universidade estadual de campinas faculdade de engenharia de alimentos taÍsa pires de ... · 2018....
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DE ALIMENTOS
TAÍSA PIRES DE JESUS SANTINI
Salmonella sp. E Escherichia coli PATOGÊNICA EM POLPAS DE FRUTAS
CONGELADAS E FRUTAS MINIMAMENTE PROCESSADAS: OCORRÊNCIA E
SUSCEPTIBILIDADE AOS AGENTES ANTIMICROBIANOS
CAMPINAS- SP
2017
TAÍSA PIRES DE JESUS SANTINI
Salmonella sp. E Escherichia coli PATOGÊNICA EM POLPAS DE FRUTAS
CONGELADAS E FRUTAS MINIMAMENTE PROCESSADAS: OCORRÊNCIA E
SUSCEPTIBILIDADE AOS AGENTES ANTIMICROBIANOS
Dissertação apresentada à Faculdade de
Engenharia de Alimentos da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título
de Mestra em Ciência de Alimentos.
Orientadora: PROF. DRA. DIRCE YORIKA KABUKI
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA
TAÍSA PIRES DE JESUS SANTINI E ORIENTADA
PELA PROF. DRA. DIRCE YORIKA KABUKI
CAMPINAS- SP
2017
FICHA CATALOGRÁFICA
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): CAPES
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos
Márcia Regina Garbelini Sevillano - CRB 8/3647
Santini, Taísa Pires de Jesus, 1988-
Sa59s As nSalmonella sp. e Escherichia coli patogênica em polpas de frutas
congeladas e frutas minimamente processadas : ocorrência e susceptibilidade
aos agentes antimicrobianos / Taísa Pires de Jesus Santini. – Campinas, SP :
[s.n.], 2017.
SanOrientador: Dirce Yorika Kabuki.
SanDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Engenharia de Alimentos.
San1. Salmonella. 2. Escherichia coli. 3. Minimamente processados. 4. Polpa
de frutas. I. Kabuki, Dirce Yorika,1964-. II. Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital Título em outro idioma: Salmonella sp. and pathogenic Escherichia coli in frozen fruit pulps and minimally processed fruits : occurrence and susceptibility to antimicrobial agents Palavras-chave em inglês: Salmonella Escherichia coli Minimally processed Fruit pulp Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Mestra em Ciência de Alimentos Banca examinadora: Dirce Yorika Kabuki [Orientador] Ana Lucia Penteado Uelinton Manoel Pinto Data de defesa: 06-09-2017 Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Dirce Yorika Kabuki
Orientador
Faculdade de Engenharia de Alimentos/UNICAMP
Dra. Ana Lúcia Penteado
Membro Titular
EMBRAPA/Jaguariúna
Prof. Dr. Uelinton Manoel Pinto
Membro Titular
Faculdade de Ciências Facrmacêtiucas/USP
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Ao meu marido Marcos Vinícius e minha
mãe Eliane que sempre me deram forças
para seguir em frente nesta jornada, e a
todos meus amigos e família que torceram
por mim desde o começo deste trabalho
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço à Deus por ter me dado saúde e inteligência
para superar todas as dificuldades e conseguir chegar onde hoje estou e me lembrar
a cada dia para sempre continuar lutando.
À minha orientadora Dirce Yorika Kabuki por toda a orientação e
ajuda que me foram dados, além de toda paciência e dedicação que possibilitaram
que eu realizasse este trabalho.
Ao meu marido Marcos Vinícius pelo amor, carinho, paciência e por
não medir esforços para que eu pudesse levar meus estudos adiante.
À minha filha Lara por toda a alegria que me concedeu a cada dia de
trabalho árduo e, muitas vezes, frustrante. Dedico todo o meu esforço à você que
tanto amo.
À minha mãe Eliane, irmã Joelma e todos os familiares por cada
palavra de incentivo e força, por sempre torcerem por mim nunca me deixando
desistir. Amo vocês!
Aos meus amigos Juliana Carusi, Juliana Marques, Caio Henrique,
Vanessa Alonso, Jeana Bortolomedi, Karen Vanessa, dentre outros, pela grande
ajuda, apoio e conselhos nos momentos mais difíceis desta jornada. Agradeço a
parceria de todos e sentirei muitas saudades dos grandes momentos de risadas.
Aos membros da banca pela disponibilidade e pelas grandes dicas e
correções desta dissertação. Todos contribuíram para a melhora deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela bolsa de estudo concedida e por sua prorrogação devido à minha
gestação, e pelo apoio financeiro.
Ao Fundo de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Extensão (FAEPEX) pelo
apoio financeiro para finalização do projeto.
Ao Laboratório de Referência Nacional para Enteroinfecções
Bacterianas (LRNEB) da Fundação Oswaldo Cruz pela doação de cepas utilizadas
neste trabalho, sem elas não seria possível dar continuidade à pesquisa. À todos
muito obrigada!
Aos que contribuíram de alguma forma para este trabalho, deixo meu
imenso agradecimento.
RESUMO
No Brasil, frutas minimamente processadas e polpas de frutas estão ganhando mais
espaço no mercado, uma vez que são produtos similares ao original mantendo o
sabor e textura da fruta in natura, assim como seu apelo saudável. Contudo, são
alimentos que passam por várias etapas de manipulação, podendo, portanto, ocorrer
contaminação por diversos micro-organismos durante sua produção. Os objetivos do
trabalho foram: verificar se amostras de polpas de frutas e frutas minimamente
processadas estão de acordo com a RDC nº 12/2001 para coliformes
termotolerantes e ausência total de Salmonella, além de realizar a contagem de
bolores e leveduras a fim de observar a qualidade do produto em relação à Instrução
Normativa nº1/2000 do Ministério da Agricultura, realizar a caracterização genética
de E.coli quanto ao potencial de virulência e avaliar o perfil de resistência a
antimicrobianos. A identificação dos isolados de Salmonella sp. e o perfil de
patogenicidade de E. coli foram realizados pela técnica da Polymerase Chain
Reaction (PCR) e a susceptibilidade aos antimicrobianos ácido nalidíxico,
ampicillina, ceftadizima, ciprofloxacina, cloranfenicol, e trimetroprina/sulfametoxazol
foi testada através da técnica do disco difusão. As polpas de frutas congeladas
estavam dentro dos padrões da legislação, porém foi encontrado o patógeno
Escherichia coli, caracterizado como ETEC, através da identificação do gene est1b
em uma amostra de polpa de manga não pasteurizada. As frutas minimamente
processadas estavam contaminadas com altas contagens de bolores e leveduras em
36,25% (29/80) das amostras, 12,5% (10/80) apresentaram coliformes
termotolerantes acima do limite da legislação, além de uma amostra de coco ralado
estar contaminada com Escherichia coli e uma de melão com Salmonella sp. Os
isolados de E. coli apresentaram maior taxa de resistência a ampicilina e ao
cloranfenicol o que resultou em 14,3% (2/14) apresentando multirresistência. Apenas
uma cepa dos isolados de Salmonella sp. foi resistente ao
sulfametoxazol/trimetroprim. Sugere-se, portanto, que a etapa de pasteurização no
processamento da polpa de fruta seja adotada por todas as indústrias. O controle
higiênico-sanitários e da temperatura no preparo de alimentos minimamente
processados devem ser usados como medidas para produção de alimentos seguros
ao consumidor.
Palavras-chave: Salmonella sp, Escherichia coli, polpa de frutas, frutas
minimamente processadas, antimicrobianos
ABSTRACT
In Brazil, the consumption of minimally processed fruits and fruit pulps are growing,
because they are similar to original products maintaining the flavor and texture of in
natura fruit, likewise as its appeal as healthy foods. However, they are foods that go
through several stages of handling, and may occur, therefore, contamination by
several microorganisms during their production.The objectives of the research are:
verify if samples of fruit pulps and fruits minimally processed are in accordance with
RDC nº 12/2001 for thermotolerant coliforms and absence of Salmonella, in addition
counting of molds and yeasts in order to assert the quality of the product in relation to
the Normative Instruction nº1/2000 from Agriculture Ministry, carry out genetic
characterization regarding virulence potential of Escherichia coli and evaluate its
antimicrobial resistance profile. The identification of Salmonella sp. and E. coli
pathogenicity profile were performed with Polymerase Chain Reaction (PCR)
technique. The susceptibility to antimicrobials, nalidixic acid, ampicillin, ceftadizime,
ciprofloxacin, chloramphenicol, and trimetroprin/sulfamethoxazole were tested with
diffusion disc technique. The frozen fruit pulps were within legislation standards, but
Escherichia coli pathogen was found, characterized as ETEC through the
identification of the est1b gene in a sample of unpasteurized mango pulp. Minimally
processed fruits were contaminated with a high yeast and mold counts in 36.25%
(29/80) of samples and 12,5% (10/80) thermotolerant coliforms were present above
legislation limit, in addition one sample of grated coconut being contaminated with
Escherichia coli and unique of yellow melon with Salmonella sp. E. coli strains
presented higher resistance rates to ampicillin and chloramphenicol resulting in
14,3% (2/14) with multiresistance. One strain of Salmonella sp. was resistant to the
antibiotic sulfamethoxazole / trimethoprim. It is, therefore, suggested that the
pasteurization step in the processing of fruit pulps get adopted by all industries. The
hygienic-sanitary control and temperature in the preparation of minimally processed
foods in the storage and distribution ought get adopted as measures for safer food
production to the consumer.
Keywords: Salmonella sp, Escherichia coli, fruit pulp, minimally processed fruits,
antimicrobials
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Fluxograma do processamento de polpa de fruta congelada ..................... 20
Figura 2 Fluxograma do processamento de frutas minimamente processadas........ 24
Figura 3 Ciclo de contaminação e transmissão de Escherichia coli patogênica ....... 33
Figura 4 Mecanismos de virulência de estirpes de E.coli patogênicas em células
epiteliais .................................................................................................................... 36
Figura 5 Esquema de análise de bolores e leveduras .............................................. 43
Figura 6 Esquema de análise do NMP para coliformes termotolerantes .................. 44
Figura 7 Esquema de análise da presença/ausência de Escherichia coli ................ 45
Figura 8 Esquema de análise de Salmonella ........................................................... 49
Figura 9 Porcentagem de amostras de frutas minimamente processadas com
contagens de bolores e leveduras superiores a 103 UFC.g-1 .................................... 57
Figura 10 Porcentagem de amostras acima do limite da RDC12/2001 .................... 60
Figura 11 Gel de eletroforese do gene est1b de ETEC ............................................ 62
Figura 12 Gel de eletroforese dos isolados positivos para o gene invA ................... 64
Lista de Tabelas
Tabela 1 Quantidades de sabores e marcas de polpas de frutas congeladas .......... 41
Tabela 2 Genes e sequências de primers utilizados neste estudo. .......................... 48
Tabela 3 Antibióticos utilizados e suas concentrações ............................................. 51
Tabela 4 Valores de pH de polpas de frutas congeladas .......................................... 53
Tabela 5 Valores de pH de frutas minimamente processadas .................................. 53
Tabela 6 Contagem de bolores e leveduras em polpas de frutas congeladas .......... 55
Tabela 7 Contagem de bolores e leveduras em frutas minimamente processadas
acima de 5 x 103 UFC.g-1 .......................................................................................... 56
Tabela 8 Contagem de coliformes termotolerantes em frutas minimamente
processadas acima de 1,2x102 NMP.g-1 .................................................................... 59
Tabela 9 Genes de E. coli analisados por PCR em isolados de polpa de manga e
coco ralado ................................................................................................................ 62
Tabela 10 Isolados característicos de Salmonella identificados por testes
bioquímicos e confirmados por PCR ......................................................................... 65
Tabela 11 Número de amostras de frutas minimamente processadas fora do padrão
RDC nº12/2001 (n=80) .............................................................................................. 66
Tabela 12 Frequência da susceptibilidade dos isolados de Escherichia coli e
Salmonella sp. resistentes, com resistência intermediária e susceptíveis aos
antibióticos analisados .............................................................................................. 70
Tabela 13 Frequência da susceptibilidade dos isolados de Escherichia coli e
Salmonella sp. resistentes (R), com resistência intermediária (I) e susceptíveis (S)
aos antibióticos analisados........................................................................................ 71
Sumário
1. Introdução ......................................................................................................... 14
2 Objetivos ............................................................................................................ 16
2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 16
2.2 Objetivos específicos ................................................................................... 16
3 Revisão Bibliográfica ....................................................................................... 17
3.1 Polpa de Fruta Congelada ........................................................................... 17
3.1.1 Etapas do processo de produção de polpas de frutas congeladas ....... 19
3.1.2 Qualidade Microbiológica de Polpas de Frutas...................................... 20
3.2 Frutas minimamente processadas ............................................................... 21
3.2.1 Etapas de produção de frutas minimamente processadas .................... 23
3.2.2 Qualidade Microbiológica de Frutas Minimamente Processadas .......... 25
3.3 Desenvolvimento de E. coli e Salmonella sp. em frutas ............................... 27
3.4 Salmonella sp e suas características ........................................................... 28
3.4.1 Surtos causados por Salmonella sp. associados ao consumo de frutas e
derivados ............................................................................................................ 29
3.4.2 Salmonella sp e sua resistência aos antimicrobianos ............................ 30
3.5 Escherichia coli e suas características ......................................................... 32
3.5.1 Surtos causados por E.coli associados ao consumo de frutas e produtos
de frutas .............................................................................................................. 36
3.5.2 E. coli e a resistência aos antimicrobianos ............................................ 38
4 Material e Métodos............................................................................................ 40
4.1 Amostras ...................................................................................................... 40
4.2 Determinação do pH .................................................................................... 42
4.3 Contagem de Bolores e Leveduras .............................................................. 42
4.4 Contagem de coliformes termotolerantes e E. coli pela Técnica do Número
Mais Provável (NMP) ............................................................................................. 43
4.4.1 Identificação de E. coli ........................................................................... 44
4.5 Método da presença/ausência de E. coli ...................................................... 44
4.5.1 Detecção do sorotipo de E.coli O157:H7 ............................................... 45
4.5.2 Extração do DNA ................................................................................... 46
4.5.3 PCR para diferenciação dos tipos patogênicos de E. coli ..................... 46
4.6 Análise de Salmonella sp. ............................................................................ 49
4.6.1 Identificação de Salmonella sp. ............................................................. 50
4.7 Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos ........................................... 50
5 Resultados e Discussão ................................................................................... 52
5.1 Valores de pH das polpas de frutas congeladas e frutas minimamente
processadas ........................................................................................................... 52
5.2 Contagem de Bolores e Leveduras .............................................................. 53
5.3 Contagem de coliformes termotolerantes e presença de E.coli ................... 57
5.3.1 Confirmação de fatores de virulência de E. coli potencialmente
patogênicas por PCR .......................................................................................... 60
5.4 Presença de Salmonella sp .......................................................................... 63
5.5 Relação de amostras em conformidade com a legislação RDC nº12/2001 . 65
5.6 Análise da susceptibilidade dos patógenos aos antimicrobianos ................. 67
6 Conclusões ....................................................................................................... 72
7 Referências Bibliográficas ............................................................................... 73
14
1. Introdução
Polpas de frutas são consumidas diariamente em bares e restaurantes
como alternativa às bebidas industrializadas gaseificadas, assim como, utilizadas
para consumo em domicílio devido às suas características saudáveis. Na indústria,
os processos utilizados para comercialização destes produtos incluem a
pasteurização e o congelamento. Porém, esses mecanismos podem ser falhos na
fase de produção provendo de erro humano, irregularidades nos equipamentos ou a
temperatura inadequada durante o transporte e armazenamento, podendo acarretar
em uma contaminação do produto.
