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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E ANTIPROLIFERATIVA DA ESPÉCIE

Luehea candicans MART et ZUCC. (TILIACEAE)

Dissertação apresentada por Dioni

Antunes da Silva ao Programa de Pós-

Graduação em Química do Departamento

de Química do Centro de Ciências Exatas

da Universidade Estadual de Maringá, como

parte dos requisitos para obtenção do título

de Mestre em Química.

MARINGÁ, DEZEMBRO DE 2004

“Quanto a você, porém, permaneça nas coisas que aprendeu e das quais tem

convicção, pois você sabe de quem aprendeu. Porque desde criança você

conhece as Sagradas letras, que são capazes de torná-lo sábio para salvação

mediante a fé em Cristo Jesus. ” 2 Timóteo 3: 14,15 (NVI)

Agradecimentos

- À Professora Doutora Cleuza Conceição da Silva pela

orientação, paciência e dedicação.

- À Professora Doutora Maria Conceição de Souza, Departamento

de Biologia, pela coleta e identificação da planta.

- Aos Professores Doutores Celso Vataru Nakamura e Benedito

Prado Dias Filho, Departamento de Análises Clínicas, pela realização

dos ensaios de atividade antibacteriano e antifúngico.

- Ao Doutor João Ernesto de Carvalho, Instituto CPQBA

(UNICAMP), pela realização dos ensaios de atividade

antiproliferativa.

- Aos professores do curso de mestrado em Química Aplicada

pela formação.

- À professora Doutora Silvana Maria de Oliveira Santin pela

orientação na realização do estágio docência.

- Aos colegas da Universidade Estadual de Maringá, pelos

inúmeros serviços prestados, em particular ao Cláudio, Ana e

Claudemir.

- À Ivânia pela valiosa contribuição e também pela obtenção dos

espectros.

- Aos acadêmicos e amigos Vanessa, Anelise, Júlio, Anderson,

Conceição, Fábio, Isis e Lílian.

- A todos os professores, funcionários e amigos pela convivência

durante este período.

- Ao CNPq, pelo suporte financeiro e à CAPES pela bolsa

concedida para realização deste trabalho.

- Finalmente, ao Sivaldo pela compreensão, paciência e presença

nos momentos difíceis.

SUMÁRIO

1 – Introdução e objetivo 1

1.1 – Introdução 1

1.2 – Objetivos 4

2 – Revisão Bibliográfica 5

1.3 – Família Tiliaceae 5

1.4 – Gênero Luehea 11

3 – Parte Experimental 13

3.1 – Matérias e métodos 13

3.2 – Estudo químico de Luehea candicans 14

3.2.1 – Coleta e secagem do material botânico 14

3.2.2 - Isolamento dos principais constituintes químicos dos galhos de

Luehea candicans 14

3.2.2.1 – Preparação e fracionamento do extrato bruto dos galhos 14

3.2.2.2 – Tratamento da fração LCG-4 (fração clorofórmica) 15

3.2.2.3 - Tratamento da fração LCG-5 (fração CHCl3/MeOH 25%) 17

3.2.2.4 – Tratamento da fração LCG-6 (fração CHCl3/MeOH 50%) 18

3.2.2.5 – Tratamento da fração LCG-7 (fração CHCl3/MeOH 75%) 19

3.2.3 - Isolamento dos principais constituintes químicos das folhas de

Luehea candicans 20

3.2.3.1 - Preparação e fracionamento do extrato bruto das folhas 20

3.2.3.2 - Tratamento da fração LCF-2 (fração clorofórmica) 21

3.2.3.3 - Tratamento da fração LCF-3 (fração acetato de etila) 23

3.2.3.4 - Tratamento da fração LCF-4 (fração metanólica) 24

4 – Resultados e Discussão 29

4.1 – Método de extração e isolamento dos constituintes

químicos de L. candicans 29

4.2 – Determinação estrutural dos compostos isolados 31

4.2.1 – Substância LC-1 31







4.3 – Dados espectroscópicos das substâncias isoladas 86

4.3.1 - Substância LC-1: lup-20(29)-en-3β-ol 86

4.3.2 - Substância LC-2 : Mistura dos compostos:

LC-2(I) 24ξ- etil- colest- 5 enol, LC-2(II)24ξ- etil- colesta-

5, 22- dienol, LC-2(III) 24ξ- metil- colest- 5 enol 87

4.3.3 – Substância LC-3: 3β,28-diidróxilup-20(29)-ene 88

4.3.4 – Substância LC-4: 3β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5enol 89

4.3.5 – Substância LC-5: 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-

benzopiran-3,5,7-triol 90

4.3.6 – Substância LC-6: (siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-

bis-β-D-glicosídeo-3’,5’-dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo) 91

4.3.7 – Substância LC-7: 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-

2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona 91

5 – Estudo da atividade biológica 94

5.1 – Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto

dos galhos e do extrato bruto das folhas 94

5.2 – Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos

das folhas e dos galhos e substâncias isoladas 94

5.3 – Avaliação da atividade antiproliferativa 95

5.3.1 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto

das folhas e frações Hexano, CHCl3, AcOEt e MeOH 96

5.3.2 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto

dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH (50%)

e MeOH 99

6 – Conclusões 103

7 – Referências Bibliográficas 105

INDICE DE ESQUEMAS ESQUEMA 1: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna

cromatográfica do extrato bruto dos galhos e para o

isolamento de seus principais constituintes químicos

15

ESQUEMA 2: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna

cromatográfica do extrato bruto das folhas e para o

isolamento de seus principais constituintes químicos

21

ESQUEMA 3: Provável fragmentação de LC-1 33

INDICE DE FIGURAS FIGURA 1: Luehea candicans – árvore 3 FIGURA 2: Luehea candicans – flores 3 FIGURA 3: Espectro no IV de LC-1 31 FIGURA 4: Espectro de massas (70 eV) de LC-1 32 FIGURA 5: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-1 35 FIGURA 6: Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-1 37 FIGURA 7: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de

LC-1

39

FIGURA 8: Mapa de contornos HETCOR (13C x 1H, CDCl3) de LC-1 40 FIGURA 9: Cromatograma da mistura LC-2 42 FIGURA 10: Espectro de massas (70 eV) de LC-2(I) 42 FIGURA 11: Espectro de massas (70 eV) de LC-2(II) 43 FIGURA 12: Espectro de massas (70 eV) de LC-2(III) 43 FIGURA 13: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-2 44 FIGURA 14: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de

LC-2

45

FIGURA 15: Espectro no IV de LC-3 49 FIGURA 16: Espectro de massas (70 eV) de LC-3 50 FIGURA 17: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-3 52 FIGURA 18: Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-3 53 FIGURA 19: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de

LC-3

56

FIGURA 20: Mapa de contornos HETCOR (13C x 1H, CDCl3) de LC-3 57 FIGURA 21: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-4 59 FIGURA 22: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de

LC-4

61

FIGURA 23: Espectro no IV de LC-5 63 FIGURA 24: Espectro de massas (70 eV) de LC-5 64 FIGURA 25: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CD3OD) de LC-5 67

FIGURA 26: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CD3OD) de

LC-5

68

FIGURA 27: Espectro de massas (70 eV) de LC-6 69 FIGURA 28: Espectro de RMN 1H (300 MHz, D2O) de LC-6 71 FIGURA 29: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, D2O) de

LC-6

72

FIGURA 30: Mapa de contornos HMQC (75 MHz, D2O) de LC-6 73 FIGURA 31: Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, D2O) de LC-6 74 FIGURA 32a: Mapa de contornos NOESY (300 MHz, D2O) de LC-6 75 FIGURA 32b: Mapa de contornos NOESY de LC-6 (expansão) 76 FIGURA 33: Mapa de contornos HMBC (300 MHz, D2O) de LC-6 77 FIGURA 34: Correlações de HMBC de LC-6 78 FIGURA 35: Espectro no IV de LC-7 81 FIGURA 36: Espectro de massas (70 eV) de LC-7 82 FIGURA 37: Espectro de RMN 1H (300 MHz, DMSO) de LC-7 84 FIGURA 38: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, DMSO) de

LC-7

85

FIGURA 39: Doxorrubicina – Controle positivo do teste antiproliferativo 97 FIGURA 40: Teste antiproliferativo do extrato bruto das folhas de L.

candicans

97

FIGURA 41: Teste antiproliferativo da fração hexano (folhas) 98 FIGURA 42: Teste antiproliferativo da fração CHCl3 (folhas) 98 FIGURA 43: Teste antiproliferativo da fração MeOH (folhas) 98 FIGURA 44: Teste antiproliferativo da fração AcOEt (folhas) 99 FIGURA 45: Teste antiproliferativo do extrato bruto dos galhos de L.

candicans

100

FIGURA 46: Teste antiproliferativo da fração hexano (galhos) 101FIGURA 47: Teste antiproliferativo da fração CHCl3/MeOH (50%) (galhos) 101FIGURA 48: Teste antiproliferativo da fração CHCl3 (galhos) 102FIGURA 49: Teste antiproliferativo da fração MeOH (galhos) 102

INDICE DE TABELAS

TABELA 1: Fracionamento preliminar do extrato bruto dos galhos 15TABELA 2: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-4 16TABELA 3: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-5 17TABELA 4: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-6 18TABELA 5: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7 19TABELA 6: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7.9 20TABELA 7: Dados do fracionamento do extrato bruto das folhas 21TABELA 8: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2 22TABELA 9: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6 22TABELA 10: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6.3 23TABELA 11: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-4 24TABELA 12: Linhagens de células tumorais utilizadas no teste de atividade

antiproliferativa

28

TABELA 13: Dados de RMN 1H de LC-1 e do lupeol 34TABELA 14: Correlações observadas nos espectros HETCOR (13C x 1H) e

COSY (1H x 1H) de LC-1

36

TABELA 15: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-1 e do lupeol 38TABELA 16: Dados de RMN 13C/DEPT da mistura LC-2 e da mistura 24α –

etil- colest- 5 enol (sitosterol), 24α – etil- colesta- 5, 22- dienol

(estigmasterol) e 24ξ – metil- colest- 5 enol

46

TABELA 17: Dados de RMN 1H para os metilas de LC-2(I) e do 24α –

metil- colest- 5 enol(campesterol) e 24β – metil- colest- 5

enol(22,23 diidrobrassicasterol)

47

TABELA 18: Dados de RMN 1H para os metilas de LC-2(II) e do 24α – etil-

colest- 5,22- dienol(estigmasterol) e 24β – etil- colest- 5,22 -

dienol(poriferasterol)

47

TABELA 19: Dados de RMN 1H para os metilas de LC-2(III) e do 24α – etil-

colest- 5 enol(sitosterol) e 24β – etil- colest- 5

enol(clionasterol)

48

TABELA 20: Dados de RMN 1H de LC-3 e da betulina 51TABELA 21: Correlações observadas nos espectros HETCOR (13C x 1H) e

COSY (1H x 1H) de LC-3

54

TABELA 22: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-3 e da betulina 55TABELA 23: Dados de RMN 1H de LC-4 e do glicopiranositosterol 60TABELA 24: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-4 e do glicopiranositosterol 62TABELA 25: Dados de RMN 1H de LC-5 e da (−)-epicatequina 65

TABELA 26: Dados de RMN 13C / DEPT de LC-5 e da (−)-epicatequina 66

TABELA 27: Correlações observadas nos mapas de contornos (13C x 1H)

HMQC, (1H x 1H) COSY e NOESY da substância LC-6

78

TABELA 28 Correlações observadas no mapa de contornos HMBC da

substância LC-6

79

TABELA 29: Dados de RMN 1H de LC-6 e da liriodendrina 79TABELA 30: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-6 e da liriodendrina 80TABELA 31: Dados de RMN 1H de LC-7 e da vitexina 83TABELA 32: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-7 e da vitexina 86TABELA 33: Atividade antibactriana do extrato bruto das folhas e galhos de

L. candicans

94

TABELA 34: Atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos

galhos de L. candicans

95

TABELA 35: Atividade antiproliferativa ( efeito citostático) dos extratos

brutos das folhas e das frações Hexano, CHCl3, AcOEt e

MeOH de L. candicans

96

TABELA 36: Atividade antiproliferativa ( efeito citostático) dos extratos

brutos dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH

(50%) e MeOH de L. candicans

99

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ATCC American Type Culture Collection

CC Cromatografia em coluna

CCD Cromatografia em camada delgada

COSY 1H-1H Correlation Spectroscopy

D Dubleto

Dd Duplo Dubleto

Dl Dubleto Largo

DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer

DMSO Dimetilssulfóxido

EM Espectro de massas

EV Elétron Volt

HETCOR Heteronuclear Correlation Spectroscopy

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HMQC Heteronuclear Multiple Quantun Coherence

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento, em Hertz

M Multipleto

M.+ Íon molecular

m/e Relação massa/carga

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

Ppm Partes por milhão

Q Quarteto

S Singleto

Sl Singleto largo

T Tripleto

TMS Tetrametilsilano

UFC Unidade Formadora de Colônia

UV Ultravioleta

δ Deslocamento químico (em ppm)

RESUMO

A espécie Luehea candicans Mart. et Zucc., (Tiliaceae), conhecida

popularmente como ‘’mutamba-preta” e “açoita cavalo”, está distribuida

nos Estados de Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e floresta latifoliada

semidecídua da bacia do Paraná. Pouco se conhece a respeito dos

constituintes químicos presentes no gênero Luehea, e o único estudo

químico descrito na literatura para espécie do gênero, o qual foi realizado

anteriormente em nosso laboratório de pesquisa, relata o isolamento de

um triterpeno, da classe dos ursenos e outro dos oleanenos, da espécie

Luehea divaricata, da qual também foram obtidos uma flavona e um

flavonol.

O presente estudo envolveu a extração, isolamento, identificação

dos constituintes químicos dos galhos e folhas de L. candicans, e ainda

ensaios biológicos para avaliação da atividade antibacteriana, antifúngica

e antiproliferativa dos extratos brutos, frações e substâncias isoladas.

Do extrato bruto metanólico dos galhos foram isolados dois

triterpenos pertencentes à classe dos lupanos, o lup-20(29)-en-3β-ol

(lupeol) e o 3β,28-diidróxilup-20(29)-eno (betulina), a mistura dos

esteróides 24ξ- etil- colest- 5 enol (sitosterol), 24ξ- etil- colesta- 5, 22-

dienol (estigmasterol) e 24ξ- metil- colest- 5 enol, o esteróide glicosilado

3-β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5-enol (3-O-β-D-

glicopiranosilsitosterol), o flavan-3-ol, 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-

benzopiran-3,5,7-triol [(-)-epicatequina] e a lignana (+)-siringaresinol di-

O-β-D-glicopiranosídeo (liriodendrina).

Do extrato bruto metanólico das folhas foi isolada a flavona C-

glicosilada 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-H-

benzopiran-4-ona (vitexina).

Os extratos brutos dos galhos e folhas tiveram suas atividades

antibacteriana, antifúngica e antiproliferativa testadas. Nenhum dos

extratos apresentou atividade antibacteriana através da metodologia

empregada. O extrato bruto das folhas apresentou atividade antifúngica

contra a cepa Candida krusei. O extrato bruto das folhas de L. candicans

apresentou atividade antiproliferativa, com efeito citostático de 85%

(25μg/mL) e efeito citocida em 25%, na maior concentração utilizada,

para células de câncer de rim. As frações hexano, CHCl3 e MeOH

apresentaram efeito citastático em 100%, na maior concentração

utilizada, também para células de câncer de rim. O extrato bruto dos

galhos apresentou atividade antiproliferativa concentração dependente

com efeito citostático e pequena seletividade entre as linhagens

estudadas.

A atividade antifúngica dos triterpenos, esteróides e flavonóides

isolados foi testada, e nenhuma das substâncias foi ativa através da

metodologia empregada.

Palavras-chave: Luehea candicans; triterpenos; flavonóides; lignana;

atividade biológica

ABSTRACT

The species Luehea candicans Mart. et Zucc., ( Tiliaceae),

popularly known as “mutamba- preta” and “açoita cavalo”, it is found in

the states of Minas Gerais, Mato Grosso do Sul and forests of Paraná’s

basin. Little is known about the chemical components presented in the

genus Luehea, and the only chemical research described in the literature

for the species of the genus, which was made in our laboratory of

research previously, reports the isolation of a triterpene, of the class of

the ursenes and another of the oleanenes, of the species Luehea

divaricata, from which was obtained also a flavone and a flavonol.

The following study involved the extraction, isolation, identification

of the chemical components of the branches and leaves of the L.

candicans, besides biological essays to evaluate the antibacterial,

antifungal and antiproliferative activity of the crude extracts, fractions and

isolated substances.

From the crude methanolic extract of the branches were isolated

two triterpenes belonging to the class of the lupanes , the lup- 20 (29)-

en- 3ß -ol (lupeol) and the 3ß, 28- dihydroxylup-20 (29)-ene (betulin), the

mixture of the steroid 24ξ-ethylcholest-5-enol ( sitosterol), 24ξ-

ethylcholesta-5,22-dienol (stigmasterol) and 24ξ-methylcholest-5-enol,

the glucosiled steroid 3-ß-O-glucopyranosyl-24ξ-ethylcholest-5-enol (3-O-

ß-D-glucopyranosylsitosterol), the flavan-3-ol, 2-(3,4-dihydroxyphenil)-

3,4-dihydro-1-2H-benzopyran-3,5,7- triol [(-)-epicatechin] and the lignan

(+)- syringaresinol di-O-ß-D-glucopyranoside (liriodendrin) .

From the crude methanolic extract of the leaves it was isolated the

(-glucoside 8- ß-D-Glucopyranosyl-5, flavone 7- dihydroxy-2-(4-

hydroxyphenil)-4-H-benzopyran-4-one (vitexin).

The crude extracts of the branches and leaves had their

antibacterial, antifungal and antiproliferative activities tested. None of the

extracts presented antibacterial activity through the methodology

employed. The crude extract of the leaves presented antifungal activity

against Candida Krusei. The crude extract of the leaves of L. candicans

presented antiproliferative activity with inhibition of growth of 85%

(25μg/mL) and cellular death in 25%, in the major concentration utilized,

to cells of cancer of kidney. The fractions hexane, CHCl3 and MeOH

presented inhibition of growth in 100%, in the major concentration

utilized, also, to the cells of kidney’s cancer.

The crude extract of the branches presented anticancer activity,

dependent concentrations with inhibition of growth and small selectivity

between the lineages studied.

The antifungal activity of the triterpenes, steroids and isolated

flavonoids it was tested, and none of the substances tested presented

any activity.

