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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIERA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇAO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES pvcrt-o E pvmdr1 COMO
POTENCIAIS BIOMARCADORES DE RESISTÊNCIA in vivo À CLOROQUINA EM
PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX
SIUHELEM ROCHA DA SILVA
MANAUS
2017
ii
SIUHELEM ROCHA DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES pvcrt-o E pvmdr1 COMO
POTENCIAIS BIOMARCADORES DE RESISTÊNCIA in vivo À CLOROQUINA EM
PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX
ORIENTADORA: Profº Drª. Gisely Cardoso de Melo
CO-ORIENTADOR: Profª. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro
MANAUS
2017
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Ficha Catalográfica S586c Silva, Siuhelem Rocha
Caracterização molecular dos genes pvcrt-o e pvmdr1 como potenciais biomarcadores
de resistência in vivo à cloroquina em pacientes com malária vivax. /Siuhelem Rocha
Silva. --Manaus: Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical,
2017.
xvii. 96f. : il.
Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2017.
Orientador: Gisely Cardoso de Melo
Coorientador: Wuelton Marcelo Monteiro
1. Malária. 2. Plasmodium vivax. 3. Resistência à cloroquina. 4.Variação do número de
cópias do DNA. 5. Região Promotora. I. Título
iv
FOLHA DE JULGAMENTO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS GENES pvcrt-o E pvmdr1
COMO POTENCIAIS BIOMARCADORES DE RESISTÊNCIA in vivo À
CLOROQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX
SIUHELEM ROCHA DA SILVA
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças
Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação
em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a
Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________________________
Drª.Gisely Cardoso de Melo
Presidente
______________________________________
Drª. Fernanda Rodrigues Soares
Membro
______________________________________
Dr. Rajendranath Ramasawmy
Membro
v
DEDICATÓRIA
A minha Tia Ana Cássia
Anunciação e as avós Ariadna
Paula de Sá,
Cleonilce Rocha (in memorian) e
Salomé Silva (in memorian), que
me incentivaram a prosseguir nos
estudos.
vi
AGRADECIMENTOS
Primeiramente à Deus pelo dom da vida, o qual me concedeu equilíbrio emocional em todas
etapas, principalmente ao término desta pesquisa;
Aos meus pais Maria de Fátima Rocha Anunciação, Wildienne Maria Paula de Sá e Francisco
Silvio Alves da Silva, pelo apoio incondicional em todas dificuldades vivenciadas e se
fazerem presente em todas minhas conquistas acadêmicas;
Aos meus orientadores Gisely Cardoso de Melo e Wuelton Marcelo Monteiro pelo
aprendizado durante toda a minha trajetória na pesquisa (desde Inciação Científica);
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas - FAPEAM, pelo financiamento e bolsa
concedida durante a vigência do projeto;
À Universidade do Estado do Amazonas, pela oportunidade de formação acadêmica no nível
de mestrado;
À Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pela estrutura física e
profissionais concedidos;
Ao programa de Pós Graduação em Medicina Tropical pelos atividades administrativas e
apoio aos assuntos pertinentes do projeto de pesquisa;
À Gerência e Coleta de Malária na pessoa da gerente Msc. Mônica Costa, por disponibilizar
insumos, microscopistas, ajudar na logística das atividades e por ser também uma grande
amiga;
Aos alunos do Programa de Apoio à Iniciação – PAIC: Tayna Ribeiro, Emanuelle Lira, aos
técnicos de Análises Clínicas: Alexandre Trindade, Bebeto Muller e Elisângela Silva, a
voluntária Nataly Tirzon pelo apoio ofertado desde coleta, realização de exames e
armazenamento de amostras biológicas;
Às farmacéuticas Marly Melo, Kelry Mazurenga e Marcela Sousa por toda ajuda na inclusão
e acompanhamento dos pacientes;
Ao grupo do Centro Internacional de Pesquisa Clínica - CIPCLIN, pelo apoio intelectual
durante toda a pesquisa;
Ao Instituto René Rachou - Fiocruz Minas, pela realização do treinamento com Msc. Gabriel
Costa de uma das metodologias do projeto;
Ao Instituto Leônidas e Maria Deane – Fiocruz Amazônia, pelo treinamento de
sequenciamento realizado com o Msc. Victor Costa, sendo pesquisadora responsável: Profª
Drª. Stefanie Lopes.
A minha turma de mestrado, especialmente ao Luis Salazar, Tati Pinilla e Suzana Kanawati
pelas experiências vividas e trocas de conhecimento científico;
vii
Ao Profº Drº. Rajendranath e ao Msc. George Silva pela ajuda nas análises do
sequenciamento realizado e por todo apoio.
À doutoranda Anne Almeida e Dr. Vanderson Sampaio pela ajuda nas análises estatísticas
desta pesquisa.
Aos meus amigos Allyson Guimarães, Aguyda Cavalcante pela motivação na reta final.
Aos meus amigos Sabrina Silva, Joyce Magalhães, Caroline Brelaz e Silvio Bernardo do
Centro de Antenção Integral à Melhor Idade – CAIMI Dr. Paulo lima pela motivação e apoio
na reta final.
A todos que direta ou indiretamente colaboraram para a conclusão desta pesquisa.
viii
DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS
O estudo fez parte do projeto de pesquisa intitulado: “COMBINAÇÃO DE DOSE
FIXA DE ARTESUNATO-AMODIAQUINA VERSUS CLOROQUINA PARA O
TRATAMENTO DE FASE SANGUÍNEA DE INFECÇÃO NÃO COMPLICADA DE
PLASMODIUM VIVAX: ENSAIO CLÍNICO DE FASE 3 RANDOMIZADO, ABERTO,
DE NÃO- INFERIORIDADE” financiado pela FAPEAM, CAPES e CNPq.
ix
RESUMO
O tratamento preconizado para malária por Plasmodium vivax baseia-se na administração de
cloroquina e primaquina, porém parasitos têm se tornado resistentes aos antimaláricos em
diversas regiões do mundo, o que contribui para um aumento na morbidade e mortalidade da
doença. Estudos sugerem que genes órtologos do Plasmodium falciparum, o pvcrt-o e pvmdr1
poderiam estar envolvidos no mecanismo de resistência à cloroquina (RCQ). O objetivo foi
caracterizar possíveis biomarcadores moleculares associados com resistência in vivo do
Plasmodium vivax à cloroquina. Foi realizado um estudo do tipo caso-controle. Os pacientes
foram recrutados e entrevistados no ambulatório da Fundação de Medicina Tropical Dr.
Heitor Vieira Dourado. Foram incluídos pacientes de ambos os sexos, entre 6 meses e 60
anos, apresentando peso superior a 5 quilos, densidade parasitária entre 100 a 100.000
parasitas/mL e temperatura axilar ≥ 37.5°C ou história de febre nas últimas 48 horas,
avaliados nos dias 0, 1, 2, 3, 7, 14, 28 e 42. O diagnóstico foi realizado através da gota
espessa pela técnica de Walker, na admissão e recrudescência foi coletado sangue venoso para
realização de hemograma e exames bioquímicos. A dosagem de cloroquina e metabólito
desetilcloroquina foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência, extração de DNA
para realização de genotipagem, PCR em tempo Real, sequenciamento e determinação do
número de cópias e extração de RNA para determinação da expressão gênica. Os dados foram
analisados utilizando SPSS® versão 16.0 para Windows (SPSS Inc® Chicago, IL, USA).
Foram incluídos 190 pacientes, sendo selecionados 60 pacientes para o presente estudo, 25
casos e 35 controles. Dos resistentes, 80% foram do sexo masculino, com idade média de 24,6
anos. A média de densidade parasitária foi de 2553,5 no D0 e 4672,1 no DR parasitos por
mm3. A média de hemoglobina foi de 12,9 g/dL no D0 e 12,7 g/dL no DR. No grupo dos
sensíveis, 77,2% foram do sexo masculino, com idade média de 33,1 anos. A média de
densidade parasitária foi de 2623,9 e média de hemoglobina de 13,2 g/dL. Quanto a variação
no número de cópias, houve diferença significativa entre sensíveis e resistentes no DR para o
gene pvcrt-o e nenhuma diferença entre os grupos para o gene pvmdr1. Para a análise de
polimorfismo na região promotora, evidenciou deleção e inserção de 19pb no gene pvcrt-o
mas não foi associada a RCQ. No éxon 1 do pvcrt-o, encontrou-se repetições de 4 e 5 AAG
(lisina), porém não associada à RCQ. Não foi observado associação entre variação no número
de cópias e aumento da expressão para gene pvcrt-o, porém para pvmdr1, as amostras com
amplificação gênica tiveram média menor comparado com as de cópia única. Foi observado
que deleção de 19pb, deleção com repetição de 4 AAG, inserção de 19pb e inserção com
repetição de 5 AAG nas amostras sensíveis e resistentes não foram associadas com aumento
da expressão gênica de pvcrt-o. Porém, as amostras com inserção de 19pb com repetição de 4
AAG no D0 e no DR houve aumento da expressão gênica.
Palavras chaves: Malária; Plasmodium vivax; Resistência à cloroquina; variações do número
de cópias do DNA, região promotora.
x
ABSTRACT
The recommended treatment for malaria by Plasmodium vivax is based on the administration
of chloroquine and primaquine, but parasites have become resistant to antimalarials in several
regions of the world, which contributes to an increase in morbidity and mortality of the
disease. Studies suggest that orthologous genes of Plasmodium falciparum, pvcrt-o and
pvmdr1 could be involved in the mechanism of resistance to chloroquine (WHR). This study
aimed to characterize possible molecular biomarkers associated with in vivo resistance of
Plasmodium vivax to chloroquine. A case-control study was conducted. Patients were
recruited and interviewed at the ambulatory of the Dr. Heitor Vieira Dourado Tropical
Medicine Foundation. The study included patients of both sexes, between 6 months and 60
years, weighing more than 5 kilograms, parasite density between 100 and 100,000 parasites /
mL and axillary temperature ≥ 37.5 ° C or history of fever in the last 48 hours, patients were
evaluated on days 0, 1, 2, 3, 7, 14, 28 and 42. The diagnosis was made through blood film
technique by Walker, at the admission and recrudescence venous blood was collected for
blood counts and biochemical tests. The dosage of chloroquine and desethylchloroquine
metabolite it was made by high-performance liquid chromatography, DNA's extraction for
genotyping embodiment, real time PCR, copy number's sequencing and determination and
RNA extraction for gene expression determination. Data were analyzed using SPSS® version
16.0 for Windows (SPSS Inc® Chicago, IL, USA). A total of 190 patients were included, 60
patients were selected for the present study, 25 cases and 35 controls. Among the resistant
ones, 80% were male, with a mean age of 24.6 years. The mean parasite density was 2553.5
in the D0 and 4672.1 in the DR parasites per mm3. The mean hemoglobin was 12.9 g / dL at
the D0 and 12.7 g / dL at the DR. In the sensitive group, 77.2% were males, with a mean age
of 33.1 years. The mean parasite density was 2623.9 and mean hemoglobin was 13.2 g / dL.
The variation in the number of copies, a significant difference between the sensitive and
resistant to pvcrt-o DR gene and no difference between groups for pvmdr1 gene. For analysis
of polymorphism in the promoter region, it was found deletion and insertion of 19bp in the
pvcrt-o gene but was not associated with WHR. In plexus exon 1, 4 and 5 AAG (lisine)
replicates were found, but his was not associated with WHR. No association was found
between variation in copy number and increase in expression for pvcrt-o gene, but for
pvmdr1, samples with gene amplification had lower mean compared to single copy. It was
observed that 19bp deletion, 4 AAG repeat deletion, 19bb insertion, and 5 AAG repeat
insertion in the sensitive and resistant samples were not associated with increased pvcrt-o
gene expression. However, samples with insertion of 19 bp with 5 AAG repeat in D0 and DR
showed an increase in gene expression.
Keywords: Malaria; Plasmodium vivax; Resistance to chloroquine; DNA copy number
variation; Promoter region.
xi
RESUMO LEIGO
Atualmente, a malária é um problema de saúde que atinge milhões de pessoas no mundo.
Uma das maneiras de diminuir o risco de pegar a doença é através da diminuição no número
dos mosquitos e através de medicamentos que promovam a cura, porém alguns pacientes não
estão curando ao uso desses medicamentos, o que pode resultar em inúmeros retornos de
malária num mesmo paciente. Então, o presente estudo investigou tipos de mecanismos que o
parasito utiliza para não ser eliminado do organismo. Vários testes laboratoriais foram
realizados, indicando se o paciente tem parasitas não respondedores à cloroquina, auxiliando
no monitorando da resposta da cloroquina e permitindo a individualização do tratamento.
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo Biológico da Malária.................................................................................
2
Figura 2. Distribuição geográfica da malária no mundo entre os anos 2000 e
2016.....................................................................................................................
3
Figura 3. Mapa de Risco da Malária por munícipio de infecção, Brasil
2015.....................................................................................................................
4
Figura 4. Casos de malária notificados entre janeiro de 2015 até agosto de
2017.....................................................................................................................
4
Figura 5. Localizações de relatos de casos de P. vivax A. resistentes B. e sensíveis à
cloroquina............................................................................................................
7
Figura 6. A. Determinação do número de cópias para o gene pvcrt-o entre os grupos
sensíveis e resistentes no D0 e DR. B. Determinação do número de cópias do
gene pvmdr-1 entre os grupos sensíveis e resistentes no D0 e
DR........................................................................................................................
22
Figura 7. Figura 7. Esquema do gene pvcrt-o mostrando inserção (destaque quadrado)
e deleção (destaque triângulo) de 19pb na região promotora e repetições de 4
AAG e 5 AAG (destaque em círculo) no éxon 1.................................................
23
Figura 8. Sequenciamento das amostras do grupo caso e controle para gene
pvmdr1.................................................................................................................
25
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Primers utilizados para avaliar polimorfismo na região promotora dos genes
pvcrt-o e pvmdr1................................................................................................
17
Tabela 2. Oligonucleotídeos que foram utilizados na genotipagem do P. vivax............... 18
Tabela 3. Relação dos iniciadores e sondas utilizados na amplificação por PCR em
tempo real para determinação do número de cópias
gênicas................................................................................................................
19
Tabela 4. Características gerais dos pacientes inclusos no estudo do período de janeiro
de 2012 à abril de 2014 no ambulatório da Fundação de Medicina Tropical
Dr. Heitor Vieira Dourado.................................................................................
