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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Atividade antiviral do Maraviroque e participação do receptor de quimiocina CCR5 na infecção de células mononucleares humanas pelo vírus da dengue 2”.

Letícia Batista Pinto

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.

RIBEIRÃO PRETO – SP 2013

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA “Atividade antiviral do Maraviroque e participação do receptor de quimiocina CCR5 na infecção

de células mononucleares humanas pelo vírus da dengue 2”.



Orientador: Benedito Antônio Lopes da Fonseca

RIBEIRÃO PRETO – SP

2013

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

FICHA CATALOGRÁFICA

Pinto, Letícia Batista Atividade antiviral do Maraviroque e participação do receptor de quimiocina

CCR5 na infecção de células mononucleares humanas pelo vírus da dengue 2. Ribeirão Preto, 2013. 51f. : il. ; 30 cm Monografia (Curso de Ciências Biológicas), Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

Orientador: Fonseca, Benedito Antônio Lopes da

1- Dengue 2- Maraviroque 3- CCR5

FOLHA DE AVALIAÇÃO


Atividade antiviral do Maraviroque e participação do receptor de quimiocina

CCR5 na infecção de células mononucleares humanas pelo vírus da dengue 2


Data da defesa: Resultado: ______________________________

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. __________________________________________________________________ Instituição:_________________________ Assinatura: _____________________________ Prof. Dr. __________________________________________________________________ Instituição:_________________________ Assinatura: _____________________________ Prof. Dr. __________________________________________________________________ Instituição:_________________________ Assinatura: _____________________________

Dedicatória

Aos meus pais, Débora e Gilson, pelo bom exemplo, incentivo e amor.

Obrigada por estarem comigo nessa jornada, sempre me apoiando.

Ao meu irmão Gabriel, que sempre tem uma palavra carinhosa a dizer.

Aos meus familiares e amigos, que sempre torceram por mim, e estiveram ao meu lado,

vocês com certeza sempre estarão em meu coração

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a Deus por sempre estar ao meu lado me dando serenidade e

me guiando.

Ao prof. Dr. Benedito Antonio Lopes da Fonseca, meu orientador, pela oportunidade,

pelo incentivo e acima de tudo pela confiança que creditou em mim durante esse trabalho.

Ao Dr. Flávio Lauretti, meu Co-orientador, por estar sempre comigo, procurando me

ensinar tudo que sabe, com boa vontade de disposição.

À todos os companheiros de laboratório, Luiza, Danillo, Mariana, João, Taline, Aline,

Fernanda, Ana Luisa, Flávia e Emiliana pela amizade, pelas rizadas e momentos de

descontração, e por sempre me ajudarem, contribuindo para o meu aprendizado

Aos membros da banca por dedicarem parte de seu tempo com a correção do meu

trabalho e pela a preocupação na minha aprendizagem.

À Dona Leila, por sempre manter o laboratório limpo e organizado.

Ao Prof. Dr. Guilherme de Araújo Lucas, por ter compartilhado sua experiência com

tanto afeto e carinho.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela

concessão da bolsa de Iniciação Científica.

Ao Departamento de Medicina de Ribeirão Preto pela concessão do espaço para a

realização dos experimentos.

À minha mãe, Débora e ao meu pai, Gilson por terem me apoiado desde o começo,

financeira e psicologicamente, por sempre me ensinarem que o caminho pode ser difícil, mas

que vale a pena percorrê-lo; ao meu irmão, Gabriel, por sempre estar ao meu lado me

apoiando.

A todos os meus familiares que sempre torceram por mim.

Às minhas amigas, Flávia, Vitória e Natália que estão ao meu lado todos os dias, e que

me ajudaram tanto neste percurso, obrigada pela compreensão amizade e carinho.

Às minhas queridas amigas Ana Beatriz, Daniela, Ingrid, Julia e Mayara, amigas de

longa data das quais jamais esquecerei.

Ao meu amigo Andrew, por ser um bom ouvinte. E especialmente ao Luis Eduardo,

por ter me ajudado nas análises estatísticas.

A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização desse trabalho.

Vamos, então levantar e agir com entusiasmo para qualquer resultado;

Ainda realizando, ainda perseguindo, aprender a labutar e a esperar.

Henry Wadsworth Longfellow

RESUMO A dengue é uma arbovirose humana, febril e aguda, causada pela infecção por um dos quatro

sorotipos de dengue vírus (DENV 1 a 4). É transmitida ao homem por mosquitos do gênero

Aedes, e é considerada a mais importante arbovirose humana, tanto em termos de morbidade

como mortalidade. Os vírus da dengue pertencem à família Flaviviridae, e são dotados de um

genoma de RNA de fita simples, revestido por um capsídeo proteico envolto num envelope

lipídico. Em trabalhos recentes tem sido observado que os vírus DENV diminuem a carga

viral do HIV em pacientes co-infectados, o que está associado a uma redução da replicação do

vírus HIV, levando a uma melhor sobrevivência de pacientes infectados por dengue. Como há

diminuição da viremia do HIV em pacientes co-infectados por dengue pode-se especular que

o CCR5 (receptor de quimiocina cisteína-cisteína tipo 5), que é importante para a infecção do

vírus HIV tenha participação na infecção por dengue, já que, interferências cruzadas sugerem

uma via comum de infecção. Apesar de vários receptores para os vírus DENV já terem sido

elucidados, ainda não foi verificado se o CCR5 é um deles. Desta forma objetivamos

determinar a possível atividade antiviral do inibidor de CCR5 maraviroque (MRv) contra o

vírus dengue 2 e, com isso, a participação do receptor de quimiocina CCR5 na infecção de

células de linhagem monocíticas, derivadas de linfoma histiocítico humano (U937). Para isto

a citotoxicidade do MrV foi determinada pelo ensaio da atividade da desidrogenase

mitocondrial com 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio (MTT, Acros

Arganics, USA), chegando-se a CC50 (concentração que reduz a viabilidade das células em

50%) de 0,7 mg/ml. Além disto, construímos uma curva de crescimento das células U937

infectadas pelos vírus DENV-2, em que o pico de liberação de vírus no sobrenadante é no

segundo dia pós-infecção. Por último, realizamos um ensaio de tempo de adição da droga,

testando as concentrações de 0,2, 0,4, 0,6 e 0,8 mg/ml da droga em diferentes tempos. Nossos

resultados indicam que houve uma redução estatisticamente significativa da quantidade de

cópias de RNA viral nas diferentes concentrações de MvR (0,2, 0,4, 0,6 e 0,8 mg/ml), porém

estes resultados devem ser confirmados por repetição desta metodologia e realização de um

ensaio de neutralização do receptor CCR5 com anticorpos anti-CCR5.

