FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DOUTOR HEITOR VIERA DOURADO

PROJETO PAIC 2015/2016

TOTEN 05

MAL MALÁRIA

MAL 01 ANEMIA E MALÁRIA NA GESTAÇÃO NA CIDADE DE MANAUS COMO FATORES

PROGNÓSTICOS PARA PREMATURIDADE: UM ESTUDO DE COORTE RETROSPECTIVO

MAL 02 AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DE GENES DE RESISTÊNCIA À CLOROQUINA

EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX

MAL 03 CARACTERIZAÇÃO DA MEDULA ÓSSEA HUMANA EM PACIENTES COM MALÁRIA POR PLASMODIUM VIVAX

MAL 04

COMORBIDADES E FATORES COMPORTAMENTAIS E NUTRICIONAIS ASSOCIADOS AO PARTO PREMATURO E AO BAIXO PESO AO NASCER EM GESTANTES COM

MALÁRIA EM MANAUS

MAL 05 ESTUDO DOS POLIMORFISMOS NOS GENES DOS RECEPTORES TLR-1, TLR-5 E TLR-6 EM PACIENTES COM MALÁRIA SINTOMÁTICA POR PLASMODIUM VIVAX

MAL 06 FREQUÊNCIA ALÉLICA DOS POLIMORFISMOS NOS GENES DO TLR-4 (ASP299GLY E

THR399ILE) E CD14 (-159) EM PACIENTES COM MALÁRIA-VIVAX.

MAL 07 INFLUÊNCIA DO ANTIMALÁRICO CLOROQUINA NA CITOADESÃO DE PLASMODIUM VIVAX ÀS CÉLULAS ENDOTELIAIS

MAL 08 INVESTIGAÇÃO DE POLIMORFISMOS NO GENE MBL EM PACIENTES COM MALÁRIA

SINTOMÁTICA POR PLASMODIUM VIVAX

MAL 09 MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE PLAQUETAS PARA AVALIAÇÃO DE SUA CAPACIDADE ADESIVA AO ENDOTÉLIO: UMA POSSÍVEL EXPLICAÇÃO PARA

TROMBOCITOPENIA NA MALÁRIA VIVAX

ANEMIA E MALÁRIA NA GESTAÇÃO NA CIDADE DE MANAUS COMO FATORES PROGNÓSTICOS PARA PREMATURIDADE: UM ESTUDO DE

COORTE RETROSPECTIVO

Thayane Karine Verçosa da Silva1 , Maria de Nazaré dos Santos Simão1, Flor Martínez-Espinosa, MD, PhD2,3, Camila Bôtto-Menezes, MD, MSc1,2

1. Universidade do Estado do Amazonas (UEA); 2. Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD); 3. Centro de Pesquisas Leônidas e Maria Deane/FIOCRUZ.

INTRODUÇÃO

A anemia na gravidez está associada com consequências adversas tanto para a mãe quanto para o feto. As mulheres grávidas são particularmente vulneráveis à malária e o principal efeito adverso da malária na gravidez na mãe é a anemia.

OBJETIVOS

Descrever o padrão hematológico de gestantes atendidas na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado no período de dezembro de 2005 a março de 2008 e avaliar a anemia como possível fator associado ao parto prematuro.

MATERIAIS E MÉTODOS

Estudo de Coorte retrospectivo de gestantes com lâmina positiva para Plasmodium sp na FMT-HDV no período de dezembro de 2005 a março de 2008. Amostras de sangue foram coletadas para a detecção ativa e passiva de infecção por microscopia, além de teste de anemia por método automatizado.

RESULTADOS

Foram incluídas na análise 605 medidas de hemoglobina de gestantes com malária e 741 de gestantes sem malária. O valor médio da hemoglobina foi de 10,8 g/dL (DP±1,5 g/dL) nas gestantes com malária, e de 11,6 g/dL (DP±1,2 g/dL) nas gestantes sem malária (p<0,001). Para cada unidade de incremento na hemoglobina, houve uma redução de 27% no risco de parto prematuro nas gestantes com malária (OR, 0,73 [IC 95%, 0,62-0,87]; p = 0,000). A anemia não foi associada com aumento no risco de parto prematuro nas gestantes com malária (OR, 1,57 [IC 95%, 0,95-2,59]; p = 0,076) e nem nas gestantes sem malária (OR, 0,73 [IC 95%, 0,48-1,10]; p = 0,133).

CONCLUSÃO

Os valores da concentração de hemoglobina são menores nas gestantes com malária, refletindo na frequência aumentada de anemia. O risco de parto prematuro diminuiu com o aumento da hemoglobina neste grupo de gestantes.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Kalaivani K. Prevalence & consequences of anaemia in pregnancy. Indian J Med Res. 2009 Nov;130 (5): 627-33. 2.Martínez-Espinosa FE. Malária e gravidez na região Amazônica: susceptibilidade aumentada à infecção por P. falciparum em gestantes de Coari, Amazonas em 2001 e 2002 [tese]. Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz - IOC/FIOCRUZ, 2003. 3. Luxemburger C et al. Effects of malaria during pregnancy on infant mortality in an area of low malaria transmission. Am J Epidemiol 2001; 154 (5): 459-65 Email: thayanevercosa@gmail.com

Tabela 1: Características dos valores hematimétricos de gestantes com e sem malária, FMT-HVD, Manaus, 2005-2008.

