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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

“Pesquisa do Padrão de Metilação dos genes

GRB10, MEST e da Região 11p15 na Síndrome de

Silver-Russell”.

Jaqueline Carvalho de Oliveira

RIBEIRÃO PRETO

2009

Livros Grátis

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

“Pesquisa do Padrão de Metilação dos genes

GRB10, MEST e da Região 11p15 na Síndrome de

Silver-Russell”.

Jaqueline Carvalho de Oliveira

Dissertação Apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para Obtenção do Título de Mestre em Ciências.

Área de Concentração: Genética

Orientadora: Profa. Dra. Ester Silveira Ramos.

RIBEIRÃO PRETO

2009

AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de Ribeirão Preto/USP

Oliveira, Jaqueline Carvalho de

Análise do Padrão de Metilação dos genes GRB10, MEST e da Região 11p15 na Síndrome de Silver-Russell.

90 p.:il. ; 30cm

Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Genética.

Orientadora: Ramos, Ester Silveira.

1. Síndrome de Silver-Russell 2. Metilação 3. GRB10 4. MEST

5. 11p15

FOLHA DE APROVAÇÃO

Jaqueline Carvalho de Oliveira Pesquisa do Padrão de Metilação dos genes GRB10, MEST e da Região 11p15 na Síndrome de Silver-Russell

Dissertação Apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para Obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Genética

Aprovado em:____/____/____

Banca Examinadora Profª Dra Ester Silveira Ramos Instituição:__________________________Assinatura____________________ Prof Dr Instituição:__________________________Assinatura____________________ Prof Dr Instituição:__________________________Assinatura____________________

Dedico aos meus pais, por todo amor e dedicação. Por sempre terem acreditado em mim e me incentivado.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por ter me permitido chegar até aqui, sempre me

ajudando a vencer os obstáculos.

A Profª.dra. Ester Silveira Ramos, pela oportunidade e confiança depositada

em mim. Por toda orientação e apoio essenciais a esse trabalho e à minha

formação.

Aos médicos do Ambulatório de Genética do HCFMRP, principalmente ao Dr.

Jair Huber, por todo o envolvimento no trabalho e ajuda inestimável durante a coleta

das amostras.

Às famílias dos pacientes que prontamente aceitaram participar da pesquisa,

alguns precisando se locomover até o ambulatório de genética exclusivamente para

a doação das amostras.

Ao apoio financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP), Fundação de Amparo ao Ensino Pesquisa e assistência do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FAEPA),

Conselho Nacional de Desenvolvimento de Pesquisa (CNPq) e Cordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Ao Prof. Dr. Raysildo Lôbo e a Profa. Dra. Lúcia Regina Martelli, pela

convivência e incentivo.

Aos membros da Banca Examinadora, por terem aceitado participar desta

avaliação.

Ao doutor Marcus Vinícius de Matos Gomes, pela ajuda nesse trabalho, às

padronizações das primeiras metodologias utilizadas e valiosas discussões sobre as

outras metodologias e sobre os resultados.

À Karine Coelho pela grande ajuda na parte prática desse trabalho, muitas

vezes dividindo comigo as tarefas para que tudo fosse realizado mais rapidamente.

À Lisandra Cristina Caetano da Silva, pela ajuda nas reações de PCR em

tempo-real e também por aguentar minhas lamentações quando nada dava certo.

À Adriane Araújo de Oliveira, pela contribuição nas reações e também por ter

buscado algumas amostras urgentes no meio da tarde.

Ao doutor Álvaro Fabrício Lopes Rios pela grande ajuda e pelas discussões

sobre as metodologias utilizadas.

Às meninas do bloco C que sempre estavam dispostas à ajudar no que fosse

preciso: Paula Lumy Takegushi, Adriana Renzi, Andrea Martins da Silva, Hélida

Magalhães, Flávia Gaona de Oliveira Gennaro, Cristiana Libardi Miranda, Francielle

Marques Araújo, Juliana Meola e também ao Murilo Racy Soares.

À todos os amigos do bloco C ainda não citados: Marcelo Rodrigues,

Fernanda Prado Elias, Flávia Cappelo Donabela, Jeferson Nomelini, Juliana Fabricia

Cuzzi, Ana Carolina Laus, Daniel Blassioli Dentillo, Luciana Caricati Veiga Castelli,

Maria Silvina Juchniuk de Vozzi, Pedro Alejandro Vozzi, Rita de Cássia Pessotti,

Juliana Serafim, Mariana , Ciro Silveira e Pereira.

Aos técnicos do bloco C: Sílvio, Reginaldo e Marli, pela colaboração nos

experimentos e preparo das soluções de laboratório e também ao Luis Bezerra,

Paulo Bezerra e Marco Conrado pela colaboração nos assuntos de informática.

A Profa. Dra. Chong Ae Kim e Profa. Dra. Angela Maria Vianna Morgante

pelas amostras do pacientes provenientes da Universidade de São Paulo, também

analisadas nesse trabalho.

As secretárias do departamento de genética, Susie, Maria Aparecida e Silvia,

pela atenção e convivência nos últimos anos.

A todos meus amigos de Ribeirão Preto, Londrina e Cornélio Procópio, por

fazerem parte da minha vida e permitirem que as etapas da vida sejam mais

prazerosas.

Ao meu namorado, Paulo Emílio Ferreira e Alvarenga, pela ajuda diretamente

nesse trabalho e por estar sempre ao meu lado.

À minha irmã, Simone Carvalho de Oliveira, por todo apoio e pela nossa

amizade, por mesmo distante estar sempre presente.

Aos meus pais, Jusevaldo Amorim de Oliveira e Ivani Carvalho A. de Oliveira,

por tudo que sempre fizeram por mim. Por tudo que foi investido, pelo incentivo e por

sempre me mostrarem que era capaz e que com eles podia contar.

RESUMO

OLIVEIRA, J. C. Pesquisa do Padrão de Metilação dos Genes GRB10, MEST e da Região 11p15 na Síndrome de Silver-Russell. 2009. 71 f. Dissertação (Mestrado em Biologia – Genética). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto. 2009. A síndrome de Silver-Russell (SSR) é caracterizada por retardo no crescimento intra-

uterino associado a várias dismorfias características, sendo clínica e geneticamente

heterogênea, com relatos de diferentes cromossomos e genes potencialmente

envolvidos em sua etiologia. Porém, apenas os cromossomos 7 e 11 têm-se

mostrado consistentemente implicados na SSR, ambos contendo regiões envolvidas

com imprinting genômico. Este último é um mecanismo epigenético no qual os dois

alelos de um determinado gene são expressos diferencialmente dependendo da

origem parental. Os genes MEST, GRB10, mapeados no cromossomo 7, e a região

11p15 estão sob regulação do imprinting genômico e são sugeridos na etiologia da

SSR pelo envolvimento no crescimento fetal. No presente trabalho, foram avaliados

o perfil de metilação nas regiões diferencialmente metiladas dos genes MEST e

GRB10, além da análise de metilação de duas regiões controladoras de imprinting

na região 11p15, H19DMR e KvDMR, por metodologias qualitativas (Análise de

restrição combinada com bissulfito e PCR específica para a metilação) e quantitativa

(Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real).

Foram selecionados 15 pacientes com SSR além de cinco casos analisados

separadamente (um indivíduo com SSR filho de casal consaguíneo e com irmão

apresentando fenótipo de hipercrescimento, três irmãos com SSR de uma mesma

família e um indivíduo com cariótipo 45,X[25]/46,XX[75] e características típicas da

SSR e da síndrome de Turner). Foi observada a hipermetilação para paciente,

6,7% (1/15), na região diferencialmente metilada do gene MEST, hipometilação para

20% (3/15) dos pacientes na H19DMR, não sendo encontrada alteração na região

da KvDMR, para o grupo analisado. No entanto, hipermetilação dessa última região

foi encontrada para o paciente filho de casal consanguíneo e nos três irmãos,

sugerindo o envolvimento também dessa região na etiologia da SSR. Não foi

possível correlacionar estatisticamente os resultados laboratoriais e a gravidade dos

achados clínicos, entretanto as metodologias utilizadas se mostraram eficientes na

confirmação diagnóstica da SSR, trazendo benefícios diretos para o diagnóstico

mais rápido, além da contribuição para estudos posteriores que poderão auxiliar o

aconselhamento genético das famílias com portadores de SSR e desenvolvimento

de novos tratamentos.

Palavras-chave: metilação; Síndrome de Silver Russell; MEST; GRB10; KvDMR;

H19DMR.

(Versão parcial, a original sem cortes será disponibilizada após publicação).

ABSTRACT

OLIVEIRA, J. C. Methylation pattern at the GRB10 and MEST genes and the 11p15 region in patients with Silver-Russell syndrome. 2009. 71f. Dissertation (Master degree in Biology – Genetics). Medicine School of Ribeirão Preto, University of São Paulo. Ribeirão Preto. 2008.

The Silver-Russell syndrome (SRS) is characterized by intrauterine growth

retardation, which is associated with characteristic dimorphic features. The SRS is a

clinically and genetically heterogeneous. Nevertheless, only chromosome 7 and 11

have been consistently implicated in patients with strict clinical diagnosis of SRS.

Genomic imprinting is a epigenetic phenomenon where the two alleles of certain

genes are expressed differentially, depending on the sex of the parent from whom

each was inherited. The MEST and the GRB10 genes (mapped in the chromosome

7) and the 11p15 region are imprinted and they are suggested in SRS etiology due to

their involvement in fetal growth. In this study, it was analyzed the methylation

pattern in the differential methylated regions in GRB10 and MEST genes and in the

imprinting control regions of 11p15, H19DMR and KvDMR, through qualitative

methods (Combined Bisulfite Restriction Analysis and Methylation Sensitive PCR)

and quantitative (Digestion Sensitive Associated with Real-Time PCR). It was

selected 15 patients with SRS besides five special cases (a individual SRS born of a

consanguineous crossing and a brother with increase of growth, three brothers with

SRS, an individual with 45,X[25]/46,XX[75] cariotype and features of Turner

syndrome and SSR). It was observed a hipermethylation in a patients, 6,7%

(1/15), in MEST gene region, partial hipomethylation in 20% (3/15) patients in

H19DMR. It was been detected partial hipermethylation in KvDMR region in the SRS

born of a consanguineous crossing and in the three brothers, suggesting the role of

this region in etiology of SRS. It was not possible to relate the laboratorial results with

the clinical findings, however, the utilized methods showed to be efficient tools for

diagnosing the SRS, allowing faster diagnosis. Another benefit is the support for

further research that can improve the genetic counseling for families with SRS

patients and the new possibilities of treatment.

Key-words: methylation; Silver-Russell syndrome; MEST; GRB10; KvDMR;

H19DMR.

ABREVIATURAS E SIGLAS

% porcentagem °C grau celsius A Adenina C Citosina CDKN1C cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (inibidor de quinase dependente de ciclina 1C) CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ct ciclo threshold - número do ciclo no qual o nível de fluorescência emitido pela amostra amplificada atingiu o nível arbitrário CTCF fator de ligação CCCTC DMR differential methylated region (região diferencialmente metilada) DMRs differential methylated regions (regiões diferencialmente metiladas) DNA deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucléico) DNMT enzima DNA metiltransferases DNMT1 DNA metiltransferases 1 DNMT2 DNA metiltransferases 2 DNMT3 DNA metiltransferases 3 DUP dissomia uniparental G Guanina GRB10 growth factor receptor-binding protein 10 (proteína ligante de receptor de fator de crescimento 10) H19DMR região diferencialmente metilada H19 HCl ácido clorídrico ICR imprinting control region (região controladoras de imprinting)

ICRs imprinting control regions (regiões controladoras de imprinting) IGF insulin-like growth factor (fator de crescimento semelhante à insulina) IGF1 insulin-like growth factor 1 (fator de crescimento semelhante à insulina 1) IGF1R insulin-like growth factor I receptor (receptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1) IGF2 insulin-like growth factor 2 (fator de crescimento semelhante à insulina 2) IGFBP insulin-like growth factor binding protein (proteína ligante de IGF) IR insulin receptors (receptor de insulina) kb kilobases KCl Cloreto de potássio KCNQ1 potassium channel, voltage-gated, kqt-like subfamily, member 1 KCNQ1OT1 KCNQ1-overlapping transcript 1 LIT1 long QT intronic transcript 1 mDUP7 dissomia uniparental materna do cromossomo 7 MEST mesoderm-specific transcript MgCl2 Cloreto de Magnésio mM milimolar MPLP multiplex ligation dependent probe analysis ncRNA RNA não-condificante OMIM online mendelian inheritance in man p braço curto do cromossomo PCR polymerase chain reaction (reação em cadeira da polimerase) PEG1 paternally expressed gene 1 (gene paternalmente expresso 1)

pH potencial hidrogeniônico PHLDA2 pleckstrin homology-like domain, family a, member 2 q braço longo do cromossomo RNA oxyribonucleic acid (ácido ribonucléico) SBW síndrome de Beckwith-Wiedemann SSR síndrome de Silver-Russell T Timina t translocação tRNA RNA transportador U Uracila uL microlitro UTR untranslated region (região não traduzida) µg micrograma

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1

Características clínicas encontradas em paciente com síndrome de SSR...........................................................................................................

