UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica

COMPARAÇÃO DA ACURÁCIA DA CITOLOGIA CONVENCIONAL E CITOLOGIA

EM BASE LÍQUIDA PARA DIAGNÓSTICO MORFOLÓGICO E

MICROBIOLÓGICO

Beatriz Silva Ibrahim

Trabalho de Conclusão do Curso de

Farmácia-Bioquímica da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da

Universidade de São Paulo.

Orientador(a): Prof. Dra. Silvya Stucchi

Maria-Engler

Co-orientador(a): Prof. Dra. Michelle

Garcia Discacciati de Carvalho

São Paulo

2017

AGRADECIMENTOS

À Deus, pela vida e pelo sustento diário.

À minha mãe, pelo suporte em todos os momentos, e ao meu pai, presente

mesmo à distância. Aos demais familiares, pelas orações e carinho.

Ao Calvin, pelo amor, principalmente nas horas mais difíceis.

A todos os meus amigos de curso e de intercâmbio, que trilharam comigo

esse complexo caminho da graduação, por toda vida compartilhada dentro e fora

da Universidade. Aos demais amigos, sem os quais a vida não seria completa.

À Dra. Silvya Stucchi, à Dra. Adriana Lino, à Dra. Leanne Stokes, à Dra.

Dominique Fischer e a todos os demais docentes com quem tive contato, por

compartilharem essa preciosidade que é o conhecimento, em aulas, em

orientações, em laboratórios, em monitorias, no Brasil e na Inglaterra. À Dra

Michelle Garcia, sem a qual este Trabalho de Conclusão de Curso não seria

possível, pela orientação e por toda a ajuda.

A todos os funcionários da Universidades de São Paulo e da University of

East Anglia, por possibilitarem a conclusão dessa jornada.

“We ourselves feel that what we are doing is just a drop in

the ocean. But the ocean would be less because of that missing

drop.” Mother Teresa

1

SUMÁRIO

Pág.

Lista de Abreviações 2

Lista de Figuras e Tabelas 4

RESUMO 5

1. INTRODUÇÃO 7

2. OBJETIVOS 11

3. MATERIAIS E MÉTODOS 11

4. RESULTADOS 15

5. DISCUSSÃO 23

6. CONCLUSÃO 26

7. BIBLIOGRAFIA 27

8. ANEXOS 30

2

LISTA DE ABREVIAÇÕES

Abreviação Definição

AGC Células Glandulares Atípicas (Atypical Glandular Cells)

ASC-US Células Escamosas Atípicas de Significado Indeterminado

(Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance)

ASC-H Células Escamosas Atípicas de Significado Indeterminado em que

não se pode excluir HSIL (Atypical Squamous Cells, Cannot Rule

out HSIL)

CBL Citologia em Base Líquida

CC Citologia Convencional

CCE Carcinoma de Células Escamosas

CO Citologia Oncótica

HPV Papilomavirus Humano

HSIL Lesão escamosa intraepitelial de alto grau (High-grade Squamous

Intraepitelial Lesion)

JEC Junção Escamo-Colunar

LLETZ Excisão da zona de transformação por alça diatérmica (Large

Loop Excision of the Transformation Zone)

LSIL Lesão escamosa intraepitelial de baixo grau (Low-grade

Squamous Intraepitelial Lesion)

NIC Neoplasia Intraepitelial Cervical

PBS Tampão Fosfato-Salino (Phosphate buffered saline)

PCR Reação de Cadeia de Polimerase (Polimerase Chain Reaction)

SUS Sistema Único de Saúde

3

TBS Sistema de Bethesda (The Bethesda System)

VB Vaginose Bacteriana

UEM Universidade Estadual de Maringá

UNICAMP Universidade Estadual de Campinas

USP Universidade de São Paulo

VPN Valor Preditivo Negativo

VPP Valor Preditivo Positivo

WHO Organização Mundial de Saúde (World Health Organization)

4

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura/Tabela Descrição

Figura 1 A - Citologia Convencional e B – Citologia em Base Líquida. A1

e B1: diagnóstico concordante para negativo para lesões

intraepiteliais e microbiota lactobacilar. A2 e B2: diagnóstico

discordante, mostrando LSIL na CBL e HSIL na CC. A3 e B3:

diagnóstico concordante de HSIL/NIC2. Nikon ACT-1 1.200C

DXM, aumento de 400x

Figura 2 A - Citologia Convencional e B - Citologia em Base Líquida. A1 e

B1: diagnóstico concordante de HSIL/NIC2. A2 e B2: diagnóstico

concordante de HSIL/NIC3 com comprometimento glandular. A3

e B3: diagnóstico concordante de carcinoma escamoso invasor.

