UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONASUNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONASESCOLA SUPERIOR DE SAÚDEESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

ANA PAULA BARBOSA DA SILVAANA PAULA BARBOSA DA SILVA

MANAUS - AMAZONASMANAUS - AMAZONAS

Joselita Maria Mendes dos Santos, Dra.Joselita Maria Mendes dos Santos, Dra.

Wanderli Pedro Tadei, Dr.Wanderli Pedro Tadei, Dr.

Orientador(es)Orientador(es)

Doença parasitária causada por protozoários do Doença parasitária causada por protozoários do gênero gênero PlasmodiumPlasmodium, que são transmitidos pela , que são transmitidos pela picada do mosquito fêmea do gênero picada do mosquito fêmea do gênero AnophelesAnopheles (SWEENEY, 1999);(SWEENEY, 1999);

Caracteriza-se por acessos de febre com Caracteriza-se por acessos de febre com intervalos de 24, 48 ou 72 horas. A forma mais intervalos de 24, 48 ou 72 horas. A forma mais virulenta é causada pela espécie virulenta é causada pela espécie Plasmodium Plasmodium falciparumfalciparum;;

Continua sendo a principal parasitose, causando Continua sendo a principal parasitose, causando de 1,5 a 2,7 milhões de mortes/ano, 4% da de 1,5 a 2,7 milhões de mortes/ano, 4% da mortalidade total mundial;mortalidade total mundial;

Região amazônica: principal vetor da Região amazônica: principal vetor da malária – malária – Anopheles darlingiAnopheles darlingi..

• Classe: InsectaClasse: Insecta

• Ordem: DipteraOrdem: Diptera

• Família: CulicidaeFamília: Culicidae

• Gênero: Gênero: AnophelesAnopheles

• Subgênero: Subgênero: NyssorhynchusNyssorhynchus

DOGGETT (2002)DOGGETT (2002)

COSTA (2005)COSTA (2005)

FORATTINI, 2002FORATTINI, 2002DOGGETT (2002)DOGGETT (2002)

FORATTINI, 2002FORATTINI, 2002

http://www.cf.ac.uk/biosi/staff/berry/tox.html

Ocorre desde o México - Argentina, e Ocorre desde o México - Argentina, e Alpes Andinos - América do Sul Alpes Andinos - América do Sul (FORATTINI, 1962);(FORATTINI, 1962);

Costuma picar o homem no intradomicílio. Mas, em algumas situações Costuma picar o homem no intradomicílio. Mas, em algumas situações pode picar no peridomicílio;pode picar no peridomicílio;

Atualmente - uma espécie monotípica. Estudos prévios sobre a biologia Atualmente - uma espécie monotípica. Estudos prévios sobre a biologia indicaram a presença de populações geograficamente distintas e indicaram a presença de populações geograficamente distintas e diferentes padrões na atividade de picar (Malafronte diferentes padrões na atividade de picar (Malafronte et al.et al., 1999)., 1999).

http://pgrc3.agr.gc.ca/images/gel.gifhttp://pgrc3.agr.gc.ca/images/gel.gif

Williams Williams et al. et al. (1990) – variação da (1990) – variação da técnica PCR – utiliza apenas 1 “primer”;técnica PCR – utiliza apenas 1 “primer”;

Primer – 10 oligonucleotídeos;Primer – 10 oligonucleotídeos;

Vantagens (Williams Vantagens (Williams et al.et al., 1990):, 1990):

• Não necessita do conhecimento prévio do genótipo do organismo a ser Não necessita do conhecimento prévio do genótipo do organismo a ser estudado;estudado;• Possibilita um maior número de marcadores possíveis de serem Possibilita um maior número de marcadores possíveis de serem mapeados;mapeados;• Permite de maneira rápida identificar o grau de similaridade entre os Permite de maneira rápida identificar o grau de similaridade entre os genótipos (inter e intra-específicos).genótipos (inter e intra-específicos).

Wilkerson Wilkerson et al. et al. (1995) – (1995) – A. albitarsisA. albitarsis, procedentes do Paraguai, Argentina, , procedentes do Paraguai, Argentina, Brasil e Venezuela;Brasil e Venezuela;

Manguin Manguin et al. et al. (1999) – (1999) – A. darlingiA. darlingi, procedentes de Belize, Bolívia, Brasil, , procedentes de Belize, Bolívia, Brasil, Guiana Francesa e Venezuela.Guiana Francesa e Venezuela.

Dimopoulos Dimopoulos et al. et al. (1996) – (1996) – A. gambiaeA. gambiae;;

Analisar a variabilidade genética intra e interpopulacional de Analisar a variabilidade genética intra e interpopulacional de Anopheles Anopheles darlingidarlingi, procedentes de localidades ao longo dos rios Negro e Solimões , procedentes de localidades ao longo dos rios Negro e Solimões (AM), usando marcadores moleculares de RAPD.(AM), usando marcadores moleculares de RAPD.