03

Figura 2 Ideograma do cromossomo 7 humano...................................................... 10

Figura 3 Ideograma do cromossomo 11 humano.................................................... 12

Figura 4

Representação esquemática do mapa gênico da região cromossômica 11p15.........................................................................................................

14

Figura 5

Seqüência próxima à região do gene GRB10 analisada, GenBank AC004920..................................................................................................

25

Figura 6

Seqüência próxima à região do gene MEST analisada, GenBank NT_007933................................................................................................

26

Figura 7 Seqüência próxima à região H19DMR analisada, GenBank U50731....... 30

Figura 8 Seqüência próxima à região KvDMR1 analisada, GenBank U90095........ 32

Figura 9

Perfil de metilação do gene GRB10 pelo método COBRA em amostras de indivíduos saudáveis (controle)............................................................

34

Figura 10

Perfil de metilação do gene GRB10 pelo método COBRA em amostras de pacientes com síndrome de Silver-Russell...........................................

34

Figura 11

Perfil de metilação do gene MEST pelo método COBRA em amostras de indivíduos saudáveis (controle)...........................................................

35

Figura 12

Perfil de metilação do gene MEST pelo método COBRA em amostras de pacientes com síndrome de Silver-Russell...........................................

35

Figura 13

Metilação da H19DMR pelo método COBRA em amostras de pacientes com Silver-Russel......................................................................................

36

Figura 14 Gráfico de amplificação em tempo-real da H19DMR................................ 37

Figura 15

Comparação entre a média de porcentagem de metilação da H19DMR no grupo controle e no grupo de pacientes com síndrome de Silver-Russel........................................................................................................

38

Figura 16

Perfil de metilação da KvDMR pelo método MS-PCR em indivíduos saudáveis (controle)..................................................................................

40

Figura 17

Perfil de metilação da KvDMR pelo método MS-PCR em amostras de pacientes com síndrome de Silver-Russell................................................

40

Figura 18 Gráfico de amplificação em tempo-real da KvDMR................................... 42

Figura 19

Comparação entre a média de porcentagem de metilação da KvDMR no grupo controle e no grupo de pacientes com síndrome de Silver-Russell.......................................................................................................

42

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Resultados da H19DMR obtidos pelo método DESM-RT em amostras controle................................................................................................... 38

Tabela 2

Resultados da H19DMR obtidos pelo método DESM-RT em pacientes com Silver-Russell.................................................................................. 39

Tabela 3

Resultados da H19DMR obtidos pelo método DESM-RT em casos particulares............................................................................................. 39

Tabela 4

Resultados da KvDMR obtidos pelo método DESM-RT em amostras controle................................................................................................... 43

Tabela 5

Resultados da KvDMR obtidos pelo método DESM-RT em pacientes com Silver-Russell.................................................................................. 44

Tabela 6

Resultados da KvDMR obtidos pelo método DESM-RT em casos particulares............................................................................................. 44

Tabela 7

Resultado molecular e características clínicas dos pacientes com Silver-Russell.......................................................................................... 46

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................... 01 1.1. SÍNDROME DE SILVER-RUSSEL.................................................................. 02 1.2. ASPECTOS GENÉTICOS............................................................................... 04 1.3. EPIGENÉTICA E IMPRINTING GENÔMICO.................................................. 07 1.4. GENE GRB10.................................................................................................. 09 1.5. GENE MEST ................................................................................................... 11 1.6. REGIÃO 11p15................................................................................................ 11 2. OBJETIVOS........................................................................................................ 16 2.1. OBJETIVO GERAL.......................................................................................... 17 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................ 17 3. CASUÍSTICA...................................................................................................... 18 3.1. PACIENTES..................................................................................................... 19 4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 20 4.1. ANÁLISE MOLECULAR................................................................................... 21 4.1.1. Coleta de Sangue Periférico...................................................................... 21 4.1.2. Extração de DNA......................................................................................... 21 4.1.3. Modificação do DNA com Bissulfito de Sódio.........................................

22

4.1.4. Identificação de Ilhas CpGs e Desenhos de Primers.............................. 23 4.1.5. Análise de Metilação .................................................................................. 24 4.1.5.1. Análise do padrão de metilação do gene GRB10...................................... 24 4.1.5.2. Análise do padrão de metilação do gene MEST........................................

26

4.1.5.3. Análise do Padrão de Metilação da H19DMR............................................ 27

4.1.5.3.1. PCR Análise Combinada de Bissulfito e Restrição Enzimática ( (COBRA)........................................................................................................ 27 4.1.5.3.2. Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em T Tempo Real (DESM-RT)................................................................................ 28 4.1.5.4. Análise do Padrão de Metilação da KvDMR1..................................................... 30 4.1.5.4.1. PCR específica para a metilação (MS-PCR)................................. 30 4.1.5.4.2. Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em T Tempo Real (DESM-RT)................................................................................ 31 5 RESULTADOS.................................................................................................... 33 5.1. ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO DO GENE GRB10........................ 34 5.2. ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO DO GENE MEST........................... 35 5.3. ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO DA H19DMR.................................. 36 5.3.1. COBRA......................................................................................................... 36 5.3.2. DESM-RT...................................................................................................... 36 5.4. ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO DA KVDMR1.................................. 40 5.4.1. MS-PCR........................................................................................................ 40 5.4.2. DESM-RT...................................................................................................... 41 5.5. CORRELAÇÃO DOS ACHADOS CLÍNICOS E MOLECULARES................... 45 6. DISCUSSÃO................................................................................................... 48 7. CONCLUSÃO.................................................................................................... 61 8. REFERÊNCIAS.................................................................................................. 63

1. INTRODUÇÃO1. INTRODUÇÃO1. INTRODUÇÃO1. INTRODUÇÃO

1. Introdução

2

1.1. SÍNDROME DE SILVER-RUSSELL

A síndrome de Silver-Russell (SSR; OMIM 180860) foi independentemente

descrita por Silver et al. (1953) e Russell (1954), recebendo, somente em 1961, essa

denominação (BLACK, 1961).

Essa síndrome é caracterizada por retardo no crescimento intra-uterino que

persiste no período pós-natal e apresenta incidência estimada entre 1:50.00 e

1:10.000 nascimentos (ANDERSON et al., 2002; MONK et al., 2002), não havendo

relação com sexo ou origem étnica (WEE, 2007).

As alterações “maiores” (ou principais) encontradas na maioria dos pacientes

e que caracterizam a síndrome são: baixo peso ao nascimento, baixa estatura

resultante de retardo do crescimento pós-natal e face triangular característica

(HITCHINS et al., 2001).

No entanto, algumas outras alterações “menores” auxiliam no diagnóstico e

são frequentemente observadas como a clinodactilia e/ou o encurtamento do quinto

dedo de mãos, a macrocefalia aparente e a assimetria corporal. Também podem

estar presentes alterações de orelha, rima labial com inclinação para baixo, ponte

nasal proeminente e filtro naso-labial bem demarcado, hipotonia e hipotrofia

muscular, atraso motor e neuropsicomotor, alterações dentárias, alteração de voz

(“esganiçada”), prega palmar única (ou simiesca), sindactilia, campodactilia,

artrogripose distal, manchas café-com-leite, puberdade precoce, alterações genitais

incluindo hipospádia, hérnia inguinal, atraso de fala/linguagem e dificuldade de

alimentação nos primeiros meses de vida (EGGERMANN et al., 1997; PRICE et al.,

1999; HITCHINS et al., 2001; ROSSI et al., 2006) (Figura 1).

1. Introdução

3

Figura 1. Características clínicas encontradas em paciente com síndrome de SSR. (A) Face triangular, macrocefalia aparente, orelhas displásicas, (B) clinodactilia do 5° dedo da mão.

É observado um risco de hipoglicemia na infância especialmente se a

alimentação não é frequente, o que pode ser agravado pela falta de apetite e a

absorção reduzida de caloria também característicos desses pacientes (PERKINS,

HOANG-XUAN, 2002; AZCONA, STANHOPE, 2005).

Não há consenso em relação ao déficit cognitivo nos pacientes com SSR,

mas Lai et al., em 1994, relataram que aproximadamente metade das crianças com

a síndrome tem uma diminuição significativa em suas habilidades cognitivas. Price et

al. (1999) e Noeker et al. (2004) também mostraram uma moderada, mas

significativa, alteração cognitiva. Azcona e Stanhope, em 2005, sugeriram que a

hipoglicemia estaria relacionada à falha no desenvolvimento intelectual dos

pacientes com SSR.

A B

1. Introdução

4

Outras características associadas com a síndrome são tendência para

sudorese excessiva e palidez durante as primeiras semanas de vida, especialmente

na cabeça e na parte superior do tronco, a deformidade de Sprengel, anomalias

renais, defeitos gastrintestinais, defeitos cardíacos, micrognatia, esclera azulada,

fechamento retardado da fontanela anterior e neoplasias como craniofaringioma,

seminoma testicular, carcinoma hepático e tumor de Wilms (PRICE et al., 1999;

ANDERSON et al., 2002; PERKINS, HOANG-XUAN, 2002;).

Não há critérios diagnósticos estritos para a SSR, entretanto a presença de

três características “maiores” simultaneamente a uma ou mais características

“menores” confirmatórias são geralmente requeridas para um diagnóstico positivo.

Mas isso não é obrigatório, existindo pacientes diagnosticados com muitas

características “menores”, porém, sem nenhuma das “maiores” (HITCHINS et al.,

2001; NOGUEIRA et al., 2001).

O diagnóstico pode ser subjetivo, sendo influenciado pela experiência clínica

do investigador. Além do mais, o fenótipo do paciente com SSR adulto é menos

evidente ao comparado à infância. Portanto um diagnóstico laboratorial seria

importante para confirmar o clínico (SCHÖNHERR et al., 2006).

1.2. ASPECTOS GENÉTICOS

Vários estudos têm evidenciado a heterogeneidade etiológica da SSR sendo

a maioria dos casos esporádicos, atribuídos a mutações novas dominantes (OUNAP

et al., 2004; ROSSIGNOL, 2006). No entanto, em revisão realizada a partir de 197

casos, 19% apresentava mais de um afetado na família (DUCAN et al., 1990;

1. Introdução

5

OUNAP et al., 2004) e diferentes modelos de herança têm sido sugeridos através de

estudos baseados em histórico familiar.

Uma herança autossômica recessiva foi sugerida pela verificação de muitas

famílias com mais de um filho afetado gerados por pais fenotipicamente normais e

também pela presença de afetados nascidos de casamentos consanguíneos

(GOUDA et al. 1996). Transmissões autossômicas dominantes ou ligadas ao

cromossomo X também foram sugeridas (OUNAP et al., 2004; PARTINGTON,

1986). Adicionalmente, o relato de gêmeos monozigóticos discordantes

fenotipicamente em relação à síndrome abre a discussão para o envolvimento de

fatores ambientais e fatores genéticos pós-zigóticos (HITCHINS et al., 2001).

Com relação às anomalias cromossômicas estruturais, a maioria dos

pacientes com SSR apresenta um cariótipo normal. Entretanto, para alguns

pacientes foi relatada a ocorrência de alterações em diferentes cromossomos

correlacionados ao fenótipo desta síndrome. Entre as anomalias citadas, existe a

translocação balanceada envolvendo o cromossomo 17q25 em dois pacientes com

características típicas de SSR, um com a translocação t(17;20)(q25;q13) e o outro

t(1;17)(q31;q25)( WAKELING et al., 1998).

Para o cromossomo 8, foi encontrada uma deleção paternalmente herdada de

8q11-13 em um paciente com SSR (SCHINZEL at al., 1994) e para o cromossomo

18 verificou-se a deleção completa do braço curto. Há também outro caso relatado

com trissomia do 18 em mosaico (CHAUVEL, MOORE, HASLAM, 1975; SCHINZEL

et al., 1994).

Tem sido relatada a presença de anel no cromossomo 15 ou deleções distais

de 15q em pacientes com características de SSR. No braço curto do cromossomo 15

está localizado o IGF1R (receptor de fator de crescimento semelhante à insulina I),

1. Introdução

6

pertencente a família de fatores de crescimento semelhante à insulina (IGF). Essa

família inclui a insulina, o IGF1 e o IGF2, seus receptores e seis proteínas ligantes

de IGF (IGFBPs), que desempenham um papel fundamental na regulação do

crescimento fetal. Por esse papel, o IGF1R foi candidatado na etiologia da SSR

nesses pacientes com alteração do cromossomo 15, entretanto estudos moleculares

mais aprofundados falharam em mostrar mutações nesse gene em pacientes com

SSR (HITCHINS et al., 2001).