Nikon ACT-1 1.200C DXM, aumento de 400x

Figura 3 A - Citologia Convencional mostrando Alteração em Célula

Glandular, com artefato de fixação. B - Citologia em Base Líquida

mostrando Alteração em Célula Glandular e grupamento de

HSIL. O diagnóstico histológico foi NIC 3 com comprometimento

glandular. Nikon ACT-1 1.200C DXM, aumento de 400x.

Figura 4 A- Citologia Convencional e B- Citologia em Base Líquida.

Ambos mostrando diagnóstico de vaginose bacteriana. Nikon

ACT-1 1.200C DXM, aumento de 400x.

Figura 5 Citologia Convencional mostrando células metaplásica sugestiva

de Chlamydia trachomatis. Nikon ACT-1 1.200C DXM, aumento

de 400x.

Tabela 1

Desempenho da CBL e CC para diagnóstico de lesões cervicais

de acordo com a biópsia obtida por conização.

Tabela 2 Desempenho da CBL e CC para diagnóstico de vaginose

bacteriana tendo a bacterioscopia de Nugent como padrão ouro.

5

RESUMO

IBRAHIM, BS. Comparação da acurácia da citologia convencional e citologia em

base líquida para diagnóstico morfológico e microbiológico. 2017. no. f. Trabalho de

Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências

Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.

Palavras-chave: Citologia, Papanicolaou, diagnóstico, acurácia

INTRODUÇÃO: O câncer de colo de útero é a terceira neoplasia mais incidente em

mulheres brasileiras. No Brasil, Exame de Papanicolaou ou Exame de Citologia

Oncológica (CO) é o exame de rotina para o rastreamento deste câncer na rede

pública e privada, utilizando a Citologia Convencional (CC). O rastreamento

citológico também pode ser realizado pela Citologia em Base Líquida (CBL), e

desde o surgimento da mesma, existe um extenso debate sobre qual das duas

técnicas seria mais eficiente. A literatura é controversa sobre a superioridade da

CBL em relação à CC, tanto para diagnóstico morfológico quanto microbiológico.

OBJETIVO: Através de um estudo tipo “validação de teste diagnóstico”, determinar

a sensibilidade, a especificidade, o valor preditivo negativo (VPP), valor preditivo

positivo (VPN) e kappa das técnicas de CC e CBL para diagnóstico morfológico e

microbiológico.

MATERIAIS E MÉTODOS: Amostras cervicais de 100 participantes foram

coletadas. Após preparação das lâminas e leitura, foram calculados os indicadores.

RESULTADOS: A sensibilidade encontrada para CBL foi superior à CC para

diagnóstico morfológico, sendo os valores encontrados para os demais indicadores

similares para ambas as citologias. O grau de concordância entre as duas citologias

é proporcional ao grau da lesão, sendo considerada boa para os cut-offs HSIL/NIC2-

3 e carcinoma invasor. Os desempenhos da CBL e da CC para diagnóstico

microbiológico também foram semelhantes, com ótima concordância para o

diagnóstico de vaginose bacteriana.

6

CONCLUSÃO: A acurácia encontrada para a CBL foi maior no diagnóstico

morfológico, sendo neste estudo a técnica superior à CC.

7

1. INTRODUÇÃO

1.1 Câncer de colo de útero e o Papilomavirus humano (HPV)

O câncer de colo de útero (ou câncer cervical) é a terceira neoplasia mais

incidente em mulheres brasileiras. Para o ano de 2016, foram estimados 16.340

novos casos no Brasil (INCA, 2015). De acordo com a World Health Organization

(WHO), em 2014 a mortalidade no sexo feminino por câncer de colo de útero

correspondeu a 8,6% do total de 104.100 mortes por câncer no país (WHO, 2014).

A infecção persistente por genotipos de Papilomavirus humano (HPV) de alto

grau oncogênico é necessária para o desenvolvimento do câncer do colo do útero

(Schiffman et al, 2007). O HPV é transmitido através de relações sexuais, e a

maioria das infecções é resolvida dentro do período de 1 a 2 anos da exposição

pelo próprio sistema imunológico (Schiffman et al, 2007; Voltaggio et al, 2016).

Entretanto, parte destas infecções é persistente e pode evoluir para estados pré-

cancerosos, e isto está majoritariamente relacionado ao tipo de HPV, embora outros

fatores como a multiparidade, o hábito de fumar e o uso de anticoncepcionais

possam influenciar (Schiffman et al, 2007). O intervalo de tempo entre a detecção

de uma lesão cervical pré-neoplásica e o desenvolvimento de um carcinoma

escamoso invasivo pode ser de até 2 décadas (Voltaggio et al, 2016).

Um estudo conduzido pelo nosso grupo, que contou com a inclusão de

mulheres de Campinas e região que apresentavam neoplasias intraepiteliais

cervicais e/ou carcinoma escamoso invasor, mostrou um o HPV 16 é o tipo mais

prevalente (34%), seguido de HPV31 (8%), HPV52 (7%), HPV33 (6,5%), HPV58

(6%), HPV35 (5,5%) e HPV62 (4%). HPV18 representou 2,6% de todos os casos.