O mercado de frutas minimamente processadas está em crescente
desenvolvimento no país, uma vez que elas estão nas preferências do consumidor
como uma alimentação saudável com a praticidade de se consumir o produto com
características semelhantes à fruta in natura.
Os procedimentos para obtenção de frutas minimamente processadas
devem ser realizados cuidadosamente com a finalidade de evitar qualquer
contaminação do produto final, visando uma melhor qualidade e maior vida útil do
alimento. A matéria prima é selecionada, higienizada, cortada e armazenada em
temperatura adequada para limitar o crescimento de micro-organismos deteriorantes
e patogênicos. O processamento mínimo aumenta a perecibilidade do produto
devido aos danos mecânicos sofridos pelo corte que libera enzimas que aceleram
sua degradação.
Contudo, estes produtos podem oferecer riscos à saúde devido à sua
manipulação, permitindo a contaminação de micro-organismos patogênicos que
podem ser resistentes ao ácido da fruta e ao congelamento, vindo a causar
infecções e intoxicações alimentares.
Salmonella e Escherichia coli, conhecidos por causar vários surtos de
doenças transmitidas por alimentos (DTA) ocorridos em todo o mundo, podem estar
presentes nas frutas e em produtos derivados delas. Salienta-se a capacidade
desses micro-organismos suportarem condições de baixas temperaturas e
ambientes ácidos.
O Brasil, entre 2007 e 2016, apresentou cerca de 121 mil pessoas
doentes devido a contaminação de origem alimentar, totalizando mais de seis mil
15
surtos. A região sudeste é a mais afetada pelas DTAs com 43,6% dos casos em
2016, seguida pela região sul com 24,6% no mesmo período. Dentre os micro-
organismos mais envolvidos em surtos notificados, Escherichia coli e Salmonella
lideram o ranking (SINAN, 2016).
Beuchat (2002) relata que existe uma estreita afinidade entre o consumo
de vegetais crus e doenças transmitidas por alimentos e alguns dos motivos citados
são: a adaptação de micro-organismos patogênicos às condições ambientais de
estresse, práticas de processamento impróprias, maior consumo de alimentos
prontos para o consumo e globalização.
Os trabalhos encontrados no Brasil avaliam a qualidade microbiológica de
frutas e produtos de frutas. No entanto, ainda são escassos os trabalhos destacando
a investigação de patógenos como Salmonella sp. e Escherichia coli com perfil
patogênico e a susceptibilidade destes a agentes antimicrobianos.
16
2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
Avaliar a qualidade microbiológica de polpas de frutas congeladas e frutas
frescas fracionadas comercializadas no município de Campinas-SP e verificar a
presença de Salmonella sp. e Escherichia coli patogênica.
2.2 Objetivos específicos
Verificar se as amostras de polpas de frutas e frutas minimamente
processadas estão em conformidade com os padrões microbiológicos propostos
pela RDC nº 12/2001 para Salmonella e coliformes termotolerantes e Instrução
Normativa nº1/2000 do Ministério da Agricultura e Abastecimento para bolores e
leveduras.
Caracterizar o potencial patogênico de E. coli através da detecção dos
principais genes de virulência stx1, est1b, ipaH, eae e agg pela técnica da
Polymerase Chain Reaction (PCR).
Avaliar a susceptibilidade dos isolados a diferentes agentes
antimicrobianos
17
3 Revisão Bibliográfica
3.1 Polpa de Fruta Congelada
A produção de polpa de fruta no Brasil é promissora, uma vez que a
preocupação com a qualidade de vida tem transformado o comportamento do
consumidor, que gradativamente vem substituindo os refrigerantes por opções mais
saudáveis. Segundo o Instituto Brasileiro de Frutas (IBF), nos últimos oito anos as
exportações brasileiras cresceram em média 19% ao ano, alcançando a posição de
maior exportador de polpas de frutas tropicais (SEBRAE, 2013).
As polpas de maior relevância no mercado brasileiro são as derivadas do
processamento de frutas tropicais como, abacaxi, acerola, cupuaçu, goiaba,
graviola, mamão, manga, maracujá, dentre outras, que resultam em produtos de
grande aceitação. Por meio destes é possível a preparação de, por exemplo, sucos,
sorvetes e doces, atendendo às necessidades de donas de casa, restaurantes e
indústrias (SEBRAE, 2013).
O congelamento de polpa de fruta é um método de conservação que
preserva as características da fruta, permitindo seu consumo em períodos de
entressafra. Isto possibilita ao produtor uma alternativa para a utilização de frutas
que não atendam ao padrão de comercialização do produto in natura (MATTA, et al.
2005).
A polpa de fruta deve apresentar a mesma composição da porção
comestível da fruta sã, fresca e estar no estado ótimo de maturação. Podem ser
classificadas como polpas simples ou mistas, sendo a primeira originada de uma
única fruta e a segunda de duas ou mais (ANDRADE, 2004).
Este produto não exige uma seleção e classificação das frutas tão
rigorosa quanto àquela necessária para produzir o suco de fruta ou doce em calda,
em especial nos quesitos aspecto e uniformidade, uma vez que a matéria-prima será
triturada ou desintegrada e, por fim, despolpada (MORAES, 2006).
A utilização da polpa de fruta como matéria-prima vem sendo empregada
para indústrias na fabricação de néctares, sucos, geleias, doces, iogurtes, alimentos
infantis, etc, assim como para consumo direto. Porém, durante a colheita,
processamento e manipulação, os alimentos podem ser contaminados com uma
diversidade de micro-organismos (CARDONHA et al, 2009).
18
Diversos surtos de doenças alimentares causadas por bactérias
patogênicas podem ser atribuídos ao consumo de sucos de frutas não pasteurizadas
(FERREE; HUDAK, 2003), o que inclui, também, os sucos produzidos através de
polpas de frutas congeladas, devido à sua praticidade na hora do preparo e sua
longa vida de prateleira (em média um ano sob congelamento).
As características químicas, físicas e sensoriais das polpas devem ser
provenientes do fruto de origem e não podem ser alteradas pelos equipamentos,
utensílios, recipientes e embalagens utilizadas durante o processamento e
comercialização. Devem possuir cor, sabor e aroma semelhantes ao da fruta in
natura. Os parâmetros físico-químicos que indicam a qualidade das polpas são: pH,
sólidos solúveis totais, açúcares totais, acidez total titulável e ácido ascórbico
(BRASIL, 2000).
Quanto aos padrões microbiológicos, é importante que sejam realizadas
análises para avaliar a presença de micro-organismos patogênicos, conhecer as
condições de higiene em que os alimentos são preparados, os riscos que o alimento
pode oferecer à saúde do consumidor e a vida útil do produto. Assim, é possível
verificar se os padrões e especificações microbiológicas para alimentos,
estabelecidos por legislações nacionais, estão sendo atendidos adequadamente
(FRANCO; LANDGRAF, 2005).
A Instrução Normativa nº 1 de 07 de Janeiro de 2000, do Ministério de
Agricultura e do Abastecimento (BRASIL, 2000) estabelece valores máximos de 1
NMP.g-1 de coliformes termotolerantes, máximo de 5x103 UFC.g-1 de bolores e
leveduras, para polpa congelada ou in natura e ausência de Salmonella em 25 g do
produto. Polpas que forem destinadas à industrialização de outras bebidas e não
destinadas ao consumo direto, poderão ser adicionados aditivos químicos, sendo
para estas 2x103 UFC.g-1 o limite máximo para bolores e leveduras, assim como
para àquelas que sofrerem tratamento térmico.
De acordo resolução RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001, da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde (ANVISA) (BRASIL, 2001), é
estabelecido um valor máximo de 102 UFC/g para coliformes termotolerantes e
ausência de Salmonella em 25 g. Não há padrões para bolores e leveduras.
19
A Resolução RDC nº12/2001 e a Instrução Normativa nº1 do Ministério da
Agricultura não exigem pasteurização no processamento da polpa de fruta
congelada.
3.1.1 Etapas do processo de produção de polpas de frutas congeladas
De acordo com o fluxograma (Figura 1), a produção de polpas de frutas
congeladas passa por várias etapas até chegar ao produto final. Primeiramente, é
realizada a recepção das frutas bem como sua pesagem, que será realizada em
duas etapas: uma quando se recebe os frutos e outra após a seleção. As indústrias
produtoras de polpa devem realizar o controle físico-químico das frutas para que
possam manter o grau de qualidade de seus produtos. A recepção é a etapa onde o
lote da matéria-prima pode ser especificado pelos parâmetros físico-químicos, peso,
tamanho, textura e cor (ALVES, 2009; TOLENTINO & GOMES, 2009).
A primeira seleção é realizada pelos funcionários do setor, sendo
observado as características da fruta (amassadas ou não) e o grau de
amadurecimento. Em seguida, são transferidas para a esteira onde será realizada a
primeira lavagem. A etapa de seleção é imprescindível, pois qualquer fruto podre,
verde ou machucado pode interferir no sabor final. Após a seleção, os frutos são
lavados e imersos em água clorada (100 a 200 ppm) por 3 minutos. Em seguida, é
realizada a segunda lavagem onde as frutas são encaminhadas para um tanque
com água sem cloro e imersas por mais 3 minutos (ALVES, 2009; MATTA, 2005).
Os frutos passam pela remoção da casca, que pode ser realizada
manualmente ou com auxílio de máquinas. Já o despolpamento consiste em passar
os frutos descascados ou não por um equipamento chamado despolpadeira, dotado
de peneiras rotativas (refinamento) que separam a polpa da casca, semente e a
parte fibrosa (TOLENTINO; GOMES, 2009).
A polpa extraída é acondicionada, manualmente, em sacos plásticos ou
colocadas em um equipamento chamado dosadora, que enche as embalagens em
quantidades definidas. Após o envase as embalagens são fechadas à quente com
seladora manual e em seguida encaminhadas para o congelador (MATTA, et al,
2005).
20
As informações no rótulo devem vir seguidas de denominação da polpa
(polpa seguida do nome da fruta), peso (g), data de fabricação, data de validade e
expressões como: 100% integral (caso o produto não possua qualquer aditivo), não
fermentado e não alcoólico (MATTA, et al, 2005).
Figura 1 Fluxograma do processamento de polpa de fruta congelada
Fonte: Tolentino, Gomes, 2009
3.1.2 Qualidade Microbiológica de Polpas de Frutas
No Brasil, foram realizados trabalhos relatando a qualidade microbiológica
de polpas de frutas. Em 1996, um estudo sobre o perfil microbiológico de 43 polpas
coletadas de janeiro a abril em supermercados do Ceará e Rio Grande do Norte,
concluiu que 20 amostras (46,51%) estavam com contagens acima de 102 UFC.g-1
de bolores e leveduras e uma amostra estava imprópria para o consumo por
apresentar coliformes termotolerantes acima dos padrões microbiológicos (4 NMP.g-
1). Quanto à Salmonella todas as amostras apresentaram ausência em 25 gramas
do produto. O estudo revelou, sob o ponto de vista sanitário, que a maioria das
amostras encontrava-se em condições de higiene insatisfatórias. Recomendou-se,
21
portanto, a aplicação mais efetiva dos princípios de higiene e sanitização nas etapas
de produção (OLIVEIRA, et al., 1997).
Em 2002, em São José do Rio Preto –SP, Bueno et al. mostraram que
53% das 15 amostras de polpas de frutas analisadas microbiologicamente
apresentaram padrões não aceitáveis para consumo, devido à presença de
sujidades como partes de insetos, ácaros e larvas. Não foi verificado o crescimento
de bactérias, porém foi observado o desenvolvimento de fungos. Nas análises físico-
químicas, 4 das 15 amostras estavam irregulares e fora dos padrões legislativos.
Filamentos de micélio foram encontrados em 53% das amostras, sendo
imprescindível o controle microbiológico destes produtos.
No município de Palmas-TO, foi avaliado o perfil microbiológico de 98
amostras de polpas frutas congeladas de sabores e marcas variados coletadas no
período entre agosto de 2005 a junho de 2006 em mercados da cidade. Nas
análises de bolores e leveduras, 90% dos produtos analisados estavam
contaminados. Foi confirmada uma contagem de até 6,2x104 UFC.g-1 em 29,6%
encontrando-se, portanto, fora dos padrões legislativos. Coliformes termotolerantes
estavam presentes em cinco amostras com contagens entre 0,3 e 0,9 NMP.g-1. Os
resultados indicaram a falta de controle sanitário, evidenciando que as condições de
limpeza e armazenamento não estavam de acordo com os padrões de Boas Práticas
de Fabricação (SANTOS, et al, 2008).
Dantas et al (2012) analisaram 19 polpas de frutas congeladas em
Campina Grande – PB e foi observado a presença de várias bactérias, dentre elas
algumas patogênicas como a Salmonella encontrada em 4 amostras contrariando a
legislação, que exige ausência em 25g do produto. Foram analisadas 4 marcas, das
quais uma delas estava em desacordo com os padrões da Instrução Normativa
nº1/2000 do Ministério da Agricultura para bolores e leveduras, confirmando uma
contagem de até 8,6x104 UFC.g-1. Todas as amostras estavam de acordo com a
RDC nº12/2001 para coliformes termotolerantes.
3.2 Frutas minimamente processadas
As frutas minimamente processadas são aquelas que, essencialmente,
sofreram alterações físicas e manipulação, ou seja, foram descascadas, picadas,
22
cortadas, torneadas ou raladas, porém mantidas no seu estado fresco e
metabolicamente ativas (MORETTI, et al, 2007).