A verificação de dois pacientes com SSR que também possuíam, em

homozigose, uma mesma mutação no gene CFTR causador da fibrose cística

proveniente de mães portadoras, sugeriu o envolvimento da dissomia uniparental

materna do cromossomo 7 (mDUP7) na etiologia da síndrome (KOTZOT et al.,

1995). Trabalhos posteriores confirmaram o importante papel dessa alteração,

sendo descrita atualmente como presente em aproximadamente 5-10% dos casos

(BINDER et al., 2008).

A partir de 2005, três trabalhos demonstraram relação da SSR com alterações

do padrão de metilação da região 11p15 em alta frequência (31-50%) das crianças

afetadas pela síndrome (EGGERMANN et al., 2005; GICQUEL et al., 2005; BLIEK et

al., 2006;).

Apesar da variedade de alterações genéticas em diferentes regiões, apenas

os cromossomos 7 e 11 têm sido considerados, até os últimos anos, candidatos

consistentes para a possível utilização nas triagens clínicas, ambos com evidências

do envolvimento do imprinting genômico.

1. Introdução

7

1.3. EPIGENÉTICA E IMPRINTING GENÔMICO

O imprinting genômico é um processo de controle da transcrição gênica no

qual apenas um dos alelos é expresso, de acordo com a sua origem parental. A

base molecular é epigenética, isto é, modificação herdável na expressão do gene

sem mudanças na sequência do DNA (WOLFFE; MATZKE, 1999).

Os mecanismos epigenéticos podem incluir modificações como metilação do

DNA, modificações nas histonas (metilação, acetilação, ubiquitinação e fosforilação)

e alteração na conformação da cromatina (WEKSBERG; SHUMAN; SMITH, 2005;

DELEVAL; WAGSCHAL; FEIL, 2006).

A metilação do DNA, modificação epigenética melhor caracterizada, consiste

na adição de um radical metil (CH3) no carbono 5 de Citosina geralmente seguida

por Guanina (dinucleotídeo CpG), catalisada por enzimas DNA metiltransferases

(DNMTs) (PAULSEN; FERGUNSONSMITH, 2001). Em mamíferos foram

identificadas três classes principais de DNMTs: DNMT1, DNMT2 e DNMT3

(BESTOR, 2000). A DNMT1, também denominada metiltransferase de manutenção,

está envolvida no processo de metilação que ocorre durante a divisão celular

mitótica, copiando o padrão de metilação da fita original. A DNMT2, diferentemente

das demais metiltransferases, parece apresentar uma atividade metiltransferase de

tRNA (BESTOR, 2000; JELTSCH et al., 2006). A terceira classe das DNMTs está

relacionada à aquisição de metilação de DNA de novo (DNA não-metilado

previamente) (BOURC’HIS et al.,2001; HATA et al., 2002).

Existem vários mecanismos segundo os quais a metilação do DNA pode atuar

no controle da expressão gênica. O mais simples é através de um silenciamento

direto do promotor, havendo a não transcrição do alelo metilado. A metilação do

1. Introdução

8

DNA pode interferir diretamente na sequência de ligação de fatores trans-atuantes

como ocorre com a proteína CTCF (fator de ligação CCCTC), um fator de transcrição

com domínios dedos-de-zinco envolvido na formação de barreiras e isolamentos de

cromatina, o que modula a expressão e/ou inativação de genes específicos (BELL;

FELSENFELD, 2000; HOLMGREN et al., 2001; RAND et al., 2004, MONK et al,

2008).

Um outro mecanismo envolve o silenciamento, dependente de metilação, de

um RNA não-codificante (ncRNA) especificamente em um dos alelos parentais.

Consequentemente, o ncRNA transcrito é expresso apenas a partir do alelo não

metilado e, através do recrutamento de proteínas, mantém modificações repressivas

nas histonas, levando ao silenciamento de genes próximos (MONK et al., 2008) .

As modificações epigenéticas envolvidas na regulação do imprinting

genômico ocorrem em sequências especializadas chamadas de regiões

controladoras de imprinting (imprinting control regions ou ICRs) responsáveis,

geralmente, pela regulação de um grupo de genes agrupados em domínios

cromossômicos. Essas regiões, de aproximadamente 1-2 kb, são marcadas

diferencialmente nos alelos herdados paterna ou maternamente e, como

consequência, são ativadas em apenas uma das duas cópias parentais, regulando

através de atividade em cis a expressão de um dos alelos especificamente (LEWIS;

REIK, 2006).

Esses padrões epigenéticos são mantidos nos tecidos somáticos,

independentemente do sexo do embrião, mas são apagados e refeitos durante a

gametogênese, baseados no padrão sexual da transmissão (LI, 2002). Falhas

nesses processos podem resultar em alterações da expressão dos genes regulados

por imprinting.

1. Introdução

9

Outro fator importante que pode resultar na desregulação do mecanismo de

imprinting é a dissomia uniparental (DUP), fenômeno onde dois cromossomos

homólogos são herdados do mesmo progenitor (KOTZOT et al., 2008).

A DUP pode ocorrer principalmente através de dois mecanismos. A fusão de

um gameta dissômico com um normal monossômico e subsequente perda de um

cromossomo extra durante a divisão mitótica, evento denominado “resgate da

trissomia”, ou a fusão de um gameta nulissômico com um normal dando origem a um

zigoto monossômico, seguida por uma duplicação mitótica do cromossomo

existente, denominada “duplicação mitótica” (HITCHINS et al., 2001).

1.4. GENE GRB10

O gene GRB10 (growth factor receptor-binding protein 10) codifica uma

proteína adaptadora que interage tanto com o receptor de insulina (IR) quanto com o

receptor de fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1R) (YAMAMOTO et

al., 2008).

O IGF1R tem afinidade a dois importantes reguladores de crescimento

embrionário, o IGF1 e o IGF2, sendo que este último também atua via IR e, portanto,

vias susceptíveis a interferência da GRB10. Além disso, a GRB10 deve estar

envolvida na regulação da homeostase de glicose, que é regulada pelo IR

(YAMAMOTO et al., 2008).

Trabalhos em camundongos com silenciamento do gene GRB10 mostram um

fenótipo de hipercrescimento embrionário (CHARALAMBOUS, et al. 2003) sendo

que, ao contrário, a sua hiperexpressão desencadeia um retardo de crescimento

1. Introdução

10

(SHIURA et al., 2005). Essas evidências sugerem um importante papel negativo do

GRB10 no crescimento celular.

Em camundongos esse gene está mapeado no cromossomo 11 e apresenta

expressão materno-específica. Já em humanos, localizado em 7p11.2–p13, o gene

GRB10 é expresso paternalmente no cérebro fetal e têm expressão bialélica em

outros tecidos como coração, pulmão, pele, rim entre outros, exceto pela expressão

materna de uma isoforma (γ 1) em músculo esquelético (BLAGITKO et al., 2000).

Os dados obtidos em camundongos e a identificação de pacientes com

duplicação da região 7p11.2-p13 sugeriram a região como candidata a apresentar

um papel importante na etiologia da SSR (MONK et al., 2002). Entretanto, a

expressão bialélica na grande maioria dos tecidos e a não descrição de mutações

específicas nesse gene são contrários à responsabilização isolada do gene, o que

requer maiores estudos.

Figura 2: Ideograma do cromossomo 7 humano. Regiões candidatas na etiologia da SSR analisadas nesse trabalho, gene MEST e GRB10. (p) braço curto, (q) braço longo.

1. Introdução

11

1.5. GENE MEST

O gene MEST (mesoderm-specific transcript), também denominado PEG1

(paternally expressed gene 1), está localizado em humanos na região 7q31 (Figura

1) e apresenta expressão restrita ao alelo paterno durante a fase embrionária

(RIESEWIJK et al., 1997).

A função específica do gene é desconhecida, embora se tenha verificado a

presença de motivos encontrados em enzimas alfa/beta hidrolases, enzimas

envolvidas em atividades lipolíticas, o que sugere a relação com essa família

(RIESEWIJK et al., 1998).

A verificação de camundongos com retardo de crescimento pré e pós-natal

devido ao silenciamento do gene e pacientes com SSR com mDUP7 específica da

região 7q31 indicam o gene MEST como candidato na etiologia da doença

(LEFEBVRE et al., 1998; HANNULA et al., 2001).

Entretanto, alguns trabalhos não relacionaram alterações específicas do gene

com o desenvolvimento da síndrome (RIESEWIJK et al., 1998, SCHÖHERR et al,

2008) sendo ainda incerto o papel do MEST na etiologia da SSR.

1.7. REGIÃO 11p15

A região 11p15 possui dois centros reguladores de imprinting, a ICR1 e a

ICR2. A primeira, também chamada H19DMR, é mapeada 2kb acima (upstream) do

gene H19. Esse gene, maternalmente expresso, codifica um RNA não-codificante de

função ainda desconhecida, sendo sugerido que atue como supressor tumoral

(GABORY et al., 2006; YOSHIMIZU et al., 2008).

1. Introdução

12

Figura 3: Ideograma do cromossomo 11 humano. Em destaque a região 11p15, analisada nesse trabalho. (p) braço curto, (q) braço longo.

Nesse domínio também está presente o gene IGF2 cujo alelo expresso é o

paterno e codifica um fator de crescimento semelhante à insulina, sendo um dos

principais reguladores do crescimento fetal e pós-natal (DELAVAL et al., 2006).

Níveis aumentados da expressão em camundongos causam hipercrescimento fetal

(EGGENSCHWILER et al., 1997) e a expressão reduzida está associada ao

hipocrescimento (DECHIARA et al., 1990).

Estudos em camundongos mostraram que o alelo não metilado materno na

ICR1 é ligado a muitas cópias da proteína CTCF (VERONA; MANN; BARTOLOMEI,

2003). Essa ligação cria um limite de cromatina, que atua como inibidor do gene

IGF2 e acentuador da expressão do H19. Como consequência, o IGF2 não é

expresso a partir do alelo materno. No alelo paterno, por ação da enzima DNMT1,

há a metilação do DNA e não há a ligação da CTCF, permitindo o acesso do

enhancer ao IGF2. Durante as etapas iniciais do desenvolvimento, a metilação do

DNA paterno se estende da ICR até o promotor do H19, guiando a repressão do

alelo paterno. Em resumo, a manutenção da diferença de metilação do DNA na ICR

1. Introdução

13

garante que o gene IGF2 seja expresso apenas a partir do alelo paterno e o H19, do

materno (VERONA; MANN; BARTOLOMEI, 2003; MOSS, WALLRATH, 2007).

O outro domínio de imprinting da região é um longo agrupamento regulado

pela ICR2, também denominado de KvDMR1, maternalmente metilada e situada em

um íntron do gene KCNQ1 (WEBESBERG; SHUMAN; SMITH, 2005). Essa ICR

também compreende o promotor do gene KCNQ1OT1 (ou LIT1) que se localiza

dentro da sequência do gene KCNQ1, mas com transcrito antisense. O gene

KCNQ1OT1 expressa, a partir do alelo paterno, um longo RNA não-codificante de

função ainda desconhecida potencialmente envolvido na regulação do KCNQ1

(WEBESBERG; SHUMAN; SMITH, 2005)(figura 4).

O KCNQ1, também conhecido como KvLQT1, codifica um canal de potássio e

apenas o alelo materno é expresso (LEE et al., 1999). Alterações na expressão

desse gene foram descritas em doenças cardíacas (NEYROUD et al., 1999) e seu

envolvimento em alterações de crescimento ainda não é conhecido. Ao lado desse,

muitos outros genes do domínio têm silenciamento paterno sendo um deles o

CDKN1C (cyclin-dependent kinase inhibitor), também chamado de P57kip2. Este

gene codifica um inibidor de quinase dependente de ciclina, sendo regulador

negativo de proliferação celular e crescimento que pode também atuar como

supressor tumoral (FEINBERG, 1999). Um outro gene silenciado paternalmente no

domínio é o PHLDA2, importante no crescimento placentário (DELAVAL;

WAGSCHAL; FEIL, 2006).

1. Introdução

14

Figura 4: Representação esquemática do mapa gênico da região cromossômica 11p15. As caixas pretas representam os genes silenciados, as azuis os genes expressos paternalmente e em vermelho os expressos maternalmente. As caixas amarelas representam as regiões diferencialmente metiladas (DMRs). (ICR) centros reguladores de imprinting. As setas ligadas às caixas indicam a orientação da transcrição, os círculos azuis indicam a metilação e o arco rosa, a proteína CTCF.

Alterações no padrão de metilação nas ICRs da região 11p15 como,

hipermetilação e silenciamento do H19 materno e ativação de ambos os alelos do

IGF2 (WEKSBERG; SHUMAN; SMITH, 2005) e perda da metilação da KvDMR1

associada com a expressão bialélica do LIT1 (LEE et al., 1999), estão relacionadas

com a síndrome de Beckwith-Wiedemann (SBW). Essa última caracteriza-se por

hipercrescimento intra-uterino e pós-natal, macroglossia, alterações de parede

abdominal e assimetria corpórea (GOMES et al., 2007).