(Discacciati et al, 2015).

A detecção precoce das lesões cervicais precursoras do câncer do colo de

útero, que tem como método principal de rastreamento o exame de Papanicolaou,

é capaz de prevenir o carcinoma invasor, promovendo a cura em 100% dos casos

diagnosticados e tratados precocemente (Diretrizes INCA, 2016;).

8

1.2 Exame de Citologia Oncótica

No Brasil, o exame de Papanicolaou ou exame de Citologia Oncológica (CO)

é o exame de rotina para o rastreamento do câncer de colo de útero na rede pública

e privada (INCA, 2015). O exame de Papanicolaou foi elaborado por George

Nicholas Papanicolaou em 1920, com o objetivo de estudar as células vaginais e do

colo uterino para diagnóstico de anormalidades. (Diretrizes INCA, 2016)

Atualmente, o rastreamento é realizado no Sistema Único de Saúde (SUS)

dentro de um padrão oportunístico, ou seja, é realizado quando as mulheres

brasileiras procuram o SUS por outras razões que não ginecológicas. (Diretrizes

INCA, 2016). A recomendação geral pelo Ministério da Saúde é que o rastreamento

seja feito uma vez por ano e após dois resultados seguidos negativos, a cada três

anos, na faixa etária de 25 a 64 anos. Esta diretriz é válida para mulheres sem

complicações ou casos específicos, sendo outros intervalos requeridos para

situações particulares (Diretrizes INCA, 2016).

O exame de Papanicolaou pode ser realizado por duas técnicas: a Citologia

Convencional (CC) e a Citologia em Base Líquida (CBL). Existem vários

interferentes que podem prejudicar a visualização de células neoplásicas durante o

exame de CO, como, por exemplo, presença de hemácias e infiltrado inflamatório

intenso (Schiffman et al, 2007). A CO realizada em lâminas de CC possui alta taxa

de falso negativo, que varia de 20 a 40%, como consequência de processos

reparativos, inflamatórios e atróficos (Stabile et al, 2012), falhas na coleta e

preparação das lâminas (Anschau e Gonçalves, 2006) e baixa sensibilidade para

detecção de lesões de alto grau (50%) (Stabile et al, 2012).

A CBL foi desenvolvida para tentar minimizar as falhas da CC, e ganhou

aprovação em 1996 pelo Food and Drug Administration (Stabile et al, 2012). A CBL

tem como características uma ótima fixação, dispersão homogênea do material de

análise em uma única camada sem sobreposição de células e a existência de um

fundo limpo, proporcionando maior nitidez dos detalhes celulares (Takei et al, 2006;

Strander et al, 2007; Stabile et al, 2012). Nesta técnica, as amostras são coletadas

e dispostas em um meio preservativo, que em seguida é homogeneizado por

9

centrifugação, permitindo a separação de acordo com diferentes densidades,

removendo muco, sangue e debris celulares (Takei et al, 2006). A CBL substituiu a

CC no rastreamento do câncer de colo de útero em países como o Reino Unido e o

Canadá (Strander et al, 2007).

1.3 Sistema de Bethesda (TBS)

O Sistema de Bethesda (The Bethesda System, TBS) teve origem em um

workshop no ano de 1988, sendo modificado posteriormente por mais três reuniões

em 1991, 2001 e 2014, e tendo como objetivo a padronização da terminologia entre

diferentes patologistas e laboratórios, facilitando a interpretação dos resultados do

exame de CO para outros profissionais da saúde (Nayar e Wilbur, 2015). O TBS

também padronizou os critérios de adequabilidade das amostras e indiretamente

levou à criação de diretrizes de manejo clínico através de pesquisas clínicas e

pesquisas sobre o vírus HPV. A terminologia do TBS é atualmente recomendada

pela WHO e por outras organizações dedicadas à patologia para o reporte citológico

de lesões associadas ao HPV (Nayar e Wilbur, 2015).

As lesões pré-cancerosas escamosas são classificadas em lesão

intraepitelial de baixo grau (do inglês Low-grade Squamous Intraephitelial Lesion,

LSIL) e lesão intraepitelial de alto grau (do inglês High-grade Squamous

Intraepithelial Lesion, HSIL) (Nayar e Wilbur, 2015).

1.4 Classificação de Richart

A nomenclatura de Richart surgiu dos esforços de Ralph Richart, em meados

da década de 1960, para compreensão do desenvolvimento dos diferentes estágios

celulares sequenciais que precedem o câncer cervical, uma vez que seus estudos

concluíram que a displasia acentuada e o carcinoma in situ eram próximos.

(Diretrizes INCA, 2016). O espectro de lesões pré-cancerosas levou à criação do

termo Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC), o qual é dividido em NIC 1, 2 e 3. NIC

1 refere-se à displasia leve, NIC 2 displasia moderada e NIC 3 displasia severa.

