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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
WILLIAN ORLANDO CASTILLO ORDÓÑEZ
Avaliação dos efeitos neuroprotetores do extrato etanólico de Caliphruria subedentata e o
fármaco Galantamina em células indiferenciadas SH-SY5Y expostas ao peptídeo Beta-
amiloide(1-42)
RIBEIRÃO PRETO
2016
WILLIAN ORLANDO CASTILLO ORDÓÑEZ
Avaliação dos efeitos neuroprotetores do extrato etanólico de Caliphruria subedentata e o
fármaco Galantamina em células indiferenciadas SH-SY5Y expostas ao peptídeo Beta-
amiloide(1-42)
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração:
Genética
Orientador:
Profa. Dr
a. Catarina Satie Takahashi
RIBEIRÃO PRETO
2016
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação da Publicação
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
FICHA CATALOGRÁFICA
Castillo Ordóñez, Willian Orlando
Avaliação dos efeitos neuroprotetores do extrato etanólico de Caliphruria subedentata e o
fármaco galantamina em células indiferenciadas SH-SY5Y expostas ao peptídeo Beta-
amiloide (1-42)/ Willian Orlando Castillo Ordóñez; Orientadora: Catarina Satie Takahashi –
Ribeirão Preto, 2016.
109 f.:il; 30 cm
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de
concentração: Genética; Orientadora: Takahashi, Catarina Satie
1. Doença de Alzheimer, Neurotoxicidade, peptídeo beta amiloide(1-42), Caliphruria
subedentata, Amaryllidaceaes, Galanthamine, Antigenotoxicidade.
Nome: CASTILLO ORDÓÑEZ, Willian Orlando.
Título: Avaliação dos efeitos neuroprotetores do extrato etanólico de Caliphruria subedentata
e o fármaco galantamina em células indiferenciadas SH-SY5Y expostas ao peptídeo Beta-
amiloide (1-42):
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Genética
Aprovado em: ____/____/________
Banca Examinadora
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: _____________________
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: _____________________
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: _____________________
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: _____________________
APOIO E SUPORTE FINANCIERO
Este trabalho bem como a sua apresentação em diversos congressos foi realizado com o apoio
financeiro das seguintes instituições e entidades:
Ministério das Relações Exteriores (MRE) através do Programa de Estudantes–
Convênio de Pós-Graduação – PEC–PG (Proc. N° 5614-11-2).
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES.
Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência – FAEPA.
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP.
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – FFCLRP/USP.
Associação Brasileira de Mutagênese e Genômica Ambiental-MutaGen-Brasil
AGRADECIMIENTOS
A la Profa. Dr
a. Catarina Satie Takahashi, por haberme aceptado en su laboratorio,
orientarme y ofrecerme todo el soporte necesario para la realización de este trabajo, a Ella mi
admiración, afecto y aprecio.
A CAPES por la asignación de la beca de doctorado.
A la Profa. Dr
a. Elza Tiemi Sakamoto Hojo, por la asesoría y el apoyo proporcionado
en la ejecución de este trabajo.
Al Prof. Dr. Ademilson Espencer E. Soares, a la Profa. Dr
a. Silvana Giuliatti Ex-
coordinadores y a la Profa. Dr
a. Ester Silveria Ramos actual coordinadora del Programa de
Post-grado en Genética de la FMRP-USP.
Al Prof . Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, jefe del Departamento de Genética de la
FMRP-USP.
Al Laboratorio de Bioinformática coordinado por la Profa Dra
a. Silvana Giuliatti
A los Profesores: Dra
Zilá Luz Paulino Simões, Dra. Marcia Maria Gentile Bitondi
y Dr. Geraldo Aleixo da S. Passos Junior, por permitir el uso de algunos equipos de sus
laboratorios.
Al laboratorio de Microscopía Electrónica del Departamento de Biología Celular
(FMRP-USP).
A la Profª Dra
Ana Lilia Alzate Marín, por su simpatía como compatriota y amiga.
Al Profesor Fabio Cabezas Fajardo del Laboratorio de Química de Compuestos
Naturales del Departamento de Química de la Universidad del Cauca, Colombia.
A los Técnicos del Laboratorio de Citogenética y Mutagénesis del Departamento de
Genética de la FMRP-USP, Luis Augusto da Costa Junior y Sueli Aparecida Neves.
A las secretarias del Departamento de Genética: Susie, Ana Claudia y Silvia por esa
disponibilidad constante.
A doña María por cuidar del laboratorio, ofreciéndonos un espacio limpio para el
desarrollo de nuestras actividades.
A los Profesores miembros del jurado evaluador, por la disponibilidad para leer este
trabajo y por las críticas constructivas a este trabajo.
Al Departamento de Genética y a la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto, por la
estructura ofrecida para el desarrollo de este proyecto.
A la Embajada de Brasil en Colombia, por la atención calurosa y por ser el primer
contacto de entrada con la Cultura Brasileña.
A todos mis compañeros del Laboratorio de Citogenética y Mutagénesis. A aquellos que
ya se fueron: Fernandas, Tiago, Andrés Felipe, Verónica, Ana Clara, Giovana y João
Paulo como aquellos que continúan: Ana Paula, Paulo, Danilo, Leonardo y Sahara gracias
por haberme proporcionado un ambiente ameno en el transcurso de estos cuatro años.
A mis amigos: Leandro Ribeiro de Oliveira, Elis Regina Ribeiro de Oliveira y
família, gracias por su amistad, cariño y aprecio.
A mi familia que siempre me acompaña desde la distancia y son motivación constante
en mi vida.
"Una noche, por la época en que Rebeca se curó del vicio de comer tierra y fue llevada a dormir en el
cuarto de los otros niños, la india que dormía con ellos despertó por casualidad y oyó un extraño ruido
intermitente en el rincón. Se incorporó alarmada, creyendo que había entrado un animal en el cuarto, y
entonces vio a Rebeca en el mecedor, chupándose el dedo y con los ojos alumbrados como los de un
gato en la oscuridad. Pasmada de terror, atribulada por la fatalidad de su destino, Visitación reconoció
en esos ojos los síntomas de la enfermedad cuya amenaza los había obligado, a ella y a su hermano, a
desterrarse para siempre de un reino milenario en el cual eran príncipes. Era la peste del insomnio". -
Cien años de soledad-
Gabriel García Márquez
LISTA DE ABREVIATURAS
ACh= Acetilcolina
AChE= Acetilcolinesterase
AChEIs=Inibidores da acetilcolinesterase
APOE= Apolipoproteina E
Aβ(1-42)=Peptídeo beta-amiloide(1-42)
BNPs= Brotos nucleoplasmicos
CB= Citocalacina B
DA= Doença de Alzheimer
DNMT= DNA metiltransferase
DO= Doxorrubicina
EROs= Espécies reativas de oxigênio
LDMA= Ligantes dirigidos a múltiplos alvos
mAChRs= Receptores muscarínicos da acetilcolina
MNCBNs= Micronúcleos em células binucleadas
MNs= Micronúcleos
nAChRs= Receptores nicotínicos da acetilcolina
nAChRs= Receptores nicotínicos da acetilcolina
NMDA= N-metil D-Aspartato
NNFs= Novelos neurofibrilares
NOS= Óxido nítrico sintetase
ON= Óxido nítrico
ONOO-= Peroxinitrito
Peptídeo beta amiloide (1-42)= Peptídeo Aβ (1-42)
PNPs= Pontes nuncleoplásmicos
PNs= Placas neuríticas
PPA= Proteína precursora amiloide
PSEN1= Presenilina 1
PSEN2= Presenilina 2
RL= Radical livre
RESUMO
CASTILLO, W. O. Avaliação dos efeitos neuroprotetores do extrato etanólico de
Caliphruria subedentata e o fármaco Galantamina em células indiferenciadas SH-SY5Y
expostas ao peptídeo Beta-amiloide(1-42). 2016. 109f. Tese (Doutorado) - Faculdade de
Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016.
A Doença de Alzheimer (DA) é o tipo mais comum de demência em idosos, a etiologia é
multifatorial e a fisiopatologia da doença é complexa, com um novo caso acontecendo a cada
sete segundos; globalmente, a doença está se tornando em uma lenta pandemia.
Bioquimicamente, a DA é caracterizada pela presença das placas neuríticas (PNs) e os
novelos neurofibrilares (NNFs). O peptídeo beta peptide1-42 (Aβ(1-42)) é o principal
componente das placas neuríticas e tem sido fortemente associado ao estresse oxidativo,
desregulação colinérgica e morte celular. Os múltiplos mecanismos envolvidos na patogênese
criam consideráveis dificuldades para identificar alvos terapêuticos apropriados. As
abordagens terapêuticas atuais melhoram temporariamente os sintomas da DA; no entanto,
apesar de esforços intensivos, nenhum dos tratamentos disponíveis hoje conseguiu alterar o
curso da doença. Porém, algumas das terapias mais relevantes para o tratamento da doença
estão baseadas na atividade inibidora da acetilcolinesterase (AChE). Nos últimos anos, os
alcaloides pertencentes à família Amaryllidaceae têm recebido muita atenção devido à
atividade anticolinérgica e antioxidante. A galantamina foi o primeiro alcaloide isolado a
partir de diferentes espécies de Amaryllidaceas e é o mais recente inibidor da AChE aprovado
para o tratamento sintomático da DA. Este fato tem motivado a pesquisa de outros alcaloides
como possíveis moduladores da doença em adição à atividade inibitória da AChE. Diante
disso, o objetivo deste estudo foi investigar se o extrato de Caliphruria subedentata e a
galantamina modulam a neurotoxicidade induzida pelo Aβ(1-42) na linhagem celular SH-SY5Y
indiferenciada. Para compreender os mecanismos de neuroproteção, um conjunto de ensaios
foi realizado tais como atividade inibitória da AChE, ensaios clonogênico, micronúcleos com
bloqueio na citocinese celular (CBMNcyt), cometa; análises por microscopia eletrônica de
transmissão (MET) e de metilação. Os resultados mostraram que tanto o extrato quanto a
galantamina diminuíram significativamente a citotoxicidade e genotoxicidade induzida pelo
Aβ(1-42). Além disso, ambos os tratamentos modularam alterações morfológicas mitocondriais
induzidas pelo peptídeo. Em conclusão, os resultados deste estudo demonstraram que, em
adição à atividade inibitória da AChE, tanto o extrato de C. subedentata quanto a galantamina
exercem propriedades antigenotóxicas. Essas propriedades relevantes da Amaryllidaceaes e o
fármaco tornam-se um potencial valioso para continuar sendo explorado.
Palavras-chaves: Doença de Alzheimer, Neurotoxicidade, Peptídeo beta amiloide(1-42),
Caliphruria subedentata, Amaryllidaceaes, Galanthamine, Antigenotoxicidade.
ABSTRACT
CASTILLO, W. O. Evaluation of neuroprotective effects of ethanolic extract of
Caliphruria subedentata and drug galanthamine on undifferentiated SH-SY5Y cells
exposure to amyloid beta peptide(1-42). 2016. 109p. Tese (Doutorado) - Faculdade de
Medicina, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016.
Alzheimer´s disease (AD) is the most common type of dementia in elderly population, the
etiology is multifactorial and the pathophysiology of the disease is complex, with a new case
occurring every seven seconds; globally, the disease itself is becoming a slowly pandemic.
Biochemically, the AD is characterized by presence of the neuritic plaques and neurofibrillary
tangles. Amyloid beta peptide1-42 (Aβ(1-42)) is the principal component of neuritic plaques and
it has been strongly associated with oxidative stress, cholinergic deregulation and cell death.
The multiple mechanisms involved in the pathogenesis create considerable difficulty to
identify appropriate targets. The current therapeutics approaches for AD improve temporally
the symptoms; and despite intensive efforts, none of the treatments available today alter the
course of disease. Nervertheless, some of the most relevant therapies for the treatment of
disease are based on acetylcholinesterase (AChE) inhibitor activity. In recent years, alkaloids
belonging Amaryllidaceae family have received great attention due to the well-known anti-
cholinergic and antioxidant activity and the galanthamine was the first alkaloid isolated from
different species of Amaryllidacea and it is the most recently AChE inhibitor approved for the
symptomatic treatment of AD. This fact has motivated the screening of other alkaloids as
possible modulators of disease in addition acetylcholinesterase activity. Purpose this study
was to investigate whether C. subedentata extract and galanthamine modulate Aβ(1-42)-
induced neurotoxicity in the undifferentiated SH-SY5Y cell line. To understand the
mechanisms of the neuroprotection, a set of biomarkers such as AChE activity, clonogenic,
cytokinesis block micronucleus cytome (CBMNcyt) and comet assays; beside transmission
electron microscope (TEM) and methylation analyses were realized. The results showed that
C. subedentata extract and galanthamine were capable to significantly reduce the Aβ(1-42)-
induced cytotoxicity and genotoxicity. Furthermore both treatments modulated Aβ(1-42)-
induced mitochondrial morphological alterations. In conclusion, this study demonstrated that
in addition to inhibition of acetylcholinesterase (AChE), the extract of C. subedentata and
galanthamine exert antigenotoxic properties. This relevant property of Amaryllidaceaes and
galanthamine are worthwhile exploring further which may improve the development of new
diseases-modifying agents.
Keywords: Alzheimer Disease, Neurotoxicity, Amyloid beta peptide(1-42), Caliphruria.
subedentata, Amaryllidaceaes, Galanthamine, antigenotoxicity.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 14
1.1 Doença de Alzheimer ................................................................................................... 14
1.2 O peptídeo beta-amiloide (1-42) na patogênese da doença de Alzheimer ...................... 15
1.3 Fatores de risco para a Doença de Alzheimer .............................................................. 17
1.4 Fatores genéticos .......................................................................................................... 18
1.5 Fatores epigenéticos ...................................................................................................... 19
1.6 O sistema de neurotransmissão colinérgica no cérebro ................................................ 20
1.7 O sistema glutamatérgico no cérebro ........................................................................... 21
1.8 A linhagem celular SH-SY5Y como modelo biológico para a doença de Alzheimer .. 22
1.9 Tratamentos e estratégias na doença de Alzheimer ...................................................... 23
1.10 Alcalóides das Amaryllidaceaes, a Galantamina .......................................................... 26
2 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 31
2.1 Objetivos Específicos ................................................................................................... 31
3 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 32
3.1 Extrato total de C. subedentata ..................................................................................... 32
3.2 Drogas ........................................................................................................................... 32
3.2.1 Peptídeo beta amiloide............................................................................................ 32
3.2.2 Galantamina ............................................................................................................ 33
3.3 Linhagem celular, condições da cultura e tratamentos ................................................. 33
3.4 Ensaio de viabilidade celular XTT ............................................................................... 33
3.5 Ensaios de Docking molecular in silico para avaliação da atividade inibitória da
acetilcolinesterase humano (hAChE) .................................................................................... 34
3.5.1 Seleção de ligantes .................................................................................................. 34
3.6 Determinações da inibição da acetilcolinesterase (AChEI) .......................................... 35
3.7 Ensaios de sobrevivência clonogênica ........................................................................... 36
3.8 Ensaios de diferenciação celular em células expostas ao extrato de C. subedentata ..... 36
3.9 Avaliação de morte celular ............................................................................................. 37
3.10 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ............................................................ 37
3.11 Ensaios de genotoxicidade: Micronúcleos e Cometa ................................................... 37
3.11.1 Ensaio de Micronúcleos ......................................................................................... 39
3.11.2 Ensaio cometa ........................................................................................................ 40
3.12 Ensaio de Metilação ..................................................................................................... 41
3.12.1 Extração de DNA .................................................................................................... 41
3.12.2 Conversão com Bissulfito ...................................................................................... 41
3.12.3 Análise de dissociação de alta resolução - Sensível à Metilação (Methylation-
sensitive high resolution melting MS-HRM) ..................................................................... 42
3.13 Análises estatísticas ...................................................................................................... 43
4 RESULTADOS ................................................................................................................ 44
4.1 Baixas concentrações do extrato de C. subedentata não promove citotoxicidade nas
células SH-SY5Y .................................................................................................................. 44
4.2 Alcaloides de C. subedentata apresentaram atividade inibitória da rAChE em estudos de
Docking Molecular in Silico .................................................................................................. 45
4.3 C. subedentata possui atividade inibitória da acetilcolinesterase ................................... 47
4.4 Resultados do teste de sobrevivência clonogênica ......................................................... 47
4.5 Indução de diferenciação das células SH-SY5Y pelo extrato de C. subedentata e
galantamina ........................................................................................................................... 49
4.6 Análise de morte celular .................................................................................................. 49
4.7 Avaliação mitocondrial por MET ................................................................................... 51
4.8 Efeito protetor do extrato de C. subedenta e a galantamina sobre a desestabilidade
genética induzida pelo o peptídeo Aβ(1-42) ............................................................................ 52
4.9 Avaliação do efeito neuroprotetor do extrato de C. subedenta e a galantamina sobre os
danos induzidos ao DNA pelo o peptídeo Aβ(1-42) ................................................................ 53
4.10 Status de metilação das ilhas CpGs nas regiões promotoras dos genes associados ao
processamento da proteína precursora amiloide (APP) ........................................................ 54
5 DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 56
6 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 74
BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................... 75
ANEXOS ................................................................................................................................. 96
14
1 INTRODUÇÃO
1.1 Doença de Alzheimer
A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa progressiva crônica
multifatorial, caracterizada pela deterioração irreversível das funções como a memória,
linguagem e outras funções cognitivas (Selkoe, 2002; Mattson, 2004; Kumar e Singh, 2015).
Após os 65 anos de idade, o risco de se desenvolver a doença dobra a cada 5 anos e alguns
estudos sugerem que em torno dos 85 anos, aproximadamente 50% dos indivíduos
desenvolverão a enfermidade (Felsenstein et al., 2014). Mundialmente, um novo caso
acontece a cada sete segundos; a doença tem se tornado uma lenta pandemia (Ferri et al.,
2006) e para o ano de 2050 espera-se que um em cada 85 indivíduos sofra da DA
(Brookmeyer et al., 2007). As alterações patológicas no cérebro de um paciente com
Alzheimer podem começar vinte anos antes ou mais dos sintomas clínicos se manifestarem
(Reiman et al., 2012) e o diagnóstico da doença está baseado no histórico clínico e familiar do
paciente, além do desempenho cognitivo em vários testes psicométricos. No entanto, o
diagnóstico definitivo pode ser feito somente com a autopsia.
Neuropatologicamente o cérebro de pacientes com a doença apresenta dois marcadores
que definem as características neuropatológicas da enfermidade: as placas neuríticas (PNs)
extracelulares e os novelos neurofibrilares (NNFs) intracelulares (Chong et al., 2005; Lilja et
al., 2013). As PNs são formadas pela autoagregação do peptídeo beta-amiloide1-42 (Aβ(1-42)),
um peptídeo derivado da clivagem sequencial da proteína precursora amiloide (PPA) pela
ação de várias secretases (Hartmann et al., 1997; Ashe e Zahs, 2010). Um evento na DA é a
conversão do peptídeo Aβ(1-42) da forma solúvel à forma agregada (Selkoe, 1997).
Inicialmente a hipótese original atribuía a DA à presença do peptídeo Aβ(1-42) insolúvel nas
PNs (Hardy e Higgins, 1992; Joachim e Selkoe, 1992), porém há mais de dez anos que tal
hipótese foi modificada, com a sugestão do que os oligômeros solúveis do peptídeo Aβ
originados pelo processamento anormal da PPA, são mais tóxicos que as PNs (Klein, 2002;
Selkoe, 2002; Lacor et al., 2007; Rosenblum, 2014).
Os depósitos intracelulares dos novelos neurofibrilares (NNFs) estão formados pela
associação da proteína tau hiperfosforilada aos microtúbulos; o que leva à dissociação da
tubulina e os microtúbulos, resultando assim em colapso da rede de transporte cerebral. Em
seu estado fisiológico, as proteínas tau se associam com a tubulina na formação de
microtúbulos os quais conferem forma e estrutura à célula e geram redes de transporte celular
15
para movimentação dos micronutrientes, neurotransmissores e organelas (Goedert et al.,
1991; Iqbal et al., 1998). De acordo com o modelo da proteína tau, os NNFs se correlacionam
positivamente com a severidade da doença (Tiraboschi et al., 2004). Nas condições de
Alzheimer, as modificações estruturais provocadas pela hiperfosforilação de tau interferem no
funcionamento normal dos neurônios, acarretando perda de atividade biológica e morte
celular (Iqbal et al., 1989; Arias et al., 2005). Essas alterações em tau enfraquecem as
ligações que estabilizam os microtúbulos e geram agregação da proteína entre os neurônios.
Mesmo assim, a hiperfosforilação pode levar a defeitos no fuso mitótico e resultar em
aneuploidias para um número de cromossomos, incluindo o cromossomo 17, o que torna uma
expressão anormal de genes como TAU associados ao Alzheimer (Thomas e Fenech, 2006).
1.2 O peptídeo beta-amiloide (1-42) na patogênese da doença de Alzheimer
Muitas hipóteses tentam explicar os depósitos extracelulares do peptídeo Aβ(1-42) que
podem estar associados ao início da cascata de eventos neurodegenerativos que resultam na
disfunção sináptica, declínio cognitivo, perda neuronal e atrofia cerebral (Price et al., 1991;
Billings et al., 2005; Samanta et al., 2006).
De acordo com a hipótese amiloide, a DA começa com o processamento anormal da
PPA, que sofre clivagem por β e γ secretases em uma via amiloidogênica. Esse processo
origina uma família de peptídeos Aβ, entre eles Aβ(1-40) e Aβ(1-42). Aβ(1-42) é mais insolúvel e
forma agregados fibrilares que originam as PNs características da doença (Mori et al., 1992;
Roher, A. et al., 1993; Roher, A. E. et al., 1993; Giliberto et al., 2009; Bulbarelli et al., 2012;
Weiner et al., 2012). Em condições fisiológicas a PPA, uma proteína de superfície celular
com comprimento de 695-770 aminoácidos é clivada pela α e γ secretase, originando um
fragmento peptídico não neurotóxico de 40 aminoácidos, conhecido como P3 (Selkoe, 2001).
Porém, na via amiloidogênica, o peptídeo Aβ(1-42) é gerado pela clivagem sequencial da PPA
por β e γ secretases (Figura 1). A β secretase tem sido identificada como a enzima BACE1 e
a γ secretase é um complexo proteico formado por presenilina 1 (PSEN1), presenilina 2
(PSEN2), nicastrina (Nct) e presenilina enhancer-2 (Pen2), necessários para uma atividade
proteolítica eficiente (Sun et al., 2005; Giliberto et al., 2009).
16
P3
Aβ(1-40)
Placa neurítica
APP
COOHNH2
α-secretase
γ-secretasePS1 PS2
Pn2 Nct
687∕688
772∕774 ∕775
sAPPα
β-secretase
γ-secretase
Aβ(1-42)
671∕672
712∕714 ∕715
sAPPβ
PS1 PS2
Pn2 Nct
Figura 1- Processamento fisiológico e amiloidogênico da PPA. Na via fisiológica a proteína PPA é
processada pela clivagem sequencial das α e γ secretases originando fragmentos de 40 aminoácidos,
entretanto, na via amiloidogênica a clivagem sequencial é feita pelas β e γ secretases originando
diferentes fragmentos amiloides entre eles o fragmento Aβ de 42 aminoácidos, os quais formam as
placas neuríticas. Fonte: (Castillo et al.; 2016).