Frutas frescas têm uma popularidade maior em relação às frutas
processadas, contudo a dificuldade de conservação e a procura na facilidade de
consumo levaram ao surgimento das frutas minimamente processadas. Elas têm o
propósito de oferecer um produto com características similares ao produto
originalmente fresco, sem perder suas propriedades nutricionais e com vida útil
aceitável para sua distribuição, comercialização e consumo (HUBINGER, et al,
2003). O setor de alimentos minimamente processados tem sido próspero como um
todo e se diversificado, abrangendo novos produtos, inclusive as frutas. Como setor
da agroindústria moderno e competitivo, os processadores dependem de inovação
tecnológica e da adoção de sistemas de garantia de qualidade para a
sustentabilidade do agronegócio (CENCI, et al, 2006).
Alimentos minimamente processados têm sido desenvolvidos para
atender ao mercado de conveniência de saladas, sopas e pizzas, bem como para
venda ao varejo, principalmente em grandes supermercados. Nos países
desenvolvidos, cerca de 70% desses produtos são utilizados em cozinhas
industriais, “fast-foods” e restaurantes, devido à sua praticidade e por apresentarem
qualidade nutricional e sensorial proeminente. As frutas minimamente processadas
são adquiridas principalmente, por consumidores individuais, em razão da mudança
de estilo de vida e das tendências saudáveis. Em geral, as frutas já apresentam uma
sinalização positiva no mercado por apresentarem potencial de comercialização e
aceitação por parte do consumidor (BASTOS, 2006).
Muitas frutas já apresentam características desejáveis ao processamento
mínimo como o abacaxi, melancia, melão, goiaba, manga, carambola e jaca,
resultando em produtos bem aceitos pelo seu público-alvo, no qual visam à
conveniência de produtos frescos, prontos e com boa qualidade de higiene
(DURIGAN, 2004).
Produtos minimamente processados são mais perecíveis do que os in
natura, pois sofrem injúria nos tecidos devido à sua manipulação, favorecendo o
crescimento microbiano. A contaminação da matéria-prima pode prover do solo, pelo
contato com fezes de animais, na colheita, manuseio e transporte pelos
manipuladores, armazenagem durante o trajeto, e até na indústria no decorrer das
23
etapas de processamento do produto. Medidas preventivas como Boas Práticas de
Produção (BPP), Boas Práticas Agrícolas (BPA) e a introdução da análise de perigos
e pontos críticos de controle (APPCC) são fundamentais para o conhecimento e
precaução de eventual contaminação microbiana (WILEY, 1997).
A maioria das frutas, em seu estado natural, está susceptível à
colonização de micro-organismos em razão de seus fatores intrínsecos como
atividade de água e pH e/ou extrínsecos como temperatura de armazenamento, por
exemplo. As frutas minimamente processadas com um pH superior a 4,6 e atividade
de água (aw) maior que 0,85 são altamente perecíveis quando não expostas a
processos de preservação que diminuem as reações bioquímicas indesejáveis.
Neste grupo estão incluídos o melão Cataloupe e a melancia, com pH mais elevado
(> 5,2) que propicia o desenvolvimento de Salmonella e E.coli (BASTOS, 2006).
Quanto aos padrões microbiológicos, a RDC nº 12 de 2001, da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2001) estabelece um valor máximo de
5x102 UFC/g para coliformes termotolerantes e ausência de Salmonella em 25 g.
3.2.1 Etapas de produção de frutas minimamente processadas
O processamento é todo realizado a 12ºC com utensílios higienizados em
água clorada e os operadores devem estar protegidos com luvas, aventais, gorros e
máscaras para evitar ao máximo a contaminação (DURIGAN, 2004). Recomenda-se
que o ambiente para armazenamento do produto final deve estar climatizado a
temperaturas menores que 7ºC, ampliando a sua vida de prateleira e limitando o
desenvolvimento de bactérias nocivas à saúde (MORETTI, et al, 2007).
Os frutos são colhidos e passam por seleção e classificação, pré-
lavagem, sanitização, centrifugação, descascamento e corte, e embalagem (Figura
2), visando oferecer um produto saudável, que não necessita de preparo pelo
consumidor.
Com a chegada em caminhões munidos de boa condição de higiene e
transporte, a matéria-prima é recebida e a qualidade geral do lote é avaliada.
Imediatamente são destinadas ao armazenamento em câmara fria dotada de
controle de temperatura e umidade relativa, com sistema de ventilação que mantém
a temperatura em, no máximo 10ºC até o processamento. As frutas são
24
selecionadas e as de baixa qualidade e estragadas são separadas, e as viáveis são
lavadas a 4ºC com detergente para retirar as sujidades. Na sanitização, os frutos
são imersos em solução clorada de 100 a 200 ppm de cloro ativo a 5ºC por
aproximadamente 10 minutos. Após esse procedimento, é realizada a centrifugação,
cujo objetivo é a remoção do excesso de água do produto, seguido de
descascamento e corte. As embalagens são de polietileno ou poliestireno
expandido, dependendo do produto final. No armazenamento, os produtos
embalados são mantidos em caixas plásticas e transportado à câmara fria a 2ºC, na
qual ficam estocadas até a distribuição para grandes centros comerciais (MÜLLER,
et al., 2011, BASTOS, 2006).
Figura 2 Fluxograma do processamento de frutas minimamente processadas
Fonte: Bastos, 2006; Müller, et al, 2011
Nas indústrias de processamento mínimo foram colocadas em prática
ações de melhoria da sanitização das frutas. A reavaliação do fluxo de trabalho,
incluindo mudanças nas instalações, e nos procedimentos de manipulação da
matéria-prima e do produto acabado, foram realizadas a fim de evitar a
contaminação por patógenos. Assegurou-se uma padronização do produto final, com
níveis de micro-organismos nocivos à saúde e deteriorantes dentro dos limites
25
aceitáveis pela legislação, o que contribuiu para elevar a vida útil dos produtos,
tornando-os mais seguros (CENCI, et al, 2006).
3.2.2 Qualidade Microbiológica de Frutas Minimamente Processadas
A avaliação microbiológica realizada em trabalhos com frutas
minimamente processadas no Brasil tem relevância, pois os consumidores estão
cada vez mais habituados a estes produtos, devido à sua praticidade e qualidade
similar ao de origem.
A elevada quantidade de ácidos orgânicos, como o cítrico, málico e
tartárico são responsáveis pelo pH baixo das frutas. Alguns nutrientes importantes e
também presentes nos vegetais são as vitaminas e minerais. Sendo assim, as frutas
possuem os nutrientes indispensáveis para promover o crescimento de micro-
organismos como as bactérias, bolores e leveduras. Nos frutos, a grande proporção
de água e baixa quantidade de carboidratos possibilitam que a maior parte da água
esteja na sua forma livre, facilitando o crescimento de bactérias. Apesar da
disponibilidade de nutrientes, muitas possuem o crescimento inibido pelas condições
ácidas de pH, favorecendo também o crescimento de bolores e leveduras
(González-Aguilar et al., 2005).
Pui et al (2011) determinaram a quantidade e prevalência de Salmonella
spp., S. Typhimurium e S. Typhi em frutas fatiadas comercializadas em
supermercados e vendedores ambulantes na Malásia. Foram coletadas 210
amostras como mamão, melancia, manga, sapoti, pitaya e melão. Os patógenos só
foram encontrados em frutas de vendedores ambulantes. O número máximo de
Salmonella encontrado foi de 19 NMP.g-1, menor do que a média de contagens em
carne, porém como a fruta é ingerida crua, o risco de infecção é maior.
Em Fortaleza, foram analisadas microbiologicamente 15 amostras de
frutas minimamente processadas (mamão picado, abacaxi picado e salada de frutas)
coletadas de janeiro a maio de 2004 na região. Foram realizadas análises de
coliformes termotolerantes, Salmonella sp., contagem de bolores e leveduras,
contagem de Staphylococcus coagulase positiva e contagem total de psicrotróficos
após 10 dias de armazenamento a 10ºC. Todas as amostras de frutas atenderam
26
aos padrões da legislação para contagem de coliformes termotolerantes, porém
26,6% delas apresentaram presença de Salmonella sp., tornando-as impróprias para
o consumo. Das amostras positivas para este patógeno, duas foram de abacaxi e
duas de salada de frutas. O estudo sugere a adoção de Boas Práticas de Fabricação
durante o processamento mínimo para assegurar a qualidade microbiológica dos
produtos (BRUNO et al, 2005).
O processamento mínimo em goiabas foi realizado no laboratório
especializado de uma universidade em Jaboticabal/SP para avaliar a qualidade
microbiológica, química e sensorial do produto após todo o processo. Os frutos
foram colhidos de goiabeiras de cultivares da região, selecionando as de estágio de
maturação “de vez”, ideal para o consumo. Depois de colhidos, foram submetidos às
etapas do processamento, atendendo rigorosamente o controle da temperatura,
armazenamento e higiene. Devido a isto, a contagem de bactérias mesófilas,
coliformes totais e termotolerantes foram baixas (MATTIUZ et al, 2003).
Cem amostras de frutas minimamente processadas foram analisadas em
Fortaleza – CE, dentre elas, goiaba vermelha, manga, melão japonês, mamão
formosa e abacaxi. Análises de coliformes termotolerantes, contagem de bolores e
leveduras, Staphylococcus coagulase positiva e detecção de Salmonella sp. foram
realizadas. Das amostras analisadas, 25% estavam contaminados com Salmonella e
28% apresentavam coliformes termotolerantes com valores superiores a 5,0x10²
NMP.g-1. Estes resultados mostraram que 43 amostras estavam impróprias para o
consumo segundo a legislação vigente. Não foi observada a presença de
Staphylococcus coagulase positiva. A contagem de bolores e leveduras foi mais
elevada em 15 amostras de melão (75% das amostras analisadas), variando de
1,0x105 a 1,8x106. Os resultados deste trabalho recomendam a implantação de Boas
Práticas de Fabricação pelos estabelecimentos comerciais e uma efetiva fiscalização
do órgão sanitário, visando um produto saudável e seguro ao consumidor
(PINHEIRO et al, 2005).
Smanioto et al. (2009), analisaram a qualidade microbiológica de trinta
amostras da região de Bauru – SP, sendo quinze delas de frutas minimamente
processadas e quinze de hortaliças adquiridas de supermercados da região. Os
micro-organismos pesquisados foram coliformes termotolerantes e presença
27
Salmonella sp. Todas as amostras estavam dentro dos padrões vigentes na
legislação brasileira.
3.3 Desenvolvimento de E. coli e Salmonella sp. em frutas
É bem documentado que algumas cepas de Salmonella são resistentes
a baixas temperaturas. Morangos frescos foram inoculados com aproximadamente 6
log UFC.g-1 de cepas de Salmonella spp. e armazenados a -18ºC por 12 semanas.
Os resultados mostraram que o patógeno foi capaz de sobreviver em morangos
congelados por um período de 4 a 8 dias (HUANG et al, 2012).
Dados de uma pesquisa realizada pelo FDA em 1999, relataram que a
cada 143 amostras de morangos importados, uma estava contaminada com
Salmonella (FDA, 2001). Apesar do índice de contaminação ser baixo, mais estudos
são necessários para evitar possíveis contaminações.
No Brasil, em 2004, foi avaliado o crescimento de Salmonella Enteridis
em polpa de mamão, melancia e melão, constatando que o patógeno pode
sobreviver em frutas de baixa acidez e temperaturas baixas. Foi observado que o
crescimento diminuiu, porém não foi inibido (PENTEADO & LEITÃO, 2004).
Abadias et al (2012), relataram o potencial crescimento de E. coli
O157:H7 em melão e abacaxi cortados, mostrando que a 25ºC o melão obteve um
alto desenvolvimento do patógeno, enquanto no abacaxi não houve crescimento. E.
coli não se desenvolveu, porém sobreviveu a temperatura de 5ºC. O trabalho
mostrou a importância do desenvolvimento do patógeno em baixas temperaturas e a
sua sobrevivência em uma variedade de frutas e vegetais refrigerados.
Straw e Danyluk (2010) avaliaram o desenvolvimento de E. coli em
mangas e mamões em temperaturas ambiente e de refrigeração. A 12ºC, o
patógeno somente cresceu em mamão, mas sobreviveu até 28 dias na temperatura
de 4ºC em mangas e mamões. Já a 23ºC manteve seu desenvolvimento normal em
ambas as frutas.
A capacidade de resistência ao ácido de E. coli O157:H7 também tem
contribuído para a ocorrência de surtos envolvendo sucos de frutas ácidas. Esse
28
patógeno pode sobreviver em suco de abacaxi a 20-25ºC e até a 4ºC (PATIL, et al,
2010).
3.4 Salmonella sp e suas características
É caracterizada por ser um bacilo gram negativo e anaeróbico facultativo
que pertence à família das Enterobacteriaceae, a maioria apresentando flagelos em
toda superfície celular (RUSSEL, 2012). As salmonelas não fermentam a lactose, o
que as diferem de outras bactérias nos meios de identificação com esse açúcar. Não
formadoras de esporos, desenvolvem colônias oxidase-negativas e com formação
de gás. Elas podem estar presentes no ambiente, água e alimentos, devido à
contaminação por fezes de indivíduos doentes. No homem, pode causar vários tipos
de infecção como gastroenterite e febre tifoide (TRABULSI & ALTERTHUM, 2008).
Atualmente, o gênero Salmonella é dividido em 02 espécies: S. enterica e
S. bongori, sendo a primeira dividida em 06 subespécies: S. enterica subsp.
enterica; S. enterica subsp. salamae; S. enterica subsp. arizonae; S. enterica subsp.
diarizonae; S. enterica subsp. houtenae e S. enterica subsp. indica, entretanto, esta
divisão apresenta pouca importância epidemiológica (TRABULSI & ALTERTHUM,
2008; THAM, 2013;).
Os sorotipos mais frequentes são Salmonella Tiphimurium, S. Enteridis,
que são responsáveis por causar doenças gastrointestinais. A temperatura ideal de
crescimento é de 35º a 43ºC, mas também podem se desenvolver em uma faixa de
5º a 46ºC. O desenvolvimento pode ocorrer em pH de 3,8 a 9,5, a faixa ideal é de
7,0 a 7,5 e o mínimo de atividade de água para crescimento é de 0,94 (JUNQUEIRA,
et al, 2010). Os alimentos com maior incidência são de origem animal como frango,
carne, leite e produtos lácteos, mas pode ser encontrado em frutas e vegetais,
principalmente se não forem lavados corretamente (CARDOSO; CARVALHO, 2006).