Palavras chave: Dengue; Maraviroque; CCR5

LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Casos anuais de dengue no Brasil. Modificado de Figueiredo, 2000 .................... 18

Figura 02: Medições longitudinais dos níveis de DNA de HIV-1 em um paciente com

dengue na fase aguda e durante 4 semanas. Modificado de Watt, 2003 .................................. 23

Figura 03: Produto de amplificação por RT-PCR dos estoques de DENV-2.......................... 34

Figura 04: Plaque realizado na titulação da curva de crescimento .......................................... 36

Figura 05: Resultado da titulação viral por plaque da curva de crescimento de células

U937 infectadas pelo vírus DENV 2 (com a retirada do inóculo) em PFU ............................. 36

Figura 06: Resultado da titulação viral por qRT-PCR da curva de crescimento de células

U937 infectadas pelo vírus DENV 2 (com a retirada do inóculo) em número de cópias por

ml .............................................................................................................................................. 37

Figura 07: Regressão linear entre os valores de Ct (Ciclo threshold) e as concentrações de

RNA transcrito em número de cópias/µl .................................................................................. 37

Figura 08: Viabilidade celular em função da concentração da droga maraviroque em

ensaio de citotoxicidade por MTT com três dias de incubação ................................................ 38

Figura 09: Viabilidade celular em função da concentração da droga maraviroque em

ensaio de citotoxicidade por MTT com sete dias de incubação ............................................... 39

Figura 10: Número de cópias de RNA viral de DENV 2 em relação ao tempo de adição da

droga MrV. As diferentes linhas representam as concentrações da droga utilizada no

experimento em mg/ml ............................................................................................................. 40

LISTA DE TABELAS

Tabela 01: Primers para Multiplex RT-PCR, segundo Harris et al., 1998 .............................. 28

Tabela 02: Características dos oligonucleotídeos utilizados na avaliação da carga viral........ 31

Tabela 03: Resultado da titulação viral por plaque da curva de crescimento de células

U937 infectadas (com permanência do inóculo) pelo vírus DENV 2 em PFU ........................ 35

LISTA DE ABREVIATURAS

BHK – Baby Hamster Kidney cells

C –Proteína estrutural do capsídeo

C6/36 – Células de mosquito Aedes albopictus

CCR5 – Receptor de quimiocina 5

CC50 – Concentração que reduz a viabilidade das células em 50%

CD14 – protein cluster of differentiation 14

CMC – carboximetilcelulose

CT – cycle threshold

CXCR4 – Receptor de alfa-quimiocinas 4

DC-SIGN – dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin

DMEM – Meio essencial de Eagle modificado por Dulbecco

DENV 1 – Vírus da dengue tipo 1




DO – Densidade optica

DSS – Síndrome do choque da dengue

E – Proteína estrutural do envelope

FHD – Febre hemorrágica da dengue

GBV-C – Vírus da hepatite G

HIV- Vírus da Imunodeficiência Humana

HSP– Heat shock proteins

IgG – Imunoglobulina G

M – Proteína estrutural da membrana

MOI – Multiplicidade de infecção

MrV – Maraviroque

MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio

NGC – Cepa de dengue 2 New Guinea C

NS1– Proteína não estrutural 1

NS2 – Proteína não estrutural 2




OPAS – Organização Pan-Americana da Saúde

PB – Pares de bases

PBS – Tampão fosfato salino

PCR – Reação em cadeia da polimerase

PBMC – Células mononucleares do sangue periférico

PEG – polietilenoglicol

pH – Potencial hidrogeniônico

prM – Proteína estrutural pré membrana

qRT-PCR – Reação em cadeia da polimerase em tempo real precedida por transcriptase

reversa

RNA – Ácido ribonucleico

RPMI – Meio Roswell Park Memorial Institute

SFB– Soro fetal bovino

TNE – Tris, NaCl, EDTA

TR1751 – Cepa viral de dengue 2 Trinidad R 1751

U937 – Linhagem celular monocítica humana estabelecida a partir de um linfoma histiocítico

difuso

Vero – Células de rim de macaco verde africano

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 15

1.1.Histórico da dengue ............................................................................................................ 16

1.2. A doença ............................................................................................................................ 18 1.3. Os vírus da dengue ........................................................................................................... 20

1.4. A relação DENV – HIV..................................................................................................... 21 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 24

3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 26

3.1. Células ............................................................................................................................... 27

3.2. Estoque viral ...................................................................................................................... 27 3.3. Extração de RNA ............................................................................................................... 28

3.4. RT- PCR ............................................................................................................................ 28

3.5. Titulação viral por ensaio de plaque .................................................................................. 29 3.6. Citotoxicidade .................................................................................................................... 29

3.7. Curva de crescimento do DENV 2 em Células U937 ....................................................... 30 3.8. Avaliação da carca viral da curva de crescimento ............................................................. 30 3.8.1. Obtenção da curva padrão .............................................................................................. 30

3.8.2. RT- PCR em tempo real ................................................................................................. 31

3.9. Imunoflorescência ............................................................................................................. 31

3.10. Atividade antiviral do maraviroque – Ensaio de tempo de adição da droga ................... 32

3.11. Análise estatística ............................................................................................................ 32

4. RESULTADOS ................................................................................................................... 33

4.1. Estoque viral ...................................................................................................................... 34

4.2.Titulação viral ..................................................................................................................... 34

4.2.1. Titulação do estoque viral............................................................................................... 34

4.2.2. Titulação da curva de crescimento ................................................................................. 35

4.3.Citotoxicidade ..................................................................................................................... 38

4.4.Ensaio do tempo de adição da droga .................................................................................. 39

5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 41

6. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 45

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 47

Introdução

Introdução

16

1. Introdução

1.1. Histórico da dengue

A dengue é uma arbovirose humana, febril e aguda, causada pela infecção por um dos

quatro sorotipos intimamente relacionados de dengue vírus (DENV 1-4), pertencentes à

família Flaviviridae. Todos os vírus dessa família são sorologicamente relacionados e na

maior parte dos casos, são transmitidos por vetores artrópodes hematófagos (mosquitos ou

carrapatos) para hospedeiros vertebrados (Jain, 2005). O principal vetor da dengue é o

mosquito da espécie Aedes aegypti, mas a doença pode ainda ser transmitida pela espécie A.

albopictus. A distribuição destes vetores é de importância global, já que grande parte da

população mundial vive em áreas de risco; estas áreas inicialmente eram restritas apenas a

regiões topicais, porém com o crescente aumento da dispersão geográfica do gênero Aedes sp.

e da globalização, os vetores dos vírus dengue tem sido encontrados em áreas nas quais não

eram encontrado anteriormente, como regiões subtropicais (Nishiura & Halstead, 2007;

Noisakran et al., 2010).

Especula-se que as pandemias de dengue se iniciaram nas regiões da Ásia e do

Pacífico durante e depois da segunda Guerra Mundial, principalmente devido a mudanças de

padrões ecológicos que favoreceram a expansão e o aumento da densidade do vetor da

doença, associadas a alterações em padrões sociais e demográficos, aumentando a

suscetibilidade dos indivíduos principalmente pelo grande deslocamento de pessoas (Guzman

& Kouri, 2003).

Provavelmente a primeira referência a uma epidemia no Brasil datou de 1846 e foi

registrada no Rio de Janeiro. A partir deste primeiro registro outros estados como Paraná e o

Rio Grande do Sul apontaram epidemias em 1917. Uma nova grande epidemia foi registrada

no Rio De Janeiro entre os anos de 1922 e 1923 (Figueiredo 2000).

Por iniciativa de Oswaldo Cruz, iniciou-se no ano de 1904 uma campanha de

erradicação do vetor Aedes aegypti, e a partir do ano de 1940, com o apoio técnico da

Fundação Rockefeller, esta erradicação foi efetiva, sendo confirmada no ano de 1955.