Com relação à SSR, inicialmente quatro estudos evidenciaram com

alterações do padrão de imprinting da região 11p15, demonstrando hipometilação na

H19DMR em alta frequência (31-50%) nas crianças afetadas (EGGERMANN et al.,

2005; GICQUEL et al., 2005; BINDER et al., 2006; BLIEK et al., 2006). Em 2007,

Schönherr et al. verificaram também alteração na KvDMR1 em pacientes com SSR.

1. Introdução

15

Os dados da literatura apontam para o envolvimento do padrão de metilação

nos domínios de 11p15 na etiologia da SSR, entretanto, a verdadeira relação entre

as alterações epigenéticas e a doença permanece incerta.

2222.... OBJETIVOS OBJETIVOS OBJETIVOS OBJETIVOS

2. Objetivos

17

2.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar a influência do perfil epigenético dos genes GRB10, MEST e da região

11p15 no desenvolvimento da síndrome de Silver-Russell.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Analisar o padrão de metilação na região diferencialmente metilada da

porção 5´UTR do gene GRB10;

• Analisar o padrão de metilação na região diferencialmente metilada da

porção 5´UTR do gene MEST;

• Analisar o padrão de metilação na região diferencialmente metilada do

H19 (H19DMR);

• Analisar o padrão de metilação na região diferencialmente metilada

KvDMR1;

• Correlacionar os resultados laboratoriais aos achados clínicos dos

pacientes portadores de SSR;

• Avaliar a aplicação das metodologias utilizadas para a confirmação

diagnóstica da SSR.

3.3.3.3. CASUÍSTICACASUÍSTICACASUÍSTICACASUÍSTICA

3. Casuística

19

3.1. PACIENTES

A amostra foi selecionada a partir de pacientes atendidos pela equipe médica

do Ambulatório de Aconselhamento Genético do Hospital das Clínicas da Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (HC-FMRP-USP)

mediante aprovação da Comissão de Normas Éticas e Regulamentares deste

hospital (Processo HCRP n° 1497 / 2008).

Foram analisadas amostras de 10 indivíduos controles voluntários saudáveis,

15 portadores da síndrome de Silver-Russell clássicos (SR1 a SR15) atendidos pela

equipe médica do Ambulatório de Aconselhamento Genético do Hospital das

Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo

(HC-FMRP-USP).

Adicionalmente, foram realizadas análises moleculares em um indivíduo com

fenótipo claro de SSR, atendido no HC-FMRP-USP, filho de pais consanguíneos e

com dois irmãos não SSR, porém com malformações congênitas (SR16).

Em três pacientes com fenótipo claro de SSR e irmãos, todos de uma mesma

família, atendidos no campus São Paulo da Universidade de São Paulo (irSR1,

irSR2, irSR3).

Também foi analisado um indivíduo com cariótipo condizente com síndrome

de Turner, 45,X[25]/46,XX[75], porém com caracteres não condizentes com a

alteração cromossômica e relacionada à SSR (ST1), atendido no HC-FMRP-USP.

Os critérios para o diagnóstico da SSR foram a presença de baixa estatura de

origem pré-natal associada à pelo menos duas outras características clínicas como

aparente macrocefalia, face triangular, manchas café-com-leite, assimetria corpórea,

quinto dedo de mãos curtos e/ou com clinodactilia.

4. MATERIAL E MÉTODOS4. MATERIAL E MÉTODOS4. MATERIAL E MÉTODOS4. MATERIAL E MÉTODOS

4. Material e Métodos

21

4.1. ANÁLISE MOLECULAR

As análises moleculares foram realizadas no Laboratório do Grupo de

Epigenética e Reprodução do Departamento de Genética da Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto – USP.

4.1.1. Coleta de Sangue Periférico

Para a análise molecular foram coletados 5-10 mL de sangue periférico de

cada paciente em tubo estéril tipo Vacutainner contendo o anticoagulante EDTA. O

material foi obtido após esclarecimento aos familiares sobre a pesquisa e assinatura

do termo de consentimento livre-esclarecido.

4.1.2. Extração de DNA

Amostras de DNA foram extraídas utilizado o método de extração e

precipitação em NaCl (OLERUP;ZETTERQUIST, 1992, modificado).

Ao volume de 0,5mL de sangue foi adicionado 1,0mL de Tampão de Lise

[Sacarose 0,32M; Tris HCl 12mM (pH 7,5); MgCl2 5,0M; Triton X 1,0%] em

microtubos de 1,5mL. As amostras foram centrifugadas a 13000rpm por 20

segundos, o sobrenadante descartado e o procedimento repetido até a obtenção de

pellet branco. O pellet foi ressuspendido em 80µL de Tampão de Proteinase K (5X)

[NaCl 0,375M; EDTA ( pH8,0) 0,12 M], 8,0µL de proteinase K (20ng/mL), 10µL de

SDS 20% e 283,3µL de água destilada e incubado à 55°C por 16 horas. Foram


22

adicionados 120µL de NaCl 5M e após agitação por 15 segundos a amostra foi

centrifugada a 13000rpm por 8 minutos. O sobrenadante foi transferido para outro

microtubo onde foi adicionado 1,0mL de etanol à 20°C, homogeneizado e

centrifugado por 10 minutos à 13000rpm a uma temperatura de 4°C. O

sobrenadante foi descartado e o pellet restante desidratado. O pellet foi

ressuspendido em 50µL de água deionizada.

4.1.3. Modificação do DNA com Bissulfito de Sódio

O tratamento do DNA com bissulfito de sódio tem por finalidade converter in

vitro as Citosinas presentes na molécula de DNA em Uracila, porém, esta conversão

não ocorre quando as Citosinas encontram-se metiladas. Através dessa reação, é

possível a análise do padrão de metilação com base na presença de Citosinas que

permanecem no DNA após a modificação com bissulfito de sódio (Citosinas

metiladas) (FROMMER et al., 1992; CLARK et al., 1994; HERMAN et al.,1996).

Na execução do protocolo de modificação do DNA com bissulfito de sódio,

inicialmente, 1µg de DNA genômico foi diluído em 70µL de água ultra pura (Milli Q)

estéril. A seguir, foram adicionados 8µL de NaOH 3M para a desnaturação do DNA e

as amostras foram incubadas a 37°C por 15 minutos seguido de 94°C por 5 minutos.

Terminado o tempo de incubação, as amostras foram imediatamente

colocadas em gelo e, a cada tubo, acrescentou-se 1mL de uma solução constituída

por bissulfito de sódio 2,7M, hidroquinona 0,6mM e NaOH 0,36M.

A seguir as amostras foram incubadas a 55°C, no escuro, por 5 horas

(utilizou-se 100µL de óleo mineral para evitar a evaporação das amostras) e


23

posteriormente purificadas a partir do kit de purificação Wizard DNA Clean –up

System (Promega).

Terminada a purificação, ao DNA foi adicionado 5µL de NaOH 3M e incubado

a 37°C por 15 minutos. A seguir, o DNA foi novamente precipitado em 5µL de

Acetato de Sódio 3M pH 5,2 e 100µL de etanol absoluto e incubado a –20°C

overnight. No dia seguinte, as amostras foram centrifugadas a 13000rpm por 20

minutos e lavadas com etanol 70% seguido de centrifugação a 13000rpm por 5

minutos. O sobrenadante foi então desprezado, e após secar, o DNA modificado foi

resuspendido em 30Μl de água ultra pura (Milli Q) estéril.

4.1.4. Identificação de Ilhas CpGs e Desenhos de Primers

Previamente às análises moleculares foi realizada uma minuciosa revisão

bibliográfica para a escolha de regiões que melhor representassem sítios

regulatórios e DMRs experimentalmente comprovadas.

Também foi utilizado o software Methprimer (LI;DAHIYA, 2002) para a

identificação de ilhas CpGs e para a construção dos primers específicos, com

ajustes realizados através do programa GeneRunner V.3.05 (Hasting Software Inc.),

sempre evitando a formação de estruturas secundárias como dímeros e loops.

A presença de polimorfismos e sequências repetitivas foi excluída utilizando

os programas BLAST SNP Sequence (disponível em

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snpblastByChr.html) e RepeatMasker Open-3.0

(SMIT; HUBLEY; GREEN, 1996), respectivamente.


24

4.1.5. Análise de Metilação

4.1.5.1. Análise do padrão de metilação do gene GRB10

Para a análise de metilação na DMR próxima ao gene GRB10, utilizou-se o

Método de Análise Combinada de Bissulfito e Restrição Enzimática (COBRA –

Combined Bisulfite Restriction Analysis).

O método COBRA consistiu-se na análise do padrão de metilação de DNA,

previamente modificado por bissulfito de sódio, com auxílio de digestão enzimática.

O DNA modificado foi amplificado com primers que não discriminam os alelos

metilado e não metilado, pois não contém em sua sequência dinucleotídeos CGs.

Posteriormente, o fragmento resultante da amplificação foi submetido à restrição

enzimática com a enzima BstUI que reconhece e cliva a sequência CGCG, de modo

que a digestão somente ocorreu quando as Citosinas estavam metiladas (não foram

convertidas em Uracilas pelo bissulfito de sódio).

De acordo com a sequência no GenBank AC004920, foram utilizados os

seguintes primers: hGRB10-S= 5´ TATTTAGTTTTYGAGGGATTGGG 3´ e hGRB10-

AS= 5´ AAAATTAAACAACAAAAAACCCCC 3´ para o DNA modificado. Os

nucleotídeos sublinhados são os correspondentes às Citosinas que foram

modificadas para Timinas. No primer sense, hGRB10-S, está anotada uma base Y,

correspondente a iguais proporções de ambas as bases pirimidinas (C e T) uma vez

que a presença do nucleotídeo CG não pôde ser evitada e é susceptível à metilação.


25

42301 aaagcgggcc aacgccgcct ctggggacgc catccgggcg agggtgggat gccgcgccac

42361 cgcccgagcg tgcccggggg ctcccagcgc catcaccacg caggtgcccg ggggcccctc

42421 cgcggagccg gctgccgccc ggctgcaata ctcagcctcc gagggactgg gcgctcctga

42481 ggagcgggag gacgacggag cagcgcccgg tcctggagca caacaggaat cccaggacca

42541 aacccatgtg acgcggccac gccccaacgc ccggcggggg ccctctgctg cccaatcccc

42601 ggatccctgg ttctcatggc aaccctgaag aaccccttgt tccctccact gcctcctctc

42661 ctcccccaca gcccccccgc ctgatgggca aggacgcgca cactggccac tctgacgatg

42721 ccgaaagccc tccatgtcta cccgctacgc cgcattcgca gacaggcggg ggacatcgcg

42781 gccgcggcaa gctagagatg ccgcctgctc gagcaacctt ccacctgcag ggccggccag

Figura 5: Sequência próxima à região do gene GRB10 analisada, GenBank AC004920. Verde: primers utilizados. Maiúsculas e em negrito: sítio de clivagem da enzima BstUI.

Para a amplificação do fragmento correspondente, o meio de reação

constituiu-se de KCl 50 mM; MgCl2 1,5 mM; Tris HCl (pH 8,4) 10 mM; dNTP (0,1mM

de cada nucleotídeo); primer 0,2 mM (de cada); Taq DNA Polimerase 1U; DNA

genômico 0,1µg em volume final de 25 uL.

As reações foram realizadas em aparelho termociclador programável T-

gradiente (Biometra) seguindo protocolo que se consistiu de uma etapa inicial de

95°C por 10 minutos (hot start), seguido de 40 ciclos de 95°C por 45 segundos, 58°C

por 45 segundos e 72°C por 45 segundos.

Após verificada a presença de fragmento amplificado em gel de poliacrilamida

10% corado com nitrato de prata (0,2%), 1ug do produto de PCR foi submetido à

digestão com 5U da enzima BstUI e incubado em 5mM NaCl, 1mM Tris-HCl, 1mM

de MgCl2, 0,1mM DTT, pH 7,9 (Buffer 2, 1x), overnight à 60°C.

Os produtos das digestões foram visualizados por eletroforese em gel de

poliacrilamida 10% corado com nitrato de prata (0,2%).

Uma digestão completa foi esperada em caso de metilação em ambos os

alelos, devido à manutenção do sítio de restrição após a modificação com bissulfito

de sódio (CGCG se tornaria UGUG). Para toda reação de modificação por bissulfito

de sódio, foi incluído também uma amostra de espermatozóide (padrão


26

conhecidamente hipometilado para a região) para controle de modificação completa

em todas as Citosinas não metiladas.

4.1.5.2. Análise do padrão de metilação do gene MEST

Para a análise de metilação da DMR do gene MEST (GenBank NT_007933),

utilizou-se o método COBRA.