Ainda que a patologia da DA permaneça desconhecida, muitos estudos têm sido
propostos para explicar a relação entre o acúmulo do peptídeo, alterações dos microtúbulos
pela proteína tau e o estresse oxidativo (Mattson, 2004; Mohmmad Abdul et al., 2006;
Praticò, 2008). Alguns estudos sugerem que metais como o Cu+2
e Fe+3
participem do
mecanismo de estresse oxidativo induzido pelo peptídeo Aβ(1-42) através de seu potencial
redox. A transferência de um só elétron do peptídeo para o metal poderia resultar na formação
de um radical livre (RL) peptídico, o qual se torna uma possível explicação para a formação
de radicais Aβ (Varadarajan et al., 2000; Varadarajan et al., 2001). Mesmo assim, a interação
entre o peptídeo Aβ(1-42) e íons metálicos podem gerar espécies reativas de oxigênio (EROs)
como H2O2 que medeia a neurotoxicidade celular (Tabner et al., 2002; Boyd-Kimball et al.,
2004; Smith et al., 2007). Além disso, o estresse oxidativo e os mecanismos neurotóxicos
associados à produção de radicais Aβ têm sido associados ao resíduo metionina na posição 35
do peptídeo Aβ(1-42) (Vogt, 1995; Varadarajan et al., 2001; Butterfield e Kanski, 2002;
Kadlcik et al., 2004). É relatado que o peptídeo Aβ(1-42) tipo selvagem e seu derivados
oxidados levam uma metionina sulfóxido na posição 35 responsável pela formação fibrilar e
pela atividade tóxica, mesmo assim, derivados do peptídeo Aβ(1-42) mutados na posição 35 do
aminoácido apresentam reduzida agregação do peptídeo e toxicidade menor (Seilheimer et al.,
1997).
De acordo com a teoria do estresse oxidativo, a morte neural é consequência dos RL que
se ligam e mudam a arquitetura estrutural das moléculas lipídicas dos neurônios. Neste
17
modelo, pequenos agregados solúveis do peptídeo Aβ(1-42) poderiam ser inseridos na camada
lipídica da membrana celular dos neurônios e das células gliais, gerando então estresse
oxidativo, incluindo peroxidação lipídica, oxidação de proteinase e dano no DNA
(Varadarajan et al., 2000; Butterfield e Lauderback, 2002; Chang et al., 2014; Lee et al.,
2014; Tranah et al., 2014). Contudo, as mudanças patológicas incluem outras alterações
biológicas como perda sináptica, inflamação e morte neuronal resultantes de uma
vulnerabilidade ao estresse e ao dano oxidativo (Butterfield et al., 2002; Petrozzi, L. et al.,
2002; Thomas et al., 2009). Apesar disso, o mecanismo exato pelo qual o peptídeo Aβ(1-42,)
predomina como causador da neurotoxicidade é ainda desconhecido (Varadarajan et al., 2001;
Drake et al., 2003; Anand et al., 2014; Kumar e Singh, 2015).
O processo pelo qual Aβ induz estresse oxidativo é essencial na associação do peptídeo
Aβ com o modelo de RL para a neurodegeneração na DA (Varadarajan et al., 2000;
Butterfield e Lauderback, 2002). Em virtude disso, a prevenção da agregação das placas Aβ
tem sido proposta como uma estratégia terapêutica primária para o tratamento de doenças
neurodegenerativas como Alzheimer (Butterfield et al., 2002; Liu et al., 2005). Porém,
estudos recentes sugerem que os oligômeros do peptídeo Aβ(1-42) são mais tóxicos do que seus
agregados monoméricos ou fibrilares e ainda os mecanismos moleculares que levam à doença
não estejam muito bem entendidos, evidência suficiente sobre o papel do estresse oxidativo e
disfunção mitocondrial com a DA são reconhecidos como eventos precoces no
desenvolvimento da doença (Chen e Yan, 2006; Rosenblum, 2014; Kaur et al., 2015). Têm se
demonstrado também que o peptídeo Aβ(1-42) da camada lipídica pode acessar a matriz
mitocondrial e seu acúmulo crescente induzir estresse mitocondrial, interferindo na atividade
enzimática, originando uma via importante na DA (Chen e Yan, 2006; Mossmann et al.,
2014).
1.3 Fatores de risco para a Doença de Alzheimer
Estudos neuropatológicos demonstram que a maioria dos indivíduos diagnosticados
com a DA esporádica não apresenta DA ״pura", o que significa que a prevalência de
comorbidade para enfermidades que contribuem para a deterioração cognitiva aumenta com a
idade avançada (Carrillo et al., 2013). A DA pode ser classificada baseada na idade de início,
como: DA de início precoce e DA de início tardio. A DA de início precoce acontece
aproximadamente em 1% a 6% de todos os casos e manifesta-se mais ou menos entre os 30 e
60 anos, enquanto a DA de início tardio representa cerca do 90% dos casos e tem uma idade
18
de início após os 60 anos de idade (Anand et al., 2014). Embora o maior fator de risco seja a
idade avançada, outros fatores também estão relacionados, como: histórico familiar,
traumatismo craniano, gênero feminino, depressão anterior, diabetes mellitus, hiperlipidemia,
fatores vasculares e estresse oxidativo (Kivipelto et al., 2001; Perry et al., 2002; Luchsinger et
al., 2005; Bonda et al., 2010; Kaur et al., 2015). No entanto, sabe-se que muitos fatores de
risco que contribuem para o desenvolvimento das demências na vida tardia são modificáveis
(Carrillo et al., 2013). Por outro lado, com exceção da mutação do peptídeo β amiloide (Aβ)
nenhum desses fatores moleculares e genéticos parece prevalecer na causa da doença. Muitos
indivíduos podem ter os mesmos fatores de risco para a DA, expressar a Aβ alterada, além das
alterações na proteína tau e nunca desenvolver a patologia; o que permite considerar que estes
mecanismos junto à associação genética por si só não conseguem explicar a suscetibilidade
para desenvolver a doença (Lue et al., 1996; Bertram et al., 2010; Hamza e Payami, 2010;
Morris et al., 2014). Epigenética, genética e fatores ambientais ainda precisam ser
identificados para entender melhor o desenvolvimento dessa doença neurodegenerativa
(Iraola‐Guzmán, S. et al., 2011).
1.4 Fatores genéticos
Mutações em genes da proteína precursora amiloide (PPA) localizado no cromossomo
21(21q21), presenilina 1(PSEN1) localizado no cromossomo 14 (14q24.3) e presenilina
2(PSEN2) localizado no cromossomo 1(1q31-q42) são conhecidas por predispor a DA de
início precoce. Formas mutantes nesses genes induzem um aumento na produção do peptídeo
Aβ(1-42) e o desequilíbrio entre produção e degradação do mesmo origina o fenótipo clínico e
histopatológico associado com a DA (Demetrius et al., 2015).
A DA de início tardio, não parece ser influenciada pelos mesmos genes implicados na
doença de início precoce, porém o polimorfismo APOEε4 do gene APOE localizado no
cromossomo 19 (19q13.2) está associado com a DA de início tardio (Roses, 1997). O gene
APOE não causa a DA, mas parece atuar como marcador de susceptibilidade que altera o
risco individual para o desenvolvimento da doença, com a sugestão de que o alelo APOEε4
facilita a agregação e os depósitos do peptídeo Aβ (Corder et al., 1993; Holtzman et al.,
2000). Segundo as pesquisas estima-se que entre 40% e 65% dos pacientes diagnosticados
com a DA apresentam uma ou duas cópias do alelo APOEε4 (Farrer et al., 1997). Embora os
mecanismos que fundamentam a natureza patogênica de APOE na DA não estejam ainda
19
completamente compreendidos, novos dados sugerem que APOE contribui para a doença por
ambas as vias dependente e independente do peptídeo Aβ (Yu et al., 2014).
1.5 Fatores epigenéticos
Nas últimas décadas, diferentes hipóteses têm tentado explicar a etiologia da DA; no
entanto, nenhuma delas consegue elucidar de forma satisfatória as causas que a desencadeiam.
Doenças neurodegenerativas como Alzheimer são resultado da interação complexa entre
fatores genéticos e ambientais (Iraola‐Guzmán, S et al., 2011; De Bem et al., 2016; Marczylo
et al., 2016) (Figura 2). A influência dos fatores ambientais regulados por mecanismos
epigenéticos podem se iniciar durante o desenvolvimento embrionário e continuam
modificando o risco durante a vida toda (Calvanese et al., 2009; Lahiri e Maloney, 2010;
Sanchez-Mut et al., 2016).
Figura 2- Hipóteses associadas à Doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer seria o resultado da
interação entre fatores genéticos e epigenéticos modulados pelo ambiente.
O termo epigenética se refere às modificações herdáveis na expressão de genes, sem
alterar necessariamente a sequência de nucleotídeos no DNA (Mastroeni et al., 2011;
Babenko et al., 2012). Esses efeitos são tipicamente acompanhados pela inibição da
transcrição, levando à repressão ou silenciamento gênico; e de efeito oposto, a liberação da
repressão epigenética pode aumentar a expressão gênica (Wilson e Jones, 1983;
Bandyopadhyay e Medrano, 2003; Fraga e Esteller, 2007; Fuso et al., 2011). A metilação do
20
DNA é um dos mecanismos mais importantes de silenciamento epigenético e ocorre pela
adição de um grupo metil na posição 5` da citocina, nos sítios citosina-fosfato-guanina (ilhas
CpG) (Razin e Riggs, 1980; Herman e Baylin, 2003; Aguilera et al., 2010).
Aproximadamente 70% dos promotores gênicos com ilhas CpG encontram-se usualmente
desmetilados em células normais (Jones e Takai, 2001; Saxonov et al., 2006; Weber et al.,
2007; Barrachina e Ferrer, 2009).
Por muitos anos pensou-se que a metilação do DNA era um processo estável e
irreversível e que as mudanças nos modelos de metilação aconteciam somente durante
períodos críticos na embriogênese (Razin e Riggs, 1980); contudo, novos dados sugerem que
a metilação do DNA é um processo dinâmico no decorrer da vida (Levenson et al., 2006;
Miller e Sweatt, 2007); acompanhada por uma perda global da metilação à medida que se
envelhece (Vanyushin et al., 1973; Fuke et al., 2004; Babenko et al., 2012). Os padrões de
metilação são altamente específicos para cada tecido; o cérebro em particular, mostra um
aumento elevado na taxa de metilação quando comparado com outros tecidos (Gama-Sosa et
al., 1983; Tawa et al., 1990; Fraga et al., 2005; Hernandez et al., 2011). Mesmo assim, o
cérebro de um paciente com a DA apresenta certos promotores de genes associados à doença
com patrões epigenéticos desmetilados (West et al., 1995; Bertram et al., 2010). A natureza
dinâmica das marcas epigenéticas e sua participação em processos adaptativos, idade,
diferenciação celular e reposta aos estímulos externos, fazem da epigenética um caminho
promissor para entender a etiologia de doenças complexas como o Alzheimer e desenvolver
novas estratégias terapêuticas (Takizawa et al., 2001; Meissner et al., 2008; Heijmans et al.,
2009; Bernal e Jirtle, 2010; Hernandez et al., 2011; Iraola‐Guzmán, S et al., 2011).
1.6 O sistema de neurotransmissão colinérgica no cérebro
Outra característica importante no cérebro de pacientes com a DA é a perda dos
neurônios colinérgicos e os receptores nicotínicos da acetilcolina (nAChRs), os quais atuam
como neuromoduladores nos processos cognitivos regulados por diferentes
neurotransmissores (Giacobini et al., 1991; Nordberg, 2001). As alterações no sistema
colinérgico na DA acontecem em diferentes níveis, incluindo decréscimo na biossíntese de
acetilcolina (ACh), atividade acetilcolina transferase, redução no metabolismo de colina e
desregulação da função dos receptores da acetilcolina (AChRs) (Slotkin et al., 1990;
Jürgensen e Ferreira, 2010; Xu et al., 2012). Há evidência substancial de que o peptídeo Aβ(1-
42) afeta a função dos nAChRs. Entre essas alterações, uma significante redução nos níveis das
21
subunidades proteicas α3, α7 e β2 dos nAChRs tem sido observada em linhagens celulares
expostas ao peptídeo (Guan et al., 2001; Qi et al., 2005). A deterioração progressiva do
sistema colinérgico, junto com as evidências farmacológicas dos inibidores da
acetilcolinesterase (AChEIs), levam ao desenvolvimento da hipótese colinérgica, amplamente
aceita e se torna evidente pela utilização de drogas como donepezil, rivastigmina e
galantamina, as quais atuam como AChEIs, acrescentando a concentração de ACh entre a
fenda sináptica ou modulando alostericamente os nAChRs como potentes ligantes (Eisele et
al., 1993; Rogers e Friedhoff, 1996; Polinsky, 1998; Maelicke e Albuquerque, 2000; Arias et
al., 2005; Matsuzono et al., 2015).
1.7 O sistema glutamatérgico no cérebro
A neuropatologia de Alzheimer também atinge o sistema glutamatérgico nos últimos
estágios da doença (Anand et al., 2014). O glutamato encontra-se em altas concentrações no
sistema nervoso, bem como o maior neurotransmissor excitatório no hipocampo e na região
neocortical do cérebro. O neurotransmissor é liberado em milissegundos das terminações
nervosas de maneira dependente do Ca2+
. Uma vez na fenda sináptica, difunde-se e interage
com receptores pós-sinápticos de um neurônio adjacente. A membrana pós-sináptica
apresenta alta densidade de um de seus receptores o N-metil-D-apartato (NMDA). A atividade
do glutamato na fenda sináptica é cuidadosamente equilibrada pela inativação do receptor e
recaptação do neurotransmissor (Maragakis e Rothstein, 2001). O glutamato exerce um papel
importante nos processos da memória, cognição, aprendizado, desenvolvimento e plasticidade
da sinapse; porém, estudos mostram que na DA existe um excesso extracelular, resultado de
um aumento na liberação pré-sináptica e uma diminuição na recaptação, o que leva a uma
ativação tônica dos receptores NMDA (Revett et al., 2013).
Evidencias têm mostrado uma interação entre receptores NMDA e o peptídeo Aβ(1-42)
levando à ativação dos receptores NMDA e à produção de oligômeros Aβ peptídicos
(Dinamarca et al., 2012; Revett et al., 2013). O Mg+2
bloqueia os canais NMDA em
condições fisiológicas; porém, quando o glutamato está disponível o bloqueio é liberado, os
canais NMDA abertos e os ions Mg+2
são excluídos para permitir o fluxo continuo de Ca+2
através da membrana que, por sua vez, ativa o óxido nítrico sintetase neural (nNOS) com a
geração de EROs (Gunasekar et al., 1995; Ota et al., 2015). A hiperestimulação dos
receptores NMDA leva à morte celular por necrose; ao mesmo tempo em que, a estimulação
leve ou crônica induz morte por apoptose, ambas as mortes sendo associadas com
22
desregulação mitocondrial (Ankarcrona et al., 1995; Bonfoco et al., 1995).
Farmacologicamente, o bloqueio dos receptores NMDA pela memantina um antagonista
competitivo dos receptores NMDA inibe a ativação e exitotoxicidade dos receptores,
exercendo neuroproteção e melhorando o déficit da memória (Danysz et al., 2000; Chen e
Lipton, 2006; Parsons et al., 2007; Bordji et al., 2010). A eficácia farmacológica da
memantina está aprovada para a DA na etapa de moderada à severa, mostrando benefícios
cognitivos globais, embora não impede a progressão da doença. A falta de benefício da
memantina nas primeiras fases da doença não está muito bem entendida, talvez porque a
defasagem colinérgica acontece muito antes do dano no sistema glutamatérgico e na
degeneração citotóxica (Ni et al., 2013).
1.8 A linhagem celular SH-SY5Y como modelo biológico para a doença de Alzheimer
Estudos para elucidar os mecanismos que relacionam a idade humana e algumas
doenças a ela associadas, são usualmente dificultados pela falta de um modelo que permita
recriar os eventos que acontecem na população humana. Porém, as células SH-SY5Y são um
terceiro subclone obtido da linhagem parental SK-N-SH a qual foi estabelecida inicialmente
de uma biópsia de medula óssea de neuroblastoma de um paciente do sexo feminino. O
neuroblastoma humano é um dos tumores sólidos mais comuns em crianças e acredita-se que
seja originado a partir das células da crista neural durante o desenvolvimento embrionário.
Devido à sua origem, estas células apresentam uma importante plasticidade biológica
(Ciccarone et al., 1989). A linhagem parental SK-N-SH origina dois fenótipos morfológicos e
bioquimicamente distintos: uma forma não neuronal (tipo-S) aderente a um substrato que leva
ao subclone SH-EP (como epitelial) e uma linhagem neuroblástica (tipo-N), que leva ao
subclone SH-SY5Y como neuroblasto.
A B
Figura 3- Células SH-SY5Y indiferenciadas (A) e diferenciadas (b). Tanto as células diferenciadas
quanto as indiferenciadas são amplamente utilizadas na neurociência (imagem captada através de
objetiva de 40X).
23
Entre as características mais importantes das células SH-SY5Y está sua capacidade para
diferenciar-se em um fenótipo neuronal funcionalmente maduro (Figura 3) (Yusuf et al.,
2013), além de expressar enzimas biossintéticas noradrenérgicas, receptoras para o fator de
crescimento nervoso, opióide e muscarínico (Rettig et al., 1987; Sadee et al., 1987). Essas
propriedades têm feito destas células uma ferramenta importante e alternativa às limitações
experimentais causadas pela inabilidade de neurônios primários de serem propagados in vitro
(Yusuf et al., 2013). As células SH-SY5Y diferenciadas e não diferenciadas têm sido
utilizadas como modelo neuronal desde 1980 para avaliar doenças como Parkinson,
Alzheimer, doenças do desenvolvimento neuronal, autismo, metabolismo mitocondrial e
defesa de antioxidantes (Constantinescu et al., 2007; Häbig et al., 2008; Agholme et al., 2010;
Schneider et al., 2011; Yasui et al., 2011). No entanto, existe controvérsia sobre a necessidade
de diferenciar ou não as células SH-SY5Y. Alguns estudos sugerem que a diferenciação
confere às células SH-SY5Y uma tolerância maior frente aos diferentes estímulos e, como
resultado, não é possível avaliar com precisão os efeitos de neurotoxicidade ou neuroproteção
(Tieu et al., 1999; Cheung et al., 2009; Lopes et al., 2010). Estudos focados no reparo por
excisão de bases (BER) têm mostrado que as células diferenciadas são mais sensitivas ao
dano oxidativo em comparação às indiferenciadas; o qual seria parcialmente devido à
atenuação do BER em neurônios pós-mitóticos como consequência do decréscimo nos níveis
proteicos dessa via (Sykora et al., 2013; Narciso et al., 2016). Em razão dessas ocorrências, as
células SH-SY5Y indiferenciadas tornam-se apropriadas para estudar a neurotoxicidade,
neuroproteção e a neurodiferenciação, recriando, portanto, eventos próximos aos acometidos
no cérebro (Cheung et al., 2009; Teppola et al., 2016). No entanto, as vantagens da linhagem
celular SH-SY5Y tanto indiferenciadas quanto diferenciadas nos estudos de doenças
neurodegenerativas, tornaram-nas um modelo clássico na descoberta de novos alvos
terapêuticos com grande significância biológica e clínica.
1.9 Tratamentos e estratégias na doença de Alzheimer
Embora a DA seja conhecida há mais de um século (Ramirez-Bermudez, 2012) e apesar
dos esforços intensos da ciência, não há um tratamento que modifique o curso da
enfermidade. Contudo, as estatísticas indicam um aumento exponencial no número de casos
com a doença, enfatizando a necessidade do desenvolvimento de um tratamento efetivo
(Henriksen et al., 2014). Devido à complexidade da doença e ao aumento da população com
idade avançada, a DA vem se tornando um problema de saúde pública do século XXI (Snyder
24
et al., 2014) e as terapias farmacológicas atuais fornecem apenas um tratamento sintomático,
sem conseguir alterar o curso da doença (Anand et al., 2014).
Atualmente as drogas aprovadas como tratamento para a DA (Tabela 1) incluem quatro
inibidores da acetilcolinesterase (AChEIs) ou inibidores colinérgicos: tacrina, donepezil,
rivastigmina e galantamina; além de um glutamatérgico: a memantina, um antagonista não
competitivo dos receptores N-metil D-Aspartato (NMDA) (Anand et al., 2014). Hoje em dia,
a tacrina é raramente usada pela sua hepatotoxicidade (Watkins et al., 1994). Porém, outros
candidatos farmacológicos dirigidos a diferentes estratégias terapêuticas estão em
desenvolvimento e muitos têm progredido em ensaios clínicos (Rafii et al., 2011; Reid et al.,
2011; Jia et al., 2013; Moss et al., 2013; Walker et al., 2015; Zheng et al., 2015). A limitação
na disponibilidade de fármacos para o tratamento da doença obedece às múltiplas vias
envolvidas na patogênese, criando dificuldade substancial para a produção de um tratamento
eficaz, e todos os fármacos anti-DA desenvolvidos desde 2003 têm falhado (Anand et al.,
2014). As doenças complexas como o Alzheimer, estão relacionadas à alteração em diferentes
redes e raramente são causadas pela disfunção em um único gene ou em uma única via de
sinalização (Zheng et al., 2015).
Tabela 1- Fármacos aprovados pela FDA para a sintomatologia da Doença de Alzheimer.
Fármacos
AChEIs Glutamatérgico
Tacrina: (Cognex®) Memantina: (Cloridrato de memantina)
Rivastigmina: (Exelon®)
Donepezil: (Aricept®)
Galantamina: (Reminyl®)
AChEi: Inibidores da acetilcolinesterase com seu nome comercial.
Até agora, muitas das drogas tanto para DA quanto para outras doenças neurológicas
têm apresentado uma abordagem farmacológica reducionista, isso é, ação de uma droga para
um alvo central (Bolognesi et al., 2009), conhecido com o nome de “uma doença um alvo”
(Morphy et al., 2004) ou “um gene um alvo ou uma droga” (Hopkins, 2008). Porém, devido à
etiologia multifatorial da doença, os ligantes dirigidos a múltiplos alvos (LDMAs) são um
método promissor na pesquisa de novas drogas para Alzheimer (Guzior et al., 2015). Uma das
fontes promissórias de LDMAs é a área dos produtos naturais e entre eles os compostos
botânicos, relevantes não só em número, mas também em metabolitos químicos são
considerados fonte importante para o desenvolvimento de novas substâncias farmacológicas
(Agis-Torres et al., 2014). A combinação farmacológica é um campo promissor onde a
25
combinação de dois compostos diferentes e independentes se ligam covalentemente formando
um composto híbrido, no qual a potência farmacológica é maior que a potencia expressa por
cada um de forma individual (Müller-Schiffmann et al., 2012). É bem conhecido que o efeito
sinérgico obtido pela combinação de diferentes compostos interfere simultaneamente num
circuito biológico definido, o que pode acrescentar a bio-habilidade de cada composto no
mesmo alvo (Müller-Schiffmann et al., 2012). Em consequência, os extratos botânicos com
longo histórico de uso entre as populações humanas, podem prover uma nova forma de
estratégia potencialmente segura como terapia profilática na melhora cognitiva ou na
antidemência ao mesmo tempo em que se tornam referência para a síntese de novos análogos
químicos (Perry e Howes, 2011; Libro et al., 2016).
Nos últimos anos, o sequenciamento do genoma humano tem levado ao aumento no
número de novos alvos terapêuticos para a pesquisa farmacêutica. Os estudos cristalográficos
de alta eficiência e os métodos de ressonância magnética têm contribuído para o
desenvolvimento e a aquisição de estruturas atômicas tanto das proteínas quanto de
complexos ligante-proteína, com níveis crescentes de detalhes (Gore e Desai, 2014; De Ruyck
et al., 2016). Contudo, o entendimento molecular da patologia e o estudo minucioso de
possíveis agentes com propriedades protetoras tornam os avanços computacionais uma
valiosa ferramenta na descoberta de fármacos. Conhecida a estrutura tridimensional de um
alvo, técnicas computacionais como o Desenho de Drogas Baseado na Estrutura (DDBE) são
utilizadas para a procura ou desenho de inibidores moleculares. Vários algoritmos têm sido
desenvolvidos para analisar a estrutura e função de proteínas, identificação de ligantes que
interagem, resíduos do sitio ativo e para estudar as interações proteína-ligando que podem
eventualmente levar à identificação de novas drogas (Gore e Desai, 2014).