Associado à erradicação do vetor da dengue no Brasil, a Organização Pan-Americana da

Saúde (OPAS), também iniciou um programa de erradicação do Aedes aegypti, a fim de evitar

epidemias urbanas de febre amarela; este programa eliminou o vetor de 19 países (mais de

73% da área originalmente infestada). Estas campanhas foram provavelmente a razão para a

Introdução

17

ausência de surtos de dengue no Brasil entre 1923 e 1981. Porém a erradicação do vetor é de

difícil manutenção, e na década de 1970, houve uma nova entrada mosquito nas áreas

erradicadas e esta reinfestação continuou durante os anos 1980 e 1990 (Figueiredo 2000;

Guzman & Kouri, 2003).

A partir da década de 1990, os países das Américas Central e do Sul começaram a se

destacar no cenário de casos de dengue, relatando sucessivas epidemias, e passaram a registrar

muito mais da metade dos casos desta doença no mundo. Nesta mesma década, no ano de

1998, o Brasil registrou mais de 700 mil casos da doença (Barreto & Teixeira, 2008).

A reintrodução do Aedes aegypti no Brasil se deu pelo estado de Roraima e pela região

amazônica, no ano de 1981 e estima-se que 11 000 pessoas foram infectadas por DENV 1 e

DENV 4, os quais foram isolados a partir de pacientes e do próprio mosquito. O primeiro

surto no sudeste do Brasil foi causado pelo DENV 1 e ocorreu em 1986 assolando a região

metropolitana do Rio de Janeiro. Novas epidemias surgiram com a entrada dos sorotipos

DENV 2 em 1990-1991, no estado do Rio de Janeiro e do DENV 3 em 2001-2002 também

iniciada no Rio de Janeiro (Figura 1) (Figueiredo 2000; Câmara et al., 2007).

Desde a entrada de DENV 4 em 1981, não tinham sido registrados casos de infecção

por esta cepa viral, até 2008, quando foi confirmada a infecção de três pacientes na região

amazônica. Em 2010, novos casos foram reportados na cidade de Roraima, e em 2011,

associado à epidemia de DENV 1, o estado do Rio de Janeiro, especificamente a cidade de

Niterói, registrou 7 casos de pacientes infectados com DENV 4. Desde então, o número de

casos de dengue registrados na cidade do Rio de Janeiro e também no estado aumentou,

atingindo 10.042 casos confirmados em laboratório até agosto de 2012 (Campos et al, 2012).

Atualmente a dengue é foco da maior campanha de saúde pública do Brasil, que visa

controlar o vetor Aedes aegypti, o qual está adaptado a se reproduzir nos ambientes doméstico

e peridoméstico, em locais contendo água limpa parada. A dengue é registrada em todos os

estados do Brasil, e nosso pais é responsável por cerca de 60% dos registros de caso nas

Américas (Câmara et al, 2007).

A dengue é uma doença de difícil prevenção visto que não há vacinas eficazes ou

drogas terapêuticas disponíveis para prevenir ou tratar a infecção. Além disso, o gênero Aedes

sp. tem revelado grande capacidade de adaptação a diferentes situações ambientais, inclusive

seus ovos têm uma alta capacidade de resistir à dessecação. O fato de o vetor ser bem

adaptado ao ambiente urbano densamente povoado, em que a população gera habitats ideais

para a proliferação deste mosquito, torna a prevenção da dengue muito complicada. As

Introdução

18

medidas de controle atuais que têm como objetivo a eliminação do mosquito em todas as suas

fazes de vida, não têm sido muito eficazes, de modo que a disseminação do vírus e as

epidemias não têm sido evitadas (Barreto & Teixeira, 2008).

Figura 01: Casos anuais de dengue no Brasil. Modificado de Figueiredo, 2000.

1.2. A doença

Os quatro sorotipos dos vírus da dengue podem, cada um deles, apresentar quadros

clínicos que variam de assintomático, febre não específica, febre da dengue, febre

hemorrágica da dengue (FHD), e a síndrome do choque da dengue (DSS). As formas

sintomáticas podem apresentar febre com duração de 5 a 8 dias, mialgia, dor nas articulações,

erupções cutâneas, rash cutâneo com branqueamento sobre pressão (nas primeiras 24 a 48h de

febre), cefaleia, dor retro ocular e leucopenia. Pode-se ainda observar náuseas ou vômito,

trombocitopenia e hemorragia cutânea na forma mais grave da doença (Henchal & Putnak,

1990, Malavige et al., 2004).

Depois da picada de um mosquito infectado, o vírus entra na corrente sanguínea e

passa a se multiplicar em órgãos específicos, como o baço, o fígado e os tecidos linfáticos,

principalmente em células mononucleares. Este período é conhecido como período de

incubação, em que não há sintomas aparentes, durando de quatro a sete dias. Assim que o

vírus volta a circular na corrente sanguínea, depois do período de incubação, ocorrem os

primeiros sintomas (Jain, 2005).

Anos

Cas

os d

e de

ngue

Introdução

19

O quadro febril leve resulta geralmente de uma infecção primária, podendo também

ser decorrente de infecção secundária e é clinicamente indistinguível de outras infecções

virais. Os sintomas geralmente se iniciam com febre alta súbita, dor de cabeça,

particularmente na área retro-orbital, artralgia, mialgia, mal-estar abdominal, e por vezes, rash

cutâneo. A prova do laço tem sido positiva em muitos indivíduos com febre da dengue,

provavelmente devido à fragilidade capilar. Nos casos típicos, febre persiste por 4 a 6 dias e a

viremia geralmente coincide com este período. A recuperação da febre da dengue ocorre

usualmente sem complicações, mas pode ser prolongada, especialmente em adultos (Henchal

& Putnak, 1990, Malavige et al., 2004).

A FHD geralmente resulta de uma infecção secundária, porém pode ser causada por

uma infecção primária, especialmente em crianças. Os principais fatores de risco para FHD

incluem a estirpe do vírus (sendo algumas mais virulentas do que outras, apesar de todas

poderem causar complicações), a idade, os antecedentes genéticos do indivíduo e

principalmente infecções anteriores, que podem causar um fenômeno denominado

amplificação dependente de anticorpos, no qual os anticorpos produzidos pelo paciente

infectado contra o sorotipo da primeira infecção apresentam reação cruzada com os outros três

sorotipos aumentando a infecção viral em uma possível infecção posterior (Malavige et al.,

2004).

A organização Mundial de Saúde define a FHD segundo quatro critérios: febre alta e

súbita por 2-7 dias; manifestações hemorrágicas, com pelo menos o teste do laço positivo; a

contagem de plaquetas, menor do que 100x109/l de sangue; hemoconcentração (aumento do

volume globular 20%) ou outra evidência de vazamento de plasma, por exemplo, ascite,

derrame pleural, baixo nível de proteína de soro/albumina (Malavige et al., 2004).

A síndrome do choque da dengue está associada a infecções secundárias e leva a uma

alta mortalidade (cerca de 9,3% e 47% nos casos de choque profundo). Este quadro clínico é

caracterizado por grave extravasamento de plasma associado a manchas na pele, cianose

perioral e distúrbios circulatórios. Vômito persistente e dor abdominal aguda são sintomas que

indicam choque, e hipotensão súbita pode indicar o início do choque profundo. O choque

prolongado é muitas vezes acompanhado pela acidose metabólica, que pode levar a

hemorragia maciça (Malavige et al., 2004).