Analisar a variabilidade genética intra e peridomiciliar, e tentar Analisar a variabilidade genética intra e peridomiciliar, e tentar correlacionar com a capacidade vetorial e a adaptabilidade da espécie; correlacionar com a capacidade vetorial e a adaptabilidade da espécie;

Identificar a presença de possíveis variantes alélicas que possam estar Identificar a presença de possíveis variantes alélicas que possam estar separadas por barreiras geográficas (rios Negro e Solimões);separadas por barreiras geográficas (rios Negro e Solimões);

Estabelecer o nível de variância molecular entre as populações;Estabelecer o nível de variância molecular entre as populações;

Comparar dois protocolos de extração de DNA.Comparar dois protocolos de extração de DNA.

Determinar os índices de similaridade e distância genética a partir do Determinar os índices de similaridade e distância genética a partir do índice de Nei (1978);índice de Nei (1978);

Verificar a função dos rios Negro e Solimões como agentes mantenedores e Verificar a função dos rios Negro e Solimões como agentes mantenedores e propiciadores da diversidade genética desses insetos na Amazônia;propiciadores da diversidade genética desses insetos na Amazônia;

Figura 1 - Mapa do Estado do Figura 1 - Mapa do Estado do AmazonasAmazonas

Transportadas para o Laboratório de Malária e Dengue (INPA) – Repasto Transportadas para o Laboratório de Malária e Dengue (INPA) – Repasto sanguíneo com hamster (sanguíneo com hamster (Mesocricetus auratusMesocricetus auratus), isoladas para postura;), isoladas para postura;

SILVA, 2006SILVA, 2006

Mosquitos criados em insetário – Temperatura 26ºC Mosquitos criados em insetário – Temperatura 26ºC ± 1ºC – Umidade 80 ± 1ºC – Umidade 80 a 90% - Algumas desovas foram mantidas até 4ºestádio larval, outras até a 90% - Algumas desovas foram mantidas até 4ºestádio larval, outras até o estágio adulto – Congelamento a -70ºC;o estágio adulto – Congelamento a -70ºC;

Identificação dos mosquitos – Gorham Identificação dos mosquitos – Gorham et al. et al. (1967) e Consoli & Lourenço-(1967) e Consoli & Lourenço-de-Oliveira (1994);de-Oliveira (1994);

Espectrofotômetro específico para DNA;Espectrofotômetro específico para DNA;

Absorbância entre 260 a 280nm – Diluição de 1:35 (2µL DNA/68µL água Absorbância entre 260 a 280nm – Diluição de 1:35 (2µL DNA/68µL água milli-q autoclavada);milli-q autoclavada);

Modelo Gene Quant Pro – Marca Modelo Gene Quant Pro – Marca Pharmacia;Pharmacia;

SILVA, 2006SILVA, 2006

Procedimentos de Wilkerson Procedimentos de Wilkerson et al. et al. (1995) – algumas modificações;(1995) – algumas modificações;

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

94ºC – 1min94ºC – 1min

36ºC – 1min36ºC – 1min

72ºC – 2min72ºC – 2min

72ºC – 7min72ºC – 7min

45 ciclos45 ciclos

SIL

VA

, 200

6S

ILV

A, 2

006

AM 05:AM 05:

5’ 5’ G G T T G G A A C C G G T T A A G G C C 3’ 3’

AM 08:AM 08:5’ 5’ G G T T T T G G C C G G A A T T C C C C 3’3’

AM 09:AM 09:

5’ 5’ G G G G A A C C T T G G G G A A G G T T 3’3’

Selecionados – Sanguino & Santos (2002).Selecionados – Sanguino & Santos (2002).

SILVA, 2006SILVA, 2006

Gel de Agarose (1,5%)Gel de Agarose (1,5%)DNA + Azul de BromofenolDNA + Azul de Bromofenol

Cuba EletroforéticaCuba Eletroforética

http://www.ahdiagnostics.dk/Admin/Public/404.htmlhttp://www.ahdiagnostics.dk/Admin/Public/404.html

Aparelho de FotodocumentaçãoAparelho de Fotodocumentação

Eagle Eye II (Stratagene) – UV - 300 nmEagle Eye II (Stratagene) – UV - 300 nm

Análise da variabilidade genética – Programa Tools for Population Análise da variabilidade genética – Programa Tools for Population Genetics Analyses (TFPGA) – opção de Marcadores Dominantes para Genetics Analyses (TFPGA) – opção de Marcadores Dominantes para Organismos Diplóides (MILLER, 1997) – cada banda um loco;Organismos Diplóides (MILLER, 1997) – cada banda um loco;