A amplificação do fragmento correspondente ocorreu em meio com KCl 50

mM; MgCl2 1,5 mM; Tris HCl (pH 8,4) 10 mM; dNTP (0,1mM de cada nucleotídeo);

primer 0,2 mM (de cada); Taq DNA Polimerase 1U; DNA genômico 0,1µg em volume

final de 25 uL.

Foram utilizados os primers: hMEST/PEG1- S 5´ TGTTGGTTAGTTTTGTA

TGGTTG 3´ e hMEST/PEG1- AS 5´ CCCAAAAACAACCCCAACAC 3´. A

amplificação ocorreu, após um hot start, em 40 ciclos de 95°C por 45 segundos,

58°C por 45 segundos e 72°C por 45 segundos, termociclador T-gradiente

(Biometra).

5881 tgccgcggca accagcacac cccggcacct cctctgcggc agctgcgcct cgcaagcgca

5941 gtgccgcagc gcacgccgga gtggctgtag ctgcccggcg cggcgccgcc ctgcgcgggc

6001 tgtgggctgc gggctgcgcc cccgctgctg gccagctctg cacggctgcg ggctctgcgg

6061 cgcccggtgc tctgcaacgc tgcggcgggc ggcatgggat aacgcggcca tggtgcgccg

6121 agatcgcctc cgcaggtgag tgtgcggtgg gaacgagggg gtgtggctgg cggccctggg

6181 actagggcgc aggcgagcgg aggactgtgt gcccgtgtcc gagctggggc tgcctctggg

6241 cgaaaactct accgacaggc ggcacgcatt ccgcgcccgc tctgcctact tgaggagggg

6301 gtgtcactcc tgcccgcaat ggaatgttca gaacgcggga cctccttggg ttaggatttc

Figura 6: Sequência próxima à região do gene MEST analisada, GenBank NT_007933. Verde: primers utilizados. Maiúsculas e em negrito: sítio de clivagem da enzima BstUI.


27

O fragmento amplificado foi submetido à digestão com 5U da enzima BstUI,

overnight à 60°C.

Os produtos das digestões foram visualizados por eletroforese em gel de


Também foi realizada a modificação de DNA por bissulfito de sódio de

amostra de espermatozóide (padrão conhecidamente hipometilado para a região)

em toda reação, para controle de modificação completa.

4.1.5.3. Análise do Padrão de Metilação da H19DMR

A análise da região H19DMR foi realizada através de dois métodos. O método

COBRA e o método Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em

Tempo Real (DESM-RT).

4.1.5.3.1. Análise Combinada de Bissulfito e Restrição Enzimática (COBRA)

Para o método COBRA, foram utilizados os 0,2 mM de cada primer:P1A: 5´

GTATAGTATATGGGTATTTTTGGAGGTTTT 3´ e P1B: 5´ TAAATATCCTATTCCCA

AATAACCC 3´ em meio com KCl 50 mM; MgCl2 1,5 mM; Tris HCl (pH 8,4) 10 mM;

dNTP (0,1mM de cada nucleotídeo); primer 0,2 mM (de cada); Taq DNA Polimerase

1U; DNA genômico 0,1µg em volume final de 25 uL. O fragmento foi amplifica em 50

ciclos de 95°C por 45 seg, 61°C por 45 seg e 72° por 45 seg.


28

Do produto amplificado, 1ug foi submetido à digestão com 5U da enzima

BstUI e incubada em 5mM NaCl, 1mM Tris-HCl, 1mM de MgCl2, 0,1mM DTT, pH 7,9

(Buffer 2, 1x), overnight à 60°C e visualizados por eletroforese em gel de


Como controle de eficiência da modificação por bissulfito de sódio, foi

amplificado um fragmento a partir de DNA genômico (primers H19 UPH19II: 5’-

CAATGAGGTGTCCCAGTTCCA-3’ e H19 UPH19III: 5´-CACATAAGTAGGCGTG

ACTTGA-3´. Esse fragmento amplificado, não metilado, foi incluído em todas as

reações por bissulfito de sódio, sendo usada como controle de hipometilação. Já

amostras de espermatozóide humano, conhecidamente hipermetiladas para a

região, foi utilizada como controle de digestão total.

Para excluir a presença de alterações na sequência de DNA nos sítios

analisados, o que poderia falsear os resultados de metilação, na metodologia

COBRA, o fragmento amplificado a partir do DNA genômico (primers UPHII e

UPHIII) foram também digeridos com a BstUI em todas as amostras analisadas.

4.1.5.3.2. Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em

Tempo Real (DESM-RT)

Pela metodologia de PCR em tempo real associada à digestão com enzimas

sensíveis à metilação foi obtido, de forma quantitativa, o padrão de metilação na

região H19DMR a partir da comparação da amplificação de DNA não digerido com

DNA digerido com a enzima HpaII, enzima capaz de clivar apenas os alelos não

metilados (GOMES et al., 2007). Para a comparação foi utilizado o número do ciclo


29

no qual o nível de fluorescência emitido pelas amostras amplificadas atingiu o nível

arbitrário - ct (threshold). De acordo com o princípio de amplificação exponencial das

amostras (ou seja, o dobro de produto a cada ciclo) a porcentagem de DNA metilado

foi calculada pela fórmula (1/2)d - nd, sendo d a média do ct do DNA digerido e nd a

média do ct do DNA não digerido.

A digestão de 0,2 ug de DNA genômico foi realizada em meio contendo com 1

mM Bis Tris Propano-HCl, 1 mM MgCl2, 0,1 mM DTT (pH 7.0) com 10 U da enzima

HpaII (NE- New England) à 37°C, overnight, seguido por uma etapa de 60°C à 20

minutos para inativação. O material não digerido recebeu o mesmo tratamento

apenas retirando-se a enzima.

Todas as amostras foram também digeridas separadamente pela enzima

MspI, com mesmo sítio de restrição da HpaII porém não sensível à metilação, para

excluir alterações na sequência de DNA.

Foi utilizado o sistema de detecção de sequência StepOne™ Real-Time PCR

(Applied Biosystems, Foster City, CA) com 5 ul SYBR Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems) e 0,4 uMol de cada primer: H19 UPH19II: 5’-

CAATGAGGTGTCCCAGTTCCA-3’ e H19 Real T-2: 5’-CTATGAGTGTCCTATTCCC

-3’.

Cada amostra foi quantificada em duplicata ou triplicata, com desvio padrão

máximo estipulado em 0,2. Todo resultado foi confirmado pelo menos duas vezes,

com uma nova digestão e nova amplificação em uma placa de reação diferente da

primeira análise.

As condições de ciclagem foram: 95°C for 10 min e 35 ciclos (95°C por 15 seg

e 61°C por 60 seg), seguidos por análise de dissociação realizada de 60° a 95°,

variando 0,1°C a cada segundo.


30

1081 tgcactgttg aaggttgggg agatgggagg agatactagg ggaacaatga ggtgtcccag

1141 ttccatggat gatggggatc tcggccctag tgtgaaaccc ttctcgcagg gtctctggca

1201 ggcacagagc ccgggggctc ttgcatagca catgggtatt tctggaggct tctcttcggt

1261 ctcaccgcct ggatggcacg gaattggttg tagttgtgga atcggaagtt gcgcgcggcg

1321 gcagtgcagg ctcacacatc acagcccgag cccgccccaa ctggggttcg cccgtggaaa

1381 cgtcccgggt cacccaagcc acgcgtcgca gggttcacgg gggtcatctg ggaataggac

1441 actcatagga gccgcaccag atcttcaggt cgggcattat ccacagcccc gtggccccgg

1501 gtcacactcc gagggcttca gtgtcatggc ctgggactca agtcacgcct acttatgtga

1561 tgatcacagt gtgttccacc aaaatcttac attttccaca tctatcccag agcacagctc

Figura 7: Sequência próxima à região H19DMR analisada, GenBank U50731. Cinza: região dos primers utilizados no método COBRA. Maiúsculas e em negrito: sítios de clivagem das enzimas BstUI e HpaII. Negrito: primers utilizados no método de Digestão Enzimática Associada à PCR em Tempo Real. Sublinhado: primers utilizados para amplificação da região H19 usada como controle de modificação.

4.1.5.4. Análise do Padrão de Metilação da KvDMR1

Para análise molecular do padrão de metilação da KvDMR também foram

utilizadas duas metodologias: a PCR específica para a metilação (MS-PCR –

methylation specific PCR) e a DESM-RT.

4.1.5.4.1. PCR específica para a metilação (MS-PCR)

O princípio da MS-PCR consiste na amplificação específica de fragmentos

metilados e não-metilados de uma determinada região do DNA modificada por

bissulfito de sódio (HERMAN et al.,1996). Para tal, utilizam-se primers específicos

capazes de discriminarem e hibridarem apenas a um tipo de fragmento.

Após a modificação por bissulfito de sódio as Citosinas não-metiladas

convertidas em Uracilas são reconhecidas pela Taq Polimerase como Timina, devido

à similaridade estrutural. Dessa forma, para a amplificação do fragmento metilado foi

utilizado o primer denominado “M” (hibridação em fragmento que contém Citosinas

não convertidas – CG) e para a amplificação do fragmento não metilado foi utilizado

o primer “U” (hibridação em fragmento que contém timinas - TG).


31

Ambas as reações realizaram-se em KCl 50 mM; MgCl2 1,5 mM; Tris HCl (pH

8,4); 10 mM; dNTP (0,1mM de cada nucleotídeo); primer 0,2 mM (de cada); Taq

DNA Polimerase 1U e 0,1 µg de DNA genômico, no aparelho termociclador

programável T-gradiente (Biometra).

A ciclagem para amplificação do fragmento M consistiu de uma fase de

denaturação do DNA a 94° C por 5 min e de 50 ciclos de 94°C por 1 min; 59,3°C por

1min e 30 seg e 72°C por 1 minuto, seguido por uma fase final de extensão de 72°C

por 10 min, com os primers: M1A: 5’ TTTTTTCGGTTAATGATAGGATACG 3’ e M1B:

5’ TCTACCTAAAAACTACGACAACGCT 3’

Para o fragmento U foi realizada uma denaturação a 94°C por 5 min, seguido

de 50 ciclos de 94°C por 1 min; 56,2°C por 1min e 30 seg e 72°C por 1 min, seguido

por uma fase final de extensão de 72°C por 10 min e os primers utilizados foram:

U2A: 5’ TTTTTTGGTTAATGATAGGATATGG 3’ e U2B: 5´ TCTACCTAAAAACTA

CAACAACACT 3’.

Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de poliacrilamida

(30%) corado com nitrato de prata (0.2%).

4.1.5.4.2. Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em

Tempo Real (DESM-RT)

Na análise por DESM-RT na KvDMR, também foi realizada digestão com a

enzima HpaII, comparando-a ao material não digerido.

A digestão de 0,2 ug de DNA genômico ocorreu em meio contendo com 1 mM

Bis Tris Propano-HCl, 1 mM MgCl2, 0,1 mM DTT (pH 7.0) com 5 U da enzima HpaII


32

(NE- New England) à 37°C, overnight, seguido por uma etapa de 60°C à 20 minutos

para inativação.

Também foi utilizado o sistema de detecção de sequência StepOne™ Real-

Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) com 5 ul SYBR Green PCR Master

Mix (Applied Biosystems) e 10pmol de cada primer (sense: 5’-

GTGCCTCTCAGCGTGGTCC-3’; antiscoense: 5’- AACCACGATGACTGACGCA C -

3’).

Cada amostra foi quantificada em duplicata ou triplicata, com desvio padrão

máximo estipulado em 0,2. Todo resultado foi confirmado pelo menos mais uma vez,

com uma nova digestão e nova amplificação em uma placa de reação diferente da

primeira análise.

As condições de ciclagem foram: 95°C for 10 min e 35 ciclos (95°C por 15 seg

e 65,4°C por 45 seg), seguido por análise de dissociação realizada de 60° a 95°,

variando 0,1°C a cada segundo.

Amplificação do material digerido com MspI, para controle, também foi

realizada em todas as amostras.

67201 gtggtgctca gggacgacgg gtgggggcag ggagggcggc ggctcgcgcc acctcacacc

67261 cagccagtgc ctcatgcggc gctggacccg ctgggccaat ctgagcccgg gtggcatcaa

67321 aaccagactc tttcggccaa tgacaggaca cggcacatca ctttccgcac ccagccaatc

67381 cgtgcagcag cccgccgcaa gccttcccct gctgccgccc aatcagcagg tggggggcgg

67441 tcgccacgtc ggcagcggcg ggggcagtcg gagcgctgcc gcagtctcca ggcagaacgg

67501 tcgccgcgtc gcctcagcac ggacctccag ggagctcctc agcaagatcc tgccagggcg

67561 cccctcagcg cgattctgcc ggggtgcctc tcagcgtggt cctccccggg gctcctcagc

67621 acgattctcc cggtgcgccc ctcagcgcgg tcctcctcgg tgcgtcagtc atcgtggttc

67681 tccccggcgc gcccctcggc gcggttctcc tcggggctcc tcagcgcggc gctcttctgg

67741 gggctcctcg gcgcagttct ccccggggac tcctcggcgc cgttctcctc ggggcacccg

Figura 8: Sequência próxima à região KvDMR1 analisada, GenBank U90095. Cinza: região dos primers utilizados no método MS-PCR. Negrito: primers utilizados no método de Digestão Enzimática Associada à PCR em Tempo Real. Maiúsculas e em negrito: sítio de clivagem da enzima HpaII. Em negrito e sublinhado, Citosinas analisadas.