Introdução

20

1.3. Os vírus dengue

Os vírus da dengue pertencem à família Flaviviridae, com cerca de 70 vírus distintos,

todos dotados de um RNA de fita simples que é revestido por um capsídeo proteico de forma

icosaédrica. Este nucleocapsídeo está rodeado por uma membrana lipoprotéica derivada do

hospedeiro, na qual duas proteínas transmembranas virais são inseridas, a glicoproteína do

envelope E, na forma de hélices, e a proteína de membrana M (Smith et al., 2011; Ma et al,

2003 apud Zhang et al, 2003; Henchal & Putnak, 1990). A maioria dos marcadores

moleculares para patogenicidade foram localizados no gene da proteína E (Leitmeyer et al.,

1999).

O genoma viral contém uma única fase aberta de leitura, que codifica uma poliproteína

precursora e é flanqueado por duas regiões não traduzidas. A única poliproteína é traduzida e

clivada em três proteínas estruturais (E, prM / M, e C) e sete proteínas não estruturais (NS1,

NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) por proteases virais ou do hospedeiro (Noisakran et

al., 2010). A proteína C é essencial para assegurar a montagem do vírus e a encapsidação

específica do genoma viral (Ma et al., 2003 apud Ferlenghi et al, 2001).

Na infecção viral, o vírus da dengue se liga aos receptores de superfície celular, e é

internalizado por endocitose; uma vez dentro da vesícula endocítica ocorre uma diminuição

no pH e a proteína E sofre uma mudança conformacional de dímero para trímero, facilitando a

fusão da membrana do envelope viral como a membrana do endossoma, ocorrendo a liberação

do nucleocapsídeo no citoplasma, e a replicação imediata do genoma viral (McBride &

Bielefeldt-Ohmann, 2000). Assim que a poliproteína viral é clivada, ocorre a montagem do

vírus no retículo endoplasmático das células infectadas, seguida pela liberação de virions

infecciosos provenientes desta célula no espaço extracelular anexo (Jain, 2005, McBride &

Bielefeldt-Ohmann, 2000).

O primeiro passo na via de entrada do virion na célula é a ligação da glicoproteína E a um

receptor celular, e nos últimos anos, várias moléculas receptoras têm sido identificadas,

indicando que os vírus da dengue podem usar vários destes receptores na infecção celular

(Smith et al., 2011). Os vírus desenvolveram uma variedade de estratégias para reconhecer e

se ligar a células hospedeiras, podendo utilizar proteínas, lipídios, ou oligossacarídeos como

ligantes na célula hospedeira (Jain, 2005).

Os receptores celulares para os vírus da dengue ainda estão em estudo, porém o

envolvimento da proteína do envelope (proteína E) do vírus no processo é indiscutível. Com

Introdução

21

base nos dados disponíveis, parece evidente que a ligação e a internalização do vírus da

dengue é um processo de múltiplas etapas, envolvendo o reconhecimento e a ligação ordenada

e sequencial de várias moléculas da superfície da célula alvo por múltiplos epítopos da

proteína de envelope (McBride & Bielefeldt-Ohmann, 2000).

Um exemplo de receptor celular já elucidado é o sulfato de heparan, uma glicoproteína de

carga negativa, que é expressa em diversos tipos celulares e é utilizado como fator de baixa

afinidade de ligação por vários flavivírus. Porém vários outros receptores para DENV em

mamíferos já foram identificados tais como proteínas de choque térmico (HSP 90 e 70),

neolactotetraosylceramido, CD14 em células mielóides, DC-SIGN (em células dendríticas) o

receptor de manose, e o domínio C da família 5 das lectinas (Smith et al., 2011).

Todos os flavivírus têm grupos comuns de epítopos nas proteínas de envelope, o que

resulta em extensa reação cruzada em testes serológicos, esta interferência cruzada geralmente

sugere uma via comum de receptores celulares (Dasika & Letchworth, 2000).

1.4. A relação DENV – HIV

As infecções virais alteram a homeostase da célula hospedeira podendo interferir na

replicação de outros microrganismos em hospedeiros co-infectados. Em trabalhos recentes

(como de Watt et al., 2002 e Mendes et al., 2006) tem sido observado que os vírus DENV

diminuem a carga viral do HIV em pacientes co-infectados, isto está associado a uma redução

da replicação do vírus do HIV (Figura 2).

No estudo de caso relatado por Watt et al., 2003, o soro obtido de um paciente em

observação (na fase aguda da infecção por DENV- 1) foi capaz de inibir a replicação do vírus

do HIV em células linfocitárias, in vitro, porém nem o soro controle nem uma amostra de soro

da fase convalescente, obtidas a partir do mesmo paciente, inibiram a replicação do HIV,

indicando que a infecção por DENV induziu fatores solúveis que inibiram esta replicação

(McLinden et al., 2008; Watt et al., 2003).

Ensaios realizados com linhagens de célula T CD4+ que expressam a proteína DENV viral

NS5, mostram que a replicação do HIV diminuiu aproximadamente 90% em comparação com

células controles, isto se deve à diminuição do co-receptor do vírus HIV, o CXCR4. Este

achado de que a proteína viral NS5 inibe a replicação do HIV in vitro, pode, possivelmente

explicar a redução da infecciosidade de HIV em pacientes co-infectados por dengue (Xiang et

al., 2009; McLinden et al., 2008).

Introdução

22

Outro vírus da família Flaviviridae que possui interferência na viremia do HIV é o vírus

da hepatite G (GBV-C), vários estudos encontraram uma associação entre a co-infecção

GBV-C/HIV e uma sobrevivência prolongada em pessoas infectadas pelo HIV (Tillmann et

al., 2001). O vírus GBV-C se replica em linfócitos B e T incluindo células T CD4+, e a

replicação desse vírus em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) diminui a

expressão de co-receptores do HIV, como os receptores de quimiocinas CCR5 (receptor de

quimiocina cisteína-cisteína tipo 5) e CXCR4, na superfície dessas células, e também aumenta

a expressão de quimiocinas que funcionam como inibidores competitivos dos co-receptos de

HIV. A estrutura geral do genoma DENV é semelhante a do vírus da hepatite G (GBV-C),

com algumas exceções; nos vírus DENV a fosfoproteína NS5 não é processada em dois

polipeptídeos (NS5A e NS5B), como é no vírus da hepatite G. A porção amino-terminal das

proteínas NS5 dos DENV tem atividade metil-transferase, enquanto que o GBV-C usa um

local de entrada interno ao ribossomo para tradução direta da poliproteína viral. Apesar das

diferenças, as sequências de aminoácidos da NS5 dos DENV e da NS5A do GBV-C são 15%

idênticas (Xiang et al., 2009; McLinden et al., 2008).

O co-receptor de HIV CCR5 é um membro da família de receptores acoplados à proteína

G, sendo expresso, majoritariamente, na superfície de uma ampla variedade de células que

podem ser infectadas por HIV, como as células T e macrófagos que também são permissivas

aos vírus DENV (Miranda et al., 2010).

Uma das drogas utilizadas no tratamento do HIV é o maraviroque (MrV), que atua como

um antagonista de receptores CCR5, tendo como alvo os receptores de quimiocina CCR5,

presentes nos linfócitos T, as principais células do hospedeiro infectadas pelo HIV (Miranda

et al, 2010).

Apesar de vários receptores para os vírus DENV já terem sido elucidados, ainda não foi

verificado se o CCR5 é um deles. Como há diminuição da viremia do HIV em pacientes co-

infectados por dengue pode-se especular que o CCR5, que é importante para a infecção do

vírus HIV tenha participação na infecção por dengue, já que, interferências cruzadas sugerem

uma via comum de infecção (Dasika & Letchworth, 2000).