21
Tabela 5. Frequência da mutação na região promotora do gene pvcrt-o nas amostras
resistentes e sensíveis à cloroquina....................................................................
24
Tabela 6. Frequência de repetições de AAG encontradas nos grupos casos e controles
em amostras com deleção e inserção de 19pb no gene pvcrt-
o..........................................................................................................................
24
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
% Por cento
≥ Maior igual
µl Microlitro
µm Micrômetro
AQ Amodiaquina
AS Artesunato
C (aminoácido) Cisteína
cDNA Ácido desoxirribonucleico complementar
CNV Variação no número de cópias (Copy Number Variation)
CQ Cloroquina
Ct Ciclo threshold
D0 Dia da admissão
DCQ Desetilcloroquina
Dl Decilitros
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTP Desoxirribonucleotideos trifosfatados
DR Dia da recrudescência
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
F (forward) Sentido Progressivo
F (aminoácido) Fenilalanina
G Força gravitacional
GAA Ácido glutâmico
H (aminoácido) Histidina
HE Heterosigosidade
HF Halofantrina
HPLC Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
IC Intervalo de confiança
K (aminoácido) Lisina
xv
Kb Quilobase
Kbp Quilo pares de bases
Kg Quilograma
L (aminoácido) Leucina
Mb Megabase
Mg Miligramas
MgCl2 Cloreto de magnésio
Ml Mililitros
Mm Milímetro
mM Milimol
mm3 Milímetros cúbicos
MQ Mefloquina
mRNA Ácido ribonucleico menssageiro
MS2 Microssatélite 2 de Plasmodium vivax
MSP1F3 Microssatélite 21, bloco 10 de Plasmodium vivax
Ng Nanograma
nM Nanomolar
ºC Graus Celsius
P (aminoácido) Prolina
p Valor de significância
P. falciparum Plasmodium falciparum
P. knowlesi Plasmodium knowlesi
P. malariae Plasmodium malariae
P. ovale Plasmodium ovale
P. vivax Plasmodium vivax
Pb Pares de bases
PCR Reação em cadeia da polimerase
PfCRT Transportador resistente à cloroquina em P. falciparum
Pfcrt Gene de resistência do P. falciparum à cloroquina
pfgch1 P. falciparum GTP-cyclohydrolase 1
PfMDR Transportador resistente à múltiplas drogas em P. falciparum
xvi
pfmdr1 Gene de resistência à múltiplas drogas do P. falciparum
PfMRP2 Proteína multidroga associada a resistência
POP Procedimento operacional padrão
PQ Primaquina
PvCRT Transportador de resistência à cloroquina do P. vivax
pvcrt-o Gene de resistência à cloroquina do P. vivax
PvMDR Transportador resistente à múltiplas drogas em P. vivax
pvmdr-1 Gene de resistência à múltiplas drogas do P. vivax
Q (aminoácido) Glutamina
QN Quinino
R Sentido Reverso
RCQ Resistência à cloroquina
RNA Ácido ribonucleico
RT-PCR Reação em cadeia da polimerase – transcriptase reversa
S (aminoácido) Serina
SNP Polimorfismo de um único nucleotídeo
sp. Espécie
Taq DNA polimerase termoestável
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
U Unidade de Massa Atômica
V (aminoácido) Valina
Y (aminoácido) Tirosina
ΔCT Variação do ciclo threshold
xvii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 1 1.1 Malária ............................................................................................................................ 1 1.2 Malária no mundo ........................................................................................................... 2 1.3 Malária na Amazônia Brasileira ..................................................................................... 3 1.4 Tratamento Malária Vivax no Brasil .............................................................................. 5
1.5 Resistência à Cloroquina (CQ) ....................................................................................... 5 1.6 Mecanismos moleculares de resistencia à cloroquina .................................................... 8
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 13 2.1 GERAL ............................................................................................................................... 13 2.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................................... 13
3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 14 3.1 Tipo de Estudo .............................................................................................................. 14
3.2 Local e período do Estudo ............................................................................................ 14 3.3 Aspectos Éticos .................................................................................................................. 14 3.4 Critérios de Elegiblidade .................................................................................................... 15
3.5 Desenho do Estudo e Procedimentos.................................................................................. 15 3.5.1 Diagnóstico de Plasmodium vivax por gota espessa .............................................. 15
3.5.2 Coleta do Material Biológico - sangue venoso ....................................................... 15 3.5.3 Dosagem Cloroquina mais Desetilcloroquina por HPLC ...................................... 16 3.5.4 Extração de DNA ..................................................................................................... 16
3.5.5 qPCR ........................................................................................................................ 16
3.5.6 Extração de RNA ..................................................................................................... 17 3.5.7 Expressão gênica do pvcrt-o e pvmdr1 ................................................................... 17 3.5.8 Sequenciamento dos genes pvcrt-o e pvmdr1 .......................................................... 18 3.5.9 Análise em marcadores moleculares, msp1F3 e MS2 ............................................. 18
3.5.10 Variação do número de cópias (CNV) .................................................................. 19 3.6 Análise Estatística .............................................................................................................. 21
4. RESULTADOS ................................................................................................................... 22 4.1 Determinação do número de cópias.................................................................................... 22
4.2 Sequenciamento da Região Promotora ............................................................................... 23 4.3 Associação de CNV e mutação na região promotora com expressão gênica de pvcrt-o e
pvmdr1. ..................................................................................................................................... 26
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 28
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 31
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 32
8. ANEXOS ............................................................................................................................. 40 8.1 PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ............ 40 8.2 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ........................................ 41 8.3 TERMO DE ASSENTIMENTO ........................................................................................ 49 8.4 PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRÃO – POP´S ............................................ 60
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Malária
É uma doença infecciosa parasitária causada por protozoários da classe Sporozoa,
família Plasmodidae do gênero Plasmodium. Cinco espécies de Plasmodium são infectantes
ao homem: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi, sendo sua
transmissão do tipo vetorial, através da picada por fêmeas do gênero Anopheles (1).
Seu ciclo biológico é heteroxênico, um no homem o hospedeiro intermediário e outro
no mosquito Anopheles sp., definitivo. A fêmea do anofelino, durante sua alimentação
hematófaga, inocula esporozoítos na corrente sanguínea do hospedeiro intermediário. O
parasito pode permanecer na epiderme ou, através da corrente sanguínea, migrar para o
fígado. Nos hepatócitos, as formas inoculadas se transformam em esquizontes e originam
milhares de merozoítos. Os merozoítos formam vesículas chamadas merossomos, que ao se
romperem entram novamente na circulação sanguínea, o que propicia a invasão das hemácias
pelos parasitos. No interior dos eritrócitos, os merozoítos podem originar os trofozoítos que,
por divisão nuclear, formam os esquizontes ou ainda gametócitos, forma sexuada capaz de
infectar o vetor. A fragmentação dos esquizontes no interior das hemácias culmina com a
hemólise e a liberação de novos merozoítos na circulação, processo desencadeador do
paroxismo febril (Figura 1) (2).
O principal recurso distintivo na biologia do Plasmodium vivax é sua capacidade de
formar estágios duradouros no fígado, chamados hipnozoítos. São metabolicamente ativos,
não se dividem e permanecem adormecidos por semanas e até meses antes de reativar (3).
2
Figura 1. Ciclo Biológico da Malária. A transmissão do parasito acorre através do repasto
sanguíneo realizado por fêmeas do mosquito do gênero Anopheles (direita) em um hospedeiro
humano (esquerda). Esporozoítos inoculados na pele pelos mosquitos atingem a corrente
sanguínea e migram para os hepatócitos, onde se reproduzem liberando os merozoítos para
iniciar o estágio eritrocítico. Na célula sanguínea ocorre a formação de outros merozoítos,
capazes de invadir novas hemácias. Uma parte dos parasitos assexuados se diferenciará em
gametócitos e, durante o repasto sanguíneo, serão ingeridas pelo mosquito, onde ocorrerá a
fecundação. No mosquito, os parasitos sofrem meiose e replicação mitótica para formar
esporozoítos, que podem infectar outro hospedeiro humano. A ocorrência de hipnozoítos é
característica, assim como a invasão de eritrócitos jovens (reticulócitos) característico de P.
vivax. Adaptado de Mueller et al, 2009 (2).
1.2 Malária no mundo
A malária continua sendo um problema de saúde pública, afetando milhões de pessoas
no mundo, a maior carga da doença é encontrada em países em desenvolvimento ou
subdesenvolvidos (Figura 2). Estima-se que 3,2 bilhões de pessoas estão sob o risco de
infecção por malária (1), no ano de 2015 foram estimados 212 milhões de casos,
representando 90,1% destes na África, 6,8% na Ásia Oriental, 1,8% na Região do
Mediterrâneo, 0,6% no Pacífico Ocidental e 0,4% nas Américas, causando 429.000 óbitos no
mundo (4).
3
Países endêmicos para malária, 2016 Países endêmicos em 2000, não em 2016
Países não endêmicos para malária, 2000 Não se aplica
Figura 2. Distribuição geográfica da malária no mundo entre os anos 2000 e 2016. Adaptado
WHO, 2016 (4).
A maior morbidade e mortalidade da malária é causada por duas das cinco espécies de
Plasmodium sendo elas: P. falciparum e P. vivax (5). P. falciparum é mais prevalente no
continente Africano e é responsável pela maioria das mortes em malária (1). A malária por P.
vivax acomete em várias partes do mundo subestimando o número de mortes (6), responsável
por 8,5 milhões de casos no mundo, na região das Américas representa (5,9%) dos casos
relatados nesta região. A maioria dos casos ocorrem no sudeste asiático (57,6%), seguido pela
região do mediterrâneo (16,5%), região africana (11,8%), causando 3.100 óbitos, no mundo
em 2015 (4).
1.3 Malária na Amazônia Brasileira
Em 2015, continente americano foi responsável por 800.000 casos de malária. O
Brasil é o país com a maior incidência desta doença na América (Figura 3), representando
24%, totalizando 192.000 casos (4).
4
Figura 3. Mapa de Risco da Malária por munícipio de infecção, Brasil 2015 (7).
No Brasil, em 2016, foram registrados 128.748 casos (Figura 4), sendo que o maior
número de casos se concentra na região da Amazônia Legal, contribuindo em cerca de 99%
dos casos. Os estados com maior número de casos são: Amazonas (40,0%), Acre (27,0%) e
Pará (10% dos casos). A espécie de plasmódio prevalente na Região Amazonica é o P. vivax,
responsável por 71.246 casos, no Amazonas (29.998 casos), Acre (17.873 casos) e Pará
(7.042 casos) (7).
Figura 4. Casos de malária notificados entre janeiro de 2015 até agosto de 2017 (7).
Devido aumento no número de casos por malária, a Organização Mundial da Saúde
tem preocupação quanto ao controle deste agravo, implementando assim, estratégias de
prevenção e tratamento que consistem em: controle vetorial, quimioprofilaxia, detectar,
diagnosticar, tratar e curar infecções (1).
5
1.4 Tratamento Malária Vivax no Brasil
Por ser uma das estratégias de controle da malária, o tratamento preconizado pelo
Ministério da Saúde consiste na administração de antimaláricos visando atingir o parasito em
pontos-chave de seu ciclo evolutivo: interrompendo esquizogonia sanguínea, destruindo
formas latentes do parasito (hipnozoítos) e interrompendo sua transmissão (gametócitos). São
administrados levando em consideração faixa etária, peso, espécie de plasmódio, história de
exposição, condições associadas (tais como gravidez) e gravidade da doença para garantir boa
eficácia e baixa toxicidade (8).
O esquema de tratamento para malária vivax não complicada baseia-se na
administração de cloroquina (CQ) - 150mg por 3 dias (ação esquizonticida e gametocitocida)
por possuir eficácia, segurança e baixo custo associado a primaquina (PQ) - 15mg por 7 dias
(ação hipnozoiticida) (9).
Em 1936, a cloroquina (CQ) foi administrada pela primeira vez em quatro pacientes
com sífilis e malária vivax em Dusseldorf, na Alemanha (10), porém liberada apenas em 1943
após investigação do seu composto, e oficialmente sua denominação como CQ foi registrada
em 1946. Neste mesmo ano, Loeb et al. publicaram sua atividade contra Plasmodium
falciparum e Plasmodium vivax. Sua atividade terapêutica é esquizonticida para as duas
espécies e gametocitocida apenas para P. vivax (11). A CQ faz parte da classe das quinolonas
de tipo1 (4 – aminoquinolina) (12) e sua ação no vacúolo parasitóforo do parasito inibe a
formação de hemozoína (não tóxico), resultando num acúmulo de hematina (tóxico)
ocasionando morte do parasito em Plasmodim falciparum (13).
1.5 Resistência à Cloroquina (CQ)
O reaparecimento da parasitemia da malária por P. vivax pode ser considerada recaída,
reinfecção ou resistência de estágios assexuados que sobreviveram à terapia. A definição de
parasito resistente se dar por persistência de estágios sanguíneos assexuados do P. vivax
mesmo com níveis adequados de CQ e seu metabólito desetilcloroquina (DCQ) no sangue
total ou plasma, devendo ultrapassar a concentração mínima efetiva de 100 ng/mL (14). As
recaídas têm aspecto importante no ciclo de vida do plasmódio, são decorrentes de estágios
6
sanguíneos assexuados originados de hipnozoítos (fase latente) (15). Reeinfecção se dá por
um novo episódio de malária ocasionado por uma nova picada do mosquito (16).
Em 1989, na Papua Nova Guiné foi relatado o primeiro caso de resistência à CQ por
P.vivax em dois soldados australianos que falharam o tratamento (17). Estudos posteriores na
Indonésia (18) (19-21), em Mianmar (22, 23), Índia (24, 25), América Central e do Sul (26),
Coréia (27) e na Fronteira da Tailândia com Mianmar – Dawei (28) também relataram
resistência clínica à CQ. O aumento da resistência, na maioria das áreas do mundo onde a
infecção por P. vivax é endêmica, apresenta consequências significativas para as
manifestações clínicas da infecção e para o seu controle (29).