O screening virtual mais usado no DDBE é o docking molecular in silico, o qual teve
seus inícios nos anos 70 (docking rígido) e nos últimos anos tem se aprimorado com técnicas
que permitem conhecer e modelar mudanças de interações recorrentes na geometria interna
dos complexos formados (De Ruyck et al., 2016). Os métodos DDBE exigem o conhecimento
sobre a estrutura tridimensional do alvo, enquanto as abordagens baseadas no ligante usam as
informações de no mínimo um ligante conhecido (Figura 4). Ambos, o alvo e o ligante com
sua conformação tridimensional são obtidos das diferentes bases de dados existentes para tal
finalidade. A concepção in sílico, envolve a identificação da proteína alvo que é responsável
pelo desenvolvimento da doença sob estudo (Gore e Desai, 2014).
26
Identificação de
princípios ativos
Isolar
Screening virtual
Enzima responsável
pela patologia
Doença de
Alzheimer
Docking Molecular
Validação
Fármaco
Figura 4-Modelo de Screening virtual de ligantes como potenciais inibidores de proteínas
associadas com doenças. As plantas são a principal fonte de metabolitos com diversos princípios
ativos, os quais podem ser testados através do docking molecular como possíveis inibidores de
proteínas.
A estrutura tridimensional da proteína pode ser prevista utilizando a modelagem de
homologia, enquanto o docking molecular é aplicado para estudar a interação de uma
molécula da droga (ligante) com a proteína. A melhor orientação da estrutura ligando-proteína
ancorada que tem energia mínima global precisa ser obtida. Os métodos em sílico podem ser
utilizados para identificar potenciais medicamentos para várias doenças. Assim, o desenho de
drogas assistido por ferramentas computacionais tornou-se uma parte indispensável e
integrante do processo de descoberta de drogas(Gore e Desai, 2014), uma vez que permite
direcionar a pesquisa farmacêutica.
1.10 Alcalóides das Amaryllidaceaes, a Galantamina
Estudos epidemiológicos evidenciam que é possível, mediante a suplementação com
agentes quimiopreventivos, prevenir o câncer e outras doenças crônicas, que apresentam um
mecanismo patogênico comum, como dano ao DNA, estresse oxidativo e inflamação crônica
(De Flora e Ferguson, 2005). A Organização Mundial da Saúde (OMS) tem mostrado um
aumento na utilização das plantas na medicina moderna desde que mais de 50.000 espécies
têm sido utilizadas na fitoterapia contemporânea e na medicina alopática moderna, tendo
27
como objetivo comum a identificação de compostos bioativos com princípios farmacêuticos
(Fredyc et al.; K Julsing et al., 2007; Tasheva e Kosturkova, 2012).
Devido ao impacto gerado pela DA e pelas múltiplas vias que estão alteradas, procurar
novos compostos terapêuticos nos vegetais é um desafio para a medicina moderna.
Consequentemente, 75% da população mundial utiliza as plantas medicinais, das quais o uso
tradicional fundamenta-se nos extratos totais. Além disso, tem-se publicado que os extratos
totais apresentam um melhor sistema bioprotetor devido à interação sinérgica de seus
compostos ativos, o que potencializa a ação de um metabolito (Bergman et al., 2001;
Calderón-Segura et al., 2004; Calderón-Segura et al., 2007; Wu et al., 2011).
Entre os agentes vegetais com potencial terapêutico para a DA, encontra-se as plantas
pertencentes à família Amaryllidaceae, grupo de monocotiledôneas composta por
aproximadamente 80 gêneros, distribuída em 1100 espécies e ocupando uma ampla região nos
trópicos e zonas equatoriais da terra. Estes grupos de plantas têm recebido muita atenção
recentemente por sua ampla atividade farmacológica ao ter os 20 alcaloides mais importantes;
entre eles, a galantamina (Elgorashi et al., 2006; Unver, 2007; Cortes, Posada-Duque, et al.,
2015). Porém, em adição à galantamina, essa família produz uma série de alcaloides únicos,
chamados alcaloides das Amaryllidaceae, os quais exibem uma ampla bioatividade como
antiviral, antineoplásico, anti-bacterial, antifúngico (Zhu et al., 2015). Contudo, a atividade
como AChEI é a mais relevante (Eriksson et al., 2012; Cortes, Posada-Duque, et al., 2015), e
isso tem motivado a procura de novos alcaloides derivados das Amaryllidaceaes como
possíveis AChEI.
A galantamina comercializada com o nome genérico de Remynil® foi o primeiro dos
alcaloides derivado das Amaryllidaceaes (Leucojum spp., Narcissus species, Galanthus spp) a
ser aprovado em muitos países como medicamento no tratamento de uma doença humana
como Alzheimer (Heinrich e Lee Teoh, 2004). No entanto, seu histórico farmacológico
mostra que vem sendo usada em toda a Europa Oriental desde 1950 para o tratamento de
dores neurológicos e poliomielites (Marco e Carreiras, 2006). A galantamina apresenta um
mecanismo de ação duplo, combinando a modulação alostérica dos receptores nicotínicos
com a inibição competitiva reversível da AChE (Mulder et al., 2005; Marco-Contelles et al.,
2006; Wang et al., 2007). Adicional aos efeitos colinérgicos, a galantamina contem
propriedades antioxidantes, neuroprotetoras e ação antiapoptótica (Arias et al., 2004; Arias et
al., 2005). O alcaloide estimula a atividade colina acetiltransferase e potencializa a liberação
do neurotransmissor ACh, o que aumenta sua concentração nas fendas sinápticas por ligar-se
ao sítio ativo da AChE evitando a degradação do neurotransmissor (Arias et al., 2004;
28
Villarroya et al., 2007) ao mesmo tempo em que interage alostericamente com os nAChRs
para potencializar a sensibilidade dos receptores a ACh, a fim de melhorar a cognição nos
pacientes como a DA (Woodruff-Pak et al., 2001; Wang et al., 2007; Tsvetkova et al., 2013).
O efeito da galantamina, no entanto, não pode ser exclusivamente correlacionado com
seu papel como AChEI (Raskind et al., 2004). Sabe-se que além de modular os receptores
nicotínicos, a galantamina também modula o sistema colinérgico muscarínico e reduz os
níveis do peptídeo Aβ(1-40) e Aβ(1-42) em culturas celulares e no líquido cefalorraquidiano ao
interagir diretamente com o peptídeo (Wolf et al., 1995; Raskind et al., 2004; Matharu et al.,
2009). Mais recentemente foi demonstrado que o tratamento crônico tolerável com
galantamina é capaz de degradar os depósitos de PNs em camundongos 5XFAD, além de
diminuir a gliose, correlacionada positivamente com a expressão de PNs (Bhattacharya et al.,
2014). A galantamina foi inicialmente aprovada para o tratamento de Alzheimer nos primeiros
estágios da doença; de leve a moderada; porém é demonstrado que o fármaco é capaz de
melhorar a cognição em pacientes com a doença em estágio severo (Burns et al., 2009).
Mesmo assim, a galantamina também promove a neurogênese hipocampal; mesmo que os
mecanismos exatos ainda não sejam conhecidos, acredita-se que possam estar influenciados
pela ativação dos nAChRs e mAChRs (Kita et al., 2014). Tem sido proposto que a
neurogênese poderia prover uma estratégia de defesa natural frente à neurodegeneração na
DA ao estimular as células tronco na maior zona neurogênica a zona subventricular no
ventrículo lateral ou no giro dentado do hipocampo (Lilja et al., 2013). Uma diminuição na
neurogênese no cérebro de pacientes com a DA seria consequência dos reduzidos níveis de
fatores neurotróficos e de crescimento, além de um acréscimo dos oligômeros do peptídeo
Aβ(1-42) durante a progressão da doença (Wicklund et al., 2010).
Entre as Amaryllidaceaes, a galantamina é o metabolito clássico com amplo potencial
terapêutico. No entanto, estudos recentes revelaram outros alcaloides com similar ou maior
capacidade como AChEI e antioxidantes em membros dessa família (López et al., 2002b; Jin
et al., 2014; Cortes, Alvarez, et al., 2015; Zhu et al., 2015). O gênero Caliphruria é pouco
abundante na natureza, conhecidas apenas quatro espécies distribuídas de forma restringida
em algumas regiões tropicais da América do Sul; as quais estão adaptadas a bosques úmidos e
com pouca luminosidade. Uma dessas espécies Caliphruria korsakofii (Traub) foi reportada
no Perú, enquanto as outras três: C. hartwegiana Herb, C. subedentata Baker e C. tenera
Baker, são espécies endêmicas da Colômbia, a última considerada extinta e as outras duas em
via de extinção (Walter e Gillett, 1998; Cabezas et al., 2013). Na Colômbia o gênero
Caliphruria encontra-se restringido geograficamente à Cordilheira Central e Ocidental nos
29
departamentos de Cauca, Valle, Cundinamarca e Huila (Cabezas et al., 2013). Em prévios
estudos fitoquímicos de C. subedentata (Figura 5) por métodos clássicos e pela técnica de
cromatografia de gases acoplados a espectrofotometria de massas (CG/EM) foram
identificados e caracterizados diferentes alcaloides (Figura 6) com grande valor terapêutico
entre eles galantamina e licorina (Codina et al., 2007; Cabezas et al., 2013).
a b
Figura 5- Caliphruria. subedenta, planta bulbosa pertencente à família das Amaryllidaceaes.
30
Figura 6- Estruturas químicas dos alcaloides relatadas para Caliphruria subedentata
Considerando o aumento da DA na população e devido à crescente demanda da
galantamina, novas pesquisas foram promovidas na última década com o intuito de buscar
novas fontes desta substância e de outros alcaloides com princípios bioativos que possam ter
efeitos promissores para a doença (Houghton et al., 2006; Feng et al., 2009; Andrade et al.,
2011; Cortes, Posada-Duque, et al., 2015). Neste sentido, a procura de novos fármacos a
partir de fontes naturais, fornece uma janela de oportunidades para a identificação de novas
estruturas químicas que por combinação possam atingir diversas redes biológicas envolvidas
em doenças multifatoriais como a doença de Alzheimer. Assim, por apresentar alcaloides tipo
galantamina e licorina, C. subedentata torna-se uma planta com grande valor para ser
explorada em estudos de neurotoxicidade e neuroproteção.
Desta forma, a hipótese deste trabalho se baseia nas informações mencionadas, de tal
forma que, se o extrato total de C. subedentata e a galantamina (Reminyl®) exercem
atividade neuroprotetora sobre a neurotoxicidade induzida pelo peptídeo Aβ(1-42), espera-se
uma diminuição nos danos induzidos pelo peptídeo quando avaliados pelos diferentes testes.
31
2 OBJETIVOS
Avaliar a capacidade neuroprotetora induzida pelo extrato total de Caliphruria
subedentata e o fármaco galantamina em células SH-SY5Y sob o estímulo neurotóxico
induzido pelo peptídeo Aβ(1-42), utilizando biomarcadores citogenéticos e moleculares.
2.1 Objetivos Específicos
Avaliar o efeito citotóxico do extrato de C. subedentata na linhagem celular SH-SY5Y.
Explorar o potencial inibitório da Acetilcolinesterase exercido pelo extrato de C.
subedentata.
Avaliar o efeito neurotóxico induzido pelo peptídeo Aβ(1-42) em células SH-SY5Y.
Determinar a capacidade neuroprotetora e antigenotóxica do extrato de C. subedentata e
da galantamina nas células SH-SY5Y expostas ao peptídeo Aβ(1-42).
Investigar se o efeito neuroprotetor do extrato total de C. subedentata e a galantamina
estão relacionados às mudanças nos perfis de metilação de genes envolvidos no
processamento da PPA.
32
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Extrato total de C. subedentata
O material fresco de C. subedentata foi coletado em janeiro de 2013, da coleção de
Amaryllidaceaes do Jardim botânico “Álvaro José Negret” pertencente à Universidad del
Cauca (Colômbia). O material vegetal foi identificado e um exemplar da espécie (No:
0027587) encontra-se depositado no herbário da mesma universidade.
O extrato etanólico foi preparado no Laboratório de Química de Compuestos Bioactivos
de la Universidad del Cauca (Colômbia). Os bulbos de C. subedentata Baker foram cortados,
moídos e posteriormente secos a 37°C em uma estufa com controle de temperatura. O pó foi
colocado num balão cônico contendo 0,25 L de etanol a 70%. Em seguida, a amostra foi
submetida à extração assistida por ultrasson (Branson 2510, Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis,
MO, EUA) por um tempo de 4 horas. O extrato obtido foi concentrado e secado sob vácuo a
40°C usando um evaporador rotativo (Rotavapor®, Buchi, Flawil Switzerland).
Posteriormente, o extrato foi depositado em um recipiente de cor âmbar e armazenado a -4°C
para logo ser diluído em água destilada e filtrado através de um filtro de membrana de 0.2 µm
(Millipore). Os alcaloides de C. subedentata foram previamente identificados pelo grupo de
Compuestos Bioactivos de la Universidad del Cauca (Colômbia) em conjunto com
pesquisadores do Laboratório de Química de produtos Naturales, Biología Vegetal y
Edafología da Universidad de Barcelona (España) através das técnicas de Cromatografia
Gasosa acoplada ao Espectro de Massas - GC-MS, Espetro Infravermelho e Espectro de
Ressonância magnética Nuclear (RMN) de 1H y
13C (Codina et al., 2007; Cabezas et al.,
2013).
3.2 Drogas
3.2.1 Peptídeo beta amiloide.
A metodologia para a preparação do peptídeo Aβ(1-42) (Sigma-Aldrich) foi a sugerida
pela literatura (Liu et al., 2005; Qi et al., 2005; Broersen et al., 2011). O peptídeo foi
dissolvido em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) 100% na concentração de 1 mg/mL e
sonicado em banho-maria por 10 minutos. Em seguida foram aliquotados em tubos de
microcentrifuga de 0,5 mL; secados ao vácuo e se armazenados a -20°C. Antes de ser usado
33
nos tratamentos celulares, o peptídeo foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) a 1 mg/mL
e incubado a 37°C por 72 h em meio de cultura antes de ser colocado no meio condicionado
com as células.
3.2.2 Galantamina
A solução estoque de galantamina (Remynil® de Janssen Pharmaceuticals) foi preparada
em metanol e dissolvida em meio DMEM/HAM-F10, seguindo uma metodologia
previamente reportada (Ezoulin et al., 2008). A concentração final de metanol no meio da
cultura foi de 1:100 (v/v).
3.3 Linhagem celular, condições da cultura e tratamentos
A linhagem celular SH-SY5Y foi adquirida comercialmente do Banco de Células do
Rio de Janeiro – BCRJ; cultivadas em meio HAM F10 + DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA); suplementado com 2 mM L-glutamina, 10% de Soro fetal bovino (Cultilab,
Campinas, SP, Brazil); 1% penicilina, 1% de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
USA) e mantidas em estufa a 37°C e 5% de CO2. Antes de iniciar os tratamentos, as células
foram subcultivadas até atingirem 60-70% de confluência (24 h). Para todos os experimentos
de neuroproteção tanto com o extrato quanto com a galantamina as células foram tratadas com
Aβ(1-42) (10 μM) por 24 h; depois desse período, o meio de cultura foi removido, as culturas
foram lavadas três vezes com PBS e se adicionou meio de cultura fresco com as respectivas
concentrações de C. subedentata ou galantamina e se incubaram por 24 h.
3.4 Ensaio de viabilidade celular XTT
A técnica de viabilidade celular pelo teste XTT (Assay-Cell Proliferation Kit II-XTT,
Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN, USA) é baseada na metabolização do sal
amarelo tetrazolium XTT resultando na formação de um corante formazan alaranjado. A
metabolização do sal acontece apenas em células viáveis que retém capacidade das enzimas
desidrogenase mitocondriais para reduzir o sal XTT (Roehm et al., 1991; Zhu et al., 2004).
As células SH-SY5Y foram semeadas em placas de 96 poços a uma concentração de
1x104 células∕poço, incubadas a 37°C. Uma vez estabelecidas as culturas celular (24 h), o
extrato de C. subedentata (6,2; 12,5; 25; 50; 100; 200; 400 e 800 µg/mL) foi adicionado a
34
cada poço e mantido por 24 h. Depois disso, as culturas foram lavadas e o meio de cultura
trocado para deixar em recuperação por 24 horas. Passado esse tempo, o meio foi retirado e as
células foram lavadas três vezes com PBS e incubadas por 4 h a 37°C com 10 µL de XTT (3
mg/mL) em cada poço. A leitura colorimétrica foi realizada em um espectrofotômetro e a
densidade óptica em termos da absorbância foi medida a 450 nm. Realizados os testes de
viabilidade, três concentrações do extrato foram definidas para continuar com os estudos de
neuroproteção. Na figura 7, se mostra de forma geral o esquema dos tratamentos utilizado. As
concentrações do peptídeo Aβ(1-42) 10 µM e as de galantamina (0.1, 1 e 10 µM) são as mesmas
reportadas previamente pela literatura (Mannens et al., 2002; Datki et al., 2004; Mohmmad
Abdul et al., 2006; Ezoulin et al., 2008).
10 μM
24 h com peptídeo Aβ(1-42)
24 h com C. subedentata ou
galantamina
Figura 7- Esquema dos tratamentos. Para verificar o efeito neurotóxico e neuroprotetor as células
foram incubadas 24 h com uma única concentração do peptídeo Aβ(1-42) 10 µM, seguido por 24 h de
incubação com concentrações do extrato de C. subedentata ou galantamina.
3.5 Ensaios de Docking molecular in silico para avaliação da atividade inibitória da
acetilcolinesterase humano (hAChE)
Os estudos de bioinformática foram realizados pelo laboratório de Bioinformática
coordenado pela Pra, Dr
a. Silvana Giuliatti.
3.5.1 Seleção de ligantes
Um conjunto de 5 alcaloides presentes no extrato de C. subedentata foram testados
através de docking molecular in silico para avaliar a possível atividade inibidora da AChE
humana (hAChE). As estruturas dos alcaloides ou ligantes foram obtidos a partir do
repositório público PubChem no formato de arquivo sdf (Kim et al., 2015).
Os sítios de ligação dos ligantes à enzima foram mapeados na estrutura cristalográfica
de hAChE, a qual foi recentemente resolvida por difração de raio-X, com resolução de 2.4 Å;
código de identificação PDB ID 4EY6 (Cheung et al., 2012). O docking molecular entre a
enzima hAChE e as moléculas de interesse foi realizado por meio da ferramenta
computacional Genetic Optimisation for Ligand Docking (GOLD) (Jones et al., 1997) e a
35
inspeção visual dos complexos de interação enzima-ligante foi avaliada por meio de
ferramentas computacionais DS Visualizer (http://accelrys.com/products/collaborative-
science/biovia-discovery-studio/) e Chimera 1.10.1 (Pettersen et al., 2004).
3.6 Determinações da inibição da acetilcolinesterase (AChEI)
Esta técnica baseia-se na hidrólise da acetilcolina pela enzima acetilcolinesterase para
produzir colina e acetato. A colina gerada reage com o composto ácido 5, 5´-ditio-bis-(2-
nitrobenzoico (DNTB) para produzir 2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina e ácido 5-tio-2-
nitrobenzoico, composto de cor amarela que apresenta um máximo de absorção a 405 nm
(Figura 8). AChE de Electrophorus electritus; iodeto de acetiltiocolina (ATCI); (DNTB) e a
fisostigmina foram obtidos de Sigma-Aldrich St.Louis, MO. A atividade inibitória da AChE
foi realizada usando o método colorimétrico de Ellman (Ellman et al., 1961), modificado por
Ingkaninan (Ingkaninan et al., 2003). Três concentrações do extrato de C. subedentata (6.2;
12.5; 25 μg/mL) foram testadas. Os tampões usados no ensaio foram preparados como segue:
tampão A (50 mM Tris HCl, pH 8), tampão B (50 mM Tris HCl, pH 8, contendo 0.1 % de
albumina de soro bovino) e tampão C (50 mM Tris HCl, pH 8, contendo 0.1M NaCl e 0.02 M
MgCl2). Em uma placa de 96 poços foram adicionados 125 μL de DNTB 3 mM em tampão C;
25 μL de M ATCI 15mM em tampão A; 50 μL do tampão A e 25 μL do extrato dissolvido em
água em concentrações que variam entre 5 μg/ mL e 1000 μg/ mL. Em seguida, 25 uL de
AChE 0. 28 U/mL dissolvida em tampão B foi adicionada a cada poço. A absorbância foi
medida a 405 nm a cada 25 s por 3,3 min usando um leitor de microplaca. Como controle
positivo se utilizou a fisostigmina em concentrações que variam entre 0,78 ug/mL a 100
ug/mL. A percentagem de inibição foi calculada utilizando a equação de inibição:
(%) = [(A controle-A amostra)/A controle ] x 100. Onde A controle é a absorbância do controle (buffer
A) e A amostra é a absorbância da amostra. Os valores de AChEI correspondem às meias de três
determinações individuais realizada cada uma por triplicata. A concentração inibitória de 50%
da AChE (IC50) foi calculada a partir da curva de regressão logarítmica não linear derivada a
partir dos dados "plotteados".
36
(CH3)3N+CH2CH2S + RSSR
H20 + (CH3)3N+CH2CH2SCOCH3 (CH3)3N+CH2CH2S + (CH3)3COO + 2H+AChE
(CH3)3NCH2CH2S SR+RS
- -
-
Acetilcolina Colina Acetato
Colina DNTB Ácido 5-tio-2-nitrobenzóico
cor amarela
R=
Figura 8- Reação de hidrólise da ACh pela AChE e formação do ácido 5-tio-nitrobenzóico.
(Adaptado de Ellman et al., 1961).
3.7 Ensaios de sobrevivência clonogênica
O Ensaio clonogênico ou ensaio de sobrevivência clonogênica está baseado na
capacidade de uma única célula para se dividir e formar uma colônia após tratamentos que
podem inibir a capacidade de reprodução em virtude de danos citogenéticos (Brown e Attardi,
2005).
Os experimentos foram realizados seguindo o protocolo previamente descrito para esta
linhagem celular (Coccini et al., 2014). As células foram semeadas em placas de 6 poços (300
células/2mL de meio) e o esquema de tratamentos foi o mesmo inicialmente descrito. No final
dos tratamentos, as culturas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas a 37 °C em meio
fresco por 10 dias. Passado esse tempo, as culturas foram lavadas com PBS, fixadas
(metanol/ácido acético/água na proporção 1:1:8 v/v) e coradas com giemsa. Uma colônia se
caracteriza pela presença de no mínino 50 clones de uma célula. A contagem foi realizada
com o auxílio de uma lupa (Zeiss; aumento: 16X).
3.8 Ensaios de diferenciação celular em células expostas ao extrato de C. subedentata
As células SH-SY5Y foram cultivadas em placas de seis poços (1x105 células por poço)
seguindo protocolos previamente relatados (Lopes et al., 2010). Após 24 h de estabelecida a
cultura, a diferenciação foi induzida diminuindo a concentração do Soro fetal bovino a 1% e
acrescentando as respectivas concentrações do extrato de C. subedentata. O meio foi trocado
a cada três dias (4, 7 e 10 dias) para substituir aos tratamentos. As células PC12 e o ácido
retinóico 10 µM foram usados como controle. As observações foram feitas através de
microscópio de contraste de fase com objetiva de 40X acoplado a uma câmara Canon-
PowerShot A2300 hD.