Características

Com malária (N=605)

Sem malária (N=741)

n (%) ou Média ± DP n (%) ou Média ± DP

Valor da Hb (g/dL) 10,8 ± 1,5 11,6 ± 1,2

Presença de anemia 331 (54,8) 202 (27,3)

Anemia no 1º trimestre 21 (26,9) 52 (31,3)

2º trimestre 134 (60,9) 69 (21,2)

3º trimestre 129 (58,3) 67 (31,3)

Gráfico 1: Média do valor da hemoglobina por trimestre gestacional nas gestantes com e sem malária, FMT-HVD, Manaus, 2005-2008.

11,8

10,5 10,7 11,5 11,8 11,5

Tabela 2: Associação do incremento da hemoglobina e da anemia com a prematuridade em gestantes com e sem malária, FMT-HVD, Manaus, 2005-2008.

Características

Com malária Sem malária

OR (IC 95%) P valor OR (IC 95%) P valor

Valor da hemoglobina

Redução da Hb 1 … … 1 … …

Incremento da Hb 0,73 (0,62-0,87) 0,000 1,13 (0,97-1,32) 0,114

Anemia

Não (Hb ≥ 11 mg/dL) 1 … … 1 … …

Sim (Hb < 11 mg/dL) 1,57 (0,95-2,59) 0,076 0,72 (0,48-1,10) 0,133

AVALIAÇÃO DO NÚMERO DE CÓPIAS DE GENES DE RESISTÊNCIA À CLOROQUINA EM PACIENTES COM MALÁRIA VIVAX

Tayna R. L. Ribeiro1; Siuhelem R. da Silva2,3; Gabriel L. Costa4; Anne C.G. Almeida2,3; Kelry

M. O. Dinelly2; Marcela S. Sousa2; Marly M. Melo2; Thais N. Souza4; Marcus V.G. Lacerda2,5; Wuelton M. Monteiro2,3; Gisely C. Melo2,3

1Universidade Paulista - UNIP; 2Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD);

3Universidade do Estado do Amazonas (UEA); 4Centro de Pesquisa René Rachou - FIOCRUZ MINAS ; 5Instituto Leônidas e Maria Deane - FIOCRUZ AMAZÔNIA

INTRODUÇÃO A malária causada por Plasmodium vivax é amplamente distribuída em todo o mundo1. O tratamento baseia-se em antimaláricos, especialmente, a Cloroquina2. Contudo, parasitos tem se tornado resistentes a estes medicamentos em diversas regiões do mundo, o que contribui para um aumento na morbidade e mortalidade da doença3. Alguns estudos sugerem que a amplifificação do gene pvmdr-1 está relacionada com suscetibilidade de P. vivax à múltiplas drogas4. A variação do número de cópias dos genes pvcrt-o e pvmdr-1 poderia modular o fenótipo de resistência.

OBJETIVO O objetivo do estudo foi determinar o número de cópias dos genes pvcrt-o e pvmdr-1 em amostras resistentes e sensíveis à cloroquina em pacientes com malária vivax, atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.

MATERIAIS E MÉTODOS Consistiu num estudo do tipo caso-controle. Na admissão (D0) e dia de resistência (DR) realizou-se gota espessa, hemograma e foi coletado sangue para detecção molecular e para armazenamento de DNA, para avaliação de número de cópias.

RESULTADOS

CONCLUSÃO As amostras não obtiveram diferença estatisticamente significativa no número de cópias dos genes estudados. Será necessário um número maior de amostras para verificar se há associação entre número de cópias e resistência à cloroquina in vivo.

AGRADECIMENTOS

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. http://www.who.int/malaria/en/. 2.http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/guia_pratico_malaria 3.White N. Antimalarial drug resistance and mortality in falciparum malaria. Trop Med Int Health. 1999 Jul;4(7):469-70. 4. R. N. Price. Menzies School of Health Research, PO Box 41096, Casuarina, Darwin, NT 0811 Australia.

Tabela 1. Características dos pacientes do estudo

Sistema Taqman. Controle endógeno:

β-tubulina

Resistentes Sensíveis

Sexo n(%)

Masculino 29 (74,3) 5 (83,3)

Feminino 8 (25,6) 1 (16,7)

Idade (média) 20,5 35,0

Densidade parasitária (média) 8470,1 mm³ 2680,4 mm³

Hemoglobina (média) 12,4g/dL 13,5g/dL

Figura 1. Nº de cópias de pvcrt-o de amostras resistentes e sensíveis

Figura 2. Nº de cópias de pvmdr-1 de amostras resistentes e sensíveis

Média=0,6

CARACTERIZAÇÃO DA MEDULA ÓSSEA HUMANA EM PACIENTES COM MALÁRIA POR Plasmodium vivax

Erick F. G. Figueiredo1,2; Marcelo A. M. Brito2,3; Anne C. G. Almeida2,3; Bàrbara Baro2; Katrien Deroost2; Izabella P. Safe2,3; Rodrigo S. Leitão4; Cármen F. Becerra5,6; Wuelton M. Monteiro2,3; Hernando A. Del