5555. . . . RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS

5. Resultados

34

5.1. ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO DO GENE GRB10

A análise do padrão de metilação do gene GRB10 pelo método COBRA

demonstrou metilação monoalélica (normal) para todos os controles e todos os

pacientes com SSR (Figuras 9 e 10).

L ESP C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 BR

Figura 9: Perfil de metilação do gene GRB10 pelo método COBRA em amostras de indivíduos saudáveis (controle). Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% visualizado por impregnação com nitrato de prata. (L) - marcador molecular (Ladder 100bp, Promega). (C1 a C10) - amostras dos controles, com padrão normal de metilação. (ESP) – amostra de espermatozóide, controle hipometilado , (BR) – controle negativo da amplificação. L ESP SR1 SR2 SR3 SR4 SR5 SR6 SR7 SR8 SR9 SR10 BR

Figura 10: Perfil de metilação do gene GRB10 pelo método COBRA em amostras de pacientes com Silver-Russell. Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% visualizado por impregnação com nitrato de prata. (L) - marcador molecular (Ladder 100bp, Promega). (SR1 a SR10) – amostras dos pacientes, padrão normal de metilação. (ESP) – amostra de espermatozóide, controle hipometilado , (BR) – controle negativo da amplificação.

151pb

46 pb

105pb

46 pb

105pb

151pb

5. Resultados

35

5.2. ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO DO GENE MEST

A análise do padrão de metilação do gene MEST evidenciou um padrão

indicativo de hipermetilação para apenas um paciente com SSR (1/15, 6,7%), sendo

encontrado padrão monoalélico normal de metilação para os demais pacientes e

amostras controle (Figuras 11 e 12).

L ESP C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 BR

Figura 11: Perfil de metilação do gene MEST pelo método COBRA em amostras de indivíduos saudáveis (controle). Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% visualizado por impregnação com nitrato de prata. (L) - marcador molecular (Ladder 100bp, Promega). (C1 a C10) - amostras dos controles, com padrão normal de metilação. (ESP) – amostra de espermatozóide, controle hipometilado , (BR) – controle negativo da amplificação. L ESP SR1 SR2 SR3 SR4 SR5* SR6 SR7 SR8 SR9 SR10 BR

Figura 12: Perfil de metilação do gene MEST pelo método COBRA em amostras de pacientes com síndrome de Silver-Russell. Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% visualizado por impregnação com nitrato de prata. (L) - marcador molecular (Ladder 100bp, Promega). (SR1 a SR4 e SR6 a SR10) - amostras dos pacientes, padrão normal de metilação. (SR5*) - amostra de paciente com hipermetilação. (ESP) – amostra de espermatozóide, controle hipometilado , (BR) – controle negativo da amplificação.

79 pb

131pb

79 pb

210pb

131pb

210pb

5. Resultados

36

5.3. ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO DA H19DMR

5.3.1. COBRA

Foi observado padrão condizente com a metilação monoalélico para todas as

amostras analisadas (Figura 13).

L HIP ESP SR1 SR2 SR3 SR4 SR5 SR6 SR7 SR8 SR9 SR10 BR

Figura 13: Perfil de metilação da H19DMR pelo método COBRA em amostras de pacientes com síndrome de Silver-Russell. Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% visualizado por impregnação com nitrato de prata. (L) - marcador molecular (Ladder 100bp, Promega). (SR1 a SR10) – amostras dos pacientes, padrão normal de metilação. (HIP) – fragmento amplificado com primers UPHII e UPHII posteriormente modificado por bissulfito de sódio – controle hipometilado, (ESP) - amostra de espermatozóide, controle hipermetilado, (BR) – controle negativo da amplificação.

5.3.2. DESM-RT

A análise da H19DMR pelo método DESM-RT permite a quantificação da

porcentagem de metilação.

Para os 10 indivíduos controle, obteve-se média de metilação igual a 40% ±

(Tabela 1). A partir desse grupo foram considerados níveis normais de metilação os

valores entre a média mais duas vezes o valor do desvio padrão, tanto para mais ou

para menos, ou seja, foram consideradas porcentagens normais entre 22 e 58%.

223pb

92pb 89pb

5. Resultados

37

A média de metilação no grupo dos pacientes com SSR (31% ± 0,11) foi

comparada com a média do grupo controle pelo teste estatístico Mann Whitney

realizadas com auxílio do software Prism Graphpad (USA), não sendo encontrada

diferença estatisticamente significativa (p>0,05) (Figura 15).

A maioria dos pacientes (12/15) apresentou perfil de metilação normal.

Entretanto, três deles (20%) apresentaram um perfil condizente com hipometilação

parcial, sendo a metilação de 9, 12 e 19%, para os pacientes SR2, SR8 e SR13,

respectivamente (Tabela 2).

Nos pacientes analisados separadamente, SR16, irSR1, irSR2, irSR3 e ST1,

o perfil de metilação foi considerado normal (Tabela 3).

Figura 14: Gráfico de amplificação em tempo-real da H19DMR. ∆ Rn – magnitude do sinal gerado por uma condição específica de PCR; Ciclo – número do ciclo; t- threshold, nível de fluorescência arbitrário; nd – amostra não digerida; d – amostra digerida com HpaII. A porcentagem de metilação é calculada pela fórmula 1/2(ct d – ct nd). A, amplificação exemplificando uma amostra com metilação normal, monoalélica (amostra C4 = 48%). B, amplificação exemplificando uma amostra com hipometilação (amostra SR2 = 9%).

5. Resultados

38

Figura 15: Comparação entre a média de porcentagem de metilação da H19DMR no grupo controle e no grupo de pacientes com síndrome de Silver-Russell. % de Metilação – porcentagem de metilação obtida pelo DESM-RT, CTL - amostras controles, SRS – amostras de pacientes com SSR.

Tabela 1: Resultados da H19DMR obtidos pelo método DESM-RT em amostras controle.

Amostra % de Metilação

C1 41%

C2 38%

C3 28%

C4 48%

C5 30%

C6 50%

C7 51%

C8 44%

C9 27%

C10 36%

Porcentagem metilação das amostras controle C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 e C10.

5. Resultados

39

Tabela 2: Resultados da H19DRM obtidos pelo método DESM-RT em pacientes com síndrome de Silver-Russell.

Amostra % de Metilação Perfil

SR1 41% Monoalélico

SR2 9% HIPOMETILADO






SR8 12% HIPOMETILADO





SR13 19% HIPOMETILADO



Porcentagem metilação dos pacientes com SSR. SR1, SR2, SR4, SR5, SR6, SR7, SR9, SR10, SR11, SR12, SR14, SR15 – perfil normal, monoalélico, de metilação, SR3, SR8, SR13 – perfil hipometilado.

Tabela 3: Resultados da H19DRM obtidos pelo método DESM-RT em casos particulares. Amostra % de Metilação Perfil


irSR1 39% Monoalélico



ST1 44% Monoalélico

Porcentagem metilação dos pacientes SSR16, irSR1, irSR2, irSR3, ST1 – perfil normal, monoalélico, de metilação.

5. Resultados

40

5.4. ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO DA KVDMR1

5.4.1. MS-PCR

Observou-se um perfil condizente com metilação monoalélica normal para

todas as amostras analisadas (Figura 16 e 17).

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 . L M U M U M U M U M U M U M U br

Figura 16: Perfil de metilação da KvDMR pelo método MS-PCR em indivíduos saudáveis (controle). Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% visualizado por impregnação com nitrato de prata. (L) - marcador molecular (Ladder 100bp, Promega). (C1 a C7) – amostras dos controles, com padrão normal de metilação. (M) – reação utilizando primers M1A e M1B, (U) – reação utilizando primers U2A e U2B. (br) – controle negativo da amplificação. SR1 SR2 SR3 SR4 . SR5 SR6 SR7 SR8 . L M U M U M U M U M U M U M U M U br

Figura 17: Perfil de metilação da KvDMR pelo método MS-PCR em amostras de pacientes com síndrome de Silver-Russell. Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% visualizado por impregnação com nitrato de prata. (L) - marcador molecular (Ladder 100bp, Promega). (SR1 a SR8) – amostras dos pacientes, com padrão normal de metilação. (M) – reação utilizando primers M1A e M1B, (U) – reação utilizando primers U2A e U2B. (br) – controle negativo da amplificação.

169pb

169pb

5. Resultados

41

5.4.2. DESM-RT

Analisando quantitativamente o perfil de metilação da região KvDMR,

constatamos que os 10 indivíduos controle apresentaram uma média de metilação

de 49% ± 0,07 (Tabela 3). A partir desse grupo foram considerados níveis normais

de metilação os valores entre 35 e 63%.

Entre os 15 pacientes analisados, a média de metilação foi de 45% ± 3%, não

apresentando diferença estatisticamente significante quando comparado ao grupo

controle (p>0,05 – teste (método Mann Whitney, software Prism Graphpad (USA)

(Figura 19). Sendo que todos apresentaram perfil condizente de metilação normal,

monoalélico (tabela 4). O paciente ST1 também apresentou perfil normal (Tabela 6).

Já os pacientes com histórico de consanguinidade se mostraram parcialmente

hipermetilados. O paciente SR16 apresentou 68% de metilação nessa região e foi

verificado, ainda, para os três irmãos de 72%, 74% e 65% de metilação (Tabela 6).

5. Resultados

42

Figura 18: Gráfico de amplificação em tempo-real da KvDMR. ∆ Rn – magnitude do sinal gerado por uma condição específica de PCR; Ciclo – número do ciclo; t- threshold, nível de fluorescência arbitrário; nd – amostra não digerida; d – amostra digerida com HpaII. A porcentagem de metilação é calculada pela fórmula 1/2(ct d – ct nd). A, amplificação exemplificando uma amostra com metilação normal, monoalélica (amostra C3 = 45%). B, amplificação exemplificando uma amostra com hipometilação (amostra irSR2 = 74%).

Figura 19: Comparação entre a média de porcentagem de metilação da KvDMR no grupo controle e no grupo de pacientes com síndrome de Silver-Russell. % de Metilação – porcentagem de metilação obtida pelo DESM-RT, CTL - amostras controles, SRS – amostras de pacientes com SSR.

5. Resultados

43

Tabela 4: Resultados da KvDMR obtidos pelo método DESM-RT em amostras controle.

Amostra % de Metilação

C1 58%

C2 53%

C3 45%

C4 60%

C5 56%

C6 42%

C7 44%

C8 41%

C9 42%

C10 45%

Porcentagem metilação das amostras controle C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9 e C10.

5. Resultados

44

Tabela 5: Resultados da KvDMR obtidos pelo método DESM-RT em pacientes com síndrome de Silver-Russell.

















Porcentagem metilação dos pacientes com SSR. SR1, SR2, SR3, SR4, SR5, SR6, SR7, SR8, SR9, SR10, SR11, SR12, SR13, SR14, SR15 – perfil normal, monoalélico, de metilação.

Tabela 6: Resultados da KvDMR obtidos pelo método DESM-RT em casos particulares.


SR16 68% HIPERMETILADO

irSR1 72% HIPERMETILADO



ST1 43% Monoalélico

Porcentagem metilação dos pacientes SSR16, irSR1, irSR2, irSR3, ST1 – perfil normal, monoalélico, de metilação.

5. Resultados

45

5.5. CORRELAÇÃO DOS ACHADOS CLÍNICOS E MOLECULARES

Com relação aos aspectos clínicos, verificamos que o peso médio das

crianças ao nascimento foi de 1881 gramas, com desvio padrão de 634g. Todos os

pacientes analisados apresentaram retardo de crescimento pré e pós-natal (Tabela

7). Não foi possível obter o prontuário de dois pacientes analisados molecularmente

(SR2 e SR4), sendo, portanto, excluídos desta parte da análise.

O paciente (SR5) que apresentou hipermetilação do gene MEST possuía face

triangular, macrocefalia aparente, clinodactilia do 5° dedo, alterações de orelha, rima

labial com inclinação para baixo, leve atraso no desenvolvimento neuropsicomotor e

necessidade de ensino especial. Esse paciente não apresentou assimetria corporal

e também não há relato de alterações genitais.

Entre os pacientes (SR8 e SR13) com hipometilação da H19DMR analisados,

o caso SR8 apresentava macrocefalia aparente, face triangular, alterações

dentárias, clinodactilia do 5° dedo e uma discreta assimetria corpórea. O caso SR13,

também apresentou face triangular, aparente macrocefalia e clinodactilia, porém

com ausência de assimetria corpórea evidente.

