tenha origem no momento da inserção do
DNA viral no genoma do hospedeiro, interrompendo ou desregulando a expressão
de proteínas envolvidas na manutenção da célula (LUTZ et al., 2009; GREGGS et
al., 2011).
O prognóstico clínico também é influenciado pelo subtipo isolado no animal.
Gatos positivos para o FeLV-A e FeLV-B têm um risco maior de desenvolver linfoma
do que gatos apenas infectados pelo FeLV-A. O FeLV-C desencadeia uma aplasia
da linhagem eritróide, desenvolvendo uma anemia arregenerativa em poucas
semanas. O FeLV-T é descrito como um forte indutor de imunodeficiência devido
29
seu efeito citopático direto ou induzindo apoptose dos linfócitos T (JARRETT, 1999;
GREGGS et al., 2011; STEWART et al., 2012; WILLETT; HOSIE, 2013)
3.2.6 Alterações Laboratoriais
As doenças hematológicas mais comuns descritas em associação com FeLV
incluem anemia persistente, neutropenias cíclicas e anormalidades na contagem de
plaquetas (LINENBERGER; ABKOWITZ, 1995; JARRETT, 1999). Acredita-se que
das anemias associadas a animais FeLV positivos, apenas 10% são provocadas por
hemólise imunomediada ou por infecções secundárias por hemoparasitas, os outros
90% estão associados a mielossupressão provocada pelo vírus (STUTZER et al.,
2009).
Collado et al. (2012) observaram que animais FeLV-positivos com sinais
clínicos apresentavam uma tendência maior em ter contagens de eritrócitos
subnormais do que aqueles sem sinais. Bardshiri et al. (2011) encontraram
resultados similares, sendo a anemia, linfopenia e neutropenia as alterações mais
frequentes em gatos FeLV-positivos.
Valores alterados de aspartato aminotransferase (AST) e uréia foram
observados nos animais infectados pelo FeLV, sendo que o aumento deste ultimo
parâmetro pode ser explicado devido a deposição de imunocomplexos, levando a
disfunção renal (HOFMANN-LEHMANN et al., 1997).
3.3 Prevalência
Desde a descoberta do FIV e FeLV muitos estudos têm sido realizados em
todo o mundo determinando as prevalências que variam de 2,5 a 31,3% e de 2,3 a
30,4%, respectivamente (ARJONA et al., 2000; LEVY et al., 2006; BANDE et al.,
2012) (Tabela 2). A distribuição de animais infectados pelos retrovírus varia
consideravelmente dependendo da região geográfica, população felina avaliada e
método de diagnóstico escolhido (LEVY et al., 2008; GLEICH et al). No Brasil as
infecções por FIV e FeLV já foram detectadas por meio de pesquisas usando
30
técnicas sorológicas e moleculares em gatos domésticos de origens distintas,
demostrando a presença dos dois retrovírus em diferentes estados (Tabela 3).
De acordo com Courchamp et al. (1997), uma vez introduzido o FIV na
população, este se espalha e é mantido durante os anos, enquanto o FeLV pode
desaparecer ou persistir, sendo que os dois retrovírus nunca induzem a extinção da
população. Tal fato pode ser explicado pelo baixo impacto do FIV na expectativa de
vida dos animais infectados, bem como a capacidade do FeLV extinguir a infecção
(HOFMANN-LEHMANN et al., 1997).
A prevalência das infecções pelo FeLV tem diminuído durante os últimos anos
possivelmente devido a introdução de testes de diagnósticos na rotina clínica,
permitindo assim o isolamento dos animais infectados e a vacinação dos grupos de
risco (ARJONA et al., 2000; LEVY et al., 2008; GLEICH et al., 2009). O mesmo não
é observado em alguns países como o Brasil, onde o diagnóstico para a Leucemia
Viral Felina ainda é restrito devido ao seu custo elevado, afetando diretamente a
utilização da vacina (ALMEIDA et al., 2012). Medidas de remoção e isolamento dos
animais positivos também são formas importantes de impedir a propagação dessas
doenças (LITTLE et al., 2011).
Os fatores de risco associados a presença do FIV e/ou FeLV estão
intimamente relacionados com as rotas de infecção do vírus e a susceptibilidade do
hospedeiro, por isso gatos machos, jovens, que tem acesso a rua ou que vivem em
locais com alta densidade populacional estão em maior risco de terem contato com
os agentes (COURCHAMP et al., 1998; HARTMANN, 2011).
31
Tabela 2 –Frequência do FIV e FeLVno mundo, métodos de diagnóstico utilizados e tipo de população de gatos selecionadas.
País População
selecionada Método
Diagnóstico n FIV FIV (%) FeLV
FeLV (%)
FIV e FeLV
FIV e FeLV (%)
Referência
Malásia Animais doentes e
sadios ELISA 368 115 31,3% 45 12,2% 16 4,3% Bande et al., 2012
Alemanha Animais doentes e
sadios ELISA 17.472 563 3,2% 638 3,6% 42 0,2% Gleichet al., 2009
Espanha Animais sadios ELISA 180 14 8,3% 27 15,16% 2 1,1% Arjona et al., 2000
Espanha Animais doentes ELISA 115 15 13,8% 34 30,4% 3 2,6%
Japão Animais sadios ELISA 1.088 107 9,8% 32 2,9% NA NA Maruyama et al., 2003
Estados Unidos Animais doentes e
sadios ELISA 18.038 450 2,5% 414 2,3% 54 0,3% Levy et al., 2006
Japão Animais doentes e
sadios ELISA 3.323 960 28,9% NA NA NA NA Ishida, et al., 1989
NA= Não avaliado
3
1
32
Tabela 3–Frequência do FIV e FeLVno Brasil, métodos de diagnóstico utilizados e tipo de população de gatos selecionadas.
Estado População selecionada Método
Diagnóstico n FIV FIV (%) FeLV
FeLV (%)
FIV e FeLV
FIV e FeLV (%)
Referência
Rio de Janeiro Animais atendidos em
clínica ELISA 149 25 16,70% 39 26,17% 8 5,36% Macieira et al., 2008
Distrito Federal Animais doentes e sadios nested-PCR 200 4 2% 1 0,50% 1 0,50% Marçolaet al., 2013
Distrito Federal Animais doentes e sadios nested- PCR 267 6 2,24% 53 19,85% 4 1,49% Aquino, 2012
São Paulo Animais doentes e sadios ELISA 401 47 11,7% 32 8% 1 0,25% Reche Jr. et al., 1997
São Paulo Animais doentes e sadios ELISA 302 17 5,63% 1 0,33% Sobrinho et al., 2011
Rio Grande do Sul
Animais doentes e sadios nested-PCR 70 11 15,70% NA NA NA NA Silva et al, 2014
São Paulo Animais doentes e sadios nested-PCR 454 67 14,70% NA NA NA NA Lara et al., 2008
Minas Gerais Animais de abrigo ELISA 40 NA NA 13 32,50% NA NA Teixeira et al., 2007
Rio de Janeiro Animais doentes e sadios RIFI 1094 NA NA 126 11,52% NA NA Almeida, et al., 2012
Minas Gerais Animais doentes e sadios nested-PCR 1072 NA NA 507 47,50% NA NA Coelho et al., 2011
São Paulo Animais doentes e sadios RIFI 812 NA NA 50 6,20% NA NA Jorge, et al., 2011
NA= não avaliado
32
33
3.4 Diagnóstico
O diagnóstico das infecções por FIV e FeLV é feito pela associação dos sinais
clínicos apresentados pelo paciente com exames laboratoriais complementares
(TEIXEIRA et al., 2007), sendo importante tanto para os animais não infectados,
onde os proprietários podem tomar medidas preventivas como a vacinação e
segregação dos animais doentes, mas também é essencial o diagnóstico para
aqueles que são positivos e assim poderem receber os cuidados necessários
(ARJONA et al., 2000; LEVY et al.,2008).
Rotineiramente as infecções pelo FIV e FeLV são diagnosticadas por meio de
testes sorológicos. Para o FIV pesquisa-se anticorpos neutralizantes contra as
proteínas do capsídeo (como a p24 e p15) e uma das glicoproteínas do envelope
viral (gp41), estas podem ser detectados em 4 a 8 semanas após a infecção (HOSIE
et al.,2009; LITTLE et al., 2011). Porém resultados falto-negativos podem ser
encontrados nos animais em estágios terminais, nos quais os títulos de anticorpos
diminuem (ARJONA et al., 2007); e falso-positivos podem ocorrer em gatinhos
jovens oriundos de prole de mães positivas, devido à transferência de anticorpos
maternos através da placenta ou colostro (MORTOLA et al., 2004). Para o FeLV
utiliza-se da detecção de antígenos solúveis, proteína p27 do capsídeo, sendo
recomentado o teste 30 dias após a exposição (LITTLE et al., 2011). Um resultado
positivo pode indicar infecção transitória ou persistente, sendo indicada a repetição
do teste dentro de 30 dias, ou utilizar outra técnica de diagnóstico como a PCR
(LEVY et al., 2008).
O isolamento viral é considerado o teste ouro, e pode ser realizado para os
dois retrovírus, porém por ser mais trabalhoso e não estar disponível em todos os
laboratórios não é utilizado na rotina (LEVY et al., 2008; LITTLE et al., 2011). A
reação de imunofluorescência indireta do sangue ou medula é um teste com baixa
taxa de discrepância se comparado as outras técnicas sorológicas (MORTOLA et
al.,2004), porém sua sensibilidade é muito menor quando comparado ao isolamento
viral. Animais FeLV positivos só serão positivos para a imunofluorescência caso
ocorra a infecção da medula (segunda viremia), e o teste pode apresentar falso-
negativos em animais leucopênicos (LUTZ et al., 2009; LITTLE et al., 2011).
34
A PCR para a detecção do DNA pró-viral nas células mononucleares do
sangue periférico vem sendo amplamente usado para o diagnóstico do FIV e FeLV.
Sua utilização é independentemente da presença de anticorpos para o FIV ou
viremia (RNA plasmático) para o FeLV, permitindo a identificação de gatos com
infecção latente (HOFMANN-LEHMANN et al., 2001; TORRES et al., 2005). Além
disso, o desenvolvimento da nested-PCR, com a utilização de pares de iniciadores
externos e internos permitiu o aumento da sensibilidade da técnica (MIYAZAWA;
JARRETT, 1997; HOHDATSU et al., 1998).
O desenvolvimento da PCR em tempo real contribuiu para o conhecimento da
dinâmica das infecções retrovirais (HOFMANN-LEHMANN et al., 2001), uma vez que
permite a detecção do vírus e também a quantificação do DNA e RNA viral (LUTZ et
al., 2009; LITTLE et al., 2011). Essa técnica adicionou uma nova dimensão para o
diagnóstico das infecções pelo FeLV permitindo uma classificação correta do estágio
que o animal se encontra (LUTZ et al., 2009). A dosagem da carga de RNA viral
também se mostrou como um bom marcador do estágio clínico de gatos infectados
pelo FIV, permitindo uma melhor compreensão do estado imunológico e antecipando
o possível prognóstico desses animais. Essa técnica também tem sido utilizada
como um indicador da eficácia terapêutica dos antivirais (GOTO et al., 2002).