São amplamente distribuídas na natureza, tendo o homem e os animais
como seus principais reservatórios, habitando principalmente os seus tratos
gastrointestinais. As que infectam somente o homem são Salmonella Typhi e
Salmonella Paratyphi, que incluem os agentes da febre tifoide, sendo que outros
sorotipos podem causar a salmonelose (JAY, 2005).
29
3.4.1 Surtos causados por Salmonella sp. associados ao consumo de frutas e
derivados
As carnes de frango, produtos de frango e ovos são os alimentos mais
associados aos surtos de salmonelose. No entanto, vegetais, incluindo frutas e
sucos também tem sido incriminados como veículos de transmissão.
Um surto ocorrido em 1999 envolvendo suco de laranja pasteurizado
contaminado com Salmonella Muenchen acometeu 207 pessoas em 15 estados dos
EUA e 2 no Canadá. A maior parte das pessoas infectadas declarou ter ingerido
suco de laranja pasteurizado do mesmo fornecedor (MMWR/CDC, 1999).
Em dezembro de 1999, nos EUA, um surto envolvendo Salmonella
Newport foi associado ao consumo de mangas frescas importadas do Brasil.
Ocorreram 78 casos e 2 mortes em 13 estados norte-americanos
(SIVAPALASINGAM et al., 2003).
Em 2010, no oeste dos EUA, polpa de fruta congelada de mamey,
importada da Guatemala, foi responsável por causar a febre tifoide em várias
pessoas (LOHARIKAR et al., 2012).
Salmonella Agona foi o agente ligado a um surto multiestadual nos EUA
envolvendo mamão fresco importado do México, onde foram registrados 97 casos,
incluindo 10 hospitalizações. O fornecedor foi obrigado a realizar um recall dos
produtos depois que o Food and Drug Administration (FDA) identificou o patógeno
na fruta (CDC, 2011).
Também nos EUA, Salmonella Saintpaul contaminou 84 pessoas devido à
ingestão de pepino importado do México, 28% das pessoas foram hospitalizadas,
porém não houve mortes (CDC, 2013a).
Novamente, nos EUA, foi publicado um surto envolvendo 907 pessoas
infectadas com Salmonella Poona, em 40 estados. Um total de 204 pessoas foram
hospitalizadas e 6 mortes registradas em 4 estados. O produto responsável foi
pepino importado do México e distribuído por uma empresa de grande porte na área
de venda de vegetais (CDC, 2016b).
Na Austrália, 26 pessoas foram infectadas com o patógeno identificado
como Salmonella Litchfield entre outubro de 2006 e janeiro de 2007. Um estudo
caso-controle foi realizado com 12 pessoas infectadas e 24 controles, e associou-se
30
o surto com o consumo de mamão papaya. Não foi encontrado o micro-organismo
em amostras ambientais da fazenda que fornecia a fruta, contudo detectou-se outros
sorotipos de Salmonella em amostras de água do local. A fonte de contaminação
mais provável seria de água de irrigação não tratada que era usada para regar as
frutas (GIBBS et al, 2009).
Surtos envolvendo outros vegetais também foram relatados de acordo
com dados do CDC (2016c). Vinte e cinco pessoas foram infectadas com cepas do
sorotipo Salmonella Muenchen e 1 pessoa por Salmonella Kentucky em 12 estados
dos EUA. De 26 pessoas infectadas, 8 foram hospitalizadas e ninguém veio a óbito.
Investigações colaborativas constaram que o surto foi devido ao consumo de broto
de alfafa que procedeu de um lote contaminado.
3.4.2 Salmonella sp e sua resistência aos antimicrobianos
A capacidade de micro-organismos em adquirir resistência aos
antibióticos, como é o caso da Salmonella, diminui a eficácia terapêutica dos
medicamentos, com implicações clínicas relevantes (FIGUEIREDO, 2013).
Os genes acr, mdt, mds, emr, mdt e mac são responsáveis pela
codificação de proteínas que promovem a resistência de Salmonella a diversos
antibióticos como novobiocina e eritromicina (NISHINO et al, 2009).
Salmonella enterica sorovar Kentucky demonstrou maior resistência ao
tratamento com o medicamento ciprofloxacina em uma pesquisa baseada na análise
de 76 isolados do patógeno submetidos ao Programa de Vigilância da Resistência
Antimicrobiana no período de 2003-2009 no Canadá. Dos 76 isolados, 35 se
mostraram sensíveis a todos os antimicrobianos do grupo das cefalosporinas e
fluoroquinolonas. Porém, 23 destes isolados (30%) apresentaram resistência à
ciprofloxacina. Além disso, a proporção de isolados de S. Kentucky com resistência
à ciprofloxacina aumentou de 22% em 2003 para 57% em 2009 (MULVAY, et al,
2013).
Singh e Mustapha (2014) testaram o método da PCR em tempo real
utilizando como alvo os genes que oferecem resistência às cepas de Salmonella aos
antimicrobianos. Os pesquisadores identificaram os genes responsáveis pela
31
resistência a estreptomicina (aadA2), tetraciclina (tetG), clorafenincol (floR) e
ampicilina (bla). Analisaram-se 41 cepas do patógeno que foram inoculadas em
amostras de alimentos para avaliar a sensibilidade do método, o que se mostrou
eficiente. Salmonella Typhimurium foi resistente à estreptomicina e tetraciclina e
Salmonella Enteridis foi resistente a todos os antimicrobianos testados.
Particularmente, em relação a Salmonella, existe grande preocupação em
todo o mundo devido a ocorrência cada vez mais frequente de cepas
multirresistentes. Por isso, programas nacionais e internacionais de vigilância
epidemiológica foram criados com o intuito de identificar os padrões de resistência
das cepas ao longo do tempo, contribuindo, assim, para a identificação de fatores de
risco e suas implicações na saúde pública (YAN et al., 2003).
De acordo com um estudo de Hirose et al. (2001), Salmonella Typhi
apresentou resistência aos antimicrobianos ampicilina, cloranfenicol, sulfametoxazol
e trimetoprim. Das 62 cepas de Salmonella Typhi e 37 Salmonella Paratyphi isoladas
de pacientes japoneses no período de 1997 a 1999, cinco isolados e dez
respectivamente, foram resistentes a todos esses antibióticos.
White et al. (2001) realizaram um estudo com 45 culturas de Salmonella
sp. isoladas de amostras de carne moída coletadas no varejo de Washington (EUA)
no período de junho a setembro de 1998. Todas mostraram resistência aos
antibióticos amikacina, apramicina, ciprofloxacina e ácido nalidíxico. Oitenta por
cento dos isolados foram resistentes a tetraciclina e 73% a estreptomicina.
Isolados de Salmonella não-tifoidal (n=23.761) foram recuperados desde
2003 até 2013, sendo 21.390 advindos de fezes ou sangue, 1.390 da urina e 983 de
outras fontes. As cepas foram classificadas quanto à sua resistência aos
antimicrobianos amoxicilina, ampicilina, cefoxitina, ceftiofur, ceftriaxona,
cloranfenicol, ciprofloxacino, gentamicina, kanamicina, ácido nalidíxico,
estreptomicina, sulfametoxazol (sulfonamida), tetraciclina e
tripetropim/sulfametoxazol. A tetraciclina obteve o maior número de cepas
resistentes (n=2.695), seguido do sulfametoxazol (n=2.289), estreptomicina
(n=2.199) e ampicilina (n=2.194). O antimicrobiano com menor taxa de isolados
resistentes (n=7) foi a azitromicina (ANGELO, et al, 2016).
32
3.5 Escherichia coli e suas características
Escherichia coli foi reconhecida como patógeno de origem alimentar em
1971, quando queijos importados da América do Sul causaram, aproximadamente
400 casos de gastroenterite nos EUA (JAY, 2005).
Pertence à família Enterobacteriaceae, se apresenta como um bacilo
curto gram-negativo, não esporulado e geralmente com flagelo peritríqueo.
Anaeróbio facultativo, habita o trato gastrointestinal de humanos e animais (ESLAVA
et al, 2003). É um mesófilo típico, capaz de se desenvolver entre 7º e 46ºC, com
temperatura ótima de desenvolvimento a 37ºC, embora existam cepas que possam
se multiplicar a 4ºC. O pH ótimo para seu crescimento é próximo do neutro, mas a
multiplicação pode ocorrer a 4,4 e a atividade de água ótima é de 0,95. Pode ser
encontrado em água e solos contaminados, e estes podem ser responsáveis pela
contaminação em diversos tipos de alimentos desde a carne bovina e produtos
lácteos até os vegetais crus (JAY, 2005; TRABULSI, 2008).
E. coli possui vários tipos patogênicos conhecidos, como: E. coli
enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli entero-
hemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC)
e E. coli difusamente aderente (DAEC) (KAPER et al. 2004).
A forma de contaminação por E.coli patogênica pode se dar por diferentes
fontes assim como mostra a Figura 3. Cepas do patógeno podem ser encontradas
em vários animais que podem servir de reservatórios contaminando água, solo e
alimentos. Assim, seres humanos podem ser infectados pela ingestão de água e
alimentos ou pelo contato direto com esses animais. Uma contaminação secundária
pode ocorrer entre humanos que possuem contato direto no dia a dia, assim como
utilizar utensílios contaminados com o corte de determinado alimento para o preparo
de outros produtos.
33
Figura 3 Ciclo de contaminação e transmissão de Escherichia coli patogênica
Fonte: CROXEN et al, 2013
ETEC pode ser transmitida através de alimentos ou água contaminadas
com fezes de humanos e animais. No intestino produz duas toxinas, uma termolábil
(LT) e outra termoestável (ST) responsáveis por elevar os níveis de AMPc
(monofosfato cíclico de adenosina), levando a alteração do equilíbrio hidrossalino do
lúmen intestinal, resultando na secreção de eletrólitos contribuindo para uma
possível desidratação da pessoa afetada (TRABULSI, 2008). Os fatores de
colonização (CFs) são produzidos por ETEC e são caracterizados por possuírem
estruturas filamentosas de natureza proteica, antigênicas que se encontram
distribuídas na superfície bacteriana sendo responsáveis pela adesão, colonização e
multiplicação no interior da célula hospedeira, evitando que a mesma seja removida
pelos movimentos peristálticos do intestino (TRABULSI, 2008).
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) está associada com surtos em
maternidades, acomete, em sua maioria, crianças causando diarreia aquosa, vomito
34
e febre. O seu principal mecanismo de ataque é denominado attaching-effacing
causando lesão e destruição das microvilosidades do epitélio intestinal. O bundle-
forming pilus (BFP) é encontrado em colônias típicas de EPEC e tem se mostrado
um importante fator de virulência, uma vez que é responsável pela interação
bactéria-bactéria e formação de microcolônias (NATARRO; KAPER, 1998 apud
CLEARY, et al, 2004). As intiminas são proteínas que estão relacionadas com o
potencial de virulência de EPEC, produzindo uma adesão íntima e irreversível às
células epiteliais. O sistema de secreção tipo III é uma série de proteínas secretadas
por EPEC que são injetadas no citoplasma do enterócito resultando em variás
alterações como morte celular por apoptose, disfunção de mitocôndrias e diminuição
da barreira defensiva da mucosa intestinal (TRABULSI, 2008).
Escherichia coli enteroinvaisa (EIEC) produz infecções similares à
Shigella (que também possui os mesmos fatores de virulência). É caracterizada por
colonizar o epitélio, produzir toxinas iniciando com uma diarreia aguda e aquosa,
febre, dores abdominais e evoluindo para fezes mucossanguinolentas. São
altamente invasivas colonizando o interior das células epiteliais causando a morte
dos macrófagos, também são resistentes a diversos ambientes inóspitos como o
estômago com o pH extremamente baixo, mudanças de temperaturas e stress
oxidativo. O gene ipaH é responsável por causar a supressão do sistema de auto-
defesa do hospedeiro gerando uma resposta inflamatória (CROXEN, et al, 2013).
Associada aos surtos com diarreia persistente contendo sangue, a
Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) produz citotoxinas, causando alterações
hemorrágicas com habilidade de aderir de forma empilhada às células intestinais,
acometendo principalmente crianças. Produzem diversas enterotoxinas que causam
a destruição das células do epitélio intestinal e algumas cepas são capazes de
produzir a toxina de shiga. Um dos principais genes, o agg, está envolvido na
regulação de diversos fatores de virulência para aderência e produção de toxinas
(CROXEN, et al, 2013).
Eschericha coli entero-hemorrágica ou Escherichia coli produtora de
toxina de shiga (EHEC ou STEC) causa uma das formas mais graves de diarreia
sanguinolenta, pode evoluir para uma síndrome hemolítica urêmica (HUS) devido a
produção de toxinas de Shiga (STX1 e STX2) (ESLAVA, 2003; BERTÃO et al,
2007). Quando as células de STEC entram em contato com as células intestinais, as
35
toxinas STX1 e STX2 são produzidas no intestino grosso e translocadas pelo epitélio
intestinal para a circulação sanguínea. A toxina, quando se liga ao seu receptor, é
endocitada e transportada para o complexo de Golgi e, posteriormente, para o
retículo endoplasmático, bloqueando a síntese de proteínas, o que resulta em lesão
e perda de integridade das células endoteliais vasculares pela necrose ou apoptose,
cujo efeito pode ser local ou sistêmico. Essas toxinas, em contato com os rins, via
corrente sanguínea, causam danos ao endotélio vascular e oclusão dos microvasos,
por meio de uma combinação de toxicidade direta e indução da inflamação local, os
quais podem levar à síndrome hemolítica urêmica (CALDORIN, et al, 2013).
Não são encontrados muitos estudos sobre E. coli difusamente aderente
(DAEC) que é identificada assim devido à sua capacidade de se aderir de forma
difusa às células. O termo “difusamente aderente” foi utilizado para definir culturas
típicas de EPEC, que se aderiam de forma diferente das outras cepas comuns na
célula hospedeira (SCALETSKY et al, 1984). Posteriormente, foi definido que a
categoria E.coli difusamente aderente (DAEC) ficou restrito àquelas cepas que
possuíam a capacidade de se aderir de modo homogêneo nas células
(HERNANDES et al, 2009).
E.coli aderente invasiva (AIEC) tem sido implicada em casos de diarréia
aguda, conhecida como uma inflamação intestinal que afeta principalmente o
intestino delgado. Sua patogênese é conhecida por sua habilidade de se aderir e
invadir células epiteliais e se replicar utilizando um pili para adesão (CROXEN et al,
2013).