No Brasil, o primeiro caso robusto relatado de P. vivax resistente à CQ in vivo foi o de
um paciente tratado na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-
HVD), em Manaus, Amazonas (30). Um estudo realizado na mesma localidade que realizou
acompanhamento clínico de 42 dias e dosagem de CQ plasmática em 109 pacientes com
malária vivax, detectou resistência in vivo à CQ em 10,1% dos casos (31) e outro estudo em
2014 detectou resistência em 5,2% dos pacientes tratados com CQ e primaquina associada,
acompanhados por 28 dias e com níveis plasmáticos de CQ e desetilcloroquina acima de
100ng/mL (32). Em 2017, Siqueira et al., avaliou eficácia da CQ correlacionando dosagens
séricas de CQ e DCQ estimando prevalência de resistência à CQ em 11,2% dos 190
pacientes (33). De acordo com estudos realizados em diferentes locais do mundo é possível
observar locais onde houve relatos de casos de resistência e sensibilidade à CQ como
demonstrado no mapa (Figura 5).
7
Figura 5. Localizações de relatos de casos de P. vivax A. resistentes B. e sensíveis à CQ.
Categoria 1: > 10% de recidiva ao dia 28, independentemente da confirmação de
concentração adequada de CQ no sangue; Categoria 2: recidivas confirmadas no dia 28
relatada dentro da concentração de CQ > 100 nm em sangue total; Categoria 3: > 5% de
recorrência no dia 28, independentemente da concentração de CQ. Adaptado de Howes, RE
(34).
A atividade antimalárica determinada por testes in vivo decorre de uma variedade de
fatores associados tanto do parasita quanto ao hospedeiro e testes ex vivo mostram com mais
precisão os efeitos isolados dos compostos sobre o metabolismo do parasita (35). Além de
estudos in vivo, estudos ex vivo são utilizados para determinar o grau de susceptibilidade do
parasito à droga e assim é possível monitorar o efeito do medicamento e determinar a melhor
escolha terapêutica para indivíduos de uma mesma região, porém ainda não estão
padronizados e validados (36, 37). Resistência ex vivo é definida por valores de IC50%
(concentração de droga que inibe em 50% o crescimento parasitário) maiores que 100nM de CQ,
após 42hs de cultivo, determinados pela microscopia ou citometria de fluxo (38).
Em 2013, Chehuan et.al num estudo ex vivo verificaram que 10,7% de 112 isolados do
Estado do Amazonas foram considerados resistentes à CQ (39). Os resultados de estudos ex
8
vivo são similares aos encontrados em ensaios clínicos, o que sugere que também são úteis na
vigilância da resistência à CQ na Amazônia (38).
1.6 Mecanismos moleculares de resistencia à cloroquina
A sequência do genoma nuclear do P. Vivax (Salvador 1) apresenta aproximadamente
26,8 megabase (Mb), apresentando 14 cromossomos, são únicos entre as espécies
de Plasmodium humano exibindo uma forma de estrutura isócora, com regiões subteloméricas
de baixo teor de G + C e regiões internas de cromossomos com conteúdo G + C
significativamente maior. Os possíveis marcadores moleculares envolvidos na resistência à
cloroquina do P. vivax, pvcrt-o e pvmdr-1, estão localizados no cromossomo 1 e cromossomo
10 respectivamente (40, 41)
Diversos trabalhos vêm buscando elucidar os mecanismos de resistência clínica à CQ.
Para P.falciparum esses mecanismos foram descritos associando genótipo de resistência e
pelo menos dois genes estariam envolvidos nessa mediação, o pfmdr1 e pfcrt (42). O pfmdr1
está envolvido com resistência a diversas drogas e pfcrt específico a resistência à CQ (41). A
proteína PfCRT é transmembrana, localizada no vacúolo digestivo do parasito onde a CQ tem
ação (43). Estudo verificou que a proteína PfMDR1 (transportador de resistência a
multidrogas) com mutacão associada ao fenótipo de resistência produzia mudança no pH do
lisossomo e diminuição no acúmulo da CQ, indicando que polimorfismos no gene pfmdr1
pode alterar a função da proteína e modular a resistência à CQ (44).
Como o tratamento para P. falciparum é similar ao do P. vivax, subtendia-se que os
mecanismos moleculares que leva ao fenótipo de resistência à CQ poderiam ser
compartilhados. Em 2001, Nomura et al. descreveram pela primeira vez o gene ortólogo de
pfcrt em P. vivax, denominado pvcrt-o (45), o qual codifica uma proteína transmembrana de
10 domínios e faz parte da família de transportadores de droga (46). Diversos estudos não
encontraram relação entre mutações no gene pvcrt-o e fenótipo de resistência à CQ (47-49) e
polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) também não foi associado à resistência, sugerindo
que mecanismos de resistência nesta espécie difere de P.falciparum (45). Linhagens
transgênicas de P. falciparum superexpressando pvcrt-o apresentaram redução significativa de
2,2 vezes na sensibilidade à CQ (50).
9
Em 2005, Brega et al., descreveram o gene ortólogo de pfmdr1 em P. vivax,
denominado pvmdr1 (51), no qual apresenta dois domínios homólogos hidrofóbicos, cada um
com seis alfa-hélices transmembrana e um dominio citosólico (41).
Polimorfismos de nucleotídeo único em 2 códons do gene pvmdr1 - Y976F e F1076L -
foram encontrados em 14 dos 23 isolados com P. vivax de diferentes áreas de endemicidade,
incluindo Tailândia, Indonésia, Turquia, Azerbaijão, e da Guiana Francesa (51). A mutação
Y976F foi associada com resistência à CQ no Sudeste Asiático e Papua Nova Guiné, 95% dos
isolados da Indonésia tinham a mutação Y976F no gene pvmdr1 em comparação com 25%
dos isolados tailandeses e o IC50 foi maior nos isolados com mutação Y976F quando
comparados com isolados do tipo selvagem (47), já no Nepal (52) houve baixa prevalência
dessa mutação. No Oriente Médio, em Catar, foi demonstrado que em 90% dos isolados
amplificados e sequenciados, apresentaram alelo do tipo selvagem para gene pvcrt-o (53).
Trabalhos realizados no Brasil também buscam a caracterização molecular de isolados
de P. vivax (31, 39, 41, 54, 55). Em sete amostras foi realizada análise completa dos códigos e
sequências não-codificantes dos genes de resistência pvcrt-o e pvmdr1 e não foi encontrada
nenhuma associação com resistência à CQ (41). Em 2009, foi identificado por Gama et al.,
mutação Y976F em pvmdr1 em todos os isolados examinados e em outro estudo realizado no
mesmo ano por Orjuela-Sanchez et al., três pacientes que recrudesceram a mutação não foi
encontrada (41), o que demonstrou não ser valiosa para a monitorização da resistência CQ no
Brasil (55).
Em outro estudo, foi realizado uma análise quantitativa do transporte de drogas
mediada por todas isoformas mutantes conhecidas do PvCRT (K10, Q34H, P38L, L47S,
L242P, S249P, F275V, L384F e Y390C) e parece provável que o PvCRT desempenhe um
papel na modulação da resistência a antimaláricos à base de quinolina, particularmente
amodiaquina (AQ) (56).
Outro marcador molecular associado ao fenótipo de resistência, utilizado no
monitoramento e estudo da resistência é a variação no número de cópias gênicas (CNV- do
inglês Copy Number Variation), definidas como alterações genômicas com pelo menos 1kb
de extensão, envolvendo deleções cromossômicas, inserções e/ou duplicação que estão
presentes em diferente número de cópias em comparação a um genoma de referência (57, 58).
A diversidade genética conferida por CNV abriu um novo tópico no entendimento da variação
10
fenotípica, evolução humana e susceptibilidade à doenças (59) e podem afetar a expressão
gênica em centenas de quilobases de distância do local do rearranjo, atuando em elementos
regulatórios de transcrição e tradução e também por meio do controle de RNA mensageiro
(mRNA) e taxas de degradação de proteínas (60).
O aumento do número de cópias pode aumentar a expressão gênica sem exigir uma
alteração na sequência. Estudos para avaliar CNV em parasitas da maláría começaram na
década de 80, a importãncia foi dada quando houve descoberta de um gene de P. falciparum
resistente a multidroga (pfmdr1) candidato a resistência à drogas no qual detectaram
aumento de número de cópias em parasitas do sudeste asiático associada a uma elevada
resistência à uma variedade de drogas antimaláricas (61). A alteração no número de cópias
deste gene também está associada à resistência a MQ (mefloquina), AS (artesunato), QN
(quinina) e HF (halofantrina), porém ao contrário do que ocorre com a CQ, a resistência a
estas drogas se deve ao aumento no número de cópias de pfmdr1(62).
Pesquisa realizada recentemente por Costa et al., 2017 para determinação do CNV em
amostras de pacientes infectados por P. falciparum do Amapá não apresentaram amplificação
gênica para os genes pfmdr1 e pfgch1 (Plasmodium falciparum GTP-cyclohydrolase 1) (63).
Neste mesmo estudo foi analisado em 43% dos isolados múltiplas cópias do gene pvmdr1 em
Mato Grosso e em Rondônia, apenas 4% dos isolados apresentaram múltiplas cópias. Para o
gene pvcrt-o, 7% dos isolados de Mato Grosso apresentaram múltiplas cópias e em nenhum
isolado de Rondônia mostrou amplificação (63).
Lu et al., 2011 encontraram número de cópias único em isolados da Coréia e duplo em
dois isolados Tailandeses no gene pvmdr1 (64). Jovel et al., 2011 descreveram presença de
duas cópias de pvmdr1 em 2,7% das amostras analisadas (65). Outro estudo verificou que
todos os parasitos tinham uma única cópia de pvmdr1 (66). A amplificação do gene pvmdr1
foi significativamente mais comum na Tailândia do que no Sudeste Asiático (67) e aumento
do número de cópias de pvmdr1 em 21% dos isolados da Tailândia e nenhum da Indonésia
(68). Vargas-Rodrigues et al., 2012 identificaram presença de apenas dois isolados com
número de cópias aumentado em pvmdr1 onde CQ e MQ são usados no tratamento da malária
(14). Foi observado que CNV estavam localizados a menos de 1 kbp de distância do gene
pvmdr1 (cromossomo 10, PVX_080100) em isolados cambojanos e tailandeses (69). Até o
momento, poucos estudos investigaram a relação entre os CNVs e resistência em P. vivax
(14).
11
O fluxo da informação genética é um processo em que o DNA é transcrito em RNA,
posteriormente usado como modelo para síntese protéica durante a tradução, tal fluxo é
conhecido como expressão gênica (70).
O processador central da regulação da expressão de um gene é seu promotor, uma vez
que contêm os sítios de ligação para as RNAs polimerases responsáveis pela transcrição
gênica. Promotores gênicos estão, normalmente, localizados imediatamente antes (upstream)
da região transcrita de um gene (71).
O fenótipo de resistência em P. falciparum é causado por uma deleção de 4,1 kb em
região upstream 5´ do gene pfmrp2 que conduz a uma alteração na sua transcrição causando
aumento do nível da proteína PfMRP2 (proteína multidroga resistência-associada), sugerindo
que elementos promotores são importantes na regulação da expressão do gene e potencial
polimorfismos genéticos são subjacentes a resistência aos medicamentos (72).
Fernandez-Becerra et al., 2009 identificaram níveis de expressão aumentados em dois
genes associados com multirresistência (pvcrt-o e pvmdr1) em um paciente com malária grave
por P. vivax, sendo a primeira evidência direta de que esses dois genes podem ser utilizados
como marcadores de gravidade associados com as infecções por P.vivax (73). Outro estudo
demonstrou que o nível de expressão do gene pvcrt-o estava aumentado no grupo resistente
(6,2 vezes) e do gene pvmdr1 (2,4 vezes) comparado ao grupo susceptível. Este dado sugere
também que a expressão destes genes poderia ser utilizada como biomarcador de resistência,
mas são necessários outros estudos para verificar o mecanismo pelo qual o aumento da
expressão génica destes genes é desencadeado (74).
A diversidade genômica que se encontra dentro e entre as populações de P. vivax pode
ser usada para elucidar potenciais mecanismos de resistência e invasão de fármacos, bem
como facilitar a codificação de barreiras moleculares do parasita para aplicações de vigilância
(69).
O surgimento de resistência do P. vivax aos antimaláricos tornou-se um obstáculo na
estratégia de controle a partir de drogas. Os possíveis biomarcadores podem ser utilizados na
prática clínica para a monitorização da eficácia do tratamento, para o diagnóstico e para
prever o prognóstico. O uso da expressão do gene como um biomarcador permitirá a
12
individualização do tratamento da malária e não há muitos estudos que demonstram se o
número de cópias e polimorfismos na região promotora estão relacionados com o aumento da
expressão de genes resistentes à CQ.
13
2. OBJETIVOS
2.1 GERAL
Caracterizar biomarcadores moleculares possivelmente associados com resistência in vivo do
Plasmodium vivax à cloroquina.
2.2 ESPECÍFICOS
a) Determinar a variação no número de cópias dos genes pvcrt-o e pvmdr1 em amostras
resistentes e sensíveis à cloroquina;
b) Verificar se variação no número de cópias dos genes pvcrt-o e pvmdr1 está relacionada
com resistência à cloroquina;
c) Verificar se há polimorfismo na região promotora em amostras resistentes e sensíveis à
cloroquina;
d) Verificar se há associação entre variação no número de cópias e aumento da expressão
gênica dos genes pvcrt-o e pvmdr1;
e) Verificar se existe associação entre mutação na região promotora e aumento na expressão
gênica dos genes pvcrt-o e pvmdr1.
14
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Tipo de Estudo
Foi realizado um estudo do tipo caso-controle. Os critérios de inclusão foram:
pacientes de ambos os sexos; com idade de 6 meses a 70 anos, peso ≥ 5 Kg, densidade
parasitária entre 100 a 100.000 parasitos/µL e apresentando temperatura axilar ≥ 37.5°C ou
história de febre nas últimas 48 horas. No grupo caso, foram inseridos pacientes com
recidiva do parasito obtendo concentração plasmática de CQ maior que 100 ng/mL e/ou
menor que 100 ng/mL, mas apresentando os mesmos alelos no D0 e DR. No grupo controle,
foram inseridos os que não apresentaram recidiva durante o período do acompanhamento.
Critérios de não inclusão: uso de antimaláricos nos últimos 60 dias e impossibilidade de ser
acompanhado por 42 dias e qualquer complicação clínica.