3.5 Tratamento
Embora o FIV possa provocar uma síndrome de imunodeficiência adquirida
em gatos, aumentando os riscos de infecções oportunistas, doenças neurológicas e
tumores, a maioria dos gatos naturalmente infectados vive por muitos anos, diferente
das infecções progressivas do FeLV que estão associadas a diminuição da
expectativa de vida. Diante dessas duas doenças, cada vez mais proprietários optam
por fornecer tratamento para os seus gatos, alcançando resultados satisfatórios e
melhorando a qualidade de vida desses animais (HOSIE et al., 2009; HARTMANN,
2011).
Normalmente esses animais FIV e/ou FeLV positivos recebem tratamento de
suporte para amenizar as alterações clínicas provocadas pelas infecções
secundárias. Estas costumam responder bem aos tratamentos nas fases iniciais,
35
mas tornam-se refratários com o passar do tempo, provavelmente devido à
deterioração do sistema imune (PEDERSEN et al., 1989). Callanan et al. (1992)
observaram que animais experimentalmente infectados pelo FIV apresentando febre
e apatia, responderam bem ao tratamento com antibióticos. Os corticoides são
utilizados em casos de estomatite ou doenças imunomediadas induzidas pelo FeLV
(HOSIE et al.,2009). Fluidoterapia, tranfusões de sangue, drogas antiparasitárias e
antifúgicas, entre outras, podem se fazer necessárias em animais muito debilitados
(LUTZ et al., 2009; DOMENÉCH et al., 2011).
A eficácia dos antivirais no tratamento do FIV e FeLV é limitado, muitas
dessas drogas utilizadas em seres humanos são tóxicas para gatos (HOSIE et al.,
2009), ou sua ação é transitória devido a alta frequencia de mutações virais
(BENDINELLI et al., 1995). O composto anti-retroviral mais utilizado rotineiramente é
a azidotimidina (AZT), nos retrovírus ele inibe a replicação diminuindo a carga viral,
favorecendo a melhora imunológica e o estado clínico do animal (LUTZ et al., 2009;
GÓMEZ et al., 2012), porem não há estudos bem desenhados demonstrando a
eficácia do AZT em prolongar a vida dos gatos com infecção estabelecida, além de
induzir efeitos colaterais tais como anemia, vômito e anorexia (GREGGS et al.,
2011).
Os imunomoduladores, principalmente os interferons tipo I, tem sido
propostos para o tratamento das desordens provocadas pelo HIV, e tem alcançado
uma resposta satisfatória nos animais FIV e/ou FeLV positivos. Seu mecanismo de
ação não está totalmente elucidado, porém já se sabe que induzem a expressão de
genes específicos que codificam citocinas envolvidas na imunidade inata, além de
efeitos anti-proliferativos e ações anti-inflamatórias (DOMENÉCH et al., 2011; GIL et
al., 2013).
Para o sucesso do tratamento é necessário que o diagnóstico ocorra
precocemente. Nesses animais espera-se que o sistema imune ainda esteja
totalmente funcional e que os órgãos não estejam lesionados pelas infecções, desse
modo a terapia é melhor tolerada (GÓMEZ et al., 2012).
36
3.6 Coinfecções
É sabido que as infecções por FIV e/ou FeLV são acompanhadas por um
quadro de imunossupressão devido a alterações na contagem de linfócitos CD4 e
CD8 (COLLATO et al., 2012), que predispõem os gatos a uma variedade de
patógenos oportunistas como os hemoplasma, coccidioses, herpesvirus, calicivírus
felino e Toxoplasma gondii (ROJKO; OLSEN et al., 1984).
O Toxoplasma gondii infecta uma ampla variedade de hospedeiros, tendo os
felídeos papel importante na epidemiologia desse agente, uma vez que são os
únicos hospedeiros definitivos conhecidos que podem excretar transitoriamente
oocistos no ambiente (DUBEY, 2008). Esse protozoário quando em contato com o
hospedeiro humano imunocompetente, causa uma resposta imune celular eficaz,
não desenvolvendo sinais clínicos da doença. Porém em uma pequena porcentagem
da população a doença pode evoluir e levar a morte, principalmente em fetos de
gestantes primo infectadas e em indivíduos imunossuprimidos, por exemplo, HIV
positivos. (HILL; DUBEY, 2002).
Normalmente os gatos tem o primeiro contato com T. gondii até os 6 meses
de vida, liberando os oocistos por um curto período de tempo e depois adquirem
uma imunidade intestinal e normalmente não voltam a reeliminar os mesmos
(DUBEY, 2008). No entanto, acredita-se que os quadros de imunossupressão
desencadeados pelo FIV e FeLV possa reativar uma infecção latente pelo T. gondii,
tornando-se fatores de risco para a toxoplasmose humana(WITT et al., 1989).
Diante do possível potencial zoonótico, muitos trabalhos são realizado para
determinar as coinfecções entre o FIV e/ou FeLV e as infecções toxoplásmicas. As
soroprevalência encontradas para T. gondii, variam de 2,5%-66,6% para FIV
positivos, e 1,5%-35% FeLV positivos (LUCAS et al., 1998; AKHTARDANESH et al.,
2010, SPADA et al., 2012)
37
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local de Realização do Estudo
O estudo foi realizado nas cidades de Ilhéus e Itabuna (latitude14º47’’S;
longitude39º02’’W e latitude14º47’’S; longitude 39º16’’W, respectivamente) inseridas
na microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia. A microrregião de Ilhéus-Itabuna pertence à
mesorregião Sul Baiano e é a microrregião da Bahia que possui o maior número de
municípios, sendo 41 no total, com área de 21.308,944km². As cidades apresentam
uma população humana de aproximadamente 473.000 habitantes (IBGE, 2010).
4.2Coleta do Material Biológico
No período de fevereiro de 2012 a abril de 2013 foram coletadas por
conveniência amostras de 201 gatos domésticos heterogêneos em idade, sexo e
raça. Foram coletados 4mL de sangue por punção venosa, cefálica ou jugular de
cada animal, sendo 1mL acondicionado em tubo com EDTA a 11% para realização
de hemograma e extração do DNA, 2 mL de sangue em tubos sem EDTA para
obtenção do soro sanguíneo para a realização de perfil bioquímico sérico e
sorologia. Os valores obtidos em todas as análises foram tabulados em pacote
Excel.
O projeto obedeceu aos princípios de bioética e bem estar animal do Comitê
de Ética no Uso dos Animais (CEUA-UESC), recebendo o número de protocolo
011/12.
4.3 Coleta de Dados
Os proprietários foram submetidos a uma entrevista semi-estruturada no
momento das coletas, em busca de informações sobre os hábitos e manejos dos
animais com vistas à determinação dos fatores associados à infecção (Anexo A).
38
4.4 Análise Hematológica e Bioquímica
Para realização do hemograma completo dos animais utilizou-se o contador
automático hematológico uso veterinário (ABX VET- Horiba®). O hematócrito (VG)
foi determinado pela técnica do microhematócrito. As proteínas plasmáticas totais
foram determinadas com o auxílio do refratômetro. Os esfregaços sanguíneos foram
fixados em metanol por cinco minutos e corados com Giemsa-Doles® durante 30
minutos para a contagem da leucometria específica e observação da morfologia das
células sanguíneas. Os valores de referência utilizados foram de acordo com Jain
(1993).
Para a determinação da contagem de reticulócitos foram utilizadas partes
iguais de sangue e corante azul cresil brilhante em um tubo de ensaio levado ao
banho-maria a 37ºC por 15 minutos e confeccionado esfregaços. Foram contados
1000 eritrócitos, entre reticulócitos e células maduras em objetiva de imersão
(100%), como proposto por Harvey (2001).
Para a determinação da alanina aminotransferase (ALT), aspartato
aminotransferase (AST), gama glutamil transpeptidase (GGT), bilirrubina total, direta
e indireta, uréia e creatinina séricas, foram utilizados kits comerciais Labtest® e
analisador bioquímico Bioplus 2000. Os valores de referência foram baseados no
Kaneko (1997).
4.5 Sorologia para FIV e FeLV
Os soros obtidos foram testados para o ELISA comercial FIV Ac / FeLV Ag
Test Kit (Alere ®) e o resultado interpretado de acordo com as recomendações do
fabricante.
39
4.6 Extração do DNA Genômico
Após a realização do hemograma o sangue total foi mantido a -20ºC até o
momento da extração do DNA genômico utilizando um kit comercial - QIAamp
DNA Blood Mini (Qiagen ®) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante
(Anexo B).
Após a extração as amostras foram submetidas à espectrofotometria
(NanoDrop®) para quantificar o DNA obtido e logo em seguida foram armazenados
em freezer a -20ºC até a realização da reação em cadeia de polimerase (PCR).
4.7 Realização da Reação em Cadeia da Polimerase
Todas as amostras foram submetidas à PCRs para FIV e FeLV. As amostras
que apresentaram resultado negativo foram submetidas a uma reação utilizando
oligonucleotídeos específicos para o gene da enzima GAPDH (gliceraldeído-3fosfato
desidrogenase), a fim de se verificar a integridade do DNA e a presença de
inibidores da PCR. Na Tabela 4 estão listadas as sequências dos oligonucleotídeos
utilizados para cada PCR. Os controles positivos para FIV e FeLV foram gentilmente
cedidos pelo Prof. João Pessoa Araújo Júnior (Departamento de Microbiologia e
Imunologia, Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP-Botucatu, São Paulo). A
água ultra pura foi utilizada como controle negativo para verificar possíveis
contaminações dos reagentes. Todos os PCRs foram realizados no mesmo
termociclador Applied Biosytems (Veriti®).
40
Tabela 4 - Primers utilizados nas PCRs para FIV, FeLV e GAPDH. Descrito a sequência de oligonucleotídeos, a região de origem no DNA pró-viral e o tamanho do produto amplificado.
Reação Sequência 5'-3' Região Produto Referência
FIV A2 AAT ATG ACT GTA TCT ACT GC gag 329pb
Hohdatsu et al.,1998 S2 TTT TCT TCT AGA GTA CTT TCT GG gag
NS TAT TCA AAC AGT AAA TGG AG gag NA CTG CTT GTT GTT CTT GAG TT gag
FeLV
U3-F ACA GCA GAA GTT TCA AGG CC U3/gag 601pb
Myiazawa; Jarrett, 1997 G-R GAC CAG TGA TCA AGG GTG AG U3/gag
U3-F(2) GCT CCC CAG TTG ACC AGA GT U3/gag G-R(2) GCT TCG GTA CCA AAC CGA AA U3/gag
GAPDH
GAPDH F CCT TCA TTG ACC TCA ACT ACAT
400pb Birkenheuer et al., 2003
GAPDH R CCA AAG TTG TCA TGG ATG ACC
4.7.1 Reação em Cadeia da Polimerase para detecção do DNA pró-viral do FIV
Sequências de oligonucleótídeos específicos do gene gag do FIV foram
utilizados na realização da nested-PCR para identificação do DNA pró-viral, gerando
um produto de 329pb (HOHDATSU et al., 1998).
As duas reações com volume final de 25µL foram compostas por: 10x tampão
de PCR; 2,0mM de MgCl2; 0,2mM de cada dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP); 1µM
de cada oligonucleotídeo iniciador;1,25 U de Taq DNA polimerase. Na primeira
reação foi adicionado 5µL do DNA da amostra a ser testada, e 2µL do produto dessa
reação foi adicionada a segunda reação para amplificação. A água ultra pura estéril
foi utilizada para completar o volume da reação.
Ambas as reações utilizaram o mesmo protocolo de amplificação com
temperatura inicial de 95°C por 5 minutos, seguidos de 30 ciclos a 95°C por 45
segundos, 58°C por 45 segundos e 72°C por 45 segundos, extensão final a 72°C por
5 minutos, protocolo segundo Marçola (2011).