Portillo5,6,7; Marcus V. G. Lacerda2,3,8

1Universidade Federal do Amazonas (UFAM); 2Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD); 3 Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical - Universidade do Estado do Amazonas (PPGMT-UEA); 4Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM); 5Institute for Global Health (ISGlobal). Hospital Clínic - Universitat de Barcelona; 6Institut d’Investigació Germans Trias i Pujol (IGTP);

7Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA); 8Fundação Oswaldo Cruz - Instituto Leônidas e Maria Deane (FIOCRUZ-Amazônia).

INTRODUÇÃO O Plasmodium vivax (P. vivax) pode invadir reticulócitos e precursores hematopoiéticos na medula óssea (MO) humana[1], além de causar dano na proliferação e maturação destas células [2,3], possivelmente contribuindo com a patogênese da anemia, complicação mais frequente da malária vivax [4]. Sabe-se também que o Plasmodium falciparum utiliza a MO como nicho de maturação de gametócitos, tornando-a um importante órgão no desenvolvimento de seu ciclo biológico no hospedeiro humano [5], onde, até o momento, não existem evidências que o mesmo ocorra com o P. vivax.

OBJETIVOS Verificar se há diferença na parasitemia da MO e do sangue periférico (SP), se há acúmulo de alguma forma parasitária de P. vivax na MO humana e otimizar o método de purificação da linhagem eritropoiética.

MATERIAIS E MÉTODOS Realizou-se um estudo observacional prospectivo, onde foram incluídos 15 indivíduos de ambos os sexos, maiores de 12 anos de idade. Foram coletados 4 ml de MO e 4 ml de SP no dia do diagnóstico de malária, antes do início do tratamento. Foi determinada parasitemia por microscopia óptica em 10.000 hemácias, assim como a confirmação de monoinfecção por qPCR e purificação da linhagem eritróide com uso de microbeads magnéticos.

RESULTADOS A parasitemia média na MO foi de 0.12% (IC95%: 0.03-0.21) e no SP de 0.16% (IC95%: 0.03-0.29). Sem diferença significativa de parasitemia entre os grupos (p=0.59). Não foi observado predomínio de forma parasitária na MO em relação ao SP. A monoinfecção por P. vivax foi confirmada em todas as amostras através da técnica de qPCR. Com a otimização do método de purificação da linhagem eritróide, foram alcançados valores superiores a 90% de pureza de células CD71+.

CONCLUSÃO Resultados não significativos entre MO e SP, podem ter sido observados devido a baixa parasitemia dos pacientes por microscopia óptica. Com isso, será necessária a inclusão de mais indivíduos no estudo para melhor compreensão do papel da medula óssea no desenvolvimento do parasito no hospedeiro humano e da patogênese da anemia relacionada à malária vivax.

AGRADECIMENTOS

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Ru, Y.X., et al., Invasion of erythroblasts by Pasmodium vivax: A new mechanism contributing to malarial anemia. Ultrastruct Pathol, 2009. 33(5): p. 23642. [2] Helleberg, M., et al., Bone marrow suppression and severe anaemia associated with persistent Plasmodium falciparum infection in African children with microscopically undetectable parasitaemia. Malar J, 2005. 4(1): p. 56. [3] Mohapatra, M.K. and A. Ghosh, Suboptimal erythropoietin Production in adult severe falciparum malaria. J Assoc Physicians India, 2011. 59: p. 3923. [4] Douglas, N.M., et al., The anaemia of Plasmodium vivax malaria. Malar J, 2012. 11: p. 135. [5] Abdulsalam, A.H., N. Sabeeh, and B.J. Bain, Immature Plasmodium falciparum gametocytes in bone marrow. Am J Hematol, 2010. 85(12): p. 943.

MO TOTAL MO PURIFICADA

Figura 01. Punção da medula óssea da crista ilíaca

Figura 02. Leitura da parasitemia em microscopia óptica

Figura 03. MO com precursores hematopoiéticos e uma célula parasitada com anel de P. vivax

Figura 04. MO purificada com precursores eritróides

Gráfico 03. Purificação com microbeads CD71

COMORBIDADES E FATORES COMPORTAMENTAIS E NUTRICIONAIS ASSOCIADOS AO PARTO PREMATURO E AO BAIXO PESO AO NASCER

EM GESTANTES COM MALÁRIA EM MANAUS

Maria de Nazaré dos Santos Simão1, Thayane Karine Verçosa Da Silva1, Flor Martínez-Espinosa, MD, PhD2,3, Camila Bôtto-Menezes, MD, MSc1,2

1. Universidade do Estado do Amazonas (UEA); 2. Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD); 3. Centro de Pesquisas Leônidas e Maria Deane/FIOCRUZ;

INTRODUÇÃO

Os fatores maternos relacionados à prematuridade e ao baixo peso ao nascer podem ser biológicos como a idade materna, comportamentais como os hábitos de vida, nutricionais como a desnutrição, infecções maternas como a malária e relacionados à presença de doença crônica como a hipertensão, entre outros.