3.2 Local e período do Estudo
Os pacientes foram recrutados no período de janeiro de 2012 à abril de 2014
provenientes do ambulatório da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado,
por ser uma instituição de referência em doenças tropicais e infecciosas localizada na cidade
de Manaus, Amazonas.
3.3 Aspectos Éticos
O estudo foi aprovado tanto pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de
Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) quanto pela Comissão Nacional de
Ética em Pesquisa (CONEP) sob parecer 426/2011. A coleta do material biológico foi
realizada após a exposição dos objetivos da pesquisa aos pacientes e sua autorização como
participante da pesquisa após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido
(TCLE). Em pacientes menores de 18 anos, o termo de assentimento foi aplicado e assinado
pelos pais ou responsável. Os pacientes diagnosticados com malária por P. vivax foram
tratados de acordo como preconizado pelo Ministério da Saúde (8).
15
3.4 Critérios de Elegiblidade
Respeitando os critérios de inclusão (para grupos caso e controles), os pacientes
receberam tratamento supervisionado com 25 mg/kg de CQ por um período de 3 dias (10
mg/kg no dia 0 e 7,5 mg/kg nos dias 1 e 2). PQ foi prescrita no dia 42 de acompanhamento
ou quando houve recidiva por período de 7 dias, na dosagem de 0,5 mg/kg por dia. Pacientes
que vomitaram 30 minutos após a ingestão do medicamento foram retratados com a mesma
dose. Pacientes foram avaliados nos dias 0, 1, 2, 3, 7, 14, 28, 42 e uma visita extra se sentiu
qualquer sintoma durante o período de acompanhamento.
No dia da admissão (D0) e no dia de recrudescência (DR), 20 mL de sangue total
foram coletados para armazenamento de DNA e RNA. Nível plasmático de CQ e DCQ foi
determinado somente em casos de falha parasitológica (75) utilizando 3 alíquotas de 100 μL
de sangue total armazenado em papel de filtro para análise por cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC) (76, 77).
3.5 Desenho do Estudo e Procedimentos
3.5.1 Diagnóstico de Plasmodium vivax por gota espessa
O diagnóstico foi realizado através da gota espessa pela técnica de Walker (78),
conforme a descrição do POP_MAL_LB_001_v02D_PT (Anexo 8.4.1) e avaliados por
microscopistas especialistas da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. A
densidade parasitária (parasitas/μL) foi calculada pela contagem do número de parasitas em
200 leucócitos.
3.5.2 Coleta do Material Biológico - sangue venoso
Na admissão, 20 mL de sangue total foi coletado para realização de hemograma
(aparelho automatizado Coulter LH 750 Analyse da BECKMAN COULTER®), exames
bioquímicos, como: bilirrubina total e frações, creatinina, fosfatase alcalina, glicose, TGO,
TGP, GAMA GT e uréia (aparelho automatizado CT600i da WIENER LAB - GROUP) e
estocagem para extração de RNA e DNA.
16
3.5.3 Dosagem Cloroquina mais Desetilcloroquina por HPLC
As análises foram realizadas no Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal do
Pará em cromatógrafo líquido de alta eficiência Varian®, modelo PRO- STAR. A separação
cromatográfica foi realizada a temperatura ambiente empregando-se uma coluna X-TERRA® RP8
5μm 4.6 X 150mm (32).
3.5.4 Extração de DNA
Para extração de DNA foi utilizado o kit QIAmp® Blood Mini kit (Qiagen, Hilden,
Germany) e realizado seguinte protocolo, sucintamente: 200μL de sangue com EDTA foram
adicionados a 20 μL de proteinase K e 200 μL de tampão de lise. Após completa
homogeneização em vórtex, a mistura foi incubada em banho-maria a 56°C por 10 minutos.
Ao ser lisado foram adicionados 200 μL de etanol 96-100%, homogeneizado em vórtex por 5
segundos para a obtenção de uma solução homogênea. Para a purificação do DNA, a solução
foi aplicada em coluna, que posteriormente lavada sucessivamente com dois tampões de
lavagem. O DNA obtido foi eluído com 50 μL do tampão de eluição, conforme descrito no
POP_MAL_LB_002_v01D_PT (Anexo 8.4.2). Em seguida, a confirmação de monoinfecção
por P. vivax por PCR em tempo real.
3.5.5 qPCR
O método molecular utilizado para o diagnóstico do plasmódio baseia-se na
amplificação do gene 18S rRNA (direcionada para uma detecção qualitativa de Plasmodium
spp.)(79, 80). Os primers e sondas utilizados para amplificar região conservada deste gene do
P. vivax e P. falciparum foram utilizados como descrito no POP_MAL_LB_003_v02D_PT
(Anexo 8.4.3). As PCRs foram realizadas em reações de 20µL contendo 300 nM de cada
primer, 200 nM de cada sonda, 10µL de master mix TaqMan PCR (Applied® Biosystems) e
3µL de DNA genômico no Applied® Biosystems 7500 Fast System, nas seguintes
condições: 2 min a 50°C, 10 min a 95°C para ativar AmpliTaq Gold DNA polimerase,
seguido de 45 ciclos de 15seg a 95°C e 1 min a 60°C. Em cada experimento, um poço apenas
com mix foi incluído como controle negativo e realizado em duplicata.
17
3.5.6 Extração de RNA
As amostras foram tratadas com saponina e conservadas no reagente Trizol® até a
extração conforme descrito no POP_MAL_LB_004_v01D_PT (81) (Anexo 8.4.4). Em
resumo, foram adicionados 200 μL de clorofórmio, homogeneizado, incubado por 5-15 min e
centrifugado a 12.000g por 15 min a 4°C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo
com 500 μL de isopropanol, incubado por 10 min a temperatura ambiente e centrifugado a
12.000g por 10 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e lavado com 1mL de etanol a
75 %, depois centrifugado a 7.500g por 5 min 4°C. O pellet foi ressuspenso em 20 μL de
H2O DEPC (pirocarbonato de dietilo) – água tratada sem RNase e deixado em termobloco a
65ºC por 5 min, agitou-se em um vórtex por 2 min e em seguida dado spin de vários
segundos.
Para assegurar a qualidade do RNA foi realizado o gel de agarose a 2%. Para evitar
que contaminação por DNA genômico pudesse interferir nos resultados, todas as amostras de
RNA total foram tratadas com DNAse antes de serem submetidas ao RT-PCR (reação em
cadeia da polimerase e transcriptase reversa), conforme as instruções do fabricante, DNAse I
– Amplification Grade (Invitrogen®, EUA). Para a reação de transcrição reversa, foi
utilizado o kit SuperScript III (Invitrogen®, EUA), conforme descrito no
POP_MAL_LB_004_v01D_PT (Anexo 8.4.4).
3.5.7 Expressão gênica do pvcrt-o e pvmdr1
As reações de amplificação foram realizadas utilizando SYBR Green PCR Master
Mix (Applied Biosystems) e 45 ng de cDNA de cada amostra como descrito no
POP_MAL_LB_005_v01D_PT (Anexo 8.4.5). Os experimentos foram executados de forma
independente e em triplicata. Os produtos de PCR foram amplificados usando Applied
Biosystems® 7500 Fast System (73).
Para analisar os níveis de transcrição relativa, o valor do ciclo limite (Ct) de cada
amostra foi utilizado para calcular e comparar o ΔCt de cada amostra do P. vivax do gene Sal
I β-tubulina. O nível de expressão gênica foi calculado: N-fold = 2 - Δ Δ CT (82). A PCR foi
realizada nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 10 min, seguidos por 40
ciclos de 95°C por 15 seg e 60°C for 1 minuto.
18
3.5.8 Sequenciamento dos genes pvcrt-o e pvmdr1
Todas as amostras antes do tratamento (D0) e depois do tratamento (DR), em que
houve recrudescência e suscetibilidade, foram utilizadas para pesquisar polimorfismos através
de reações de sequenciamento de DNA. Os primers utilizados e as condições da reação usadas
para amplificar as sequencias de pvcrt-o e pvmdr-1 estão descritos na (Tabela 1). As PCRs em
reações de 50 µL contendo: 5 μL de tampão 10X, 2 μL de MgCl2 50mM, 1 mM de dNTP, 2,5
μM de cada primer, 0,25 μL de DNA polimerase e 8 µL de DNA genômico. Utilizando as
seguintes condições no termociclador: desnaturação inicial a 95°C por 10 min, acompanhado
de 35 ciclos de desnaturação 94°C por 50 seg, temperatura de anelamento específica de cada
primer (60ºC e 44ºC para pvcrt-o e pvmdr-1, respectivamente) por 1 min e extensão a 72°C
por 1 min.
Os produtos amplificados foram quantificados por NanoDrop® 2000 (Thermo
Scientific®) e o sequenciamento foi realizado na Plataforma Tecnológica de Sequenciamento
do Instituto Leônidas e Maria Deane – FIOCRUZ AMAZÔNIA. As sequências de
aminoácidos foram comparadas com sequências do Sal I (Salvador I), alinhados e analisados
usando software Geneious® versão 6.0.
Tabela 1. Primers utilizados para avaliar polimorfismo na região promotora dos genes pvcrt-o
e pvmdr1.
Gene Cromosomo Sequência 5’ 3’ Pares bases
pvcrt-o 1 5’-TCA ACC CGA ATC CAA ACC AGT G-3’
5’-GGC CTG CCT TAC TCT CAT TCT G-3’
698
pvmdr1 10 5’-T ACT GCT GTT GCT ATT GTC CCT GGG-3’
5’-GAA TAT ATC ATT ATA CAG TGG-3’
1.002
3.5.9 Análise em marcadores moleculares, msp1F3 e MS2 em pacientes resistentes à CQ
O MS2 foi escolhido devido a sua alta diversidade genética demonstrado em estudos
anteriores na América do Sul (83, 84) e o msp1F3, pois codifica uma região altamente
polimórfica da MSP1 e apresenta baixa ocorrência de artefatos na PCR (83-85). A PCR foi
executada como descrito por Koepfli et al. (86), com pequenas modificações, sendo realizado
em reações de 20 µL contendo 10 µM de cada primer, 2 µL de tampão 10X, 2,5 mM dNTP,
19
25 mM MgCl2, 1,5 U Taq DNA polimerase e 5 µL DNA genômico (tabela 2). Foi diluído 3
µL do produto de PCR primário para ser utilizado como amostra na nested PCR (msp1F3 e
MS2). A reação foi realizada em termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial
a 95°C por 1 min, acompanhado de 29 ciclos (PCR primária) ou 24 ciclos (nested PCR) de
desnaturação 95°C por 30 seg, anelamento a 59°C por 45 seg, extensão a 72°C por 1 min,
acompanhada por extensão final a 72°C por 5 min. Em cada experimento, uma mistura sem
DNA foi inclusa como controle negativo. Os produtos de PCR foram estocados e embalados
em papel alumínio em abrigo da luz a 4°C até serem enviados para Macrogen®, onde foi
realizado eletroforese capilar e analisados com GeneMarker® version 2.6.0.
Para assegurar a qualidade dos produtos de PCR foi realizado o gel de agarose a 2%.
Os perfis eletroforéticos foram analisados para cada amostra em relação ao comprimento do
amplicon e altura do pico. Os diferentes alelos detectados foram agrupados de acordo com o
respectivo comprimento de repetição (msp1F3 -3 pb, MS2 -4 pb). Os picos abaixo de 150 bp
não foram considerados, pois resultam de dímeros de primers residuais. O valor mínimo para
a altura do pico foi definido como 500 unidades de fluorescência relativa. De acordo com a
OMS, uma amostra é classificada como recrudescente se pelo menos um mesmo alelo for
detectado no D0 e DR (87, 88) e como reinfecção se todos os alelos para um gene são
distintos no D0 e DR (87).
Tabela 2. Oligonucleotídeos utilizados na genotipagem do P. vivax.
3.5.10 Variação do número de cópias (CNV)
A PCR foi realizada em triplicada no sistema StepOne™
for Software and StepOne™
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems em placas de 96 poços e a amplificação gênica foi
confirmada por três experimentos independentes. O gene contendo cópia única, β-tubulina, foi
usado como referência (normalizador) (48, 67) e uma amostra de campo com uma única cópia
20
do gene alvo foi usado como calibrador. O método ΔΔCt foi usado para estimar o número de
cópias dos genes pvmdr1 e pvcrt-o em relação a um gene calibrador padrão. As amostras
foram consideradas como cópia única quando o valor estimado do número de cópias foi de
0,5 a 1,5, enquanto valores acima de 1,5 foram definidos como amplificação gênica. Somente
amostras com CT - cycle threshold (definido como o número do ciclo da reação no qual a
fluorescência gerada supera o limiar de fluorescência) entre 25-34 ou desvio padrão das
triplicatas ≤ 0,3 foram consideradas nas análises (63).
As reações de amplificação foram realizadas em um volume total de 10 µL na
presença de 5 µL de Taqman® Universal PCR Master MIX 2x (Applied Biosystems, AB,
Foster City, CA, USA), 1 µL de DNA (~100-200 ng), 900 nM (pvcrt-o e pvmdr1) ou 300 nM
(pvtubulin e pvcrt-o) para os iniciadores senso, 900 nM dos iniciadores anti-senso para todos
os genes, e 200 nM (pvmdr1 e pvcrt-o) ou 250 nM (pvtubulin) para as sondas. Os iniciadores
e sondas específicos para cada um dos genes estão descritos na (Tabela 3). Os parâmetros de
ciclagem para a PCR foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 10 minutos, 40
ciclos de 15 segundos a 95 °C e 1 minuto a 60 °C (63).
Tabela 3. Relação dos iniciadores e sondas utilizados na amplificação por PCR em tempo real
para determinação do número de cópias gênicas.
Locus Iniciador Referência
pvmdr1–F 5´-CAGCCTGAAAGATTTAGAAGCCTT
Imwong et al.,
2008 (67)
pvmdr1–R 5´-CGGCTGTTGGAATCACTTTGA
pvmdr1–probe 5´CGGAGGAGTCGAACGAAGATGGTTTTTCTT
pvtubulin–F 5´-TCGCTTAACGACGTCCCC
pvtubulin–R 5´-TGGAATGTCACAAACGCTGG
pvtubulin–
probe
5´-TTCCGCTTCCCCCTCCACAGG
pvcrto–F 5´-TTTGGTCGCCGGGTCAT
pvcrto–R 5´-CAGCAGCGAGATTAGCAAAAATT Costa et al.,
2017 (63)
pvcrto-probe 5´-TGTTTAACCTCGTGTTGATTGCCTCGC
21
3.6 Análise Estatística
Os dados foram analisados usando SPSS® versão 16.0 para Windows (SPSS Inc
®
Chicago, IL, USA). Teste qui-quadrado ou de Fisher usado para testar diferenças na
frequência de polimorfismo na região promotora entre pacientes resistentes e sensíveis à CQ e
Teste T foi utilizado para comparação de média das variáveis contínuas.