37
3.9 Avaliação de morte celular
A caracterização da morte celular por apoptose e necrose foi realizada através de
coloração diferencial com corantes específicos. As células SH-SY5Y foram semeadas em
placas de 12 poços (2x105 células por poço), após os tratamentos conforme descrito
anteriormente, transferiu-se o meio de cultura para um eppendorf e as células aderentes foram
tripsinizadas e ambos foram centrifugadas. Os pellets celulares foram corados com solução de
iodeto de propídio (1 mg/mL), diacetato de fluoresceína (1,5 mg/mL) e solução de Hoescht (1
mg/mL). As análises celulares se realizaram através de microscopia de fluorescência
(Olympus BX51; objetiva de 40x), utilizando um filtro triplo (DAPI, Propídio e FITC).
Avaliação de células apoptóticas e necróticas foram distinguidas com base na coloração das
células: células normais (núcleos esféricos corados de azul por Hoescht, citoplasma verde
corado por FDA); células em apoptose (núcleos fragmentados, corpos apoptóticos corados de
azul por Hoechst e citoplasma verde) e células necróticas (núcleos homogêneos com
citoplasma corado de vermelho pelo iodeto de propídio) como previamente relatadas
(Korostoff et al., 1998; Duarte et al., 2010).
3.10 Microscopia eletrônica de transmissão (MET)
Semearam-se 5 x 104 células em placas de 6 poços. No final do período de tratamentos,
as células foram lavadas três vezes com PBS, fixadas em 3% de glutaraldeído (2 horas, 37 °C)
e pós-fixados em 1% de OsO4 (2 horas, 4 °C). Em seguida, as células foram lavadas em
tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,3) e se desidrataram através de uma bateria crescente de
etanol (30 a 100%) para logo serem infiltradas e polimerizadas em resina EMbed 812 (EMS)
por 72 h a 60 °C. Após da polimerização se realizaram cortes semifinos (0,5 µm) em
ultramicrótomo (Ultracut UC-6, Leica, Heidelberg, Alemanha) e se coraram com 1% de azul
de toluidina. Os cortes ultrafinos (70 nm) se contrastaram com 2% de acetato de uranilo e 1%
de citrato de chumbo. Finalmente, as microfotografias foram obtidas com MET (JEOL-JEM
100CXII) equipado com uma câmera digital Hamamatsu ORCHA-HR.
3.11 Ensaios de genotoxicidade: Micronúcleos e Cometa
A fim de determinar os efeitos de C. subedentata e da galantamina sob os danos
induzidos pelo peptídeo Aβ(1-42) foram utilizados os ensaios de micronúcleos (MNs) em
38
células binucleadas (MNCB) e o ensaio cometa. Ambos os testes são amplamente usados em
biomonitorização para avaliar o dano no DNA como biomarcador de exposição aos agentes
genotóxicos ou para a pesquisa de agentes genoprotectores e antioxidantes. Além de serem
considerados parte da bateria de testes na validação de drogas e na avaliação de substâncias
com efeitos aneugênicos e clastogênicos (Dusinska e Collins, 2008; Collins et al., 2014;
Araldi et al., 2015).
O teste de micronúcleos em células binucleadas (MNCBNs) atualmente é conhecido
como teste citoma (Figura 9). O termo citoma implica que cada célula no sistema é contada
citologicamente para avaliar seu estado de viabilidade (necrose, apoptose); estado mitótico
(IDN=índice de divisão nuclear, atendendo células mono, bi e multinucleadas) e os danos
cromossômicos como biomarcadores de genotoxicidade através de parâmetros como
micronúcleos (MNs), um marcador de quebras e∕ou perda cromossômica, definido como um
fragmento cromossômico acêntrico ou cromossomo inteiro que fica fora do núcleo como
consequência de uma perda de cromatina ou de danos no aparelho mitótico; pontes
nucleoplasmáticas (PNPs), um marcador de rearranjos cromossômicos, misrepair e∕ou fusão
dos telômeros e os brotos nucleoplasmáticos (BNPs), um biomarcador de amplificação de
genes e∕ou eliminação dos complexos de reparo do DNA (Fenech et al., 2003; Fenech, 2007;
Lee et al., 2014). Contudo, o ensaio de MNs é extremamente informativo uma ferramenta que
tem evoluído muito rápido no campo da genética toxicológica (Salvadori et al., 2003; Huang
et al., 2011).
-
Aβ(1-42)
CB
IDN
CBN
MNCBNs
PNPs
BNPs
Figura 9- Representação esquematizada dos parâmetros avaliados pelo ensaio de MNCBNs. CB,
Citocalasina B; CBN, célula binucleada; MNCBN, micronúcleos em célula binucleada; BNPs, broto
nucleoplasmático; PNPs, pontes nucleoplasmática; IDN, índice de divisão nuclear (representando
células mono, bi e multinucleadas).
39
O ensaio cometa também conhecido como teste de eletroforese em gel de uma única
célula é uma técnica que permite avaliar o dano do DNA através da observação visual. O
ensaio recebe esse nome uma vez que visto ao microscópio, a migração do DNA induzido
pelo dano adquire uma forma de cometa (Figura 10), com uma região nuclear e a cauda que
contem fitas do DNA ou fragmentos que migram na direção do ânodo durante a eletroforese
(Klaude et al., 1996). A versão alcalina deste ensaio permite detectar quebras de fitas simples,
duplas e sítios álcali-lábeis na molécula do DNA as quais podem ser induzidas por diferentes
agentes tóxicos que interagem com o DNA (Gontijo e Tice, 2003; Sponchiado et al., 2016).
Figura 10- Representação do dano ao DNA avaliado pelo ensaio cometa (Imagem gerada pelo
sistema de análise Comet Assay IV).
3.11.1 Ensaio de Micronúcleos
O método utilizado foi o citado pela literatura (Fenech, 2000; He et al., 2008), com
adaptações feitas para nosso laboratório. As células foram semeadas a uma densidade de
1x106 células em placas de 6 poços. No final do período de tratamentos, o meio foi trocado
por meio fresco e adicionou-se 5 µg/mL de Citocalasina B (CB) (Sigma) e ao término de 24 h
procedeu-se a colheita. As culturas celulares foram lavadas com PBS, tripsinizadas e
inativadas com DMEM-F10. Posteriormente as células foram transferidas para um tubo de
ensaio de 15 mL previamente identificado, e centrifugado a 1500 rpm por 7 minutos. O
sobrenadante foi removido e adicionaram-se vigorosamente 5 mL de solução hipotônica
gelada (KCL 0,075 M) e se centrifugou a 1500 rpm por 7 minutos. Na sequência, o
sobrenadante foi descartado, o pellet do tubo foi levemente agitado e foram acrescentados 5
mL de solução fixadora (metanol:ácido acético, 3:1) fresco. Com o propósito de ajudar na
preservação do citoplasma, 3 gotas de formaldeído foram acrescentadas em cada tubo e se
procedeu à centrifugação (1500 rpm por 7 minutos). O sobrenadante foi parcialmente
descartado, deixando aproximadamente 1 mL em cada tubo, que foi gotejado sobre lâminas de
40
vidro. As células foram coradas com solução de giemsa (tampão fosfato: Giemsa 20:1) por 5
minutos e analisadas em microscópio óptico de luz (Carl Zeiss) em aumento de 400X.
Doxorrubicina (0,4 µg/mL) foi utilizado por 2 h como controle positivo. Os MNs, PNPs e
BNPs foram contados em 1000 células binucleadas, de acordo com critérios já estabelecidos.
Contaram-se 500 células para determinar o IDN usando a fórmula: IDN=(M1 + M2 x 2 + M3
x 3 + M4 x 4) ∕ N, onde M1-M4 representam o número de células com 1 a 4 núcleos, e N é o
número total de células contadas (Fenech et al., 2003).
3.11.2 Ensaio cometa
O ensaio do cometa alcalino foi realizado segundo o protocolo estabelecido por (He et
al., 2008) com algumas modificações feitas para nosso laboratório. Foram semeadas em
placas de 12 poços (5x105 células/poço) e após os tratamentos o meio foi descartado e as
células lavadas com PBS, tripsinizadas e inativadas com meio HAM-F10+DMEM. Para dar
continuidade ao protocolo do ensaio cometa, a concentração de células viáveis em cada
cultura foi analisada pelo método de exclusão com Azul de Tripano (todas as culturas
apresentaram viabilidade acima de 70%). Em seguida, 600 µL de suspensão celular de cada
poço foi transferida para microtubos de 1,5 mL, previamente identificado, que foi
posteriormente centrifugado a 1500 rpm por 7 minutos. O sobrenadante foi removido e o
pellet celular resuspendido; 10 µL da suspensão celular foram misturados com 75 µL de
agarose de baixo ponto de fusão (0,75%) e colocados sobre uma lâmina de microscópio
previamente recoberta com uma camada de agarose de ponto de fusão normal 1,5%. Foram
colocadas lamínulas sobre o material e as lâminas foram mantidas a 4°C por 15 minutos.
Logo depois, as lamínulas foram removidas e as lâminas imersas overnight a 4°C em solução
de lise (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 100 mM, Triton X-100 1% e DMSO 10%). Após
esse período, as lâminas foram retiradas da solução de lise e colocadas em solução tampão de
eletroforese (NaOH 10 N e EDTA 200 mM, pH > 13) por 15 minutos a 4ºC. Posteriormente,
as lâminas foram alocadas em uma cuba horizontal e a eletroforese foi conduzida a 25 V e
300 mA por 20 minutos. Finalizada a corrida eletroforetica, as lâminas foram mergulhadas em
solução de neutralização (Tris-HCl 0,4 M, pH 7,5) por 15 minutos, secas à temperatura
ambiente e fixadas em etanol absoluto. Para a coloração dos nucleóides foram adicionados 40
µL de solução de SYBR Green (Invitrogen). Um total de 100 nucleóides foi analisado por
tratamento em microscópio de fluorescência acoplado a um sistema de análise de imagem
(Comet Assay IV® Perceptive Instruments), usando uma objetiva 40X. O parâmetro utilizado
41
para a mensuração dos danos no DNA foi o tail intensity (% de DNA na cauda do cometa).
Todas as etapas da técnica foram conduzidas sob luz indireta.
3.12 Ensaio de Metilação
3.12.1 Extração de DNA
Foram semeadas em garrafas de 25 cm2 1x10
6 células e após os tratamentos o meio foi
descartado e as células lavadas com PBS, tripsinizadas e inativadas com meio HAM-
F10+DMEM. A extração do DNA foi feita utilizando o Wizard® Genomic DNA Purification
Kit TM
(Promega, Madison, USA). Brevemente, as células foram centrifugadas a 16000 x g. O
precipitado celular foi separado e exposto ao buffer de lise celular. Em seguida foi
acrescentada solução de RNase, incubado 37°C por 30 min e esfriadas a temperatura
ambiente. Posteriormente, se adicionou solução precipitante de proteínas e se centrifugou a
16000 x g. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e o DNA foi precipitado e isolado
com isopropanol e etanol a 70%. O produto final foi secado, misturado com solução de
reidratação de DNA e armazenado a -20°C. Cada amostra extraída foi quantificada no
espectrofotômetro (NanoDrop 2000- Thermo Scientific), tendo-se medido a absorbância de
cada amostra em contraste com uma amostra de solução de reidratação nos comprimentos de
onda de 260 e 280 nm (Sambrook e Fritsch, 1989). Razão entre 1,8 e 2,0 é considerada ideal.
3.12.2 Conversão com Bissulfito
O DNA extraído foi submetido à conversão das citosinas não metiladas em uracilas com
o Cells-to-CpG™ Bisulfite Conversion Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).
Brevemente, o DNA foi denaturado e misturado com a solução de conversão (bissulfito de
sódio) e submetido a ciclos de temperatura de 95°C e 65°C por 2 horas, permitindo que o
grupo amino (-NH2) de todas as citosinas seja convertido em grupo ceto (=O), assim, as
citosinas são convertidas em uracilas; enquanto as 5’metil-citosinas não podem ser
convertidas por interferência eletrônica do grupo metil. Finalmente, cada amostra de DNA foi
lavada para retirar o sal e o bissulfito usando colunas de separação. O DNA limpo foi
ressuspenso em buffer TE 1X.
Antes da análise do status de metilação dos genes estudados, a presença de DNA
modificado com bissulfito de cada amostra foi determinado pela amplificação de um
42
fragmento de 133-pb do gene β-Actina, usando um set de primers selecionados que
amplificam apenas o DNA modificado com bissulfito (F: 5′ -
TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT - 3′ e R: 5′ - AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA - 3′),
independentemente do status de metilação da amostra. Como controle positivo e negativo da
amplificação tanto para sequência metilada quanto não metilada foi realizada uma reação
usando Cells-to-CpG™ Methylated & Unmethylated gDNA Control Kit (Applied
Biosystems, Carlsbad, CA, USA) para cada set de primers.
3.12.3 Análise de dissociação de alta resolução - Sensível à Metilação (Methylation-
sensitive high resolution melting MS-HRM)
O MS-HRM foi realizado para semi-quantificar o nível de metilação dos promotores
que deram positivo na análise de MSP (Reação em Cadeia da Polimerase Específica para
Metilação). O DNA modificado com bissulfito foi para a análise de MS-HRM dos promotores
dos genes alvo. Foram desenhados primers específicos para cada região promotora usando o
software Methyl Primer Express™ (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). As sequências
dos primers anelaram em regiões próximas das ilhas CpG que foram analisadas. As
sequências usadas para o promotor do gene APP foram F – 5’ TTAGGATGGTGTTGATTTTTTG
‘3 e R – 5’ CCAAAATTATACCATTACACTCCA ‘3; PS1 F – 5’ TGGTTGTTAAAGTTGGAGTTTA ‘3
e R – 5’ CCCCTATATAAATTAAACCCAAC ‘3; e no caso do gene BACE1 foram usadas
sequências F – 5’ GTGGGTGTTTTTTTTATGTTGA ‘3 e R – 5’ CTACTCAAACCACCATAATCCA
‘3. A MS-HRM foi feita num volume final de 20 µL, usando MeltDoctor™ HRM Master Mix
1X (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), 0,5 μM de cada primer e 80 ng de DNA
convertido com bissulfito. As condições foram 10’ de desnaturação inicial a 95°C,
continuando com 40 ciclos de 15’’ a 95°C e 1’ a 60°C. Finalmente a análise de dissociação de
alta resolução foi feita desde os 60°C por 1’ seguido de aumento progressivo de temperatura
de 0,3% por 15’’ até atingir os 95°C. Diluições do Cells-to-CpG™ Methylated &
Unmethylated gDNA Control Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) foram usadas
para fazer curvas padrão de metilação 100%, 10%, 5%, 1% e 0% metilado para cada
promotor, como se mostra na figura 11.
43
Figura 11- Análise de dissociação da região promotora do gene APP por MS-HRM. As curvas são
geradas com base na porcentagem de metilação das ilhas CpG na região promotora.
Todos os experimentos foram realizados em placas de 96 poços apropriadas para a
análise de HRM no equipamento Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System e a
análise de dissociação de alta resolução (MS-HRM) foi feita usando o software específico
para este fim. O High Resolution Melt Software v3.0.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA,
USA) permitiu a semi-quantificação da porcentagem de metilação das regiões promotoras dos
genes APP, BACE1 e PSEN1 comparando com curvas padrões de dissociação.
3.13 Análises estatísticas
Os dados foram expressos como os valores da média e o desvio padrão (DP) de três
experimentos independentes com suas respectivas triplicatas. As diferenças estatísticas dos
dados foram determinadas usando os testes: “One-Way ANOVA”, Bonferroni ou Dunnet´s
pos hoc. O nível de significância estatístico foi estabelecido a um valor de P <0,05. Todos os
testes foram realizados usando o software GraphPad Prism versão 5.0.
44
4 RESULTADOS
4.1 Baixas concentrações do extrato de C. subedentata não promove citotoxicidade nas
células SH-SY5Y
Os resultados mostram que o extrato de C. subedentata a baixas concentrações não
altera a viabilidade celular; no entanto, com concentrações iguais ou maiores que 100 µg/mL
verificou-se uma diminuição estatisticamente significante da mesma em comparação com o
controle (p<0,05); apresentando-se um efeito dose-dependente (Figura 12). Baseados nessas
análises, as concentrações de 6,2, 12,5 e 25 µg∕mL foram definidas para se avaliar o efeito
neuroprotetor do extrato nas células SH-SY5Y expostas ao peptídeo Aβ(1-42).
Co 6,2 12,5 25 50 100 200 400 800 DO
0
20
40
60
80
100
120
*
***
Extato de C. subedentata (g/mL)
***
***
***
% V
iab
ilid
ad
e c
elu
lar
Figura 12- Avaliação da viabilidade celular pelo teste XTT. As células SH-SY5Y foram expostas
durante 24 horas a diferentes concentrações (6.2-800 µg∕mL) do extrato total de C. subedentata. A
viabilidade celular foi normalizada em cada experimento individual como 100% de sobrevivência no
controle. Os dados correspondem à media e DP de três experimentos independentes com sua
respectiva triplicata. O nível de significância estatístico foi estabelecido a *, p < 0.05; **, p < 0.001
and ***, p < 0.0001 vs o controle (Co); DO, Doxorrubicina.
45
4.2 Alcaloides de C. subedentata apresentaram atividade inibitória da rAChE em estudos
de Docking Molecular in Silico
Os alcaloides obtidos do repositório público PubChem com seus respectivos códigos de
identificação são apresentados na tabela 2. Resultados do docking molecular entre a enzima
hAChE e a galantamina como ligante farmacológico foram utilizados como controle positivo
para comparar as interações entre a enzima e os alcaloides (Figura 13). Os ligantes
selecionados foram ancorados 10 vezes no sítio de inibição proposto para a enzima utilizando
o programa GOLD5 5.1. Os parâmetros do algoritmo genético foram ajustados
automaticamente pelo programa e de acordo com o tamanho do ligante para se obter o
máximo de eficiência do docking.
Tabela 2- Alcaloides presentes no extrato de C. subedentata
Molécula Pubchem CID Gold Score
Galantamina 9651 8.27
Licorina 72378 14.19
Licorenina 160472 13.78
Narciclasina 72376 13.60
Hemantamina 441593 6.23
Dados obtidos a partir do repositório público PubChem
Figura 13- Modelo 3D Enzima- ligante; interações entre a enzima hAChE e a galantamina.
Baseados nas análises de reprodutibilidade entre a enzima hAChE e cada um dos alcaloides,
os principais resíduos comuns nessa interação são mostrados na tabela 3
46
Tabela 3- Principais resíduos da enzima hAChE interagindo com os ligantes
Residue Hydrogen bond interaction
Tyr 341 Doador/Aceptor de Hidrogênio
Asp 74 (Aceptor de Hidrogênio)
Tyr 124 (Doador/Aceptor de Hidrogênio)
Ser 125 (Doador/Aceptor de Hidrogênio)
Tyr 337 (Doador/Aceptor de Hidrogênio)
O anterior indica a afinidade relativa dos alcaloides pela enzima, o qual evidencia
potencial farmacológico, uma vez que os resíduos são comuns para a interação entre enzima-
ligante; mesmo assim, alcaloides como a licorenina e a narciclasina apresentaram maior
número de interações com a enzima, sendo ainda maiores aos relatados para a galantamina
(Figura 14).
Galantamina Licorina
Licorenina Narciclasina
Desfavorável
Ligação convencional de HLigações C-H
Ligações H-água
Van der WaalsInterações pi
Figura 14- Principais resíduos de interação entre os ligantes e a enzima hAChE.
47
No que diz respeito ao valor de score atribuídos pelo programa GOLD, os alcaloides
tipo licorina, licorenina e narciclasina foram aqueles que revelaram melhor ajuste ao sítio de
inibição da enzima, apresentando maior valor quando comparado com galantamina (Tabela
3). O Gold Score é um indicativo da facilidade de se acoplar e inibir à enzima no interior do
sítio; não é necessariamente indicativo de qual seria o melhor inibidor, mas é um bom ponto
de norteamento para a continuidade com a pesquisa.
4.3 C. subedentata possui atividade inibitória da acetilcolinesterase
Os valores da inibição da acetilcolinesterase expressados como porcentagens de inibição
(%) e valores de IC50 são resumidos na tabela 4. As porcentagens de AChEI para as três
concentrações do extrato encontra-se entre 12 e 21% e um valor IC50 de 45.48±2.31 μg/mL.
A Fisostigmina um AChEI usada como controle positivo apresentou um valor IC50 de
18.01±2.80 menor ao relatado para o extrato, corroborando assim para sua alta afinidade
química pela enzima AChE.
Tabela 4- % de inibição da acetilcolinesterase e valores IC50 do extrato de C. subedentata
Concentração
μg/mL %AChEi
Extrato Fisostigmina 25 21.33±1.12 60.44±2.18 12,5 16.99±0.98 43.39±1.97 6,2 12.65±0.57 33.64±1.56 IC50 (µg/mL) 45.48±2.31 18.01±2.80
AChEi, inibição da acetilcolinesterase
4.4 Resultados do teste de sobrevivência clonogênica
As células tratadas com o peptídeo Aβ(1-42) mostraram uma diminuição estatisticamente
significante na capacidade das células para formar colônias quando comparadas ao controle
(p<0.05). No entanto, nas células que receberam tratamento com o extrato de C. subedentata
(Figura 15. A) ou galantamina (Figura 15. B) pode se verificar um acréscimo na taxa de
sobrevivência celular, verificada pelo aumento do número de colônias. Para o extrato de C.
subedentata duas das três concentrações (6,2 e 12,5 mg/mL) apresentaram um maior efeito
quando comparado com o peptídeo Aβ(1-42) (p<0.05). Com relação às células que receberam
galantamina houve uma leve recuperação na taxa de sobrevivência e na capacidade das
células para formar colônias. No entanto, em termos de significância estatística, apenas a
48
concentração de 10 µM apresentou tal efeito (p<0.05) em comparação com o peptídeo Aβ(1-
42).
Co 6,2µg 12,5µg 25µg
0.0
0.5
1.0
1.5
** *****
***
Extrato de C. subedentata
A (1-42)
A%
Sob
reviv
ên
cia
clo
nog
ên
ica
Co 0,1µM 1µM 10µM
0.0
0.5
1.0
1.5
*** *** *
* *
Galantamina
A (1-42)
B
% S
ob
reviv
ên
cia
clo
nog
ên
ica
Figura 15- Porcentagens do número de colônias formadas na linhagem celular SH-SY5Y tratadas
durante 24 horas com o peptídeo βA(1-42), seguido pelo tratamento por 24 horas com três concentrações
do extrato de C. subedentata (A) ou galantamina (B). A sobrevivência celular foi normalizada para
cada experimento individual como um 100% de sobrevivência no controle. Os resultados são
expressos como a média ± DP de três experimentos (n= 3 em triplicata) com *, p < 0.05; **, p < 0.001
and ***, p < 0.0001
49
4.5 Indução de diferenciação das células SH-SY5Y pelo extrato de C. subedentata e
galantamina
Os tratamentos com o extrato de C. subedentata evidenciaram um aumento no
crescimento dos dendritos celulares seguido do decréscimo na proliferação celular quando
comparado aos controles (Células SH-SY5Y e PC12 sem tratamento) (Figura 16); sendo a
concentração de 25 mg/mL aquela que apresentou o maior efeito na indução da diferenciação.
As células PC12 foram usadas como controle por apresentar uma morfologia mais definida
em comparação às SH-SY5Y, o que permite observar com maior facilidade evidencias de
diferenciação quando expostas a um agente indutor.
Controle 6,2 µg∕mL 25 µg∕mL12,5 µg∕mL
SH
-SY
5Y
PC
12
SH-SY5Y
AR
Figura16- Indução de diferenciação nas células SH-SY5Y. Tratamento das células SH-SY5Y com
o extrato de C. subedentata após 10 dias de tratamento. O meio foi trocado a cada três dias (4, 7 e 10
dias) para substituir aos tratamentos. As células PC12 e o AR (ácido retinóico) foram usados como
controle. Observe-se a formação de neuritos e seu alongamento (Imagens captadas através de objetiva
40X).