O processo de virulência da E. coli patogênica ocorre de acordo como a
Figura 4, onde EPEC e STEC são patógenos que atuam na parede extracelular
atacando o epitélio do intestino destruindo as microvilosidades, caracterizando um
processo de “attaching and effacing”. EPEC é capaz de formar microcolônias
resultando em padrão de aderência localizado (LA) e ETEC usa fatores de
colonização (CF’s) para atacar as células hospedeiras. EAEC forma biofilmes na
mucosa intestinal e a bactéria consegue se aderir bem às células da superfície
formando um padrão de aderência agregativa (AA), conhecido como “stacked brick”
que significa “tijolos empilhados”. DAEC se dispersa em toda a superfície das
células intestinais, resultando em um padrão de aderência difusa. AIEC coloniza a
mucosa intestinal de pacientes com doença de Crohn sendo capaz de invadir células
36
epiteliais assim como se replicar no interior de macrófagos. A célula bacteriana de
AIEC utiliza pili tipo I para se aderir às células intestinais e uma longa fímbria polar
que contribui para sua invasão. EIEC de E.coli/Shigella são patógenos intracelulares
que penetram no epitélio intestinal através das células M para ter acesso à
submucosa. Ela consegue resistir aos macrófagos pela indução da morte dos
mesmos, seguido de uma invasão basolateral dos colonócitos propagando as suas
laterais (CROXEN et al, 2013).
3.5.1 Surtos causados por E.coli associados ao consumo de frutas e
produtos de frutas
E. coli O157:H7 teve seu primeiro relato em 1982 quando ocorreu um
surto de diarreia sanguinolenta nos EUA (ELÍZAQUÍVEL et al, 2014). É uma bactéria
patogênica, cuja doenças transmitidas por alimentos (DTAs) são classificadas pela
Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas em Alimentos (ICMSF) no
Figura 4 Mecanismos de virulência de estirpes de E.coli patogênicas em células epiteliais
Fonte: CROXEN et al, 2013
37
principal grupo de risco, que inclui doenças de alta gravidade para a população em
geral, representando perigo de morte ou sequelas de longa duração (ICMSF, 2002).
O trato intestinal de ruminantes parece ser o principal habitat de E. coli O157:H7, o
que incrimina em surtos envolvendo carne bovina mal-cozida, leite cru, vegetais,
molhos para saladas, maionese e suco de maçã (SANDERSON, et al, 1995).
Surtos associados com frutas e sucos têm sido relatados nos EUA. De
acordo com o CDC (1997), os alimentos frequentemente implicados em surtos
provocados por cepas de E. coli, no período de 1993 a 1997, foram a carne bovina
(25%) seguido das frutas e vegetais (20%). O FDA acredita que dentre essas cepas,
a mais frequente é a E. coli sorotipo O157:H7.
Em 1991, nos Estados Unidos, 23 pessoas foram contaminadas através
do consumo de cidra de maçã não pasteurizada. Aparentemente, as maçãs foram
recolhidas do chão e contaminadas com esterco de bovinos (FENG, 1995 apud
SILVA, et al, 2003). Em 1996, ocorreram dois surtos nos Estados Unidos,
provocados também pelo consumo de suco de maçã não pasteurizado. O primeiro
atingiu pelo menos 70 pessoas, espalhadas por vários estados do oeste, com 3
casos de HUS e 1 morte. O segundo atingiu 45 pessoas dos estados da Califórnia,
Colorado, Columbia Britânica e Washington, com 12 casos de HUS, mas nenhuma
morte (CDC, 1996 apud SILVA et al, 2003).
Entre 1995 e 2005, nos EUA, 21 casos de contaminação com E. coli
O157:H7 foram confirmados através da ingestão de sucos de frutas. Surtos recentes
relatados no CDC mostraram que frutas podem ser veículos de patógenos como E.
coli (PATIL et al, 2008).
Em 2011, um surto ocorreu em Oregon (Canadá) envolvendo morango
contaminado com E. coli O157:H7 comercializados em uma fazenda. Quinze
pessoas adoeceram com um óbito (STONE, 2011).
Em julho de 2011, um surto associado ao consumo de guacamole
vendido em um restaurante do Texas acometeu 11 pessoas, incluindo 2
hospitalizações, o alimento estava contaminado com a cepa E.coli O157:H7
(CHAPMAN & POWELL, 2011).
Nesta presente pesquisa, não foram encontrados mais surtos
relacionados às frutas no mundo, porém há relatos envolvendo outros tipos de
vegetais. Um surto multiestadual envolvendo o patógeno E.coli O157:H7 foi relatado
38
nos EUA infectando 33 pessoas, sendo 32% delas hospitalizadas, duas com SHU,
mas nenhuma morte. O alimento alvo foi salada pronta para comer, cujo recall foi
realizado assim que foi identificado o patógeno (CDC, 2013b).
Nos EUA, em dois estados (Minnesota e Wisconsin), 11 pessoas que
consumiram brotos de alfafa foram infectadas pelo patógeno E.coli STEC O157 e 2
hospitalizadas, mas nenhuma apresentou SHU. Brotos são conhecidos por
transmitirem doenças de origem alimentar, portanto se recomenda o uso das boas
práticas de fabricação e de segurança na manipulação destes alimentos (CDC,
2016a).
Estudos com populações patogênicas de E. coli vem sendo realizados em
diversas partes do mundo, na área da pesquisa básica e aplicada, envolvendo
pesquisas relacionadas ao diagnóstico, prevenção, virulência, diversidade, evolução
e epidemiologia de suas infecções (TORRES, 2010).
3.5.2 E. coli e a resistência aos antimicrobianos
Cepas bacterianas podem adquirir resistência a diversos antimicrobianos,
devido à frequência com que são usados na agricultura. Foi encontrado em E. coli
genes envolvidos na resistência do antibiótico tetraciclina no solo de diferentes
regiões da Holanda, aproximadamente oito vezes mais resistente em 2008 do que
em 1970-1979 (BECH et al, 2014).
Na Malásia, foram encontradas cepas resistentes de E. coli nas mãos de
manipuladores de alimentos de colégios locais. Foram isoladas 28 cepas e os
antibióticos utilizados na pesquisa foram penicilina (10 µg), ampicilina (10 µg),
gentamicina (10 µg), kanamicina (30 µg), tetraciclina (30 µg), cloranfenicol (30 µg),
trimetoprim (5 µg), sulfamethoxazol (25 µg), ciproflaxina (5 µg) e nitrofurantoina (300
µg). A porcentagem de cepas de E. coli resistentes a penicilina e cloranfenicol foi de
85,71%; 57,14% resistentes a sulfamethoxazol, ampicilina e trimetoprim, 28,57%
resistentes a kanamicina e tetraciclina e 14,29% à ciproflaxina. Todos os isolados
mostraram susceptibilidade a nitrofuratoina e gentamicina. A resistência do patógeno
aos antimicrobianos foi alta, podendo causar complicações no quadro de pacientes
enfermos (TAN, et al. 2014).
39
Um estudo realizado em São Paulo no ano de 2001, avaliou o perfil de
resistência de cepas de E.coli a determinados antimicrobianos em 600 amostras de
fezes de leitões com diarreia, e constatou-se que todas elas foram resistentes a pelo
menos 5 dos 13 antimicrobianos testados. Os antibioticos com maior eficácia foram
o cloranfenicol (97% das amostras), estreptomicina (96%), oxitetraciclina (97%) e
norfloxacina (92%) (BACCARO, et al, 2002).
Brito & Tagliari (2000), realizaram o mesmo estudo no Paraná com 224
cepas isoladas de leitões lactentes e obtiveram resultados divergentes em relação à
resistência de E.coli aos antimicrobianos. Verificaram que 96% de todas as amostras
processadas foram sensíveis à gentamicina, 90,2% à neomicina, 85,7% à kamicina,
56,7% ao cloranfenicol e 26,3% à tetraciclina.
Cepas de E.coli usualmente são resistentes a tetraciclina, estreptomicina,
sulfonamidas, ampicilina e kanamicina (HIRSH & ZEE, 1999 apud COSTA et al,
2006). Na pesquisa de Costa et al (2006), envolvendo 53 amostras de fezes de
suínos da região sul do Brasil, a maior resistência por E.coli foi observada em
tetraciclina com 88,6% das amostras.
Em um estudo realizado em Uberlândia de setembro a dezembro de
1999, foi coletado amostras de fezes de frangos de corte três vezes por semana
com o objetivo de avaliar a resistência das cepas de E.coli e enterobactérias lactose
negativa isoladas aos antimicrobianos. As cepas com maior resistência foram o
cloranfenicol (52%), cefalotina (51%), tetraciclina (48%) e ácido nalidíxico (45%). Em
relação às cepas de enterobactérias lactose-negativa, o antimicrobiano com maior
taxa de resistência foi a tetraciclina (84%) seguida de ácido nalidíxico (45%) e
ampicilina (42%) (PESSANHA, FILHO, 2001).
A resistência de Escherichia coli a antibióticos é preocupante, pois pode
comprometer o tratamento de doenças causadas por estirpes patogênicas, além da
possibilidade de propagação de fatores de resistência e virulência entre as cepas
(SCALETSKY et al, 2010).
40
4 Material e Métodos
4.1 Amostras
Um total de 100 amostras de polpas de frutas congeladas e 80 amostras
de frutas minimamente processadas foram adquiridas em supermercados da cidade
de Campinas, SP, transportadas em caixas isotérmicas com gelo e analisadas no
Laboratório de Microbiologia de Alimentos em até 6 horas após a coleta.
Os sabores escolhidos foram os mais comuns no mercado e foram
coletadas com as embalagens intactas e sem injúrias. Foram 7 marcas analisadas e
quatro delas sofrem tratamento térmico durante o processamento (Tabela 1).
As amostras de frutas fatiadas estavam contidas em bandejas de
poliestireno expandido revestidas de filme de PVC e as seletas de frutas estavam
armazenadas em potes de polipropileno.
41
Tabela 1 Quantidades de sabores e marcas de polpas de frutas congeladas
Marcas Quantidade
por marca Sabores
Quantidade
por sabor
Tratamento
Térmico
Marca A
28
Manga 3
Não
Pasteurizada
Goiaba 1
Caju 6
Morango 5
Coco 6
Açaí 4
Acerola 3
Marca B
20
Manga 2
Pasteurizada
Caju 3
Coco 6
Açaí 7
Acerola 3
Marca C
13
Caju 3
Pasteurizada Goiaba 4
Manga 2
Morango 4
Marca D
17
Caju 4
Pasteurizada
Morango 5
Acerola 3
Goiaba 3
Manga 2
Marca 5 4 Manga 4 Pasteurizada
Marca E 6 Acerola 3 Não
Pasteurizada Açaí 3
Marca F
11
Manga 2
Não
Pasteurizada
Morango 1
Goiaba 3
Açaí 2
Acerola 3
42
4.2 Determinação do pH
A medição do pH das polpas de frutas foi realizada de acordo com a
metodologia do Instituto Adolfo Lutz (IAL) (2008). Dez gramas da amostra foram
diluídas e homogeneizadas em 100 ml de água para posterior medição com
pHmetro (STARTER 2100 da Ohaus, Suécia) devidamente calibrado.
4.3 Contagem de Bolores e Leveduras
O método utilizado para quantificação de bolores e leveduras foi realizado
por contagem em Ágar batata dextrose (PDA) (Oxoid, São Paulo-SP, Brasil)
acidificado com ácido tartárico a 10%, conforme fluxograma da Figura 5.
Primeiramente, uma unidade analítica de 25 g da amostra foi pesada e
homogeneizada com 225 ml de solução de peptona (Difco, São Paulo-SP) a 0,1%
em condições assépticas. Após a homogeneização, três diluições decimais seriadas
(10-1, 10-2 e 10-3) foram realizadas.
Alíquota de 0,1 mL de cada diluição foi inoculada e espalhada na
superfície de placas com PDA acidificado. As placas foram incubadas a 25ºC por 3 a
5 dias e então, as colônias de bolores e leveduras foram contadas com auxílio de
contador de colônias (modelo CP608, Phoenix Luferco, Araraquara, SP) e os
resultados foram expressos em UFC.g-1 (BEUCHAT & COUSIN, 2001).
43
Figura 5 Esquema de análise de bolores e leveduras
4.4 Contagem de coliformes termotolerantes e E. coli pela Técnica do
Número Mais Provável (NMP)
A partir das diluições realizadas no item 4.3, 1 ml de cada diluição foi
inoculada em uma série de 3 tubos com caldo Lauryl Sulfato Triptose (LST; Merck
S.A São Paulo-SP, Brasil) para contagem de coliformes pela técnica do Número
Mais Provável (NMP). Os mesmos foram incubados a 35ºC por 24-48 h e os tubos
positivos com formação de gás foram transferidos, através de uma alçada, para o
caldo Escherichia coli (EC; Difco) e incubados em banho-maria a 45ºC por 24-48
horas. Os tubos com formação de gás foram confirmados para coliformes
termotolerantes e uma alçada foi estriada em placas com Levine’s eosin-methylene
blue agar (L-EMB; Difco) e incubadas a 35º C por 24 horas (Figura 6). As colônias
características para E. coli foram transferidas para tubos com Tryptone soy agar;
(TSA; Difco) e incubadas a 35º C por 24 horas, e então mantidas sob refrigeração
para posterior identificação (KORNACKI & JOHNSON, 2001).
44
Figura 6 Esquema de análise do NMP para coliformes termotolerantes
4.4.1 Identificação de E. coli
Foram realizadas a coloração de Gram para caracterização morfológica e
os testes bioquímicos como crescimento característico em ágar inclinado Triple
sugar iron (TSI; Difco) e IMViC (teste de indol, teste de vermelho de metil, teste de
Voges-Proskauer e teste de citrato de Simmons) de acordo com o Bacteriological
Analytical Manual (BAM) (FENG, et al, 2011).
4.5 Método da presença/ausência de E. coli
A detecção foi feita por um método alternativo do BAM, com
modificações. Foi homogeneizado 25 g da amostra com 225 ml de caldo Tryptone
phosphate; (TP; Difco) e posterior incubação a 44º C por 24 horas. Uma alçada foi
estriada em agar L-EMB (Difco) e Agar MacConkey (Merck) e incubadas a 35ºC por
24h (Figura 7). Cinco colônias típicas de E. coli foram inoculadas e mantidas em
TSA para posterior identificação morfológica e bioquímica conforme teste descrito no
item 4.1 (FENG, et al, 2011).