22
4. RESULTADOS
Foram selecionados 60 pacientes, sendo 25 casos e 35 controles. Dos resistentes, 80%
foram do sexo masculino, com idade média de 24,6 anos. A média de densidade parasitária
foi de 2553,5 mm3 no D0 e 4672,1 mm
3 no DR. A média de hemoglobina foi de 12,9 g/dL no
D0 e 12,7 g/dL no DR. Dentre os sensíveis, 77,2% foram do sexo masculino, com idade
média de 33,1 anos. A média de densidade parasitária foi de 2623,9 mm3
e de hemoglobina de
13,2 g/dL (Tabela 4).
Todos resistentes incluídos tiveram dosagem de CQ e DCQ ≥100 ng/Dl e/ou análise
de microssatélites revelando presença do mesmo clone em D0 e DR indicando uma
recrudescência.
Tabela 4. Características gerais dos pacientes incluídos no estudo do período de janeiro de
2012 à abril de 2014 no ambulatório da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado.
n (%) Resistentes D0 95% IC Resistentes DR 95% IC Sensíveis 95% IC
Sexo
Masculino 20 (80) - - - 27 (77,2) -
Feminino 5 (20) - - - 8 (22,8) -
Idade (média) 24,6 17,8 - 31,98 - - 33,1 28,53 - 37,63
Densidade parasitária (média) 2553,5 1343,19 - 3763,78 4672,1 2163,31 - 7180,90 2623,9 1992,99 - 3254,75
Hemoglobina (média) 12,9 12,14 - 13,71 12,7 11,84 - 13,47 13,2 12,73 - 13,74
CQ+DCQ - - 229,4 181,79 - 277,11 - - *CQ= cloroquina
*DCQ= desetilcloroquina
4.1 Determinação do número de cópias
Para o gene pvcrt-o, foram analisados 28 pacientes sensíveis e 25 resistentes, sendo 14
no D0 e 18 no DR. Foram verificados que 7,1% das amostras sensíveis, 0% das resistentes no
D0 e 33,3% no DR apresentaram múltiplas cópias. Houve diferença significativa entre
sensíveis e resistentes no DR (p≤0,05) (Figura 6A).
Para pvmdr-1, foram analisados 28 pacientes sensíveis e 19 resistentes, sendo 9 no D0
e 17 no DR. Apresentaram múltiplas cópias 10,7 % sensíveis, 11,1 % resistentes no D0 e 0 %
no DR. Não houve diferença significativa entre os grupos (p≥0,05) (Figura 6B). Foram
excluídos das análises desses genes as amostras que não obedeceram aos critérios utilizados
na metodologia.
23
Figura 6. A. Determinação do número de cópias para o gene pvcrt-o entre os grupos sensíveis
e resistentes no D0 e DR. B. Determinação do número de cópias do gene pvmdr-1 entre os
grupos sensíveis e resistentes no D0 e DR. Valor maior que 1,5 foi considerado amplificação
gênica. *p<0,05
4.2 Sequenciamento da Região Promotora
Para o gene pvcrt-o, o sequenciamento foi realizado em 23 amostras sensíveis e 18
resistentes, sendo 13 no D0 e 11 no DR. Encontrou-se deleção e inserção de 19pb na região
promotora na posição 32083 a 32102 e 523 a 542, respectivamente. Foram encontradas
algumas cepas com 5 repetições de AAG (lisina) e em outras cepas, 4 repetições do mesmo
códon no éxon 1 do Transportador de resistência à cloroquina, PVX_087980 (Figura 7).
24
Figura 7. Esquema do gene pvcrt-o mostrando inserção (destaque quadrado) e deleção (destaque triângulo) de 19pb na
região promotora e repetições de 4 AAG e 5 AAG (destaque em círculo) no éxon 1.
25
Deleção de 19pb foi encontrada em 56,5% do grupo sensível, 33,3% no grupo
resistente no D0 (p=0,162) e 45,5% no grupo resistente no DR (p=0,545). A inserção de 19pb
foi encontrada em 43,5% no grupo sensível, 66,7% no grupo resistente no D0 (p=0,545),
54,5% no grupo resistente no DR (p=0,162) (Tabela 5).
Tabela 5. Frequência da mutação na região promotora do gene pvcrt-o nas amostras
resistentes e sensíveis à CQ.
D0 Sensíveis Resistentes D0 P Resistentes DR p
Deleção 19pb
SIM 56,50% 33,30% 0,162 45,50% 0,545
NÃO 43,50% 66,70% 54,50% Inserção 19pb
SIM 43,50% 66,70% 0,545 54,50% 0,162
NÃO 56,50% 33,30% 45,50%
Repetições 4 AAG e mais um códon AAA (5 lisinas) e de 5 AAG e mais um códon
AAA (6 lisinas) estão localizadas no éxon 1, posição 1017 a 1026 e 1017 a 1029,
respectivamente. A frequência destas em cada grupo estudado encontram-se descritas na
(Tabela 6). Não foram encontradas repetições de 5 AAG em amostras com deleção de 19pb e
não houve diferença significativa entre os grupos analisados.
Tabela 6. Frequência de repetições de AAG encontradas nos grupos casos e controles em
amostras com deleção e inserção de 19pb no gene pvcrt-o.
Sensíveis Resistentes D0 p Resistentes DR P
Deleção 19 pb (4 AAG)
SIM 54,50% 23,10% 0,089 45,50% 0,622
NÃO 45,50% 76,90%
54,50%
Inserção 19pb (4 AAG)
SIM 8,70% 14,30% 0,625 8,30% 1,000
NÃO 91,30% 85,70%
91,70%
Inserção 19pb (5 AAG)
SIM 39,10% 50% 0,517 45,50% 0,726
NÃO 60,90% 50%
54,50%
Para o gene pvmdr-1, o sequenciamento foi realizado em 66 amostras, sendo que 27
(41,5%) não foram analisadas, pois não amplificaram. Foram sequenciadas 16 amostras
sensíveis e 23 resistentes, sendo 14 no D0 e 9 no DR. Não houve nenhuma variação no gene
analisado. Ressalta-se que foi comparado com amostra de referência PVX_087980 (sal-1)
(Figura 8).
26
Figura 8. Sequenciamento das amostras do grupo caso e controle para gene pvmdr1. Imagem:
software Geneious.
4.3 Associação de CNV e mutação na região promotora com expressão gênica de pvcrt-o
e pvmdr1.
Foram avaliados a expressão do gene pvcrt-o e pvmdr-1 em 9 amostras sensíveis e 12
resistentes, sendo 10 no D0, 9 no DR.
A expressão foi determinada no grupo dos sensíveis apresentando média igual a 0,225 e
amostras resistentes com valores médios de expressão gênica em D0 e DR apresentando
aumento de 2,4 vezes (IC 95%: 0,96-7,1) e 6,1 vezes (IC 95%: 3,8-14,3) nos níveis de pvcrt-o
em comparação aos pacientes suscetíveis.
Para gene pvmdr1, foram 9 sensíveis apresentando média igual a 0,189 e resistentes
apresentando níveis aumentados 2,0 vezes (IC 95%: 0,95-3,8) e 2,4 vezes (IC 95%: 0,53-9,1)
em D0 e DR em comparação aos pacientes suscetíveis. Houve diferença significativa entre os
grupos – caso e controle no D0 (p=0,000).
Não se observaram diferenças significativas nos níveis de expressão entre D0 e DR para
parasitas resistentes (p = 0,375 para pvcrt-o e p = 0,844 para pvmdr1). No entanto, quando
comparados os níveis de expressão entre parasitas resistentes e sensíveis em D0 para ambos
os genes, os valores foram significativamente maiores para falhas de tratamento (p <0,05 para
ambos os genes).
27
Na análise de associação entre variação no número de cópias e aumento da expressão
não foi observado diferença significativa para gene pvcrt-o tanto em D0 quanto em DR. Para
pvmdr-1, nas amostras com amplificação gênica, foi observado média de expressão gênica de
0,306 e naqueles com cópia única apresentou média de expressão gênica de 2,096 (p=0,045).
Foi verificado que tanto a deleção de 19pb, deleção com repetição de 4 AAG, inserção
de 19 pb e inserção com repetição de 5 AAG nas amostras sensíveis e resistentes no D0 e DR
não foi associado com aumento da expressão gênica de pvcrt-o (p>0,05). Amostras com
deleção de 19pb tanto no D0 quanto no DR não apresentam repetição de 5 AAG para associar
ou não com a expressão gênica.
Foi observado diferença significativa na expressão gênica das amostras com inserção
de 19 pb com repetição de 4 AAG no D0 e no DR (p=0,000) influenciando assim no aumento
da expressão gênica.
28
5. DISCUSSÃO
O estudo de CNVs em Plasmodium é recente, sendo a maioria em P. falciparum.
Estima-se que entre 0,3 a 1,0% do genoma de P. falciparum diverge em número de cópias
gênicas entre isolados do parasito (89, 90). As bases moleculares da resistência aos diferentes
antimaláricos não é totalmente compreendida, mas vários CNVs em genes de P. falciparum já
foram associados à resistência, tais como no gene pfmdr1 (múltiplas drogas – QN, CQ, MQ e
HF) e pfgch1 (SP)(91, 92).
Poucos estudos avaliaram presença de CNVs em P. vivax. O primeiro, em pvcrt-o
foram em isolados de Mato Grosso e Rondônia, porém sem acompanhamento clínico, no qual
foram encontrados múltiplas cópias (7%) nos isolados do Mato Grosso e em nenhum de
Rondônia mostrou amplificação. Porém, neste estudo, as amostras resistentes apresentaram
múltiplas cópias, com diferença significativa entre os sensíveis e resistentes no DR (63).
Em relação ao gene pvmdr1, em isolados de diversos países, a variação do número de
cópias não apresentou uma característica única. Na Coréia apresentou cópia única, dupla
cópia na Tailândia e nenhuma na Indonésia (67). Outros estudos demonstraram que todos os
parasitos apresentavam cópia única e em outro em que apenas 2 isolados apresentaram cópia
aumentada (64-66). Neste estudo, não foi observado diferença significativa na amplificação
gênica entre os grupos, sendo observado que a distribuição de isolados resistentes aos
antimaláricos é diferente entre as regiões endêmicas do mundo, assim como o perfil de CNV
nos diferentes genes (63).
Um outro marcador molecular importante para fenótipo de resistência é análise de
SNP. A importância das mutações pontuais encontradas na proteína PfCRT foi reforçada
devido resultados de transformação genética e por um estudo no oeste africano que mostrou
que o alelo mutante K76T do pfcrt estava presente em 100% dos pacientes com falha
terapêutica, em comparação com prevalência de 40% na população em geral (93).
O primeiro estudo verificou que mutantes de PfMDR1 associados ao fenótipo de
resistência à CQ, produziam mudanças no pH do lisossomo e diminuição no acúmulo da CQ,
indicando que mutações no gene pfmdr1 poderia alterar a função desta proteína (94, 95).
Outros estudos verificaram que polimorfismos neste gene pode alterar a função da proteína e
modular a resistência à CQ em P. falciparum (44, 96). Diferente da compreensão sobre os
29
mecanismos de resistência aos antimaláricos em P. falciparum, esse entendimento ainda é
limitado para P. vivax.
Estudo realizado na Amazônia Peruana por Flannery et al., 2015, evidenciou através
do sequenciamento, que algumas infecções de P. vivax analisadas da região são policlonais e
que apesar disso observaram uma diversidade genética de parasitas, três ou menos haplótipos
compreendem 94% do genoma analisado, sugerindo introdução de parasitos recentes na
região. Em contrapartida encontraram também mais de três haplótipos em gene putativos de
resistência à fármacos incluindo o gene que codifica a dihidrofolato sintase redutase-
timidilato e o pvmdr1, sugerindo que as mutações de resistência surgiram de forma
independente (97).
Dharia et al., 2010 realizou sequenciamento de todo genoma e análise de microarrays
em unico isolado do Peru que revelou pressão seletiva sobre os genes de resistência à
fármacos. Encontraram mais de 18.261 SNPs, dos quais 6.257 foram ainda validados usando
microarrays. Essa sequência mostra que mesmo regiões com baixo número de leituras de
sequência alinhadas são também altamente variáveis pela análise de microarrays genômicos.
Os genes que contêm a maior proporção de SNPs não sinônímio incluem dois fatores de
transcrição de AP2 e a proteína PvMDR1 (98).
Este é o primeiro trabalho a avaliar possíveis mutações na região promotora dos genes
em estudo que podem ou não influenciar na expressão gênica e consequentemente no fenótipo
de resistência. As deleções e inserções de 19 pares de bases encontradas em pvcrt-o exercem
um papel importante no estudo da expressão, uma vez que os resultados conferem aumento da
expressão deste gene devido a inserção de 19pb seguido da repetição de 4 lisinas na
sequência. Estudo realizado em isolados de Myanmar, em mais da metade das amostras
apresentaram inserção de AAG (lisina) no K10, localizada no éxon1 em décima posição do
gene pvcrt-o (99), essa inserção já foi sugerida como um marcador de resistência (47, 64), o
que indica alta resistência no sul de Myanmar (64).
Na análise do sequenciamento do gene pvmdr1, não foi encontrada nenhuma variação
na região promotora que pudéssemos associar com perfil de resistência à múltiplas drogas.
O seqüenciamento do genoma integral de parasitas da malária de pacientes pode
fornecer uma visão mais detalhada sobre a evolução da resistência aos medicamentos do que a
30
associação genética ou estudos de associação, especialmente em regiões geográficas com
diversidade genética de parasitas limitada (97).