OBJETIVOS

Descrever a presença de comorbidades e fatores comportamentais e nutricionais em gestantes com malária atendidas na FMT-HVD no período de dezembro de 2005 à março de 2008 e identificar possível associação com a prematuridade e o baixo peso ao nascer.

MATERIAIS E MÉTODOS

Desenho do estudo de coorte retrospectivo com gestantes com malária atendidas na FMT-HVD entre dezembro de 2005 à setembro de 2007. A avaliação de comorbidades foi avaliada pela presença de doença crônica de base referida pela paciente. A avaliação dos fatores comportamentais de risco foi realizada pela investigação do tabagismo, do uso de álcool e de drogas ilícitas durante a gestação e dos nutricionais pelo índice de massa corporal pela idade gestacional.

Tabela 1. Características das gestantes com malária, FMT-HVD, Manaus, 2005-2008.

AGRADECIMENTOS

À FAPEAM, FMT-HVD, DEP, professora Camila Bôtto, pesquisadora Flor Martínez pelo apoio na realização do estudo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Pan American Health Organization. Report on the situation of malaria in the Americas, 2008. ONU. Global strategy for women’s and children’s health. 2010.

RESULTADOS

As características das pacientes estão descritas na tabela 1. Sobre os desfechos, 16,4% dos recém-nascidos foram prematuros (70/427) e 8,6% (42/489) tiveram baixo peso ao nascer. O tabagismo foi associado com aumento no parto prematuro (OR 6,16 [IC 95% 1,94-19,63]; p = 0,002). Não houve associação estatisticamente significativa entre os fatores maternos e o baixo peso ao nascer.

Características n (%) ou X±DPa

Doença de base (n=572) Não 505 (88, 3)

Sim 67 (11,7)

Alcoolismo (n=565) Nunca 351 (62,1)

No passado 194 (34,3)

Atualmente 20 (3,5)

Tabagismo (n=561) Nunca 421 (75)

No passado 117 (20,9)

Atualmente 23 (4,1)

Drogas (n=564) Nunca 532 (94,3)

No passado 28 (5)

Atualmente 4 (0,7)

Classificação do IMC pela idade gestacional (n=373)

Baixo peso 100 (26,8)

Adequado 170 (45,6)

Sobrepeso 67 (18)

Obesidade 36 (9,6)

Fatores maternos Modelo univariado Modelo multivariado

OR (IC95%) pa OR (IC95%) pa

Idade < 20 1 … … 1 … …

≥ 20 0,45 (0,26-0,77) 0,003 0,39 (0,22-0,68) 0,001

Número de gestações Primípara 1 … … … … …

Multípara (≥2) 0,55 (0,32-0,94) 0,028 … … …

Tabagismo Nunca 1 … … 1 … …

No Passado 1,30 (0,70-2,43) 0,410 1,23 (0,65-2,34) 0,518

Atualmente 4,88 (1,57-15,18) 0,006 6,16 (1,94-19,63) 0,002

CONCLUSÃO

A presença de fatores maternos já descritos como associados a prematuridade e ao baixo peso ao nascer mostrou-se frequente nas gestantes que apresentaram malária durante a gestação. O tabagismo durante a gestação foi fator de risco para a prematuridade.

Email: mariiasimao@gmail.com

Tabela 2 . Fatores de risco para o parto prematuro em neonatos de gestantes com malária, FMT-HVD, Manaus, 2005-2008.

aMédia ± Desvio Padrão.

aTeste Chi-quadrado.

ESTUDO DOS POLIMORFISMOS NOS GENES DOS RECEPTORES TLR-1, TLR-5 E TLR-6 EM PACIENTES COM MALÁRIA SINTOMÁTICA POR

Plasmodium vivax Hiochelson Najibe dos Santos Ibiapina¹, Lilyane de Amorim Xabregas¹, Marcus Vinicius Guimarães de Lacerda¹, Adriana Malheiro Alle Marie², Allyson Guimarães da Costa¹,²

Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado¹, Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Estado do Amazonas²

INTRODUÇÃO

A malária é uma doença infecto-parasitária, febril e aguda, causada por protozoários do gênero Plasmodium (COX-SINGH et al., 2008). Na patogênese da doença ocorrem dois processos de esquizogonia (hepática e sanguínea). Durante a fase sanguínea, ocorre o reconhecimentos de toxinas e outras moléculas liberadas após o rompimento dos eritrócitos (SCHOFIELD; GRAU, 2005). Os Receptores Toll-like (TLRs) são o principal grupo de receptores na resposta imune inata e reconhecem esses componentes liberados após o processo de esquizogonia, gerando sinais de produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas (CAMPOS et al., 2001). Estudos com os SNPs (polimorfismo de nucleotídeos único) presentes no TLR-1, TLR-5 e TLR-6 têm sido associados com diversas doenças parasitárias.