Key words: Luehea candicans; triterpenes; flavonoids; lignan;

biological activity

1 – INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

1.1 – INTRODUÇÃO

Há cerca de 15 anos o grupo de pesquisa do Nupélia/UEM iniciou o

levantamento florístico direcionado às espécies nativas presentes na planície de

inundação do alto rio Paraná, região considerada como área de preservação

ecológica do Estado. Esta região abriga uma grande diversidade de ambientes,

incluindo florestas do tipo estacional semidecídua, submontana e mata ciliar.

Existem ainda, várzeas paludícula e aquática em áreas alagadas das lagoas

temporárias ou permanentes.

Um dos objetivos deste levantamento é apresentar uma listagem das

espécies presentes nesta área e correlacioná-las com sua distribuição na América

do Sul, acompanhando principalmente a vegetação que segue o leito do rio

Paraná, através de outros estados brasileiros e outros países como Argentina e

Paraguai.

Muitas espécies mapeadas nesta região não possuem estudo químico e/ou

de atividade biológica descritos na literatura e algumas já estão incluídas entre as

ameaçadas de extinção no Estado do Paraná, sendo que dentre estas encontra -

se a espécie Luehea candicans (Vazzoler e col.1997).

Este levantamento tem ainda o objetivo de contribuir para a ampliação do

conhecimento do potencial químico e farmacológico de tais espécies, bem como

dar suporte à classificação botânica das mesmas, com base em estudos

qimiotaxonômicos.

Desta forma, considerando que alguns estudos químicos de plantas

bioativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná, estão sendo

desenvolvidos de forma interdisciplinar entre pesquisadores do NUPÉLIA,

Biologia, do grupo de Produtos Naturais (DQI) e Análises Clínicas, optou-se pelo

estudo químico de Luehea candicans, o qual se somará ao estudo da espécie L.

divaricata, realizado em nosso laboratório de pesquisa, sendo este o primeiro no

gênero.

Pertencente à família Tiliaceae, a qual compreende aproximadamente cerca

de 35 gêneros e 370 espécies e tem o sul da África e o Brasil como os dois

principais centros de dispersão, sendo que no Brasil encontra-se cerca de 13

gêneros e de 55 a 60 espécies (Barroso e col., 1978), a espécie L. candicans

(Figuras 1 e 2) conhecida popularmente como ‘’mutamba-preta” e “açoita-cavalo”,

ocorre também nos Estados de Minas Gerais e Mato Grosso do Sul

(Lorenzi,1998).

Na classificação botânica segundo Cronquist (1988), a espécie Luehea

candicans pertence à seguinte posição sistemática:

Divisão: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopsida

Sublcasse: Dilleniidae

Ordem: Malvales

Família: Tiliaceae

Tribo: Tilieae (segundo Angely – 1965)

Gênero: Luehea

Espécie: Luehea candicans

E segundo Lorenzi (1992) seus dados botânicos são:

Nome científico: Luehea candicans Mart. et Zucc.

Nomes populares: mutamba-preta, açoita-cavalo.

Características morfológicas: árvore com altura de 8-12 m, com tronco de 30-50

cm de diâmetro. Folhas simples, de coloração prateada.

Ocorrência: São Paulo, Minas Gerais e Mato Grosso do Sul, floresta latifoliada

semidecídua da bacia do Paraná.

Utilidade: a madeira é empregada na confecção de cadeiras, cangas de boi,

saltos de calçados, ripas, caibros, etc.

Informações ecológicas: planta decídua, heliófita, seletiva higrófita, exclusiva da

floresta semidecídua do rio Paraná. Planta rara e de dispersão descontínua.

Fenologia: floresce durante os meses de novembro-dezembro. A maturação dos

frutos ocorre durante os meses de julho-agosto.

FIGURA 1 – Luehea candicans : Árvore

FIGURA 2 – Luehea candicans : Flores

1.2 – OBJETIVOS

O estudo de L. candicans visa ampliar o conhecimento químico e biológico

do gênero Luehea que iniciou-se com o estudo da espécie L. divaricata. E ainda, o

estudo químico e a avaliação da atividade biológica sevirão de auxílio,

contribuição e suporte para a confirmação da classificação botânica desta espécie.

Desta forma, considerando que tais informações também poderão contribuir para

ampliar o conhecimento do potencial químico e farmacológico das espécies

nativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná e com isto,

assegurar a preservação de espécies com potencial biológico ainda

desconhecidos, este trabalho tem por objetivo:

♦ Estudar fitoquimicamente a espécie L. candicans visando isolar e

identificar os principais metabólitos secundários presentes nos galhos e

folhas.

♦ Avaliar a atividade biológica (antibacteriana, antifúngica e

antiproliferativa) dos extratos brutos, frações e substâncias isoladas.

2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 – Família Tiliaceae Na família Tiliaceae poucas espécies, pertencentes a apenas três dos 35

gêneros, foram estudadas quimicamente, sendo que a maioria dos estudos são

com espécies do gênero Corchorus, relatando principalmente o isolamento de

cardenolídeos glicosilados. Da espécie C. olitorius foram isolados os

cardenolídeos glicosilados (1,2,3,4,5,6,7,8)(Nakamura e col., 1998).

a

OHO

HO

HOO H

O O

O H

C H 3

C H 3O

O H

OHO

HO

HOO H

O

b

C H 3O

O H

c HO

dO

O H

HOC H 3

C H 3O

O H

OHO

HO

HOO H

O

e

OHO

HOO H

O

O

O

R2

CH3

OH

R3

(1) R1=a, R2=CHO, R3=OH(2) R1=c, R2=CHO, R3=OH(3) R1=d, R2=CHO, R3=OH(4) R1=b, R2=CH2OH, R3=H(5) R1=e, R2=CH3, R3=H(6) R1=b, R2=CH3, R3=H(7) R1=a, R2=CH3, R3=H(8) R1=c, R2=CH3, R3=H

R1O

Venkata (1975) isolou quatro cardenolídeos glicosilados (9), (10), (11), (12),

da espécie C. trilocularis.

(9) R=β-D-boivonosil

(10) R=H

(11) R=OMe

(12) R=α-L-raminosil

Ahmad e colaboradores (1998) isolaram os triterpenos cicloartanos

glicosilados (13) e (14), enquanto que Khan e colaboradores (1991) obtiveram os

derivados da α-amirina (15), (16) e (17) da espécie C. depressus.

ROOH

O O

O

OH

O

OH

(13)Glc

(15)

(16)

OH

CO2H

HO2CHO

HO

OH

CO2H

GlcO2CHO

HO

O

OAc

O

OH

(14)Glc

(17)

Os triterpenos glicosilados (18) e (19), juntamente com os triterpenos (20),

(21) e (22) foram isolados da espécie C. acutangulus por Mahato e col. (1988).

C O 2H

H O 2 C H O

H O

Das folhas da espécie C. capsularis foram obtidos os triterpenos (23), (24),

(25) e (26) por C. M. Hasan e col. (1984) .

CH2OR3

R1O

OR2

R2=R3=Me

R2=R3=HO

OHHO

HOOH

O

OMeMeO

MeOOMe

(18) R1=

(20) R1=R2=R3=H(21) R1=H, R2=R3=Me(22) R1=Ac, R2=R3=Me

(19) R1=

(23) R1=R2=R3=H

(24) R1=R2=Ac, R3=H

(25) R1=R2=R3=Ac

(26) R1= Glc, R2=R3=H

Do gênero Microcos foram isolados alcalóides piperidínicos, sendo a

micropina (27) isolada da espécie M. philippinensis por Aguinaldo (1990) e a

piperidina (28) isolada da espécie M. paniculata por Bandara e col. (2000).

N

OH

CH2OH

Me(27)

R1O

OR3

CH2OR2

H

O

OH

H

No gênero Grewia, Rosler e colaboradores (1978) isolaram o alcalóide 6-

hidróxi-1-metil-β-carbolina (29) das raízes de Grewia mollis e Lakshmi e

colaboradores (1976) obtiveram uma δ-lactona (30) das flores de Grewia asiatica.

(29)

(30)

N

OMe

Me

Me(28)

O

O

OH

NH

N

HO

CH3

2.2 – Gênero Luehea

No gênero Luehea, algumas espécies são usadas na medicina popular

como diuréticas e antinflamatórias (Alice e col.,1985). Braga (1976), assinalou

como adstringentes as cascas de L. speciosa Willd. (sinônimo botânico de L.

divaricata), e registrou também a presença das espécies L. candicans Mart. et

Zucc. (Luehea uniflora St. Hil.) e L. paniculata Mart., assinalando-as como tendo o

mesmo uso da primeira. A atividade antifúngica de L. divaricata foi avaliada por

Zacchino e colaboradores (1998), obtendo como resultado a ação moderada do

extrato diclorometânico na inibição do crescimento de hifas de fungos

dermatófitos.

Sáens e Nassar (1968) constataram a presença, em pequena quantidade,

de alcalóides na espécie L. candida (DC) Mart. Flavonóides, taninos, saponinas e

triterpenos/esteróides foram detectados em triagem fitoquímica dos extratos

etanólicos das folhas e caules de L. divaricata (Alice e col.,1985), cujo estudo

químico foi realizado em nosso laboratório de pesquisa. No trabalho citado, foram

isolados de L. divaricata o triterpeno inédito ácido 3β-p-hidroxibenzoil tormêntico

(ácido 3β-p-hidroxibenzoil, 2α,19α-di-hidroxiurs-12-en-28-óico) (31); uma mistura

de triterpenos cujo constituinte majoritário é o ácido 2α, 3β-dihidroxiolean-12-en-

28-óico (ácido maslínico), um derivado 2,3 diidroxilado de β-amirina (32) (Tanaka

e col., 2003). Além dos triterpenos, foi isolado uma flavona, a vitexina (33) e a (-)-

epicatequina (34), um flavonóide pertencente à classe dos flavan-3-ol (Tanaka,

2002). Este foi o primeiro relato de estudo fitoquímico no genêro Luehea.

(31)

COOH

OH

HO

H

HO

O

HO

(32)

(33)

(34)

H

H

HO

HO

COOH

O

OOH

HO HO

OH

OHO

HO

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

3 – PARTE EXPERIMENTAL

3.1 – Materiais e métodos

Os espectros de massas de baixa resolução foram obtidos em um

equipamento GC/MS SHIMADZU a 70 eV, modelo QP 2000A, com sonda para

sólidos.

Os espectros de absorção na região do IV foram registrados em um

espectrofotômetro FTIR-BOMEM MB-100, na região de 400 a 4000 cm-1. Utilizou-

se a absorção em 1601 cm-1 de um filme de poliestireno como referência.

Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram obtidos em espectrômetro

VARIAN, modelo Gemini 2000 BB e Mercury Plus BB (300,6 MHz para 1H e 75,45

MHz para 13C). Os deslocamentos químicos foram obtidos em ppm, tendo como

referência interna o TMS (δ = 0,0 ppm). Os solventes deuterados utilizados foram

DMSO-d6, CDCl3, CD3OD, Aldrich ou Isotec.

As técnicas unidimensionais de RMN utilizadas na obtenção dos dados

experimentais visando a elucidação estrutural das substâncias obtidas foram RMN

de 1H, RMN de 13C, DEPT 90o e 135o. Foram também utilizadas em alguns casos,

as técnicas bidimensionais COSY 45o, HETCOR, NOESY, HMQC e HMBC.

As cromatografias em coluna foram feitas utilizando sílica gel 60 [(0,063 –

0,200 mm) (70-230 mesh ASTM)] ou [(0,2 - 0,5 mm) (35-70 mesh ASTM)] da

Merck ou Fluka e o monitoramento das frações foi realizado através de

cromatografia em camada delgada analítica (CCDA).

A espessura da camada de sílica gel (silica gel GF254 - Merck) usada na

confecção das placas de vidro para cromatografia em camada delgada analítica

(CCDA) e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foram de 0,25

mm (20x5 cm) e 1,00 mm (20x20 cm).

Os solventes utilizados nas CC, CCDP, CCDA e recristalizações

apresentavam grau de pureza P.A. ou foram tratados e destilados quando

necessário.

As substâncias foram visualizadas nas placas de CCDA utilizando

reveladores como H2SO4/MeOH (1:1), iodo e anisaldeído para terpenos (4-metóxi-

benzaldeído, ácido acético, ácido sulfúrico, / 1,0 : 48,5 : 0,5). As substâncias

fluorescentes foram visualizadas sob luz UV nos comprimentos de onda de 254 e

366 nm.

3.2 – Estudo químico de Luehea candicans

3.2.1 – Coleta e secagem do material botânico A planta foi coletada no entardecer do dia 12 de outubro de 2000, na região

de Porto Rico, Estado do Paraná, reserva ecológica do NUPÉLIA (UEM). A coleta

e identificação do material botânico foi feito pela Profa Dra Maria Conceição de

Souza. Uma excicata da planta em estudo foi depositada no Herbário do

Departamento de Biologia da Universidade Estadual de Maringá, sob número

9326. O material foi seco ao ar e pulverizado em moinho, obtendo-se 345,0g das

folhas e 432,5g dos galhos.

3.2.2 – Isolamento dos principais constituintes químicos dos galhos de

Luehea candicans

3.2.2.1 – Preparação e fracionamento do extrato bruto dos galhos O material botânico dos galhos foi submetido ao processo de remaceração

exaustiva com metanol (20x 500mL), a temperatura ambiente e concentrado a

pressão reduzida em evaporador rotativo (40o) obtendo-se 49,0g de extrato bruto.

Parte do extrato bruto, 20,0 g, foi adsorvido em sílica gel (31,0g) e

submetido a uma separação preliminar em coluna cromatográfica utilizando o

sistema de eluentes conforme Tabela 1. O procedimento geral do fracionamento

dos galhos está representado no Esquema 1.

Tabela 1: Fracionamento preliminar do extrato bruto dos galhos

Fração(%) Volume(mL) Massa(g) Código

Hexano 1500 0,0151 LCG-1

Hex./Clorofórmio 50 700 0,0415 LCG-2

Hex./Clorofórmio 75 700 0,0730 LCG-3

Clorofórmio 1400 0,7020 LCG-4

CHCl3/Metanol 25 700 0,8979 LCG-5



Metanol 1300 7,1133 LCG-8

Esquema 1: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna

cromatográfica do extrato bruto dos galhos e para o isolamento de seus principais

constituintes químicos

EXTRATO BRUTO20,0g

LCG-1

LC-64,3mg

LC-7.9

LCG-2 LCG-4 LCG-6 LCG-7 LCG-8

LC-59mg

LC-312mg

LC-212mg

LC-116mg

LCG-5

LC-418mg

CC sílica gel

CC sílica gelCC sílica gel

CC sílica gel

CC sílica gel

PRÉ-FRACIONAMENTOCC SILICA GEL

HEXANO HEX./CHCl350%

CHCl3CHCl3/MeOH

25%CHCl3/MeOH

50%CHCl3/MeOH

75%MeOH

GALHOS (430,0g)↓

EXTRATO BRUTO ( 49,0g)↓

3.2.2.2 – Tratamento da fração LCG-4 (Fração clorofórmica) Parte da fração LCG-4 (620,0 mg) foi submetida à cromatografia em coluna

de sílica gel 60(∅= 1,0 cm e msi = 8,6g) empacotada com hexano e eluída com

hexano/ acetato de etila em polaridade crescente. Foram coletadas 125 frações de

10,0mL cada, reunidas em 14 novas frações de acordo com as semelhanças

observadas por CCDA, conforme Tabela 2.

Tabela 2: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-4

Frações

reunidas

Eluente(%)

Massa(mg) Denominação Substância

Isolada

1-5 Hexano/AcOEt 2,5 0,1 LCG-4.1

6 Hexano/ AcOEt 2,5 19,0 LCG-4.2

7 Hexano/ AcOEt 2,5 0,1 LCG-4.3

8-12 Hexano/ AcOEt 5,0 18,1 LCG-4.4 LC-1 (16,0mg)

13-14 Hexano/ AcOEt 5,0 1,0 LCG-4.5


17-20 Hexano/ AcOEt 5,0 2,0 LCG-4.7

21-23 Hexano/ AcOEt 7,0 19,7 LCG-4.8

24-37 Hexano/ AcOEt 10,0 31,0 LCG-4.9

38-40 Hexano/ AcOEt 10,0 10,0 LCG-4.10


55-65 Hexano/ AcOEt 20,0 32,0 LCG-4.12

66-93 Hexano/ AcOEt 50,0 28,0 LCG-4.13

925 Hexano/ AcOEt 75,0 13,0 LCG-4.14

Na fração LCG-4.4 formou-se um sólido branco, o qual foi lavado com

hexano para remoção de impurezas. A análise por CCDA apresentou uma única

mancha. Os dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram tratar-se de um

triterpeno, o qual foi denominado de LC-1.

A fração LCG-4.6 também apresentou uma única mancha em CCDA e seus

dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram tratar-se de mistura de esteróides,

denominada de LC-2. Esta fração também foi purificada com hexano.

Da fração LCG-11 as impurezas foram retiradas utilizando-se acetona,

isolando-se também um sólido branco solúvel em clorofórmio. Os dados de RMN

de 1H e de 13C demonstraram que esta substância também tratava-se de um

triterpeno, a qual foi denominada de LC-3. As demais frações não foram

estudadas por apresentarem-se como misturas complexas ou por conterem pouca

massa.

3.2.2.3 – Tratamento da fração LCG-5 (Fração CHCl3/MeOH 25%) Parte da fração LCG-5 (700,0mg) foi submetida à cromatografia em coluna

de sílica gel 60 (∅= 1,5cm e msi = 12,0g) empacotada com clorofórmio e eluída

com clorofórmio/acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Desta coluna

foram coletadas 103 frações de 10,0mL cada, reunidas em 15 novas frações de

acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 3. Tabela 3: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-5

Frações Reunidas

Eluente(%)

Massa(mg) Denominação Substância Isolada

1-2 CHCl3/AcOEt 2,5 0,1 LCG-5.1 3-4 CHCl3/ AcOEt 2,5 19,9 LCG-5.2 5-9 CHCl3/ AcOEt 2,5 61,7 LCG-5.3

10-12 CHCl3/ AcOEt 5,0 23,9 LCG-5.4 13-18 CHCl3/ AcOEt 10,0 96,1 LCG-5.5 19-30 CHCl3/ AcOEt 10,0 37,8 LCG-5.6 31-37 CHCl3/ AcOEt 25,0 12,0 LCG-5.7 38-42 CHCl3/ AcOEt 25,0 85,4 LCG-5.8 LC-4 (10,0mg)43-54 CHCl3/ AcOEt 50,0 68,7 LCG-5.9 LC-4 (8,0mg) 55-60 CHCl3/ AcOEt 75,0 19,1 LCG-5.10 61-72 AcOEt 89,6 LCG-5.11 73-78 AcOEt 25,5 LCG-5.12 79-91 AcOEt/MeOH 20,0 10,6 LCG-5.13 92-96 MeOH 10,6 LCC-5.14 97-103 MeOH 92,6 LCG-5.15

Nas frações LCG-5.8 e LCG-5.9 formou-se um precipitado branco, cuja a

análise por CCDA apresentou uma única mancha. Os dados obtidos nos

espectros de RMN de de 1H e de 13C demonstraram tratar-se de um esteróide (LC-4). As frações LCG-5.5 e LCG-5.15 foram estudadas não tendo sido obtido

resultado satisfatório. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-

se como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa.