Estimativa da freqüência alélica – raiz quadrada das freqüências de Estimativa da freqüência alélica – raiz quadrada das freqüências de bandas ausentes observadas;bandas ausentes observadas;

Dendrograma de similaridade – índice de Nei (1978), método não Dendrograma de similaridade – índice de Nei (1978), método não ponderado de agrupamento de pares de populações com média aritmética ponderado de agrupamento de pares de populações com média aritmética (UPGMA);(UPGMA);

2,072 pb2,072 pb

1,500 pb1,500 pb

600 pb

Figura 1. Perfil da variabilidade genética em populações de Figura 1. Perfil da variabilidade genética em populações de A. darlingi A. darlingi do Estado do do Estado do Amazonas. M=marcador molecular (Ladder 100pb) e C=Controle. Amostras: 1 a 5 (S. Amazonas. M=marcador molecular (Ladder 100pb) e C=Controle. Amostras: 1 a 5 (S. Gabriel da Cachoeira), 6 a 10 (Coari), 11 a 14 (Tabatinga) e 15 a 18 (Manaus).Gabriel da Cachoeira), 6 a 10 (Coari), 11 a 14 (Tabatinga) e 15 a 18 (Manaus).

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 C M M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 C M

M I P I P I P I P I P I P I P I P I P C M M I P I P I P I P I P I P I P I P I P C M

Figura 2. Perfil da variabilidade genética em populações de Figura 2. Perfil da variabilidade genética em populações de A. darlingi A. darlingi da Cidade de da Cidade de Manaus, de acordo com a atividade de picar. M = Marcador molecular (Ladder 100pb) e Manaus, de acordo com a atividade de picar. M = Marcador molecular (Ladder 100pb) e C = Controle. Amostras: I = Intradomicílio e P = Peridomicílio.C = Controle. Amostras: I = Intradomicílio e P = Peridomicílio.

2,072 pb2,072 pb

1,500 pb1,500 pb

600 pb600 pb

PopulaçãoPopulação

Número Número médio de médio de

amostras por amostras por locoloco

Percentagem Percentagem de locosde locos

polimórficos *polimórficos *

Heterozigosidade médiaHeterozigosidade média

ObservadaObservada Esperada **Esperada **

S. Gabriel Cachoeira*S. Gabriel Cachoeira* 29,0929,09 81,8281,82 0,25690,2569 0,26150,2615

CoariºCoariº 30,0030,00 90,9190,91 0,32040,3204 0,32590,3259

TabatingaºTabatingaº 29,3929,39 81,8281,82 0,28490,2849 0,28980,2898

Manaus*Manaus* 25,4525,45 78,7978,79 0,27840,2784 0,28410,2841

•Freqüência do alelo mais comum menor ou igual a 0,95; **Estimativa não Freqüência do alelo mais comum menor ou igual a 0,95; **Estimativa não enviesada (Nei, 1978).enviesada (Nei, 1978).* = Rio Negro; º = Rio Solimões* = Rio Negro; º = Rio Solimões

Tabela 1 – Estimativa da variabilidade genética em quatro populações de Tabela 1 – Estimativa da variabilidade genética em quatro populações de A. A. darlingidarlingi no Estado do Amazonas. no Estado do Amazonas.

Tabela 2 – Matriz de similaridade e distância genética entre Tabela 2 – Matriz de similaridade e distância genética entre as populações de as populações de A. darlingiA. darlingi do Estado do Amazonas*. do Estado do Amazonas*.

PopulaçãoPopulação 11 22 33 44

1. S. Gabriel da Cachoeira1. S. Gabriel da Cachoeira ********** 0,9068 0,9068 0,9167 0,9167 0,9514 0,9514

2. Coari2. Coari 0,0979 0,0979 ********** 0,9895 0,9895 0,9703 0,9703

3. Tabatinga3. Tabatinga 0,0870 0,0870 0,0105 0,0105 ********** 0,9787 0,9787

4. Manaus4. Manaus 0,0498 0,0498 0,0301 0,0301 0,0215 0,0215 **********

Figura 3. Dendrograma agrupando as populações de Figura 3. Dendrograma agrupando as populações de A. darlingiA. darlingi do do

Estado do Amazonas, com base na distância genética. Método não Estado do Amazonas, com base na distância genética. Método não

ponderado de agrupamento de pares de populações com média aritmética ponderado de agrupamento de pares de populações com média aritmética

- UPGMA (Nei, 1978). - UPGMA (Nei, 1978).

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MUITO MUITO OBRIGADAOBRIGADA!!!!!!!!