Neste presente trabalho, o nível de expressão gênica de pvcrt-o e pvmdr1 foi
determinado em pacientes com RCQPv procedente de um ensaio clínico com tratamento
supervisionado, evidenciando uma associação entre RCQ in vivo e aumento na expressão
desses genes. Além disso, esses pacientes apresentaram alta concentração plasmática de CQ e
microssatélites revelaram a presença do mesmo clone em D0 e DR indicando uma
recrudescência. De acordo com resultados encontrados não foi observado associação de
variação no número de cópias com aumento da expressão para gene pvcrt-o. Para pvmdr-1,
nas amostras com amplificação gênica, foi observado menor média da expressão gênica em
relação naqueles com cópia única. Há estudos que comprovam diversidade genética do P.
vivax em diferentes localidades, isso pode explicar o fato de que há divergências de resultados
na análise (100).
Os sinais de seleção natural sugerem que P. vivax está evoluindo em resposta a
medicamentos antimaláricos e está se adaptando às diferenças regionais no hospedeiro
humano e no vetor. Há uma epidemiologia variável desta espécie de parasita e novas
abordagens a serem realizadas para eliminação do P. vivax (101).
O monitoramento da resistência à CQ em P. vivax deve continuar (102). Novos
esquemas e estratégias que utilizem medicamentos antimaláricos existentes serão necessários
até que novos compostos possam ser implantados (103).
Diante dos dados apresentados nesta pesquisa, é possível sugerir como perspectivas
futuras, trabalhos que possam traçar perfil genético dos genes citados de diversas regiões
independentemente, pois muitas variações moleculares e fenotípicas diferenciam entre
localidades. Principalmente estudos que envolvam marcadores moleculares.
31
6. CONCLUSÃO
1. Quanto CNV, houve diferença significativa entre sensíveis e resistentes no DR para o gene
pvcrt-o e nenhuma diferença entre os grupos para o gene pvmdr1.
2. Análise de polimorfismo na região promotora, evidenciou deleção e inserção de 19pb no
gene pvcrt-o, mas não foi associada a RCQ.
3. No éxon 1 do pvcrt-o, encontrou-se repetições de 4 AAG e 5 AAG, também não associada
à RCQ.
4. Há aumento da expressão gênica para ambos os genes entre parasitos resistentes e sensíveis
no D0 em amostras RCQ.
5. Não foi observado associação entre variação no número de cópias e aumento da expressão
para gene pvcrt-o, porém para pvmdr1, as amostras com amplificação gênica tiveram média
menor comparado com as de cópia única.
6. Deleção de 19pb, deleção com repetição de 4 AAG, inserção de 19pb e inserção com
repetição de 5 AAG nas amostras sensíveis e resistentes não foi associada com aumento da
expressão gênica de pvcrt-o.
7. Por último, nas amostras com inserção de 19pb com repetição de 4 AAG no D0 e no DR
está influenciando no aumento da expressão gênica.
32
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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40
8. ANEXOS
8.1 PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
41
8.2 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
42
43
44
45
46
47
48
49
8.3 TERMO DE ASSENTIMENTO
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
8.4 PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS PADRÃO – POP´S
8.4.1 Pop de preparo e leitura de lâminas para detecção de Plasmodium spp
Código POP POP_MAL_LB_001_v01D_PT
Título Preparo e leitura de lâminas para detecção de Plasmodium spp.
Idioma da versão original PORTUGUÊS
Elaborado por:
Gisely Cardoso de Melo
Revisado por:
Aprovado por:
Data de aplicação:
05 de julho de 2010
Data da próxima revisão:
Emenda Razão da emenda
.
ObjETIVOS Descrever os procedimentos para preparo, coloração, leitura e registro de resultado de lâminas para detecção de
Plasmodium spp. utilizando gota espessa.
Definições Não se aplica
ApLICÁVEL A Todas as lâminas coletadas para detecção de Plasmodium spp. durante os estudo.
RESPONSABILIDADES Pessoal encarregado da coleta das amostras, técnicos e microscopistas, chefia do laboratório.
POps RELACIONADOS Seguimento dos participantes no estudo “Epidemiologia da Malária no Município do Careiro, Amazonas”
(versão atual do POP_MAL_TC_002). Triagem e seguimento dos pacientes no estudo de malária grave por
Plasmodium vivax (versão atual do POP_MAL_HO_001).
ProcedIMENTOS
6.1 Coleta e identificação das amostras
1 Dependendo do protocolo do estudo, em cada local (campo, unidade básica de saúde ou hospital) serão
coletadas:
- duas gotas espessas por indivíduo ou;
- quatro lâminas por pessoa - duas com duas gotas espessas na mesma lâmina e duas com esfregaço.
2. Após limpar a polpa do dedo anelar com algodão embebido em álcool a 70%. Fazer a punção digital com
lanceta estéril. Comprimir o dedo suavemente.
3. Duas gotas espessas serão preparadas na mesma lâmina, alternativamente a uma gota espessa e um esfregaço.
Confeccionar uma gota espessa homogênea de 1,5 x 1,0 cm na lâmina de vidro.
4. Uma etiqueta de identificação, contendo código de barras e números únicos, será colada na margem da
lâmina, como segue:
Código: POP_MAL_LB_001_v01D_PT
Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária
S
61
5. Os três formulários seguintes serão preenchidos no momento da coleta da lâmina no hospital, na unidade
básica de saúde ou no campo:
- Uma Ficha de amostras de laboratório;
- Cada estudo tem uma diferente ficha de amostras de laboratório, onde os tipos de amostras coletadas de cada
estudo são especificados;
- Uma etiqueta de identificação de amostra será pregada e o nome o número de identificação no estudo de cada
paciente será preenchido;
- Um formulário de resultado da primeira leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A01) e de
resultado da segunda leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A02);
- Uma etiqueta de identificação será colada em cada formulário, que também será preenchido com nome e
número de identificação permanente (NIP) do paciente no estudo, além da data de coleta da lâmina.
6.2 Recepção de amostras no laboratório
1. As lâminas serão levadas inicialmente para o laboratório onde serão devidamente coradas (e será realizada a
leitura rápida.
2. Para leitura de densidade parasitária, as lâminas serão enviadas ao laboratório da Gerência de Malária
acompanhadas de uma Ficha de amostras de laboratório para cada paciente, acompanhada de:
- formulário de resultado da primeira leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A01);
- formulário de resultado da segunda leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A02).
3. Quando as amostras chegarem ao laboratório, a pessoa encarregada da recepção checará se todas as amostras
registradas na ficha de amostras de laboratório foram entregues.
4. A Ficha de amostras de laboratório será preenchida no local da coleta em ordem de data. Cada estudo tem uma
diferente
5. Após a recepção, caso não sejam realizada a leitura da densidade parasitária no mesmo momento da chegada,
estas serão armazenadas
6. Quando as amostras chegarem ao laboratório, a pessoa encarregada da recepção checará se todas as amostras
registradas na Ficha de amostras de laboratório foram entregues.
7. A Ficha de amostras de laboratório será preenchida no local da coleta em ordem de data.
8. Após a recepção, caso não sejam realizada a leitura da densidade parasitária no mesmo momento da chegada,
estas serão armazenadas conforme procedimento descrito na seção 8.
6.3 Coloração
6.3.1 Reagentes
Azul de metileno fosfatado
Solução alcoólica de Giemsa estoque
Solução alcoólica de Giemsa diluída 1:10
Água tamponada
6.3.1.1 Preparação
Azul de metileno fosfatado
Azul de metileno medicinal em pó 16H18ClN3S 200 mg
Fosfato de sódio monobásico NaH2PO4 600 mg
Fosfato de potássio bibásico K2HPO4 200 mg
Água destilada H2O 250 mL
Filtrar para retirar as impurezas
62
Solução alcoólica de Giemsa estoque
Corante Giemsa em pó C14H14ClN3S 750 mg
Álcool metílico PA CH3OH 65 mL
Glicerina PA CH2(OH)CH(OH)CH2OH 35 mL
Agitar bem (várias vezes por dia) em garrafa contendo pérolas de vidro.
Manter o recipiente tampado em forma de estoque.
Filtrar quando necessário.
Solução alcoólica de Giemsa diluída 1:10
Solução alcoólica de Giemsa estoque 1 gota
Água tamponada 1mL
Água tamponada
Fosfato bibásico de sódio Na2HPO4 6 g
Fosfato monobásico de potássio KH2PO4 4 g
Misturar em gral de porcelana.
Diluir 1 g da mistura em 1000 mL de água destilada.
6.3.1.2 Armazenamento dos reagentes
Os reagentes utilizados nesse procedimento devem ser armazenados em temperatura ambiente.
6.3.2 Procedimento
1ª fase: Desemoglobinização pela solução hipotônica de azul de metileno.
1. Aplicar a solução de azul de metileno fosfatado sobre a gota espessa de sangue, por dois segundos.
2. Enxaguar a lâmina com água tamponada (sem jato forte).
2ª fase: Coloração pela solução de Giemsa para coloração da gota espessa.
1. As lâminas devem ser coradas dentro de 72 horas com uma solução de Giemsa a 10% com água tamponada.
2. Colocar a lâmina com o lado da gota voltada para a superfície da placa de coloração.
3. Preparar uma solução de Giemsa na proporção de uma gota de corante para 1mL (1 gota) de água tamponada.
Homogeneizar
4. Aplicar esta solução na placa côncava de coloração, sob a lâmina invertida.
5. Deixar corar por 10 minutos.
6. Enxaguar com água tamponada (sem jato forte).
7. Secar ao calor suave ou sob ventilação.
3ª fase: Coloração do esfregaço método de Giemsa
1. Fixar o esfregaço com álcool metílico por um minuto.
2. Deixar secar.
3. Colocar a lâmina invertida sobre a placa de coloração.
4. Despejar a diluição do corante de Giemsa na proporção de uma gota do corante para 1mL de água tamponada.
5. Deixar corar por 20 a 30 minutos.
6. Enxaguar com jato forte de água tamponada.
7. Secar ao calor suave ou sob ventilação.
4ª fase: Montagem das lâminas (no caso de a leitura da densidade parasitária não for realizada no mesmo dia da
coloração, realizar a montagem, como segue):
1. Pingar duas a três gotas de Entelan® em cada lâmina.
2. Colocar uma lamínula sobre as gotas.
3. Deixar secar sob temperatura ambiente.
6.4 Controle de qualidade da coloração de lâminas
1. A solução de Giemsa deve ser controlada antes do uso. Isto é realizado preparando a solução de Giemsa 1:10
que será usada e corando uma lâmina sabidamente positiva. Não deve haver coloração das hemácias.
2. Cada nova preparação de Giemsa deve ser submetida a controle de qualidade.
63
3. O tampão de pH deve ser checado utilizando pHmetro ou fita, estando o pH a 7,2. O pH deve ser ajustado se
necessário. O tampão deve ser analisado ao menos duas vezes por semana se for preparado em grandes
quantidades.
6.5 Leitura
1. Antes do início da contagem, o equivalente a 0.25 µL de sangue (aproximadamente 100 campos utilizando
uma ocular de 10X e uma objetiva de 100X) deverá ser examinado para determinar a espécie do parasito e
estágios que possam estar presentes.
2. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre a lamínula.
3. Ligue o microscópio. Cheque a presença de ocular de 10X.
4. Com o condensador elevado, a lâmina corada é colocada no suporte e a fonte de luz é ajustada visibilizando
pela ocular e pela objetiva de 100X.
5. Ao mover lentamente a objetiva de imersão, uma camada de óleo será formada entre a lâmina e a lente. O
ajuste fino é usado para focar o campo; a lente não deve tocar a lâmina.
6. O exame microscópico deve ser sistemático e padronizado. Ele deve iniciar pela extremidade esquerda da
lâmina. A leitura é iniciada da periferia do campo e termina no centro. Quando o campo está lido, move-se a
lâmina longitudinalmente para examinar os campos adjacentes. Move-se a lâmina verticalmente para que outra
fileira/largura seja lida. Há cerca de 100 campos em um eixo de 2 cm da lâmina;
7. No início será realizada a leitura rápida das lâminas para guiar o tratamento e, após, será feita a quantificação
da densidade parasitária para determinar o resultado final.
6.5.1 Leitura rápida
1. As lâminas serão lidas imediatamente após a coleta para guiar o tratamento.
2. A leitura rápida será realizada conforme a prática padrão em cada centro.
3. Os resultados da leitura rápida serão transcritos no formulário apropriado de cada estudo (versões atuais de
POP_MAL_TC_002_A01, POP_MAL_TC_002_A02, POP_MAL_HO_002_A01, POP_MAL_HO_002_A02)
6.5.2 Leitura da densidade parasitária: parasitos por μL
1. Uma vez coradas, as lâminas serão colocadas em caixas e distribuídas com o formulário de primeira leitura de
lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A01) ao microscopista que realizará a primeira leitura.
2. Para contagem de parasitos e leucócitos separadamente, dois contadores devem ser usados, um para as formas
assexuadas do parasito e outro para os leucócitos. Caso detecte-se infecção mista, outro contador deverá ser
utilizado para a contagem de formas da outra espécie.
Determinando uma lâmina como negativa
1. O microscopista irá ler a lâmina até que 200 campos tenham sido contados.
2. A lâmina apenas será determinada negativa quando nenhum parasito for encontrado em 200 campos.
Caso sejam vistas formas assexuadas de Plasmodium spp.
1. O microscopista contará parasitos até que o número de 500 leucócitos ou 500 parasitos seja alcançado.
2. Caso o microscopista já tenha contado 500 leucócitos ou mais quando o primeiro parasito for visto, a leitura
será interrompida.
3. A contagem de parasitos ou leucócitos não será interrompida até que o campo inteiro seja lido.
4. Este método será usado tanto para infecções únicas ou mistas por Plasmodium. No segundo caso, os parasitos
de cada espécie deverão ser contados separadamente.
5. A contagem parasitária em relação à contagem de leucócitos pode ser convertida a parasitos por μL usando a
seguinte fórmula matemática:
6. Está fórmula será calculada para cada espécie de parasito encontrada.
7. Caso o número de leucócitos para cada participante seja conhecido ( ex: estudo de malária vivax grave), a
densidade pode ser calculada mais precisamente com a seguinte fórmula:
Nº de parasitos X Nº de leucócitos / Nº de leucócitos = parasitos por μl
8. A contagem de gametócitos será feita de forma específica para cada espécie.
9. Este procedimento é semelhante aos métodos diagnósticos preconizados pelas diretrizes do CLSI do CDC
(contagem superior a 500 parasitos ou 1000 leucócitos) e também similar às diretrizes da OMS (que para
densidades < 10 parasitos por 200 leucócitos propõe contar acima de 500 leucócitos, mas que para densidades
superiores a 10 parasitos por 200 leucócitos propõe parar a contagem ao atingir 200 leucócitos).