Introdução

23

Figura 02: Medições longitudinais da carga viral de HIV-1 em um paciente com dengue (●) na fase aguda

e durante 4 semanas. A carga de vírus mediana para seis indivíduos infectados com HIV-1 sem co-

infecção (□). Modificado de Watt, 2003.

Objetivos

Objetivos

25

2. Objetivos

O objetivo do presente trabalho é a determinação da possível atividade antiviral do MrV

sobre o vírus DENV 2 através da inibição do receptor CCR5 em cultura de células U937

(linhagem celular monocítica humana), visando avaliar conjuntamente a participação deste

receptor na infecção pelos DENV 2. Para isto foram realizados ensaios de redução da carga

viral por PCR quantitativa (qRT-PCR) em diferentes concentrações da droga, e em diferentes

tempos de adição desta, pretendendo mensurar a atividade do receptor CCR5 na infecção de

células U937 por DENV 2.

Material e métodos

Material e métodos

27

3. Material e métodos

3.1. Células

Inicialmente as células sugeridas para a realização dos experimentos envolvendo os

vírus da dengue e a droga maraviroque foram as células mononucleares humanas do sangue

periférico (PBMC), porém seriam necessários muitos mililitros de sangue para a obtenção de

células suficiente para realização dos experimentos. Além disso, para uma maior fidelidade

dos experimentos seria necessário que essas células fossem retiradas do sangue periférico de

uma mesma pessoa, para que não houvesse variação da quantidade e na natureza dos

receptores em estudo. Como alternativa para este problema passou-se a utilizar as células

U937 (não aderentes), derivadas de uma linhagem de monócitos humanos que também possui

o receptor CCR5 (Rossi et al., 2011).

As células U937 foram cultivadas a 37°C em garrafas de 75 ml com densidade entre

1x105 e 2x106 em meio RPMI (Meio Roswell Park Memorial Institute) suplementado com

10% de soro bovino fetal (SFB), antibióticos (penicilina 100 U/ml, estreptomicina 1 mg/ml) e

L-Glutamina.

No preparo dos estoques virais foram utilizadas células de mosquito Aedes albopictus

(C6/36), cultivadas em estufa a 28 °C em meio Leibowitz L-15, suplementado com 10% de

SFB), L-Glutamina e antibióticos.

Já para os ensaios de plaque foram empregadas células de rim de macaco verde

africano (Vero), cultivadas em estufa a 37 oC em meio essencial de Eagle modificado por

Dulbecco (DMEM), suplementadas com SFB a 10% (manutenção das células) ou 2% (durante

o cultivo do vírus), L-Glutamina e antibióticos.

3.2. Estoque viral

As cepas padrão utilizadas para a realização do primeiro estoque foram DENV-2

TR1751 (Trinidad R 1751) e New Guinea C. As culturas foram inoculadas, separadamente, a

uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10, adsorvidas por 90 minutos a 37°C, em estufa, e

cultivadas por 5 dias. O estoque viral foi centrifugado por 5 minutos a 5000 G e o

sobrenadante congelado a -20 °C com 20% do SFB.

Material e métodos

28

No preparo de um segundo estoque viral, devido à dificuldade da obtenção de títulos

adequados, utilizou-se a técnica de ultracentrifugação para concentração dos vírus. A cepa

TR1751 foi cultivada, como descrito anteriormente, entretanto num volume de cultura quatro

vezes maior, seguido de arraste do vírus com polietilenoglicol (PEG 8000). Oito por cento de

PEG foram dissolvidos no sobrenadante sob agitação overnight a 4°C que, em seguida foi

centrifugado a 14.000 G por 1 h a 4°C. O pellet formado foi ressuspendido em 2ml de

DMEM, aplicado sobre um cushion de sacarose a 30%, e ultracentrifugado a 110.000 G por

3h. Finalmente o pellet foi ressuspendido em tampão TNE com pH 8.

3.3. Extração de RNA

Para a extração de RNA foi utilizado o kit QIAamp Viral RNA mini kit (QIAGEN®

Califórnia, USA) através do qual extraiu-se o RNA de 140 µl do sobrenadante das culturas,

conforme instruções do fabricante, sendo posteriormente eluídos em um volume final de 50 µl

e estocado em freezer -70 °C até o momento do uso.

3.4. RT-PCR

Utilizou-se o RNA extraído dos estoques virais para realização da RT-PCR e

determinação do sorotipo segundo Lanciotti, et al, 1992, na qual utilizou-se o QIAGEN One

step RT-PCR kit (QIAGEN®, Alemanha) e primers específicos, previamente descritos por

Harris et al em 1998 (Tabela 1). As etapas de ciclagem foram 50 °C por 30 minutos para

realização da transcrição reversa, 95 °C por 15 minutos para inativação da transcriptase

reversa, seguidos de 40 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 55 °C por 1 minuto e 72 °C por 1

minuto. O resultado das amplificações foi detectado por eletroforese em gel de agarose 2%,

corado com GelRed (Biotium, USA) e visualizado sob ação de luz ultravioleta.

Tabela 01: Primers para Multiplex RT-PCR, segundo Harris et al., 1998.

Primer Seqüência D1 TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA

ACC G TS1 CGT CTC AGT GAT CCG GGG G TS2 CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG TS3 TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C

DEN4 TGT TGT CTT AAA CAA GAG AGG TC

Material e métodos

29

3.5. Titulação viral por ensaio de plaque

Para o preparo das placas utilizadas nesta titulação 1x106 células Vero foram semeadas

em placa de 24 poços e cultivadas por aproximadamente 24 h a 37 °C e 5% de CO2. Em

seguida foram preparadas diluições seriadas do DENV 2 em meio DMEM sem SFB. O meio

de cultivo foi removido e 100 µl de cada diluição do vírus foram inoculados em triplicata. O

inóculo foi adsorvido por 1 h agitando-se a placa a cada 15 min, e em seguida retirado, e a

cada poço foi adicionado 1 ml de meio semisólido DMEM com 2% de carboximetilcelulose

(CMC) e 2% de SFB. Posteriormente a placa foi incubada por 7 dias e finalmente as células

foram fixadas por 1 h com solução de formaldeído tamponado a 10% e coradas com cristal

violeta 2% para contagem dos plaques.

3.6. Citotoxicidade

A citotoxicidade da droga maraviroque foi testada pelo ensaio da atividade da

desidrogenase mitocondrial com 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo de tetrazólio

(MTT, Acros Arganics, USA). A droga foi preparada a partir de dois comprimidos triturados

de Celsentri®, com 150 mg de MrV cada, e em seguida, o pó obtido foi misturado à 10 ml de

meio RPMI não suplementado com SFB até que fosse dissolvido ao máximo, depois, esta

solução foi agitada por 10 min no vortex e posteriormente centrifugada por 10 min à 2500 G.

Por fim, a solução foi filtrada de maneira asséptica com filtro de 0,2 µm, aliquotada e

congelada a -20 °C. No final obtivemos uma solução de MrV à 30mg/ml.

Para a determinação da citotoxicidade foram preparadas placas de 96 poços com

0,3x106 células U937 em 50 µl por poço com meio RPMI suplementado com 10 % SFB.

Essas placas foram incubadas por 24 h a 37 °C e em seguida foram acrescentadas as

concentrações teste de MrV.