41
4.7.2 Reação em Cadeia da Polimerase para detecção do DNA pró-viral do FeLV
Para detecção do DNA pró-viral do FeLV, sequências de oligonucleotídeos
amplificam parcialmente o gene gag e a região U3 do FeLV-A, gerando um produto
de 601pb (MIYAZAWA; JARRETT, 1997).
As reações com 25µl na primeira e segunda reação da nested-PCR
continham 10x tampão de PCR; 2,0mM de MgCl2; 0,2mM de dNTPs (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP); 0,4µMde cada oligonucleotídeo iniciador, 1,25U de Taq DNA
polimerase. Na primeira reação foi adicionado 5µL do DNA da amostra a ser testada,
e 2µL do produto dessa reação foi adicionada a segunda reação para amplificação.
A água ultra pura estéril foi utilizada para completar o volume da reação.
O protocolo no termociclador consistiu em temperatura inicial de 94°C por 7
minutos, seguida de 33 ciclos a 94°C por 55 segundos, 55,3°C por 55 segundos na
primeira reação ou 59,5°C por 55 segundos na segunda reação, e 72°C por 1 minuto
e 10 segundos; com extensão final de 72°C por 7 minutos, protocolo segundo
Guimarães (2008).
4.7.3 Reação em Cadeia da Polimerase para o GAPDH
As amostras negativas foram submetidas à PCR para o gene da enzima
GAPDH, gerando um produto de 400pb. A reação com volume final de 25µL foi
composta por 10x de tampão de PCR; 2,0mM de MgCl2; 0,2mM de cada dNTPs
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP); 1µM de cada oligonucleotídeo iniciador, 1,25U de Taq
DNA polimerase a 5U/µL e 5µL de DNA da amostra a ser testada (BIRKENHEUER
et al., 2003).
O protocolo de amplificação foi composto de uma etapa inicial de 95°C por 5
minutos, seguida de 40 ciclos a 94°C por 30 segundos, 52°C por 1 minuto e 72°C
por 1 minuto, com extensão final de 72°C por 5 minutos.
42
4.8 Revelação dos produtos da Reação em Cadeia da Polimerase
Os produtos amplificados das PCRs para FIV, FeLV e GAPDH foram
armazenados a 4°C até o momento da eletroforese em gel de agarose a 2% em
solução de corrida TE (40 mM Tris-Acetato, 2mM EDTA, pH 8), corado
posteriormente com brometo de etídio (0,5µg/mL).Foi aplicado em cada canaleta 10
µL de cada produto, acrescidos de 2 µL de tampão de amostra (glicerol 40% e azul
de bromofenol 0,02%). A corrida foi realizada a 75 V, 150 mA durante 30 min. O
tamanho dos produtos amplificados foram estimados utilizando-se um padrão de
pares de base em cada gel de corrida. A visualização dos produtos amplificados foi
realizada em transiluminador ultravioleta (UV) L.PIX (Loccus Biotecnologia) e
fotografados por um analisador de imagens acoplado.
4.9 Sorologia para Toxoplasma gondii
Para realização da sorologia para pesquisa de anticorpos contra T. gondii foi
utilizada Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), considerando como ponto de
corte a diluição de 1:64 (PINTO et al., 2009; ROSA et al., 2010). Foi utilizado
conjugado antiIgG felino Sigma (Anti-CatIgG – F4262, Sigma-Aldrich ®) na diluição
de 1:128. Para a leitura das lâminas, foi utilizado microscópio com sistema de
epifluorescência (OLYMPUS, BX 51®).
Foram consideradas positivas as reações com completa fluorescência na
periferia dos taquizoítos. As lâminas sensibilizadas com taquizoítos da cepa RH,
fixadas em formol a 10%, foram provenientes da Universidade Estadual Paulista –
UNESP, Campus Jaboticabal, bem como os controles positivo e negativo. O
protocolo de realização da RIFI encontra-se no Anexo C.
43
4.10 Análise Estatística
O resultado da nested-PCR e ELISA para ambos os retrovírus, da RIFI para
T. gondii e os dados obtidos na entrevista, foram tabulados e analisados através do
programa EPI INFO versão 3.5.2, utilizando o teste qui-quadrado com correção de
Yates ou teste exato de Fisher para cada variável. A chance de ocorrer (OR) da
análise bivariada foi calculada com medidas de associação e intervalo de confiança
de 95%. As varáveis com plausibilidade biológica selecionadas foram submetidas à
correlação de Spearman (p≤ 0,2) para determinação da colinearidade, através do
programa estatístico Bioestat 5.0 (Apêndice A) e posteriormente compuseram o
modelo preliminar da regressão logística não condicional. O modelo final foi
construído através da entrada e saída das variáveis (sistema backward). Os valores
hematimétricos e bioquímicos de animais positivos e negativos para FIV e FeLV
foram comparados através do teste t student ou Mann-Whitney, com intervalo de
confiança de 95% utilizando o programa estatístico Bioestat 5.0®.
5 RESULTADOS
Dos 201 animais avaliados no presente estudo através da técnica de nested-
PCR e ELISA, 6% (12/201 - IC 3,1-10,2%) apresentaram resultados positivo para
FIV e3% (6/201 - IC 1,1%-6,4%) para FeLV. Nenhum felino foi positivo para ambos
os vírus. Nas Tabelas 5 e 6 estão apresentados os resultados descritivos completos
acerca da prevalência das infecções pelos retrovírus para ambos os testes.
Tabela 5. Diagnóstico do vírus da imunodeficiência felina pelas técnicas ELISA e nested-PCR em gatos domiciliados da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA.
nested-PCR
Positivo Negativo
Total
Positivo 7(3,5%)
4 (2%) 11 (5,5%)
ELISA
Negativo 1 (0,5%)
189(94%)
190(94,5%)
Total 8 (4%) 193(96%) 201 (100%)
44
Tabela 6–Diagnóstico do vírus da leucemia felina pelas técnicas ELISA e nested-PCR em gatos domiciliados da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA.
nested-PCR
Positivo Negativo Total
Positivo 1 (0,5%)
2 (1%)
3 (1,5%)
ELISA
Negativo 3 (1,5%)
195 (97%)
197 (98,5%)
Total 4 (2%) 197 (98%) 201 (100%)
As figuras 3 e 4 apresentam produtos da amplificação na nested-PCR para o
FIV e oFeLV, respectivamente, que pode ser visualizado no gel de agarose a 2%. A
Figura 5 apresenta duas amostras positivas pelo ELISA para os retrovírus.
Figura 3 - Resultado da Nested-PCR para FIV apresentando um produto de 329pb. Colunas: 1-marcador molecular; 2-controle positivo; 3-controle negativo; 4, 5- amostras positivas.
45
Figura 4 - Resultado da Nested-PCR para FeLV apresentando um produto de 601pb.Colunas: 1 marcador molecular; 2-controle positivo; 3-controle negativo; 4,5,6- amostras positivas
Figura 5 - Resultado de animais positivos pelo ELISA através da detecção dos anticorpos contra o FIV e a detecção do antígeno FeLV. A: reação positiva para o FIV. B: reação positiva para o FeLV.
Todas as amostras negativas para FIV ou FeLV, testadas para GAPDH
apresentaram um segmento de 400pb, indicando que as extrações dos DNAs foram
realizadas com êxito (Figura 6).
Figura 6 - Resultado da PCR para o GAPDH. Colunas: 1- marcador molecular; 2-controle negativo; 3,4,5,6,7,8- amostras positivas.
46
A Reação de Imunofluorescência Indireta revelou um percentual de
coinfecções entre oToxoplasma gondiie os animais positivos para FIV ou FeLV de
75% (9/12) e 50% (3/6), respectivamente.
As Tabelas 7 E 8 apresentam os valores encontrados de p para as diferentes
variáveis com plausibilidade biológica para as infecções pelo FIV e FeLV,
respectivamente.
Tabela 7 - Fatores com plausibilidade biológica associados às infecções pelo FIV em gatos da microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia.
VARIÁVEIS FIV Odds ration
POSITIVOS NEGATIVOS CI 95% p
N % N %
IDADE
Maior ou igual a um 2 ano 7 7,5 86 92,5 1,6(0,5-5,4) 0,57
Menor que 2 ano 5 4,6 103 95,4
SEXO
Macho 7 6,5 100 93,5 1,2(0,3-4,1) 0,94
Fêmea 5 5,3 89 94,7
TEM RAÇA DEFINIDA
Sim 1 7,7 12 92,3 1,3(0,1-11,1) 0,56
Não 11 5,9 175 94,1
CASTRADO
Sim 3 6,7 42 93,3 1,1(0,2-4,2) 0,55
Não 9 6,0 140 94,0
EPISÓDIOS DE BRIGAS
Sim 4 5,7 66 94,3 0,8(0,2-2,9) 0,52
Não 8 6,7 112 93,3
MORDIDO POR GATO
Sim 5 8,2 56 91,8 1,5(0,4-5,1) 0,68
Não 7 5,5 121 94,5
MORA EM APARTAMENTO
Sim 1 8,3 11 91,7 1,4(0,17-12,4) 0,53
Não 11 5,8 178 94,2
TEM ACESSO A RUA
Sim 8 6,1 124 93,9 0,9(0,2-3,1) 0,54
Não 4 6,7 56 93,3
PERIURBANO
Sim 8 12,5 56 87,5 4,7(1,3-16,4) 0,01
Não 4 2,9 133 97,1 CONTATO OUTROS GATOS
Sim 11 9,9 100 90,1 8,9(1,1-70,4) 0,01
Não 1 1,2 81 98,8
CIDADE ITB 4 5,8 65 94,2
0,95(0,2-3,2) 0,6 IOS 8 6,1 124 93,9
47
Tabela 8 - Fatores com plausibilidade biológica associados às infecções pelo FeLV em gatos da microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia.
VARIÁVEIS FeLV Odds ration
POSITIVOS NEGATIVOS CI 95% p
N % N %
IDADE
Maior ou igual a um 2 ano 2 2,2 91 97,8 0,57(0,1-3,2) 0,41
Menor que 2 ano 4 3,7 104 96,3
SEXO
Macho 4 3,7 103 96,3 1,7(0,3-9,9) 0,40
Fêmea 2 2,1 92 97,9
TEM RAÇA DEFINIDA
Sim 0 0 13 100 0 0,66
Não 6 3,2 180 96,8
CASTRADO
Sim 1 2,2 44 97,8 0,65(0,07-5,7) 0,57
Não 5 3,4 144 96,6
EPISÓDIOS DE BRIGAS
Sim 4 5,7 66 94,3 3,5(0,6-20) 0,13
Não 2 1,7 118 98,3
MORDIDO POR GATO
Sim 2 3,3 59 96,7 1,05(0,1-5,9) 0,63
Não 4 3,1 124 96,9
MORA EM APARTAMENTO
Sim 0 0 12 100 0 0,68
Não 6 3,2 183 96,8
TEM ACESSO À RUA
Sim 6 4,5 126 95,5 0 0,10
Não 0 0 60 100
PERIURBANO
Sim 2 3,1 62 96,9 1(0,19-6) 0,62
Não 4 2,9 133 97,1 VIVE COM OUTROS GATOS
Sim 4 3,6 107 96,4 1,4(0,2-8,3) 0,49
Não 2 2,4 80 97,6
CIDADE
ITB 0 0 69 100 0 0,07
IOS 6 4,5 126 95,5
48
Nenhuma das variáveis com plausibilidade biológica apresentou colinearidade
(Apêndice A), desta maneira, sendo todas incluídas no modelo preliminar da
regressão logística não-condicional para o FIV e FeLV. As Tabelas9 e
10apresentam, respectivamente, o modelo preliminar e final da regressão logística
estabelecido para o FIV, onde as variáveis “mora em região periurbana” e “tem
contato com outros gatos” foram associadas com risco à infecção. Para FeLV
nenhuma das varáveis foi significativa na regressão logística não condicional.