3.2.2.4 – Tratamento da fração LCG-6 (Fração CHCl3/MeOH 50%) Parte da fração LCG-6 (2,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de

sílica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 38,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com

clorofórmio/acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas

123 frações de 10,0mL cada, reunidas em 11 novas frações de acordo com as

semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 4.

Tabela4: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-6

Frações reunidas

Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância Isolada

1-61 CHCl3/AcOEt 5,0-50,0 25,6 LCG-6.1 62-64 AcOEt 28,9 LCG-6.2 LC-5 (9,0mg) 65-70 AcOEt 42,8 LCG-6.3 71-84 AcOEt /MeOH 10,0 616,3 LCG-6.4 85-87 AcOEt /MeOH 25,0 103,4 LCG-6.5 88-90 AcOEt /MeOH 25,0 249,1 LCG-6.6 91-96 AcOEt /MeOH 25,0 399,5 LCG-6.7 97-100 AcOEt /MeOH 50,0 197,2 LCG-6.8

101-107 AcOEt /MeOH 50,0 116,3 LCG-6.9 108-112 MeOH 193,8 LCG-6.10 113-123 MeOH 42,0 LCG-6.11

Na fração LCG-6.2, formou-se um sólido levemente marrom, solúvel em

metanol, o qual foi purificado utilizando-se clorofórmio. A análise por CCDA

apresentou uma única mancha. Os dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram

que a substância isolada pertencia à classe dos flavonóides, a qual foi

denominada de LC-5. A fração LCC-6.4 foi estudada, não tendo sido obtido

resultado satisfatório. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-

se como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa.

3.2.2.5 – Tratamento da fração LCG-7 (Fração CHCl3/MeOH 75%) Parte da fração LCG-7 (5,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de

sílica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 60,0g) empacotada com acetato de etila e eluída

com acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 95

frações de 10,0mL cada, reunidas em 11 novas frações de acordo com as


Tabela 5: Cromatografia em coluna da fração LCG-7

Frações reunidas

Eluente(%) Massa(g) Denominação Substância isolada

1-6 AcOEt 0,074 LCG-7.1 LC-5 7 AcOEt 0,455 LCG-7.2

8-10 AcOEt 0,227 LCG-7.3 11-27 AcOEt/MeOH 10,0 0,130 LCG-7.4 28-32 AcOEt /MeOH 20,0 0,180 LCG-7.5 LC-5 33-41 AcOEt/MeOH 20,0 0,712 LCG-7.6 42-51 AcOEt/MeOH 20,0-30,0 0,953 LCG-7.7 52-59 AcOEt/MeOH 30,0 0,334 LCG-7.8 60-67 AcOEt/MeOH 30,0-40,0 1,000 LCG-7.9 68-75 AcOEt/MeOH 50,0 0,515 LCG-7.10 76-95 AcOEt/MeOH 75,0 0,199 LCG-7.11

Nas frações LCG-7.1 a LCG-7.5 foi detectado a presença de LC-5. As

frações LCG-7.6 a LCG-7.8 foram reunidas por apresentarem flurescência

semelhante sob luz ultravioleta, no comprimento de onda λ = 366 nm, e

submetidas a uma coluna cromatográfica em silica gel onde nenhum resultado

satisfatório foi obtido.

A fração LCG-7.9 (1,0g), por apresentar perfil cromatográfico menos

complexo, foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm

e msi = 12,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em

polaridade crescente. Foram coletadas 40 frações de 15,0mL cada, reunidas em 6

novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme

Tabela 6.

Tabela 6: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7.9

Frações reunidas

Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância Isolada

1-6 CHCl3/MeOH 5,0 18,3 LCG-7.9.1 7-14 CHCl3/MeOH 7,0-10,0 1,7 LCG-7.9.2 15-18 CHCl3/MeOH 15,0 4,3 LCG-7.9.3 LC-6 (4,3mg)19-20 CHCl3/MeOH 20,0 2,9 LCG-7.9.4 21-30 CHCl3/MeOH 25,0-50,0 177,0 LCG-7.9.5 31-40 CHCl3/MeOH 75,0 728,0 LCG-7.9.6

Na fração LCG-7.9.3 precipitou um sólido branco(4,0mg) solúvel em H2O,

denominado LC-6. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-se

como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa.

As frações LCG-1, LCG-2 e LCG-3 não foram estudadas por apresentarem

perfil muito complexo e massa insuficiente para dar continuidade aos trabalhos.

A fração LCG-8 não foi estudada por apresentar muita quantidade de

taninos, visualizados através de cromatografia em camada delgada (MeOH/ H2O –

50%) que dificultaram o trabalho.

3.2.3 – Isolamento dos principais constituintes químicos das folhas de

Luehea candicans

3.2.3.1 – Preparação e fracionamento do extrato bruto das folhas As folhas foram submetidas ao processo de remaceração exaustiva com

metanol (26x500mL) à temperatura ambiente, concentrado à pressão reduzida em

evaporador rotativo (40o) obtendo-se 61,0g de extrato bruto.

Parte do extrato bruto obtido, 40,0 g, foi adsorvido em silica gel (40,0g) e

submetido a uma separação preliminar em coluna cromatográfica utilizando o

sistema de eluentes conforme Tabela 7. O procedimento geral do fracionamento

das folhas está representado no Esquema 2.

Tabela 7: Dados do fracionamento do extrato bruto das folhas

Fração Volume(L) Massa(g) Código Hexânica 2,2 0,286 LCF-1

Clorofórmica 2,0 2,789 LCF-2 Acetato de etila 2,0 1,597 LCF-3

Metanólica 2,5 23,855 LCF-4

Esquema 2: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna

cromatográfica do extrato bruto das folhas e para o isolamento de seus principais

constituintes químicos

EXTRATO BRUTO40,0g

LCF-1

LC-1 LC-78,0 mg

LCF-3pCC sílica gel

CC sílica gel

PRÉ-FRACIONAMENTOCC SILICA GEL

HEXANO CHCl3 MeOH

FOLHAS (345,0g)↓

EXTRATO BRUTO ( 60,0g)↓

LCF-2 LCF-3 LCF-4

AcOEt

LC-74,0 mg

LC-411,0 mg

Ppt

CHCl3 / H2O (sucessivas lavagens)

3.2.3.2 – Tratamento da fração LCF-2 (Fração clorofórmica) Parte da fração LCF-2 (2,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de

sílica gel 60 (∅= 2,0cm e msi = 20,0g) empacotada com hexano e eluída com

hexano/acetato de etila em polaridade crescente. Foram coletadas 64 frações de

15,0mL cada, reunidas em 8 novas frações de acordo com as semelhanças

observadas por CCDA, conforme Tabela 8.

Tabela 8: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2

Frações

reunidas

Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância

isolada

1-14 Hexano/AcOEt 2,5-7,0 173,6 LCF-2.1

15-22 Hexano AcOEt 10,0 114,8 LCF-2.2 LC-1 23-27 Hexano/ AcOEt 10,0 160,0 LCF-2.3 28-34 Hexano/ AcOEt 15,0 106,3 LCF-2.4 LC-2 35-44 Hexano/ AcOEt 20,0-25,0 220,8 LCF-2.5

45-53 Hexano/ AcOEt 50,0-75,0 215,4 LCF-2.6

54-55 AcOEt 49,1 LCF-2.7

56-64 AcOEt 42,7 LCF-2.8

Na fração LCF-2.2 foi detectada a presença de LC-1 e na fração LCF-2.4

LC-2. As frações LCF-2.6 e LCF-2.7 foram reunidas por apresentarem

semelhanças. Esta fração foi denominada LCF-2.6 (264,0mg), e foi submetida a

uma coluna cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm e msi = 10,0g) empacotada

com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente.

Foram coletadas 55 frações de 15,0mL cada, reunidas em 5 novas frações de

acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 9.

Tabela 9: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6

Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação

1-8 CHCl3 88,0 LCF-2.6.1

9-17 CHCl3/MeOH 2,5 160,0 LCF-2.6.2

18-24 CHCl3/MeOH 2,5-5,0 4,0 LCF-2.6.3

25-48 CHCl3/MeOH 7,0-40,0 2,3 LCF-2.6.4

49-55 CHCl3/MeOH 40,0-80,0 1,0 LCF-2.6.5

A fração LCF-2.6.2 (160,0mg), por apresentar fluorescência sob luz

ultravioleta no comprimento de onda λ = 254 nm, foi submetida a uma coluna

cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm e msi = 8,0g) empacotada com

clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente. Foram

coletadas 43 frações de 15,0mL cada, reunidas em 4 novas frações de acordo

com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 10.

Tabela 10: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6.3

Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação

1-11 CHCl3 14,0 LCF-2.6.3 a

12-18 CHCl3/MeOH 1,0 76,0 LCF-2.6.3 b

19-38 CHCl3/MeOH 1,5-2,5 52,6 LCF-2.6.3 c

38-43 CHCl3/MeOH 5,0 3,0 LCF-2.6.3 d

A fração LCF-2.6.3b (76,0mg), por apresentar perfil cromatográfico menos

complexo foi submetida a uma cromatografia em camada delgada

preparativa(CCDP). Foram retiradas quatro faixas sendo que apenas uma

apresentou quantidade de massa suficiente para análises espectroscópicas,

sendo denominada LCF-2.6b (4,0mg).

3.2.3.3 – Tratamento da fração LCF-3 (Fração acetato de etila) A fração LCF-3 foi evaporada à secura e ao ser solubilizada em metanol

,para removê-la do balão, houve a formação de um precipitado de coloração

amarela. A análise por CCDA apresentou duas manchas com rfs diferentes, uma

de cor amarela e outra de cor violeta sob luz visível. As substâncias foram

separadas utilizando-se clorofórmio e água. Os dados de RMN de 1H e de 13C

demonstraram que uma substância isolada pertencia à classe dos flavonóides, a

qual foi denominada de LC-7 (8,0 mg) e a outra substância era o esteróide já

isolado (LC-4) (11,0 mg). Optou-se por não fazer coluna cromatográfica da fração

LCF-3 por apresentar perfil intermediário entre a fração clorofórmica(LCF-2) e a

fração metanólica(LCF-4).

3.2.3.4 – Tratamento da fração LCF-4 (Fração metanólica) Parte da fração LCF-4 (4,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de

silica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 50,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com

clorofórmio/acetato de etila/ metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 72

frações de 15,0mL cada, reunidas em 7 novas frações de acordo com as


Tabela 11: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-4

Frações

reunidas

Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância

isolada

1-33 CHCl3/ AcOEt 10,0-50,0 42,5 LCF-4.1

34-40 AcOEt /MeOH 5,0-10,0 104,8 LCF-4.2

41-50 AcOEt /MeOH 20,0 84,6 LCF-4.3 LC-7

51-52 AcOEt /MeOH 30,0 45,0 LCF-4.4

53-57 AcOEt /MeOH 50,0 87,2 LCF-4.5

58-64 AcOEt /MeOH 50,0-75,0 104,8 LCF-4.6

65-72 MeOH 178,0 LCF-4.7

Na fração LCF-4.2 foi detectado através de CCDA, uma mancha de

coloração amarela sob luz visível. Esta fração foi purificada com acetato de etila

não tendo sido obtido quantidade de massa suficiente para as análises

espectroscópicas. Na fração LCF-4.3 foi isolada mais quantidade da substância

LC-7 (4,0 mg). As demais frações não foram estudadas por apresentarem um

perfil cromatográfico muito complexo.

A fração LCF-1 não foi estudada por apresentar pouca massa e perfil

cromatográfico muito complexo.

3.3 – Estudo de atividade biológica Os testes de atividade antifúngica e antibacteriana foram realizados no

Departamento de Análises Clínicas da Universidade Estadual de Maringá, sob

coordenação do professor Dr. Benedito Dias Prado Filho e professor Dr. Celso

Nakamura. O método usado nos testes foi o da microdiluição descrito por Woods

(1995).

A avaliação da atividade antiproliferativa foi realizada no CPQBA

(UNICAMP), sob responsabilidade do professor Dr. João Ernesto de Carvalho. Os

testes de atividade foram realizados segundo método descrito por Skehan e col.

(1990) e Monks e col. (1991).

3.3.1 – Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto dos galhos e das folhas A avaliação da atividade antibacteriana foi feita através do teste de

susceptibilidade antibacteriana pelo método de microdiluição. Este método utiliza

placas contendo 96 compartimentos, sendo cada compartimento denominado well

(poço). Foram utilizadas três placas para verificar a atividade antibacteriana, uma

para cada espécie de bactéria, juntamente com os respectivos antibacterianos

padrões descritos pela literatura. Cada poço continha aproximadamente 10 μL de

caldo de cultura Müller-Hinton para crescimento bacteriano. As drogas utilizadas

(padrões e testes) foram diluídas em dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração

de 20 mg/mL. Após sucessivas diluições do extrato e das frações em meio de

cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se concentração de 2000 μg/mL. A

partir dessa concentração foi retirada uma alíquota de 100 μL e iniciou-se a

inoculação da droga em sucessivos compartimentos com meio de cultura. As

diluições ocorreram no sentido das colunas, uma para cada droga. Ao ser

adicionada em um compartimento este era homogeneizado com a mesma pipeta,

sendo transferida uma quantidade igual a 100 μL para o poço seguinte. Dessa

forma, cada compartimento anterior tinha o dobro da concentração do posterior. O

primeiro poço da primeira coluna, portanto, ficou com a primeira droga teste numa

concentração de 1000 μg/mL, o segundo com 500 μg/mL, o terceiro com 250

μg/mL, o quarto com 125 μg/mL, o quinto com 62,5 μg/mL, o sexto com 31,75

μg/mL e o último com aproximadamente 15,85 μg/mL. As placas de microdiluição

foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi feita,

considerando o CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento

bacteriano.

A concentração mínima bactericida foi determinada retirando uma alíquota

de 10 μL (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a droga,

mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio de

cultura ágar Mueller Hinton, devidamente identificadas. A Concentração Mínima

Bactericida (CMB) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga

que impediu o crescimento visível do subcultivo.

Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente as

bactérias Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6623 e

Escherichia coli ATCC 25922, utilizando-se como padrões os antibacterianos

penicilina, vancomicina e tetraciclina, respectivamente.

3.3.2 – Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos

A avaliação utilizou o teste de susceptibilidade antifúngica pelo método de

microdiluição. Este método utiliza placas contendo 96 compartimentos, sendo

cada compartimento denominado well (poço). Foram utilizadas quatro placas para

verificar a atividade antifúngica, uma para cada espécie de fungo, juntamente com

o antifúngico padrão descrito pela literatura. Cada poço continha

aproximadamente 10 μL de caldo de cultura RPMI-1640 da Sigma® para

crescimento fúngico. As drogas utilizadas (padrão e testes) foram diluídas em

dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração de 20 mg/mL. Após sucessivas

diluições do extrato em meio de cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se

concentração de 2000 μg/mL. A partir dessa concentração foi retirada uma

alíquota de 100 μL e iniciou-se a inoculação da droga em sucessivos

compartimentos com meio de cultura. As diluições ocorreram no sentido das

colunas, uma para cada droga. Ao ser adicionada em um compartimento este era

homogeneizado com a mesma pipeta, sendo transferida uma quantidade igual a

100 μL para o poço seguinte. Dessa forma, cada compartimento anterior tinha o

dobro da concentração do posterior. O primeiro poço da primeira coluna, portanto,

ficou com a primeira droga teste numa concentração de 1000 μg/mL, o segundo

com 500 μg/mL, o terceiro com 250 μg/mL, o quarto com 125 μg/mL, o quinto com

62,5 μg/mL, o sexto com 31,75 μg/mL e o último com aproximadamente 15,85

μg/mL. As placas de microdiluição foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º

C por 24 horas. A leitura foi feita, considerando o CMI a menor concentração

capaz de inibir o crescimento fúngico.

A concentração mínima fungicida (CMF) foi determinada retirando uma

alíquota de 10 μL (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a

droga, mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio

de cultura ágar Sabourand, devidamente identificadas. A concentração mínima

fungicida (CMF) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga

que impediu o crescimento visível do subcultivo.

A droga padrão foi a micostatina e a incubação foi realizada em estufa

bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi realizada considerando a CMI a

menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico.

Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente aos fungos

Candida albicans, C. parapsilosis, C. krusei e C. tropicalis utilizando-se como

antifúngico padrão a micostatina.

3.3.3 – Avaliação da atividade antiproliferativa dos extratos brutos das folhas e suas frações, do extrato bruto dos galhos e suas frações As linhagens celulares cedidas pelo National Cancer Institute (NCI) dos

Estados Unidos da América, e utilizadas na triagem da atividade antiproliferativa

foram diluídas em dimetilsulfóxido de sódio (DMSO) na concentração de 1g/mL

resultando em soluções estoques.

Para o teste de atividade, foram plaqueados 100 μl de células em meio

RPMI/SFB/ gentamicina, nas suas respectivas densidades de inoculação, em

placas de 96 compartimentos. As placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC em

atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido, para readaptação ao ambiente. Após

esse período uma placa controle foi fixada através da adição de ácido

tricloroacético para determinação da quantidade de células no momento da adição

das drogas. Nas demais placas foram adicionadas as drogas nas concentrações

de 0,25; 2,5; 25 e 250 ug/mL e incubadas por 48 horas, centrifugadas por 3

minutos a 2000 rpm, e fixadas com 50 μl de ácido tricloroacético a 50% (TCA)

para as células aderidas e 80% para as células em suspensão (leucemia). Para

completar a fixação celular, as placas foram incubadas por 1 hora a 4ºC,

submetidas a quatro lavagens com água destilada para a remoção dos resíduos

de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários e mantidas em temperatura

ambiente até a secagem completa. As placas foram coradas pela adição de 50μl

do corante proteico sulforrodamina B (SRB) a 0,4 % (peso/volume), dissolvido em

ácido acético a 1 %, e incubadas a 4 ºC, durante 30 minutos e lavadas por 4 vezes

com uma solução de ácido acético 1%. O resíduo da solução de lavagem foi

removido das placas, as quais foram secas à temperatura ambiente. O corante

ligado às proteínas celulares foi solubilizado com uma solução de Trizma Base na

concentração de 10μM e pH 10,5 por 5 minutos em ultra-som. A leitura

espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 560 nm em um leitor de

microplacas. Para análise dos resultados, foram calculadas as médias das

absorbâncias descontadas de seus respectivos brancos, e calculada a

porcentagem de inibição de crescimento. Com os dados obtidos, foram

construídos gráficos relacionando a porcentagem de inibição de crescimento com

a concentração da substância teste. Como controle positivo foi padronizado o

quimioterápico doxorrubicina Os testes foram realizados com os extratos

brutos das folhas e galhos e frações, avaliados frente a um painel de células

tumorais humanas composto pelas linhagens apresentadas na Tabela 12. O

quimioterápico utilizado como controle foi a doxorrubicina.