Nos primeiros ensaios foram avaliadas as concentrações de 0,11 mg/ml a 7,5 mg/ml,

com três dias de contato das células com a droga. Para a obtenção dessas concentrações foram

realizadas diluições 1:2 a partir da solução de estoque suplementada com 2 % de SFB. Em

ensaios posteriores foram avaliadas as concentrações de 0,05 mg/ml a 7 mg/ml, aumentando o

tempo de contato entre as células e a droga para sete dias. Cada concentração e o controle

eram dispostos na placa em replicata. Após os três ou sete dias de incubação foram

adicionados 50 µl de solução de PBS com 2 mg/ml de sal de MTT e em seguida as placas

Material e métodos

30

foram novamente incubadas a 37 °C por quatro horas. Depois foram adicionados 100 µl de

isopropanol acidificado com HCl (0,08 mol/l) e as placas foram agitadas por 30 min para

dissolução dos cristais de Formazan. Por fim foi realizada a leitura das placas em

espectrofotômetro a 540 nm e com filtro de referência de 620 nm. A absorbância obtida é

diretamente proporcional à viabilidade celular que é determinada pela seguinte fórmula: % 100

3.7. Curva de crescimento do DENV-2 TR1751 em células U937

Para a realização deste experimento foram preparadas placas de 96 poços com 0,3x106

células U937 por poço em meio RPMI suplementado com 10% de SFB, incubadas por 24 h

em estufa a 37 °C. Após o período de incubação as células de cada poço foram recolhidas e

centrifugadas a 2000 G por 5 min. Em seguida, as células foram resuspensas em meio RPMI

com 2% de SFB.

No primeiro ensaio deste experimento as células foram inoculadas com o vírus DENV

2 TR1751 em MOI de 0,1 e 1,0. Para cada MOI de cada dia foi realizada uma diluição seriada

até a concentração de 10-5. As replicatas foram colhidas a cada 24 h a partir do primeiro dia de

infecção até o sétimo dia e depois congeladas a -20 °C. Porém, neste primeiro experimento, o

inóculo foi deixado em contato com as células de modo que não obtivemos resultados claros,

por isto, no segundo ensaio as células foram inoculadas com MOI de 1,0 e o inóculo

permaneceu em contato com as células por apenas 1 hora. Após este tempo as células foram

coletadas, centrifugadas à 2500 G por 5 min (retirando-se o inóculo), ressuspensas em meio

RPMI com 2% de SFB e mantidas em estufa a 37°C por 7 dias. As replicatas também foram

coletadas a cada 24 h a partir do primeiro dia de infecção até o sétimo dia e depois congeladas

a -20 °C. Em seguida foi realizado um ensaio de plaque e uma qRT-PCR.

3.8. Avaliação da carga viral da curva de crescimento

3.8.1. Obtenção da curva padrão

A metodologia referente à padronização da técnica de RT-PCR em tempo real foi

desenvolvida por pesquisadores do laboratório segundo Castro, 2013.

Material e métodos

31

3.8.2. RT- PCR em tempo real

Os oligonucleotídeos e sondas utilizados na RT-PCR em tempo real estão descritos na

Tabela 2.

Tabela 02: Características dos oligonucleotídeos utilizados na avaliação da carga viral.

Oligonucleotídeos Sequência Sonda Sorotipo Tamanho (pb) FD2 5'CTAAATGAAGAGCAGGACAAAAGGT3'

TGCAAACACTCCATGGTA DENV - 2 72 RD2 5'ATCCATTTCCCCATCCTCTGT3'

As reações de amplificação foram realizadas utilizando-se 3µL de RNA, 2µL do

reagente QuantiTect Virus Master Mix (QIAGEN®, Germantown, EUA), 0,1µl do reagente

QuantiTect Virus RT Mix, 0,38µL dos oligonucleotídeos (10 pmol) e 0,38 µL da sonda (10

pmol), e água para completar o volume final de 10 µL. As condições de amplificação foram:

50°C por 30 min e 95°C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e

60°C por 60 segundos. A reação foi executada no aparelho 7500 FastReal-Time PCR System

(Applied Biosystems, Foster City, EUA).

Os resultados foram analisados com o software 7500 Software v. 2.0.1 (Applied

Biosystems, City, EUA), tendo como base o valor de CT (cycle threshold), que corresponde

ao ciclo no qual é atingido o limiar da detecção da fluorescência emitida pelo fluoróforo

liberado da sonda durante a reação de PCR em tempo real. A curva padrão possibilitou, por

extrapolação, o cálculo do número de cópias em 3µL de RNA. Para obter o número de

cópias/mL de cultura o valor obtido foi multiplicado por 142,8571429 (conversão para 60µL

de RNA eluído, extraído de 140µL de cultura celular).

3.9. Imunoflorescência

Em todos os experimentos envolvendo as curvas de crescimento houve

acompanhamento da infecção viral por imunoflorescência indireta na qual foram coletados

100 µl da suspensão celular de cada poço da placa. Em seguida as células foram lavadas duas

vezes pela adição de 1ml de PBS 1x e posteriormente centrifugadas a 2500 G por 5 min. As

células foram ressuspensas, e 15 µl destas células foram colocados em duplicata em uma

lâmina de imunoflorescência, que permaneceu sobre a bancada até que estivesse seca, e logo

depois foi imersa em acetona gelada (-20°C) por 30 min, sendo novamente deixada sobre a

bancada até secar. Logo depois, 15 µl de anticorpos monoclonais (Millipore MAB 8705)

Material e métodos

32

diluídos 1:400 foram adicionados sobre as células e a lâmina foi incubada em câmara úmida à

37°C por 30 min, depois a lâmina foi lavada por imersão em PBS 1x por 5 min.

Posteriormente 15 µl de anticorpos anti-mouse IgG (Sigma F0257) também diluídos 1:400

foram adicionados a cada poço e a lâmina foi novamente incubada em câmara úmida à 37°C

por 30 min, depois lavada por imersão em PBS 1x por 5 min. Por último os poços foram

cobertos com glicerol 10% tamponado e cobertos com lamínula para visualização em

microscópio de florescência.

3.10. Atividade antiviral do Maraviroque – Ensaio de tempo de adição da droga

Na realização dos experimentos envolvendo a atividade antiviral do Maraviroque

foram preparadas placas de 96 poços com 0,3x106 células U937 por poço. A placa foi

incubada em estufa úmida a 37°C por 24h e depois do período de incubação, foi adicionada a

droga MrV nas concentrações de 0,2, 0,4, 0,6 e 0,8 mg/ml, 1h antes da adição do vírus. O

vírus, com MOI de 1,0, foi adicionado na hora zero em todos os poços da placa, inclusive no

controle viral, que não recebeu a droga. Seguidamente a droga (também nas concentrações de

0,4, 0,6 e 0,8 mg/ml) foi adicionada nos tempos 0, 6, 12, 24, 36 e 72 horas após a infecção

viral. As triplicatas de cada concentração de cada hora de adição da droga foram juntadas em

eppendorfs após 96 horas de infecção, e em seguida extraiu-se RNA das amostras de cada

eppendorf, sendo realizada posteriormente a quantificação do RNA viral pelo método de qRT-

PCR.

3.11. Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o auxílio do software GraphPad Prism 5.0

(GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Foi realizado o teste ANOVA dois critérios, sem

repetições, seguido pelo teste de Bonferroni para analisar as diferenças das diferentes

concentrações da droga em relação ao controle nos diferentes tempos de adição da droga, as

diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P < 0,05.