Tabela 9 - Modelo preliminar da regressão logística não-condicional dos fatores
associados à infecção pelo FIV em gatos da microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia.
Variáveis Chance de ocorrer IC (95%) Valor de p
Idade ≥ 2 0,84 0,20 - 3,40 0,80
É macho 1,19 0,28 – 4,96 0,80
Tem raça definida 3,68 0,20 - 65,9 0,37
É castrado 1,18 0,21 - 6,39 0,84
Já teve episódios de brigas 0,19 0,02 - 1,59 0,12
Já foi mordido por outro gato 6,05 0,81 - 45,0 0,07
Mora em apartamento 2,35 0,11 – 48,2 0,57
Tem acesso a rua 0,75 0,14 - 3,90 0,73
Mora em região periurbana 45,74 1,14 -823,04 0,01
Tem contato com outros gatos 9,7 1,14 – 83,1 0,03
Mora em Itabuna 17,09 1,08 - 270,2 0,04
p<0,02 likelihood = 22,14
Tabela 10 - Modelo final da regressão logística não-condicional dos fatores associados à infecção pelo FIV em gatos da microrregião Ilhéus-Itabuna, Bahia.
Variáveis Chance de ocorrer IC (95%) Valor de p
Mora em região periurbana 4,42 1,25-15,6 0,02
Tem contato com outros gatos 8,14 1,01-65,08 0,04
p<0,0021 likelihood= 13,11
Os resultados dos hemogramas completos dos animais FIV positivos, FeLV
positivos e negativos estão listados nas Tabelas 11.Os parâmetros hematológicos
não apresentaram diferenças estatísticas.
Tabela 11 - Valores médios e desvio padrão dos parâmetros hematológicos dos gatos FIV positivos, FeLV positivos e negativos da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA.
Parâmetros FIV (+) FELV (+) Negativos Referência
Eritrócitos (x 106/µl) 6,05±1,64a 7,40±0,87a 6,64±1,59a 5,0-10,0
Hemoglobina (g/dL) 12,09±2,77a 12,62±0,65a 12,35±2,34a 8,0-15,0
Volume Globular (%) 28,47±6,54a 32,77±4,48a 32,29±6,72a 24-45
VCM (fl) 48±8,71a 45,75±3,80a 49,78±11,2a 39-55
CHCM (%) 42,92±5,61a 37,95±4,98a 39,01±5,99a 12,5-17,5
Leucócitos (x 103/µl) 15.625±7.600a 14.800±5.412a 14.822±8.682a 5.500-19.500
Neutrófilos Bastonetes/(x 103/µl) 448,8 ± 478,8a 434,6 ± 477,7a 504,8 ± 527,4a 0-300
Neutrófilos Segmentados/(x 103/µl) 11.542,5 ±5.858a 9.569,3 ±3.872,8a 10.206,6 ±6.264,6a 2.500-12.500
Linfócitos/(x 103/µl) 3.058,0±1.935,7a 4.234,8±1.573,7a 3.561,6 ±2.379,3a 1.500 - 7.000
Eosinófilos/(x 103/µl) 220,08 ± 250,2a 59,1 ± 83,6a 97,8 ± 261,3a 0-1.500 Monócitos/(x 103/µl) 355,4 ± 200,5a 502± 318,8a 360,4± 271,7a 0-850 Basófilos/(x 103/µl) 0a 0a 7,1 ± 35,8a 0
Plaquetas/µl 269.750±198.843a 201.500±90.215a 214.174±139.559a 300.000-800.000 Valores em uma mesma linha seguidos por letras diferentes diferem (p<0,05) entre si pelo teste t student ou Mann-Whitney.
49
50
Os resultados das análises bioquímicas dos animais FIV positivos e
negativos, FeLV positivos e negativos estão listados na Tabela 12 e Tabela13,
respectivamente. Entre as análises bioquímicas, valores de bilirrubina total, direta e
indireta foram estatisticamente significativos entre os animais FIV positivos e os
animais negativos
Tabela 12 - Valores médios e desvio padrão das análises bioquímicas dos gatos FIV positivos e negativos da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA.
Parâmetros FIV (+) Negativos Referência
Uréia (mg/dL) 36,8 ± 6a 35,5 ± 10,6a 42,8-64,2
Creatinina (mg/dL) 1,4 ± 0,4a 1,3 ± 0,4a 0,8-1,8
AST (UI/L) 47 ± 17,8a 39,8 ± 18,3a 6-83
ALT (UI/L) 41,7 ± 21,5a 41,4 ± 18,2a 26-43
GGT (UI/L) 2,1 ± 1,2a 2,7 ± 1,5a 1,3-5,1
Bilirrubina Total (mg/dL) 0,8 ± 0,4a 0,52 ± 0,29b 0,1-0,6
Bilirrubina Direta (mg/dL) 0,18 ± 0,17a 0,06 ± 0,06b 0-0,3
Bilirrubina Indireta (mg/dL) 0,68 ± 0,29a 0,46 ± 0,26b 0-0,5
Proteína Total soro (g/dL) 7,81 ± 0,71a 8,51 ± 8,61a 5,4-7,8 Valores em uma mesma linha seguidos por letras diferentes diferem (p<0,05) entre si pelo do teste t student ou Mann-Whitney
Tabela 13 - Valores médios e desvio padrão das análises bioquímicas dos gatos FeLV positivos e negativos da microrregião Ilhéus-Itabuna, BA.
Parâmetros FELV(+) Negativos Referência
Uréia (mg/dL) 37,8 ± 9,2a 35,5 ± 10,6a 42,8-64,2
Creatinina (mg/dL) 1,3 ± 0,2a 1,3 ± 0,4a 0,8-1,8
AST (UI/L) 39 ± 23,3a 39,8 ± 18,3a 6-83
ALT (UI/L) 47,4 ± 20,9a 41,4 ± 18,2a 26-43
GGT (UI/L) 4,3 ± 2,9a 2,7 ± 1,5a 1,3-5,1
Bilirrubina Total (mg/dL) 0,4 ± 0,2a 0,52 ± 0,29a 0,1-0,6
Bilirrubina Direta (mg/dL) 0,03 ± 0,01a 0,06 ± 0,06a 0-0,3
Bilirrubina Indireta (mg/dL) 0,41 ± 0,23a 0,46 ± 0,26a 0-0,5
Proteína Total soro (g/dL) 6,87 ± 0,40a 8,51 ± 8,61a 5,4-7,8 Valores em uma mesma linha seguidos por letras diferentes diferem (p<0,05) entre si pelo do teste t student ou Mann-Whitney
51
6 DISCUSSÃO
Este é o primeiro estudo realizado na região Nordeste sobre a presença dos
vírus da imunodeficiência felina e da leucemia felina e as possíveis alterações
laboratoriais desencadeadas nos gatos portadores. Os resultados encontrados
evidenciaram uma baixa frequência tanto para o FIV e FeLV, corroborando com os
achados de outros estudos epidemiológicos que também utilizaram animais
domiciliados com ausência de sinais clínicos ou laboratoriais sugestivos de infecção
(RECHE JR et al., 1997; CAXITO et al., 2006), embora o tipo de população
selecionada (assintomático x sintomático) seja um importante fator, uma análise
multifatorial sempre se faz necessária, na explicação dos resultados das frequências
encontradas.
Desta forma, em populações de gatos saudáveis, mas com acesso irrestrito a
rua, pode-se esperar elevadas prevalências para os dois retrovírus (ARJONA et al.,
2000), entretanto no nosso estudo embora 66% dos gatos tivessem acesso a rua,
observou-se uma baixa frequência, o que caracteriza uma necessidade de ter o
acesso a rua associado ao contato com animais infectados, o que nos permite
sinalizar que a presença dos retrovírus esteja distribuída de maneira heterogênea
estando restrita a pequenas comunidades de gatos.
Procedimentos como a realização de testes rápidos para diagnóstico e
vacinação foram listadas por Gleich et al. (2009) como possíveis razões para as
baixas prevalências encontradas no seu estudo. Entretanto, essas duas condutas
ainda são pouco frequentes na região devido ao custo dos testes, associada à
carência de informação dos Veterinários sobre a dinâmica das infecções
estabelecidas pelos retrovírus. No Brasil apenas a vacina para FeLV está disponível.
Possivelmente a baixa frequência do FeLV observada no atual estudo esteja
mais atrelada aos diferentes cursos que a infecção pode desenvolver frente a
interação vírus-hospedeiro. Resultado que ratifica essa observação foi demonstrado
por Courchamp et al. (1997), onde algumas populações de gatos estavam livres de
FeLV, mesmo aquelas que sabidamente estavam regularmente em contato com o
vírus. Outros modelos preveem que a dinâmica do FeLV nas populações de gatos
dependam do tamanho da população hospedeira e do padrão de contatos dos gatos,
52
assim populações menores de gatos teriam mais possibilidades de extinguir esse
vírus (FROMONT et al., 1998).
Macieira et al. (2008) e Coelho et al. (2011) identificaram prevalências
elevadas utilizando populações atendidas em clínicas e hospitais veterinários.
Resultado este esperado uma vez que gatos que necessitam de atendimento
médico possivelmente apresentam doença ou sintomatologia no momento da
consulta, diferindo do presente estudo que utilizou animais assintomáticos a partir de
coletas a domicílio.
Mesmo utilizando como ferramenta de diagnóstico o nested-PCR, possuindo
este uma sensibilidade maior quando comparado ao PCR, as frequências
encontradas no presente estudo foram baixas, corroborando com os achados de
Marçola (2013) que utilizou a mesma técnica e atribuiu o baixo percentual
encontrado ao pouco contato dos gatos com o vírus, uma vez que a população felina
da sua área de estudo é pequena e restrita a bairros distantes.
Com o intuito de complementaridade, o ELISA e a nested-PCR foram
realizados em todos os animais. Fatores que poderiam alterar os resultados da
prevalência foram excluídos, como animais abaixo de seis meses que ainda podem
possuir anticorpos maternos contra o FIV, e a realização do GAPDH nas amostras
negativas garantindo a integridade do DNA extraído. Nos animais FeLV-positivos o
uso das duas técnicas além de estabelecer o diagnóstico, possibilita a detecção dos
animais com infecção latente (HERRING et al., 2001; HOFMANN-LEHMANN et al.,
2001). No presente estudo, dos 6 animais positivos para o FeLV, 3 apresentaram
resultado negativo para o p27 e positivo para a nested-PCR, sugerindo infecção
regressiva/latente nesses animais
Coinfecções entre os retrovírus não foram observadas, sugerindo focos
distintos de ambas as doença ou o que é mais provável, os animais que são FIV e
FeLV positivos simultaneamente, sucumbem mais rapidamente as alterações
provocadas pelos dois retrovírus e vem a óbito mais precocemente. Estudos
realizado por Courchamp et al. (1997) corroboram com tal afirmação, relatando que
o impacto da coinfecção entre os retrovírus é maior do que a soma dos efeitos de
cada doença examinada separadamente. Esse fato se deve ao efeito sinérgico e
potencializador da FIV e FeLV, aumentando assim a taxa de mortalidade.