OBJETIVOS

Estimar as frequências alélicas dos polimorfismos I602S (TLR-1), R392stopCodon (TLR-5) e S249P (TLR-6) em indivíduos infectados por Plasmodium vivax, relacionando os genótipos e alelos com a malária-vivax.

MATERIAL E MÉTODOS

Trata-se de um estudo descritivo transversal, com genotipagem de 117 amostras de pacientes infectados por P.vivax (casos) e 108 amostras de indivíduos não infectados (controles).

RESULTADOS

Os polimorfismos encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os polimorfismos I602S (χ2=0.1110), R392stopCodon (χ2=0.5629) e S249P (χ2=2.098) não possuem associação com a malária.

CONCLUSÃO

Sugerimos que não há associação dos polimorfismos I602S (TLR-1), R392StopCodon (TLR-5) e S249P (TLR-6) com a malária causada por P. vivax.

AGRADECIMENTOS

Ao CIPClin (Centro Internacional de Pesquisa Clínica em Malária), a Gerência de Malária, ao Departamento de Ensino e Pesquisa da FMT-HVD (em especial a dona Socorro Almeida) e a Equipe de Trabalho

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAMPOS, M A et al. Activation of Toll-like receptor-2 by glycosylphosphatidylinositol anchors from a protozoan parasite. J Immunol v. 167, n. 1, p. 416–423 , 2001. COX-SINGH, J et al. Plasmodium knowlesi malaria in humans is widely distributed and potentially life threatening. Clin.Infect.Dis. v. 46, n. 1537-6591 (Electronic), p. 165–171 , 2008.1537-6591. SCHOFIELD, Louis; GRAU, Georges E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature reviews. Immunology v. 5, n. 9, p. 722–735 , 2005.1474-1733.

Polimorfismo,

Genótipo ou Alelo

Pacientes com

Malária-vivax

n (%)

Grupo

Controle

n (%)

(p) valor OR (95% CI)

I620S (TLR-1)

Genótipo

T/T 74 (63,24%) 66 (61,11%) 0.7839 1.095

(0.6385 – 1.878)

TTvsTG+

GG

T/G 37 (31,62%) 36 (33,33%) 0.7746 1.091

(0.6192 – 1.922) TTvsTG

G/G 6 (5,12%) 6 (5,55%) 1.0000 1.121

(0.3447 – 3.647) TTvsGG

Alelos

T 185(79,05%) 168 (77,77%) 0.8186

1.079

(0.6881 – 1.691)

G 49 (20,95%) 48 (22,23%)

R392StopCodon (TLR-5)

Genótipo

C/C 105 (89,74%) 100 (92,6%) 0.7000

1.441

(0.2746 – 1.784) CCvsCT

C/T 12 (10,26%) 8 (7,4%)

Alelos

C 222 (94,9%) 208 (96,3%) 0.4638

0.7115

(0.2851 – 1.776)

T 12 (5,1%) 8 (3,7%)

S249P (TLR-6)

Genótipo

C/C 4 (3,41%) 1 (0.92%) 0.3714 3.788

(0.4164 – 34.45)

CCvsCT+

TT

C/T 25 (21,36%) 28 (25,92%) 0.3525 4.480

(0.4688 – 42.81)

CCvsCT

T/T 88 (75,21%) 79 (73,14%) 0.3738 3.591

(0.3928 – 32.83)

CCvsTT

Alelos

C 33 (14,5%) 30 (12,5%) 1.0000

1.018

(0.5972 – 1.735)

T 201 (85,5%) 186 (87,5%)

Figura 01. Fluxograma de Trabalho

Figura02. TLR-1 I602S: homozigoto selvagem T/T; heterozigostoT/G; homozigoto de alelos mutatos G/G.

Tabela 01. Frequência dos alelos nos polimorfismos no TLR-1, TLR-5, TLR-6

Figura03. TLR-5 R392StopCodon: Homozigoto selvagem C/C; Heterozigoto C/T; Homozigoto de alelos mutados T/T

Figura04. TLR-6 S249P Homozigoto selvagem C/C; Heterozigoto C/T; Homozigoto de alelos mutados T/T

FREQUÊNCIA ALÉLICA DOS POLIMORFISMOS NOS GENES DO TLR-4 (ASP299GLY E THR399ILE) E CD14 (-159) EM PACIENTES COM

MALÁRIA-vivax

Lilyane de Amorim Xabregas¹, Hiochelson Najibe dos Santos Ibiapina2 Marcus Vinicius Guimarães de Lacerda¹, Adriana Malheiro Alle Marie², Allyson Guimarães da Costa¹,2

Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado¹, Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas²

INTRODUÇÃO

A malária é uma doença infecto-parasitária, ocasionada por protozoários do gênero Plasmodium. Mais de 90% dos casos notificados de malária na região amazônica é por Plasmodium vivax (WHO,2016). O curso clínico é correlacionado à ruptura dos eritrócitos sucedendo a resposta imunológica com liberação de citocinas pró-inflamatórias. O TLR-4 é um receptor extracelular que ao fazer o complexo TLR-4/CD14 reconhece componentes externos do parasita como, no caso, âncoras de GPI. Estudos sugerem a associação de polimorfismos nos genes desses receptores (TLR-4 e CD14), com à suscetibilidade ou resistência a doenças parasitárias . (MARIA; LEORATTI, 2008).