Resultados

Resultados

34

4. Resultados

4.1. Estoque viral

Os estoques virais foram preparados conforme descrito acima, e foi observado que as

células começaram a desprender-se a partir do quarto dia, e entre o quinto e o sexto dia, o

conteúdo das garrafas foi coletado e congelado. Após RT-PCR, foi constatado que as duas

cepas NGC e TR1751 realmente eram DENV-2 e eram puras (Figura 03).

Figura 03: Produto de amplificação por RT-PCR dos estoques de DENV-2 segundo Lanciotti et al, 1992

com 119pb, característico dos DENVs 2. Coluna (1), marcador de 50pb invitrogen, (2) branco, (3) DV1

Hawaii, (4) DV 2 NGC, (5) DV2 TR1751, (6), (7), (8) e (9), RNAs controles de DV1, DV2, DV3 e DV4

respectivamente.

4.2. Titulação viral

4.2.1. Titulação do estoque viral

Inicialmente a titulação viral foi o maior obstáculo encontrado em virtude da

dificuldade da obtenção de plaques nítidos e de um título adequado no estoque original de

DENV-2 New Guinea C. Embora a proposta inicial fosse de titular o vírus por contagem de

foco por imunoperoxidase, uma vez que a cepa padrão dos estoques do laboratório não estava

formando plaques, continuamos insistindo no plaque enquanto padronizávamos o ensaio de

800pb

350pb

119pb

Resultados

35

foco. Iniciamos a titulação por plaque de maneira convencional utilizando-se a linhagem Vero

na preparação das placas, porém o título obtido era muito baixo (104 PFU/ml) e a nitidez das

placas muito ruim, então outras linhagens de culturas celulares, como BHK (Baby Hamster

Kidney) e Vero E6 foram utilizadas no preparo das placas. Outras variações como

substituição do meio semissólido CMC por meio sólido com agarose a 1,5%, variação do

tempo de cultivo das placas, e contagem das células infectadas utilizando-se

imunoperoxidase, também foram realizadas. Com essas mudanças, a nitidez da placa tornou-

se melhor, porém, não houve sucesso em aumentar o título viral. Obteve-se então outra cepa

de vírus DENV-2, a TR1751, na qual a titulação passou a funcionar em células Vero e células

Vero E6, com meio semissólido CMC, obtendo-se o título de 3,75 x 108 PFU em célula

C6/36. Em posteriores tentativas, o plaque passou a funcionar também na cepa New Guinea

C, utilizada no início dos experimentos de ensaio de plaque.

Na preparação do segundo estoque viral da cepa TR1751 a partir de ensaios de plaque

(com células Vero e meio semissólido CMC) obteve-se o título de 2,0 x 109 PFU.

4.2.1. Titulação da curva de crescimento

A titulação viral dos dias da curva de crescimento foi realizada por ensaios de plaque

(Figura 4) e por qRT-PCR obtendo-se os seguintes resultados:

Tabela 03: Resultado da titulação viral por plaque da curva de crescimento de células U937 infectadas

(com permanência do inóculo) pelo vírus DENV 2 em PFU/ml.

MOI 0,1 MOI 1,0

Dia 1 2x102 4x102

Dia 2 1,9x103 1,4x103

Dia 3 2,2x103 1,25x103

Resultados

36

Figura 04: Plaque realizado na titulação da curva de crescimento. É possível observar placas de lise viral

nos poços que correspondem ao segundo e ao terceiro dia de infecção (1 e 2, controle celular, 3 e 4, 2° dia

de infecção com 1,4x103 PFU, 5 e 6 3° dia com 1,25x103).

Figura 05: Resultado da titulação viral por plaque da curva de crescimento de células U937 infectadas

pelo vírus DENV 2 (com a retirada do inóculo) em PFU.

0,00E+00

2,00E+02

4,00E+02

6,00E+02

8,00E+02

1,00E+03

1,20E+03

1,40E+03

1 2 3

Uni

dade

s for

mad

oras

de

Resultados

37

Figura 06: Resultado da titulação viral por qRT-PCR da curva de crescimento de células U937 infectadas

pelo vírus DENV 2 (com a retirada do inóculo) em número de cópias por ml.

Figura 07: Regressão linear entre os valores de Ct (Ciclo threshold) e as concentrações de RNA transcrito

em número de cópias/µl.

1,00E+07

5,10E+08

1,01E+09

1,51E+09

2,01E+09

2,51E+09

3,01E+09

1 2 3 4 5Dias pós

Núm

ero

de có

pias

/ml

Resultados

38

4.3. Citotoxicidade

Como a proposta inicial de titulação era por contagem de foco por imunoperoxidase,

que era realizada em três dias pós-infecção, determinamos a citotoxicidade do MrV levando-

se em conta os três dias de experimento, e a partir das DOs obtidas nas células tratadas com

diferentes concentrações de MrV foi determinada a viabilidade em função da concentração

que provocava morte em 50% das células (CC50) em função do tempo (Figura 08). A CC50 foi

determinada por análise do gráfico, chegando-se ao valor de 1,05 mg/ml.

Porém depois de realizados os ensaios de MTT para determinar as concentrações de

trabalho de MrV, levando-se em conta o sucesso com os plaques nas células Vero, decidiu-se

modificar o tempo de incubação do experimento de citotoxicidade para 7 dias, uma vez que a

técnica de titulação foi modificada para ensaio de plaque (que leva 7 dias) e que é um método

ouro para titulação viral, além de ser importante para o estudo de receptores virais. Deste

modo, foram realizados outros experimento de citotoxicidade com sete dias de incubação da

droga e a CC50 também foi determinada por análise do gráfico, Figura 09, chegando-se o

resultado de 0,7mg/ml.

Figura 08: Viabilidade celular em função da concentração da droga maraviroque em ensaio de

citotoxicidade por MTT com três dias de incubação. A CC50 de 1,05 mg/ml foi determinada por análise do

gráfico.

0

20

40

60

80

100

120

0,05 0,11 0,23 0,46 0,93 1,87 3,75mg/ml

(%)

Viab

ilida

de

Resultados

39

Figura 09: Viabilidade celular em função da concentração da droga maraviroque em ensaio de

citotoxicidade por MTT com sete dias de incubação. A CC50 de 0,7 mg/ml foi determinada por análise do

gráfico.

4.4. Ensaio de tempo de adição da droga

Os resultados obtidos a partir da realização do qRT-PCR com as amostras de RNA

viral extraídas das replicatas das diferentes concentrações da droga MrV em diferentes tempos

de adição podem ser observados na figura 10.

A análise estatística destes dados informa que há uma redução estatisticamente

significativa da quantidade de cópias de RNA viral em relação a quantidade de cópias do

controle (5,0x108), porém o tempo de adição da droga não é estatisticamente significativo na

redução do números de cópias do RNA viral. Este resultado foi processado por um teste

ANOVA dois fatores sem repetição de modo que o software assumiu que as concentrações

possuem o mesmo efeito em todos os níveis de tempo.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

(%) V

iabi

lidad

e

mg/ml

Resultados

40

Figura 10: Número de cópias de RNA viral de DENV 2 em relação ao tempo de adição da droga MrV. As

diferentes linhas representam as concentrações da droga utilizada no experimento em mg/ml.