Uma alta associação entre o FIV e o FeLV e as infecções toxoplásmicas foi
encontrada no nosso estudo, corroborando com os achados de Lucas et al. (1998).e
53
Akhtardanesh et al. (2010). Para tanto, esses autores sugeriram que embora os
gatos fossem domiciliados, estes possuíam livre acesso à rua e consequentemente
estavam predispostos a terem contato com outros gatos e a se alimentarem de
pequenas presas, características de manejo bem similares ao do presente estudo.
Prevalências menores foram encontradas por Bastos et al. (2014), que sugeriram o
uso de caixas sanitárias de areia como fator de proteção para a infecção.
Os fatores associados à infecção pelo FIV demonstram a influência da
procedência dos gatos e o modo de vida/manejo que é oferecido a estes. Na
literatura os fatores comumente vistos são sexo, idade, histórico de brigas e acesso
a rua, sendo estes relacionados à transmissão do vírus pela mordida (BURKAHARD,
DEAN, 2003). No nosso estudo o contato com outros gatos foi um fato associado a
infecção, não sendo relatados pelos proprietários comportamentos agressivos,
entretanto é possível que a variável presença de briga possa ter sido negligenciada
durante a entrevista, uma vez que pequenas lesões podem não ser notadas. Similar
ao observado por Lara et al. (2008), os animais abrigados não possuíam
comportamento agressivo, entretanto seus proprietários notavam sinais de mordida
quando retornavam para casa. No entanto, estudo de Addie et al. (2000) relata a
transmissão do FIV com regularidade sem a presença de agressões entre os gatos,
sugerindo que o contato amigável entre gatos positivos e gatos susceptíveis e o
compartilhamento de vasilhas seja também suficiente para a transmissão do vírus.
Possivelmente a presença do FIV está distribuída de maneira irregular nas
cidades do estudo, concentrando-se nas áreas periurbanas. O acesso à rua (nas
áreas urbanas e periurbanas) são similares, indicando que a presença do vírus em
maior ou menor quantidade no local estudado é determinante nos valores de
prevalência a serem encontrados. A presença de todos os animais positivos abaixo
de dois anos de idade residindo na região periurbana também reforça esta
observação, uma vez que o tempo de exposição desses animais a outros gatos
possivelmente infectados foi menor. O aspecto sociocultural dos proprietários
inseridos nessa região também devem ser levados em consideração, possivelmente
não são oferecidos a esses animais aporte nutricional e manejo sanitário adequado,
favorecendo a disseminação dessa e de outras doenças.
Devido ao número reduzido de gatos infectados pelo FeLV não foi possível a
realização do modelo de regressão logística, porém através do qui-quadrado
podemos verificar tendências que estão de acordo com o descrito na literatura.
54
Todos os animais FeLV-positivos não moravam em apartamento e tinha acesso a
rua, possibilitando o contato destes com gatos infectados. Estudo que corrobora com
estes resultados listam acesso ao exterior, vivem ou tem contato com outros gatos
como fatores associados à infecção deste retrovírus (ALMEIDA et al., 2012).
A tendência observada nas infecções pelo FIV, de se mostrarem mais
prevalentes na região periurbana não foi verificada no FeLV, a ocorrência de
positividade foi similar em ambas as regiões. Diante de tal fato, sugere-se uma
dinâmica na qual a região periurbana deva apresentar um número maior de
infecções precoce, e consequentemente mais óbitos, observação essa baseada no
fato de todos os animais positivos desta região terem até 1 ano de idade; e na área
urbana, provavelmente deva haver um menor número de animais infectados, porem
com uma expectativa de vida maior para os animais positivos.
Os valores mais elevados da bilirrubina total e indireta podem estar
associados a uma hemólise intravascular devido a ligação de anticorpos e/ou
complemento a superfície dos eritrócitos como proposto por Tasker et al. (2010),
entretanto esta condição não foi associada a um quadro de anemia nos animais
(embora os animais FIV positivos tenham valores de hematócrito mais baixo, mas
dentro dos valores de referência), isto demonstra um quadro subclínico da infecção,
pois além da hemólise intravascular há também o efeito supressivo sobre as células
precursoras na medula, induzindo uma eritropoiese ineficaz, levando a quadros de
anemia arregenerativa (LINENBERGER; ABKOWITZ, 1995; HOFMANN-LEHMANN
et al., 1997). Relatos da presença de anemia em gatos FeLV-positivos estão
relacionados principalmente a infecções pelo subtipo C, e indiretamente por
infecções secundárias e neoplasias (GLEICH; HARTMANN, 2009). Contrário ao
descrito na literatura, nenhum gato apresentou hematócrito abaixo de 24%. A
ausência de anemia pode estar relacionada ao estágio de infecção apresentado por
esses animais no momento da coleta, uma vez que nas infecções
regressiva/latentes estes tendem a ter sofrido uma menor ação do vírus. A
caracterização dos subtipos não foi realizada no presente estudo, mas
possivelmente os subtipos infectantes não devam ser indutores de anemia
55
7 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos durante o estudo permitem concluir que:
- Há a presença dos vírus da imunodeficiência felina e leucemia felinas na
microrregião Ilhéus-Itabuna;
- O uso das técnicas de Nested-PCR e ELISA possibilitou a identificação de animais
FeLV-positivos em diferentes momentos de infecção;
- Há elevadacoinfecção entre os animais FIV ou FeLV positivos e Toxoplasma
gondiisugere um ponto comum de infecção;
- A distinta distribuição da infecção pela FIV nas regiões urbana e periurbana
demonstra uma distribuição heterogênea deste vírus;
- Discretas alterações laboratoriais encontradas nos animais infectados pelo FIV,
demonstram a dificuldade encontrada no estabelecimento do diagnóstico no período
assintomático da doença.
56
REFERÊNCIAS
ADDIE, D. D.; DENNIS, J. M.; TOTH, S.; CALLANAN, J. J.; REID, S.; JARRETT, O. Long-term impact on a closed household of pet cats of natural infection with feline coronavirus, feline leukaemia virus and feline immunodeficiency virus. Veterinary Record, v. 146, p.419-424, 2000. AKHTARDANESH, B.; ZIAALI, N.; SHARIFI, H.; REZAEI, S. Feline immunodeficiency virus, feline leukemia virus and Toxoplasma gondii in stray and household cats in Kerman–Iran: Seroprevalence and correlation with clinical and laboratory findings. Research in Veterinary Science, v. 89, p. 306-310, 2010. ALMEIDA, N. R.; DANELLI, M. G. M.; SILVA, L. H. P.; HAGIWARA, M.K.; MAZUR, C. Prevalence of feline leukemia viru infection in domestic cats in Rio de Janeiro. Journal of Feline Medicine and Surgery, v. 14, p. 583-586, 2012. AQUINO, L. C.Ocorrência do Vírus da Leucemia Felina e suas alterações laboratoriais. 2012. 93f. Dissertação (Mestrado em Saúde Animal) - Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, Distrito Federal, 2012. ARJONA, A.; ESCOLAR, E.; SOTO, I.; BARQUERO, N.; MARTIN, D.; LUCIA-GOMES, E. Seroepidemiological survey of felineleukemia vírus in Madrid and correlation with some clinical aspects. Journal of Clinical Microbiology, v.38, n.9, p.3448-3449, 2000. ARJONA, A.; BARQUERO, N.; DOME’NECH, A.; TEJERIZO, G.; COLLADO, V. M.; TOURAL, C.; MARTIN, D.; GOMEZ-LUCIA, E. Evaluation of a novel nested PCR for the routine diagnosis of feline leukemia vírus (FeLV) and feline immunodeficiency vírus (FIV). Journal of Feline Medicine and Surgery, v. 9, p. 14-22, 2007. BANDE, F.; ARSHAD, S. S.; HASSAN, L.; ZAKARIA, Z.; SAPIAN, N. A.; RAHMAN, N. A.; ALAZAWY, A. Prevalence and risk factors of feline leukaemia virus and feline immunodeficiency virus in peninsular Malaysia. BMC Veterinary Research, v. 8, p. 1-6, 2012. BARDSHIRI, B.; RAFIE, S. M.; SHAPOURI, M. R. S. A.; KHAKI, Z.; AKHTARDANES, B; KOMEILIAN, A.A case-controlled study of FeLV infected cats in Tehran, Iran, confirmed by immunochromatography and RT-PCR and correlation with clinical and hematological findings. Slovenian Veterinary Research, v. 48, p. 57-64, 2011.
57
BASTOS, B. F.; BRENER, B.; GERSHONY, L.; WILLI, L.; LABARTHE, N.; PEREIRA, C.; MENDES-DE-ALMEIDA, F. Seroprevalence of Toxoplasma gondii (Nicole & Manceaux, 1909) and retroviral status of client-owned pet cats (Felis catus, Linnaeus, 1758) in Rio de Janeiro, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 56, p. 201-203, 2014. BEEBE, A. M..; DUA, N.; FAITH, T. G.; MOORE, P. F.; PEDERSEN,N. C. Primary Stage of Feline Immunodeficiency Virus Infection: Viral Dissemination and Cellular Targets. Journal of Virology, v. 68, p. 3080-3091, 1994. BENDINELLI, M.; PISTELLO, M.; LOMBARD, S.; POLI, A.; GARZELLI, C.; MATTEUCCI, D.; CECCHERINI-NELLI, L.; MALVALDI, G.; TOZZINI, F. Feline immunodeficiency virus: an interesting model for AIDS studies and an important cat pathogen. Clinical Microbiology Reviews, v. 8, n. 1, p. 87-112, 1995. BIRKENHEUER, A. J.; LEVY, M. G.; BREITSCHWERDT, E. B. Development and Evaluation of a Seminested PCR for Detection and Differentiation of Babesia gibsoni(Asian Genotype) and B. canis DNA in Canine Blood Samples. Journal of Clinical Microbiology, v. 41,p. 4172–4177, 2003. BURKHARD, M. J.; DEAN, D. A. Transmission and Immunopathogenesis of FIV in Cats as a Model for HIV. Current HIV Research, v. 1, p.15-29, 2003. CALLANAN, J. J.; THOMSON H.; TOTH, S. R.; O’NEIL, B.; LAWRENCE, C. E; WILLETT, B.; JARRETT, O. Clinical and pathological findings in feline immunodeficiency virus experimental infection. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.35, p. 3-13, 1992. CALLANAN, J. J.; JONES, B. A.; IRVINE, J.; WILLETT, B.J.;MCCANDLISH, I.A.; JARRETT, O. Histologic classification and immunophenotype of lymphosarcomas in catswith naturally and experimentally acquired feline immunodeficiency virus infections. Veterinary Pathology, v. 33, p. 264–72, 1996. CAXITO, F.A.;COELHO, F.M.; OLIVEIRA, M.E.;RESENDE, M. Phylogenetic analysis of feline immunodeficiency virus strains from State of Minas Gerais, Brazil. Arquivo Brasileiro Medicina Veterinária Zootecnia, v. 58, n.6, p.1222-1225, 2006. COELHO, F. M.; MAIA, M. Q.; LUPPI, M. M.; COSTA, E. A.;LUIZ, A. P. M. F.; RIBEIRO, N. A. M.R.Q. BOMFIM, F.G. FONSECA, M. RESENDE. Ocorrência do vírus da leucemia felina em Felis cattus em Belo Horizonte. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.63, p.778-783, 2011.