OBJETIVOS

Estimar a frequência alélica dos polimorfismos Asp299Gly e Thr399Ile (TLR-4) e -159 (CD14), em pacientes com malária sintomática ocasionada pelo Plasmodium vivax; Relacionar os genótipos e alelos com a malária-vivax.

MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo empregou o método descritivo; transversal, com genotipagem de 117 amostras de indivíduos infectados (casos) e 108 não infectados (controles) através da técnica de PCR-RFLP com enzimas de restrição específicas NcoI (Asp299Gly), Hinf-I (Thr399Ile) e AvaII (-159) para cada polimorfismo.

RESULTADOS

CONCLUSÃO

Nossos resultados sugerem que não há associação entre os polimorfismos de TLR-4 e CD14 com malária-vivax na população de Careiro. No entanto, é necessário que sejam feitos mais estudos a cerca do assunto, aumentando o N amostral, para confirmar os achados.

AGRADECIMENTOS

À Deus acima de tudo. Ao CIPClin (Centro Internacional de Pesquisa Clínica em Malária), Gerência de Malária, a DEP e a Dona Socorro Almeida, bem como toda equipe de trabalho pela imensa colaboração.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

WHO. World Health Organization. Disponível em:<http://www.who.int/campaigns/malaria-day/2016/en/>. Acesso em: 10 Junho 2016. Maria F, Leoratti DES. Influência de variantes de receptores de reconhecimento padrão na suscetibilidade à malária. 2008;

Figura 1: Esquema do procedimento da PCR-RFLP.

Tabela 1: Frequências genotípicas e alélicas para os SNPs de TLR- 4 e CD14.

TLR-4 Asp299Gly: Homozigoto (A/A), heterozigoto (A/G); Thr399Ile: Homozigoto (C/C), heterozigoto (C/T). CD14 -159: Homozigoto (C/C), heterozigoto (C/T), homozigoto de alelos mutados (T/T). OR: Odds Ratio.

Figura 4: CD14 (-159): 1- Homozigoto selvagem (C/C); 2- Homozigoto mutado (T/T); 3- Heterozigoto (C/T).

Figura 2: TLR-4 (Asp299Gly): 1- Homozigoto selvagem (A/A); 2- Heterozigoto (A/G).

Figura 3: TLR-4 (Thr399Ile): 1- Homozigoto selvagem (C/C); 2- Heterozigoto (C/T).

INFLUÊNCIA DO ANTIMALÁRICO CLOROQUINA NA CITOADESÃO DE PLASMODIUM VIVAX ÀS CÉLULAS ENDOTELIAIS

Dayanne Kamylla Alves da Silva Barros 1,2,Dr. Rita de Cássia Mascarenhas Netto 1,3

1 Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado; 2 Centro Universitário do Norte- Uninorte; 3 Universidade Estadual de Campinas.

INTRODUÇÃO A malária é uma doença infecciosa causada pelo protozoário do gênero Plasmodium . Sendo 5 espécies P. vivax, P. falciparum, P. ovale, P. knowlesi e P. malariae capaz de infectar o homem. O Plasmodium vivax é a malaria humana mais difundida, colocando 2,5 bilhões de pessoas em risco de infecção . No Brasil cerca de 90% dos casos de malária se dá por esta espécie. Os parasitas da malária são observados não só no sangue periférico, mas também na medula óssea. Estudos anteriores mostraram a capacidade adesiva ex vivo de isolados de P. vivax a células endoteliais pulmonares e cerebrais, e em tecido placentário. Mas nenhum estudo mostrou a capacidade do parasita em aderir a células da medula óssea.

OBJETIVOS Objetivo geral Investigar a capacidade adesiva de formas maduras de P. vivax a células endoteliais de medula óssea. Objetivo específico Avaliar o nível de adesão das formas assexuadas nos dois momentos: antes e depois do cultivo. Correlacionar às porcentagens de esquizontes presentes na amostra com a taxa de citoadesão.

MATERIAIS E MÉTODOS

RESULTADOS

CONCLUSÃO Todos os isolados testados apresentaram habilidade de aderir a células da medula óssea. Apesar de haver alguns isolados com maior taxa de adesão, esta maior taxa não foi correlacionada com a maior presença de esquizontes.

AGRADECIMENTOS Fundação de Medicina Tropical

Fapeam Gerencia de Malária Aos pacientes voluntários Equipe da Cultura

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Howes R. et al. Global Epidemiology of Plasmodium vivax. Am J Trop Med Hyg. 2016 Jul 11. pii: 16-0141. Lopes S.C. et al. Paucity of Plasmodium vivax Mature Schizonts in Peripheral Blood Is Associated With Their Increased Cytoadhesive Potential. J Infect Dis. 2014; 209(9):1403-7.