Discussão

Discussão

42

5. Discussão

Existem dois casos descritos na literatura de co-infecção do Vírus HIV-1 e do vírus da

dengue na forma hemorrágica (FHS) e ambos apresentam diminuição da carga viral do HIV

na fase aguda da doença febril (Mendes et al., 2006; Watt et al., 2003). Porém se a dengue

tem um efeito inibitório sobre a carga viral de HIV, a natureza deste efeito permanece

desconhecida. Utilizando a técnica de qRT-PCR para observar a redução da infecção viral

pelo vírus DENV-2 possivelmente induzida pela droga MrV objetivamos elucidar a

participação do receptor de quimiocina CCR5 (atuante na infecção de células mononucleares

pelo vírus HIV), na infecção viral do vírus DENV. Para experimentos realizados com drogas, a determinação da citotoxicidade é um

procedimento importante, sendo fundamental que elas atuem sobre os vírus, porém que sejam

inócuas ou pouco tóxicas às células. A citotoxicidade de uma droga pode influenciar nos

resultados da atividade antiviral à medida que esta pode ter uma toxicidade alta podendo

matar as células, diminuindo a infecção pelo vírus e consequentemente o título viral, dando a

impressão de que a droga foi efetiva contra a infecção, desta maneira, é recomendável utilizar

concentrações menores do que as que afetam 50% das células em estudo; deste modo as

concentrações utilizadas nos ensaios de tempo de adição da droga foram menores que 1,05

mg/ml, que é a CC50 para as células U937 em contato com a droga por três dias.

Na realização da curva de crescimento, encontramos resultados compatíveis com os de

O´Sullivan & Killen, 1994, em que células U937 foram infectadas com DENV 1 e MOI 1, e o

pico liberação de vírus no sobrenadante é no segundo dia, com a diferença que nossa cepa

viral é a DENV 2. Porém nos primeiros experimentos que realizamos o inóculo aplicado

permaneceu em contato com as células, de modo que não pudemos interpretar se o título viral

encontrado era decorrente do inóculo ou de vírus produzidos pelas células U937. Só foi

possível a titulação desta primeira curva de crescimento, por plaque, dos dias 1, 2 e 3, pois os

outros dias coletados da curva estavam contaminados.

Para podermos determinar se os resultados obtidos foram provenientes do inóculo ou dos

vírus produzidos pelas células U937 repetimos os experimentos de curva de crescimento

removendo o inóculo, de modo que ele não fosse detectado na titulação viral. A partir da

observação de que as titulações realizadas pelo método de plaque com MOI de 1,0 e 0,1 no

primeiro experimento da curva de crescimento possuíam números muito similares (mesmo

Discussão

43

log), decidiu-se realizar nesta segunda curva de crescimento, somente a infecção com o MOI

de 1,0.

A titulação da curva de crescimento foi realizada pela metodologia de ensaio de plaque e

por qRT-PCR, e de fato, como observado na figura 5 e 6, o pico de produção viral foi no

segundo dia, com 1,25x103 na titulação por plaque e com 2,68x109 cópias/ml na titulação por

qRT-PCR.

Ainda na titulação viral da curva de crescimento, percebemos que ao realizar ensaios de

plaque, obtivemos um número de plaques muito baixo (Figura 5 e Tabela 1), de modo que não

poderíamos realizar experimentos propostos de redução de plaque para verificarmos o efeito

da droga na infecção. A obtenção de poucos plaques na titulação viral pode ser explicada pelo

fato de as células U937 serem pouco permissivas ao vírus DENV 2 <0,2% (Diamond et al,

2000), sendo possível que o plaque não fosse capaz de detectar uma redução em uma infecção

tão diminuta, por isso determinamos a atividade do MrV na infecção da U937 por qRT-PCR,

uma técnica cerca de 10 vezes mais sensível que o ensaio de plaque.

Podemos observar nas figuras 5 e 6, referentes à curva de crescimento, que o título viral

não permanece constante depois do pico de liberação viral no segundo dia, isto se deve ao fato

de as células U937 serem monócitos, que são células fagocíticas ativas, capazes de eliminar

microrganismos, ou seja, são capazes de responderem à infecção viral (Reeves et al., 2002),

de modo que com o passar do tempo do início da infecção, há mais degradação das partículas

virais pelas células do que produção delas, acarretando a diminuição do título viral.

Os experimentos do tempo de adição da droga foram realizados com uma metodologia

similar a do trabalho de Zhen et al., 2006, em que as diferentes concentrações do composto a

ser testado são adicionadas em diferentes tempos e a redução da infecciosidade viral é

comparada com um controle viral. Obtivemos resultados que indicam que as diferentes

concentrações possuem sim uma atividade antiviral dose dependente na redução da infecção

por DENV 2, porém em nossos experimentos juntamos as replicatas biológicas, de modo que

só tínhamos uma amostra para realizar a extração do RNA viral e quantificar a redução da

infecciosidade, o que causou dificuldade na análise estatística já que não tínhamos replicatas

de cada concentração em cada tempo. Assim, torna-se necessária a confirmação dos dados

obtidos por meio da repetição da metodologia do tempo de adição da droga, e pela realização

de um ensaio de neutralização do receptor CCR5 com anticorpos anti-CCR5.

No trabalho de Diamond et al., 2000, é possível observar que as células U937 foram

diferenciadas na presença de dimetil sulfóxido (DMSO, 1,25% [vol/vol]) ou acetato de forbol-

Discussão

44

miristato (PMA, 16 nM) em linhagens de macrófagos ou granulócitos e se tornaram mais

permissivas à infecção por DENV 2, passando de uma infecção de menos de 0,2% nas

células não diferenciadas, para infecções com 3,7 e 2,1% de células infectadas,

respectivamente. Observando-se o fato de que as células diferenciadas são mais permissivas à

dengue, pode-se especular que é possível que estas células estejam expressando mais

receptores, como o CCR5, aumentando a chance de infecção.

Inclusive, no trabalho de Rossi et al., 2011, utilizando o MrV, antagonista de CCR5, como

causa de uma possível diminuição de quimiotaxia de células monocíticas e células

diferenciadas em macrófagos, foi obtida uma redução da quimiotaxia estatisticamente

significativa em macrófagos porém essa atividade não foi estatisticamente significativa em

monócitos, reforçando a nossa sugestão de que estas células apresentam maior quantidade de

receptores CCR5 do que células monocíticas.

Segundo Lee et al., 2005, a exclusão da superinfecção (ou interferência homóloga) pode

ser definida como a capacidade de uma infecção viral estabelecida em interferir em uma

infecção por um vírus homólogo, isto é vantajoso pois em uma infecção de uma população

celular, os vírus recém produzidos são favorecidos pela entrada em uma célula ainda não

infectada, em relação a uma célula já infectada. Desta maneira, é possível que a diminuição da

infecção viral quantificada seja causada pelos próprios vírus, os quais diminuem os receptores

celulares para evitar uma superinfecção.

Conclusão

Conclusão

46

6. Conclusão

A partir dos resultados obtidos podemos especular que a droga MrV possui sim uma ação

antiviral contra o vírus DENV-2, de modo que é muito provável que o receptor CCR5 tenha

uma participação na infecção por dengue de células mononucleares humanas, porém estes

resultados devem ser confirmados com a repetição da metodologia do ensaio de adição da

droga apresentada neste trabalho e comprovação por um teste de redução da infecciosidade

das células U937 após a neutralização do receptor com anticorpos anti-CCR5.

Referências Bibliográficas


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