58
COLLADO, V. M.; DOMENECH, A.; MIRÓ, G.; MARTIN, S.; ESCOLAR, E.; GOMEZ-LUCIA, E. Epidemiological Aspects and Clinicopathological Findings in Cats Naturally Infected with Feline Leukemia Virus (FeLV) and/or Feline Immunodeficiency Virus (FIV).Open Journal of Veterinary Medicine, v. 2, p. 13-20, 2012. COURCHAMP, F.; SUPPO, C.; FROMONT, E.; BOULOX, C. Dynamics of two feline retroviruses (FIV and FeLV) within one population of cats. Proceedings of the Royal of Society B, v. 264, p.785-794, 1997. COURCHAMP, F.; YOCCOZ, N. G.; ARTOIS, M.; PONTIER, D.At-risk individuals in Feline Immunodeficiency Virus epidemiology: evidence from a multivariate approach in natural population of domestic cats (Felis catus).Epidemiology and Infection, v. 121, p. 227-236, 1998. DEAN, G. A.; REUBEL, G. H.; MOORE, P. F.; PDERSEN, N. C. Proviral burden and infection kinetics of feline imunodeficiency virus in lymphocyte subsets of blood and lymph node. Journal of Virology, v.70, p.5165-5169, 1996. DOMÉNECH, A.; MIRÓ, G.; COLLADO, V. M.; BALLESTEROS, N.; SANJOSÉ, L.; ESCOLARB, E.; MARTIN, S.B.; GOMEZ-LUCIA, E. Use of recombinant interferon omega in feline retrovirosis: From theory to practice. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.143, p. 301– 306, 2011. DONAHUE, P. R.; QUACKENBUSH, S. L.; GALLO, M. V.; DENORONHA, C. M. C.; OVERBAUGH, J.; HOOVER, E. A.; MULLINS, J. I. Viral Genetic Determinants of T-Cell Killing and Immunodeficiency Disease Induction by the Feline Leukemia Virus FeLV-FAIDS. Journal of Virology, v.65, p. 4461-4469, 1991. DUARTE, A.; TAVARES, L. Phylogenetic analysis of Portuguese Feline Immunodeficiency Virus sequences reveals high genetic diversity. Veterinary Microbiology, v. 114, p. 25–33, 2006. DUBEY, J. P. The History of Toxoplasma gondii—The First 100 Years. The Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 55, n. 6, p. 467–475, 2008. DUNHAM, S. P.; GRAHAM, E. Retroviral Infections of Small Animals. Veterinary Clinics Small Animal Practice, v.38, p. 879-901, 2008. FILONI, C.; CATÃO-DIAS, J.L.; CATTORI, V.; WILLI, B.; MELI, M.L.; CORRÊA, S.H.; MARQUES, M.C.; ADANIA, C.H.; SILVA, J.C.; MARVULO, M.F.; FERREIRA NETO, J.S.; DURIGON, E.L.; DE CARVALHO, V.M.; COUTINHO, S.D.; LUTZ, H.; HOFMANN-LEHMANN, R. Surveillance using serological and molecular methods for
59
the detection of infectious agents in captive Brazilian neotropic and exotic felids. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, v. 24, 166–173, 2012. FROMONT, E.;ARTOIS, M.; LANGLAIS, M.; COURCHAMP, F.; PONTIER, D. Modelling the Feline Leukemia Virus (FeLV) in Natural Populations of Cats (Felis catus). Theoretical Population Biology, v. 52, p. 60-70, 1997. GIL, S.; LEAL, R. O.;DUARTE, A.; MCGAHIE, D.; SEPÚLVEDA, N.; SIBORRO, I.; CRAVO, J.; CARTAXEIRO, C.; TAVARES, L. M. Relevance of feline interferon omega for clinical improvement and reduction of concurrent viral excretion in retrovirus infected cats from a rescue shelter. Research in Veterinary Science, v. 94, p. 753–763, 2013. GLEICH, S.; HARTMANN, K. Hematology and serum biochemistry of feline immunodeficiency virus-infected and feline leukemia virus-infected cats. Journal of Veterinary Internal Medicine, v. 23, p. 552–558, 2009. GLEICH, S. E.; KRIEGER, S.; HARTMANN, K. Prevalence of feline immunodeficiency virus and feline leukaemia virus among client-owned cats and risk factors for infection in Germany.Journal Feline Medicine and Surgery, v.11, p.985–992, 2009. GOMES-KELLER, M. A.; GONCZI, E.; TANDON, R.; RIONDATO, F.; HOFMANN-LEHMANN,R.; MELI, M. L.; LUTZ, H. Detection of Feline Leukemia Virus RNA in Saliva from Naturally Infected Cats and Correlation of PCR Results with Those of Current Diagnostic Methods. Journal of Clinical Microbiology, v. 44, p. 916-922, 2006. GOMES-KELLER, M.A.; GONCZI, E.; GRENACHER, B.; TANDON, R.; HOFMAN-LEHMANN, R.; LUTZ, H. Fecal shedding of infectious feline leukemia virus and its nucleic acids: A transmission potential. Veterinary Microbiology, v. 134, p. 208–217, 2009. GÓMEZ, N. V.; FONTANALS, A.; CASTILLO, V.; GISBERT, M. A.; SURANITI, A.; MIRA, G.; PISANO, P. B. Evaluation of Different Antiretroviral Drug Protocols on Naturally Infected Feline Immunodeficiency Virus (FIV) Cats in the late Phase of the Asymptomatic Stage of Infection. Viruses, v. 4, p. 924-939, 2012. GOTO, Y.; NISHIMURA, Y.; BABA, K.; MIZUNO, T.; ENDO, Y.; MASUDA, K.; OHNO, K.; TSUJIMOTO, H. Association of plasma viral RNA load with prognosis in cats naturally infected with feline immunodeficiency virus. Journal of Virology, n.76, p.10079-10083, 2002.
60
GREGGS, W. M.; CLOUSER, C. L.; PATTERSON, S. E.; MANSKY, L. M. Broadening the use of antiretroviral therapy: the case for feline leukemia vírus. Therapeutics and Clinical Risk Management, v. 7, p. 115-122, 2011. GUIMARÃES, A. M. S. Detecção de Micoplasmas, Bartonelas e Vírus da Leucemia Felina em pequenos felídeos neotropicais mantidos em cativeiro no refúgio Bela Vista, Foz do Iguaçu. 2008. 129f. Dissertação (Mestrado em Epidemiologia Experimental e Aplicada às Zoonoses) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. HARDY JR, W. D.; HESS, P. W.; MACEWEN, E. G.; MCCLELLAND, A. J.; ZUCKERMAN, E. E.; ESSEX, M.; COTTER, S. M.; JARRETT, O. Biology of Feline Leukemia Virus in the Natural Environment. Cancer Research, v. 36, p. 582-588, 1976. HARTMANN, K. Clinical aspects of feline immunodeficiency and feline leukemia virus Infection. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 143, p.190– 201, 2011. HARVEY, J. W. Atlas of veterinary hematology: blood and bone marrow of domestic animals. Philadelphia: W. B. Saunders Company, 2001. HAYWARD, J.; RODRIGO, A.G. Molecular epidemiology of feline immunodeficiency virus in the domestic cat. Veterinary Immunology and immunopathology, v.134, p. 68-74, 2010. HERRING, E. S.; TROY, G. C.; TOTH, T. E.; FORRESTER, S. D.; WEIGT2, L. A.; HERRING, I. P. Detection of feline leukaemia virus in blood and bone marrow of cats with varying suspicion of latente infection. Journal of Feline Medicine and Surgery, v. 3, p. 133–141, 2001. HILL, D.; DUBEY, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clinical Microbiology and Infectious Diseases, v. 8, p. 634-640, 2002. HOFMANN-LEHMANN, R.; HOLZNAGEL, E.; OSSENT, P.; LUTZ, H. Parameters of Disease Progression in Long-Term Experimental Feline Retrovirus (Feline Immunodeficiency Virus and Feline Leukemia Virus) Infections: Hematology, Clinical Chemistry, and Lymphocyte Subsets. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, v.4, p. 33–42, 1997.
61
HOFMANN-LEHMANN, R.; HUDER, J. B.; GRUBER, S.; BORETTI, B.; SIGRIST, B.; LUTZ, H. Feline leukaemia provirus load during the course of experimental infection and in naturally infected cats. Journal of General Virology, v. 82, p. 1589–1596, 2001. HOFMANN-LEHMANN, R.; CATTORI, V.; TANDON, R.; BORETTI, F. R.; MELI , M. L.; RIOND; B.; LUTZ, H. How molecular methods change our views of FeLV infection and vaccination. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.123, p.119-123, 2008. HOHDATSU, T; MOTOKAWA, K.; USAMI, M.; AMIOKA, M.; OKADA, S.; KOYAMA, H. Genetic subtyping and epidemiological study of feline immunodeficiency virus by nested polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis ofthegag gene. Journal of Virological Methods, v. 70, p. 107–111, 1998. HOSIE, M. J.; ADDIE, D.; BELAK, S.; BOUCRAUT-BARALON, C.; EGBERINK, H.; FRYMUS, T.; GRUFFYDD-JONES, T.; HARTMANN, K.; LORET, A.; LUTZ, H.; MARSILIO, F.; PENNISI, M. G.; RADFORD, A. D.; THIRY, E.; TRUYEN, U.; HORZINEK, M. C. Feline Immunodeficiency: ABCD guidelines on prevention and management. Journal of Feline Medicine and Surgery, v. 11, p. 575-584, 2009. IBGE, Censo 2010.Disponível em: <http://www.ibge.gov.br/estadosat/perfil.php?sigla=ba>. Acesso em: 5 jul. 2014. ISHIDA, T.; WASHIZU, T.; TORIYABE, K.; MOTOYOSHI, S.; TOMODA, I.; PEDERSEN, N. C. Feline immunodeficiency virus infection in cats of Japan. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 194, p. 221–225, 1989. ISHIDA, T.; TANIGUCHI, A.; MATSUMURA, S.; WASHIZU, T.; TOMODA, I. Long-term clinical observations on feline immunodeficiency virus infected asymptomatic carriers. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 35, p. 15-22, 1992. JAIN, N. C. Essentials of veterinary hematology. 5.ed. Philadelphia: Lea &Febiger, 1993. JARRETT, W. F.; CRAWFORD, E. M.; MARTIN, W. B.; DAVIE, F. A virus-like particle associated with leukemia (lymphosarcoma). Nature, v. 202, p. 567-569, 1964. JARRETT, O. Strategies of retrovírus survival in the cat. Veterinary Microbiology, v.69, p. 99-107, 1999.