10

Após a criação da terminologia de Bethesda, NIC 2 e 3 têm como correspondente

HSIL, e NIC 1 tem como correspondente LSIL. (Voltaggio et al, 2016). Atualmente,

a classificação de Richart é usada para diagnóstico histológico, enquanto a TBS é

utilizada para o diagnóstico de CO.

1.5 TBS e presença de micro-organismos

Embora não seja o foco principal do rastreamento, para uma avaliação

completa do estado cervicovaginal, são incluídos no exame reportes referentes à

presença de micro-organismos. O TBS de 2001 incluiu na categoria “Organismos”

o rastreio de 5 micro-organismos, como parte dos achados não-neoplásicos, sendo

esses: Trichomonas vaginalis, Candida spp., alterações no padrão bacteriano ou

vaginose bacteriana (VB), Actinomyces ssp., e Herpes simplex (Takei et al, 2006;

Nayar e Wilbur, 2015).

1.6 Discussão sobre a eficiência das técnicas

Desde o surgimento da CBL, na década de 1990, existe um extenso debate

sobre qual das duas técnicas seria mais eficiente. A CBL mostra-se superior à CC

pela facilidade de transporte, durabilidade das amostras, número de células

epiteliais visíveis por lâmina, embora seja uma técnica mais cara e de execução

mais demorada (Sykes et al, 2008). A CBL tem ainda a vantagem de fornecer

material para diagnóstico molecular de infecções não diagnosticas por morfologia,

como por exemplo, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhea e o próprio HPV.

Isso pode ser feito utilizando a mesma amostra coletada para o diagnóstico

morfológico, sem necessidade de coleta adicional. (Discacciati et al, 2015).

A literatura é controversa sobre a superioridade da CBL em relação à CC. A

escolha entre o método de CC e CBL depende da avaliação de diversas variáveis

relacionadas à acurácia, desenvolvimento tecnológico e custo. Assim, estudos que

comparem a eficácia destas duas tecnologias poderão fornecer subsídios para

melhor decisão sobre o método utilizado para diagnóstico das alterações cervicais.

11

2. OBJETIVOS

Determinar a sensibilidade, a especificidade, o valor preditivo negativo

(VPN), valor preditivo positivo (VPP) e kappa de Cohen das técnicas de CC e CBL

para diagnóstico morfológico e microbiológico, utilizando como padrão ouro: biópsia

para diagnóstico morfológico, GRAM e reação de cadeia de polimerase (PCR)

Multiplex como diagnóstico de infecções genitais.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Coleta das Amostras:

As participantes foram referidas ao Caism - Hospital da Mulher Prof. Dr. José

Aristodemo Pinotti da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) para

realização da excisão da zona de transformação por alça diatérmica (LLETZ), por

apresentarem diagnóstico de lesões cervicais de alto grau em exames anteriores

de Papanicolaou e/ou biópsia. As participantes foram incluídas entre agosto de 2013

e agosto de 2014.

Após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, as

participantes foram submetidas ao exame especular para coleta de amostras

cervicais. As amostras foram conservadas em meio SurePath® e salina estéril.

Também foram coletados esfregaços da parede do terço superior da vagina para

realização de bacterioscopia corada pelo GRAM e esfregaço cervicovagonal para a

realização da CC.

3.2 Preparo das lâminas para estudo citológico:

As amostras foram analisadas no Laboratório de Citopatologia da Faculdade

de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo (USP). Foram analisadas

as lâminas preparadas da seguinte maneira:

12

a.) Citologia Convencional: esfregaço cervicovaginal feito por aposição da

amostra diretamente na lâmina de vidro, com auxílio de espátula cervical e

escovinha endocervical e posterior fixação com álcool 95°.

b.) Citologia em Base Líquida: Foram aspirados 8mL das amostras

cervicovaginais armazenadas no meio conservador Surepath® e a este volume,

adicionou-se 4mL de tampão gradiente. As amostras foram centrifugadas (1400 rpm

por 10 minutos). O sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspendido em

tampão fosfato-salino (PBS) para uma segunda centrifugação (2.900 rpm por 10

minutos). Após novo descarte do sobrenadante, um volume de 200 a 300 µL do

pellet foi colocado em uma lâmina com auxílio de um delimitador de campo.

As lâminas, tanto de CBL quanto de CC, foram então coradas através da

técnica de coloração de Papanicolaou, conforme o protocolo abaixo:

Etapa Substância para coloração Número de Imersões ou

tempo

1 Álcool a 80% 15 imersões

2 Álcool a 70% 15 imersões

3 Álcool a 50% 15 imersões

4 Água Destilada 15 imersões

5 Hematoxilina de Harris Imersão durante 2 minutos

6 Água destilada 15 imersões

7 Álcool a 50% 15 imersões

8 Álcool a 80% 15 imersões

9 Álcool a 95% 15 imersões

10 Orange G Imersão durante 1 minuto

11 Álcool a 95% 15 imersões

12 EA36 (verde luz, eosina e pardo de Bismard) Imersão durante 1 minuto

13 Xilol I 15 imersões

14 Xilol II 15 imersões

15 Montagem da lâmina com lamínula utilizando

Entellan®.