45
Figura 7 Esquema de análise da presença/ausência de Escherichia coli
4.5.1 Detecção do sorotipo de E.coli O157:H7
A detecção de E. coli O157:H7 foi realizada somente nas amostras de
frutas minimamente processadas. Para identificação do sorotipo O157:H7
primeiramente, 25 g de amostra foi homogeneizada com 225 ml de caldo de
enriquecimento seletivo Tripticase de Soja suplementado com acriflavina (0,05mg/L)
(Sigma), cefsulodina (10 mg/L) (Sigma) e vancomicina (8 mg/L) (Sigma). Após
incubação a 35ºC por 24 horas, uma alçada foi estriada em placas com Ágar
MacConkey Sorbitol (Merck) com Telurito e Cefixima (Sigma) e incubadas a
35ºC/24h. Cinco colônias típicas foram transferidas e mantidas em TSA para
posterior identificação de acordo com FENG, et al 2011.
46
4.5.2 Extração do DNA
A extração do DNA dos isolados foi realizada de acordo com FENG et
al (2011) descrito no BAM que consistiu na centrifugação de 600 µl da cultura ativa
em caldo Triptona de soja (TSB; Difco) a 12000 x g por 10 minutos (centrífuga
MIKRO 185; Hettick, Alemanha) afim de separar a massa celular do sobrenadante.
Foi dispensado o sobrenadante e a massa celular suspendida em 100 µl de tampão
Tris EDTA [TE, 10mM de Tris (Invitrogen Life Technologies, EUA) e 1 mM de EDTA
(Invitrogen)]. Após esse procedimento, os tubos foram mantidos em banho a 100ºC
por 10 minutos e resfriados, imediatamente, em banho de gelo. Em seguida, outra
centrifugação foi realizada a 12000 x g por 1 minuto e o sobrenadante contendo
DNA foi transferido para outro tubo e mantido a temperatura de -20ºC até o uso.
4.5.3 PCR para diferenciação dos tipos patogênicos de E. coli
A diferenciação de ETEC, EPEC, EIEC, EHEC e EAEC dos isolados de E.
coli foi realizada através da detecção de genes de virulência descritos na Tabela 1:
est1b (toxina termoestável), para ETEC, eae (intimina) para EPEC, ipaH (antígeno
de invasão) para EIEC, stx1 (toxina de shiga) para EHEC e agg (fimbria agregativa
de aderência) para EAEC conforme Chandra et al (2013) e Müller et al (2007).
Para a identificação dos genes eae, ipaH, est1b e stx1, isoladamente,
numa concentração final de 25µl foi usado 10X de tampão PCR, 2 mM de MgCl2,
0,25 mM de cada dNTP, 1,25 U de Taq DNA Polimerase (Sinapse Inc.) e 0,2 µM de
cada par de primer referente ao gene eae, est1b e stx1. Já para o primer de ipaH, a
concentração foi de 0,3µM (CHANDRA et al, 2013). Para a análise do gene agg, as
concentrações foram de 10X de tampão PCR, 2 mM de MgCl2, 0,25 mM de dNTP, 2
U de Taq Polimerase (Sinapse Inc.) e 0,2 µM de cada par do primer de acordo com
Müller et al, 2007. A Tabela 2 informa as sequências dos primers e suas respectivas
concentrações, de acordo com os autores mencionados acima. As cepas utilizadas
como controles positivos para os genes de virulência (E. coli stx1 +, E. coli agg +, E.
coli eae +, E. coli est1b + e Shigella ipaH +) foram doadas pelo Laboratório de
Referência Nacional para Enteroinfecções Bacterianas (LRNEB) da Fundação
Oswaldo Cruz.
47
As condições do termociclador (MASTERCYCLER gradient, Eppendorf,,
Alemanha) para os genes eae, stx1, ipaH e est1b foram de temperatura de
desnaturação a 94ºC por 3 minutos, seguido de 35 ciclos de 94ºC por 30 segundos,
anelamento a 62ºC por 30 segundos e alongamento em 72ºC por 1 minuto, e por
último 72ºC por 5 minutos, de acordo com Chandra et al (2013).
Para o gene agg, as condições de temperatura foram desnaturação a
94ºC por 3 minutos, 30 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 63ºC por 30 segundos e
72ºC por 1,5 minutos, com extensão final de 72ºC por 5 minutos (Müller, et al, 2007).
A eletroforese dos produtos da PCR foi efetuada em gel de agarose a
1,5% e corada com Sybr SafeTM (Invitrogen) por 20 minutos. A visualização dos
produtos foi realizada através do transiluminador UV e fotodocumentados com o
sistema Kodak D320.
48
Tabela 2 Genes e sequências de primers utilizados neste estudo.
Patógeno Gene Produto Sequência (5'-3') Tamanho do Produto
(bp) Referência
ETEC est1b Toxina
termoestável F TGTCTTTTTCACCTTTCGCTC
171 Chandra et al, 2013
R CGGTACAAGCAGGATTACAACAC
EPEC eae Intimina F TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT
482 Chandra et al, 2013
R GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG
EIEC ipaH Antígeno de
Invasão F CTCGGCACGTTTTAATAGTCTGG
933 Chandra et al, 2013
R GTGGAGAGCTGAAGTTTCTCTGC
EAEC agg Fímbria
agregativa F ACGCAGAGTTGCCTGATAAAG
400 Müller et al, 2007
R AATACAGAATCGTCAGCATCAGC
EHEC stx1 Toxina de Shiga F GATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGC
244 Chandra et al, 2013
R AATGCCACGCTTCCCAGAATTG
Salmonella invA Proteína de
Invasão F GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA 284 Rahn et al, 1992
R TCATCGCACACGTCAAAGGACC3
49
4.6 Análise de Salmonella sp.
As análises a seguir foram baseadas no BAM, onde o pré-enriquecimento
foi realizado com 25 gramas da amostra em 225 ml de água peptonada tamponada
(BPW; Oxoid) e incubados a 35ºC por 18 horas. Para o enriquecimento seletivo, 1 ml
de caldo BPW foi transferido para o caldo Tetrationato Muller-Kauffman (TT; Sigma)
e incubados a 35ºC por 24 horas e 0,1 ml para o caldo Rappaport Vassilidis (RV;
Oxoid), seguido de incubação a 42ºC em banho-maria por 24 horas. No
plaqueamento seletivo diferencial, uma alçada dos caldos foi transferida para os
meios Ágar Entérico de Hectoen (HE; Difco), Ágar Bismulto Sulfito (BS; Difco) e ágar
Xilose Lisina Desoxicolato (XLD; Oxoid), incubados a 35ºC por 24 horas. Duas
colônias típicas de cada meio foram transferidas e mantidas em TSA para posterior
identificação (ANDREWS et al, 2014).
Figura 8 Esquema de análise de Salmonella
50
4.6.1 Identificação de Salmonella sp.
Os isolados foram submetidos aos testes bioquímicos em TSI (Difco),
Lisine iron agar (LIA; Difco), para detectar a descarboxilação da lisina, e o teste de
urease (ANDREWS et al, 2014).
A confirmação dos isolados foi realizada através da técnica da PCR para
detecção do gene invA presente em todas as espécies de Salmonella sp., sendo que
a cepa Salmonella Tiphimurium ATCC 14028 foi utilizada para controle positivo. A
extração do DNA foi de acordo com o item 4.5.2. Para 25 µl de reação foi usado o
tampão de PCR em 10X, 1,5mM de MgCl2, 0,25 mM de dNTP, 1,5 U de Taq
Polimerase (Sinapse Inc.) e 0,2µM de cada primer. As sequências dos primers estão
descritas na tabela 1, e as condições de amplificação foram de 94ºC por 3 minutos,
35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 54ºC por 30 segundos, 72ºC por 1 minuto e um ciclo
final de extensão de 7 minutos a 72ºC, de acordo com Rahn et al (1992).
4.7 Teste de Susceptibilidade aos Antimicrobianos
O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos das culturas de E. coli e
Salmonella sp. foi analisado pelo método de disco difusão recomendado pela
National Committee for Clinical Laboratory Standards ou Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2005). As culturas positivas para Escherichia coli e
Salmonella sp. foram ativadas em caldo Triptona de Soja (TSB; Difco) até o início de
seu crescimento (de duas a seis horas a 35ºC).
A turbidez de cada cultura foi padronizada a 0,5 de acordo com a escala
de McFarland, utilizando-se o aparelho Densimat (BioMerieux®). A suspensão de
cultura foi semeada em Ágar Müller-Hinton (Merck) com o auxílio de um suabe de
algodão estéril. Após a semeadura, foram inseridos os discos de antibióticos de
interesse e incubados a 35ºC. Após 16-18 horas de incubação, foi realizada a
medição do diâmetro dos halos formados ao redor de cada antibiótico testado. Os
antimicrobianos (Laborclin) avaliados e suas concentrações estão descritos na
Tabela 3.
Neste trabalho foram analisados antibióticos da classe de sulfonamidas
(sulfametoxazol/trimetroprim), penicilinas (ampicilina), cefalosporinas,
51
(ciprofloxacino), quinolonas (ácido nalidíxico), cefalosporina de terceira geração
(ceftazidima) e afenicóis (cloranfenicol).
Tabela 3 Antibióticos utilizados e suas concentrações
Antibiótico Concentração (µg)
Ácido Nalidíxico 30
Ampicilina 10
Ciprofloxacina 5
Cloranfenicol 30
Trimetropina/Sulfametoxazol 25
Ceftadizima 30
52
5 Resultados e Discussão
A validade das polpas congeladas se estendia de 12 a 18 meses de
acordo com a marca. Nas frutas minimamente processadas, o recomendado é o
consumo no mesmo dia ou até dois dias depois, dependendo da fruta e do corte
realizado.
5.1 Valores de pH das polpas de frutas congeladas e frutas minimamente
processadas
Todas as amostras estavam de acordo com a Instrução Normativa
nº1/2000 do Ministério da Agricultura em relação ao pH (Tabela 4). Contudo, as
polpas de coco e morango, com pH 4,2±0,3 e 3,5±0,4 respectivamente, não estão
determinadas na norma.
Os valores de pH nas amostras de polpas de frutas variaram de 3,5±0,2 a
5,3±0,3. Somente as polpas de açaí apresentaram pH maior que 4,5 que
possibilitaria o crescimento de bactérias (Tabela 4). As amostras de mexerica e
seleta de frutas apresentaram pH menores que 4,5, sendo consideradas frutas
ácidas. Os maiores valores de pH foram observados nas amostras de melão onde o
pH variou de 6,3±0,3 a 6,6±0,2 (Tabela 4). Penteado & Leitão (2004) obtiveram
valores similares de ph em polpa de melão, e por serem consideradas frutas de
baixa acidez, não são inibitórias para o crescimento de enterobactérias.
Monteiro e Santin (2014) avaliaram 9 amostras de polpas de frutas
congeladas de uma determinada marca e 100% delas estavam de acordo com o
previsto pela Instrução Normativa vigente e apresentaram-se com caráter satisfatório
para e ausência de sujidades, estando dentro dos padrões estabelecidos.
Baixos valores de pH, assim como o das frutas, são importantes, uma vez
que ajudam assegurar a conservação da polpa sem a necessidade de um
tratamento térmico muito elevado, evitando, assim, a perda de qualidade nutricional
(BENEVIDES et al., 2008). Na Tabela 5 estão listadas as frutas coletadas e a
variação do pH. Como não há uma legislação com padrões definidos de valores de
pH, não foram encontrados trabalhos com minimamente processados discutindo o
pH em relação a qualidade microbiológica do produto.
53
Tabela 4 Valores de ph de polpas de frutas congeladas
Tabela 5 Valores de pH de frutas minimamente processadas
Fruta N de amostras pH
Melão amarelo 9 6,3±0,3
Abacaxi 9 3,9±0,1
Melão orange 9 6,5±0,2
Seleta * 12 4,3±0,5
Coco Ralado 9 5,3±0,2
Melancia 9 5,1±0,3
Mexerica 7 3,4±0,2
Mamão 9 5,6±0,4
Melão pele de sapo 7 6,6±0,2
80
5.2 Contagem de Bolores e Leveduras
As 100 amostras de polpas estavam com contagens inferiores a 102
UFC.g-1 (Tabela 6), estando em acordo com a Instrução Normativa nº1/2000 do
Ministério da Agricultura.
De acordo com Armellini et al (2004) a temperatura adequada para
armazenamento das polpas de frutas congeladas é de -18ºC, visto que esta
temperatura retarda as reações químicas e inibe a atividade de microbiana. A
temperatura baixa diminui a atividade microbiana, sendo capaz de impedir o
desenvolvimento dos micro-organismos (VALSECHI, 2006). A temperatura de
Sabor N de amostras pH
Manga 15 4,3±0,2
Goiaba 11 3,5±0,2
Caju 16 3,8±0,2
Morango 15 3,5±0,4
Coco 12 4,2±0,3
Açaí 16 5,3±0,3
Acerola 15 3,6±0,2
100
* abacaxi, melão, manga, kiwi, morango, mamão, uva
54
pasteurização também influencia na destruição de bolores e leveduras em polpas de
frutas congeladas.
Santos et al (2008); Nascimento (2014) obtiveram resultados
diferentes, onde a contagem de bolores e leveduras foi elevada na maior parte das
amostras de polpas de frutas analisadas que variaram de 102 até 104 UFC.g-1,
estando em desacordo com a Instrução normativa nº1/2000 do Ministério da
Agricultura. O que difere o trabalho dos autores deste, é que as amostras foram
recolhidas de feiras livres, sendo fabricadas por pequenos produtores da região,
enquanto as analisadas nesta pesquisa são provenientes de indústrias
especializadas de grandes marcas, sendo a maioria delas pasteurizada.
Apesar de não possuir, ainda, legislação vigente que abrange bolores e
leveduras, as frutas minimamente processadas apresentaram 36,25% (29/80) das
amostras com contagens consideradas elevadas, conforme Tabela 7, usando como
parâmetro a legislação para polpas de frutas congeladas (Instrução Normativa
nº1/2000), onde o limite máximo permitido é de 5x103 UFC.g-1. As outras amostras,
26,2% (21/80) estavam com limites de contagem entre 103 e 2,1x103 UFC.g-1,
enquanto o restante (37,5%, 30/80) apresentou contagem inferiores a 1,2x102
UFC.g-1.
Um estudo realizado em Fortaleza-CE, em 2005, também obteve
contagens elevadas de bolores e leveduras em 75% (75/100) das amostras de frutas
minimamente processadas, onde as contagens variaram de 103 até 107 UFC.g-1 em
frutas como goiaba, mamão, abacaxi, melão e manga (PINHEIRO, et al, 2005).