10. Após a primeira leitura, as lâminas serão mantidas na mesma ordem na bandeja ou caixa para serem lidas
posteriormente por outro microscopista. As lâminas serão entregues conjuntamente com o formulário de segunda
64
leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A02) ao microscopista que realizará a segunda leitura,
assegurando-se que não seja a mesma pessoa que realizou a primeira leitura e que esta pessoa não tenha acesso
aos resultados no formulário de primeira leitura de lâmina.
6.6 Registro dos resultados
1. O microscopista registrará os resultados da leitura em μL nos formulários de primeira e segunda leitura de
lâmina. A primeira seção do formulário, incluindo a etiqueta de identificação da amostra, já haverá sido
preenchida no momento da coleta da amostra. A seção de Resultados será preenchida pelo microscopista com a
seguinte informação:
- Caso a lâmina for negativa, o número de campos examinados será registrado (deve ser 200) e o número de
parasitos deverá ser 0 para todas as espécies.
- Caso a lâmina for positiva, o número de leucócitos contados e o número de formas assexuadas de parasitos
contados para cada espécie deverão ser registrados.
- O número de gametócitos para cada espécie também deverá ser registrado.
- Caso a lâmina não possa ser lida, o motivo deverá ser registrado (não encontrada, quebrada, má qualidade).
- O microscopista assinará e datará o formulário com a data da leitura e registrará seu código do estudo.
- O microscopista que realizar a primeira leitura registrará os resultados no formulário de primeira leitura de
lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A01) e o que realizar a segunda leitura registrará os resultados no
formulário de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A02).
- Os formulários resultado de primeira leitura e resultado de segunda leitura serão enviados diariamente ao
centro de registro de dados para serem inseridos nas bases de dados. Tais formulários serão então armazenados
pelos investigadores.
7 CÁLCULO DA DENSIDADE PARASITÁRIA E CONTROLE DE QUALIDADE INTERNA
1. Todas as lâminas serão lidas duas vezes independentemente e os resultados registrados em diferentes
formulários de resultados de leitura de lâmina (primeira e segunda leituras), que serão inseridos nas bases de
dados.
2. As lâminas que NÃO caírem nos seguintes critérios deverão ser lidas uma terceira vez:
- Ambas as lâminas positivas, tendo ambas as leituras > 400 parasitos por μL e a proporção de densidades de
ambas as leituras (maior contagem / menor contagem) < 2.
- Ambas as lâminas positivas e uma ou ambas tem contagem < 400 parasitos por μl e a
maior contagem é menos que um log 10 superior à menor contagem.
- Ambas as lâminas negativas.
3. Um programa de computador gerará uma lista com as lâminas que devem ser lidas uma terceira vez, baseado
na proporção das densidades das duas primeiras leituras. No centro de dados o programa produzirá impresso que
será a ficha de Resultado de terceira leitura de lâmina e incluirá o número de identificação de amostra, o número
de identificação permanente, a posição na caixa e os códigos dos microscopistas que realizaram as primeira e
segunda leituras.
4. No laboratório a lâmina será retirada da posição na caixa correspondente e será lida a terceira vez por um
microscopista.
5. O microscopista que realiza a terceira leitura registrará os resultados no impresso, que será então devolvido ao
centro de dados e inserido nas bases de dados.
6. O resultado definitivo (após a segunda leitura no caso de concordância ou após a terceira leitura caso não haja
concordância entre as duas primeiras) será calculado por um programa de computador e levará em conta os
seguintes critérios:
- Caso ambas as leituras sejam negativas, o resultado final será negativo.
- Caso as duas lâminas sejam positivas e haja concordância, o resultado final será a média geométrica das duas
leituras.
- Caso uma leitura seja positiva e a outra negativa e a terceira leitura seja positiva, o resultado final será a média
geométrica das duas densidades positivas. Caso a terceira leitura seja negativa, o resultado final será negativo.
- Caso as três leituras sejam positivas, o resultado final será a média geométrica das duas leituras com
densidades mais próximas.
- Todos os resultados de leituras de lâminas serão armazenados pelos investigadores.
8 ARMAZENAMENTO DAS LÂMINAS
1. As lâminas serão levadas a um(a) técnico(a) de laboratório designado(a). Este deverá conferir conjuntamente
com o investigador que as trouxe a presença das lâminas e o correto preenchimento dos formulários
correspondentes.
65
2. No caso de a lâmina não haver sido montada com o Entelan® após a coloração, tal procedimento deverá ser
realizado, após a leitura do segundo microscopista para que a lâmina seja armazenada.
3. Em seguida as lâminas deverão ser armazenadas nas caixas apropriadas, sendo o local de cada lâmina
registrado nos formulários de Resultado de primeira leitura de lâmina e Resultado de segunda leitura de lâmina
(versão atual de POP_MAL_LB_001_A01 e POP_MAL_LB_001_A02).
4. As caixas serão numeradas à medida que forem preenchidas. As datas das lâminas que ocuparem a primeira e
a última posição em cada caixa deverão estar escritas no exterior da caixa.
5. A partir do registro da posição das lâminas nas caixas, o microscopista retirará as lâminas à medida que
realizar as leituras de densidade parasitária.
6. O segundo microscopista deverá atentar para o número da caixa e a posição da lâmina detalhados na ficha de
Resultado de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A02) para recolocar a lâmina na
posição correta após a leitura.
7. Caso uma terceira leitura seja necessária, a lâmina será retirada da caixa e colocada novamente na mesma
posição quando a terceira leitura for encerrada.
8. As duplicatas das lâminas serão mantidas em uma caixa de lâminas distinta e armazenadas no laboratório,
sendo usadas apenas no caso de perda ou quebra da primeira lâmina. As datas das lâminas que ocuparem a
primeira e a última posição em cada caixa deverão estar escritas no exterior da caixa.
9. As caixas de armazenamento devem ser mantidas num local trancado no laboratório, sob condições
apropriadas de temperatura e umidade e protegidas de luz direta.
9. BIOSSEGURANÇA
Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1).
10 REFERÊNCIAS
1. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de microbiologia. Brasília:
Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.
2. WHO manual for malaria diagnostic in developing countries.
3. Diagnoses and management of severe falciparum malaria. WHO/CDS/CPE/SMT/2000.4
4. Diagnostic procedures for blood specimens. Diagnostic for Parasitic Diseases, CDC, Atlanta.
5. Manual de diagnóstico laboratorial da malária. Brasília: Secretaria de Vigilância em Saúde/Ministério da
Saúde; 2005
66
8.4.2 Pop para extração de DNA de Plasmodium spp. a partir de sangue total
Código POP POP_MAL_LB_002_v01D_PT
Título Procedimento para extração de DNA de Plasmodium spp. a partir de
sangue total
Idioma da versão original PORTUGUÊS
Elaborado por:
Gisely Cardoso de Melo
Revisado por:
Aprovado por:
Data de aplicação:
05 de julho de 2010
Data da próxima revisão:
Emenda Razão da emenda
.
ObjETIVOS
Descrever o procedimento da extração de DNA de Plasmodium spp. a partir de sangue total.
Definições
Não se aplica
ApLICÁVEL A
Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa.
RESPONSABILIDADES
Pessoal encarregado da coleta das amostras da pesquisa.
Equipe do laboratório de biologia molecular.
POP'S RELACIONADOS
Seguimento dos participantes no estudo “Epidemiologia da Malária no Município do Careiro,
Amazonas” (versão atual do POP_MAL_TC_002).
Caracterização da Malária Grave por Plasmodium vivax na Fundação de Medicina Tropical
Dr. Heitor Vieira Dourado, Brasil (versão atual do POP_MAL_HO_001).
Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de plasmódio (versão
atual do POP_MAL_LB_002).
ProcedIMENTOS
6.1.2 Materiais
1. Pipetas automáticas de 10 µL, 100 µL e 1000 µL
2. Ponteiras com filtro para pipetas automáticas
3. Tubos para 1,5 e 2,0 mL
6.1.3 Equipamentos
1. Centrífuga
2. Vórtex
Código: POP_MAL_LB_002_v01D_PT
Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária
67
3. Banho Maria
6.1.4 Reagentes
Reagente Armazenamento
1. Tampão Lise dos tecidos (Tampão ATL) Temperatura ambiente
2. Proteinase K Temperatura ambiente
3. Tampão de Lise (Tampão AL) Temperatura ambiente
4. Etanol 95% PA Temperatura ambiente
5. Tampão de Lavagem 1 (Tampão AW1) Temperatura ambiente
6. Tampão de Lavagem 2 (Tampão AW2) Temperatura ambiente
7. Tampão de Eluição (Tampão AE) Temperatura ambiente
6.2 Obtenção de sangue total
6.2.1 Por punção endovenosa
1. Obter 5 mL de sangue venoso em tubo de EDTA identificado.
2. Centrifugar a 14000 rpm por 10 min.
3. Desprezar o soro e colocar a papa de hemácias em criotubo identificado.
4. Armazenar os criotubos a – 20ºC em caixa de plástico ou papelão identificada e numerada.
5. No laboratório de biologia molecular, os criotubos serão armazenados seguindo a mesma
ordem que
as lâminas.
6.3 Extração do DNA.
Para a extração do DNA a partir de sangue total será usado o Protocolo de Extração do
QIAMP® DNA Mini Kit da Qiagen.
6.3.1 Procedimento para extração do DNA a partir de tubo
1. Pipetar 20 µL de Proteinase K (2) num tubo eppendorf de 1,5 mL.
2. Adicionar 200 µL de amostra ao tubo. Se não houver 200 µL de amostra, adicionar o
volume apropriado de PBS.
3. Adicionar 200 µL de Tampão AL (3) a amostra. Vortexar por 15 segundos.
4. Incubar por 56°C por 10 minutos.
5. Adicionar 200 µL de Etanol absoluto (96 a 100%) e agitar no vórtex imediantamente.
Remover as bolhas por centrifugação.
6. Cuidadosamente transferir o conteúdo do tubo para o tubo filtro. Tampar e centrifugar a
8000 rpm por 1 minuto. Descartar o filtrado com o tubo. Colocar o tubo filtro em um novo
tubo coletor.
7. Cuidadosamente adicionar 500 µL de tampão AW1 e centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto.
Descartar o filtrado com o tubo. Colocar em um novo tubo coletor.
8. Cuidadosamente adicionar 500 µL de tampão AW2 e centrifugar a 14000 rpm por 3
minutos.
9. Descartar o tubo coletor com o filtrado. Colocar o tubo filtro em novo tubo coletor e
centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto.
10. Colocar o tubo filtro em um tubo eppendorf de 1,5 mL novo. Descartar o filtrado e o tubo
coletor. Adicionar cuidadosamente 150 µL de tampão AE ou água destilada e incubar à
temperatura ambiente por 1 minuto. Centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto.
68
11. Armazenar por -20°C.
BIOSSEGURANÇA
Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1).
7 REFERÊNCIAS
1. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de
microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.
69
8.4.3 Pop para realização de PCR em tempo real para detecção de plasmódio
Código POP POP_MAL_LB_003_v02D_PT
Título Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de
plasmódio.
Idioma da versão original PORTUGUÊS
Elaborado por:
Gisely Cardoso de Melo
Revisado por:
Aprovado por:
Data de aplicação:
19 de fevereiro de 2009
Data da próxima revisão:
Emenda Razão da emenda
V02 Revisão dos procedimentos de PCR em tempo real
.
ObjETIVOS
Descrever o procedimento de realização de PCR em tempo real para detecção de plasmódio.
Definições
PCR: a reação em cadeia da polimerase é definida como uma técnica molecular que permite a
amplificação de pequenas quantidades de um DNA específico a partir de um molde do DNA,
usando uma reação enzimática simples, sem um organismo vivo. O limiar de detecção da
técnica é muito superior ao da gota espessa (técnica padrão utilizada no diagnóstico rotineiro
da malária): cerca de 0,004 parasitos/<L.
PCR Tempo Real (PCR TR): Variação da técnica de PCR para detecção de sinal
fluorescente permitindo a quantificação de ácidos nucléicos em tempo real, assim como a
detecção qualitativa de seqüências de ácidos nucléicos utilizando análises de curvas de
dissociação ou por meio de sondas marcadas. Não requer tratamento pós-PCR para
visualização do resultado.
Iniciador (primer): uma pequena seqüência de DNA ou RNA a partir da qual pode começar
a replicação do DNA.
ApLICÁVEL A
Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa clínica.
RESPONSABILIDADES
Equipe do laboratório de biologia molecular envolvida na realização da PCR em tempo real.
POP'S RELACIONADOS
Seguimento dos participantes no estudo “Epidemiologia da Malária no Município do Careiro,
Amazonas” (versão atual do POP_MAL_TC_002).
Caracterização da Malária Grave por Plasmodium vivax na Fundação de Medicina Tropical
Dr. Heitor Vieira Dourado, Brasil (versão atual do POP_MAL_HO_001).
Código:POP_MAL_LB_003_v02D_PT
Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária
S
70
Procedimento para extração de DNA de Plasmodium spp. a partir de mosquitos inteiros ou
cabeça + tórax (versão atual de POP_MAL_LB_004).
ProcedIMENTOS
Recursos necessários
6.1.2 Materiais
1. Pipetas automáticas de 10 µL, 100 µL e 1000 µL
2. Ponteiras com filtro para pipetas automáticas
3. Tubos de 1,5 e 2,0 mL
4. Microplacas de 0,1mL, com 96 poços, para sistema de PCR em Tempo Real
5. Filme óptico para vedar as microplacas
6.1.3 Equipamentos
1. Vórtex
2. Sistema de PCR em Tempo Real 7500 Fast Applied Biosystems
6.1.4 Reagentes
Reagente Armazenamento
Taqman Universal PCR Master Mix -20°C
Sondas (Tamra Taqman® Probe) -20°C
Iniciadores (primers) da reação -20°C
Água MiliQ Temperatura ambiente
Iniciadores:
Plasmodium vivax
VIV-F 5’ACGCTTCTAGCTTAATCCACATAACT
VIV-R 5’ATTTACTCAAAGTAACAAGGACTTCCAAGC
Plasmodium falciparum
FAL-F 5’CTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAA
FAL-R 5’TATTCCATGCTGTAGTATTCAAACACAA
Sondas
FAL probe (FAM) 5_-TGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTCA 3' TAMRA
VIV probe (VIC) 5_-TTCGTATCGACTTTGTGCGCATTTTGC 3' TAMRA
6.2 PCR em Tempo Real
Para a detecção dos principais parasitos que infectam humanos, foi padronizada uma reação
de PCR em Tempo Real baseada no gene que codifica a menor subunidade do rRNA (1). Os
iniciadores (primers) usados para amplificação do P. vivax e P. falciparum flanqueiam regiões
espécie-específicas de 120pb e 396pb respectivamente.