Não se aplica

13

3.3 Leitura das lâminas:

A leitura de cada uma das lâminas foi realizada por uma citopatologista que

não tinha conhecimento dos resultados dos exames considerados padrão ouro para

diagnóstico morfológico e microbiológico.

As lâminas foram analisadas em aumento de 100x para escrutínio

panorâmico e em aumento de 400x para interpretação morfológica das alterações

celulares, em microscópio Nikon.

Os diagnósticos citológicos e microbiológicos foram registrados

individualmente na ficha elaborada para o presente trabalho (Instrumento de Coleta

de Dados, Anexo 2).

3.4 Diagnóstico Morfológico e Citológico:

Quanto ao diagnóstico citológico, a classificação foi feita em uma das

seguintes categorias: ausência de lesões intraepiteliais/malignidade (negativo),

lesão escamosa intraepitelial de baixo grau (LSIL), lesão intraepitelial escamosa de

alto grau (HSIL), carcinoma de células escamosas (CCE), células escamosas

atípicas (ASC-US e ASC-H) e células glandulares atípicas (AGC), de acordo com

os critérios do Sistema de Bethesda 2014.

A respeito do diagnóstico microbiológico, foram avaliadas as seguintes

infecções cervicais e condições clínicas: vaginose bacteriana (VB), Candida spp,

Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoea e

Actinomyces spp. Além disso, foram consideradas na avaliação as microbiotas

lactobacilar ou escassa. O diagnóstico de vaginose bacteriana no esfregaço de

Papanicolaou foi baseado na observação de pelo menos 20% de clue cells de

acordo com critérios definidos por Discacciati et al, 2006.

3.5 Diagnóstico das Lesões por Biópsia (padrão ouro):

14

O diagnóstico histológico das biópsias obtidas pelo LLETZ foi realizado por

um anatomopatologista no Laboratório de Patologia do Hospital das Clínicas da

UNICAMP como parte da rotina do ambulatório, e as amostras foram classificadas

como NIC1, NIC2, NIC3 ou carcinoma de células escamosas. Este diagnóstico foi

considerado o padrão ouro para o diagnóstico das lesões cervicais.

3.6 Diagnóstico de infecções genitais (padrão ouro):

Os diagnósticos de Chlamydia spp., Neisseria gonorrhoeae e Trichomonas

vaginalis foi realizado por PCR multiplex, a partir da amostra endocervical coletada

em salina estéril, na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade

Estadual de Maringá (UEM), conforme protocolo padronizado nesta instituição.

Estas avaliações ocorreram dentro do estudo do qual este trabalho faz parte.

Os diagnósticos de vaginose bacteriana, Candida spp. e Actinomyces spp.

foram realizados a partir de lâminas coradas pela técnica de GRAM utilizando o

score de Nugent (Nugent et al, 1991). Para o diagnóstico de vaginose bacteriana,

uma pontuação de 0 a 3 foi considerada normal, uma pontuação 4 a 6 foi

classificada como intermediária e uma pontuação ≥ 7 foi considerada positiva para

VB.

3.6 Análise estatística:

Foram analisadas amostras cervicais de 100 mulheres. Este tamanho

amostral partiu do número de amostras disponíveis a partir do projeto no qual este

trabalho está inserido.

Os diagnósticos feitos tanto pela CC quanto pela CBL foram comparados aos

testes utilizados como padrão ouro para lesões cervicais (biópsia de colo uterino

obtido por LLETZ) ou infecções genitais (bacterioscopia pelo método de Nugent e

PCR multiplex). No caso das lesões intraepiteliais de alto grau (HSIL), além de

consideramos em conjunto as lesões de NIC 2 e NIC 3, conforme preconiza o TBS,

nós também realizamos uma análise separadamente destes dois graus de lesão.

15

Foram então calculados a sensibilidade, a especificidade, o VPP, VPN e

Kappa de Cohen da CBL e CC.

3.7 Aspectos éticos:

O presente estudo foi do tipo validação de teste diagnóstico, e faz parte de

um estudo anterior aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas da USP no parecer consubstanciado número 346.238 de

2013 (Anexo 1). Todas as participantes assinaram termo de consentimento livre e

esclarecido.

4. RESULTADOS

4.1 Desempenho da CC e da CBL para diagnóstico de lesões cervicais

A Tabela 1 apresenta os valores encontrados de sensibilidade,

especificidade, VPP, VPN e acurácia de acordo com o grau de lesão citológica para

a CC e a CBL, comparando com a biópsia padrão ouro. Nesta tabela também está

descrito o valor Kappa de concordância entre CBL e CC.