Is o la d o s

Pa

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50

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2 3 4 7 9 1 0 1 3 1 6 2 3

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A n e l

T ro fo z o íta

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A n e l

T ro fo z o íta

E s q u iz o n te

Figura 1. Adesão de diferentes estágios de P. vivax a células endoteliais de medula óssea humana. (A) Taxa de adesão de P. vivax a HBMEC em 9 diferentes isolados. (B) Distribuição dos estágios assexuados de P. vivax nos diferentes isolados

% E s q u iz o n te s

Pa

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C o rre la ç ã o d e S p e a rm a n

n = 1 7

r= 0 ,2 9

p = 0 ,2 5 1

Figura 2. Taxa de adesão E distribuição dos estágios parasitários antes e depois do amadurecimento in vitro de P. vivax.

Figura 3. Correlação da porcentagem de esquizontes com a taxa de adesão.

1. O sangue foi coletado na FMT

2. Centrifugado a 1500 rpm por 5 min

3. Remoção do plasma e pellet ressuspendido em RPMI 1X

4. Celulose para a remoção dos leucócitos

5. Concentração do parasita por Percoll 45%

6. Adesão em HBMEC e o restante em cultura

7. Maturação do parasita pós Percoll

8. Adesão em HBMEC após o amadurecimento

INVESTIGAÇÃO DE POLIMORFISMOS NO GENE MBL EM PACIENTES COM MALÁRIA SINTOMÁTICA POR Plasmodium vivax

MSc Larissa W. Brasil¹, Laila Rowena A. Barbosa² Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado¹, Faculdade Estácio do Amazonas²

INTRODUÇÃO A malária é uma doença infecciosa parasitária prevalente em regiões tropicais, causada por protozoário do gênero Plasmodium, transmitida pelo mosquito fêmea do gênero Anopheles. A sintomatologia da doença está relacionada ao ciclo do parasita, em que havendo a liberação dos parasitas na corrente sanguínea, os sistemas de ação da imunidade são ativados. O agravamento da malária está relacionado com a interação entre parasita/hospedeiro, a espécie do Plasmodium, a densidade parasitária e o sistema imunológico do hospedeiro. Nessa perspectiva, vem sendo dada importância às pesquisas envolvendo genes humanos relacionados à expressão de fatores imunológicos. A Lectina ligante de manose (MBL) atua no sistema da imunidade inato, ativando o sistema complemento pela via das lectinas e na opsonização. É uma proteína plasmática de fase aguda pertencente à família das colectinas. Apresenta domínios de reconhecimento de carboidratos (DRC) associados a estruturas de colágeno, que reconhece resíduos terminais de manose presentes na superfície de microrganismos. A deficiência de MBL tem sido associada a maior suscetibilidade a doenças infecciosas, especialmente por patógenos extracelulares. Entretanto, altas concentrações séricas têm sido relacionadas a infecções por microrganismos intracelulares. A MBL tem seu gene, MBL-2, situado no cromossomo 10. Os polimorfismos nas posições -550, -221 e +4 do gene MBL-2 representam os loci H/L, X/Y e P/Q, respectivamente, e estão relacionados a suscetibilidade a doenças infecciosas.

OBJETIVOS Realizar genotipagem de MBL-2 em indivíduos com e sem malária (casos e controles); determinar as frequências alélicas e genotípicas dos polimorfismos em ambos os grupos; e investigar a associação genética de MBL-2 com a malária causada por P. vivax.

MATERIAIS E MÉTODOS As amostras foram coletadas de indivíduos residentes na comunidade Brasileirinho, situada em uma área periurbana da zona leste da cidade de Manaus, no período de abril de 2013 a abril de 2014. O DNA genômico foi extraído pelo kit FavorPrep 96-well Genomic DNA, Favorgen®. Em seguida, realizou-se a PCR-RFLP (Polimorfismos no Comprimento de Fragmentos de Restrição) e análise visual dos fragmentos a partir do gel de Agarose. Para as análises estatísticas, utilizou-se o software Haploview 4.1 e o website http://ihg.gsf.de/cgibin/hw/hwa1.pl.

RESULTADOS Das 375 amostras do estudo, foram amplificadas, satisfatoriamente, 370 para o SNP -550 de MBL2, 264 para o SNP -221, e 213 para SNP +4, de acordo com o protocolo pré estabelecido. Não houve diferença estatística significativa para o polimorfismo -221 de MBL2 (P= 0.078; X² = 3.09; OR = 1.622). Nos resultados obtidos para MBL -550, há um desacordo com equilíbrio de Hardy–Weinberg (HWE), mas observa-se uma leve associação para H/H, em comparação com H/L e L/L (P = 0.0364; OR = 2.021); e L/L em relação à H/L (P = 0.324; OR = 2.085). Para o SNP MBL+4, há uma associação do genótipo P/P em relação a P/Q (P = 0.003; OR = 2.483); e na relação Q/Q e a P/Q, comparada com P/P (P = 0.0087; OR = 2.111). A comparação de haplótipos para os dois SNPs -221 e +4 demonstra que o haplótipo YP possui distribuição com diferença significativa nos grupos, prevalente nos casos (P= 0.0019), enquanto que o haplótipo YQ demonstrou leve diferença de distribuição (P= 0.0364), com prevalência no grupo controle.