Devido ao pequeno número de pacientes com alterações moleculares, não foi

possível uma análise estatística refinada para relacionar os achados laboratoriais

aos clínicos.

Os três pacientes irmãos analisados, oriundos do Hospital das Clínicas de

São Paulo (Faculdade de Medicina da USP, São Paulo) estão sendo publicados

separadamente por esse grupo, não sendo descritos com detalhes nesse trabalho.

Entretanto, o indivíduo SR16, com hipermetilação da KvDMR, apresentou peso e

comprimento ao nascimento de 2,400g e 45cm, retardo de crescimento pós-natal,

5. Resultados

46

macrocefalia aparente, face triangular, alterações dentárias, orelhas alteradas,

clinodactilia, assimetria corpórea, manchas café-com-leite, além de cisto renal à

direita, fístula sacro-coccígea, epífese do 2° ao 5° dedos tão largas quanto à diáfise

e musculatura hipotrófica.

O paciente com cariótipo condizente com a síndrome de Turner era do sexo

feminino, 45,X[25]/46,XX[75], e apresentava algumas características próprias dessa

alteração, como cabelo com implantação baixa em tridente, algumas que podem ser

compatíveis com ambas as doenças como baixo peso pós e pré-natal. Entretanto, a

paciente apresentava características típicas de SSR, como macrocefalia aparente,

face pequena e clinodactilia de 5° dedo de mãos.

Tabela 7. Resultado molecular e características clínicas dos pacientes com síndrome de

Silver-Russell.

amostra MEST H19 P.N. (g)

C.N. (cm)

R.C.pós-natal

Face Triang

Macrocef Aparente

Clinod 5°

SR1 2.250 42 x x x x

SR3 2.600 46 x x x x

SR5 x 2.600 46 x x x x

SR6 1.680 ND x x x

SR7 1.630 42 x x x

SR8 x 2300 45 x x x x

SR9 1380 35 x x x

SR10 760 34,5 x x x x

SR11 900 ND x x x x

SR12 1.500 39 x x x x

SR13 x 2.150 44 x x x x

SR14 2.000 43 x x x x

SR15 2.700 47 x x x

Aspectos moleculares e clínicos dos pacientes SR1, SR2, SR3, SR4, SR5, SR6, SR7, SR8, SR9, SR10, SR11, SR12, SR13, SR14, SR15. P.N. = peso ao nascimento, C.N. = comprimento ao nascimento, R.C.pós-natal = retardo de crescimento pós-natal, Face Triang = face triangular, Macrocef. Aparente = macrocefalia aparente, Clinod. 5° = clinodactilia do quinto dedo da mão.

5. Resultados

47

Continuação da Tabela 7. Alteração molecular e características clínicas dos pacientes com síndrome de Silver-Russell. amostra Sindact

II-III Assimet M Café c

Leite Alt de Orelha

Alt Dent

Dif Alimen

Déficit Cognit

Aum Sudor

R Lab Baixo

Alt de Voz

Atraso Fala

Outro

SR1 x x x x hérnia gástrica

SR3 x x

SR5 x x x x x hipotonia

SR6 x x alt genitais

SR7

SR8 x x

SR9 x x x x x x hipotonia

SR10 x x x prega simiesca

SR11 x x

SR12 x x x x x x campodactilia

SR13 x x alt. gastrointest.

SR14 x x x x x

SR15 x x x x

Aspectos clínicos dos pacientes SR1, SR2, SR3, SR4, SR5, SR6, SR7, SR8, SR9, SR10, SR11, SR12, SR13, SR14, SR15. Sindact II-III = sindactilia entre segundo e terceiro pododáctilos, Assimet = assimetria corporal, M Café c Leite = manchas café-com-leite, Alt de Orelha = alterações de orelha, Alt Dent = alterações dentárias, Dif Alimen = dificuldade de alimentação, R Lab baixo = rima labial com inclinação para baixo, Alt de Voz = alterações de voz, Atraso Fala = atraso de fala, Outro = Outras alterações.

6666. . . . DISDISDISDISCUSSÃOCUSSÃOCUSSÃOCUSSÃO

6. Discussão

49

Trabalhos anteriores descreveram o papel da DUP materna completa do

cromossomo 7 na etiologia da SSR, a qual tem sido responsabilizada por cerca de

10% dos casos (KOTZOT et al., 1995; EGGERMMAN et al., 1997; HANULLA et al.,

2002). A análise molecular da maioria dos trabalhos foi realizada por marcadores

moleculares do tipo microssatélite, tendo como desvantagem a necessidade de

amostras de DNA dos pais dos pacientes, geralmente de difícil acesso e com

dificuldades em relação à paternidade real, além da exigência de análise de

múltiplos loci.

Kim et al., em 2004, descreveram uma metodologia com a qual era possível

analisar a DUP pelo perfil de metilação em DMRs de dois genes que sofrem

imprinting e que são candidatos a um papel importante na etiologia da SSR, o

GRB10 e o MEST. Por meio desse ensaio pode-se obter informação adicional do

status de metilação específica desses genes. Entretanto, esse teste é ineficaz para

detecção de DUPs segmentares não relacionadas a esses genes, também citadas

em alguns casos (PRICE et al., 1999; MONK et al., 2002).

A análise da DUP do cromossomo 7 no presente trabalho foi realizada a partir

da pesquisa proposta por Kim. Entretanto, foram desenhados novos primers, sendo

escolhidas regiões já descritas como DMRs e testadas para a detecção de DUP

(AURNAULD et al., 2003; KIM et al., 2004). O padrão alterado de metilação não

encontrado simultaneamente nos genes MEST e GRB10 sugere a ausência de

mDUP7 completa, demonstrando que essa alteração não era o principal mecanismo

responsável pela SSR nos pacientes analisados.

Com relação especificamente ao gene GRB10, o grande interesse em

candidatá-lo na etiologia da síndrome iniciou-se com a descrição de dois pacientes

6. Discussão

50

com duplicação da região 7p11-p13 (JOYCE et al. 1999; MONK et al. 2000), sendo

também escolhido por estar sujeito ao imprinting genômico e por apresentar, em

estudos com camundongos e in vitro, um efeito supressor de crescimento

(YOSHIHASHI et al., 2000).

O padrão de metilação na DMR do gene GRB10 no presente trabalho

mostrou-se normal em todos os controles e pacientes. Outros grupos, buscando

mutações no gene ou duplicações da região, também não conseguiram relacionar o

desenvolvimento da síndrome com alterações específicas do GRB10. Por exemplo,

a duplicação descrita 7p11-p13 não foi mais encontrada em 55 pacientes com SSR

posteriormente analisados (JOYCE et al., 1999; MONK et al., 2000; MARTINEZ et

al., 2001), sendo também frustrada a busca de mutações pontuais nos éxons do

GRB10 (BLAGITKO et al., 2000; HITCHINS et al., 2001)

Apenas Yoshihashi et al., em 2000, conseguiram encontrar uma mesma

mutação pontual no GRB10 em dois pacientes. Entretanto, o fato dessa mutação ser

detectada em apenas dois de 163 pacientes sugere que essa mutação não é a

grande responsável pelo desenvolvimento da doença. Essa mutação pode constituir-

se na verdade em um raro polimorfismo restrito à população japonesa, sendo

necessários estudos funcionais para elucidar seu real papel.

O gene PEG1/MEST também tem sido descrito como candidato na etiologia

da SSR, principalmente devido a duas principais linhas de evidências. Entre essas, o

gene foi o primeiro descrito a estar sujeito ao imprinting genômico no cromossomo 7,

além de ter sua expressão confinada ao alelo paterno, o que condiz com a idéia de

que estaria inativado nos pacientes com mDUP7. A outra evidência vem de estudos

6. Discussão

51

em camundongos onde o silenciamento específico do alelo paterno resultou em

embriões viáveis, mas com crescimento retardado (RIESEWIJK et al., 1998).

Através da análise de metilação na região 5´UTR do gene MEST foi

identificado um paciente (SR5) com hipermetilação da região, o que representa 6,7%

(1/15). Isso condiz com a hipótese de que a baixa expressão do gene estaria ligada

ao desenvolvimento da síndrome, podendo ser também responsabilizada por parte

dos fenótipos encontrados nos pacientes com mDUP7.

Entretanto, a maioria dos trabalhos não relatou alterações específicas do

gene MEST, como visto por Riesewijk et al., em 1998, os quais não encontraram

mutações condizentes com uma possível alteração de função na região promotora,

nos éxons e nem nas ligações íntron-éxon em 49 pacientes com SSR, além de

comprovarem um padrão normal de metilação na região 5´ do gene em 35

pacientes. Kobayashi et al., em 2001, não encontraram mutações na sequência do

gene, verificaram um perfil normal de metilação, além de uma expressão normal em

linfócitos e Meyer et al., em 2003, que buscaram mutações no gene MEST1T1,

identificado como um RNA não-codificante possivelmente envolvido na regulação do

MEST, verificaram a ausência de mutações especificamente ligadas aos 46

pacientes com SSR analisados.

Contrariamente, Hanulla et al., em 2001, descreveram um paciente com

mDUP específica da região 7q31-qter. Essa observação, conjuntamente com o

resultado de metilação verificado no paciente SR5, sugere que o gene MEST teria

papel na etiologia da síndrome.

O paciente SR5 possui alteração de metilação especificamente no gene

MEST, sendo normal para o gene GRB10. Como proposto por Kim et al., em 2004,

6. Discussão

52

apenas a alteração de metilação nas duas regiões seria compatível com a mDUP7

completa, geralmente encontrada nos pacientes com SSR, sugerindo a não

existência dessa alteração no paciente. Porém, não podemos excluir, embora menos

provável, a possibilidade de ter ocorrido uma dissomia e posteriormente uma

alteração de metilação na região do GRB10, o que resgataria o perfil normal

apresentado. Ainda não foi possível concluir se o paciente tem uma alteração

específica de metilação ou uma mDUP7 segmentar da região, como descrito por

Hanulla et al. (2001). O que não diminui a possibilidade que essa hipermetilação do

gene MEST tenha um efeito fenotípico, semelhante ao que teria nos portadores de

DUP7 completa.

Porém, devido ao número de relatos que não responsabilizaram o gene

MEST isoladamente e que dos pacientes analisados apenas um possuiu a alteração,

sugere-se que o gene deva estar envolvido na etiologia da síndrome, mas em uma

minoria de casos e/ou em associação com outros localizados no próprio

cromossomo 7 e em outros cromossomos.

A relação na literatura do cromossomo 11 com a SSR iniciou-se com a

publicação de por Gicquel et al., em 2005. Esses pesquisadores começaram a

estudar essa relação devido ao forte envolvimento da região 11p15 no controle de

crescimento fetal. Em suas análises, esses pesquisadores examinaram o perfil de

metilação na KvDMR1, no promotor do H19 e na H19DMR em sangue periférico de

nove indivíduos, sendo que cinco desses apresentaram uma perda de metilação

parcial nos domínios do H19 e todos apresentaram um perfil normal na KvDMR1. Os

casos com hipometilação também foram analisados com relação ao perfil na

IGF2DMR2, apresentando igual perda de metilação parcial. Para avaliar a real

diminuição de expressão devida à perda de metilação, foi analisado o nível de RNA

6. Discussão

53

do IGF2 em fibroblastos de dois pacientes, confirmando-a. A expressão bialélica do

H19 foi também verificada em um indivíduo heterozigoto para um polimorfismo na

região, confirmando o relaxamento da regulação do imprinting em pacientes

parcialmente hipometilados.

Posteriormente Ergermman et al (2006) chegaram às mesmas conclusões

observando perda de metilação parcial na H19DMR em 16 de 51 (31%) pacientes e

perfil de metilação normal na porção centromérica de 11p15. Ainda em 2006, outro

trabalho confirmou a hipometilação parcial da ICR1, sendo detectada em cinco de 25

pacientes (20%) com características de SSR e não encontrando essa alteração em

grupos de pacientes com atraso de crescimento isolado e com outras dismorfias não

associadas à SSR (SCHÖNHERR et al., 2006). A partir de então, outros trabalhos

vêm confirmando o papel da H19DMR na etiologia da SSR e descrevendo a

alteração como presente em alta frequência (20 a 65%) (YAMAZAWA et al, 2008),

inclusive relatando uma ausência de metilação em alguns casos (BLIEK et al.,

2006).

A ausência de metilação da região não foi verificada em nossos estudos.

Esse dado foi sugerido pelo perfil normal de metilação H19DMR através do método

COBRA, um ensaio qualitativo e que mostrou a presença de alelos metilados nas

amostras, sendo posteriormente confirmada pela análise quantitativa, sendo a

metilação mais baixa observada de 9% (SR2). Porém, a ausência de metilação

apenas foi descrita por Bliek et al., em 2006, sendo que os resultados de

hipometilação parcial verificada no presente trabalho estão em acordo com a grande

maioria dos relatos (GICQUEL et al., 2005; NETCHINE et al., 2007; BRUCE et al.,

2009).