Ravelli e Novaes (2010) avaliaram a qualidade microbiológica de 50
amostras de vegetais minimamente processadas comercializadas na cidade de
Piracicaba-SP e obtiveram contagens de bolores e leveduras em 32% dos vegetais
analisados variando entre 104 e 108 UFC.g-1.
As maiores contagens (>103 UFC.g-1) foram observadas nas amostras
de seletas de frutas, melão amarelo e melão orange fatiados totalizando 91,1%
(11/12), 77,7% (7/9) e 77,7% (7/9), respectivamente, o que pode ser explicado pela
intensa manipulação que os produtos sofreram (Figura 9). Menores contagens (<102
UFC.g-1) foram observadas em coco ralado, mexerica e mamão, suspeitando que a
grande quantidade de óleos no coco ralado e a pouca manipulação da mexerica e
do mamão por ser somente cortado ao meio tenha influenciado em uma contagem
menor.
55
Resultados semelhantes foram obtidos por Bruno et al (2005), onde
avaliou-se a qualidade microbiológica de frutas minimamente processadas como
abacaxi, mamão e seleta de frutas. Nas seletas de frutas as contagens de bolores e
leveduras variaram de 4,8x103 até 1,8x105 UFC.g-1.
Pereira et al (2004) encontraram em manga Palmer minimamente
processada, no seu estado ótimo de maturação, contagens de bolores e leveduras
variando de 103 a 106 UFC.g-1.
Tabela 6 Contagem de bolores e leveduras em polpas de frutas congeladas
Sabor Contagem (UFC.g-1)
Manga <102
Goiaba <102
Caju <102
Morango <102
Coco <102
Açaí <102
Acerola <102
56
Tabela 7 Contagem de bolores e leveduras em frutas minimamente processadas acima de 5 x 103 UFC.g-1
Fruta Código da amostra
Contagem (UFC.g-1)
Melão Orange F1 5,1x106
Melão Amarelo F2 6,7x104
Seleta F3 7,2x106
Melão Orange F4 3,2x105
Abacaxi F5 2,0x104
Seleta F10 7,1x106
Melão Amarelo F11 6,1x104
Melão Amarelo F12 4,8x104
Seleta F15 8,1x105
Seleta F17 5,2x106
Melão Orange F18 6,1x103
Seleta F20 6,6x105
Melão Orange F24 3,2x104
Melancia F25 3,1x104
Seleta F26 4,2x105
Melão Amarelo F28 3,8x104
Melão pele de sapo F35 3,9x105
Seleta F38 5,8x106
Melão Orange F40 4,0x104
Seleta F45 6,2x105
Melão Amarelo F49 5,6x104
Seleta F50 7,1x106
Melão Amarelo F59 3,9x104
Seleta F64 5,2x106
Melão Orange F65 6,0x103
Melão Orange F66 5,2x103
Abacaxi F71 5,9x103
Seleta F79 3,2x106
Melão Amarelo F80 5,9x104
57
Figura 9 Porcentagem de amostras de frutas minimamente processadas com contagens de bolores e leveduras superiores a 5x103 UFC.g-1
5.3 Contagem de coliformes termotolerantes e presença de E.coli
Não foram encontradas contagens significativas de coliformes
termotolerantes nas polpas de frutas, visto que todas apresentaram contagens < 3
NMP.g-1. Porém, houve presença de E. coli em uma amostra polpa de manga,
confirmada por testes bioquímicos.
Os valores são similares aos resultados de Santos et al (2008), onde foi
encontrado coliformes termotolerantes em polpa de maracujá, caju e açaí entre
3x101 e 9x101 NMP.g-1 estando de acordo com os padrões exigidos pela RDC nº12
de 2001, que preconiza valor máximo de 102 NMP.g-1. O baixo valor de pH apontado
na maioria das amostras, a temperatura de armazenamento e a pasteurização em
grande parte delas podem ser um fator limitante no desenvolvimento de micro-
organismos.
No trabalho de Neto et al (2016) foram avaliadas 20 amostras de polpas
de frutas congeladas comercializadas em supermercados da cidade de Missão
Velha – CE, onde todas estavam de acordo com o padrão exigido pela legislação
para coliformes termotolerantes, o que pode ser atribuído ao baixo pH das frutas e
ao processo de congelamento.
Nas frutas minimamente processadas houve contagens elevadas de
coliformes termotolerantes em 12,5% (10/80) das amostras analisadas estando em
58
desacordo com a legislação por apresentar contagens acima de 5x102NMP.g-1
(Tabela 8). Em uma amostra de coco ralado foi confirmada E. coli no teste de
presença e ausência e nas análises de NMP onde apresentou contagem de 240
NMP.g-1.
Não foi encontrado colônias características do sorotipo O157:H7 de E. coli
nas frutas minimamente processadas que foram analisadas. Resultados similares
foram obtidos por Santos (2007), que avaliou 180 amostras de frutas e hortaliças
minimamente processadas onde nenhuma delas apresentaram o patógeno.
As contagens de coliformes termotolerantes foram elevadas em 75%
(9/12) das seletas de frutas analisadas e 11,1% (1/9) das amostras de melão
amarelo.(Figura 10), estando impróprias para consumo. As seletas sofrem uma
manipulação maior, sendo picadas em pedaços bem pequenos e misturadas umas
às outras ficando expostas por um período maior sem a refrigeração necessária, o
que favorece a contaminação e o desenvolvimento de micro-organismos. A
contagem alta no melão pode ser explicada pela baixa acidez da fruta que favorece
o crescimento de micro-organismos, e assim como a seleta, esta amostra sofreu alta
manipulação, uma vez que foi toda cortada em fatias finas.
As outras 70/80 amostras (87,5%) se apresentaram dentro dos padrões
exigido pela legislação (5x102 NMP.g-1). Quinze por cento (12/80) apresentaram
contagens entre 1,2x102 NMP.g-1 e 4,6x102NMP.g-1, porém ainda estão dentro do
limite determinado pela lei.
De acordo com Pinheiro et al (2005), 28% (28/100) das amostras, de
frutas minimamente processadas coletadas de supermercados em Fortaleza-CE,
estavam contaminadas com coliformes termotolerantes acima de 5,0x102 NMP.g-1,
contrariando a legislação vigente, assim como neste trabalho, em que uma parte
considerável está em desacordo.
Resultados similares também são encontrados por Santos et al (2015),
onde avaliaram-se 100 amostras de saladas de frutas comercializadas por
ambulantes de Juazeiro do Norte – BA de junho a julho de 2011, em que 33,33%
(34/100) delas estavam contaminadas com coliformes termotolerantes com
contagens superiores a 5x102 NMP.g-1, sendo consideradas impróprias para o
consumo.
As frutas minimamente processadas coletadas para este trabalho
foram adquiridas em supermercados, onde os próprios funcionários realizam a
59
manipulação e corte do produto. Não se sabe se a higienização das mãos dos
manipuladores, assim como dos utensílios utilizados para corte estavam em
condições adequadas para garantir a qualidade do produto. A fonte da
contaminação pode vir da própria fruta que não sofreu um processo de lavagem e
sanitização correto, visto que a casca é um potencial veículo de proliferação de
micro-organismos, contudo também pode provir de más condições sanitárias do
ambiente, utensílios e colaboradores.
Tabela 8 Contagem de coliformes termotolerantes em frutas minimamente processadas acima de 1,2x102 NMP.g-1
Amostra Código Contagem (NMP.g-1)
Seleta F2 >1100
Melão Amarelo F3 1100
Melão Orange F4 240
Seleta F6 >1100
Seleta F8 >1100
Mamão F9 290
Melão Amarelo F10 240
Seleta F11 >1100
Melão Orange F12 240
Seleta F14 >1100
Melão Amarelo F16 210
Melão Orange F17 120
Melão Amarelo F18 160
Seleta F19 1100
Melão Orange F23 160
Seleta F25 1100
Melão Amarelo F28 150
Melão Orange F31 150
Seleta F48 >1100
Seleta F58 460
Seleta F60 1100
Coco F71 240
Amostras com contagens entre 1,2x102 e 4,6x102 NMP.g-1 (12/80) (15%)
Amostras com contagens acima de 5,0 x 102 NMP.g-1 (10/80) (12,5%)
60
Figura 10 Porcentagem de amostras acima do limite da RDC12/2001
5.3.1 Confirmação de fatores de virulência de E. coli potencialmente
patogênicas por PCR
Foram realizadas análises de PCR em 14 isolados identificados
bioquimicamente como E. coli, provenientes de duas amostras, sendo uma de polpa
de manga e a outra de coco ralado. Foram analisados alguns genes que expressam
alguns fatores de virulência em Escherichia coli, como est1b, ipaH, eae, agg e
stx1(Tabela 9). Um total de 42,8% (6/14) dos isolados foram positivos para o gene
est1b que codifica o fator de virulência da toxina termoestável (ST) de ETEC (Figura
11). Os isolados positivos foram advindos da amostra de polpa de manga não
pasteurizada e foram negativos para os demais genes, assim como o restante dos
isolados que não apresentaram nenhum gene analisado neste estudo.
Chandra e colaboradores (2013) detectaram o gene est1b em 4/44
amostras fecais de bovinos com diarreia na Índia. As cepas mais encontradas
através da análise de PCR foram de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) e o
gene mais presente foi o stx1 e o stx2.
Nas amostras analisadas neste trabalho, nenhum isolado de E. coli
apresentou o gene stx1 comum em cepas de EHEC.
A fonte de contaminação de patógenos pode ser proveniente da água de
irrigação ou do próprio solo, onde muitas frutas são recolhidas. E uma água de baixa
61
qualidade utilizada para irrigação pode acarretar a contaminação dos vegetais,
comprometendo a qualidade do produto e servindo de veículo para transmissão de
doenças aos consumidores (FRANCO et al, 2006).
O manipulador responsável pelo preparo da polpa também poderia
estar infectado e contaminar a fruta destinada à produção de polpa, que neste caso,
a marca analisada não sofreu o processo de pasteurização. Mesmo organismos
imunes, podem liberar uma grande quantidade de cepas de ETEC virulentas nas
fezes (NATARO & KAPER, 1998).
Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) é bem relatada em estudos
com criações de porcos, já que o patógeno causou grandes perdas econômicas na
suinocultura. Ela afeta os animais recém-nascidos ou após o desmame, cujas
toxinas LT (termolábeis) e ST (termoestáveis) são produzidas e responsáveis por
uma diarreia intensa (NAGY & FEKETE, 1999).
Nenhum dos outros patógenos (EPEC, EHEC, EAEC e EIEC) foi
detectado nos isolados de Escherichia coli, constatando que as cepas negativas,
provavelmente, não seriam virulentas. Contudo, em indivíduos imunodeprimidos ou
quando as barreiras gastrointestinais são rompidas, mesmo as cepas não
patogênicas podem causar infecções (NATARO & KAPER, 1998).
E. coli O157:H7 não foi detectada em nenhuma das amostras de frutas
minimamente processadas.
No trabalho de Batalha (2015), onde avaliou-se a presença de E. coli
produtora de toxinas de shiga em vegetais orgânicos em São Paulo-SP, foi
encontrado o micro-organismo em 15% (30/200) das amostras analisadas, porém
nenhuma delas foi positiva para os genes stx1, stx2, eae, dentre outros, obtendo
resultados similares a este estudo.
Os estudos realizados no Brasil restringem-se ao sorotipo O157:H7
devido ao seu impacto na saúde quando acometem seres humanos, porém, sugere-
se que a frequência desses micro-organismos ainda seja baixa em frutas e vegetais
no país. Contudo, deve-se levar em consideração a extensão do território nacional,
sendo necessárias mais pesquisas de todos os grupos de Escherichia coli
patogênica em alimentos.
62
Tabela 9 Genes de E. coli analisados por PCR em isolados de polpa de manga e coco ralado
ISOLADOS AMOSTRA GENE
est1b ipaH eae stx1 agg
P98-1MA
Polpa de
Manga
P A A A A
P98-2MA P A A A A
P98-3MA P A A A A
P98-1MB P A A A A
P98-2MB P A A A A
P98-3MB P A A A A
F5-1MA
Coco Ralado
A A A A A
F5-2MA A A A A A
F5-3MA A A A A A
F5-4MA A A A A A
F5-1MB A A A A A
F5-2MB A A A A A
F5-3MB A A A A A
F5-4MB A A A A A
Figura 11 Gel de eletroforese do gene est1b de ETEC
P = Presente A = Ausente
100bp
200bp
1000bp
M = Marcador 100bp; 1 a 6 = Isolados positivos; 7 = Controle positivo (E. coli est1 b +); 8 = Controle negativo.
171 bp
63
5.4 Presença de Salmonella sp
Nas amostras de polpas de frutas congeladas não houve detecção de
Salmonella sp. A ausência deste patógeno nas polpas pode ser explicada pelo
processo de pasteurização que é realizado na maioria das marcas e pelo próprio
congelamento que injuria células microbianas e inibe seu desenvolvimento.
Nas frutas minimamente processadas, duas amostras de melão e uma de
seleta, ou seja, 3,75% (3/80) das frutas minimamente processadas pesquisadas
apresentaram isolados com testes bioquímicos preliminares típicos de Salmonella
sp.
A confirmação dos isolados veio através da análise do PCR para o gene
invA, que codifica o fator de invasão presente no gênero Salmonella sp, sendo um
importante fator para a colonização no interior de células eucarióticas responsável
pela patogênese através da entrada de um grande número de células microbianas
(MOULDER et al, 1985 apud GALÁN et al 1992). De 15 isolados suspeitos nos
testes bioquímicos apenas 5 foram confirmados para o gênero Salmonella, sendo
todos eles isolados da amostra de melão amarelo fatiado (Figura 11, Tabela 10).
A técnica da PCR tem sido um instrumento valioso no diagnóstico de
vários micro-organismos que causam doenças infecciosas, devido à sua capacidade
de detecção rápida e com maior sensibilidade e especificidade (BRAZ, 2006).
Em Fortaleza-CE, 15 amostras de frutas minimamente processadas
(mamão, abacaxi e salada de frutas) de supermercados da região foram analisadas
quanto à sua qualidade microbiológica, resultando em 26,6% (4/15) contaminadas
com Salmonella, considerando-as impróprias para o consumo (BRUNO, et al, 2005).
Em 1990, o FDA analisou mais de 1440 melões Cataloupe, importados do
México, e os resultados dessas análises mostraram que 11 deles (0,76%) estavam
contaminados com oito diferentes sorotipos de Samonella em sua superfície. Um
segundo estudo realizado em 1991, mostrou que 24 (1,06%) de 2.220 melões
analisados continham doze sorotipos diferentes do patógeno (FDA, 1999).