CONCLUSÃO Os resultados obtidos neste estudo mostram que existe uma associação entre o polimorfismo +4 e o risco de desenvolver malária sintomática por P. vivax, (haplótipo YP), e o haplótipo YQ, associado ao risco diminuído de desenvolver malária.

AGRADECIMENTOS À minha orientadora Larissa, ao Drs. Marcus Lacerda e Rajendranath Ramasawmy pelo apoio à pesquisa. Ao MSc Felipe Jules pelo apoio técnico e à toda a equipe de pesquisa da Malária. À D. Socorro Almeida e colaboradores do PAIC da FMT.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1.Garred P, Nielsen MA, Kurtzhals JAL, Malhotra R, Madsen HO, Goka BQ, et al. Mannose-Binding Lectin Is a Disease Modifier in Clinical Malaria and May Function as Opsonin for Plasmodium falciparum - Infected Erythrocytes Mannose-Binding Lectin Is a Disease Modifier in Clinical Malaria and May Function as Opsonin for Plasmodium falc. Infection and Immunity. 2003;71(9):5245–53. 2.Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Imunologia celular e molecular. In: Imunidade inata. 7° Ed. Saunders Elsevier. 2012; p.55-86. 3.Araujo FJ De, Mesquita TG, Silva LDO, Almeida SA De, Vital WDS, Guerra JADO, et al. Functional variations in MBL2 gene are associated with cutaneous leishmaniasis in the Amazonas state of Brazil. Genes Immun [Internet]. Nature Publishing Group; 2015;16(4):284–8.

MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE PLAQUETAS PARA

AVALIAÇÃO DE SUA CAPACIDADE ADESIVA AO

ENDOTÉLIO: UMA POSSÍVEL EXPLICAÇÃO PARA

TROMBOCITOPENIA NA MALÁRIA VIVAX Bhrenda B. Borba1,2, João Conrado K. dos Santos3, Dr. Fabio T.M. Costa3,

Dr. Marcus Vinícius G. Lacerda1,4, Dr. Stefanie C. P. Lopes4. 1 Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado, 2 Universidade Paulista;

3 Universidade Estadual de Campinas; 4 Instituto Leônidas e Maria Deane – Fiocruz. INTRODUÇÃO Plasmodium vivax foi responsável por cerca de 19 milhões de casos de malária mundialmente em 2013, sendo o principal causador da malária no Brasil. Define-se como trombocitopenia a redução do número de plaquetas circulantes no sangue abaixo de 150.000/µL.. A trombocitopenia em pacientes com malária é comumente relatada por diversos autores variando de 24% a 94% [1]. Estudos envolvendo a etiopatogênese da trombocitopenia na malária são realizados há pelo menos quatro décadas sendo atribuído como causas: i.destruição imunomediada, ii.sequestro esplênico e não-esplênico, iii.ativação plaquetária e ativação da cascata de coagulação, iv.apoptose de plaquetas, v.estresse oxidativo e vi.alteração na produção pela medula óssea. Entretanto, até o momento pouco se conhece sobre os mecanismos exatos que causam essa alteração hematológica.

OBJETIVOS Este estudo teve por objetivo a padronização de uma metodologia capaz de purificar plaquetas que preservasse as características plaquetárias para posteriormente, investigar a capacidade adesiva de plaquetas, provenientes de pacientes infectados por P. vivax, ao endotélio vascular e determinar as mudanças nos receptores das células endoteliais frente a este estímulo.

MATERIAIS E MÉTODOS

RESULTADOS

CONCLUSÃO A metodologia 3 foi a melhor em preservar as características iniciais das plaquetas após a purificação. Não verificamos diferença na ativação ou apoptose de plaquetas entre o grupo controle e malária vivax. Somente um ensaio de co-cultivo foi realizado revelando que parece haver uma maior ativação do endotélio na presença de plaquetas oriundas de pacientes maláricos que controle, mas é necessário coletar mais amostras para este fim.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Lacerda MV, Mourao MP, Coelho HC, Santos JB. Thrombocytopenia in malaria: who cares? Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 2011; 106 Suppl 1:52-63.

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Figura 2. Marcadores de ativação plaquetária (CD62-P e PAC-1) e apoptose (Anexina-V) em pacientes com malária vivax e controle.

Figura 1. (A) Volume médio plaquetário do sangue total (ST), plasma rico em plaquetas (PRP) e plaquetas isolada após centrifugação pelos três métodos.

Figura 3. Ativação endotelial (CD36, CD62E, CD40 e CD54) de células HUVEC co-cultivadas com plaquetas purificadas de pacientes com malária vivax e controle.

Métod

o

Centrifugação

1ª 2ª 3ª

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1 150 1

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2000 1

5

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0

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0

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0

500 2

0

500 20

1. Coleta de amostra: questionário e TCLE.

2. Purificação de plaquetas (Padronização)

3. Medir ativação plaquetária e apoptose por citometria de fluxo.

4. Co-cultivo células endoteliais (HUVEC) e plaquetas.

5. Medir ativação endotelial após co-cultivo (citometria de fluxo).

C D 5 4

T e m p o d e in c u b a ç ã o

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