4.6 Análise de morte celular
Para distinguir as células apoptóticas das células necróticas e viáveis, foi utilizada uma
coloração diferencial com fluorocromos específico. Após os tratamentos com o peptídeo βA(1-
42) foi possível observar um alto percentual de células necróticas estatisticamente significante
50
quando comparado ao controle (p<0.05); indicando que a exposição ao peptídeo induz morte
celular por necrose mais do que apoptose. No entanto, pós-tratamentos com C. subedentata
(Figura 17. A) apresentaram efeitos estatisticamente significantes (p<0.05) ao diminuir a
morte necrótica induzida pelo peptídeo. Em relação à galantamina (Figura 17. B), apenas a
concentração maior (10 µM) apresentou uma diminuição estatisticamente significante quando
comparada à cultura tratada com o peptídeo βA(1-42).
Figura 17- Indução de morte celular nas células expostas ao peptídeo Aβ(1-42) e pós-tratadas com com
C. subedentata (A) ou galantamina (B). Os dados são expressos como as porcentagens de três
experimentos independentes realizados em triplicata (meia ± DP). *, p<0.05 indicando significância
estatística quando comparado com o controle e ɸ, p<0.05 quando comparado com o estimulo toxico
Aβ(1-42).
Co 0,1 1 10
0
5
10
15
20 Apoptose
Necrose
Galantamina M
A(1-42)
*
B
% M
ort
e c
elu
lar
Co 6,2 12,5 25
0
5
10
15
20ApoptoseNecrose
A(1-42)
*
A
Extrato de C. subedentata (µg/mL)
% M
ort
e c
elu
lar
51
4.7 Avaliação mitocondrial por MET
A exposição das células SH-SY5Y ao peptídeo βA(1-42) exibiram alterações
ultraestruturais atípicas da mitocondrial (M) e do retículo endoplásmico (RE). O peptídeo
induziu diminuição no número de mitocôndrias e inflamação mitocondrial com perda das
cristas e alterações das membranas mitocondriais, acompanhadas pela formação de vesículas.
O retículo endoplásmico rugoso (RER) tornou-se sem grânulos e aparelho de Golgi (AG)
dilatado (Figura 18). No entanto, tratamentos com o extrato de C. subedentata ou
galantamina induziram uma recuperação ultraestrutural quase normal em comparação às
células tratadas com o peptídeo. A máxima proteção do extrato foi observado nas
concentrações de 6,2 e 12,5 mg/mL; enquanto para a galantamina só a concentração de 10 µM
apresentou maior proteção.
1 µm
A
1 µm
B
1 µm
C
1 µm
E
1 µm
F
1 µm
G
extrato
1 µm
D
Figura 18- Imagens representativas da morfologia mitocondrial das células SH-SY5Y no grupo
controle (A); células tratadas com o peptídeo Aβ(1-42) (B, C, D e E), observa-se as alterações nas
membranas mitocondriais com perda das cristas mitocondriais, inflamação mitocondrial, dilatação das
cisternas do complexo de Golgi e alterações do aparelho espinal. Tratamento com extrato de C.
subedentata ou galantamina mostraram uma estrutura perto do normal (F e G). M: mitocôndria, MN:
membrana nuclear, ME: membrana externa, MI: membrana interna, C: cristas mitocondriais, CG:
complexo de Golgi, GL: grânulos lipídicos.
52
4.8 Efeito protetor do extrato de C. subedenta e a galantamina sobre a desestabilidade
genética induzida pelo o peptídeo Aβ(1-42)
Resultados do ensaio de MNCBNs tanto para o extrato de C. subedentata quanto para a
galantamina são apresentados nas tabelas 5 e 6. Desses resultados é evidente que tratamentos
com o peptídeo βA(1-42) teve forte impacto sob os distintos biomarcadores de instabilidade
genômica e celular avaliados através do ensaio. Eventos em termos de dano ao DNA como
MNCB, PNPs e BNPs apresentaram aumento significativo enquanto que o IDN exerceu uma
diminuição significativa, todos em relação ao controle (p<0.05).
Com relação ao efeito neuroprotetor induzido tanto pelo extrato quanto pela
galantamina pode-se apreciar uma redução significativa na frequência de micronúcleos (MNs)
após 24 horas de tratamento com cada uma das três concentrações do extrato (p<0.05); porém,
para a galantamina apenas a concentração maior (10 µM) apresentou o mesmo efeito quando
comparado ao tratamento com o peptídeo (p<0.05). No que diz respeito aos PNPs, as três
concentrações do extrato (6,25; 12,5 e 25 µg/mL) e duas das três concentrações de
galantamina (1 e 10 µM) decresceram significantemente a frequência desses biomarcadores
(p<0.05). No que concerne aos BNPs, apenas duas das três concentrações do extrato (6,25 e
12,5 µg/mL) e apenas a maior concentração de galantamina (10 µM) apresentaram efeito
significante ao decrescer a expressão desse biomarcador (p<0.05). Para o IDN, as três
concentrações do extrato (6,25; 12,5 e 25 µg/mL) e apenas a menor concentração da
galantamina (0,1 µM) apresentaram um efeito significante ao aumentar o IDN quando
comparado ao peptídeo βA(1-42).
Tabela 5- Frequência de micronúcleos em células SH-SY5Y expostas ao peptídeo beta-amiloide e
tratadas com o extrato de C. subedentata Tratamentos
IDN MNCB PNP BNP
Controle 2.11±0.02 22.33±1.15 6.33±0.58 6.67±1.53 βA(1-42) 1.71±0.04
* 31.67±1.53
* 9.67±1.15
* 11.00±1.00
*
βA(1-42)+6,2µg/Ml 2.20±0.02# 22.00±1.00
# 4.00±1.00
# 7.00±1.00
#
βA(1-42)+12,5µg/mL 2.13±0.04# 23.00±1.73
# 4.67±1.15
# 7.33±0.58
#
βA(1-42)+25µg/mL 2.16±0.06# 26.00±1.00
# 5.67±1.53
# 11.00±1.00
*
ID: Índice de divisão nuclear; MNCB: micronúcleos em células binucleadas; PNP: pontes
nucleoplasmicas; BNP: brotos nucleoplásmicos, βA(1-42): peptídeo beta amiloide. Os dados são
apresentados como media ± DP de três experimentos (n= 3 em triplicata). Com *P<0.05 quando
comparada à amostra controle, #p<0.05 quando comparada à amostra com o peptídeo βA(1-42).
53
Tabela 6- Frequência de micronúcleos em células SH-SY5Y expostas ao peptídeo beta-amiloide e
tratadas com o extrato de galantamina
Tratamentos IDN MNCB PNP BNP
Controle 2.10±0.03 23.33±1.53 6.00±1.00 6.33±1.53
βA(1-42) 1.73±0.02* 31.00±2.65
* 9.67±0.58
* 11.33±2.31
*
βA(1-42)+0,1µM 1.74±0.02* 25.33±2.08 7.67±0.58 10.00±1.00
βA(1-42)+1 µM 1.88±0.22 24.00±2.65 3.67±1.53#
8.00±1.00
βA(1-42)+10 µM 1.99±0.21 23.67±3.06#
3.67±1.15#
5.33±0.58#
ID: Índice de divisão nuclear; MNCB: micronúcleos em células binucleadas; PNP: pontes
nucleoplasmicas; BNP: brotos nucleoplásmicos, βA(1-42): peptídeo beta amiloide. Os dados são
apresentados como media ± DP de três experimentos (n= 3 em triplicata). Com *P<0.05 quando
comparada à amostra controle, #p<0.05 quando comparada à amostra com o peptídeo βA(1-42).
4.9 Avaliação do efeito neuroprotetor do extrato de C. subedenta e a galantamina sobre
os danos induzidos ao DNA pelo o peptídeo Aβ(1-42)
Os resultados de proteção do C, subedentata (a) e a galantamina (b) sob os danos
genotóxicos induzidos pelo peptídeo Aβ(1-42) são apresentados nas figuras 19 (A e B)
apresentam. Posterior ao tratamento das células por 24 h com o peptídeo, um aumento
significativo na porcentagem de dano foi observado quando comparados ao controle (p<0,05).
No entanto, tratamentos tanto com o extrato quanto com a galantamina diminuíram a
expressão do dano induzido pelo peptídeo após 24 h de tratamento. Para concentrações
menores de C, subedentata (6,2 e 12,5 mg/mL) e para a galantamina apenas nas concentração
maiores (1 e 10 µM) apresentaram uma diminuição significativa nos níveis danos quando
comparado às células tratadas com o peptídeo (p<0,05).
Co 6,2µg 12,5µg 25µg
0
5
10
15
Extrato de C. subedentata
** ***
A (1-42)
A
Ta
il I
nte
nsi
ty
54
Co 0,1µM 1µM 10µM
0
5
10
15
Galantamina
*** ***
**
A (1-42)
B
Ta
il I
nte
nsi
ty
Figura 19- Redução do dano no DNA induzido pelo extrato de C. subedentata e a galantamina em
células SH-SY5Y expostas ao peptídeo beta amiloide, avaliado pelo ensaio cometa (tail intensity-
porcentagem de DNA na cauda). Os dados correspondem a media ± DP de três experimentos (n=3 em
triplicatas). Com *, p < 0.05; **, p < 0.001 and ***, p < 0.0001.
4.10 Status de metilação das ilhas CpGs nas regiões promotoras dos genes associados ao
processamento da proteína precursora amiloide (APP)
O status de metilação nas ilhas CpG das regiões promotoras dos genes APP, BACE e
PSI foi avaliado por MS-HRM. Para a análise foi preciso converter o DNA de cada amostra
com bissulfito de sódio. O sucesso da conversão foi avaliado através da amplificação de uma
região específica de β-Actina que nunca é encontrada metilada (Figura 20). Os resultados
mostraram que todas (100%) as amostras do estudo amplificaram a região de interesse,
evidência do sucesso da conversão.
55
Figura 20- Amplificação de uma região específica de β-Actina como controle da
conversão com bisulfito. M, DNA Metilado; U, DNA não metilado - Cells-to-CpG™ Methylated
& Unmethylated gDNA Control Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA); DNASM, DNA sem
modificação por bissulfito; MW, Marcador de peso molecular. SH-SY5Y Células controle Aβ(1-42)
Peptídeo beta amiloide, G: Galantamina, E: Extrato de C. subedentata.
Foi realizada a MS-HRM para semiquantificar o nível de metilação em cada amostra
pelo método de comparação com curvas padrão de metilação. O software HRMTM
v3.0.1 foi
usado para determinar a porcentagem de metilação das regiões promotoras dos genes APP,
BACE1e PS1 neste estudo tanto do controle quanto dos tratamentos.
Os resultados completos são apresentados na tabela 7. O nível de metilação dos
tratamentos não apresentou diferenças estatisticamente significativas quando comparado para
o grupo controle (células SH-SY5Y sem tratamento) em todos os genes analisados neste
estudo.
Tabela 7- Nível de metilação dos gene associados ao processamento amiloidogenico da APP
Gene
Controle Aβ(1-42)
Galantamina (µM) Extrato (µg∕mL)
0.1 1 10 6.2 12.5 25
APP 6.44 ± 1.89 4.39 ± 0.45 5.08 ± 1.21 4.23 ± 0.90 4.46 ± 1.21 5.30 ± 1.12 4.22 ± 1.37 5.31 ± 1.09
BACE1 3.06 ± 1.04 3.6 ± 1.01 3.02 ± 0.99 2.06 ± 0.66 2.51 ± 0.82 1.25 ± 0.72 3.16 ± 0.97 2.74 ± 0.76
PSEN1 2.55 ± 0.91 2.62 ± 1.09 1.18 ± 0.85 1.43 ± 1.01 3.13 ± 0.85 1.23 ± 0.88 1.62 ± 0.84 2.84 ± 0.58
Valores em Porcentagens (%) expressadas como a média ± DP.Não foram observadas diferenças
estatisticamente significantes entre os tratamentos e o controle
56
5 DISCUSSÃO
Por centenas de anos, o uso das plantas com propósitos medicinais para o tratamento, cura e
prevenção das diferentes doenças é um dos métodos conhecidos mais antigos. Recentemente,
um crescente interesse tem emergido com respeito ao valor e uso de produtos de origem
vegetal pela sua eficácia no tratamento e melhoria do prejuízo cognitivo, DA e patologias
associadas (Jesky e Hailong, 2011; Libro et al., 2016). Em consequência, a procura de novos
fármacos originários de nossa flora apresenta um valor importante tanto econômico como
clínico, o que pode nos levar ao desenvolvimento de novos medicamentos sintéticos a partir
da identificação de novas estruturas químicas.
Dando seguimento a nossa investigação, o primeiro aspecto a ser avaliado foi a
citotoxicidade do extrato de C. subedentata com a finalidade de determinar três concentrações
do extrato a serem estudadas nos diferentes testes de neuroproteção. Em nosso estudo,
concentrações de 6,2; 12,5; 25 e 50 µg∕mL do extrato não exibiram efeitos citotóxicos quando
comparado ao controle; no entanto, concentrações iguais ou maiores que 100 µg∕mL foram
citotóxicas quando avaliadas pelo teste XTT. É amplamente aceito, que a redução do sal
acontece apenas em células viáveis (Zhu et al., 2004); porém, a diminuição no metabolismo
mitocondrial observada para as maiores concentrações do extrato, não necessariamente pode
ser o reflexo de um efeito citotóxico direito. É bem conhecido que sob certas condições
experimentais, a interação entre diferentes compostos antimutagênicos presentes em um
extrato podem induzir efeitos adversos incluindo toxicidade (De Flora et al., 1992; Cavalcante
et al., 2003). Os resultados anteriores poderiam estar associados a metabolitos ativos
farmacologicamente em baixas concentrações ou a presença de outros intermediários que
interferem no modo de ação em altas concentrações (Da Silva et al., 2010). Como em todas as
plantas, as Amaryllidaceaes também contem metabolitos que exibem toxicidade como parte
dos mecanismos naturais de defensa; porem a atividade AChEI é a mais relevante (Jin, 2005;
Barbosa-Filho et al., 2006; Duarte et al., 2010).
De acordo com a hipótese colinérgica associada à DA, os AChEIs aumentam a
neurotransmissão colinérgica através da inibição da AChE, evitando assim a degradação da
ACh. Evidencias recente sugerem que a atividade anticolinesterase dos extratos pertencentes à
família Amaryllidacea estaria correlacionada à presença de metabolitos como galantamina,
11-hidroxigalantamina, tazetina e licorina (Mcnulty et al., 2010; Cortes, Alvarez, et al., 2015;
Zhu et al., 2015). Em nosso estudo, os alcaloides testados como possíveis inibidores da
hAChE através do docking molecular mostraram potencial atividade inibitória. A
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significância biológica da hAChE a torna um alvo valioso para a realização de analises de
inibição; devido ao fato de que a maioria dos estudos relatados tradicionalmente têm sido
feito no primeiro modelo cristalográfico da AChE obtida do peixe Torpedo californica. Essa
permitiu pela primeira vez identificar a uma resolução atômica a cavidade de ligação para a
ACh, sítio onde se degrada o neurotransmissor (Soreq e Seidman, 2001). Porém, estudos
envolvendo a hAChE com drogas anti-Alzheimer foram iniciados há pouco tempo; a estrutura
cristalográfica da hAChE foi recentemente resolvida por difração de raios X (Cheung et al.,
2012) e em comparação com a AChE de Torpedo californica tem sido demonstrado que as
ligações dos inibidores na hAChE são muito mais complexas às observados na enzima de
outras espécies.
O processo de docking da enzima com os diferentes alcaloides aqui testados mostrou
que todos os complexos formados entre enzima-ligante são estabilizados por ligações
intramoleculares de hidrogênio e interações de empilhamento π. Adicionalmente existem
interações com os resíduos (aminoácidos) da enzima que são comuns para os ligantes. Essas
interações tornam-se um indicador potencial do possível modo de ação entre os alcaloides e a
enzima; sem que esses valores signifiquem necessariamente qual é o melhor inibidor da
hAChE. No entanto, os resultados do ensaio enzimático validam promissoramente o relatado
através do estudo de docking molecular, uma vez que as três concentrações do extrato
apresentaram efeito AChEI. Nesse sentido, os resultados obtidos através dos estudos de
docking molecular na enzima humana complementados com o ensaio experimental fornecem
um norteamento promissor sob as características achadas para cada um dos ligantes aqui
testados, tornando-se a análise em silico uma ferramenta aplicada ao planejamento de
abordagens farmacológicas.
A perda de neurônios colinérgicos e nAChRs é uma importante característica na DA; de
fato, as poucas terapias disponíveis estão baseadas na AChEI. A galantamina usada em toda
Europa Oriental desde 1950 (Marco e Carreiras, 2006) foi inicialmente estabelecida como um
seletivo inibidor competitivo reversível da enzima AChE; porém, além de aumentar os níveis
de ACh; a galantamina também interage como um ligante potencialmente alostérico sobre os
nAChR, associados a canais iônicos e sobre receptores mAChR, receptores metabotrópicos
associados a proteínas G; além disso, a galantamina estimula a atividade acetilcolina
transferase (Samochocki et al., 2000; Arias et al., 2004; Mulder et al., 2005; Wang et al.,
2007). A crescente demanda de galantamina como inibidor da AChE tem promovido a
pesquisa de novas fontes desse composto e outros compostos alcaloides bioativos para o
tratamento da DA; e as Amaryllidaceaes pelas características biossintéticas únicas de seus
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alcaloides estão entre as plantas com maior potencial como AChEIs. A atividade inibitória da
enzima AChE parece estar relacionada às características estruturais únicas dos alcaloides
pertencentes ao tipo galantamina e licorina (López et al., 2002b; Mcnulty et al., 2010; Cortes,
Posada-Duque, et al., 2015).
Geralmente a pesquisa direcionada aos AChEI tem se concentrado em alcaloides tipo
galantamina, no entanto, alcaloides do tipo licorina como assoanina, oxoassoanine e 1-O-
acetilcorina têm sido relatados por apresentar significante atividade AChEI (López et al.,
2002a; Elgorashi et al., 2004). Alguns deles como assoanina e oxoassoanine apresentaram
atividade maior do que a licorina, e essa atividade tem sido atribuída à presença do anel
aromático o que dá certa planaridade aos alcaloides para interagir com a enzima (López et al.,
2002b). Porém, o 1-O-acetilcorina carece do anel aromático e é 200 vezes mais potente na
inibição da AChE do que a licorina, 2-O-acetilicorina e 1,2-O-diacetilicorina, o que mostra
que existem diversas propriedades nos alcaloides que afetam as ligações do ligando ao sítio
ativo da enzima AChE (Elgorashi et al., 2006). A estrutura cristalizada de alcaloides com a
galantamina ligados no sítio ativo da AChE Torpedo californica (TcAChE) mostraram que as
ligações são resultado de um número moderado de interações fracas com a proteína, incluindo
pontes de hidrogênio (Greenblatt et al., 1999). Sobre essas bases biológicas os alcaloides pela
mesma heterogeneidade de suas estruturas têm o potencial para atingir, regular e inibir a
enzima AChE.
Com a finalidade de analisar os efeitos a longo prazo e a relevância fisiológica tanto do
extrato quanto a galantamina sob a capacidade proliferativa das células após toxicidade
induzida pelo peptídeo Aβ(1-42), se realizou o ensaio de sobrevivência clonogênica, o qual
requer análises após ter passado um longo período do tratamento (10 dias). O ensaio permite
inferir a citotoxicidade de um determinado composto, ao mesmo tempo é um método
alternativo no qual se evita a utilização de qualquer corante colorimétrico ou fluorescente, o
que permite uma estimação mais precisa dos efeitos dos compostos que estão sendo testados
devido à ausência de interação de corantes com o metabolismo celular.
A exposição ao peptídeo Aβ(1-42) levou a mudanças morfológicas nas células;
adicionalmente, inibiu a capacidade da célula de se dividir e formar colônias, Esses resultados
fornecem evidência da citotoxicidade exercida pelo peptídeo não apenas a curto tempo da
exposição (24 h), como o observado com o decréscimo do IDN o qual avalia o estado
proliferativo de uma fração celular viável (Fenech, 2007). Os efeitos do peptídeo em longo
prazo condicionam o metabolismo e a fisiologia da célula para se manter no tempo,
comprometendo o crescimento e a capacidade proliferativa da célula, À data, estudos de
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ensaio clonogênica para avaliar sobrevivência celular após exposição ao peptídeo Aβ(1-42) não
têm sido relatadas; no entanto, tem sido demonstrado que esse ensaio é apropriado para
avaliar sobrevivência celular em testes de neurotoxicidade (Ceruti et al., 2009; Coccini et al.,
2014; Coccini et al., 2015).
A diminuição no potencial de sobrevivência e proliferação das células SH-SY5Y após
tratamento com o peptídeo Aβ(1-42), provê evidência direta e concorda com outros estudos
sobre o dano celular induzido pela proteína (Datki et al., 2004; Qi et al., 2005; Mohmmad
Abdul et al., 2006). A noção pela qual o peptídeo cria um círculo vicioso de declínio
neurodegenerativo é conhecida como a hipótese da cascata amiloide (Hardy, 1992; Hardy e
Selkoe, 2002). Evidências experimentais indicam que o fragmento amiloide, um metabolito
tóxico derivado da clivagem da PPA, induz estresse oxidativo e diminui os fatores tróficos
que levam à disfunção e morte neuronal além do declínio na neurogênese no cérebro dos
pacientes com DA (Allan Butterfield, 2002; Butterfield e Lauderback, 2002; Butterfield e
Boyd‐Kimball, 2004; Mohmmad Abdul et al., 2006; Lilja et al., 2013).
Muitos estudos têm sugerido que metais como Cu+2
e Fe+3
intervêm nos mecanismos de
toxicidade induzidos pelo peptídeo através de seu potencial redox. A transferência de um só
elétron do peptídeo para o metal resultaria na formação de um RL peptidil (Varadarajan et al.,
2000; Allan Butterfield, 2002; Lilja et al., 2013). Assim, interações entre o peptídeo beta
amiloide e ions metálicos têm a capacidade de gerar EROs como H2O2 o qual está
amplamente associado à neurotoxicidade (Tabner et al., 2002; Boyd-Kimball et al., 2004;
Smith et al., 2007). Em concordância com a teoria do estresse oxidativo, a morte neural seria
consequência dos RLs que se ligam e alteram a arquitetura estrutural dos neurônios. Neste
modelo, pequenos agregados solúveis do peptídeo Aβ(1-42) podem-se integrar entre a bicamada
lipídica da membrana celular gerando dano no DNA, aumento nos níveis celulares de
malondialdehído (MDA), um produto metabólico da peroxidação lipídica e grupos carbonila,
um parâmetro que reflete oxidação de proteínas (Huang et al., 1999; Varadarajan et al., 2000;
Qi et al., 2005; Chang et al., 2014; Lee et al., 2014; Tranah et al., 2014). Adicionalmente,
sabe se que o peptídeo amiloide induz a expressão de óxido nítrico sintetase (NOS), gerando
NO o qual pode reacionar rapidamente com o radical superoxido (O2-) para gerar peroxinitrito
(ONOO-)(Butterfield e Lauderback, 2002) o que finaliza com a ativação da cascata de morte
celular.