62
JORGE,J. J.; FERREIRA, F.; HAGIWARA, M. K. Risk factors for feline leukemia virus (FeLV) infection in cats in São Paulo, Brazil. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 48, p. 392-398, 2011. KAKINUMA, S.; MOTOKAWA, K.; HOHDATSU, T.; YAMAMOTO, J.K.; KOYAMA, H., HASHIMOTO, H. Nucleotide sequence of feline immunodeficiency virus: Classification of Japanese isolates into two subtypes which are distinct from non-Japanese subtype. Journal of Virology, v. 69, p. 3639–3646, 1995. KANEKO, J.J., HARVEY, J.W., BRUSS, M. L. Clinical Biochemistry of Domestic Animals. San Diego: Academic Press, 1997. LAFRADO, L. J.; LEWIS, M. G.; MATHES, L. E.; OLSEN, R. G. Suppression of in vitro Neutrophil Function by Feline Leukaemia Virus(FeLV) and Purified FeLV-pI5E. Journalof General Virology, v. 68, p. 507-513, 1987. LARA, V. M.; TANIWAKI, S. A.; ARAÚJO JR. J. P. Caracterização filogenética de amostras do vírus da imunodeficiência felina (FIV) do Estado de São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 27, p.467-470, 2007. LARA, V. M.; TANIWAKIII, S. A.; ARAÚJO JÚNIOR, J. P. Occurrence of feline immunodeficiency vírus infection in cats. Ciência Rural, v. 38, p. 2245-2249, 2008. LAURING, A. S.; ANDERSON, M. M.; OVERBAUGH, J. Specificity in Receptor Usage by T-Cell-Tropic Feline Leukemia Viruses: Implications for the In Vivo Tropism of Immunodeficiency-Inducing Variants. Journal of Virology, v. 75, p. 8888-8898, 2001. LEVY, J. K.; SCOTT, H. M.; LACHTARA, J. L.; CRAWFORD, P. C. Seroprevalence of feline leukemia virus and feline immunodeficiency virus infection among cats in North America and risk factors for seropositivity. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 228, p. 371-376, 2006. LEVY, J.; CRAWFORD, C.; HARTMANN, K.; HOFMANN-LEHMANN, R.; LITTLE, S.; SUNDAHL, E.; THAYER, V. 2008 American Association of Feline Practitioners’ feline retrovírus management guidelines.Journal of Feline Medicine and Surgery, v.10, p. 300-316, 2008. LINENBERGER, M. L.; ABKOWITZ, J. L. Haematological disorders associated with feline retrovirus infections. Baillibre's Clinical Haematology, v. 8, p. 73-111, 1995.
63
LITTLE, S.; BIENZLE, S.; CARIOTO, L.; CHISHOLM, H.; O’BRIEN, E.; SCHERK, M. Feline leukemia virus and feline immunodeficiency virus in Canada: Recommendations for testing and management. Canadian Veterinary Journal, v. 52, p. 849–855, 2011. LUCAS, S. R. R.; HAGIWARA, M. K.; RECHE JR, A.; GERMANO, P. M. L. Ocorrência de anticorpos antitoxoplasma em gatos infectados naturalmente pelo vírus da imunodeficiência dos felinos. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 35, p. 41-45, 1998 LUTZ, H.; ADDIE, D.; BELAK, S.; BOUCRAUT-BARALON, C.; EGBERINK, H.; FRYMUS, T.; GRUFFYDD-JONES, T.; HARTMANN, K.; HOSIE, M. J.; LORET, A.; MARSILIO, F.; PENNISI, M. G.; RADFORD, A. D.; THIRY, E.; TRUYEN, U.; HORZINEK, M. C. Feline leukaemia. ABCD guidelines on prevention and management. Journal of Feline Medicine and Surgery, v. 11, p. 565-574, 2009. LUTZ, H.; JARRETT, O. Detection of Feline Leukemia Virus Infection in Saliva. Journal of Clinical Microbiology, v. 25, p. 827-831, 1987. MACIEIRA, D. B.; MENEZES, R. C.; DAMICO, C. B.; ALMOSNY, N. R. P.; MCLANE, H. L.; DAGGY, J. K.; MESSICK, J. B. Prevalence and risk factors for hemoplasmas in domestic cats naturally infected with feline immunodeficiency virus and/or feline leucemia virus in Rio de Janeiro e Brazil. Journal of Feline Medicine and Surgery, v. 10, p. 120-129, 2008. MAGDEN, E.; QUACKENBUSH, S. L.; VANDEWOUDE, S. FIV associated neoplasms: A mini-review. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 143, p. 227– 234, 2011. MAJOR, A.; CATTORI, V.; BOENZLI, E.; RIOND, B.; OSSENT P.; MELI, M. L.; HOFMANN-LEHMANN, R.; LUTZ, H. Exposure of cats to low doses of FeLV: seroconversion as the sole parameter of infection. Veterinary Research, v. 41, p. 2-10, 2010. MARÇOLA, T. G. Estudo da avaliação laboratorial e ocorrência da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina e co-infecções em felinos domésticos de diferentes localidades do Distrito Federal. 2011. 80f. Dissertação (Mestrado em Saúde Animal)- Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2011.
64
MARÇOLA, T. G.; GOMES, C. P. C.; SILVA, P. A.; FERNANDES, G. R.; PALUDO, G. R.; PEREIRA, R. W. Identification of a novel subtype of feline immunodeficiency vírus in a population of naturally infected felines in the Brazilian Federal District. Virus Genes, v. 46, p. 546–550, 2013. MARTINS, A. N.; MEDEIROS, S. O.; SIMONETTI, J. O.; SCHATZMAYR, H. G.; TANURI, A.; BRINDEIRO, R. M. Phylogenetic and Genetic Analysis of Feline Immunodeficiency Virus gag, pol, and env Genes from Domestic Cats Undergoing Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor Treatment or Treatment-Naıve Cats in Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Virology, v. 82, p. 7863–7874, 2008. MARUYAMA, S.; KABEYA, H.; NAKAO, R.; TANAKA, S.; SAKAI, T.; XUAN, X.; KATSUBE, Y.; MIKAMI, T. Seroprevalence of Bartonella henselae, Toxoplasma gondii, FIV and FeLV infections in domestic cats in Japan. Microbiology Immunology 2003; 47: 147e53. MATTEUCCI, D.; BALDINOTTI, F.; MAZZEITI, P.; PISTELLO, F.; BANDECCHI, P.; GHILARDUCCI, R.; PPOLI, A.; TOZZINI, F.; BENDINELLI, M. Detection of Feline Immunodeficiency Virus in Saliva and Plasma by Cultivation and Polymerase Chain Reaction. Journal of Clinical Microbiology, v. 31, p. 494-501, 1993. MEDEIROS, S. O. L.; MARTINS, A. N.; DIAS, C. G. A.; TANURI, A.; BRINDEIRO, R. M. Natural transmission of feline immunodeficiency virus from infected queen to kitten. Virology Journal, v. 99, p. 2-7, 2012. MIYAZAWA, T.; JARRETT, O. Feline leukaemia virus proviral DNA detected by polymerase chain reaction in antigenaemic but non-viraemic (discordant) cats. Archives Virology, v. 142, p. 323-332, 1997. MORTOLA, E.; OLIVA, G.; RISSO, M.; PECORARO, M.; VENTURINI, M. C. Feline immunodeficiency virus infection: a comparative study of different diagnostic techniques. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.56, p.13-18, 2004. MURPHY, B.; VAPNIARSKY, N.; HILLMAN, C.; CASTILLO, D.; SAMANTHA MCDONNEL, S.; MOORE, P.; LUCIW, P. A.; SPARGER, E. E. FIV establishes a latent infection in feline peripheral blood CD4+ T lymphocytes in vivo during the asymptomatic phase of infection. Retrovirology, v. 9, p. 3-17, 2012. O’NEIL, L. L.; BURKHARD, M. J.; HOOVER, E. A. Frequent Perinatal Transmission of Feline Immunodeficiency Virus by Chronically Infected Cats. Journal of Virology, v. 70, p. 2894–2901, 1996.
65
OVERBAUGH, J.; BANGHAM, C.R.M. Selection forces and constraints onretroviral sequence variation. Science, v. 292, p. 1106, 2001. PECORATO, M. R.; TOMANAGA, K.; MIYAZAWA, T.; KAWAGUCHI, Y.; SUGITA, S.; TOHYA, Y.; KAI, C.; ETCHEVERRIGARAY, M. E.; MIKAME, T. Genetic diversity of Argentine isolates of feline immunodeficiency vírus. Journal of General Virology, v. 77, p. 2031-2035, 1996. PEDERSEN, N. C.; HO, E. W.; BROWN, M. L.; YAMAMOTO, J. K. Isolation of a T-lymphotropic vírus from domestic cats with an immunodeficiency-like syndrome. Science, v. 235, p. 790-793, 1987. PEDERSEN, N. C.; YAMAMOTO, J. K.; ISHIDA, T.; HANSEN, H. Feline Immunodeficiency. Virus Infection. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 21, p. 111-129, 1989. PHILLIPS, T. R.; PROPERO-GARCIA, O.; PUAOI, D. L.; LERNER, D. L.; FOX, H. S.; OLMSTED, R. A. Neurological abnormalities associated with feline immunodeficiency virus infection. Journal of General Virology, v. 75, p.979-987, 1994. PINTO, L. D.; ARAUJO, F. A. P.; STOBB, N. S.; MARQUES, M. S. T. Soroepidemiologia de Toxoplasma gondii em gatos domiciliados atendidos em clínicas particulares de Porto Alegre, RS, Brasil. Ciência Rural, Santa Maria, v.39, p.2464-2469, nov. 2009. RECHE JR, A.; HAGIWARA, M. K.; LUCAS, S.R. R. Clinical study of acquired immunodeficiency syndrome in domestic cats in São Paulo. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 34, p. 152-155, 1997. ROGERS, A. B.; HOOVER, E. Fetal Feline Immunodeficiency Virus Is Prevalent and Occult. The Journal of Infectious Diseases, v. 186, p. 895–904, 2002. ROJKO, J. L.; OLSEN, R. G.The immmunobiology of the feline leukemia vírus.Veterinary Immunology and lmmunopathology, v. 6, p. 107—165, 1984. ROSA, L. D.; MOURA, A. B.; TREVISANI, N.; MEDEIROS, A. P.; SARTOR, A. A.; SOUZA, A. P.; BELLATO, V. Anticorpos contra Toxoplasma gondii em gatos domiciliados no município de Lages, Santa Catarina, Brasil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, Jaboticabal, v. 19, n. 4, p. 268-269, 2010.
66
SELLON, R. K.; JORDAN, H. L.; KENNEDY-STOSKOPF, S.; TOMPKINS, M. B.; TOMPKINS, W. A. F. Feline Immunodeficiency Virus Can Be Experimentally Transmitted via Milk during Acute Maternal Infection. Journal of Virology, v. 68, p. 3380-3385, 1994. SHELTON, G. H.; LINENBERGER, M. L.; GRANT, C. K.; ABKOWITZ, J. L. Hematologic Manifestations of Feline Immunodeficiency Virus Infection. Blood, v. 76, p. 1104-1109, 1990. SILVA, F. S.; CASTRO, C. C.; FINGER, P. F.; SILVA, D. S. TANIWAKI, S. A.; ULLMANN, L. S.; FISCHER, G.; VARGAS, G. D.; LIMA, M.; ARAÚJO , J. P.; HUBNER, S. O. Ocorrência do subtipo B do vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Arquivo Brasileiro Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 66, p. 1-6, 2014. SOBRINHO, L. S. V.; VIDES, J. P.; BRAGA, E. T.; GOMES, A. A. D.; ROSSI, C. N.; MARCONDES, M. Sorofrequência de infecção pelo vírus da imunodeficiência felina e vírus da leucemia felina em gatos do município de Araçatuba, São Paulo. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 48, p. 378-383, 2011. SODORA, D. L.; SHPAER, E. G.; KITCHELL, B. E.; DOW, S. W.; HOOVER, E. A.; MULLINS, J. I. Identification of three feline immunodeficiency virus (FIV) env gene subtypes and comparison of the FIV and human immunodeficiency vírus type 1 evolutionary patterns. Journal of Virology, v. 68, p. 2230-2238, 1994. SPADA, E.; PROVERBIO, D.; PEPA, A. D.; PEREGO, R.; BAGGIANI, L.; DEGIORGI, G. B.; DOMENICHINI, G.; FERRO, E.; CREMONESI, F. Seroprevalence of feline immunodeficiency virus, feline leukaemia virus and Toxoplasma gondii in stray cat colonies in northern Italy and correlation with clinical and laboratory data. Journal of Feline Medicine and Surgery, v. 14, p. 369–377, 2012. STEWART, H.; ADEMA, K. W.; MCMONAGLE, E. L.; HOSIE, M. J.; WILLETT, J. Identification of novel subgroup A variants with enhanced receptor binding and replicative capacity in primary isolates of anaemogenic strains of feline leukaemiavírus. Retrovirology, v. 9, p. 2-15, 2012. STUTZER, B.; MULLER, F.; MAJZOUB, M.; LUTZ, H.; GREENE, C. E.; HERMANNS, W.; HARTMANN, K Role of Latent Feline Leukemia Virus Infection in Nonregenerative Cytopenias of Cats. Journal of Veterinary Internal Medicine, p. 1-6, 2009.