Nota-se que os valores de sensibilidade aumentam proporcionalmente de

acordo com o grau da lesão, tanto para CC quanto para CBL. A concordância entre

a CC e CBL também aumenta de acordo com o aumento do grau da lesão.

Os valores encontrados de especificidade, entretanto, se mantêm similares,

diminuindo discretamente com o grau da lesão.

Para o VPP, encontra-se ligeira superioridade da CBL sobre a CC para

lesões LSIL/NIC1 e HSIL/NIC2, superioridade da CC para a HSIL/NIC 3 e igualdade

de valores para as outras lesões.

Para o VPN, observa-se discreta superioridade da CC em relação à CBL nas

lesões LSIL/NIC 1, HSIL/NIC 2 e carcinoma invasor, e superioridade da CBL em

relação à CC nas demais lesões.

16

Em termos de acurácia, encontramos proximidade de valores para as duas

citologias, com a CC sendo superior apenas em LSIL/NIC 1 e carcinoma invasor.

Quando se trata de concordância de diagnóstico entre as duas técnicas,

obteve-se um valor kappa crescente de acordo com o grau de lesão, sendo a

concordância considerada melhor para HSIL/NIC2-3 e carcinoma invasor.

Quanto à adequabilidade da amostra, observou-se que a CC apresentou

maior frequência de amostras sem representação de células da junção escamo-

colunar (JEC) (4 casos), de amostras mal fixadas (8 casos) e de esfregaços

obscurecidos por hemácias e neutrófilos (5 casos). Na CBL encontramos apenas

uma lâmina com ausência de células da JEC e nenhum caso com ausência de

células da JEC ou limitações por hemácias ou neutrófilos.

A Figura 1 mostra imagens das lâminas de CC e CBL cujos diagnósticos

citológicos foram concordantes para negativo para lesões intraepiteliais ou

malignidade (Figura 1 - A1 e B1), discordância para diagnóstico de HSIL na CC

(Figura 1 - A2), e LSIL (Figura 1 - B2) na CBL; e concordância para diagnóstico de

HSIL/NIC 2 (Figura 1 - A3 e B3).

A Figura 2 representa casos concordantes de HSIL/NIC2 (Figura 2 - A1 e

B1), HSIL/NIC3 com comprometimento glandular (Figura 2 - A2 e B2) e carcinoma

escamoso invasor (Figura 2 - A3 e B3). Nota-se que o caso de NIC 2 diagnosticado

na CC mostra limitações de fixação.

Foram encontrados dois casos em que o diagnóstico da biópsia foi de NIC 3

com comprometimento glandular, mas em ambas a citologias o diagnóstico foi de

células glandulares atípicas (AGC), como mostrado na Figura 3, onde podemos

observar também limitação de fixação na CC.

Tabela 1: Desempenho da CBL e da CC para diagnóstico de lesões cervicais de acordo com a biópsia obtida por conização

Teste

Lesão citológica

LSIL/NIC1 HSIL/NIC 2 HSIL/NIC 3 HSIL/NIC2-3 Carcinoma

invasor

Cit

olo

gia

em

Bas

e

Líq

uid

a

Sensibilidade % (IC95%) 10 (9-29) 21 (3-39) 71 (59-83) 81 (71-91) 54 (25-84)

Especificidade % (IC95%) 96 (91-100) 96 (92-99) 88 (81-95) 86 (60-100) 100 (100-100)

VPP % 25 50 79 98 100

VPN % 89 86 83 35 94

Acurácia % 86 83 82 81 95

Cit

olo

gia

Co

nv

en

cio

na

l

Sensibilidade % (IC95%) 0 (0-0) 12 (4-27) 62 (48-75) 75 (64-86) 64 (35-92)

Especificidade % (IC95%) 100 (100-100) 95 (90-100) 86 (76-96) 86 (59-100) 100 (100-100)

VPP % 50 33 84 98 100

VPN % 91 83 65 30 95

Acurácia % 90 81 73 76 96

Kappa entre CC e CBL 0,03 0,16 0,45 0,68 0,75

Figura 1: A - Citologia Convencional e B – Citologia em Base Líquida. A1 e B1:

diagnóstico concordante para negativo para lesões intraepiteliais e microbiota

lactobacilar. A2 e B2: diagnóstico discordante, mostrando LSIL na CBL e HSIL na

CC. A3 e B3: diagnóstico concordante de HSIL/NIC2. Nikon ACT-1 1.200C DXM,

aumento de 400x.

19

Figura 2: A - Citologia Convencional e B - Citologia em Base Líquida. A1 e B1:

diagnóstico concordante de HSIL/NIC2. A2 e B2: diagnóstico concordante de

HSIL/NIC3 com comprometimento glandular. A3 e B3: diagnóstico concordante de

carcinoma escamoso invasor. Nikon ACT-1 1.200C DXM, aumento de 400x.