Tabela 12: Linhagens de células tumorais utilizadas no teste de atividade

antiproliferativa

Código Tipo de célula tumoral K-562 Leucemia linfóide

UACC-62 Melanoma NCI-460 Pulmão tipo não pequenas células MCF-7 Mama

NCI-ADR Mama que expressa o fenótipo de resistência MDR

HT-29 Cólon OVCAR-3 Ovário

786-0 Rim PCO-3 Próstata

3.4 – Dados espectroscópicos das substâncias isoladas

3.4.1 – Substância LC-1: lup-20(29)-en-3β-ol

Fórmula molecular: C30H50O

IV ν KBr cm-1, (FIGURA 3)

max

3324 (O-H), 2917 – 2849 (C-H), 1472 – 1462 (CH2).

EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 4) [M.+ ] 426 (14,4); 411 (8,3); 281 (9,9); 219 (11,5); 218 (24,4); 208 (18,1); 207

(52,5); 203 (21,6); 191 (21,8); 190 (20,6); 189 (43,2); 176 (7,8); 175 (18,0); 173

(10,9); 163 (16,1); 162 (10,0); 161 (19,4); 149 (21,3); 148 (16,9); 147 (27,3); 145

(9,6); 137 (13,2); 136 (21,9); 135 (45,4); 134 (16,7); 133 (24,6); 123 (33,4); 122 (

21,8); 121 (47,5); 119 (32,3); 109 ( 58,9); 108 (36,0); 107 ( 55,0); 105 (31,3); 97

(16,4); 96 (18,5); 95 (78,1); 93 (62,0); 91 (29,8); 83 (23,8); 81 (79,4); 79 (44,6); 71

(24,4); 69 (73,7); 68 ( 29,7); 67 (55,1); 57 ( 32,4); 55 (87,6); 53 (16,6); 43 ( 100,0);

41 (81,5); 40 (47,2); 39 (11,0).

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 5)

4,69 (H-29; d;zsHz

2,4; 1H); 4,56 (H-29; m; 1H); 3,19 (H-3; dd;zsHz

10,8 e 5,4; 1H); 2,39 (H-19; spt; 1H); 1,91 (H-21; m; 1H); 1,88 (H-15; t;2,4; 1H);

1,68 (H-30; s; 3H); 1,66 (H-13; t; 3,0; 1H); 1,65 (H-1; 1H); 1,62 (H-12; 1H); 1,54 (H-

2; 2H); 1,49 (H-16; 2H); 1,41 (H-7; 2H); 1,41 (H-22; 1H); 1,38 (H-11; d; 1,5; 1H);

1,36 (H-18; 1H); 1,35 (H-21; m; 1H); 1,28 (H-9; 1H); 1,20 (H-11; 1H); 1,20 (H-22;

m; 1H); 1,07 (H-12; 1H); 1,03 (H-26;s; 3H); 0,99 (H-15; d; 2,1; 1H);0,97 (H-23; s;

3H); 0,94 (H-27; s; 3H); 0,88 (H-1; 1H); 0,83 (H-25; s; 3H); 0,79 (H-28; s; 3H); 0,76

(H-24; s; 3H); 0,70 (H-5; 1H).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 7)

38,6 (C-1, CH2); 27,3 (C-2, CH2); 79,0 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH);

18,2 (C-6, CH2); 34,1 (C-7, CH2); 40,7 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C);

20,8 (C-11, CH2); 25,0 (C-12, CH2); 37,9 (C-13, CH); 42,7 (C-14, C); 27,3 (C-15,

CH2); 35,5 (C-16, CH2); 42,9 (C-17, C); 48,2 (C-18, CH); 47,9 (C-19, CH); 151,1

(C-20, C); 29,7 (C-21, CH2); 39,9 (C-22, CH2); 27,8 (C-23, CH3); 15,2 (C-24, CH3);

16,0 (C-25, CH3); 15,8 (C-26, CH3); 14,4 (C-27, CH3); 17,8 (C-28, CH3); 109,3 (C-

29, CH2); 19,2 (C-30 CH3).

3.4.2 – Substância LC-2: Mistura dos compostos:

LC-2(I) 24ξ- etil- colest- 5 enol

LC-2(II)24ξ- etil- colesta- 5, 22- dienol

LC-2(III) 24ξ- metil- colest- 5 enol

EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(I) (FIGURA 10) [M.+ ] 400 (28,2); 367 (19,0); 207 (41,6); 145 (42,2); 133 (22,0); 119 (20,3); 107

(29,7); 105 (26,2); 95 (28,5); 93 (25,9); 91 (28,6); 81 (35,4); 79 (25,8); 73 (23,3); 71

(29,1); 69 (31,9); 67 (28,6); 57 (44,6); 55 (60,7); 43 (100,0); 41 (56,9); 40 (45,0).

EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(II) (FIGURA 11) [M.+ ] 412 (23,7); 281 (27,0); 255 (23,0); 207 (50,0); 159 (21,7); 145 (21,8); 133

(30,1); 119 (19,8); 109 (21,8); 107 (25,2); 105 (25,7); 97 (29,4); 95 (28,8); 93

(27,5); 91 (28,1); 83 (52,1); 81 (47,9); 79 (30,5); 73 (23,9); 71 (20,6); 69 (57,5); 67

(32,7); 57 (28,8); 55 (100,0); 43 (69,0); 41 (63,8).

EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(III) (FIGURA 12) [M.+ ] 414 (23,6); 213 (16,7); 145 (21,0); 133 (15,7); 119 (18,0); 107 (28,9); 105

(25,6); 95 (30,1); 93 (24,3); 91 (24,8); 85 (16,1); 81 (33,7); 79 (24,7); 71 (22,8); 69

(31,8); 67 (25,7); 57 (52,2); 55 (58,7); 43 (100,0); 41 (48,9).

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), Mistura LC-2 (FIGURA

13) 0,68 (H-18, 3H, LC-2 (I) e (III)); 0,69 (H-18, 3H, LC-2 (II)); 1,01 (H-19, 3H, LC-2 (I)

e (III)); 1,03 (H-19, 3H, LC-2 (II)); 0,91 (H-21, 3H, d, 6,3, LC-2 (I) e (III)); 1,03 (H-

21, 3H, LC-2 (II)); 0,85 (H-26, 3H, LC-2 (I) e (II)); 0,83 (H-26, 3H, LC-2 (III)); 0,80

(H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,79 (H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (II)); 0,83 (H-27, 3H, d,

6,3, LC-2 (III)); 0,77 (H-28, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,80 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (II));

0,85 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (III)).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), Mistura LC-2 (FIGURA 14)

37,18(C-1, CH2); 31,58(C-2, CH2); 71,79(C-3, CH); 42,25(C-4, CH2); 140,88(C-5,

C); 121,80(C-6, CH); 31,82(C-7, CH2); 31,82(C-8, CH); 50,08(C-9, CH); 36,43(C-

10, C); 20,97(C-11, CH2); 39,70(C-12, CH2); 42,25(C-13, C); 56,72(C-14, CH);

24,20(C-15, CH2); 28,15(C-16, CH2); 56,01(C-17, CH); 11,84(C-18, CH3); 19,28(C-

19, CH3); 40,20(C-20, CH); 18,92(C-21, CH3, LC-2(I) e(III)); 21,11(C-21, CH3, LC-

2(II)); 33,85(C-22, CH2, LC-2(I) e (III)); 138,42(C-22, CH, LC-2(II)); 39,70(C-23,

CH2, LC-2(I)); 129,36(C-23, CH, LC-2(II)); 28,81(C-23, CH2, LC-2(III)); 45,77(C-24,

CH, LC-2(I)); 51,19(C-24, CH, LC-2(II)); 56,01(C-24, CH, LC-2(III)); 26,00(C-25,

CH, LC-2(I)); 31,82(C-25, CH, LC-2(II)); 29,06(C-25, CH, LC-2(III)); 18,66(C-26,

CH3, LC-2(I) e (III)); 19,22(C-26, CH3, LC-2(II)); 19,70(C-27, CH3, LC-2(I) e (III));

19,22(C-27, CH3, LC-2(II)); 22,95(C-28, CH3, LC-2(I)); 25,30(C-28, CH2, LC-2(II));

18,66(C-28, CH2, LC-2(III)); 11,72(C-29, CH3, LC-2(I)); 12,12(C-29, CH3, LC-2(II)).

3.4.3 – Substância LC-3: 3β,28-diidróxilup-20(29)-ene

Fórmula molecular: C30H50O2


max

3407 e 3076 (O-H), 2942 – 2869 (C-H), 1455 (CH2), 1375 (CH3), 1106 – 1033 (=C-

H).

EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 16) [M.+ ] 456 (7,2); 411 (12,5); 248 (31,0); 234 (19,6); 220 (18,3); 207 (100,0); 203

(24,1); 190 (9,6); 189 (42,8); 175 (18,1); 147 (17,3); 137 (13,2); 135 (47,4); 123

(35,4); 122 ( 24,8); 119 (33,3); 109 ( 58,9); 107 ( 54,0); 95 (78,6); 83 (23,2); 81

(80,2); 79 (43,5); 69 (72,8); 68 ( 31,1); 57 ( 31,8); 55 (89,3); 53 (17,3); 40 (56,2); 39

(7,0).


4,68 (H-29;zsHz

1H); 4,58 (H-29; 1H); 3,78 (H-28; dd; 10,2; 1H); 3,31 (H-28; dd; 10,8; 1H); 3,18 (H-

3; dd;zsHz

10,8 e 5,1; 1H); 2,38 (H-19; m; 1H); 1,95 (H-21; m; 1H); 1,92 (H-16; 1H); 1,84 (H-

22; 1H); 1,68 (H-30; s; 3H); 1,68 (H-15; 1H); 1,64 (H-1; 1H); 1,63 (H-12; 1H); 1,62

(H-13; 1H); 1,58 (H-2; 2H); 1,57 (H-18; 1H); 1,42 (H-11; m; 1H); 1,39 (H-7; 2H);

1,26 (H-9; 1H); 1,20 (H-16; d; 2,4; 1H); 1,18 (H-11; d; 4,2; 1H); 1,05 (H-12; 1H);

1,04 (H-15; d; 2,7; 1H); 1,02 (H-22; 1H); 1,02 (H-26; s; 3H); 0,98 (H-27; s; 3H);

0,97 (H-23; s; 3H); 0,89 (H-1; 1H); 0,82 (H-25; s; 3H); 0,76 (H-24; s; 3H); 0,67 (H-

5; 1H).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 19)

38,6 (C-1, CH2); 27,2 (C-2, CH2); 78,9 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH);

18,1 (C-6, CH2); 34,1 (C-7, CH2); 40,8 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C);

20,7 (C-11, CH2); 25,0 (C-12, CH2); 37,2 (C-13, CH); 42,6 (C-14, C); 26,9 (C-15,

CH2); 26,9 (C-16, CH2); 47,7 (C-17, C); 48,6 (C-18, CH); 47,7 (C-19, CH); 150,6

(C-20, C); 29,6 (C-21, CH2); 39,8 (C-22, CH2); 27,8 (C-23, CH3); 15,2 (C-24, CH3);

15,9 (C-25, CH3); 15,8 (C-26, CH3); 14,6 (C-27, CH3); 60,5 (C-28, CH2); 109,7 (C-

29, CH2); 18,9 (C-30 CH3).

3.4.4 – Substância LC-4: 3β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5enol

Fórmula molecular: C35H60O6


5,35 (H-6; d;zsHz

1H); 5,07 (H-1’; d ; 7,8; 1H); 4,56 (H-3’; dl; 9,3; 1H); 4,45 - 4,25 (H-6’b, H-4’, H-2’;

m; 3H); 4,09 - 3,91 (H-6’a, H-5’, H-3α; m; 3H); 0,92 (H-19; s; 3H); 0,64 (H-18; s;

3H).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 22 )

37,3 (C-1, CH2); 30,0 (C-2, CH2); 78,4 (C-3, CH); 39,1 (C-4, CH2); 140,9 (C-5, C);

121,8 (C-6, CH); 31,9 (C-7, CH2); 31,8 (C-8, CH); 50,1 (C-9, CH); 36,7 (C-10, C);

21,0 (C-11, CH2); 39,7 (C-12, CH2); 42,3 (C-13, C); 56,6 (C-14, CH); 24,3 (C-15,

CH2); 28,3 (C-16, CH2); 56,0 (C-17, CH); 11,7 (C-18, CH3); 19,2 (C-19, CH3); 36,2

(C-20, CH); 18,9 (C-21, CH3); 34,0 (C-22, CH2); 26,1 (C-23, CH2); 45,8 (C-24, CH);

29,2 (C-25, CH); 18,7 (C-26, CH3); 19,7 (C-27, CH3); 23,1 (C-28, CH2); 11,9 (C-29,

CH3); 102,5 (C-1' CH); 75,2 (C-2’, CH); 77,9 (C-3’, CH); 71,5 (C-4’, CH); 78,3 (C-5’,

CH); 62,6 (C-6’, CH2).

3.4.5 – Substância LC-5: 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-benzopiran-

3,5,7-triol. Fórmula molecular: C15H14O6


max

3324 (O-H), 1628 (C = C), 1148 (C-O)

EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 24) [M.+ ] 290 (14,0); 272 (44,2); 258 ( 17,0); 164 ( 45,3); 152 (36,4); 139 (100,0); 123

(45,4); 110 (6,6); 64 (13,6); 44 (17,6);39 (6,7).

RMN 1H (CD3OD, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 25)

6,96 (H-2’; d;zsHz

1,8; 1H); 6,80 (H-6’; dd; 1,8; 1H); 6,76 (H-5’; d; 1H); 5,91 (H-6; d; 2,1; 1H); 5,93

(H-8; d; 2,4; 1H); 4,80 (H-2; m;zsHz

1H); 4,17 (H-3; m; 1H); 2,69 (H-4b; dd; 16,8 e 3,0; 1H); 2,87 (H-4a; dd; 16,8 e 4,5;

1H).

RMN 13C (CD3OD, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURAS 26)

79,9 (C-2, CH); 67,5 (C-3, CH); 29,2 (C-4a e C-4b, CH2); 157,8 (C-5, C); 96,4 (C-6,

CH); 158,2 (C-7, C); 95,9 (C-8, CH); 157,5 (C-9, C); 100,1 (C-10, C); 132,2 (C-1’,

C); 115,4 (C-2’, CH); 145,9 (C-3’, C); 146,1 (C-4’, C); 116,0 (C-5’, CH); 119,5 (C-6’,

CH).

3.4.6 – Substância LC-6: (siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-bis-β-D-glicosídeo-3’,5’-

dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo).

Fórmula molecular:

EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 27) 135 (36,5); 76 (19,2); 75 (100,0); 73 (82,7); 69 (12,2); 60 (84m0); 57 (36,1); 45

(48,2); 44 (47,2); 43 (55,5); 42 (18,0); 41 (11,4).

RMN 1H (D2O, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 28)

6,82 (H-2 e H-6; s;zsHz

2H); 4,90 (H-7; d; 5,1; 1H); 3,32 (H-8, m; 1H); 4,34 (H-9; m; 1Hb); 3,99 (H-9; dd;

7,2; 1Ha); 3,51 (H-10; 1H); 3,88 (OCH3; s; 6H); 5,03 (H-1’; d; 7,2; 1H); 3,84 (H-5’;

dd; 12,0 e 6,0; 1Hb); 3,73 (H-5’; dd; 12,6 e 5,4; 1Ha); 3,57 (H-2’; d; 1,8; 1H); 3,54

(H-4’; 1H); 3,36 (H-3’; d; 1H).

RMN 13C (D2O, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 29)

141,1 (C-1; C); 106,9 (C-2 e C-6; CH); 155,9 (C-3 e C-5; C); 136,0 (C-4; C); 88,7

(C-7; CH); 56,2 (C-8; CH); 74,7 (C-9; CH2); 72,3 (C-10; CH); 103,1 (C-11; C); 59,2

(2x OCH3); 105,9 ( C-1’; CH); 79,3 (C-4’; CH); 78,7 (C-3’; CH); 76,4 (C-2’; CH);

63,5 (C-5’; CH2).

3.4.7 – Substância LC-7: 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-

hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona Fórmula molecular: C21H20O10


max

3381 e 3237 (O-H), 1652 (C=O), 1614 (C = C), 1189 (C -O)

EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 36) [M.+ ] 432 (0,6); 414 (12,1); 378 (6,7); 342 ( 6,0); 324 (5,9); 323 (5,7); 312 (6,3);

310 (6,6); 294 ( 8,3); 284 ( 19,7); 283 (100,0); 270 (18,0); 254 (7,7); 165 (37,6);

123 (7,6); 121 (13,4); 119 (7,1); 118 (12,6); 93 (7,7); 89 (7,8); 69 (24,9); 65 (8,9);

63 (8,6); 61 (12,3); 60 (11,8); 55 (17,3); 53 (10,4); 51 (8,5); 44 (14,7); 43 (33,2); 42

(12,1); 39 (13,9).

RMN 1H (DMSO, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 37)

8,02 (H-2’e H-6’; d;zsHz

8,4; 2H); 6,89 (H-3’ e H-5’; d; 8,4; 2H); 6,77 (H-3, s; 1H); 6,26 (H-6; s; 1H); 4,69

(H-1”; d; 9,9; 1H); 3,78 (H-2”; nd; 1H).

RMN 13C (DMSO, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 38)

164,5 (C-2, C); 102,8 (C-3, CH); 182,6 (C-4, C); 160,9 (C-5, C); 98,5 (C-6, CH);

163,0 (C-7, C); 104,4 (C-8, C); 156,5 (C-9, C); 105,0 (C-10, C); 122,0 (C-1’, C);

129,4 (C-2’, CH) 116,3 (C-3’, CH); 161,6 (C-4’, C); 116,3 (C-5’, CH); 129,4 (C-6’,

CH); 73,7 (C-1”, CH); 71,2 (C-2”, CH); 78,9 (C-3”, CH); 70,8 (C-4”, CH); 82,1 (C-5”,

CH); 61,6 (C-6”, CH2).