Outros mecanismos de neurotoxicidade induzida pelo peptídeo têm sido associados com
a perda dos nAChRs em células PC12, SH-SY5Y e em neurônios hipocampais de rato (Guan
et al., 2001; Pettit et al., 2001; Qi et al., 2005; Liu et al., 2015); contribuindo assim, à
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diminuição na sobrevivência celular o que pode favorecer à explicação dos achados em nossa
pesquisa após o tratamento com o peptídeo Aβ(1-42) e a recuperação celular pós-tratamentos
tanto com o extrato quanto com a galantamina, possivelmente devido à recuperação da
sensibilidade dos receptores, como resultado de um dos mecanismos exercidos pela
galantamina. No cérebro dos pacientes com Alzheimer há uma perda de neurônios
colinérgicos no prosencéfalo basal e na inervação do córtex cerebral, que leva a uma
diminuição dos nAChRs, e se correlaciona com a severidade da doença (Perry et al., 1994;
Wilcock et al., 2000). As alterações no sistema colinérgico acontecem em diferentes níveis
incluindo, decréscimo da biossíntese de acetilcolina, atividade colina-acetil-transferase,
reduzido metabolismo de colina e disfunção nos AChRs (Slotkin et al., 1990; Jürgensen e
Ferreira, 2010; Xu et al., 2012). Essas disfunções nos receptores colinérgicos reduzem a
excitação nicotínica colinérgica, incluindo despolarização pós-sináptica, alterações na
liberação-captação de neurotransmissores e sinalização intracelular (Wang et al., 2007). As
características anteriores é a base da amplamente aceita hipótese colinérgica e torna se
evidente tanto pelos achados que coincidem com a severidade da doença no momento da
morte, como pela justificativa das terapias que têm como base os inibidores da AChE, única
estratégia terapêutica que tem conseguido desacelerar a progressão da doença ainda sem
mudar seu curso (Giacobini et al., 1991; Libro et al., 2016).
O desenvolvimento e homeostase nos organismos dependem do equilíbrio entre
sobrevivência e morte celular (Berghe et al., 2014); no entanto, em doenças como Alzheimer
a perda neural é uma das características mais importantes que ocorre em determinadas partes
do cérebro (vulnerabilidade neural seletiva) (Demetrius et al., 2015). A morte neuronal tanto
no cérebro dos pacientes que apresentam a DA, quanto aquela em modelos para a
enfermidade após dano iniciado por neurotoxinas ou RLs têm sido alvo de controvérsia a
respeito do tipo de morte predominante. Para alguns autores a morte celular é tanto apoptótica
quanto necrótica (Bonfoco et al., 1995; Gorman, 2008; Qi e Shuai, 2016). Os resultados de
nosso estudo confirmam dados publicados por outros autores, nos quais o peptídeo induziu
morte celular por necrose mais do que por apoptose em células PC12 e neurônios corticais de
ratos (Behl, Christian et al., 1994a). Mais recentemente, tem sido referido que o peptídeo
Aβ(1-42) diminuiu o potencial proliferativo de linfócitos e aumentou a morte celular por
necrose (Lee et al., 2014); porém, os nossos resultados estão em contraste com outros estudos
nos quais reportaram morte apoptótica induzida pelo peptídeo tanto em células PC12 quanto
em células SH-SY5Y (Arias et al., 2004; Rusdiah e Ah, 2009).
61
A discrepância entre os nossos resultados e os apresentados por outros autores podem
estar associados à metodologia e o tipo de ensaio utilizado para avaliar morte celular. Em
alguns dos estudos as células foram tratadas com o peptídeo na ausência do soro; no entanto, é
bem conhecido que o meio de cultura livre de soro pode ser utilizado como controle positivo
para a indução de apoptose (Behl, Christian et al., 1994b; Charles et al., 2005; Mackey et al.,
2008). Outros autores demonstraram apoptose associada ao peptídeo Aβ através do ensaio do
TUNEL, um ensaio muito utilizado para descrever e inferir taxas de morte apoptótica; porém,
o ensaio carece de especificidade; uma vez que, o citocromo c libertado da mitocôndria
necrótica despolarizada pode ativar caspases e DNases, por esta razão, células programadas
para morrer por necrose como consequência da perda de ATP mitocondrial exibem
características histológicas positivas para TUNEL (Saito et al., 2006; Dorn, 2013). Contudo, a
ausência de um biomarcador específico bioquímico ou histoquímico para apoptose e necrose
tem contribuído para a confusão desses dois processos. Em consequência, os estudos
ultraestruturais tornam-se uma valiosa ferramenta para auxiliar na caracterização do tipo de
morte celular; com presença de condensação da cromatina em apoptose e inflamação na
necrose, essa última acompanhada de forma rápida pela mudança morfológica com perda de
dendritos o qual representa o início do trauma necrótico, seguido pelo colapso do sistema de
membranas intracelulares e inflamação da mitocôndria (Behl, C. et al., 1994; Challa e Chan,
2010; Moquin e Chan, 2010; Dorn, 2013).
Em suporte à morte necrótica, as células tratadas com peptídeo apresentaram alterações
morfológicas acompanhadas pela retração dos dendritos uma hora após do tratamento
neurotóxico. Essas mudanças têm sido associadas à liberação intracelular de lactato
desidrogenase (LDH) um marcador utilizado para avaliar necrose (Chan et al., 2013).
Adicionalmente, as análises ultraestruturais mostraram que o peptídeo Aβ(1-42) causou
mudanças na morfologia mitocondrial, retículo endoplásmico e aparelho de Golgi. As
mitocôndrias tornaram-se inflamadas com alterações das membranas mitocondriais tanto
internas quanto externas, o retículo endoplásmico rugoso tornou-se degranulado e o aparelho
de Golgi dilatado.
O peptídeo Aβ(1-42) tem sido mostrado por exercer alterações na homeostase do Ca+2
,
além de entrar na matriz mitocondrial e a sua progressiva acumulação induzir estresse
mitoncondrial ao interferir com a atividade enzimática, reduzir a respiração mitocondrial e os
níveis de ATP alterando a bioenergética neural (Mattson et al., 1992; Chen e Yan, 2006;
Mossmann et al., 2014; Fonseca et al., 2015). A depleção do armazenamento do Ca+2
do
retículo endoplásmico e posterior aumento entre a mitocôndria induz fragmentação
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mitocondrial e abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPTP), em
consequência, a mitocôndria se incha e se inicia uma morte celular anormal acompanhada de
um estado patológico (Sastry e Rao, 2000; Lemasters et al., 2009; Rainbolt et al., 2014). Em
células sadias, o Ca+2
mitocondrial conduz o piruvato dentro do ciclo do ácido cítrico para
facilitar a formação de ATP, embora a continua acumulação de Ca+2
pode levar à liberação de
citocromo c, abrir o MPTP e assim iniciar o processo de morte celular (Pinton e Rizzuto,
2006; Rainbolt et al., 2014).
A mitocôndria atua como plataforma para ativação de capases durante apoptose e
participa da desregulação do Ca+2
durante a necrose. Assim, a morte necrótica aumenta como
consequência da deficiência de ATP; o qual é oposto a apoptose, uma via que precisa de ATP
como combustível para a formação do apoptosomo e remoção das organelas (Dorn, 2013;
Narciso et al., 2016). As disfunções mitocondriais induzidas pelo peptídeo reduzem a energia
necessária para dirigir os processos mitóticos e apoptóticos causando um padrão de morte por
necrose e potencialmente aumentando os níveis de dano no DNA (Hirai et al., 2001; Rusdiah
e Ah, 2009; Cardinale et al., 2012; Lee et al., 2014; Mossmann et al., 2014). Contudo, a
disfunção mitocondrial é uma importante característica em doenças neurodegenerativas de
início tardio (Mattson, 2000) e é um proeminente marcador na DA (Coskun et al., 2010;
Tranah et al., 2014; Demetrius et al., 2015). Nos últimos anos, a mitocôndria tem chamado
muito a atenção para a DA, se afastando um pouco da hipótese amiloide (um mecanismo
neurocêntrico) para dar origem a um modelo bioenergético, o qual postula que a DA na idade
avançada é o resultado da cascata de três eventos: desregulação mitocondrial, reprogramação
metabólica e seleção natural (Demetrius et al., 2015). A energia é o determinante primário da
viabilidade neural. Defeitos no metabolismo podem levar a falhas na manutenção e
restauração de gradientes iônicos associados com a transmissão sináptica (Siddiqui et al.,
2012; Demetrius et al., 2015).
Visando avaliar o efeito protetor do extrato de C. subedentata e da galantamina frente às
anteriores alterações induzidas pelo peptídeo Aβ(1-42), foram observadas muitas analogias e
semelhanças, uma vez que, tanto o extrato quanto o medicamento em diferentes
concentrações apresentaram efeitos de proteção ao restabelecer a proliferação celular e
reverter as mudanças morfológicas celulares e das organelas após a toxicidade induzida pelo
peptídeo. Baixas concentrações do extrato apresentaram maior efeito protetor, os resultados
de citotoxicidade parecem confirmar esses resultados dado que, as menores concentrações não
diminuíram a viabilidade celular quando avaliadas pelo test XTT. Porém, com galantamina
não encontramos efeito protetor a baixas concentrações como o relatado por outros autores;
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eles reportaram proteção a concentrações de 0,3 µM na mesma linhagem celular exposta ao
peptídeo Aβ(25-35) (Arias et al., 2005).
Sob as condições testadas em nosso estudo, as maiores concentrações de galantamina
forma aquelas que ofereceram efeitos significativos de neuroproteção. Essas concentrações
estão relacionadas à sua atividade como AChEI, visto que o valor IC50 de galantamina para
bloquear a enzima AChE esta entre 5 e 16 µM (Thomsen et al., 1991; Arias et al., 2004), mais
as concentrações testadas incluem os níveis de galantamina encontrada no sangue após
administração oral (Mannens et al., 2002). Conjuntamente, concentrações entre 0,9 e 10 µM
têm sido relatadas por diminuir a geração do peptídeo Aβ(1-42) no meio condicionado com
células SH-SY5Y (Li et al., 2010); além de modular o estresse oxidativo induzido pelo
peróxido de hidrogênio (500 µM) na mesma linhagem celular (Ezoulin et al., 2008).
O fato de não se ter observado proteção com a menor concentração de galantamina nas
condições aqui testada, não significa que não esteja exercendo um papel biológico de proteção
sob uma das muitas vias desreguladas pelo peptídeo amiloide. Tem sido relatado que a
incubação das células SH-SY5Y por 48 h com 300 nM de galantamina dobrou a densidade
dos receptores nicotínicos α7 e triplicou a expressão da proteína anti-apoptótica bcl-2 (Arias
et al., 2005). Além disso, a galantamina foi mostrada por induzir neuroproteção ao ativar a via
PI3K-Akt através dos nAChRs α7 e a expressão da proteína antiapoptótica bcl-2, tornando a
ativação basal dos nAChRs α7 necessários para a sobrevivência celular (Arias et al., 2004;
Arias et al., 2005; Geerts, 2005). Os efeitos protetores através da expressão de bcl-2 têm sido
associados à habilidade para modificar a homeostase do Ca+2
ao diminuir seus níveis tanto no
retículo endoplásmico quanto no aparelho de Golgi (Pinton et al., 2000; Pinton et al., 2001;
Pinton e Rizzuto, 2006).
Outro mecanismo sugerido, pelo qual a galantamina modula a produção de EROs, NO,
e ONOO-, tem sido relacionado com ao grupo alilico presente na estrutura do alcaloide. A
capacidade antioxidante da galantamina desaparece após a transformação desse grupo em um
grupo carbonila (Traykova et al., 2003; Giunta et al., 2004; Ezoulin et al., 2008). Além disso,
a presença do nitrogênio terciário na estrutura molecular do alcaloide contribui com atividade
antioxidante e pela ação dual, a galantamina bloqueia a AChE e estimula os receptores da
ACh tanto nicotínicos quanto muscarínicos, o que decresce a geração do peptídeo Aβ
(Tsvetkova et al., 2013). Mais recentemente evidências sugerem que a galantamina promove
proliferação das células progenitoras neurais via ativação dos nAChRs α7 e mAChRs
M1(Kita et al., 2014).
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Visto que o extrato e a galantamina apresentaram efeitos protetores, é possível que os
mecanismos de neuroproteção sejam similares, desde que tenha sido relatada a perda do efeito
neuroprotetor para galantamina a concentrações maiores de 10 µM (Ezoulin et al., 2008),
explicado como um bloqueio dos nAChR (Schrattenholz et al., 1996; Angelantonio et al.,
2004). Baseado nessas observações é possível que, por conter maior conteúdo de alcaloides,
altas concentrações do extrato terminem inibindo o efeito biológico como consequência da
saturação o que não permitiria uma interação entre enzimas-substrato, incluindo essas
relacionadas a processos metabólicos como CYP 450, levando à perda de neuroproteção
(Galloway et al., 2011). De forma similar, muitos antioxidantes, dependendo de seu potencial
redox, podem aceitar ou doar elétrons o que pode torná-los protetores ou tóxicos (De Flora,
1998; De Flora et al., 2001) sendo que no último caso a cascata de neuroproteção não pode
ser ativada (Arias et al., 2005).
A instabilidade genômica é provavelmente o mais significante efeito biológico e essa
pode causar expressão alterada de genes, erros nos mecanismos de reparo e função celular
alterada (Jackson e Bartek, 2009). Nesse contexto, parâmetros de dano ao DNA como MNs,
PNPs, BNPs, e quebras nas fitas do DNA foram biomarcadores afetados de forma
significante; demonstrando assim, os efeitos genotóxicos induzidos pelo peptídeo. No entanto,
pós-tratamentos tanto com o extrato quanto com a galantamina diminuíram a expressão desses
biomarcadores.
Uma variedade de agentes pode induzir formação de MNs levando à morte celular,
instabilidade genômica, desenvolvimento de câncer e desordens neurodegenerativos (Migliore
et al., 2005; Migliore et al., 2011; Luzhna et al., 2013). Entre os possíveis mecanismos pelos
quais erros na segregação cromossômica levam à formação de MNs e aneuploidias têm sido
associados a defeitos nas proteínas tau e presenilina, as quais têm um papel importante na DA
e são componentes essências do aparelho mitótico (Iqbal et al., 1989; Iqbal et al., 1998; Jeong
et al., 2000). A toxicidade do peptídeo tem sido sugerida por diminuir a afinidade de proteínas
chaves para a separação cromatídica durante a mitose (Bull et al., 2012). Adicionalmente, a
hiperfosforilação da proteína tau leva à degradação do sistema de microtúbulos, tornando um
aumento nos defeitos do fuso mitótico e desregulação do ciclo celular (Thomas e Fenech,
2006).
O presente estudo contribui para as evidências já relatadas por outros autores, com
relação ao aumento significante do dano no DNA (expressado como MNs e quebras na fita do
DNA) em linfócitos de sangue periférico, fibroblastos e em células da mucosa oral de
pacientes com prejuízo cognitivo leve e DA respectivamente (Migliore et al., 1999; Trippi et
65
al., 2001; Petrozzi, L et al., 2002; Kadioglu et al., 2004; Migliore et al., 2005; Thomas et al.,
2007; Migliore et al., 2011). Segundo estudos referidos, a formação de MNs observados in
vivo podem se dever à má segregação dos cromossomos 13, 17 e∕ou aneuploidias do
cromossomo 21, esse último, amplamente associado tanto à DA quanto à síndrome da Down.
Geralmente, pacientes portadores da síndrome desenvolvem a DA precocemente (Potter,
1991; Migliore et al., 1999; Granic et al., 2010). Porém, existe controvérsia se os danos
citotóxicos e genotóxicos induzidos em fluidos periféricos de pacientes com Alzheimer são
consequência direta do peptídeo amiloide; posto que a barreira hematocefálica oferece
resistência ao movimento de proteínas e células; além disso, as concentrações do peptídeo
Aβ(1-42) no líquido cefalorraquídeo dos pacientes com DA são baixos, devido à retenção em
forma de placas amiloides, por tanto, para alguns autores esses danos citogenéticos
observados em tecidos periféricos de pacientes com a DA podem ser o reflexo da
comorbidade que acompanha à doença (Lue et al., 1999; Lui et al., 2010; Henriksen et al.,
2014; Lee et al., 2014).
Estudos têm mostrado que a exposição da linhagem celular SH-SY5Y ao peptídeo
Aβ(1-42) aumentou os níveis de dano no DNA como determinado pelo ensaio cometa alcalino
(Rusdiah e Ah, 2009). Além disso, estudos em células PC12 expostas ao peptídeo Aβ(25-35)
apresentaram inibição da atividade DNA-PK kinase, comprometendo o reparo nas quebras de
dupla fita; como consequência, houve um aumento nos danos do DNA. No mesmo estudo,
oligômeros do peptídeo Aβ(1-42) entraram no núcleo celular e se acumularam como espécies
oligoméricas insolúveis reduzindo a atividade DNA-PK kinase, além de induzir estresse
oxidativo manifestado em peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e dano genotóxico
(quebras fitas do DNA) (Varadarajan et al., 2000; Cardinale et al., 2012; Tranah et al., 2014).
Contudo, a instabilidade genética induzida pelo peptídeo tem sido associada à contribuição
dos efeitos biológicos que finalmente levam à morte neural (Heaton et al., 2002; Jackson e
Bartek, 2009; Rusdiah e Ah, 2009).
Com base nos resultados obtidos de proteção, tanto o extrato de C. subedentata quanto a
galantamina, apresentaram efeito significante de antigenotoxicidade, cada um a concentrações
diferentes, sendo que para o extrato foram as menores e para a galantamina as maiores, ambas
as concentrações que exibiram efeito significante de proteção. Previamente, tem sido relatado
que os AChEIs como a galantamina podem impactar na via bioquímica envolvida no
processamento da PPA, demonstrando que concentrações de 10 µM induziram aumento (3
vezes ao valor basal) na liberação de um fragmento da PPA alfa solúvel (sPPAα) o que
significa, um processamento da PPA através de uma via não amiloidogênica (Figura 1)
66
mediada pela α secretasse; no entanto, esse efeito da galantamina foi inibido quando se
bloquearam os receptores nicotínicos das células condicionadas no meio; indicando assim,
que a atividade colinérgica da galantamina contribui ao processamento normal da PPA
(Lenzken et al., 2007). Alem disso, concentrações de galantamina 0,9 e 10 µM se mostraram
por inibir a produção do peptídeo Aβ ao estimular a via não amiloidogênica e assim, decrescer
a quantidade da PPA como substrato disponível para a clivagem por β secretasse; enquanto,
concentrações de 0,3 µM exerceram um efeito sobre a produção do peptídeo beta amiloide ao
diminuir a expressão de BACE1 (Li et al., 2010). Esses resultados são interessantes, uma vez
que mostram o papel biológico da galantamina em diferentes concentrações modulando
distintas vias associadas ao processamento patológico da PPA induzida pela neurotoxicidade
do peptídeo Aβ(1-42). Nesse contexto, o decréscimo na geração do peptídeo Aβ(1-42) através de
uma via não amiloidogênica torna-se um evento biológico com consequências favoráveis para
a sobrevivência e estabilidade neural.
A respeito dos efeitos antigenotóxicos exibidos por C. subedentata, é possível que parte
da redução dos diferentes danos seja resultado dos efeitos antioxidantes exibidos pelos
alcaloides presentes no extrato. Muitos deles têm sido previamente relatados por diminuir o
estresse oxidativo gerado por estímulos neurotóxicos (Traykova et al., 2003; Ezoulin et al.,
2008; Oloyede et al., 2010; Romero et al., 2010; Tsvetkova et al., 2013; Jin et al., 2014). Essa
neuroproteção é suportada pelo fato que um antioxidante é capaz de prevenir o dano no DNA
pela estimulação de enzimas de reparo e induzir a replicação fiel do DNA através de um
efeito denominado bio antimutagênico ou como agente desmutagênico que atua diretamente
sobre o mutágeno ou seu precursor em ordem de inativá-lo (Kuroda et al., 1992; Lorenzo et
al., 2009; Rusdiah e Ah, 2009). Adicionalmente, os compostos com propriedades
antioxidantes diminuem o dano oxidativo de outras moléculas por inibir a iniciação ou
propagação da cadeia de reações oxidantes (Bergman et al., 2001; Liu e Nair, 2010).
Na patologia de Alzheimer são muitas as vias fisiológicas que estão alteradas, o que
segundo alguns autores levam à formação de PNs, NNFs, processos oxidativos e
inflamatórios. Essas ocorrências neuropatológicas associadas à perda neural são sempre
acompanhadas de déficit colinérgico; não obstante, saber se essas ocorrências são causa ou
consequência para doença continua sendo ainda tema de discussão (Felsenstein et al., 2014;
Morris et al., 2014). Tentar restaurar a função colinérgica tem sido um alvo promissor para as
drogas usadas no tratamento sintomático da enfermidade; porém, devido à mesma
complexidade patológica, as bases moleculares dos fármacos disponíveis não modificam o
curso da enfermidade, uma explicação poderia estar sustentada no fato que a DA é o resultado
67
de alterações em múltiplas vias e os fármacos disponíveis geralmente tem como alvo apenas
uma via, a colinérgica (Carrillo et al., 2013; Anand et al., 2014; Henriksen et al., 2014).
A natureza é uma fonte rica em diversidade de estruturas químicas com muitas
propriedades biológicas para a saúde; no entanto, muitas dessas moléculas por serem únicas e
complexas não conseguem ser obtidas facilmente por síntese química (Natarajan et al., 2013).
Em atenção a isso, vem sendo publicado que os extratos totais exercem um melhor efeito
bioprotetor devido à interação sinérgica de cada um dos diferentes compostos ativos
(Bergman et al., 2001; Calderón-Segura et al., 2007; Wu et al., 2011; Kim et al., 2012;
Venuprasad et al., 2013). Por outro lado, uma vez identificados muitos dos metabolitos
presentes em um extrato, esses fornecem um caminho para o desenvolvimento de fármacos,
sem esquecer que muitas dessas moléculas apresentam certo nível de citotoxicidade; ainda
isso, atualmente não seja muito relevante, devido ao fato de que moléculas com características
promissoras podem ser modificadas estruturalmente a fim de torná-las menos tóxicas.
Existem aproximadamente 500 alcaloides derivados das Amaryllidaceaes e têm sido
divididos em 18 tipos estruturais, baseados em uma hipotética via biosintética (Jin, 2009);
interessantemente, ver que a maioria dos alcaloides tipo licorina e galantamina dessa família
apresentam atividade AChEI (López et al., 2002a; Elgorashi et al., 2004; Larsen et al., 2010;
Bay-Smidt et al., 2011). No entanto, exibir características colinérgicas, antioxidantes ou anti-
amiloidogênicas não são propriedades suficientes para garantir sucesso biológico, inda essas
funções sejam observadas in vitro ou em modelos biológicos. Uma das muitas limitantes e
talvez a mais relevante na DA seja a incapacidade farmacológica de uma substancia em
conseguir atravessar a barreira hematoencefálica. Estima-se que o 98% dos candidatos a
fármacos do sistema nervoso central não conseguem atravessá-la (Pardridge, 2007).
O percurso para uma substância atravessar a barreira hematoencefálica tem sido descrita
por acontecer mediante a difusão passiva; no entanto, compostos com propriedades físico-
químicas ótimas podem ainda ser impedidas pela atividade dos transportadores de efluxo
como a glicoproteina P (P-gp) a qual exerce um papel na resistência ao passo de moléculas
através da barreira hematocefálica (Schinkel, 1999; Li et al., 2007). As moléculas com
capacidade para vencer essa resistência e que tornam-se candidatas adequadas para o
desenvolvimento de agentes neuroprotetores devem reunir certas característica como: peso
molecular abaixo de 450 Da, número de doadores de hidrogênio menor que três, aceptores
menor que sete e os compostos devem ser neutros ou básicos com pKa de 7,5-10,5 (Pajouhesh
e Lenz, 2005; Eriksson et al., 2012). Por comparação, os alcaloides das Amaryllidaceaes estão
no intervalo menor dos substratos conhecidos (270-320 Da). Eles são mais carregados
68
positivamente a pH fisiológico (pKa: 7,1-9,1) e têm valores logD7.4 negativos, indicando
hidrofilicidade relativa, o que pode contribuir para a sua baixa ou interação ausente com P-gp
(Eriksson et al., 2012). Contudo, prévios estudos têm relatado que muitos dos alcaloides
presentes nas Amarylludaceaes apresentaram fraca ou não interagirem com a P-gp (Hohmann
et al., 2002; Keogh e Kunta, 2006; Namanja et al., 2009). A afinidade da galantamina a P-gp
tem sido descrita como baixa, enquanto, a licorina não apresentou interação (Heinrich e Teoh,
2004; Keogh e Kunta, 2006; Namanja et al., 2009). A falta de interação com P-gp na barreira
hematocefálica, torna os alcaloides presentes na família Amaryllidaceae como metabolitos
promissores com capacidade para atingir diferentes alvos no cérebro, enquanto aqueles que
não conseguem atravessar a barreira hematocefálica mas apresentam propriedades biológicas
poderiam regular vias periféricas alteradas que acompanham à doença.