20

Figura 3: A - Citologia Convencional mostrando Alteração em Célula Glandular,

com artefato de fixação. B - Citologia em Base Líquida mostrando Alteração em

Célula Glandular e grupamento de HSIL. O diagnóstico histológico foi NIC 3 com

comprometimento glandular. Nikon ACT-1 1.200C DXM, aumento de 400x.

4.2 Desempenho da CC e da CBL para diagnóstico microbiológico

4.2.1 Diagnóstico de Vaginose Bacteriana

A Tabela 2 apresenta os valores encontrados de sensibilidade,

especificidade, VPP, VPN e acurácia para o diagnóstico de vaginose bacteriana

para a CC e a CBL, em comparação ao teste de Nugent, considerado padrão ouro.

Também está descrito o valor kappa para concordância entre CC e CBL.

Nota-se que quanto à sensibilidade e ao VPP, a CC se mostrou superior. Já

quanto à especificidade, VPN e acurácia, ambas apresentam praticamente o

mesmo desempenho.

A Figura 4 ilustra um caso de VB diagnosticada na CC e na CBL.

21

Tabela 2: Desempenho da CBL e CC para diagnóstico de vaginose bacteriana tendo a

bacterioscopia de Nugent com padrão ouro

Citologia em Base

Líquida Citologia Convencional

Sensibilidade % (IC95%) 63 (46-81) 70 (54-86)

Especificidade % (IC95%) 99 (97-100) 100 (100-100)

VPP % 95 100

VPN % 89 88

Acurácia 90 91

Kappa entre CC e CBL 0,90

Figura 4: A- Citologia Convencional e B- Citologia em Base Líquida. Ambos

mostrando diagnóstico de vaginose bacteriana. Nikon ACT-1 1.200C DXM, aumento

de 400x.

4.2.2 Diagnóstico de outras infecções

Devido ao pequeno número de amostras em que foram detectadas infecções

por Chlamydia trachomatis, Candida spp. e Trichomonas vaginalis, os dados

encontrados serão expressos de maneira descritiva.

22

a.) Chlamydia trachomatis: Foram diagnosticados oito casos de Chlamydia

trachomatis pelo PCR multiplex. Porém, esta infecção não foi encontrada na CBL

ou CC. Entretanto, uma lâmina de CC cujo diagnóstico molecular foi positivo para

Chlamydia trachomatis apresentou vacúolos citoplasmáticos em células

metaplásicas com inclusões, que são sugestivas mas não conclusivas desta

infecção, como mostrado na Figura 5.

b.) Trichomonas vaginais: Foram diagnosticados dois casos de Trichomonas

vaginalis pelo PCR multiplex, mas este protozoário não foi visualizado tanto na CBL

quanto na CC.

c.) Candida sp: Foram diagnosticados dois casos de infecção por Candida sp

pelo PCR multiplex, com 100% de concordância pela CBL e 50% de concordância

pela CC.

Figura 5: Citologia Convencional mostrando células metaplásica sugestiva de

Chlamydia trachomatis. Nikon ACT-1 1.200C DXM, aumento de 400x.

23

5. DISCUSSÃO

Os resultados encontrados para diagnóstico morfológico sugerem que a CBL

é superior à CC quanto aos valores de acurácia. Ou seja, a probabilidade de que

um diagnóstico realizado por CBL esteja correto, frente à comparação com o padrão

ouro, é maior do que um realizado por CC, principalmente nas lesões de alto grau.

Para ambas as técnicas, a sensibilidade do teste aumenta de acordo com o

aumento do grau da lesão, isto é, baixa sensibilidade em lesões de baixo grau e

maior sensibilidade em lesões de alto grau.

As especificidades encontradas no presente trabalho para as duas técnicas

são similares. A capacidade de detecção de indivíduos verdadeiramente sadios é

semelhante para a CC e a CBL, não importando o grau da lesão, em concordância

com estudos randomizado e transversal tipo direct-to-vial de 2004 e 2005,

respectivamente (Ferraz et al, 2004; Taylor et al, 2005). Entretanto, esta ausência

de diferença significativa é contraditória aos dados encontrados em outros estudos

na literatura. As especificidades encontradas por Karimi-Zarchi e grupo, tanto para

LSIL quando para HSIL, são maiores na CC do que na CBL, sendo a diferença ainda

mais expressiva em quando se analisa HSIL (92,5% para CC versus 7,94% para

CBL) (Karimi-Zarchi et al, 2013). Outro artigo cita a especificidade geral de 97,3%

para a CBL e 90% para a CC (Fei et al, 2011).