6.2.1 Reação de PCR em Tempo Real
P. vivax
Extrato de DNA (50 a 100ng) 2µL
Taqman Master Mix 10 µL
VIV Probe 200nM
Iniciador F 300 nM
Iniciador R 300 nM
H2O para PCR 1µL
P. falciparum
Extrato de DNA (50 a 100ng) 2µL
Taqman Master Mix 2X 10 µL
71
FAL Probe 200 nM
Iniciador F 300 nM
Iniciador R 300 nM
H2O para PCR 1µL
Condições de amplificação:
1: 50ºC/2 minutos
2: 95ºC/10 minutos
3: 95ºC/15 segundos- total de 45 ciclos
4. 60 ºC/ 1 minuto
Modulo de corrida: Standard 7500
6.2.2 Em cada reação de PCR, é realizado um controle negativo (água miliQ) e um controle
positivo contendo DNA de Plasmodium sp (P. falciparum - MR4, P. vivax – amostras de
cultivo in vitro e in vivo, respectivamente).
6.2.3 As amostras são testadas em duplicatas em cada experimento.
CPV CPV CPF CPF CN CN
CPV: Controle positivo de Plasmodium vivax
CPF: Controle positivo de Plasmodium falciparum
CN: Controle negativo
6.2.4 As análises são realizadas pelo software distribuído pelo fabricante – Applied
Biosystems “7500 Fast System SDS Software”, e utiliza-se como ponto de corte Cts abaixo
de 40 ciclos.
6.2.5 Os valores do CT são comparadas às dos controles para verificar a especificidade da
reação e do produto gerado.
6.3 Restrições e limitações do procedimento
Como se faz a amplificação de DNA, a técnica não permite distinguir as diferentes formas
biológicas do parasito (trofozoíto, esquizonte, merozoíto ou gametócito). Existe a
possibilidade de contaminação da reação no momento da extração do DNA e no momento do
preparo da reação do PCR, dada a sensibilidade de amplificação da técnica.
6.4 Biossegurança
Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (2).
6.5 Registro dos resultados
O resultado da PCR será preenchido pelo responsável do procedimento no questionário
Resultado da PCR (POP_MAL_LB_002_A01_v01_PT), indicando resultado por espécie, o
1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 11
10 A
B C
D E
F G H
72
motivo em caso de não ter realizado o exame, a ordem de armazenamento, o código e a
assinatura do membro da equipe do projeto e a data do resultado.
7 REFERÊNCIAS
1. De Monbrison F, Angei C, Staal A, Kaiser K, Picot S. Simultaneous identification of the
four human Plasmodium species and quantification of Plasmodium DNA load in human blood
by real-time polymerase chain reaction. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg 2003;97:387–390.
2. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de
microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; 2001.
73
8.4.4 Pop para extração de RNA utilizando Trizol®
Código POP POP_MAL_LB_004_v02D_PT
Título Procedimento para extração de RNA utilizando Trizol®
Idioma da versão original PORTUGUÊS
Elaborado por:
Gisely Cardoso de Melo
Revisado por:
Gisely Cardoso de Melo
Aprovado por:
Data de aplicação:
30 de setembro de 2011
Data da próxima
revisão:
Emenda Razão da emenda
1 OBJETIVOS
Descrever o procedimento da extração de RNA utilizando o trizol®.
2 Definições
RT-PCR: é uma reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase. Não
utiliza o DNA de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A partir do RNA, a enzima
transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar (chamado agora de cDNA). Ao
cDNA aplica-se a técnica de PCR.
3 ApLICÁVEL A
Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa.
4 RESPONSABILIDADES
Pessoal encarregado da coleta das amostras da pesquisa. Equipe do laboratório de biologia
molecular.
5 POP'S RELACIONADOS
Procedimento para realização de RT-PCR (versão atual do POP_MAL_LB_005).
6 ProcedIMENTOS
6.1 Recursos necessários
6.1.2 Materiais
1. Tubos cônicos de 15 mL RNAse free
2. Tubos de 1,5mL RNAse free
3. Saponina
Código: POP_MAL_LB_004_v02D_PT
Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária
S
74
4. RPMI
5. PBS 1x
6. Pipetas automáticas de 10 µL , 100 µL, 200 µL e 1000 µL.
7. Ponteiras com filtro para pipetas automáticas RNAse free
8. Clorofórmio
9. Isopropanol
10. Etanol
11. H2ODEPC
12. Formamida
13. Dodecil sulfato de sódio (SDS)
14. H2O RNAse free
15. Tris-borate-EDTA (TBE)
16. Agarose
17. Loading Buffer 2X
6.1.3 Equipamentos
1. Centrífuga refrigerada para tubos cônicos
2. Centrífuga refrigerada de eppendorf
3. Cuba de Eletroforese
4. Banho maria
5. Termobloco
6.2 Obtenção do RNA
6.2.1 Protocolo de tratamento do sangue com saponina
1. Coletar 5 mL de sangue em tubos a vácuo estéreis;
2. Centrifugar o sangue a 3000 rpm por 5 minutos para separar o plasma;
3. Retirar o plasma em tubos de 1,5 mL e guardar em freezer -80°C;
4. Separar a papa de hemácias remanescentes em dois tubos cônicos contendo 5 mL de RPMI
1640 e µL de saponina 1,5%.
5. Agitar o tubo e aguardar por 5 minutos;
6. Centrifugar a 3.000 rpm por 12 minutos a 20°C. Se o pellet permanecer escuro, repetir a
etapa 4,5,6;
7. Retirar o sobrenadante e transferir o pellet para um tubo de 1,5 mL RNAse free contendo
1mL de RPMI e homogeneizar bem;
8. Centrifugar a 4°C por 5 minutos a 13.000 rpm;
9. Repetir as etapas 7 e 8;
10. Retirar o sobrenadante e adicionar trizol® e armazenar a -80°C até a extração do RNA.
6.2.2 Protocolo de extração
1. Adicionar 200µL de clorofórmo e homogeneizar vigorosamente por 15s e incubar por 5-15
min a temperatura ambiente;
2. Centrifugar a 12.000g por 15 min a 4°C;
3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo com 500µL de isopropanol e incubar por 10
min a temperatura ambiente.
4. Centrifugar a 12.000g por 10 min a 4°C
75
5. Descartar o sobrenadante e lavar com 1mL de etanol 75 %
6. Centrifugar a 7500g por 5 min 4°C;
7. Ressuspender o pellet em um volume desejado de H2ODEPC ou Formamida e deixar em um
termobloco a 65C por 3-5 min posteriormente agitar em um vórtex por 2 min e dar un spin
de varios segundos.
8. Quantificar o RNA no Nanodrop utilizando 1ul da amostra
6.2.3 Análise da qualidade do RNA em gel de agarose
1. Deixar todo o material (Cuba, base e pentes) em SDS 1% por 1h, lavar com H2O RNAse
free (alternativamente também pode ser usada H2O MilliQ esteril já que se necessita de um
grande volume) e secar com etanol 70%.
2. Preparar um gel de agarose 1% em TBE 0,5 X (todas as solucões e reagentes devem ser
RNase free).
3. Colocar en cada novo tubo aproximadamente 10% do volume final da amostra diluida 1:1
com Loading Buffer 2X especifico para RNA (Fermentas). A amostra diluida deve ser
colocada a 70 C por 10 min, esfriada rapidamente em gelo posteriormente, dar um spin,
aplicar todo o volume no gel.
6.3 Biossegurança
Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1)
7 REFERÊNCIAS
1. Chomczynski, P. (1993) A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and
proteins from cell and tissue samples. BioTechniques 15, 532-537
2. Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium
Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159
3. Hummon, A. B., Lim S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. (2007) Isolation and
solubilization of proteins after TRIzol® extraction of RNA and DNA from patient material
following prolonged storage. BioTechniques 42, 467-472
76
8.4.5 Pop para RT-PCR para expressão gênica de pvcrt-o e pvmdr-1.
Código POP POP_MAL_LB_005_v01D_PT
Título Procedimento para RT-PCR para expressão gênica de pvcrt-o e pvmdr-1.
Idioma da
versão original PORTUGUÊS
Elaborado por:
Gisely Cardoso de Melo
Revisado por:
Gisely Cardoso de Melo
Aprovado por:
Data de aplicação:
30 de setembro de 2011
Data da próxima revisão:
Emenda Razão da emenda
1 OBJETIVOS Descrever o procedimento da extração de RNA utilizando o trizol®.
2 Definições
RT-PCR: é uma reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase. Não utiliza o DNA
de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa
sintetiza uma cadeia de DNA complementar (chamado agora de cDNA). Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR.
PCR Tempo Real (PCR TR): Variação da técnica de PCR para detecção de sinal fluorescente permitindo a
quantificação de ácidos nucléicos em tempo real, assim como a detecção qualitativa de seqüências de ácidos
nucléicos utilizando análises de curvas de dissociação ou por meio de sondas marcadas. Não requer tratamento
pós-PCR para visualização do resultado.
3 ApLICÁVEL A Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa.
4 RESPONSABILIDADES Pessoal encarregado da coleta das amostras da pesquisa.
Equipe do laboratório de biologia molecular.
5 POP'S RELACIONADOS Procedimento para extração de RNA utilizando o trizol® (versão atual do POP_MAL_LB_004).
6 ProcedIMENTOS
6.1 Recursos necessários
6.1.1 Amostra obtida por extração de RNA seguindo POP_MAL_LB_004.
6.1.2 Materiais
1. Pipetas automáticas de 10 µL, 100 µL e 1000 µL
2. Ponteiras com filtro para pipetas automáticas RNAse free
3. Tubos de 0,2 mL
4. Microplacas de 0,1mL, com 96 poços, para sistema de PCR em Tempo Real
5. Filme óptico para vedar as microplacas
Código: POP MAL_LB_005_v01D_PT
Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária
S
77
6.1.3 Equipamentos
1. Centrífuga refrigerada de eppendorf
2. Sistema de PCR em Tempo Real 7500 Fast Applied Biosystems
3. Banho Maria
6.1.4 Reagentes
Reagente Armazenamento
SuperScript™ III RT (200 U/µl) -20°C
5X First-Strand Buffer -20°C
0.1 M DTT -20°C
Random Primers -20°C
10 mM dNTP Mix -20°C
RNAseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor (40 U/µl) -20°C
10X PCR Buffer -20°C
50 mM MgCl2 -20°C
Taq DNA polymerase (5 U/µl) -20°C
DNase I, Amp Grade -20°C
10X DNase I Reaction Buffer -20°C
25 mM EDTA (pH 8.0) -20°C
Iniciadores:
pvcrt-o
F-pvcrt-oRT 5'-ATGTCCAAGATGTGCGACGAT-3'
R-pvcrt-oRT 5'-CTGGTCCCTGTATGCAACTGAC-3'
Pvmdr-1
F-pvmdr1RT 5'-AAGGATCAAAGGCAACCCA-3'
R-pvmdr1RT5'-TCAGGTTGTTACTGCTGTTGCTATT-3'
Tubulina (controle interno)
F-pvtubulinRT 5' CCAAGAATATGATGTGTGCAAGTG 3'
R-pvtubulinRT 5' GGCGCAGGCGGTTAGG 3'
6.2 Reação de RT-PCR
6.2.1 Tratamento do RNA total com DNAse
RNA ? µL (1µg)
Buffer 10X 1 µL
DNase 1 µL
H2O RNAse free para 10 µl
Incubar 15 minutos a temperatura ambiente
Adicionar 2 µL de EDTA 25 mM.
Incubar por 10 minutos a 65 C.
Após esse procedimento, as amostras serão transferidas para o gelo e imediatamente
submetidas à reação de transcrição reversa.
6.2.2 Síntese de cDNA
1. Adicionar os componentes em um tubo de PCR RNAse free, sendo o volume final de 13
µL:
1.1 RNA tratado (~ 500 ng) 10 µL
78
1.2 Random Primers (300 ng/µl) 1 µL
1.3 10nM de mix de dNTPs 1 µL
1.4 H2O 1 µL
Incubar a 65 C por 5 min e depois no gelo por 1 minuto.
2. Preparo do mix:
2.1. Tampão 5X...................................................4 µL
2.2 DTT 0.1 M.....................................................1 µL
2.3 Rnase OUT...................................................1 µL
2.4 SuperScript™ III RT...................................... 1 µL
25 C por 5 minutos
50 C por 45 minutos
70 C por 15 minutos
4 C
6.2.3 Reação de PCR
10X PCR Buffer 2-4µL
50 mM MgCl2 10 µL
10 mM dNTP Mix) 0,2 µL
Sense primer (10 µM) 0,2 µL
Antisense primer (10 µM) 0,2 µL
Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0.4 µL
cDNA (from first-strand reaction) 2 µL
Água para PCR para 50 µL
Condições de amplificação:
1: 94ºC/2 minutos
2. 15-40 ciclos
6.2.4 Protocolo de PCR tempo real
Extrato de cDNA 2-4µL
PowerSYBR Green PCR Master Mix 10 µL
Iniciador F (10 uM) 0,2 µL
Iniciador R (10 uM) 0,2 µL
H2O para PCR para 20 µL
Condições de amplificação:
1: 95ºC/10 minutos
2: 95ºC/15 segundos- total de 40 ciclos
3. 60 ºC/ 1 minuto
Modulo de corrida: Standard 7500
6.3 Biossegurança
Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1)
7 REFERÊNCIAS
1. Kotewicz, M.L., D'Alessio, J.M., Driftmier, K.M., Blodgett, K.P., and Gerard, G.F. (1985) Gene 35, 249.
79
2. Gerard, G.F., D'Alessio, J.M., Kotewicz, M.L., and Noon, M.C. (1986) DNA 5, 271.
3. Houts, G.E., Miyagi, M., Ellis, C., Beard, A., and Beard, J.W. (1979) J. Virol.29, 517.