6. Discussão

54

A perda parcial de metilação foi a alteração molecular mais encontrada na

população estudada, em concordância com a literatura. A frequência de pacientes

com hipometilação descrita aqui (20%), foi igual aos dados de Schönherr (2006),

porém foram também já descritas frequências mais altas como 31, 40 e até 64%

(ERGGERMAN et al.,2006; NETCHINE et al., 2007; BARTHOLDI et al., 2008). As

diferenças nas taxas de metilação verificadas podem refletir a metodologia

empregada, uma vez que a maioria das vezes foi utilizado Southern blot e

recentemente têm sido descritas metodologias mais sensíveis como a MLPA e a

PCR em tempo real (ZESCHNIGK ET AL., 2008; EGGERMANN ET AL., 2008).

Entretanto, as diferenças de frequência não podem ser totalmente justificadas por

essa abordagem visto que a maior já descrita, 64%, foi verificada por Netchine et al.

(2008) utilizando Southern blot e nas nossas análises, com frequência mais baixa,

foi utilizada a DESM-RT, com PCR em tempo real.

A DESM-RT utilizada nesse trabalho foi descrita pela primeira vez por nosso

grupo (GOMES et al, 2007). Posteriormente, Bruce et al., 2008, utilizando a mesma

metodologia, confirmaram a aplicabilidade da técnica e descreveram 62% pacientes

com SSR como tendo hipometilação da H19DMR, frequência muito mais alta da que

por nós relatada (BRUCE et al, 2008; BRUCE et al, 2009).

Outra possibilidade para explicar as diferenças de frequência seria o critério

diagnóstico utilizado. Alguns trabalhos podem ter apenas incluído em seu grupo de

estudos os casos mais característicos, descritos como mais severos e mais

relacionados especificamente a alteração da H19DMR (BINDER et al., 2008;

BRUCE et al., 2009), já outros podem ter incluído pacientes com algumas poucas

características de SSR, esses citados como tendo baixa frequência de alteração de

6. Discussão

55

metilação (NETCHINE et al., 2008). Por isso, um consenso pré-definido para o

diagnóstico clínico da SSR seria útil para estudos futuros.

Com relação à KvDMR, seu envolvimento na SSR ainda é incerto, ao

contrário do que ocorre nos pacientes com a SBW, dos quais a grande maioria dos

casos (aproximadamente 50%) se deve à alteração nessa região (BLIEK et al.,

2001; DEBAUN et al., 2002; GOMES; RAMOS, 2003; GOMES; SANTOS; RAMOS,

2005; WEKSBERG et al., 2005). Na SSR, essa parece não ter tanta importância,

visto o número de trabalhos que não encontraram alterações (GICQUEL et al., 2005;

ERGERMMAN et al., 2006; NETCHINE et al., 2007).

O atual trabalho confirma essa verificação pela ausência de alteração no

grupo dos 15 pacientes com SSR analisados, entretanto, a análise dos casos

particulares demonstrou uma hipermetilação parcial leve, mas significativa, para os

três irmãos com fenótipo de SSR (irSR1, irSR2, irSR3) e o paciente filho de pais

consanguíneos (SR16).

O envolvimento da KvDMR na SSR foi sugerido pela verificação de pacientes

com duplicação materna da região 11p15. Em 2002, Fisher et al. descreveram essa

duplicação em três pacientes com atraso de crescimento, sendo também encontrada

a mesma duplicação em dois pacientes em um trabalho realizado por Eggermann et

al., em 2005, analisando 46 pacientes.

O nosso trabalho verificou que os pacientes com alteração na KvDMR

apresentaram perfil normal de metilação na H19DMR, sendo condizente com um

único relato descrito de uma duplicação restrita à ICR2 (SCHÖNHERR et al., 2007),

o que enfatiza o possível papel da região no desenvolvimento da SSR. Porém, não

pudemos concluir se a alteração encontrada é devida à duplicação de DNA ou a um

distúrbio especificamente de metilação.

6. Discussão

56

Pela porcentagem normal de metilação na H19DMR (entre 36 e 43%),

sugere-se que esses pacientes não possuem mDUP da região 11p15, entretanto,

Bullman et al.(2008), descreveram um paciente SSR com leve aumento de metilação

na KvDMR através de um ensaio quantitativo de MS-PCR. Esse, inicialmente,

possuía uma quantificação de metilação na H19DMR não descrita como alterada,

porém, estudos mais aprofundados, com MS-MLPA ( multiplex ligation dependent

probe analysis), demonstraram se tratar de mosaicismo de mDUP da região 11p15.

Portanto, não podemos excluir essa possibilidade em nosso trabalho.

Embora sem a verificação de que o aumento de metilação na KvDMR

observado nesse trabalho era devido ou não a uma duplicação como descrito por

Schönherr et al., 2007, a uma DUP como relatado por Bullman et al.(2008) ou a um

distúrbio específico de metilação, sugere-se o envolvimento dessa região na

etiologia da SSR.

Interessantemente, todos os pacientes descritos neste trabalho com alteração

na KvDMR possuem casos condizentes com herança recessiva, (SR16 – filho de

pais consanguíneos; irSR1, irSR2, irSR3 – irmãos, filhos de pais fenotipicamente

sem a síndrome). Para o paciente SR16, a alteração de metilação pode ser devida a

alguma mutação recessiva de genes regulatórios, o que teria levado à

hipermetilação apresentada pelo indivíduo. Já nos casos irSRs, existe a

possibilidade de estar ocorrendo uma alteração nos mecanismos de metilação de

um dos gametas, o que causaria o distúrbio nos três indivíduos, por exemplo, uma

falha de apagamento completo da marcação epigenética nos espermatozóides do

pai. Uma alteração cromossômica também não pode ser descartada. Contudo,

mesmo sem o entendimento dos mecanismos que permitiriam o processo, a

transmissão de defeitos epigenéticos também pode ser considerada, principalmente

6. Discussão

57

a partir do relato de Bartholdi et al. (2008) no qual foi descrito transmissão vertical de

pai para filha da hipometilação da H19DMR, demonstrando que há um risco de

recorrência de epimutações. Esses achados têm importantes implicações no

aconselhamento genético, uma vez que se acredita ser baixo o risco de recorrência

de alterações epigenéticas, subestimando os riscos. Entretanto, estudos posteriores

se fazem necessários para o melhor entendimento do processo.

Os níveis de hipermetilação descritos neste trabalho (de 65 a 74%) e também

o baixo mosaicismo descrito por Bartlholdi (18%), além do número de relatos que

não relacionaram a KvDMR com a SSR contrastam com as frequências de alteração

da mesma região na SBW. Existe a possibilidade de que essa alteração esteja

presente em maior frequência nos pacientes com SSR, entretanto, devido a razões

técnicas ou alterações em outras células, não leucócitos, esses números sejam

subestimados. Alternativamente, o aumento da metilação em altos níveis ou em

alguns tecidos específicos poderia ser incompatível com a vida.

A partir dos dados aqui encontrados foi verificada alteração em três regiões

distintas, possivelmente envolvidas na etiologia da SSR. Entretanto, a maioria dos

pacientes apresentou perfil normal de metilação, sugerindo que existam ainda outras

regiões a serem responsabilizadas por fenótipos característicos da SSR.

Enfatizando a heterogeneidade genética da SSR, também foi descrito um

indivíduo com síndrome de Turner e dismorfias condizentes com a SSR (ST1). Os

pacientes com síndrome de Turner apresentam, na maioria dos casos, apenas um

cromossomo X em algumas de suas células. Sabe-se que fenótipos decorrentes de

doenças com padrão de herança ligada ao X recessiva podem ser mais

frequentemente observados em meninas portadoras dessa síndrome por estarem os

genes em cópia única, como nos meninos. A partir dessa verificação, existe a

6. Discussão

58

possibilidade de que a paciente (ST1) possua alguma mutação ligada ao X

responsável pelo fenótipo de SSR.

A relação do cromossomo X com a SSR já foi sugerida em 1986, com a

descrição de uma família com baixa estatura, pigmentações anormais e dismorfias

faciais, sugerindo herança ligada ao X (PARTINGTON, 1986). Também já foi

descrito em 1972 um paciente com cariótipo 45,X/46,XY e achados clínicos de SSR

(TULINIUS, TRYGGVASON, HAUKSDOTTIR, 1972). Esses relatos, adicionalmente

à paciente descrita no presente trabalho, demonstram o envolvimento de outros

genes ainda não conhecidos na etiologia da SSR e sugerem que algum esteja

localizado no cromossomo X.

Além dos aspectos moleculares, a relação direta entre as alterações

epigenéticas e o fenótipo não é clara. Alguns trabalhos têm tentado encontrar essa

ligação.

Netchine et al. (2007) mostraram que peso e comprimento ao nascimento e

índice de massa corpórea pós-natal foram significativamente menores no grupo de

pacientes com hipometilação da H19. Esse trabalho também relatou o aumento de

assimetria corpórea e macrocefalia relativa nesse grupo de pacientes. Bartholdi et al.

(2008) pontuando pacientes com suspeita de SSR de 0 (mais brando) a 15 (mais

severo), de acordo com o número de características secundárias presentes,

descreveram que 41 de 42 pacientes com alteração de metilação na H19DMR

apresentavam pontuação maior ou igual a 8, relacionando a alteração com a

gravidade do fenótipo. A média de pontuação nos pacientes com alteração na

H19DMR, foi de 13. Já nos 10 pacientes com DUP7 a média foi de 8 pontos. Porém,

nos pacientes diagnosticados sem nenhuma das alterações moleculares analisadas,

6. Discussão

59

a média de pontuação foi 9, sendo também descrito um aumento de assimetria nos

pacientes com alteração da H19.

O número de pacientes com alterações moleculares em nosso trabalho foi

baixo para um estudo mais aprofundado relacionado ao fenótipo. Entretanto,

verificamos que os dois pacientes com alteração da H19DMR e fenótipo analisado

apresentaram quadro característico, ambos com macrocefalia e um deles com

assimetria corpórea. Todavia essas características também foram frequentemente

encontradas em outros pacientes com ausência da alteração molecular.

A partir do trabalho de Bartholdi et al. (2008), sugere-se que os portadores de

mDUP7 tenham fenótipo mais brando, entretanto, o paciente descrito nesse trabalho

com alteração no gene MEST apresentou várias características “menores” da SSR,

o que contrasta com essa idéia. Porém, esse dado é de apenas um paciente, o que

impede relacionarmos a alteração molecular com o fenótipo.

Independente da relação exata da alteração molecular e do fenótipo, é nítido

que na etiologia da SSR diferentes cromossomos podem levar a características

fenotípicas semelhantes. Estudos futuros deverão explorar como ocorre essa

interação funcional entre regiões distintas para se compreender melhor a regulação

do complexo mecanismo de crescimento humano.

O presente estudo confirma a possibilidade de utilização das quatro regiões

analisadas na prática clínica, auxiliando no melhor diagnóstico desses pacientes,

visto que aproximadamente 35% dos portadores de SSR apresentaram uma

alteração molecular detectada. Como as alterações podem se apresentar na forma

de mosaicos acredita-se que essa porcentagem pode ser aumentada com a

pesquisa adicional de outros tecidos, melhorando ainda mais a detecção dessas

anomalias.

6. Discussão

60

Benefícios diretos do diagnóstico mais rápido e com maior credibilidade

podem ser obtidos a partir de nosso trabalho, além da contribuição para estudos

posteriores que poderão auxiliar no aconselhamento genético das famílias com

portadores de SSR e desenvolvimento de novos tratamentos.

7777. . . . CONCLUSÃOCONCLUSÃOCONCLUSÃOCONCLUSÃO

7. Conclusão

62

• O padrão de metilação na região diferencialmente metilada do gene

GRB10 não estava envolvido na etiologia da SSR nos pacientes analisados;

• Foi verificada hipermetilação na amostra de um paciente (6,7%) na

região diferencialmente metilada do gene MEST;

• O padrão de metilação na H19DMR foi parcialmente hipometilado em

20% dos pacientes;

• Um perfil de hipermetilação na KvDMR1 foi detectado em alguns

pacientes analisados separadamente, mostrando o envolvimento dessa região na

etiologia da SSR;

• Nenhuma das alterações observadas foi detectada simultaneamente

em um mesmo paciente.

• Não foi possível fazer uma análise estatística correlacionando uma

determinada alteração molecular e o desenvolvimento de um quadro fenotípico mais

acentuando ou a alguma característica específica;

• A aplicação das metodologias utilizadas mostrou-se eficiente na

confirmação diagnóstica da SSR, uma vez que aproximadamente 35% dos

portadores de SSR apresentaram a alteração molecular detectável.

8. REFERÊNCIAS8. REFERÊNCIAS8. REFERÊNCIAS8. REFERÊNCIAS

8. Referências

64

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(Versão parcial, a original sem cortes será disponibilizada após publicação).

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