4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 – Método de extração e isolamento dos constituintes químicos de L.

candicans

O estudo químico de L. candicans iniciou-se com a preparação do extrato

bruto metanólico dos galhos e folhas (em separado) por remaceração à

temperatura ambiente. Pelo fato dessa espécie ser muito rica em taninos, optou-

se por submeter o extrato bruto dos galhos a um pré – fracionamento em coluna

de silica gel obtendo-se oito frações, denominadas de LCG-1, LCG-2, LCG-3,

LCG-4, LCG-5, LCG-6, LCG-7 e LCG-8 (frações Hexano, Hex./CHCl3 50% ,

Hex./CHCl3 75%, CHCl3, CHCl3/MeOH 25%, CHCl3/MeOH 50%, CHCl3/MeOH

75%, MeOH, respectivamente).

A fração LCG-4 foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 15

frações, sendo que dessas frações foram isolados três substâncias denominadas

LC-1, LC-2 e LC-3.

A fração LCG-5 também foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se

15 frações, tendo sido isolada a substância denominada LC-4.

Da fração LCG-6 foi isolada a substância LC-5, através de CC em sílica gel

e da fração LCG-7 após CC em sílica gel foi isolada a substância LC-6.

O extrato bruto das folhas também foi submetido a um pré – fracionamento

em coluna de sílica gel obtendo-se quatro frações denominadas de LCF-1, LCF-2,

LCF-3 e LCF-4 (frações Hexano, AcOEt, CHCl3 e MeOH, respectivamente).

A fração LCF-2 foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 8

frações(LCF-1 a LCF-8), sendo que dessas frações foram isolados mais

quantidade das substâncias LC-1 e LC-2 e detectado a presença de LC-3. As

frações LCF2-6 e LCF-2.7 por serem semelhantes foram reunidas e submetidas a

uma CC em sílica gel, obtendo-se 5 novas frações. Esta fração foi denominada

LCF-2.6. A fração LCF-2.6.3, por apresentar fluorescência sob luz ultravioleta no

comprimento de onda λ = 254 nm, foi submetida a uma CC em silica gel, obtendo-

se 4 frações (LCF-2.6.a a LCF-2.6.d). A fração LCF-2.6.3b, por apresentar perfil

cromatográfico menos complexo foi submetida a uma cromatografia em camada

delgada preparativa (CCDP). Foram retirados quatro faixas sendo que apenas

uma apresentou quantidade suficiente para análises espectroscópicas, a qual foi

denominada LCF-2.6b (4,0mg). Os dados de RMN de 1H e de 13C de LCF-2.6b

demonstraram que a substância estava impura, sendo que no processo de

purificação não houve quantidade de massa suficiente para continuação dos

estudos.

A fração LCF-3 foi evaporada à secura e ao ser solubilizada em metanol

houve a formação de um precipitado de coloração amarela, o qual foi denominado

de LC-7.

As demais frações não foram estudas ou por apresentarem pouca massa

ou devido à presença de taninos que dificultam muito o trabalho.

4.2 – Determinação estrutural dos compostos isolados

4.2.1 – Substância LC-1

A substância LC-1(35) (16,0mg) foi isolada da fração clorofórmica através

de coluna cromatográfica, como um sólido branco solúvel em clorofórmio.

(35)

O espectro no IV (Figura 3) apresentou banda de absorção em 3330 cm –1 referente a estiramento de ligação OH, em 2917 a 2849 cm –1 referente a

deformação axial de ligação C-H, e deformação angular de grupos metilenos em

1472 a 1462 cm –1.

29

24 23HO

26

27

28

25

3

11

5 7

15

13

3021

2218

17

1 9

2019

FIGURA 3 – Espectro no IV de LC-1

O espectro de massas de baixa resolução, obtido por inserção direta via

sólido (Figura 4), apresentou o pico base em m/e 43, relativo a uma clivagem da

cadeia lateral α ao anel com rearranjo e ganho de um hidrogênio (Silverstein e

col.,1994), e o pico do íon molecular em m/e 426 [M.+]. Verifica-se ainda os picos

em m/e 218[M.+] - [C14H23O]+, correspondendo a uma possível clivagem nos

carbonos C-8/C-14 e C-9/C-11(Esquema 3), e ainda um pico em m/e 191[207 –

OH/ + H]+ com transferência de um hidrogênio através de rearranjo (Branco &

Pizzoletti, 2002).

FIGURA 4 – Espectro de massas (70 eV) de LC-1

m/e 207 m/e 218

HO

m/e 426

HO

H

H

H HO

HO

Esquema 3- Provável fragmentação de LC-1

O espectro de RMN de 1H (Figura 5) de LC-1 apresentou sinais de

hidrogênios vinílicos em δ 4,56(dd) e δ 4,69 (d; J=2,4Hz), referentes aos

hidrogênios H-29 da ligação dupla terminal. O duplo dubleto em δ 3,18

(J =5,4 e 10,8Hz) é relativo ao hidrogênio carbinólico H-3, estes acoplamentos

indicaram a presença de β-configuração, e os sinais em δ 0,76 a δ 1,68 são

referentes aos metilas. Os dados de RMN de 1H de LC-1 (Tabela 13) foram

comparados com os dados da literatura para o lupeol, isolado da espécie

Clathrotropis branchypetala por Reynolds e col. (1986).

Tabela 13: Dados de RMN 1H de LC-1 e do lupeol (Reynolds e col.,1986).

Hidrogênio LC-1a δ 1H, mult. (no H, J)

Lupeolb δ 1H, multiplicidade

H-1 0,88, m (1H), 1,65, m (1H) 0,91, 1,68 H-2 1,54, m (2H) 1,54, q, 1,61, d H-3 3,18, dd (1H, 5,4 e 10,8) 3,18, dd H-5 0,70, m (1H) 0,69, d H-6 * 1,39, q, 1,54, d H-7 1,41, m (2H) 1,41, m H-9 1,28, m (1H) 1,28, d H-11 1,20, m (1H), 1,38, d (1H, 1,5) 1,25, q, 1,42, d H-12 1,07, m (1H), 1,62, m (1H) 1,07, q, 1,68, d H-13 1,66, t (1H, 3,0) 1,67, t H-15 0,99, d (1H, 2,1), 1,88, t (1H ,2,4) 1,01, d, 1,71, t H-16 1,49, m (2H) 1,38, t, 1,49, d H-18 1,36, m (1H) 1,37, t H-19 2,37, m (1H) 2,39, m H-21 1,35, m (1H), 1,91, m (1H) 1,33, m, 1,93, m H-22 1,20, m (1H), 1,41, m (1H) 1,20, m, 1,42, m

H-23 0,97, s (3H) 0,98, s H-24 0,76, s (3H) 0,77, s H-25 0,83, s (3H) 0,84, s H-26 1,03, s (3H) 1,04, s H-27 0,94, s (3H) 0.97, s H-28 0,79, s (3H) 0,79, s H-29 4,69, d (1H ,2,4), 4,50, m (1H) 4,69, m, 4,56, m H-30 1,68, s (3H) 1,69, s

a- RMN de 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN de 1H (CDCl3, 400MHz); As constantes

de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz. * Sinal encoberto.

As correlações entre os hidrogênios vinílicos foram confirmadas

através do mapa de contornos COSY (Figura 6) (Tabela 14). Este experimento

mostra também a correlação entre o duplo dubleto em δ 4,56 (H-29) e o metila em

δ 1,68(H-30). O septeto em δ 2,37 (H-19) está correlacionado com o sinal em δ

1,35 (Ha-21), que correlaciona - se com o sinal em δ 1,91 (Hb-21).

FIGURA 5 – Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-1

Tabela 14: Correlações observadas nos mapas de contornos HETCOR (13C x 1H )

e COSY (1H x 1H) da substância LC-1.

Carbono δ 13C / DEPT HETCOR (13C x1H)δ 1H

COSY (1H x1H) δ 1H

C-1 38,6(CH2) 0,88; 1,65

C-2 27,3(CH2) 1,54 3,18

C-3 79,0 (CH) 3,18 1,54

C-5 55,2(CH) 0,70

C-7 34,1(CH2) 1,41

C-9 50,3(CH) 1,28

C-11 20,8 (CH2) 1,20; 1,38

C-12 25,0 (CH2) 1,07; 1,62

C-13 37,9(CH) 1,66

C-15 27,3(CH2) 0,99

C-18 48,2(CH) 1,36

C-19 47,9 (CH) 2,37 1,35

C-21 29,7(CH2) 1,35; 1,91 1,91; 1,35

C-22 39,9 (CH2) 1,41

C-23 27,8(CH3) 0,97

C-24 15,2(CH3) 0,76

C-25 16,0(CH3) 0,83

C-26 15,8(CH3) 1,03

C-27 14,4(CH3) 0,94

C-28 17,8(CH3) 0,79

C-29 109,3 (CH2) 4,69; 4,56 4,56; 4,69

C-30 19,2 (CH3) 1,68 4,56

FIGURA 6 – Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-1

No espectro de RMN de 13C e DEPT (Figura 7) observa-se os sinais em δ

109,3 (C-29) e δ 151,1 (C-20), referentes a dupla terminal. O sinal em δ 79,0

corresponde ao metino carbinólico C-3, e os sinais da região de δ 14,4 a 27,8,

são atribuídos aos metilas C-23 a C28 e C-30. Os dados de RMN de 13C de LC-1

foram comparados com os dados da literatura para o lupeol, segundo Reynolds e

col.(1986), conforme Tabela 15.

Tabela 15: Dados de RMN 13C / DEPT de LC-1 e do lupeol (Reynolds e

col.,1986).

nº carbono (DEPT) LC-1a

δ13C Lupeolb

δ13C 1(CH2) 38,6 38,7 2(CH2) 27,3 27,4 3(CH) 79,0 78,9 4(C) 38,7 38,8

5(CH) 55,2 55,3 6(CH2) 18,2 18,3 7(CH2) 34,1 34,2 8(C) 40,7 40,8

9(CH) 50,3 50,4 10(C) 37,0 37,1

11(CH2) 20,8 20,9 12(CH2) 25,0 25,1 13(CH) 37,9 38,0 14(C) 42,7 42,8

15(CH2) 27,3 27,4 16(CH2) 35,5 35,5 17(C) 42,9 43,0

18(CH) 48,2 48,2 19(CH) 47,9 47,9 20(C) 151,1 150,9

21(CH2) 29,7 29,8 22(CH2) 39,9 40,0 23(CH3) 27,8 28,0 24(CH3) 15,2 15,4 25(CH3) 16,0 16,1 26(CH3) 15,8 15,9 27(CH3) 14,4 14,5 28(CH3) 17,8 18,0 29(CH2) 109,3 109,3 30(CH3) 19,2 19,3

a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (CDCl3, 14,5MHz)

FIGURA 7 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz, CDCl3)

de LC-1

O mapa de contornos HETCOR (13Cx1H) (Figura 8) mostra a correlação

dos sinais dos hidrogênios em δ 4,56 e δ 4,69 com o sinal de carbono em δ

109,3. O sinal de carbono em δ 38,6 está correlacionado com os sinais em δ

0,88 e 1,65 e o duplo dubleto em δ 3,18 correlaciona-se com o sinal em δ

79,0. Os sinais em δ 27,8, 15,2, 16,0 ,15,8, 14,4, 17,8 e 19,2 estão

correlacionados com os singletos em δ 0,97, 0,76, 0,83, 1,03, 0,94, 0,79 e 1,68,

respectivamente. Os dados obtidos nos mapas de contorno COSY (1Hx1H) e

HETCOR (13Cx 1H), confirmam as principais atribuições de LC-1.

FIGURA 8 – Mapa de contornos 1Hx13C HETCOR (75 MHz, CDCl3) de LC-1

Após análise dos dados espectrais e da comparação com os dados da

literatura, conclui-se que a substância LC-1 trata-se de um triterpeno da série dos

lupanos, o lupeol (lup-20(29)-en-3β-ol).


A mistura LC-2 (36) foi isolada da fração clorofórmica do extrato bruto dos

galhos como cristais brancos (16mg) solúveis em clorofórmio.

(36)

No cromatograma obtido na análise por CG/EM de LC-2 observa-se a

existência de três substâncias (Figura 9), com tempos de retenção de 35,81 min.,

36,98 min. e 39,60 min. O espectro de massas para a substância com o tempo de

retenção 35,81 min. (Figura 10), apresenta o pico do íon molecular em m/e 400

[M.+], e o pico base em m/e 43. Para a substância com tempo de retenção 36,98

min. (Figura 11), o pico do íon molecular ocorre em m/e 412[M.+] e o pico base em

m/e 55, enquanto que para a substância com tempo de retenção 39,60 min.

(Figura 12), os mesmos ocorrem em m/e 414[M.+] e em m/e 43.

(I) R=

(II) R=

(III) R=

HO

R

1

2

3

45

6

7

89

10

11

12

13

14 15

17 1618

19

20

2122

2324

25

26

27

28

21

21

20

20

22

22

23

2324

24 25

25

26

26

27

27

28

28 29

29

FIGURA 9 – Cromatograma da mistura LC-2

FIGURA 10 – Espectro de massas (70 eV) de LC-2 (I)

FIGURA 11 – Espectro de massas (70 eV) de LC-2 (II)

FIGURA 12 – Espectro de massas (70 eV) de LC-2 (III)

O espectro de RMN de 1H (Figura 13) de LC-2 apresenta dois multipletos

na região de hidrogênios olefínicos, sendo o sinal entre δ 5,35 a 5,37 atribudo ao

hidrogênio H-6 e o sinal na região de δ 4,97 a 5,19 correspondente aos

hidrogênios H-22 e H-23. O multipleto em δ 3,47 a 3,58 é atribuido ao hidrogênio

carbinólico H-3, e os sinais entre δ 0,68 a 1,03 são referentes aos metilas.


Os deslocamentos químicos observados nos espectros de RMN de 13C e

DEPT (Figura 14), para a mistura LC-2 foram comparados com os dados

existentes na literatura (Goulart e col., 1993) para a mistura de esteróides

pertencentes a classe Δ5, 24α- etil- colest- 5 enol(sitosterol) (a), 24α- etil- colesta-

5, 22- dienol(estigmasterol) (b) e 24ξ- metil- colest- 5 enol (c), conforme Tabela

16, devido ao deslocamento químico do C-19 (δ 19,39) dos mesmos ocorrer na

mesma região que os da mistura LC-2 (C-19=δ 19,28). O deslocamento químico

do C-19 dos esteróides da classe Δ7 ocorre em δ 13,2.


de LC-2

Tabela 16: Dados de RMN de 13C / DEPT da mistura LC-2 (isolada) e da mistura

24α- etil- colest- 5 enol(sitosterol) (a), 24α- etil- colesta- 5, 22-

dienol(estigmasterol) (b) e 24ξ- metil- colest- 5 enol (c) (Goulart e col., 1993).

Nº carbono

Misturaa

δ13C (DEPT) LC-2(I) LC-2(II) LC-2(III)

Misturab

δ13C (a) (b) (c)c

1 37,18(CH2) 37,18(CH2) 37,18(CH2) 37,25 37,25 37,24 2 31,58(CH2) 31,58(CH2) 31,58(CH2) 31,64 31,64 31,64 3 71,79(CH) 71,79(CH) 71,79(CH) 71,89 71,89 71,80 4 42,25(CH2) 42,25(CH2) 42,25(CH2) 42,29 42,29 42,27 5 140,88(C) 140,88(C) 140,88(C) 140,73 140,73 140,74 6 121,80(CH) 121,80(CH) 121,80(CH) 121,72 121,72 121,71 7 31,82(CH2) 31,82(CH2) 32,82(CH2) 31,89 31,89 31,90 8 31,82(CH) 31,82(CH) 31,82(CH) 31,89 31,89 31,88 9 50,08(CH) 50,08(CH) 50,08(CH) 50,12 50,12 50,12 10 36,43(C) 36,43(C) 36,43(C) 36,40 36,40 36,50 11 20,97(CH2) 20,97(CH2) 20,97(CH2) 21,08 21,08 21,08 12 39,70(CH2) 39,70(CH2) 39,70(CH2) 39,78 39,68 39,76 13 42,25(C) 42,25(C) 42,25(C) 42,29 42,29 42,20 14 56,72(CH) 56,72(CH) 56,72(CH) 56,75 56,87 56,75 15 24,20(CH2) 24,20(CH2) 24,20(CH2) 24,30 24,38 24,29 16 28,15(CH2) 28,15(CH2) 28,15(CH2) 28,24 28,24 28,24 17 56,01(CH) 56,01(CH) 56,01(CH) 56,05 55,93 56,04 18 11,84(CH3) 11,84(CH3) 11,84(CH3) 11,87 11,87 11,84 19 19,28(CH3) 19,28(CH3) 19,28(CH3) 19,38 19,38 19,38 20 36,10(CH) 40,20(CH) 36,10(CH) 36,16 40,50 36,13 21 18,92(CH3) 21,11(CH3) 18,92(CH3) 19,03 21,20 18,97 22 33,85(CH2) 138,42(CH) 33,85(CH2) 33,94 138,40 33,69 23 39,70(CH2) 129,36(CH) 28,81(CH2) 39,12 129,27 28,91 24 45,77(CH) 51,19(CH) 56,01(CH) 45,83 51,23 56,08 25 26,00(CH) 31,82(CH) 29,06(CH) 26,03 31,89 29,69 26 18,66(CH3) 19,22(CH3) 18,66(CH3) 18,76 19,00 18,76 27 19,70(CH3) 19,22(CH3) 19,70(CH3) 19,81 19,00 19,81 28 22,95(CH3) 25,30(CH2) 18,66(CH2) 23,06 25,42 18,24 29 11,72(CH3) 12,12(CH3) 11,99 12,27

a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (CDCl3, 50,3MHz); c- RMN de 13C

(CDCl3, 75,5MHz);

Os epímeros correspondentes de a, b e c podem ser diferenciados através

dos dados de RMN de 1H dos metilas. Nas Tabelas 17, 18 e 19, estão os valores

dos deslocamentos químicos de RMN de 1H dos metilas da mistura LC-2 e os

dados da literatura para o 24α- metil- colest- 5 enol(campesterol) e 24β- metil-

colest- 5 enol(22,23-diidrobrassicasterol) (Rubinstein e col., 1976), do 24α- etil-

colest- 5,22-dienol(estigmasterol) e 24β- etil- colest- 5,22- dienol(poriferasterol)

(Akihisa e col., 1988), e do 24α- etil- colest- 5- enol(sitosterol) e 24β- etil- colest- 5-

enol(clionasterol) (Thompson e col., 1972), respectivamente.