A transmissão do patógeno Salmonella sp. no ser humano ocorre,
geralmente, pela ingestão de alimentos contaminados, pessoa a pessoa, no
ambiente hospitalar ou através de animais que estão infectados.
Foram coletados 12 tipos diferentes de hortaliças minimamente
processadas em cinco grandes redes de supermercados de Belo Horizonte-MG,
64
onde 50%(6/12) das amostras apresentaram contaminação com Salmonella. O
estudo relatou que esses produtos eram provenientes de três supermercados onde o
local de armazenamento dos produtos não estavam com uma adequada
temperatura de refrigeração, permitindo, assim, que o micro-organismo se
desenvolvesse (FERREIRA et al, 2016).
Rezende et al (2016) analisaram 52 amostras fecais de manipuladores de
alimentos, a fim de detectar portadores assintomáticos de Salmonella sp. que
poderiam ser potenciais transmissores do patógeno. Foi verificado 0,52% de
amostras contaminadas (1/52), concluindo que um único foco pode ser uma
potencial fonte de disseminação do micro-organismo, uma vez que na manipulação
de alimentos a contaminação cruzada pode ocorrer, afetando, assim, vários
alimentos entre si manipulados pela pessoa infectada.
Os alimentos minimamente processados requerem ações que priorizam a
segurança microbiológica prezando pela saúde do consumidor, já que são alimentos
para consumo direto. A temperatura deve ser rigorosamente controlada desde o
preparo até o armazenamento para que micro-organismos patogênicos não se
desenvolvam.
Figura 12 Gel de eletroforese dos isolados positivos para o gene invA
M = Marcador 1 = Controle positivo 2 = Controle negativo 3 ao 7 = Isolados negativos 8 e 9 = Isolados positivos
100 bp
300bp
1000bp
284 bp
65
Tabela 10 Isolados característicos de Salmonella identificados por testes bioquímicos e confirmados por PCR
5.5 Relação de amostras em conformidade com a legislação RDC nº12/2001
Todas as amostras de polpas de frutas congeladas estavam em acordo
com a legislação, no entanto 16,25% das amostras de frutas minimamente
processadas (n=80) estavam em desacordo por conter Salmonella sp. e /ou
coliformes termotolerantes (Tabela 11).
Ferreira et al (2016) encontraram Salmonella em 50% (6/12) das amostras
de hortaliças coletadas em 5 supermercados diferentes de Belo Horizonte-MG.
Santos (2007) encontrou coliformes termotolerantes em 28,8% (52/180) das
Amostra Isolados
característicos
Testes
bioquímicos
preliminares
Confirmados
por PCR
Seleta
F1-68 + -
F2-68 + -
F3-68 + -
F4-68 + -
F5-68 + -
Melão fatiado
F1-72 + +
F2-72 + +
F3-72 + +
F4-72 + +
F5-72 + +
Melão metade
F1-74 + -
F2-74 + -
F3-74 + -
F4-74 + -
F5-74 + -
66
amostras de vegetais minimamente processados, sendo que 30% de 25 amostras
contaminadas eram de frutas.
Vários são os fatores que podem contribuir, direta ou indiretamente, para
o índice de doenças transmitidas por alimentos (DTA), como o aumento da
população, a existência do índice populacional exposto ou vulneráveis, o processo
de urbanização desenfreado e necessidade de produção de alimentos em grande
escala. O panorama se completa com a maior exposição das populações à
alimentos destinados prontos para o consumo. Assim, é conveniente que a
fiscalização seja efetiva de forma a diminuir os números de doentes por DTA
causadas por esses patógenos (LANZA, 2016).
No Brasil, a maior parte das DTA não são notificadas, uma vez que o
agente etiológico envolvido no surto não é identificado. Contudo, os patógenos
Salmonella, Staphylococcus aureus seguido de Escherichia coli são os principais
micro-organismos associados aos surtos que são comunicados formalmente
(SINAN, 2016).
Estudos que abrangem a qualidade microbiológica de frutas, vegetais ou
outros alimentos devem ser sempre atualizados para verificar as melhorias ou
retrocessos na produção de alimentos, e além disso, averiguar se os produtos
investigados estão em conformidade com a legislação vigente.
Tabela 11 Número de amostras de frutas minimamente processadas fora do padrão RDC nº12/2001 (n=80)
Micro-organismo Limite RDC
nº12
Nº de amostras fora do
padrão (%)
Salmonella Ausência em
25g 1(1,25)
Coliformes Termotolerantes
Máximo de
5x102
NMP.g-1
10 (12,5)
Total 13(16,25)
67
5.6 Análise da susceptibilidade dos patógenos aos antimicrobianos
Apenas um isolado (1/5) de Salmonella sp apresentou resistência ao
antibiótico trimetropina/sulfametoxazol, enquanto a ceftadizima foi o antimicrobiano
mais eficiente, onde todas as cepas foram susceptíveis
Cada isolado obteve um perfil diferente de resistência, tendo como
exemplo os isolados de Salmonella sp., onde o F1-72, apresentou resistência ao
sulfametoxazol/trimetroprim, o F2-72 foi resistente intermediário à ampicilina, o F3-
72 e o F5-72, susceptíveis a todos os antibióticos testados e o F4-72 foi resistente
intermediário a três antimicrobianos (Tabela 13). Todos os isolados do patógeno
foram sensíveis à ceftadizima (Tabela 12).
Em um estudo de Figueiredo, et al, 2013, 163 isolados de Salmonella
de amostras de aves, suínos e bovinos foram analisados de acordo com o seu perfil
de resistência à vários antibióticos incluindo a ampicilina e cloranfenicol. A maior
taxa de resistência foi observada em tetraciclina (49%) seguido de ampicilina (37%),
e a menor taxa se apresentou nas fluoroquinolonas.
Os 14 isolados de Eschecrichia coli provenientes da polpa de manga e
do coco ralado (6 de polpa de manga e 8 de coco ralado), foram resistentes à
ampicilina. Todas as cepas isoladas de coco ralado resistiram ao cloranfenicol e
25% à ciproflaxacina. O antibiótico com maior taxa de sensibilidade foi o
sulfametoxazol/trimetroprim com 100% de todos as cepas susceptíveis (Tabela 12).
O isolado F5MA3 e o F5MA1 foram resistentes a quatro ou mais antimicrobianos,
expressando um perfil de multirresistência (Tabela 13).
Os antibióticos (ceftadizima e ampicilina) pertencem ao grupo dos beta-
lactâmicos que são caracterizados por possuírem um anel beta lactâmico na sua
estrutura podendo ser quebrado por bactérias produtoras de enzimas beta-
lactamases. Echerichia coli é caracterizada por serem produtoras desta enzima, que
confere às cepas resistência aos antibióticos (Henquell et al, 1995).
Um estudo de Maynard et al (2004) avaliou a susceptibilidade de
antimicrobianos em cepas de E. coli enteropatogênica isoladas de 70 seres
humanos e 39 animais (gado, galinha, porco e animais de estimação). Uma taxa de
43% dos isolados de animais foram resistentes a pelo menos quatro antibióticos,
incluindo ampicilina, tetraciclina, trimetroprim e sulfonamidas. A maioria dos isolados
foi resistente à ampicilina, dados semelhantes a este estudo.
68
Hijazi et al (2016), analisaram 125 amostras retais de crianças de 1 a 5
anos para realizar a detecção de enterobactérias produtoras de beta lactamases de
espectro estendido (ESBL). A frequência de pacientes que tiveram a presença
destas bactérias foi de 24,8%(31/125), onde os isolados de Escherichia coli (n=25)
foram susceptíveis em 41,9%, 32,3% e 35,5% à tetraciclina,
trimetroprim/sulfametoxal e ácido nalidixico, respectivamente.
Sete isolados de E.coli neste estudo foram resistentes ou resistentes
intermediários para ciprofloxacina. De acordo com Lago et al (2010) uma forte
associação está ligada entre a produção de ESBL e à resistência à ciprofloxacina.
Em um estudo de Tan et al (2014), na Malásia, foi avaliado a prevalência
de cepas resistentes de E. coli a vários antibióticos das mãos de manipuladores de
alimentos de colégios locais. Foram isoladas 28 cepas e os antibióticos utilizados na
pesquisa foram a penicilina (10 µg), ampicilina (10 µg), gentamicina (10 µg),
kanamicina (30 µg), tetraciclina (30 µg), cloranfenicol (30 µg), trimetoprim (5 µg),
sulfamethoxazol (25 µg), ciproflaxina (5 µg) e nitrofurantoina (300 µg). A
porcentagem de E. coli resistente a penicilina e cloramfenicol foi de 85,71% das
cepas, 57,14% resistentes a sulfametoxazol, ampicilina e trimetoprina, 28,57%
resistentes a kanamicina e tetraciclina e 14,29% de ciproflaxina. Todos os isolados
mostraram susceptibilidade a nitrofuratoina e gentamicina. A resistência do patógeno
a antimicrobianos é alta, podendo causar complicações no quadro de pacientes
enfermos.
Moura et al (2012), avaliaram o perfil de resistência aos mesmos
antibióticos testados neste trabalho. Foram coletados 99 isolados de crianças
menores de 5 anos hospitalizadas com diarreia, 9 (6,4%) E. coli enteropatogênica
(EPEC), 4 (2,9%) E. coli enteroinvasiva (EIEC), 80 (57,1%) de outras E. coli, 3
(2,1%) de Shigella spp. e 3 (2,1%) de Salmonella spp. 82,7% das outras E. coli
foram sensíveis ao ácido nalidíxico e aproximadamente 60% à ampicilina e
sulfametoxazol/trimetropima. Já para os isolados de E.coli do tipo EPEC e EIEC, a
sensibilidade foi igual ou superior a 90% para os ciprofloxacinos, aminoglicosídeos e
cefalosporinas de terceira geração.
O fenótipo de resistência das bactérias mostra que 14/14 isolados de E.
coli foram resistentes à um antibiótico, sendo ele a ampicilina. 9/14 são resistentes a
dois antimicrobianos e 2/14 apresentaram multirresistência a 3 ou mais antibióticos
69
testados. Apenas um isolado de Salmonella sp. apresentou perfil de resistência a um
único antibiótico (Tabela 13).
De acordo com MOTA et al (2005), o desenvolvimento de resistência
por certas bactérias patogênicas ocorre mais rapidamente do que a capacidade que
a indústria possui para produzir novos medicamentos eficazes. A preocupação em
impedir a resistência faz com que profissionais de saúde utilizem drogas de amplo
espectro, resultando em muitos casos, em custos mais elevados com o tratamento e
a elevada ocorrência de casos de resistência aos antimicrobianos devido a
velocidade com que os micro-organismos desenvolvem multirresistência.
As cepas ETEC de Escherichia coli isoladas da polpa de manga
apresentaram menor taxa de multirresistência quando comparadas às de coco
ralado, suspeitando que não há relação da multirresistência com a virulência
apresentada pelo micro-organismo.
70
Tabela 12 Frequência da susceptibilidade dos isolados de Escherichia coli e Salmonella sp. resistentes, com resistência intermediária e susceptíveis aos antibióticos analisados
Antibióticos testados, % de resistentes, intermediários e susceptíveis
NAL AMP CIP CLO CAZ SUT
Amostra Patógeno Isolados R I S R I S R I S R I S R I S R I S
Polpa
Manga
E. coli 6 0 16,6 83,3 100 0 0 0 16,6 83,3 16,6 16,6 66,6 16,6 16,6 66,6 0 0 100
Coco
Ralado E. coli 8 25 50 25 100 0 0 25 50 25 100 0 0 12,5 25 62,5 0 0 100
Melão
Salmonella
sp. 5 0 20 80 0 20 80 0 20 80 0 20 80 0 0 100 20 20 60
NAL – Ácido Nalidíxico AMP - Ampicilina CIP – Ciprofloxacino CLO – Cloranfenicol CAZ – Ceftadizima SUT – Trimetropima/Sulfametoxazol
71
Tabela 13 Frequência da susceptibilidade dos isolados de Escherichia coli e Salmonella sp. resistentes (R), com resistência intermediária (I) e susceptíveis (S) aos antibióticos analisados
Antibióticos testados
Isolados NAL AMP CIP CLO CAZ SUT
Polpa
de
manga
E. coli
P98MA1 S R S R S S
P98MA2 S R S S I S
P98MA3 S R S S R S
P98MB1 S R I I S S
P98MB2 S R S S S S
P98MB3 I R S S S S
Coco E. coli
F5MA1 R R R R R S
F5MA2 I R I R S S
F5MA3 R R R R S S
F5MA4 I R I R I S
F5MB1 I R S R S S
F5MB2 I R I R I S
F5MB3 S R S R S S
F5MB4 S R I R S S
Melão Salmonella
F1-72 I S S S S R
F2-72 S I S S S S
F3-72 S S S S S S
F4-72 S S I I S I
F5-72 S S S S S S
NAL – Ácido Nalidíxico AMP - Ampicilina CIP – Ciprofloxacino CLO – Cloranfenicol CAZ – Ceftadizima SUT – Trimetropima/Sulfametoxazol
72
6 Conclusões
Todas as amostras de polpas de frutas congeladas estavam
apropriadas para o consumo de acordo com as exigências da legislação para
bolores e leveduras, Salmonella e coliformes termotolerantes. Contudo, em uma
amostra de polpa de manga não pasteurizada foi isolado o patógeno Escherichia coli
com potencial virulento, no qual foi detectado o gene est1b codificador da toxina
termoestável de ETEC. O patógeno pode causar infecções alimentares, indicando a
necessidade de maior atenção no processamento deste produto. Sugere-se a
inclusão de etapa de pasteurização no processamento de polpas de frutas em todas
as indústrias, para garantir produtos seguros ao consumidor.
Treze (16,25%) amostras de frutas minimamente processadas estavam
inapropriadas para o consumo, uma vez que mostraram limites que contrariam a
legislação vigente. Portanto, é recomendado boas práticas higiênico-sanitárias na
manipulação durante o preparo das frutas minimamente processadas, assim como
adequada temperatura de armazenamento, prezando para uma melhor qualidade do
produto e a boa saúde do consumidor.
O estudo mostrou uma quantidade significativa de isolados de E. coli
que apresentaram multirresistência a três ou mais antimicrobianos, sendo relevante
mais pesquisas com patógenos e sua resistência à essas drogas. Micro-organismos
portadores de multirresistência promovem dificuldades na área médica em conter
uma infecção, podendo causar mortes.
73
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