67
TALBOTT, R. L.; SPARGER, E. E.; LOVELACE, K. M.; FITCH, W.M.; PEDERSEN, N. C.; LUCIW, P. A.; ELDER, J. H. Nucleotide sequence and genomic organization of feline immunodeficiency virus. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.86, p. 5743-5747, 1989. TASKER, S; MURRAY, J. K.; KNOWLES, T. G.; DAY, M. J. Coombs’, haemoplasma and retrovírus testing in feline anaemia. Journal of Small Animal Practice, v. 51, p. 192–199, 2010. TEIXEIRA, B. M.; RAJÃO, D. S.; HADDAD, J. P. A.; LEITE, R. C.; REIS, J. K. P. Ocorrência do vírus da imunodeficiência felina e do vírus da leucemia felina em gatos domésticos mantidos em abrigos no município de Belo Horizonte. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.59, p.939-942, 2007. TEIXEIRA, B. M.; LOGAN, N.; SAMMAN, A.; MIYASHIRO, S. I.; BRANDÃO, P. E.; WILLETT, B. J.; HOSIE, M. J.; HAGIWARA, M. K. Isolation and partial characterization of Brazilian samples of feline immunodeficiency vírus. Virus Research, v. 160, p. 59–65, 2011. TORRES, A.N.; MATHIASON, C.K.; HOOVER, E.A. Re-examination of feline leukemia vírus: host relationhips using real-time PCR. Virology, v.332, p.272-283, 2005. TORTEN, M.; FRANCHINI, M.; BARLOUGH, J. E.; GEORGE, J. W.; MOZES, E.; LUTZ, H.; PEDERSEN, N. C. Progressive Immune Dysfunction in Cats Experimentally Infected with Feline Immunodeficiency Virus. Journal of Virology, v. 65, p. 2225-2230, 1991. TOZZINI, F.; MAITEUCCI, D.; BANDECCHI, P.; BALDINOTTI, F.; SIEBELINK, K.; OSTERHAUS, A.; BENDINELLI, M. Neutralizing Antibodies in Cats Infected with Feline Immunodeficiency Virus. Journal of Clinical Microbiology, v.31, p. 1626-1629, 1993. WILLETT, B. J.; HOSIE, M. J. Feline leukaemia virus: Half a century since its Discovery. The Veterinary Journal, v.195, p.16-23, 2013. WITT, C.J.; MOENCH, T.R.; GITTELSOHN, A.M.; BISHOP, B.D.; CHILDS, J.E. Epidemiologic observations on feline immunodeficiency virus and Toxoplasma gondii coinfection in cats in Baltimore, Md. Journalof the American Veterinary Medical Association, v.194, n.2, p.229- 33, 1989.
68
ZANUTTO, M. S.; FROES, T. R.; TEIXEIRA, A. L.; HAGIWARA, M. K. Características clínicas da fase aguda da infecção experimental de felinos pelo vírus da imunodeficiência felina. Pesquisa Veterinária Brasileira, v.31, p.255-260, 2011.
69
ANEXOS
Anexo A – Entrevista estruturada para determinação dos fatores associados às
infecções pelos vírus da imunodeficiência felina e leucemia felina
Registro: ----------- - -------------
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Nome do animal: ____________________sexo:_____ data:_________________
Idade: ___________raça: _______________________ castrado: sim___não____
Endereço:___________________________________________________________
Bairro:_______________________cidade: ________________
CEP:_____________
1- O animal apresenta histórico de briga: sim_______ não ________
2- O animal foi mordido ou mordeu outro gato: sim ______ não _______
3- O animal já recebeu alguma transfusão de sangue ou derivado em sua vida até o
momento da coleta para o presente estudo sim ______ não _______
4- Presença de ectoparasita: pulgas ______miiase _______
Carrapatos _____ sarna/ácaros ________
Piolho _____ Lynxacarusradosvsky _____
Outros _________________
5- O animal mora em : casa _______ apartamento ______ sítio _______
6- O animal tem acesso à rua: sim ________ não ________
7- O animal vive com outrosgatos: sim _______ não______
8- O animal é vacinado: sim _______ não ________
70
Anexo B – Protocolo de extração do DNA genômico
1- Adicionar 500µl do Tampão AP1 para um microtubo de 1,5ml (fornecido).
2- Adicionar 200-250µl de sangue total com anticoagulante. Fechar a tampa do
microtubo e misturar pelo vortex por 10 segundos.
3- Adicionar 100µl do Tampão AP2 e misturar no vortex em velocidade máxima
por 10 segundos
4- Centrifugar a 12.000x g por 20 minutos em temperatura ambiente para a
decantação de detritos celulares.
5- Colocar uma coluna de AxyPrep dentro de um microtubo de 2ml. Pipetar o
sobrenadante clarificado obtido no passo 4 dentro da coluna de AxyPrep.
Centrifugar a 12.000x g por 1 minuto.
6- Descartar o filtrado do microtubo de 2 ml. Colocar a coluna de AxyPrep de
volta dentro do microtubo de 2ml. Pipetar 700µl do Tampão W1A dentro da
coluna de AxyPrep e deixe repousar em temperatura ambiente por 2 minutos.
Centrifugar a 12.000 x g por 1 minuto.
7- Descartar o filtrado do microtubo de 2ml. Colocar a coluna de AxyPrep de
volta dentro do microtubo de 2ml. Adicionar 800µl de Tampão W2 para a
coluna de AxyPrep e centrifugar a 12.000 x g por 1 minuto.
8- Descartar o filtrado no microtubo de 2ml. Colocar a coluna de AxyPrep de
volta no microtubo de 2ml. Centrifugar a 12.000 x g por 1 minuto.
9- Coloque a coluna de AxyPrep dentro de um microtubo de 1,5ml. Adicione 80-
200µl de Tampão TE. Deixe repousar em temperatura ambiente ppor um
minuto. Centrifugue a 12000 x g por 1 minuto para diluir o DNA genomico.
71
Anexo C – Protocolo da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para
Toxoplasma gondii
Procedimentos para contagem de taquizoítos: Preencher a câmara de Neubauer com os taquizoítos. Realizar contagem em cinco dos 25 quadrantes centrais. Multiplicar o resultado por 50, o que corresponde à quantidade de taquizoítos
por L. O número ideal é de 1.500 – 2.000 taquizoítos/L para preparo do antígeno.
Diluir o material ressuspenso para uma concentração de 1.500 a 2.000
taquizoítos por L. Preparo das Lâminas:
Adicionar 10 L do antígeno em cada poço da lâmina. Secar em estufa a 37ºC por aproximadamente 30 minutos. Fixar em metanol por cinco minutos Acondicionar em lenço de papel e papel alumínio , armazenando a -20ºC, até
o momento do uso. Execução da técnica de RIFI:
Lavar as lâminas em PBS por 5 minutos. Secar as lâminas em temperatura ambiente ou estufa a 37ºC (tempo = até
secar). Diluir o soro, segundo seu ponto de corte (1:64).
Adicionar 10 L da diluição das amostras de soro.
Adicionar 10 L dos soros controles positivo e negativo. Incubar a 37ºC por 30 minutos, em câmara úmida. Lavar as lâminas duas vezes com PBS por 5 minutos. Secar as lâminas a temperatura ambiente. Diluir o conjugado com FITC (isotiocianato de fluoresceína) em solução de
PBS-Azul de Evans (0,5%), de acordo com o título determinado no Laboratório.
Adicionar 10 L do conjugado diluído em cada poço e proteger da luz. Incubar a 37ºC por 30 minutos, em câmara úmida, sempre protegendo da luz. Lavar as lâminas duas vezes com PBS por 5 minutos (protegendo da luz). Secar as lâminas a temperatura ambiente. Adicionar uma gota de glicerina entre os poços e cobrir com lamínula. Fazer a leitura em objetiva de 40x no microscópio com lâmpada de mercúrio
de alta pressão USH102 e filtro de seleção de comprimento de onda de 450 nm.
72
Apêndice A – Tabela de colinearidade das variáveis com plausibilidade biológicas para as infecções pelos vírus da
imunodeficiência felina e leucemia felina.
VARIÁVEIS Idade ≥ 2 É macho Tem raça Castrado Mora em
apartamento Acesso à rua Periurbano
Vive com outros gatos
Cidade Já foi
mordido
AP
ÊN
DIC
E
Idade ≥ 2 S= -0,0957 S= -0,0642 S= 0,1754 S= 0,0854 S= 0,1542 S= -0,0095 S= -0,0323 S= 0,0477 S= 0,0321
p= 0,1777 p= 0,3663 p= 0,0129 p= 0,2293 p= 0,0292 p= 0,8942 p= 0,6501 p= 0,5074 p= 06518
É macho S= 0,0270 S= - 0,0444 S= -0,0804 S= -0,0415 S= 0,1521 S= -0,1067 S= -0,0752 S= 0,0030
p= 0,7043 p= 0,5326 p= 0,2576 p= 0,56 p= 0,0315 p= 0,1324 p= 0,2896 p= 0,9660
Tem raça S= - 0,0367 S= 0,1237 S= 0,0449 S= -0,1282 S= 0,0142 S= 0,0816 S= -0,0802
p= 0,6074 p= 0,0807 p= 0,5299 p= 0,0704 p= 0,8426 p= 0,2520 p= 0,2612
Castrado S= -0,0249 S= 0,0322 S= -0,0358 S= 0,0582 S= 0,0605 S= 0,0468
p= 0,7258 p= 0,6564 p= 0,6134 p= 0,4212 p= 0,3959 p= 0,5177
Mora em apartamento S= - 0,0583 S= -0,1185 S= -0,0222 S= 0,0095 S= -0,1122
p= 0,4119 p= 0,0946 p= 0,9753 p= 0,8943 p= 0,1137
Acesso à rua S= -0,0054 S= 0,1221 S= 0,0498 S= -0,0524
p= 0,9392 p= 0,0915 p= 0,4844 p= 0,4713
Periurbano S= -0,1120 S= -0,3851 S= 0,1043
p= 0,1141 p= < 0,0001 p= 0,1415
Vive com outros gatos S= -0,0455 S= 0,0012
p= 0,5237 p= 0,9871
Cidade S= -0,0951
p= 0,1816
Já foi mordido
72