Tabela 17: Dados de RMN de 1H para os metilas de LC-2(I) e do 24α- metil-

colest- 5 enol(campesterol) e 24β- metil- colest- 5 enol(22,23-diidrobrassicasterol)

(Rubinstein e col., 1976).

Metila LC-2(I)a δ 1H, mult. (J)

24αb δ 1H

24βb δ 1H

18 0,680 0,680 0,678

19 1,010 1,007 1,009

21 0,911, d (J= 6,3) 0,911 0,919

26 0,846, d (J= 6,6) 0,850 0,852

27 0,803, d (J= 6,6) 0,802 0,783

28 0,772, d (J= 6,6) 0,773 0,775

a-RMN de 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN de 1H (CDCl3, 200MHz); As constantes

de acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz.

Tabela 18: Dados de RMN de 1H para os metilas de LC-2(II) e do 24α- etil- colest-

5,22-dienol(estigmasterol) e 24β- etil- colest- 5,22- dienol(poriferasterol) (Akihisa e

col., 1988).

Metila LC-2(II)a

δ 1H, mult. (J) 24αb

δ 1H, mult. (J) 24βb

δ 1H, mult. (J) 18 0,699 0,697, s 0,695, s

19 1,033 1,021, s 1,021, s

21 1,033 1,021, d (J= 6,6) 1,025, d (J= 6,6)

26 0,846, d (J= 6,6) 0,846, d (J= 6,6) 0,844, d (J= 6,0)

27 0,786, d (J= 6,6) 0,796, d (J= 7,1) 0,792, d (J= 6,6)

29 0,803, d (J= 6,6) 0,805, t (J= 7,4) 0,812, t (J= 7,4)



Tabela 19: Dados de RMN de 1H para os metilas de LC-2(III) e do 24α- etil-

colest- 5- enol(sitosterol) e 24β- etil- colest- 5- enol(clionasterol)(Thompson e col.,

1972).

Metila LC-2(III)a

δ 1H, mult. (J) 24αb

δ 1H, mult. 24βb

δ 1H, mult. 18 0,680 0,678 0,680

19 1,010 1,010 1,013

21 0,911, d (J = 6,3) 0,922 0,929

26 0,825, d (J = 6,3) 0,834 0,831

27 0,825, d (J = 6,3) 0,834 0,831

29 0,846, d (J = 6,6) 0,846 0,747



O sinal do metila 27 de LC-2(I) ocorre em δ 0,803, Tabela 17, enquanto que

para o 24α- metil- colest- 5 enol(campesterol) encontra-se em δ 0,802, e para o e

24β- metil- colest- 5 enol(22,23-diidrobrassicasterol) em δ 0,783 (Rubinstein e col.,

1976), sugerindo que LC-2(I) pode ser o campesterol.

Para o 24α- etil- colesta- 5,22-dienol(estigmasterol), o sinal do metila 29 é

observado em δ 0,805, Tabela 18, e para o 24β- etil- colest- 5,22-

dienol(poriferasterol) em torno de δ 0,812 (Akihisa e col., 1988), enquanto que o

metila 29 de LC-2(II) ocorre em δ 0,803, portanto semelhante ao estigmasterol.

Os deslocamentos dos metilas 21 (δ 0,911) e 29 (δ 0,846) de LC-2(III), ao

serem comparados com os dos esteróides 24α- etil- colest- 5- enol(sitosterol) e

24β- etil- colest- 5- enol(clionasterol), metila 21 (24α- δ 0,922 , 24β- δ 0,929) e

metila 29 (24α- δ 0,846, 24β- δ 0,747) (Garg & Nes, 1986), Tabela 19,

apresentaram semelhanças com o sitosterol.


A substância LC-3 (37) (12,0mg) foi isolada da fração clorofórmica (LCG-4)

como um sólido branco solúvel em clorofórmio.

(37)

O espectro no IV apresentou uma banda forte de absorção em 3407cm-1 e

outra fraca em 3076cm-1, indicando a presença de dois grupos hidroxila. Na região

de 2942 a 2869 cm-1 apresentou deformação axial de ligação C-H, em 1455 cm-1

uma banda de deformação angular de grupo metileno, em 1375 cm-1 uma banda

de deformação angular de grupo metila, e na região de 1106 a 1033 cm-1

apresentou estiramento de grupo vinílico (=C-H) (Figura 15).

29

24 23OH

26

27

CH2OH25

3

11

5 7

15

13

3021

2218

17

1 9

2019

28

FIGURA 15 – Espectro no IV de LC-3 O espectro de massas obtido na análise por CG/EM, apresentou o pico do

íon molecular em m/e 456 [M.+] (Figura 16), e o pico base em m/e 207 [M.+ -

248]+, o qual sugere uma clivagem nos carbonos C-8/C-14 e C-9/C-11.


O espectro de RMN de 1H (Figura 17) de LC-3 apresentou em δ 4,58 e δ

4,68, sinais de hidrogênios vinílicos referentes aos hidrogênios H-29 da ligação

dupla terminal. O sinal na região de δ 3,18 (dd; 5,1 e 10,8 Hz) é relativo ao

hidrogênio carbinólico H-3, cujos acoplamentos indicaram a presença de β-

configuração, e os dos metilas ocorrem entre δ 0,97 a δ 1,68.

Os dois dubletos de dubletos em δ 3,78 (dd; 10,2 e 3,9 Hz) e δ 3,31

(dd;10,8 e 3,0 Hz), e a desproteção nos hidrogênios H-16 (δ 1,20 e 1,92) e H-22

(δ 1,02 e 1,84 ), em relação aos de LC-1, evidenciam a presença de um metileno

carbinólico em LC-3 no lugar do metila-28 de LC-1. Os dados de RMN de 1H de

LC-3 foram comparados com os dados da literatura para a betulina, isolado da

espécie Salacia cordata, (Tinto e col. 1992) (Tabela 20).

Tabela 20: Dados de RMN 1H de LC-3 e da betulina (Tinto e col. 1992)


Betulinab δ 1H, multiplicidade

H-1 1,64, m (1H); 0,89, m (1H) 1,65; 0,89 H-2 1,58, m (2H) 1,58 H-3 3,18, dd (1H; 5,1 e 10,8) 3,18 H-5 0,67, d (1H; 9,0) 0,67 H-6 * 1,52; 1,38 H-7 1,39, m (2H) 1,39 H-9 1,26, m (1H) 1,27 H-11 1,42, m (1H); 1,18, d (1H; 4,2) 1,41; 1,19 H-12 1,63, m (1H); 1,05, m (1H) 1,63; 1,03 H-13 1,62, m (1H) 1,64 H-15 1,68, m (1H); 1,04, d (1H; 2,7) 1,70; 1,04 H-16 1,92, m (1H); 1,20, d (1H; 4,2) 1,93; 1,20 H-18 1,57, m (1H) 1,57 H-19 2,38, m (1H) 2,38 H-21 1,95, m (2H) 1,95; 1,40 H-22 1,84, d (1H; 3,3); 1,02, m (1H) 1,86; 1,02 H-23 0,97, s (3H) 0,96 H-24 0,76, s (3H) 0,76 H-25 0,82, s (3H) 0,82 H-26 1,02, s (3H) 1,02 H-27 0,98, s (3H) 0,98 H-28 3,78, dd (1H;3,9 e 10,2); 3,31, dd (1H;3,0

e 10,8) 3,77; 3,31

H-29 4,68, m (1H); 4,58, m (1H) 4,68; 4,58 H-30 1,68, s (3H) 1,68



* sinal encoberto


Os assinalamentos dos deslocamentos químicos destes hidrogênios de

LC-3 podem ser confirmados pelos dados obtidos no experimento COSY (1Hx1H)

(Figura 18) (Tabela 21)., onde observa-se as correlações entre o duplo dubleto

em δ 3,18 (H-3) e o metileno em δ 1,58 (H-2), o metila em δ 0,82 (H-25) e o

metileno em δ 1,64 (H-1) e o metino em δ 1,26 (H-9), e entre H-9 e o metila (H-26).

Destaca-se também as correlações entre os hidrogênios vinílicos H-29 da dupla

terminal (δ4,68 e δ 4,58), o sinal em δ 4,58 (H-29) e o metila em e δ 1,68 (H-30) e

o sinal dos metilas em δ 0,97 (H-23) com δ 0,76 (H-24).

FIGURA 18 – Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-3 Tabela 21: Correlações observadas nos mapas de contorno HETCOR (13C x 1H)

e COSY ( 1H x 1H) da substância LC-3.

Carbono LC-3

δ13C (DEPT)

HETCOR ( 13C x 1H)

δ 1H

COSY (1H x 1H)

δ 1H

C-1 38,6 (CH2) 1,64; 0,89 0,89; 1,64; 0,82

C-2 27,2 (CH2) 1,58 3,18

C-3 78,9 (CH) 3,18 1,58

C-5 55,2 (CH) 0,67

C-7 27,2 (CH2) 1,39

C-9 50,3 (CH) 1,26 0,82; 1,02

C-11 20,7 (CH2) 1,42; 1,18

C-12 25,0 (CH2) 1,63; 1,05

C-13 37,2 (CH) 1,62

C-15 26,9 (CH2) 1,68; 1,04 1,92

C-16 29,0(CH2) 1,92; 1,20 1,20; 1,92; 1,68

C-18 48,6 (CH) 1,57 2,38

C-19 47,7 (CH) 2,38 1,57

C-21 29,6 (CH2) 1,95

C-22 33,8 (CH2) 1,84; 1,02 1,02; 1,84

C-23 27,8 (CH3) 0,97 0,76

C-24 15,2 (CH3) 0,76 0,97

C-25 15,2 (CH3) 0,82 1,64; 1,26

C-26 15,8 (CH3) 1,02 1,26

C-27 14,6 (CH3) 0,98

C-28 60,5 (CH2) 3,78; 3,31 3,31; 3,78

C-29 109,7 (CH2) 4,68; 4,58 4,58; 4,68

C-30 18,9 (CH3) 1,68 4,58

No espectro de RMN de 13C e DEPT (Figura 19) observa-se os sinais em δ

109,7 referente ao metileno C-29 da dupla terminal, em δ 78,9 ao metino

carbinólico C-3, em δ 60,5 ao metileno carbinólico C-28 e na região entre δ 14,6 a

27,8, aos metilas. Os dados de RMN de 13C foram comparados com os dados da

literatura para a betulina, segundo Tinto e col., (1992), (Tabela 22).

Tabela 22: Dados de RMN de 13C / DEPT de LC-3 e da betulina (Tinto e

col.1992).

Nº carbono (DEPT) LC-3a

δ 13C Betulinab

δ 13C 1(CH2) 38,6 38,7 2(CH2) 27,2 27,2 3(CH) 78,9 78,9 4(C) 38,7 38,8

5(CH) 55,2 55,3 6(CH2) 18,1 18,3 7(CH2) 34,1 34,3 8(C) 40,8 40,9

9(CH) 50,3 50,4 10(C) 37,0 37,2

11(CH2) 20,7 20,8 12(CH2) 25,0 25,3 13(CH) 37,2 37,3 14(C) 42,6 42,7

15(CH2) 26,9 27,0 16(CH2) 29,0 29,2 17(C) 47,7 47,8

18(CH) 48,6 48,8 19(CH) 47,7 47,8 20(C) 150,6 150,6

21(CH2) 29,6 29,8 22(CH2) 33,8 34.0 23(CH3) 27,8 27,9 24(CH3) 15,2 15,4 25(CH3) 15,9 16,1 26(CH3) 15,8 15,9 27(CH3) 14,6 14,8 28(CH2) 60,5 60,2 29(CH2) 109,7 109,6 30(CH3) 18,9 19,1

a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (CDCl3, 100,6MHz)

No mapa de contornos HETCOR (13C x 1H) foram verificadas as correlações

entre o metileno carbinólico C-28 (δ 60,5) e os dois dubletos de dubleto em δ 3,78

e δ 3,31; entre o metileno C-29 (δ 109,7) da ligação dupla terminal e os

hidrogênios em δ 4,68 e δ 4,58; entre o metino carbinólico C-3 (δ 78,9) e o duplo

dubleto em δ 3,18 (Figura 20). As demais correlações dos mapas de contornos

COSY e HETCOR estão representadas na Tabela 21.


de LC-3

FIGURA 20 – Mapa de contornos 1Hx13C HETCOR (75 MHz, CDCl3) de LC-3

Após análise dos dados espectrais e comparação com os dados da

literatura, conclui-se que a substância (37) trata-se de um triterpeno da série dos

lupanos, a betulina (3β,28-Diidróxilup-20(29)-ene).


A substância LC-4 (38) foi isolada da fração LCG-5 como um sólido branco

(18,0 mg), solúvel em clorofórmio.

(38)

No espectro de RMN de 1H (Figura 21), observa-se os sinais referentes aos

metilas entre δ 0,64 a 0,98. Os sinais dos hidrogênios carbinólicos da unidade

glicosídica foram observados na região entre δ 3,91 a 4,98. Em δ 5,07 encontra-se

um dubleto largo atribuído ao hidrogênio anomérico (H-1’), com constante de

acoplamento de 7,8 Hz, indicando a β-configuração. O dubleto em δ 5,35

corresponde ao hidrogênio H-6 da dupla ligação, e o sinal do hidrogênio

carbinólico H-3α encontra-se na região de δ 3,91 a 4,09, entre os sinais dos

hidrogênios do açúcar. Os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H de

LC-4 foram comparados com os dados da literatura (Matida e col., 1996) para o

glicopiranosilsitosterol, (Tabela 23).

O

HO

HO

HO OHO

12

3

45

67

89

10

11

12

13

1415

1617

18

19

20

21 22

2324 25 26

27

2829

1'

2'3'4'

5'6'

Tabela 23: Dados de RMN de 1H de LC-4 e do glicopiranosilsitosterol (Matida e

col., 1996)


Glicopiranosilsitosterolb δ 1H, mult. (no H, J)

H-6 5,35, d (1H) 5,36, d (1H) H-18 0,64, s (3H) 0,66, s (3H) H-19 0,92, s (3H) 0,93, s (3H) H-1’ 5,07, d (1H, 7,8) 5,04, d (1H, 7,6) H-3’ 4,56, dl (1 H, 9,3) 4,56, dl (1H, 10,8)

H-6’b, H-4’, H-2’ 4,45 – 4,25, m 4,48 – 4,21, m H-6’a, H-5’, H-3α 4,09 – 3,91, m 4,17 – 3,82, m

a- RMN de 1H (CDCl3, 300MHz); b- RMN de 1H (C5D5N, 200MHz); Constante de

acoplamento J entre parêntesis estão em Hertz.


Os espectros de RMN de 13C e DEPT (Figura 22) mostram os sinais dos

carbonos insaturados em δ 140,9 (C) e δ 121,8 (CH). A posição da ligação dupla

Δ5 foi confirmada pela absorção do carbono C-19 em δ 19,2, enquanto que para os

esteróides Δ7 o deslocamento químico do carbono C-19 ocorreria em δ 13,0

(Goulart e col., 1993).

O deslocamento químico em δ 102,5 é característico de carbono anomérico

(CH-1’) e os sinais em δ 78,5 (CH), δ 77,9 (CH), δ 71,5 (CH) e δ 62,6 (CH2) são

atribuídos aos carbonos da unidade glicosídica C-3’, C-5’, C-2’, C-4’ e C-6’,

respectivamente. Os valores dos deslocamentos químicos de RMN de 13C obtidos

para a substância LC-4 foram comparados com os valores dos deslocamentos

químicos encontrados na literatura (Matida e col., 1996) para o 3-O-β-D-

glicopiranosilsitosterol, (Tabela 24).

Tabela 24: Dados de RMN de 13C / DEPT de LC-4 e do 3-O-β-D-glicopiranosilsitosterol (Matida e col., 1996) nº carbono (DEPT) LC-4a

δ 13C 3-O-β-D-glicopiranosilsitosterol b

δ 13C 1(CH2) 37,3 37,2 2(CH2) 30,0 29,9 3(CH) 78,4 78,2 4(CH2) 39,1 39,0 5(C) 140,9 140,6

6(CH) 121,8 122,6 7(CH2) 31,9 31,9 8(CH) 31,8 31,8 9(CH) 50,1 50,0 10(C) 36,7 36,6

11(CH2) 21,0 21,0 12(CH2) 39,7 39,6 13(C) 42,3 42,2

14(CH) 56,6 56,5 15(CH2) 24,3 24,2 16(CH2) 28,3 28,2 17(CH) 56,0 55,9 18(CH3) 11,7 11,7 19(CH3) 19,,2 19,1 20(CH) 36,2 36,1 21(CH3) 18,9 18,9 22(CH2) 34,0 33,9 23(CH3) 26,1 26,1 24(CH) 45,8 45,7 25(CH) 29,2 29,2 26(CH3) 18,7 18,7 27(CH3) 19,7 19,7 28(CH2) 23,1 23,1 29(CH3) 11,9 11,9 1’- (CH) 102,5 102,2 2’- (CH) 75,2 75,0 3’- (CH) 77,9 77,0 4’- (CH) 71,5 71,3 5’- (CH) 78,3 78,1 6’- (CH2) 62,6 62,5

a- RMN de 13C (CDCl3, 75MHz); b- RMN de 13C (C5D5CN, 75,5MHz)


de LC-4

Considerando que os deslocamentos químicos de RMN de 13C/DEPT da

substância LC-4 mostraram coerência com os dados do 3-O-β-D-

glicopiranosilsitosterol (3-β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5-enol), pode-se

concluir que trata-se da mesma substância.


A substância LC-5 (34) foi isolada da fração LCG-6 (Tabela 4) como um

sólido marrom (9,0mg), solúvel em metanol.

(34)

O espectro no I V (Figura 23) apresenta uma banda larga em 3324 cm-1

característica de estiramento de grupo hidroxila. Observa-se também a presença

de uma banda de absorção referente a deformação axial de ligação C=C em 1628

cm-1 e uma banda de absorção relativa a estiramento de ligação C-O em

1148 cm-1.


O

OH

HO

OH

OH

OH

78

9

65

10

4

3

21'2' 3'

4'

5'6'

O espectro de massas de baixa resolução, obtido na análise por CG/EM

apresentou o pico do íon molecular em m/e 290 [M.+] (Figura 24), o pico base em

m/e 139, que sugere uma clivagem β ao anel A, com a perda do fragmento m/e

152 (C8H8O3), e ainda o fragmento em m/e 123 [139 - OH/ +H], sugerindo a perda

de um grupo hidroxila e transferência de um hidrogênio através de rearranjo.