Em relação ao efeito neuroprotetor in vitro induzido pelo extrato de C. subedenta, os
nossos resultados concordam com estudos relatados na literatura, segundo os quais os extratos
naturais podem funcionar como terapias modificadoras da DA, no entanto, seu potencial raras
vezes tem sido avaliado criticamente in vivo, e na medicina tradicional não tem sido testado
com rigor científico (Felsenstein et al., 2014). Entendendo de fato, que disfunções cognitivas
não são apenas dependentes do decréscimo no sistema de neurotransmissão colinérgica
(Williams e Spencer, 2012). Em virtude disso, os extratos de produtos naturais podem ter
ação benéfica na DA, por exemplo, os compostos polifenólicos poderiam funcionar como
agentes antiagregantes ou antioxidantes e os esteróis poderiam ter ação neuroprotetora ou
anti-inflamatório e possivelmente interagir diretamente com o peptídeo beta amiloide
(Weinreb et al., 2004; Lin, 2011; Natarajan et al., 2013; Singh, 2013).
Para alguns autores, a medicina e a farmacologia moderna é reducionista, com um
único composto para uma doença específica. Isso parece válido, mas geralmente tem efeitos
colaterais inevitáveis. Por exemplo, a terapia anticâncer pode danificar totalmente o sistema
imunológico do paciente levando-o à morte precoce comparativamente aos mesmos não
tratados. Enquanto, os compostos de origem vegetal, não só podem curar a doença, mas
também podem aumentar a habilidade imunológica do paciente, devido à mistura de
metabolitos com efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios (Libro et al., 2016).
Embora, a ação neuroprotetora da galantamina esteja bem estudada, a ação sinérgica
resultante da combinação dos diferentes metabolitos presentes no extrato é uma valiosa
alternativa no contexto da hipótese que compostos multialvos podem ser mais eficazes na
prevenção ou retardo da morte neuronal. No extrato de C. subedenta, além de conter
galantamina também contem licorina e haemantamina. A licorina tem mostrado significante
69
efeito inibidor da AChE, inclusive maior que galantamina (López et al., 2002b) e a
haemantamina tem sido relatada por apresentar atividade antioxidante (Oloyede et al., 2010).
O conceito pelos quais os AChEIs podem ter efeito pleiotrópico em adição ao bloqueio da
enzima AChE, melhoramento da neurotransmissão colinérgica e atividade antioxidante os
torna uma nova estratégia como agentes com potencial terapêutico em doenças
neurodegenerativas como Alzheimer (Libro et al., 2016).
Estratégias para a descoberta de fármacos focados na ação sobre um alvo específico têm
sido amplamente discutidas, considerando que podem ter limitada aplicabilidade em doenças
multifatoriais como Alzheimer, onde um set de eventos bioquímicos e alvos proteicos estão
envolvidos. Na última década, a polifarmacologia tem emergido como uma estratégia capaz
de atuar simultaneamente sobre diversos alvos moleculares e os LDMAs são uma área dos
produtos naturais mais relevantes por mostrar “efeito multiplicativo” ao adicionar duas ou
mais drogas (Costantino e Barlocco, 2012; Agis-Torres et al., 2014; Guzior et al., 2015). Os
compostos híbridos ligados de forma covalente podem adquirir maior efeito sinérgico,
levando a uma potência farmacológica maior que a soma das potências de cada porção
individual (Müller-Schiffmann et al., 2012).
Estudos experimentais combinando duas ou mais fármacos têm mostrado resultados
muito alentadores para doenças multifatoriais. A sinalização dos receptores canabinoides
(CB1Rs) tem sido sugerida por desempenhar um papel importante na regulação da memória e
cognição. Resultados de um estudo mostraram que a combinação de SLV330, um antagonista
dos CB1R e o fármaco donezepil apresentou um efeito sinérgico aditivo, maior ao reportado
quando foram administrados isoladamente tanto em camundongos quanto em ratos Wistar
com déficit cognitivo associado à idade e ao induzido pela escopolamina (De Bruin et al.,
2010). Em outro estudo, concentrações subefetivas de melatonina (0,3nM) e galantamina (30
nM) mostraram um efeito sinérgico com uma proteção significante a qual foi similar à
máxima proteção proporcionada pela melatonina ou a galantamina individual na maior
concentração (Romero et al., 2010). Posteriormente, um estudo realizado em pacientes com
DA nos estádios de leve a moderada, investigou o efeito do genótipo APOE na resposta
clínica à monoterapia com remendo de rivastigmina e à combinação de memantina mais
remendo de rivastigmina; se encontrando que pacientes com o alelo APOEε4 responderam
mais favoravelmente à combinação de memantina e rivastigmina (Han et al., 2012).
Mais recentemente, outro estudo comparou a atividade neuroprotetora e atividade
AChEI de diferentes alcaloides provenientes de plantas da familia Amaryllidaceaes frente a
neurotoxicidade induzida pelo glutamato. A neuroproteção foi avaliada em neurônios corticais
70
de rato e atividade AChEI pelo método de Ellman. Os resultados mostraram que os extratos
alcaloides apresentaram alta neuroproteção tanto em pré como em pós-tratamentos frente ao
estímulo exitotóxico do glutamato. Os alcaloides dos extratos de C. jagus e Z. carinata
apresentaram uma atividade AChEI com valores IC50 de 18,28 ± 0,29 e 17,96 ± 1,22 mg/mL,
respectivamente; enquanto a galantamina usada como controle não apresentou efeito protetor.
O estudo conclui, sugerindo que os efeitos neuroprotetores podem estar associados à presença
de alcaloides tipo licorina e crinina, ao mesmo tempo em que a atividade AChEI pode estar
relacionada com os alcaloides tipo galantamina e licorina (Cortes, Posada-Duque, et al.,
2015). Ultimamente, resultados de um meta análise relataram que a combinação de duas
terapias com AChEIs como galantamina e donepezil em pacientes com demência vascular
apresentou maior efeito terapêutico ao reportado no grupo controle que receberam placebo
(Chen et al., 2016).
Neste trabalho, o extrato de C. subedentata e a galantamina foram testados em pós-
tratamentos, baseados na oportunidade de encontrar novas fontes de alcaloides com potencial
para decrescer ou inibir a neurotoxicidade previamente iniciada na DA. A relevância dos
extratos como possíveis agentes neuroprotetores no contexto da neurodegeneração, precisam
que o estudo seja levado em neurônios que previamente tenham sido submetidos ao dano
neurotóxico, porque esse modelo estaria perto do que hipoteticamente acontece no cérebro de
um paciente com Alzheimer. Sabe-se que a manifestação clínica da doença tornar-se visível
20 ou 30 anos após ter dado início à manifestação patológica (Reiman et al., 2012). No
entanto, antes de se estabelecer algum tipo de estratégia fito preventiva, pesquisas, em
condições sob as quais os compostos fitoquímicos promovem benefícios e previnem, retardam
ou diminuem o dano neurotóxicos são requeridas (Barcelos et al., 2007).
Teorias contemporâneas em neurociências têm revelado um maior conhecimento
associado à memória, sustentando uma relação integral em que a estabilização, consolidação e
formação da memória gira em torno da plasticidade neural (Jesky e Hailong, 2011); em
consequência, essa mesma plasticidade forneceria uma estratégia terapêutica frente à
neurodegeneração na DA. Um aumento da neurogênese no cérebro de pacientes com DA
pode ser aumentada ao estimular as células tronco na maior zona neurogênica, a zona
subventricular no ventrículo lateral e no giro denteado do hipocampo. As células tronco são
persistentes e têm capacidade única para gerar neurônios no cérebro adulto de humanos e
outros mamíferos (Deleyrolle e Reynolds, 2009; Lilja et al., 2013).
Neste contexto, os modelos biológicos para a indução de diferenciação neuronal,
fornecem uma janela de oportunidades para avaliar o potencial terapêutico de AChEIs com
71
possível propriedade estimulante da neurogênese, Entendendo-se a neurogênese como um
processo de geração de neurônios funcionais a partir de seus precursores imaturos (Ming e
Song, 2011). A capacidade de uma célula para se diferenciar é muito gratificante, não só por
que fornece respostas significativas para perguntas chaves acerca da neurogênese em tecido
adulto, mas também gera um impacto sobre os princípios gerais da regulação de células
tronco, desenvolvimento, plasticidade neural e mecanismo da doença (Ming e Song, 2011).
Os AChEis como a galantamina têm sido mostrados por induzir a neurogênese no
hipocampo. Ainda que os mecanismos não estejam elucidados, acredita-se que possam estar
influenciados via ativação dos nAChRs α7, M1 e o IGF2 os quais poderiam estar estimulando
a sobrevivência das células imaturas na camada das células granulares (Kita et al., 2014). Tem
sido relatado que o IGF2 regula a proliferação das células tronco hipocampais através da via
AKT. Essa via parece estar envolvida em sobrevivência neural, estímulo da sinalização anti
apoptótica, além de inibir a autofagia, via que tem um papel importante nos desordens
neurodegenerativos (Heras-Sandoval et al., 2014). A disfunção cognitiva em pacientes com
DA tem sido associada com um declínio nos níveis de fatores de crescimento, transporte
axonal e marcada degeneração dos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal (Wicklund et
al., 2010).
Em nosso trabalho, as células expostas à máxima concentração do extrato de C.
subedentat exibiram maior comprimento dos dendritos celulares, ao mesmo tempo em que
diminuíram a proliferação celular; características que têm sido fortemente associadas com o
processo de diferenciação. A indução da diferenciação e formação sináptica requerem
mudanças na morfologia celular, acompanhada pela inibição do crescimento celular,
modificações na condutância do sódio, aumento no crescimento de neurites, reciclagem de
vesículas sinápticas e atividade AChE (Toselli et al., 1996; Hall et al., 2000; Stio et al., 2001;
Sarkanen et al., 2007; Cheung et al., 2009). Recentemente, foi demonstrado que a
diferenciação celular induzida nas células SH-SY5Y esteve influenciada pela expressão de
proteínas como tau e MAP2 (Graser et al., 2015). Estas proteínas estão associadas aos
microtúbulos e contribuem como suporte estrutural da célula assegurando o transporte axonal
(Caceres e Kosik, 1990; Zhang e Dong, 2012). A indução de diferenciação nas células SH-
SY5Y foi sugerida como modelo para recriar parte da emergente hipótese sob a neurogenesis
e∕ou neurodiferenciação, ainda que as vias de sinalização que conduzem à diferenciação
terminal dessas células sejam desconhecidas (Teppola et al., 2016).
A identificação de moléculas a partir das plantas para modular a atividade do sistema
nervoso central hipocampal torna-se valiosa como estratégia terapêutica para a expansão
72
celular (Schneider et al., 2008; Dakas et al., 2013; Yang et al., 2014). Recentemente, foi
demonstrado que os alcaloides presentes no extrato total de Alstonia scholaris promoveram
proliferação das células tronco adultas, de uma maneira dose dependente, estimulando a via
de sinalização Wnt (Yang et al., 2014). No entanto, a capacidade das plantas para induzir a
neurogenesis não se restringe unicamente aos alcaloides. Metabolitos polifenólicos como o
epigalocatequina-3-galato (EGCG) o principal constituinte do chá verde foi indicado por
aumentar a neurogênese adulta hipocampal (Wang et al., 2012), ademais, compostos
polifenólicos como os curcuminoides que exibem propriedades anti-inflamatórias,
antioxidante e antiamiloide foram sugeridos como responsáveis pela indução de diferenciação
em células PC12 (Liao et al., 2011).
A neuroproteção induzida pelos compostos vegetais é muito ampla com capacidade para
induzir regulação gênica e epigenética. Os mecanismos epigenéticos constituem uma
importante abordagem pelo qual os componentes da dieta podem seletivamente ativar o
inativar a expressão de genes (Reuter et al., 2011). Alguns polifenoes e isoflavonas têm sido
amplamente estudados como potenciais agentes desmetilantes. Um dos mecanismos está
associado à capacidade para gerar S-adenosil-s-homocisteina, um potente inibidor da
metilação do DNA; adicionalmente, outros polifenoes podem estabelecer ligações de
hidrogênio com diferentes resíduos catalíticos das DNA metiltransferase (DNMT) e assim
atuar como inibidores diretos da DNMT1 (Fang et al., 2003; Fang et al., 2005). Compostos da
dieta como o resveratrol que ativam uma classe de histonas deacetilases HDACs III (sirtuinas)
está crescendo rapidamente pelo seu demonstrável papel no prolongamento da vida e em
reduzir ou retardar as doenças associadas à idade (Baur, 2010). Os flavonoides e alcaloides
como mahanina e seus análogos têm sido encontrados por restaurar a expressão de genes
silenciados por mecanismos epigenéticos (Sheikh et al., 2010; Schneider-Stock et al., 2011;
Busch et al., 2015) o que torna à epigenética em uma nova classe de estratégias terapêuticas.
Estudos recentes têm relatado que genes como PSN1 e APOE que participam no
processamento do peptídeo Aβ mostram uma significante variabilidade epigenética
interindividual, contribuindo à predisposição para a DA (Wang et al., 2008; Fuso et al., 2011;
De Bem et al., 2016). A hipometilação de PSEN1 pode induzir sua própria expressão o que
resulta na desregulação na produção do peptídeo Aβ (Tanzi e Bertram, 2005). Por outro lado,
a inibição da DNMTs aumentou os níveis de expressão da APP, β e γ secretases (Liu et al.,
2016).
Resultados de nossa pesquisa não mostraram influência epigenética quando avaliados os
perfis de metilação dos genes associadas ao processamento amiloide. No entanto, isso não
73
significa que ditos mecanismos não estejam sendo exercidos; talvez a mesma técnica ou o
modelo experimental não sejam os suficientemente apropriados para detectar pequenas
modificações mas que podem ser significantes para modular a expressão dos genes. Para
alguns autores, pequenas mudanças na metilação dos promotores do DNA em células
vulneráveis poderiam não ser detectadas homogeneamente, no entanto, esses resultados
devem ser interpretados com cuidado, particularmente quando eles se relacionam a doenças
degenerativas crônicas, nas quais pequenas modificações podem ser suficientes para modular
a progressão da doença (Barrachina e Ferrer, 2009).
Assim, o potencial de compostos derivados de plantas na prevenção e cura de muitas
doenças é inegável, talvez em doenças como Alzheimer, não se tenha o tempo suficiente para
verificar os resultados do tratamento, isso devido ao restrito tempo de vida do paciente após a
manifestação clínica da doença; no entanto, como estratégia preventiva baseada em dados da
literatura científica, as plantas fornecem uma valiosa fonte para futuras estratégias
terapêuticas.
74
6 CONCLUSÕES
1. O peptídeo beta amiloide(1-42) induziu atividade citotóxica e genotóxica nas condições
testadas.
2. Estudos de docking molecular in sílico e os realizados in vitro mostraram atividade
inibitória da acetilcolinesterase do extrato de C. subedentata.
3. O extrato de C. subedentata nas concentrações de 6,2 e 12,5 µg∕mL exerceu atividade
protetora frente ao dano citotóxico e genotóxico induzido pelo peptídeo, o qual suporta a
importância dos extratos totais das Amarilidáceas como fonte de metabolitos com
potencial efeito neuroprotetor, possivelmente devido ao sinergismo de suas frações
fitoquímicas.
4. A galantamina na concentração de 10 µM apresentou um efeito modulador, com relação à
proteção frente aos efeitos citotóxicos e genotóxicos induzidos pelo peptídeo beta amiloide
(1-42).
5. Tanto o extrato de C. subedentata quanto a galantamina reduziram as alterações
mitocondriais induzidas pelo peptídeo beta amiloide(1-42).
6. C. subedentata na maior concentração (25 µg∕mL) avaliada apresentou potencial efeito
como indutora de diferenciação celular.
7. Os estudos realizados com extratos totais sugerem uma janela de oportunidades para testar
e avaliar novos compostos fitoquímicos na procura de novos alvos terapêuticos, a fim de
intervir em diferentes circuitos biológicos em doenças complexas como Alzheimer.
75
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96
ANEXOS
ANEXO A- MANUSCRITO: Em revisão: Revista Nuerotoxicology. Ref. No. NEUTOX-D-16-00244
Galanthamine decreases genotoxicity and cell death induced by β-amyloid peptide in SH-SY5Y
cell line
Willian O. Castilloa*
, Andrés F. Aristizabal-Pachona, Ana P. de Lima Montaldi
b, Elza T. Sakamoto-
Hojoa,b
, Catarina S. Takahashia,b
a Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo – USP, Brazil
b Department of Biology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters at Ribeirão Preto, University of
São Paulo – USP, Brazil
*Corresponding author at: W.O Castillo, Department of Genetics, Ribeirão Preto Medical School,
University of São Paulo – USP, 14049-900 Ribeirão Preto, SP, Brazil.
E-mail address: [email protected]
Abstract
Biochemically, Alzheimer´s disease (AD) is characterized by the presence of abnormal deposition of
beta amyloid peptide (Aβ(1-42)), which is generated by proteolytic processing from its precursor, the
amyloid precursor protein (APP) in a non-physiological pathway. The presence of Aβ(1-42) in the brain
is strongly correlated with cognitive impairment, cholinergic deficiency, bioenergetics disruption, cell
death and DNA damage. Galanthamine is an acetylcholinesterase inhibitor (AChEi) used to
symptomatic treatment of Alzheimer´s disease (AD). Several studies have showed that galanthamine
has antioxidant properties, anti-apoptotic action and also promotes neurogenesis; however, it is
unknown whether galanthamine may present protection mechanisms against Aβ(1-42)-induced genomic
instability. To understand the mechanisms of this neuroprotection, we studied the effects of
galantamine on the cell toxicity, DNA strand breaks and mitochondria damage induced by Aβ(1-42)
using a set of biomarkers such as clonogenic assay, cytokinesis block micronucleus cytome
(CNMcyt), comet assay and transmission electron microscope (TEM). The results showed that
galanthamine treatments were capable to significantly reduce the Aβ(1-42)-induced cytotoxicity and
genotoxicity. Furthermore, galanthamine modulated Aβ(1-42)-induced mitochondrial morphological
alterations. In conclusion, this study demonstrated that in addition to inhibition of acetylcholinesterase
(AChE), galanthamine exerts antigenotoxic properties. This relevant property of galanthamine is
worthwhile exploring further which may improve the development of new diseases-modifying agents.
Keywords: Alzheimer disease; micronucleus test; comet assay
1. Introduction
Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia worldwide. The etiology is
multifactorial, and pathophysiology of the disease is complex (Anand et al., 2014). It has been
estimated that 35.6 million people lived with dementia worldwide in 2010, with expectation to double
these numbers every 20 years, to 65.7 million in 2030 and 115.4 million in 2050, due to the
complexity of this disease and increase in the population with advanced age, AD has been considered
as the public health crisis in the 21st century (Snyder et al., 2014).
Neurophathologically, the brain of AD patients is characterized by two classic hallmarks that define
the pathological features of disease: accumulation of senile plaques (SPs) and hyperphosphorylation of
tau protein (Ezoulin et al., 2008). SPs are extra cellular deposits composed of various peptide
fragments Aβ(1-40) and Aβ(1-42) derived from the proteolytic processing of amyloid precursor protein
(APP), an integral membrane protein (Ashe and Zahs, 2010). Evidences have shown that these
97
proteins generate deposits in specific areas of the brain, and they are critic factors involved in loss
memory and cognitive impairment in AD patients (Li et al., 2010; Shi et al., 2009). Although the
etiopathogenesis of the disease remains unknown, growing evidence suggests that soluble oligomers
of Aβ(1-42) are potentially toxics (Bao et al., 2012; Rosenblum, 2014). In addition, Aβ(1-42) has been
reported to generate reactive oxygen and nitrogen species, such as hydrogen peroxide (H2O2) and
nitric oxide (NO), lipid peroxidation, proteins oxidation and DNA and RNA damage (Chang et al.,
2014; Lee et al., 2014; Rusdiah and AH, 2009). Nevertheless, the pathological changes include other
biological alterations such as mitochondrial dysfunction, synapse loss and neuronal death, resulting
from vulnerability to stress and oxidative damage (Chen and Yan, 2006; Mossmann et al., 2014), in
parallel with a depletion of antioxidant system (Chang et al., 2014).
Likewise, there is a severe loss of cholinergic neurons and nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs),
which are correlated with severity of AD disease at the time of death (Bao et al., 2012; Nordberg,
2001). The progressive deterioration of cholinergic system and pharmacological evidence of
acetylcholinesterase inhibitors (AChEIs) has led to the development of a widely accepted cholinergic
hypothesis; and becomes evident by drugs such as donepezil, rivastigmine and galanthamine, which
act as AChEIs to increase the concentration of acetylcholine (ACh) between the synaptic cleft and
modulate the nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) such as potent allosteric ligands (Arias et al.,
2005; Maelicke and Albuquerque, 2000; Matsuzono et al., 2015). Galanthamine, a competitive
acetylcholinesterase inhibitor (AChEi) with antioxidant properties, is the most important and a quite
widespread alkaloid compound present in Amaryllidaceaes (Heinrich and Lee Teoh, 2004; Unver,
2007), and due to its ability to penetrate the blood–brain barrier and specifically to augment central
cholinergic functions, thus preventing neurodegeneration, galanthamine has become an important and
promising therapeutic option used to slow down the process of neurological degeneration (Hilmas et
al., 2009; Kita et al., 2014; Kita et al., 2013). Unlike other AChEIs such as donepezil, tacrine and
rivastigmine, galanthamine has a weak AChEi effect. However, it has a dual mode of action, since it
inhibits acetylcholinesterese and interacts allosterically with nAChRs to potentiate the sensitivity of
acetylcholine receptors (Maelicke et al., 2001; Wang et al., 2007). Additionally, galanthamine
modulates non-amyloidogenic processing of APP by inhibiting BACE (beta-site APP-cleaving
enzyme) expression (Li et al., 2010).
The purpose of the present study was to explore whether galanthamine exerts antigenotoxic effects
against Aβ(1-42)-induced DNA damages in undifferentiated human neuroblastoma SH-SY5Y cells. DNA
damage was evaluated by the cytokinesis block micronucleus cytome (CNMcyt) and comet assays,
which are highly sensitive and simple methods capable of providing relevant results regarding the
antigenotoxicity potential of galanthamine (Araldi et al., 2015; Muñoz Aristizábal, 2009).
2. Material and methods
2.1 Preparation of beta amyloid peptide Aβ(1-42) and galanthamine
Aβ(1-42) peptide was prepared as previously described (Liu et al., 2005). The stock solution of Aβ(1-42)
(Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA) was dissolved at 1 mg/mL in 100% 1,1,1,3,3,3-exafluoro-2-
propanol (HFIP), sonicated in a water bath for 10 min, aliquoted into micro centrifuge tubes, dried
under vacuum and stored at -20°C. Immediately prior to use, the HFIP-treated Aβ(1-42) was dissolved in
1mg/mL dimethylsulfoxide (DMSO). Galanthamine (Janssen Pharmaceutical, Berchem, Belgium);
stock solution was prepared as described by Ezoulin et al. (2008). The final methanol concentration in
the culture medium was 1:100 (v/v).