No espectro de RMN de 1H (Figura 25) observa-se cinco sinais

característicos de hidrogênios aromáticos em δ 6,76(d; H-5’), δ 6,80(dd; H-6’), δ

6,96(d; H-2’), δ 5,93(d; H-8), δ 5,91(d; H-6). O dubleto em δ 6,76 (J= 8,1 Hz),

revelou padrão de acoplamento “orto” com H-6’. O duplo dubleto em δ 6,80 (J=1,8

e 8,1Hz), demonstrou padrão de acoplamento “meta” com H-2’ e ”orto” com H-5’, e

o dubleto em δ 6,96 (J=1,8 Hz) confirmou acoplamento ”meta” com H-6’. As

constantes de acoplamento dos hidrogênios H-6 e H-8 em δ 5,91 (d, 2,4 Hz), e

5,93 (d, 2,4 Hz) revelaram padrão de acoplamento “meta”.

A presença dos hidrogênios em δ 2,87 (H-4b, dd, 4,5 e 16,8 Hz) e δ 2,69

(H-4a, dd, 3,0 e 16,8 Hz) indicou que LC-5 poderia pertencer à classe dos flavan-

3-ol, e os sinais de H-2 e H-3 em δ 4,80 (s) e 4,17 (m) evidenciaram a presença de

heteroátomo ligado ao carbono C-2 e de um grupo hidroxila ligado ao carbono

C-3.

Na Tabela 25 estão comparados os dados de RMN de 1H de LC-5 com os

dados da literatura para a (-)-epicatequina, isolado da espécie Licania pittieri por

Mendez e col. (1995).

Tabela 25: Dados de RMN de 1H de LC-5 e da (-)-epicatequina (Mendez e col.

1995)

Hidrogênio LC-5a δ 1H, mult. (nº H, J)

(-)-epicatequinab

δ 1H, mult. (nº H, J) H-2 4,82, s (1H) 4,80 (1H)

H-3 4,17, m (1H) 4,10 (1H)

H-4a 2,69, dd (1H; 3,0 e 16,8 ) 2,78, dd (1H; 5,6 e 16,0)

H-4b 2,87, dd (1 H; 4,5 e 16,8 ) 2,68, dd (1H; 8,1 e 16,0)

H-6 5,91, d (1H; 2,4) 5,91, d (1H; 1,9)

H-8 5,93, d (1H; 2,4) 5,93, d (1H; 1,9)

H-2’ 6,96, d (1H; 1,8) 6,84, d (1H; 1,7)

H-5’ 6,76, d (1H; 8,1) 6,75

H-6’ 6,80, dd (1H; 1,8 e 8,1) 6,75

a – RMN de 1H (CD3OD, 300 MHz); b – RMN de 1H (CD3OD, 200,13 MHz); As

constantes de acoplamento J entre parênteses estão em Hertz

A substância LC-5 foi comparada com a (-)- epicatequina isolada da

espécie L. divaricata por Tanaka (2002). No trabalho citado a técnica de diferença

de NOE foi utilizada para confirmação da estereoquímica dos hidrogênios H-4a, H-

4b, H-3 e H-2, os quais encontram-se em δ 2,72, δ 2,86, δ 4,17 e δ 4,81,

respectivamente. Os deslocamentos químicos dos hidrogênios H-4a, H-4b, H-3 e

H-2 de LC-5 ocorrem em δ 2,69, δ 2,87, δ 4,17, e δ 4,82, respectivamente,

portanto semelhante à (-)- epicatequina.

No espectro de RMN de 13C e DEPT (Figura 26) observou-se os sinais em

δ 132,2; 115,4; 145,9; 146,1; 116,0 e 119,5 relativos aos carbonos aromáticos C-1’

a C-6’. Os sinais em δ 157,8; 96,4; 158,2; 95,9; 157,5 e 100,1, também

característicos para aromáticos são relativos aos carbonos C-5 a C-10. A

presença de um sinal referente a CH2 saturado em δ 29,2, atribuído ao C-4 e os

sinais em δ 79,9 e 67,5, referentes aos carbonos C-2 e C-3, confirmaram que LC-5

tratava-se de um flavonol. Os dados de RMN de 13C foram comparados com os

dados da literatura para a (-)-epicatequina, segundo Agrawal e col.(1989),

conforme Tabela 26.

Tabela 26: Dados de RMN 13C / DEPT de LC-5 e da (-)-epicatequina (Agrawal e

col. 1989).


δ 13C (-)-epicatequinab

δ 13C 2 (CH) 79,9 79,4 3 (CH) 67,5 66,9 4 (CH2) 29,2 29,1 5 (C) 157,8 157,4

6 (CH) 96,4 96,2 7 (C) 158,2 157,4

8 (CH) 95,9 95,7 9 (C) 157,5 157,0 10 (C) 100,1 99,7 1’ (C) 132,2 132,1

2’ (CH) 115,4 115,2 3’ (C) 145,9 145,2 4’ (C) 146,1 145,2

5’ (CH) 116,0 115,5 6’ (CH) 119,5 119,4

a – RMN de 13C (CD3OD, 75,5 MHz); b – RMN de 13C [(CD3)2CO]

FIGURA 25 – Espectro de RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) de LC-5

FIGURA 26 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz,

CD3OD) de LC-5

Após a análise dos dados espectrais e da comparação com os dados da

literatura, conclui-se que LC-5 é um flavonóide, pertencente à classe dos flavan-3-

ol, a (-)-epicatequina (2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-benzopiran-3,5,7-triol).


A substância LC-6 (39) foi isolada da fração LCG-7 (fração CHCl3/ MeOH

75%) como um sólido branco, solúvel em água.

(39)

O espectro de massas de baixa resolução, obtido na análise por CG/EM

(Figura 27), não exibiu o pico do íon molecular e apresentou o pico base em m/e

75 [C6H3]+. Os principais fragmentos apresentados são m/e 135[(C6H2(OCH3)2) +

H], 60, 45 e 43.


1

5

1"3"

5"O

HO

OH

HO

OHH3CO

H3CO

O

1' 3'

5'1"' 3"'

5"'O OH

HO

OH

HOOCH3

OCH3

O

O

O

HH

9

9'7

7'8

8'

3

O espectro de RMN de 1H (Figura 28) apresentou um singleto em δ 6,82,

com integração para dois hidrogênios aromáticos, um singleto em δ 3,88, com

integração para seis hidrogênios, correspondendo a dois grupos metoxilas. Os

sinais em δ 4,92 (1H) e δ 3,32 (m,1H) são referentes a dois hidrogênios

metilenicos e os sinais em δ 4,35 (dd, J= 6,7 e 2,5 Hz, 1Hb) e δ 4,00 (dd, J=6,7 e

2,5 Hz, 1Ha) a hidrogênio metilenico. O dubleto em δ 5,03 (J= 7,2 Hz), relativo a

hidrogênio anomérico, e os dois duplo dubletos em δ 3,82 (dd, J=12,0 e 2,7 Hz,

1Hb) e δ 3,72 (dd, 12,0 e 4,8 Hz, 1Ha) indicaram a presença de uma unidade

glicosídica. Os sinais referentes aos demais hidrogênios carbinólicos foram

observados na região entre δ 3,35 a 3,57.

FIGURA 28 – Espectro de RMN de 1H (300 MHz, D2O) de LC-6

Os espectros de RMN de 13C e DEPT (Figura 29) apresentaram

sinais de quatro carbonos aromáticos, sendo um relativo a dois CH e três a

carbonos não hidrogenados em δ 107,0, δ 136,1, 141,1 e 155,8, juntamente

com sinais referentes a dois grupos metoxilas em δ 59,3, dois metinos em δ

88,8 e 56,2, e um metileno em δ 74,7. Também foram observados seis

sinais referentes a unidade glicosídica, em δ 106,0, correspondente ao

carbono anomérico (CH), e os demais sinais de carbonos carbinólicos em δ

79,4 (CH), 78,7 (CH), 76,6 (CH), 72,3 (CH) e 63,5 (CH2).

FIGURA 29 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz, D2O)

de LC-6

As correlações observadas nos mapas de contornos HMQC,

COSY, NOESY e no mapa de contornos HMBC encontram-se nas Tabelas 27 e 28. O mapa de contornos HMQC permitiu correlacionar os sinais

de CH e CH2 com os respectivos hidrogênios, destacando-se as

correlações do metino carbinólico em δ 88,8 com δ 4,92, do metileno

carbinólico em δ 74,8 com δ 4,35 e 4,00 e também a do metileno da

unidade glicosídica em δ 63,4 com δ 3,72 e 3,82 (Figura 30). A correlação

entre os hidrogênios em δ 5,03 e 3,57, e as demais correlações

observadas no mapa de contornos COSY (Figura 31) entre os hidrogênios

na região de δ 3,35 a 3,83 (Tabela 27), permitiram a confirmação dos sinais

da unidade glicosídica. Ainda foram observadas as correlações entre os

hidrogênios em δ 4,92 com 3,32, em δ 3,32 com 4,92 e 4,35, e de δ 4,35

com 3,32, indicando a presença na estrutura do fragmento abaixo, formado

pelo metino (δH-8 3,32) ligado ao metino carbinólico (δH-7 4,92) e este ao

metileno carbinólico (δH 4,35).

HC CH CH2

O O

FIGURA 30 – Mapa de contornos 13Cx1H HMQC (300 MHz, CDCl3) de LC-6

FIGURA 31 – Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, D2O) de LC-6

O mapa de contornos NOESY mostrou as correlações do singleto em δ

6,82 com o grupo metoxila em δ 3,89, indicando que o último é substituinte do anel

benzênico e está “orto” em relação ao hidrogênio aromático e com os sinais em δ

4,92 (H-7) e δ 3,32 (H-8) anteriormente observado no mapa de contornos COSY.

Também foram observadas as correlações entre o hidrogênio carbinólico em δ

5,03 e os hidrogênios em δ 3,54 e 3,35 (Figuras 32a e 32b).

FIGURA 32a – Mapa de contornos NOESY (300 MHz, D2O) de LC-6

FIGURA 32b – Mapa de contornos NOESY (300 MHz, D2O) de LC-6 (expansão)

No mapa de contornos HMBC (Figura 33) foram observadas as correlações

entre o hidrogênio aromático em δ 6,82 e os carbonos aromáticos em δ 155,8 e δ

136,1, e ainda a correlação com o metino carbinólico em δ 88,8 (δH 4,92),

indicando que o referido hidrogênio estaria a três ligações deste, e que portanto, o

anel aromático estaria ligado ao mesmo. Observou-se também a correlação entre

o hidrogênio em δ 4,35 (CH2 carbinólico) com o metino carbinólico em 88,8,

indicando que os mesmos estariam a três ligações um do outro, reforçando a

observação no COSY. Ainda foram observadas as correlações entre o grupo

metoxila em δ 3,88 com o carbono aromático em δ 155,8 e do hidrogênio

glicosídico em δ 3,55 (CH) com δ 79,3 (CH) e δ 76,6 (CH) indicando que este

hidrogênio estaria a três ligações em relação ao primeiro carbono e a duas

ligações em relação ao outro.

FIGURA 33 – Mapa de contornos HMBC (300 MHz, D2O) de LC-6

Estes dados indicaram a presença de um anel aromático com substituição

simétrica do tipo 3,5-dimetoxi-4-O-glicosilado ligado ao metino carbinólico do

fragmento proposto anteriormente, resultando na unidade apresentada na Figura 34, como parte da estrutura de LC-6.

FIGURA 34 – Correlações de HMBC de LC-6 Tabela 27: Correlações observadas nos mapas de contornos HMQC (13C x 1H),

COSY (1H x 1H) e NOESY da substância LC-6.

Carbono LC-6 (δ13C / DEPT)

HMQC (3C x 1H) δ 1H

COSY (1H x 1H) δ 1H

NOESY δ 1H

C-2/6 107,0 (CH) 6,82 6,82 4,92, 3,89, 3,32

C-7 88,8 (CH) 4,92 3,32 6,82, 3,89

C-8 56,2 (CH) 3,32 4,92, 4,35 6,82

C-9 74,8 (CH2) 4,35 4,00, 3,32

C-9 74,8 (CH2) 4,00 4,35

2 x OMe 59,9 3,89 6,82, 4,92

C-1” 106,0 (CH) 5,03 3,57 3,35, 3,55

C-2” 76,6 (CH) 3,57 5,03, 3,55

C-3” 78,7 (CH) 3,55 3,57, 3,51 5,03

C-4” 72,3 (CH) 3,51 3,55, 3,35

C-5” 79,3 (CH) 3,35 3,55 5,03

C-6” 63,4 (CH2) 3,72, 3,82 3,72, 3,83, 3,35

Tabela 28: Correlações observadas no mapa de contornos HMBC da substância

LC-6.

Carbono LC-6 (δ13C / DEPT)

HMBC δ 1H

C-2/6 107,0 (CH) 6,82 C-3/5 155,8 (C) 6,82, 3,89 C-1 136,1 (C) 6,82 C-7 88,8 (CH) 6,82, 4,35

C-2” 76,6 (CH) 3,55 C-5” 79,3 (CH) 3,57, 3,55

HOHO

OH

OHO

H3CO

H3CO

O

O

A inexistência de outros sinais nos espectros de RMN de 1H e de 13C

necessários para que se concluísse a proposta estrutural para LC-6, conduziu à

hipótese de uma estrutura simétrica. Assim, através de consulta à literatura

chegou-se à substância simétrica liriodendrina (Deyama, 1983 e Vermes e col.,

1991), cujos dados de RMN de 1H e de 13C foram confrontados com os de LC-6

(Tabelas 29 e 30), mostrando-se concordantes.

Tabela 29: Dados de RMN de 1H de LC-6, e da liriodendrina (Vermes col. 1991)

Hidrogênio LC-6a δ 1H, mult. (nº H, J)

Liriodendrinab

δ 1H, mult. (no H, J) H-2,2’/6,6’ 6,82, s (4H) 6,64, s (4H)

H-7,7’ 4,92, m (2H, J= enc. solv.) 4,68, d (2 H, J= 4,0 Hz) H-8,8’ 3,32, m (2H) 3,09, m (2H) H-9,9’ 4,00, dd (2Ha, J=6,7 e 2,5) 4,20, m (2Ha)

4,35, dd (2Hb, J= 6,7 e 2,5) 4,30, d (2Hb) OCH3 3,89 s (6H) 3,75, s (6 H) OCH3 3,89 s (6H) 3,75, s (6 H)

H-1”,1”’ 5,03, d (2H, J=7,2) 4,99, m (2H) H-2”,2”’ 3,57, d (2H, J=1,8)

H-3’” 3,55, m (2H) H-4”, 4”’ 3,51, dd (2H) H-5”,5”’ 3,35, dd (2H)

H-6”,6”’a 3,72, dd (2H, J=12,0, e 4,8) H-6”,6”’ b 3,82, dd (2H, J=12,0, e 2,7)

a – RMN de 1H (D2O, 300 MHz); b – RMN de 1H (DMSO-d6, 360 MHz)

Tabela 30: Dados de RMN de 13C/DEPT de LC-6, do e da Liriodendrina (Deyama,

1983)

nº carbono (DEPT)

LC-6a

δ 13C Liriodendrinab

δ 13C 1,1’ (C) 136,0 134.0

2,2’/6,6’ (CH) 107,0 104,4

3,3’ /5,5’ (C) 155,8 152,6

4,4’ (C) 141,2 137,1

7,7’ (CH) 88,8 85,0

8,8’ (CH) 56,2 53,6

9,9’ (CH2) 74,7 71,4

2 x OMe 59,3 56,5

1”,1”‘(CH) 106,0 102,8

2”,2”’(CH) 76,6 74,2

3”,3”’ (CH) 78,7 76,5

4”,4”’ (CH) 72,3 70,0

5”,5”’ (CH) 79,3 77,1

6”,6”’ (CH2) 63,4 61.0

a – RMN de 13C (D2O, 75 MHz); b – RMN de 13C (DMSO-d6, 100 MHz).

Após a análise dos dados espectrais e comparação com os dados

encontrados na literatura, conclui-se que LC-6 é uma lignana, a liriodendrina

(siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-bis-β-D-glicosídeo-3’,5’-dimetoxi-fenil)-3,7-

dioxabiciclo).


A substância LC-7 (33) foi isolada da fração LCF-3 como cristais amarelos

(8,0 mg) solúveis em DMSO.

(33)

O espectro no I V (Figura 35) apresentou duas bandas em 3381 cm-1 e

3237 cm-1, características de absorção relativa a estiramento de grupo OH livre.

Observou-se também absorção em 1652 cm-1, relativa a estiramento de carbonila

α,β - insaturada em ligação de hidrogênio. Em 1614 cm-1 observa-se uma banda

de absorção característica de deformação axial de ligação C=C de aromáticos e

em 1189 cm-1 uma banda de absorção relativa a estiramento de ligação C-O.


O

OOH

HO HO

OH

2

3

45

6

78

9

10

1'

2'3'

4'

5'

6'

1"

2"3"

4"5"

6"

OHO

HO

OH

O espectro de massas de baixa resolução (Figura 36), obtido por inserção

direta via sólido, revelou o pico base em m/e 283, não mostrou o pico do íon

molecular e apresentou os fragmentos em m/e 414 [M.+ - H2O], e em 270 [M.+ -

Glic.].+, sendo o primeiro correspondente a perda de uma molécula de H2O e o

outro a perda de molécula de açúcar e ganho de hidrogênio por rearranjo.


No espectro de RMN de 1H (Figura 37) observou-se os sinais em δ 6,89 (d;

H-3’ e H-5’) e em δ 8,02 (d; H-2’ e H-6’), com integração para 2 hidrogênios cada,

referentes aos quatro hidrogênios aromáticos da parte aglicona, os quais

apresentaram padrão de acoplamento “orto” (J= 8,4 Hz). Além destes, os dois

singletos em δ 6,26 e 6,77 são referentes aos hidrogênios H-6 e H-3.

Observou-se também um singleto em δ 13,16, com integração para um

hidrogênio, atribuido à hidroxila ligada ao carbono C-5, em ligação de hidrogênio

com a carbonila em C-4. Os dois singletos que aparecem na região acima de δ

10,0, são atribuidos aos hidrogênios das demais hidroxilas da aglicona.

Os sinais referentes aos hidrogênios da unidade glicosídica são observados

na região de δ 3,0 a 3,6. O dubleto em δ 4,69 é referente ao hidrogênio H-1” e o

multipleto em δ 3,78 ao hidrogênio H-2”. As hidroxilas glicosídicas estão situadas

na região de δ 4,60 a 5,03.

Os dados de RMN de 1H obtidos para LC-7 foram comparados com os

dados da literatura para a vitexina isolada por Hilsenbeck e Mabry (1990) (Tabela 31).

Tabela 31: Dados de RMN 1H de LC-7 e da vitexina (Hilsenbeck e Mabry, 1990)

H LC-7a δ 1H, mult. (nº H, J)

Vitexinab

δ 1H, mult. (nº H, J) H-6 6,26, s (1H) 6,20, s (1H)

H-3 6,77, s (1H) 6,40, s (1H)

H-3’ e H-5’ 6,89, d (2H; 8,4) 6,85, d (2H; 9,0)

H-2’ e H-6’ 8,02, d (2H, 8,4) 7,80, d (2H, 9,0)

H-1” 4,69, d (1H, 9,9) 5,0-5,2, d (1H)

H-2” 3,78, m (1H) 3,90, m (1 H)

a – RMN de 1H (DMSO, 300 MHz); b – RMN de 1H (CCl4, 90 MHz). As constantes

de acoplamento J entre parênteses estão em hertz.

Os dados de RMN de 13C e DEPT (Figura 38) de LC-7 sugeriram a

possibilidade da substância ser uma flavona C-glicosilada, devido a ausência de

deslocamento químico na região referente a carbono anomérico. O deslocamento

químico em δ 182,6 indicou a presença de carbonila α,β - insaturada. Os carbonos

não hidrogenados C-4’, C-5 e C-7, ligados a grupos hidroxila, são observados em

δ 161,6, 160,9 e 163,0, respectivamente.

FIGURA 37 – Espectro de RMN de 1H (300, MHz, DMSO-d6) de LC-7

Os sinais em δ 164,5 e 102,8 são atribuidos aos carbonos C-2 e C-3 da

ligação dupla. Os sinais em δ 116,3 e 129,4 são referentes aos carbonos

equivalentes CH-3’/5’ e CH-2’/6’.

Além dos sinais referentes à unidade aglicona, observa-se os sinais

referentes à unidade glicosídica na região de δ 61,0 a 83,0. Os dados de RMNde 13C obtidos para LC-7 foram comparados com os da literatura para a vitexina

(Tabela 32), isolada por Palme e colaboradores (1994).

FIGURA 38 – Espectro de RMN de 13C e DEPT 90o e 135o (75 MHz,

DMSO-d6) de LC-7

Tabela 32: Dados de RMN de 13C / DEPT de LC-7 e da vitexina (Palme e col.,

1994).


δ 13C Vitexinab

δ 13C 2 (C) 164,5 165,3

3 (CH) 102,8 102,6 4(C) 182,6 182,8 5 (C) 160,9 160,8

6 (CH) 98,5 99,0 7(C) 163,0 162,1 8 (C) 104,4 104,3 9 (C) 156,5 160,9 10 (C) 105,0 104,3 1’ (C) 122,0 121,0

2’ (CH) 129,4 128,9 3’ (CH) 116,3 115,9 4’ (C) 161,6 161,1

5’ (CH) 116,3 115,9 6’ (CH) 129,4 128,9 1” (CH) 73,7 73,6 2” (CH) 71,2 71,0 3” (CH) 78,9 78,7 4” (CH) 70,8 71,5 5” (CH) 82,1 81,9 6” (CH2) 61,6 61,2

a – RMN de 13C (DMSO, 75,5 MHz); b – RMN de 13C (DMSO, 50,0 MHz).

Após a análise dos dados espectrais e a comparação com os dados da

literatura, conclui-se que LC-7 é uma flavona C-glicosilada, a vitexina (8-β-D-

Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona).

Do estudo químico de L. candicans foram isolados sete substâncias, os

esteróides (36) e (38), os triterpenos (35) e (37), o flavonóide (34), a flavona (33) e

a lignana (39). Dessa forma, um dos objetivos deste trabalho foi alcançado, pois

através do mesmo , o potencial químico de L. candicans foi avaliado podendo

servir para estudos futuros. As substâncias (35), (36), (37) e (39) foram isoladas

pela primeira vez no gênero.

5 – Estudo da atividade biológica

5.1 – Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto dos galhos e do extrato bruto das folhas

Os extratos brutos dos galhos e das folhas foram testados frente aos

microorganismos Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Escherichia coli,

utuilizando-se os padrões antibacterianos penicilina, vancomicina e tetraciclina,

respectivamente, e a técnica de microdiluição, conforme Tabela 33. O teste

realizado com os extratos brutos das folhas e dos galhos não apresentou

resultado significativo frente à maior concentração utilizada.

Tabela 33: Dados da atividade antibactriana dos extratos brutos das folhas e


Microrganismos

Frações

S. aureus*

ATCC 25923

B. subtilis*

ATCC 6623

E. coli*

ATCC 25922

CMB CMI CMB CMI CMB CMI

Ext. bruto folhas >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

Ext. bruto galhos >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

CMB – concentração mínima bactericida; CMI – concentração mínima inibitória; os

valores de CMB e CMI são dados em μg/mL.

* Todos os microrganismos foram testados na concentração de 1,5 x 105 UFC/mL

5.2 – Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos e substâncias isoladas

Os extratos brutos dos galhos e das folhas foram testados frente aos

microorganismos Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida krusei e

Candida tropicalis. A avaliação utilizou o teste de susceptibilidade antifúngica pelo

método de microdiluição, usando a micostatina como antifúngico padrão. Os

resultados estão representados na Tabela 34.

Tabela 34: Dados da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos


Microganismos

Frações

C. albicans C.

parapsilosis

C. krusei C. tropicalis

CMI CMF CMI CMF CMI CMF CMI CMF

Ext. bruto folhas

>1000 >1000 >1000 >1000 >62,5 >125 >1000 >1000

Ext. bruto galhos

>1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

CMF – concentração mínima fungicida; CMI – concentração mínima inibitória; os

valores de CMF e CMI são dados em μg/mL.

O extrato bruto das folhas de L. candicans apresentou atividade antifúngica

contra a cepa C. krusei com resposta significativa na concentração de 62,5μg/mL

para ação fungiostática e 125 μg/mL para ação fungicida. As demais cepas

demonstraram-se resistentes ao extrato bruto das folhas.

Os testes realizados com os extratos brutos dos galhos e com as

substâncias (LC-1, LC-2, LC-3,LC-4,LC-5 e LC-7) não demonstraram atividade

inibitória ou fungicida através da metodologia e das concentrações testadas.

5.3 – Avaliação da atividade antiproliferativa

A atividade antiproliferativa de L. candicans, extrato bruto das folhas

e suas frações (Tabela 35), extrato bruto dos galhos e frações (Tabela 36) foi

testada utilizando-se as linhagens de células cancerígenas MCF-7 (mama), NCI-

ADR (mama com fenótipo de resistência a múltiplas drogas), UACC-62

(melanoma), NCI460 (pulmão), PCO3 (próstata), HT29 (cólon), OVCAR (ovário),

K562 (leucemia) e 786-0 (rim). O padrão utilizado como controle positivo foi o

quimioterápico doxorrubicina, cuja atividade antiproliferativa concentração

dependente, com efeito citostático (inibição de crescimento), efeito citocida (morte

celular) e seletividade entre as linhagens estudadas pode ser observada na

Figura 39. 5.3.1 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto das folhas e frações Hexano, CHCl3, AcOEt e MeOH Tabela 35: Dados da atividade antiproliferativa (efeito citostático) dos extratos

brutos das folhas e das frações Hexano, CHCl3, AcOEt e MeOH de L. candicans

(Figuras 40 a 44).

Linhagens

Frações

UACC62

MIC/%

MCF-7

MIC/%

NCI-460

MIC/%

OVCAR

MIC/%

PCO3

MIC/%

HT29

MIC/%

786-0

MIC/%

NCI-ADR

MIC/%

Ext. bruto folhas

Hexano

CHCl3

AcOEt

MeOH

Na

Na

Na

250/65

Na

Na

Na

Na

250/75

Na

Na

Na

Na

250/65

Na

Na

Na

Na

250/75

Na

Na

Na

Na

250/60

Na

Na

Na

Na

250/75

Na

25/85

250/100

250/100

Na

250/100

Na

Na

Na

250/75

Na

MIC – concentração mínima citostática (μg/mL); % – percentagem de inibição de

crescimento celular; Na – não ativa.

O extrato bruto das folhas de L. candicans apresentou atividade

antiproliferativa, com efeito citostático (inibição de crescimento) de 85% na

concentração de 25 μg/mL, bem como morte celular em 25 % na maior

concentração utilizada, somente para células de câncer de rim, demonstrando

seletividade para esta célula cancerígena (Figura 40). As frações Hexano, CHCl3 e MeOH apresentaram somente inibição de

crescimento em 100 % na maior concentração utilizada para a linhagem de células

de câncer de rim, evidenciando a seletividade dessas frações em relação à célula

acima citada (Figuras 41 a 43). A fração AcOEt apresentou baixa atividade

antiproliferativa sem seletividade, somente com efeito citostático (inibição de

crescimento) na maior concentração utilizada para todas as linhagens estudadas,

exceto células de câncer de rim, para a qual não apresentou efeito citocida ou

citostático (Figura 44).

Concentração (μg/mL)

FIGURA 40 – Teste antiproliferativo do extrato bruto das folhas de L. candicans

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250

UACC.62MCF.7NCI.460OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR

Por

cent

agem

de

Cre

scim

ento


FIGURA 41 – Teste antiproliferativo da fração hexano

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250


Por

cent

agem

de

Cre

scim

ento


FIGURA 42 – Teste antiproliferativo da fração CHCl3

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250


Por

cent

agem

de

Cre

scim

ento


FIGURA 43 – Teste antiproliferativo da fração MeOH

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250


Porc

enta

gem

de

Cre

scim

ento


FIGURA 44 – Teste antiproliferativo da fração AcOEt 5.3.2 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH (50%) e MeOH

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250


Por

cent

agem

de

Cre

scim

ento

Tabela 36: Dados da atividade antiproliferativa (efeito citostático) dos extratos

brutos dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH (50%) e MeOH de L.

candicans (Figuras 45 a 49).

Linhagens

Fração

UACC62

MIC/%

K562

MIC/%

MCF-7

MIC/%

NCI-460

MIC/%

OVCAR

MIC/%

PCO3

MIC/%

HT29

MIC/%

786-0

MIC/%

NCI-ADR

MIC/%

E. B.

Galhos

Hexano

CHCl3

CHCl3/ MeOH

50%

MeOH

Na

Na

250/75

Na

250/60

0,25/60

Na

250/100

Na

250/95

Na

Na

250/98

Na

250/65

Na

250/60

250/95

250/60

250/95

25/60

Na

250/98

Na

250/60

250/60

Na

250/75

Na

250/65

Na

250/55

250/75

Na

250/65

250/100

Na

250/85

Na

Na

250/100

Na

250/80

Na

Na

MIC – concentração mínima citostática (μg/mL); % – percentagem de inibição de

crescimento celular; Na – não ativa.

O extrato bruto dos galhos de L. candicans apresentou atividade

antiproliferativa concentração dependente com efeito citostático (inibição de

crescimento), efeito citocida (morte celular) e pequena seletividade entre as

linhagens estudadas, destacando-se o efeito citocida frente às linhagens de

células de câncer de ovário, pulmão, mama, melanoma e leucemia produzindo

morte celular na maior concentração utilizada em 25, 30, 45, 60 %,

respectivamente (Figura 45).

A fração Hexano foi seletiva para células de câncer de pulmão e cólon de

útero, inibindo o crescimento em 60 e 55%, respectivamente, na maior

concentração utilizada. E a fração CHCl3/ MeOH (50%) foi seletiva para célula de

câncer de pulmão inibindo o crescimento em 60% na maior concentração utilizada

(Figuras 46 e 47).

FIGURA 45 –Teste antiproliferativo do extrato bruto dos galhos de L. candicans

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250

UACC.62MCF.7NCI.460K.562OVCARPC0.3C786.0NCI.ADR###

Porc

enta

gem

de

Cre

scim

ento


10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250

UACC.62MCF.7NCI.460K.562OVCARPC0.3C786.0NCI.ADR###

Porc

enta

gem

de

Cre

scim

ento



FIGURA 46 – Teste antiproliferativo da fração Hexano

10-3 10-2 10-1 100 101 102-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

10-3 10-2 10-1 100 101 102-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250

UACC.62MCF.7NCI.460K.562OVCARPC0.3HT.29786-0NCI.ADR


FIGURA 47 – Teste antiproliferativo da fração CHCl3/ MeOH (50%)

As frações CHCl3 e MeOH apresentaram somente efeito citostático, sem

seletividade entre as linhagens estudadas, sendo que a fração MeOH não

apresentou atividade antiproliferativa para as linhagens de células de câncer de

rim e de mama com fenótipo de resistência a múltiplas drogas como apresentado

para a fração CHCl3 (Figuras 48 e 49).

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

10-3 10-2 10-1 100 101 102 103

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250


Por

cent

agem

de

Cre

scim

ento


FIGURA 48 – Teste antiproliferativo da fração CHCl3

10-3 10-2 10-1 100 101 102-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

10-3 10-2 10-1 100 101 102-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

100

250252,50,250


Por

cent

agem

de

Cre

scim

ento


FIGURA 49 – Teste antiproliferativo da fração MeOH

Estudos demonstram que muitas plantas com atividade antitumoral contém

o triterpeno lupeol como um de seus principais constituintes (Miles & Kokopol,

1976), (Saleem et al., 2001). Desta forma, levando-se em consideração que esta

substância foi isolada tanto nos galhos como nas folhas de L. candicans e que

ambos os extratos brutos e principalmente a fração CHCl3 dos galhos

demonstraram capacidade antiproliferativa contra algumas células tumorais

humanas, pode-se esperar que o resultado seja atribuído à presença desta

substância, necessitando-se de mais estudos para avaliação de resultados. E

ainda, o lupeol é reportado na literatura como possuidor de várias propriedades

farmacológicas como antinflamatória, antiartrítica, antimutagênica (Geetha e col,

1998) e no controle de formação de pedras no rim ( Vidya & VaralaKshmi, 2000).

Assim, torna-se necessário dar continuidade aos estudos quanto a atividade

farmacológica de L. candicans.

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Por

cent

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scim

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6 – CONCLUSÕES

O estudo fitoquímico de Luehea candicans resultou no isolamento das

substâncias LC-1 a LC-7, identificadas com base na análise de seus dados

espectrais de IV, EM, RMN de 1H e de 13C e comparação com os dados existentes

na literatura.

Dos galhos de L. candicans foram isolados dois triterpenos denominados

como LC-1 e LC-3, pertencentes à série dos lupanos, o lupeol (lup-20(29)-en-3β-

ol) (LC-1) e a betulina (3β,28-diidróxilup-20(29)-ene) (LC-3).

As substâncias LC-2 e LC-4 foram identificadas como esteróides. LC-2 uma

mistura dos esteróides 24ξ- etil- colest- 5 enol (sitosterol) (LC-2(I)), 24ξ- etil-

colesta- 5, 22- dienol (estigmasterol) (LC-2(II)) e 24ξ- metil- colest- 5 enol (LC-

2(III)) e LC-4 o esteróide glicosilado 3-O-β-D-glicopiranosilsitosterol (3-β-O-

glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5-enol).

A substância LC-5 foi identificada como um flavonóide, pertencente à

classe dos flavan-3-ol, a (-)-epicatequina (2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-

benzopiran-3,5,7-triol).

Ainda dos galhos de L. candicans foi isolado a substância LC-6, identificada

como uma lignana, a liriodendrina (siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-bis-β-D-

glicosídeo-3’,5’-dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo).

O estudo fitoquímico das folhas de Luehea candicans resultou no

isolamento da substância LC-7, identificada como uma flavona C-glicosilada, a

vitexina (8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-

ona).

As substâncias LC-1 e LC-2 foram também isoladas nas folhas de L.

candicans e a substância LC-3 foi também detectada nas folhas através de CCD.

As substâncias isoladas são conhecidas e o isolamento de LC-5 e LC-7, também isoladas da espécie L. divaricata, pode ser indicativo de possíveis

marcadores taxonômicos do gênero.

Os triterpenos da série dos lupanos LC-1 e LC-3 e a lignana LC-6 foram

isolados no gênero pela primeira vez, assim como a mistura de esteróides LC-2.

Os testes de atividade antibacteriana do extrato bruto das folhas e galhos

dessa espécie não apresentaram resultados significativos frente aos

microrganismos e às concentrações testadas através da metodologia empregada.

A avaliação da atividade antifúngica do extrato bruto dos galhos e das

substâncias (LC-1, LC-2, LC-3,LC-4,LC-5 e LC-7) não apresentou resultado

significativo frente aos microorganismos nas concentrações testadas através da

metodologia da microdiluição.

O extrato bruto das folhas de L. candicans apresentou atividade antifúngica

contra a cepa C. krusei com ação fungicida na concentração de 125 μg/mL (CMF)

e fungiostática na concentração de 62,5 μg/mL (CMI).

O extrato bruto das folhas de L. candicans e as frações Hexano, CHCl3 e

MeOH foram seletivas para células de câncer de rim apresentando atividade

antiproliferativa, com efeito citostático (inibição de crescimento) em 85% na

concentração de 25 μg/mL para o extrato bruto e 100% (250μg/mL) para as

frações. O extrato bruto das folhas apresentou morte celular em 25 % na maior

concentração utilizada para células de câncer de rim.

O extrato bruto dos galhos de L. candicans apresentou atividade

antiproliferativa concentração dependente com efeito citostático (inibição de

crescimento), efeito citocida (morte celular) e pequena seletividade entre as

linhagens estudadas, destacando-se o efeito citocida frente as linhagens de

células de câncer de ovário, pulmão, mama, melanoma e leucemia produzindo

morte celular na maior concentração utilizada em 25, 30, 45, 60 %,

respectivamente. A fração Hexano foi seletiva para células de câncer de pulmão e

cólon de útero, inibindo o crescimento em 60 e 55%, respectivamente, na maior

concentração utilizada. E a fração CHCl3/ MeOH (50%) foi seletiva para célula de

câncer de pulmão inibindo o crescimento em 60% maior concentração utilizada.

Concluindo este trabalho, destacamos a atividade antifúngica frente a cepa

C. krusei e a atividade antiproliferativa, seletiva para células de câncer de rim

apresentada pelas folhas L. candicans, verificando-se entretanto, a necessidade

de maiores estudos em relação à capacidade farmacológica da espécie L.

candicans, uma vez que tanto os triterpenos isolados quanto os flavonóides são

reportados na literatura como tendo propriedades terapêuticas.

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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