2.2 Cell line and culture conditions
SH-SY5Y cell line was purchased from the Rio de Janeiro Cell Bank (Brazil). For the experiments,
cells were cultured in HAM F1O/DMEM (1:1) medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)
containing 2mM L-glutamine, 20% Fetal bovine serum (Cultilab, Campinas, SP, Brazil) and 1%
98
penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) at 37°C with 5% CO2 in humidified
air. For each experiment, SH-SY5Y cells were treated with Aβ(1-42) 10 μM for 24 h. After this period,
the medium was removed and replaced with fresh culture medium and exposed to galanthamine (0.1,
1.0 and 10 μM) for 24 h.
2.3 Clonogenic assay
The procedure to assess clonogenic survival was carried out according to (Coccini et al., 2014), with
minor modifications. Cells were grown in 6-well plates at a density of 300 cells/well containing 2 mL
of cell culture medium and incubated for 24 h. SH-SY5Y cells were then treated as described above
with Aβ(1-42) and galanthamine; at the end of treatments, the medium was removed and cells were
rinsed and incubated in a fresh culture medium for 10 days, a period required for the colony formation.
After this period, culture medium was discarded and cells were washed with PBS, fixed and stained
with Giemsa solution (1: 20 phosphate buffer, pH 7.0) for 10 min. A colony is defined as a cluster of
at least 50 cells and colonies with ≥ 50 cells were counted.
2.4 Measurements of cell death
SH-SY5Y cells were plated onto 12-well plates (2x105 cells per well), incubated overnight and treated
as described previously with Aβ(1-42) and galanthamine. Finally, the culture medium (with dead cells in
suspension) was transferred, adherent cells were trypsinized, and the suspension was centrifuged. Cell
pellets were stained with 1mg/mL propidium iodide (BD Biosciences, San Jose, CA, USA),
fluorescein diacetate (1.5 mg/mL) and Hoescht solution (1 mg/mL). The cells were analyzed by BX51
fluorescence microscopy (Olympus, Tokyo, Japan) using a triple filter (DAPI, Propidium, and FITC).
Evaluation of apoptotic and necrotic cells was based on the cell staining as follows: normal cells
(spherical blue nuclei stained by Hoescht, green cytoplasm); apoptotic cells (blue fragmented nuclei
and green cytoplasm, apoptotic bodies stained by Hoescht) and necrotic cells (homogeneus red nuclei,
red cytoplasm, colored by the Propidium iodide) as proposed previously (Duarte et al., 2010;
Korostoff et al., 1998).
2.5 Cytokinesis block micronucleus cytome (CNMcyt)
Briefly, SH-SY5Y cells were cultured at seeding density of 1 x 106
cells for 24 h and treated as
initially described with Aβ(1-42) and galanthamine. After treatment, the culture medium was discarded
and cells were rinsed with PBS and incubated with fresh culture medium containing 2µg/ml
Cytochalasin B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and incubated for another 24 h. At the end of
incubation, cells were harvested, treated with cold hypotonic, KCl solution (0.075M), and centrifuged
(1500 x g for 7 min) then, cells were fixed in cold methanol and acetic acid (3:1) solution and
immediately centrifuged. The fixation step was repeated three times, and cells obtained were
resuspended in a small volume of fixation solution. The cytological preparations were made in
duplicated and stained with 10% Giemsa solution (pH 7.4) for 10-15 min. The positive control was
doxorubicin (0.4 g ∕mL) for 2 h. Micronuclei in binucleated cells (MNBNCs), nucleoplasmic bridges
(NPBs) and nuclear buds (NBUDs) were analyzed as previously described (Fenech, 2007). MN
frequencies were determined in 1000 binucleated cells (BNCs). Five hundred cells were scored to
determine the nuclear division index (NDI), which was calculated by applying the formula
NDI=(M1+2M2+3M3+4M4)/N, where M1-M4 represent the number of cells with 1-4 nuclei, and N is
the total number of viable cells scored.
2.6 Comet Assay (Assessment of DNA damage)
The comet assay was used to assess DNA damage as previously described (He et al., 2008; Singh et
al., 1988), with minor modifications. SH-SY5Y cells were cultivated at a seeding density of 8x105
cells for 24 h and treated as described above. Once the exposure was completed, SH-SY5Y cells were
assayed for viability using trypan blue dye exclusion and only cultures showing cell viability above 70
% were considered as suitable for the assay. Firstly, a base layer of 1.5% normal melting point agarose
99
(NMPA) was placed on the frosted glass microscope slide. The agarose was allowed to solidify at
room temperature. Then, a sample of 10 µL of cell suspension mixed with 75 µL of low melting point
agarose (LMPA- 0.75%) at 37°C was added on the slide and covered with a coverslip. The slides were
kept on ice for 15 min, and then the coverslips were gently removed and the slides were immersed in
lyses solution composed of NaCl (2.5M), Tris (10mM), EDTA (100mM) supplemented with 10% of
Triton X-100 and 10% of DMSO, overnight at 4°C. At the end of lysing period, slides were transferred
to an electrophoresis box, which was filled with freshly made electrophoresis buffer (EDTA 200Mm,
10N NaOH, pH >13) to allow the DNA to unwinding. A current of 25V/300mA was applied for 20
min. After that, the slips were submerged in a neutralization buffer (0.4M Tris (pH 7.5) for 15 min,
dried at room temperature and fixed in 100% ethanol for 3 min. SYBER-Green (Thermo Fisher,
Waltham, MO, USA) was added to each slide and covered with coverslip. Image analysis was
performed using a fluorescence microscope (Nikon, Tokyo, Japan), equipped with the imaging system
Comet Assay IVTM
Software (Perceptive Instruments, St Francis House, UK). A total of 100 nucleoids
were scored for each dose. DNA damage was expressed as percentage of DNA in the comet tail (Tail
Intensity).
2.7 Transmission Electron Microscopy (TEM)
SH-SY5Y cells were plated onto 6-well plates (5 x 104 cells per well) and cultured for 24 h. After
treatments, cells were fixed in glutaraldehyde and then rinsed in sodium phosphate (0.1 M) pH 7.3;
post-fixed in 1% OsO4. Finally, cells were rinsed with sodium phosphate buffer (0.1M, pH 7.3),
dehydrated through a graded series of 30 to 100% ethanol, infiltrated and polymerized in EMbed 812
resin (EMS). Serial semithin sections (0.5 µm) were cut with an Ultracut UC-6 (Leica, Heidelberg,
Germany) and stained with toluidine blue. Ultracut-prepared ultrathin sections (70 nm) were collected
on copper grids and contrasted with uranyl acetate and lead citrate. Finally, photomicrographs were
obtained with a TEM (JEOL-JEM 100CXII) using a digital camera Hamamatsu ORCHA-11R).
2.8 Statistical analysis
Data obtained from three independent experiments with respective triplicates, and results are
expressed as mean ± standard deviation (S.D). Statistical analysis was performed by an overall one-
way analysis of variance (ANOVA) and Bonferroni post hoc test when significant differences were
observed, using GraphPad Prism Version 5.01 for Window (GraphPad Software Inc. USA). A p value
less than 0.05 denoted a statistically significant difference.
3. Results
3.1. Galanthamine protective effects against (Aβ)1-42-induced inhibition of cell proliferation
Clonogenic survival assay confirmed that SH-SY5Y cells were sensitive to treatment with Aβ(1-42) (10
μM). In vitro cytotoxicity due to a short exposure to toxic stimulus exerted an effect that was observed
along (10 days), by disturbing the colony formation. Under our experimental conditions, 10 μM Aβ(1-
42) for 24 h significantly decreased survival rate and colony formation capacity of cells when compared
to the control (p < 0.0001); however, galanthamine treatments significantly improved the cell
recovering, as observed by the survival rates, and the capacity of cell colony formation (Fig. 1); the
maximum recovering was observed at 10 μM galantamine (p < 0.001) compared to cells treated with
Aβ(1-42).
3.2. Effect of Aβ(1–42) on mitochondrial morphology
The effect of Aβ(1–42) on mitochondrial morphology of SH-SY5Y neuroblastoma cells was examined
using TEM images. SH-SY5Y untreated cells showed endoplasmic reticulum and mitochondrial
membranes with normal appearance (Fig. 2. a). However, cells exposed to Aβ(1–42) 10 µM exhibited
severe morphological changes in the mitochondrial and endoplasmic reticulum. After exposure, the
endoplasmic reticulum appeared distended and degranulated, and we observed swelling mitochondria
100
with loss of internal membrane structure (Fig. 2. b, c). After galanthamine treatment (10 µM), SH-
SY5Y cells showed a nearly normal ultra-structure (Fig. 2. d) compared to cells exposed to Aβ(1–42),
indicating that Aβ(1–42)–induced morphological changes were reverted in mitochondria, endoplasmic
reticulum and Golgi complex, demonstrating that galanthamine protected SH-SY5Y cells against Aβ(1–
42)-induced toxicity.
3.3. Galanthamine treatments decrease Aβ(1-42)-induced cell death
In order to characterize cell death we used a differential staining technique with specific
fluorochromes to study the effects of Aβ(1-42) exposure in the presence or absence of galanthamine. It
was possible to detect a significant percentage of necrotic cells (13.7%) compared to the controls
(8%), indicating that exposure to the Aβ(1-42) alters the relative proportions of living and dead cells
(Fig. 3), and it induces a significantly higher percentage cell death by necrotic rather than apoptosis
(p<0.05). However, after treatment with 10 µM galanthamine there was a significant decrease in the
amount of necrotic cells compared to cells exposed to Aβ(1-42), while low galanthamine concentrations
had no effects.
3.4. Galanthamine protective effect against Aβ(1-42)-induced genotoxicity
To study the genotoxicity effects induced by Aβ(1-42), we conducted experiments on micronucleus and
comet assay. The results for the micronucleus assay showed that Aβ(1-42) exposure had a stronger
impact on NDI and DNA damage (Table 1). Aβ(1-42) exposure significantly decreased NDI and
increased genomic instability events (MN, NPB and NBUD) compared to untreated control (p<0.05).
In contrast, after galanthamine treatment at 10 μM a significant reduction was observed for all these
events (p<0.05). However, with respect to NDI, galanthamine treatments had no effect (p>0.05).
Regarding to DNA damage induction evaluated by the comet assay, the results showed that Aβ(1-42)
exposure for 24 h significantly increased the percentage of DNA damage when compared to untreated
cells (p<0.05). In addition, treatment with galanthamine indicated significant antigenotoxic activity,
since galanthamine concentration at 1 and 10 µM reduced Aβ(1-42)-induced DNA damage (Fig 4).
5. Discussion
AChEIs as galanthamine have demonstrated neuroprotective properties through multiple mechanisms
(Arias et al., 2004; Ezoulin et al., 2008; Romero et al., 2010). Galanthamine is a natural alkaloid with
a dual mode of action, which inhibits acetylcholinesterase and allosterycally modulates nicotinic and
muscarínico AChRs (Kita et al., 2014; Wang et al., 2007). Additionally, galanthamine exhibits
antioxidant properties and acts as ROS scavenger, thus exerting neuroprotective effects mainly by
inhibition of oxidative damage (Ezoulin et al., 2008; Romero et al., 2010). The efficacy of
galanthamine has been shown for treatment of AD patients at different stages (mild, moderate and
advanced) of the disease; however, recently, its efficacy has been observed in patients with AD in
severe stage (Burns et al., 2009). Besides, it has been reported that galanthamine induced increases in
cell survival and promotes hippocampal neurogenesis (Kita et al., 2014). In the present study, due to
the information about the neurotoxicity associated with Aβ(1-42) exposure and its implication in the
neuronal cell lost in the brain of AD patients (Reiman et al., 2012; Rosenblum, 2014), we aimed to
investigate the ability of galanthamine to afford protection against Aβ(1-42) induced toxicity and
genotoxicity in SH-SY5Y neuroblastoma cell line.
In the present study, treatments of SH-SY5Y cells with Aβ(1-42) significantly decreased cell rates when
evaluated by clonogenic assay. This method measures the capacity of colony formation when cells are
seeded at very low density (Coccini et al., 2014). The results indicated that the cells exposure to Aβ(1-
42) led to morphological changes and decreased the capacity of SH-SY5Y cells to form colonies. In
addition, Aβ(1-42) reduced NDI and increased cell death by necrosis, rather than apoptosis. The NDI
provides a measure of the proliferative status of the viable cell fraction (Fenech, 2007). These findings
confirm and corroborate the results previously reported in which Aβ exerted a reduction in the
101
proliferative potential of lymphocytes and increased cell death by necrosis (Lee et al., 2014).
Similarly, it has been reported that Aβ(1-42) exerts its toxic effects via necrotic rather than activation of
apoptotic pathway (Behl et al., 1994).
However, our data are in contrast to previous studies that have shown that Aβ induces apoptosis in
PC12 and in SH-SY-5Y cell line (Arias et al., 2004; Cardinale et al., 2012; Rusdiah and AH, 2009).
The discrepancy between our results and those reported by other authors may be due to different
experimental conditions. The absence of specific biochemical or histochemical markers for apoptosis
and necrosis may also contribute to divergent results (Dorn, 2013). It has been shown that Aβ(1-42) exert
disruption of calcium homeostasis (Fonseca et al., 2015); besides, it gains access into mitochondrial
matrix and its progressive accumulation into cells induces mitochondrial stress by interfering with
enzyme activity, thus affecting the neural bioenergetics (Chen and Yan, 2006; Mossmann et al., 2014).
Mitochondria acts as platform for the activation of caspases during apoptosis and participate in the
dysregulation of Ca2+
homeostasis during necrosis (Narciso et al., 2016). On the other hand, Aβ(1-42) has
been found to induce multiple mitochondrial dysfunctions, indicating that mitochondrial abnormalities
might be part of the spectrum of chronic oxidative stress (Mossmann et al., 2014); this conditions
causes deregulation of the normal mitochondrial function, and consequently, causing a reduced
production of ATP that is required to drive the mitotic and apoptotic processes, thus causing necrosis
cell death and potentially increasing DNA damage (Cardinale et al., 2012; Lee et al., 2014; Rusdiah
and AH, 2009).
Another important feature reported for the brain of AD patients is the deficit in mitochondrial
functions. It has been demonstrated that Aβ(25-35) peptide damages the neuronal cell, inhibits
mitochondrial function and disturbs mitochondrial and endoplasmic reticulum (ER) morphology
(Chen and Yan, 2006; Liu et al., 2010). In support to these findings, our study also showed that the
exposure of SH-SY5Y cells to Aβ(1-42) caused a significant reduction of cell viability and
morphological alterations in mitochondria and ER. Chronic exposure to oxidative stress also reduces
mitochondrial respiration and decreases cellular ATP levels, leading to the depletion of Ca2+
storage in
the ER and increase in Ca2+
concentration within the mitochondria organelle. Accordingly, this
signaling may lead to mitochondrial fragmentation and the opening of the mitochondrial permeability
transition pore (MPTP), which initiates cell death (Rainbolt et al., 2014). There are certain conditions,
such as oxidative stress and neurotoxin exposure, that can lead to an abnormal apoptosis and induce a
pathological status (Sastry and Rao, 2000).
The treatments with galanthamine for 24 h reverted cell viability and attenuated Aβ(1-42) induced
morphological changes in SH-SY5Y cell organelles. A maximum protection afforded by galanthamine
was achieved at the concentration of 10 µM. This concentration is within the range of AChE inhibiting
activity, since the IC50 to block the AChE enzyme is between 5 and 16 µM (Arias et al., 2004).
Besides, similar concentrations was reported in the human blood after oral administration of
galanthamine (Mannens et al., 2002). Our results confirm the neuroprotective effect induced by
galanthamine; nevertheless, we did not find protective effect at low concentrations, as already reported
by Arias et al., (2005). These authors found a maximum protective effect of galanthamine at 0.3 µM in
the same cell line. Protection mechanisms of drug have also been associated with the inhibition of
Aβ(1-42) aggregation, decrease in the Aβ(1-42) -induced calcium release from the ER, as well as reduction
of ROS and decline in the activation of ER stress related proteins (Liu et al., 2010).
To establish whether Aβ(1-42) induces cellular and genomic instability in SH-SY5Y cell line, we
evaluated DNA damage, cytostatic and cytotoxic effects. DNA damage events are scored specifically
in one cycle-divided binucleated cells and include (a) MN, a biomarker of chromosome breakage
and/or whole chromosome loss, (b) NPBs, a biomarker of DNA misrepair and/or telomere end-
fusions, and (c) NBUDs, a biomarker of elimination of amplified DNA and/or DNA repair complexes
(Fenech, 2007). With regard to comet assay, also known as single cell gel electrophoresis or microgel
electrophoresis, it is widely used in human biomonitoring to measure DNA damage as a marker of
exposure to genotoxic agents or to investigate genoprotective effects in individual cells (Collins et al.,
2014). Both micronucleus and comet assays are considered as part of drug validation and in the
102
evaluation of aneugenic and clastogenic substances with high sensitivity and statistical power (Araldi
et al., 2015).
We found that Aβ(1-42) caused cytostatic and cytotoxic effects when evaluated through NDI and cell
death assay, since all biomarkers (MNs, NPB, NBUD and DNA breaks) were significantly affected by
treatments with the Aβ(1-42) peptide (p<0.05). It is possible, therefore, that Aβ(1-42) may induce mitotic
dysfunction along the process of sister chromatid separation and chromosome segregation during
mitosis (Bull et al., 2012). Since a significant elevation in chromosomal abnormalities was reported in
sporadic and familial AD patients (Migliore et al., 2011; Petrozzi et al., 2002), our results obtained in
SH-SY5Y cell model provide support for the oxidative stress theory for AD pathogenesis. According
to this theory, small soluble aggregates of Aβ(1-42) inserted into the lipid bilayer of the cellular
membrane of neurons and glial cells induce oxidative stress, leading to lipid peroxidation, proteins
oxidation and genotoxic DNA damage (DNA breaks) (Lee et al., 2014; Tranah et al., 2014;
Varadarajan et al., 2000). In our study, the evaluation of DNA damage by the comet assy showed that
Aβ(1-42) induced a significant increase in tail intensity (p < 0.05). These results are consistent with
previous studies, which have shown that the exposure to Aβ peptide in SH-SY5Y and PC12 cell lines
increased the induction of DNA damage and caused an inhibition of DNA-PK kinase activity, thus
compromising double strand break repair (Cardinale et al., 2012; Rusdiah and AH, 2009). Genotoxic
damage are probably the most significant biological effect, due to consequent changes in genes
expression profiles, dysregulation of several biological and cellular processes, ultimately leading to
cell death and disease progression (Heaton et al., 2002; Jackson and Bartek, 2009; Rusdiah and AH,
2009).
Interestingly, the present results demonstrated the antigenotoxic effects of galanthamine, since treatment with the compound (1 and 10 µM) for 24 h reduced the DNA damage induced by Aβ(1-42);
probably, this effect may be associated to its antioxidant effects, as previously reported by others
(Ezoulin et al., 2008; Tsvetkova et al., 2013). This assumption is compatible with the observation that
an antioxidant is able to prevent the DNA damage by stimulating DNA repair enzymes (Lorenzo et al.,
2009; Rusdiah and AH, 2009) or acting as a desmutagenic agent that acts directly on mutagens, or on
its precursor, in order to inactivate it (Kuroda et al., 1992). Additionally, antioxidants are compounds
that decrease or delay the oxidation of other molecules by inhibiting the initiation or propagation of
oxidizing chain reactions (Bergman et al., 2001; Liu and Nair, 2010).
The capacity of galanthamine to reduce DNA damage, detected in the present work by performing the
CBMNcyt and comet assays, might be explained by its capacity to decrease the amount of ROS
generation, or to interfere in repair processes. Studies addressing the involvement of BER pathways
have shown that differentiated human SH-SY5Y cells are more sensitive to oxidative damage than
their undifferentiated counterparts. Furthermore, attenuated BER was reported in postmitotic neurons
that correlates with decreased protein levels of long-patch BER components (Narciso et al., 2016;
Sykora et al., 2013). However, this approach still needs further investigation.
Conclusion
The present results demonstrated that galanthamine exerted protective activity against Aβ(1-42)-induced
genotoxic and cytotoxic damages in SH-SY5Y cell line, indicating that this compound may exert
antigenotoxic properties, in addition to AChEi and antioxidant activities, as shown by its effects on the
reduction of DNA damage and cell death.
Acknowledgments
This research was supported by the brazilian funding agencies: CNPq (Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior) and Student Agreement Program for post graduation – PEC-PG for fellowship to
Willian O. Castillo. We thank Luiz A. Costa Junior for routine technical assistance; Dr. Paulo Godoy
for suggestions and technical support.
103
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CNT . 0.1 µM 1 µM 10 µM Ga
0.0
0.5
1.0
1.5
** *
* ***
Galanthamine
A (1-42)
* ***
***
Su
rviv
al
Rate
106
Fig. 1. Survival rate of SH-SY5Y cells after exposure to Aβ(1–42) and treatment with galanthamine. Data are
means + SD of three independent experiments, each performed in triplicate. *, p < 0.05; **, p < 0.001 and ***, p
< 0.0001 indicate statistically significant differences. CNT, Cells not treated.
1 µm1 µm
1 µm 1 µm
a b
c d
Fig. 2. Representative images of mitochondrial alterations in SH-SY5Y cells. N: nucleus, M: mitochondria; LG:
lipid globules; GC: Golgi complex; RER, Reticulum Endoplasmic Rough; C, mitochondrial cristae.
CNT A (1-42) 0.1µM 1µM 10µM
0
5
10
15Apoptosis
Necrosis
Galanthamine
*
#
% C
ell
dea
th
Fig. 3. Cell death (Apoptosis and Necrosis) induced by Aβ(1-42) in SH-SY5Y cells. Data were expressed as
percentage of three independent experiments (mean ± SD), each performed in triplicate. *, p < 0.05 indicate
statistically significant differences compared to toxic stimulus of Aβ(1-42). CNT, Cells not treated.
107
CNT . 0.1 µM 1.0 µM 10 µM Ga
0
5
10
15
Galanthamine
***
**
** **
***
***
***
A (1-42)
Ta
il I
nte
nsi
ty
Fig. 4. DNA damage measured as Tail Intensity in SH-SY5Y cells after exposure to Aβ(1–42) and treatment with
galanthamine. Data were expressed as mean ± SD. *, p < 0.05; **, p < 0.001 and ***, p < 0.0001 indicate
statistically significant differences. CNT, Cells not treated.
Table 1. Induction of micronuclei analyzed by CNMcyt in SH-SY5Y cells after exposure to Aβ(1–42) 10 µM and
treatment with galanthamine.
Treatments NDI MNBNCs NPBs NBUDs
CNT 2.10 ± 0.03 23.33 ± 1.53 6.00 ± 1.00 6.33 ± 1.53
Aβ (1-42) 1.73 ± 0.02* 31.00 ± 2.65
* 9.67 ± 0.58
* 11.33 ± 2.31
*
Aβ(1-42) + 0.1 µM G 1.74 ± 0.02# 25.33 ± 2.08 7.67 ± 0.58
# 10.00 ± 1.00
#
Aβ(1-42) + 1.0 µM G 1.88 ± 0.22 24.00 ± 2.65 3.67 ± 1.53* 8.00 ± 1.00
Aβ(1-42) + 10 µM G 1.99 ± 0.21 23.67 ± 3.06 3.67 ± 1.15* 5.33 ± 0.58
*
10 µM Ga 2.16 ± 3.0# 20.33 ± 3.06
# 4.00 ± 1.00
# 4.00 ± 1.00
#
The data are presented as mean ± S.D. of triplicate. *, p < 0.05 compared to CNT;
#, p < 0.05 compared to Aβ(1-
42). NDI, Nuclear Division Index; MNBNCs, Micronucleated Binucleated Cells; NPBs, Nucleoplasmic Bridges;
NBUDs, Nuclear Buds; CNT, Cells not treated; G, Galanthamine.
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ANEXO B- Permissão para o envio do material biológico ao Brasil
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