O VPP encontrado para a CBL neste estudo aponta que ela tem a maior

probabilidade de um diagnóstico de lesão de baixo grau estar correto em relação à

CC. Entretanto, para lesões de alto grau não há diferença. Já o VPN para CBL é

um pouco maior para alto grau. Este último dado é concordante com Karimi-Zarchi

e colegas, que encontraram 97,2% contra 90,7% para CBL e para CC

respectivamente (Karimi-Zarchi et al, 2013).

A literatura traz estudos com resultados contraditórios quanto à acurácia e

valores de sensibilidade e especificidade das duas técnicas. É interessante frisar

que alguns autores propõem que os resultados dependem do delineamento do

estudo e, em populações com alta incidência de lesões, a diferença entre as

acurácias da CBL e da CC geralmente não é significativa (Strander et al, 2007). Os

24

estudos com design mais adequado, em que não se encontram diferenças

significativas, seriam estudos prospectivos, com grande número de amostras e

randomizados (Strander et al, 2007). Alguns estudos falham pois não têm como

comparação os testes padrões ouro (Anschau e Gonçalves, 2006). Quanto melhor

a qualidade do estudo, menos diferenças são encontradas entre as técnicas (Simion

et al, 2014; Taylor et al, 2006).

A maior sensibilidade encontrada neste estudo para CBL para o diagnóstico

de lesões pré-neoplásicas pode ser explicada pela adequabilidade da amostra e

pelo fato de que algumas amostras da CC foram limitadas por lâminas dessecadas

e ausência de células da junção escamo-colunar (JEC) nos esfregaços. Neste

último caso, a citologia foi negativa para lesões, apesar do diagnóstico da biopsia

ser positivo. A presença de células da JEC indica boa qualidade da amostra, pois é

nesta região que se inicia a maior parte das lesões pré-neoplásicas, sendo a

detecção de lesões até dez vezes mais alta em amostras que apresentam estas

células (Diretrizes INCA, 2016). Amostras de qualidade superior por boa coleta e

processamento causam menor dificuldade de interpretação, levando a menos casos

de falsos positivos (Ilter et al, 2012), inclusive para as atipias de significado

indeterminado e lesões glandulares (Simion et al, 2014).

Para que uma amostra seja classificada com satisfatória, ela deve apresentar

células em quantidade representativa, com distribuição, fixação e coragem

adequadas (Anschau e Gonçalves, 2006; Diretrizes INCA, 2016). Porém, uma

amostra pode ser analisada mesmo que não seja plenamente satisfatória, sendo

denominada como “limitada”, pois 50 a 70% de suas células epiteliais terão uma

interpretação dificultosa. Este tipo de amostra pode apresentar ausência ou

escassez de células endocervicais ou metaplásicas representativas (JEC),

espessamento, dessecamento, áreas cobertas ou escurecidas por pus ou sangue

(Diretrizes INCA, 2016). No presente estudo, encontramos amostras limitadas por

dessecamento e ausência das células da JEC na CC.

A literatura traz diversos estudos que defendem que a CBL provê um menor

número de amostras insatisfatórias, mas também traz vários estudos que relatam

que não há diferença entre a CC e a CBL (Anschau e Gonçalves, 2006). Singh e

25

colegas, num estudo tipo split sample descrevem um menor número de amostras

insatisfatórias para a CBL em relação à CC, e os motivos mais comuns são baixa

celularidade e excesso de sangue para CC, e baixa celularidade para CBL (Singh

et al, 2015). Autores que procederam com estudos randomizados também reportam

um menor número de amostras insatisfatórias com a CBL (Strander et al, 2007; Ilter

et al, 2016; Sykes et al, 2006).

Foram encontrados dois casos em que o diagnóstico da biópsia foi de NIC 3

com comprometimento glandular, mas em ambas a citologias o diagnóstico foi de

células glandulares atípicas (AGC). Isto é compatível com os resultados de De-

Oliveira et al, que mostraram que os achados de AGC ou AGC + HSIL na citologia

não têm um correspondente histológico claro, sendo muitas vezes associados a NIC

3 na histologia (De-Oliveira et al, 2006).

Quanto aos valores de kappa encontrados no presente estudo, temos que a

concordância entre as duas técnicas foi satisfatória para HSIL/NIC2-3 e carcinoma

invasor, e moderada para HSIL/NIC-3. A concordância foi baixa nos outros tipos de

lesão. Outros estudos na literatura trazem uma variabilidade de valores de

concordância encontrados, como por exemplo concordância percentual de 75%

entre CC e CBL (Simion et al, 2014), e de 89% reportada em revisão de literatura

entre os métodos para estudos que classificam os resultados de citologia em

negativa, alterações atípicas LSIL, HSIL e carcinoma. Este valor sobe para 92%

caso a classificação seja “com ou sem alteração” (Anschau e Gonçalves, 2006). É

importante apontar que, apesar da concordância percentual e do kappa

expressarem consenso entre dois valores, o kappa é um indicador ajustado, o qual

leva em consideração a probabilidade do acaso na concordância, sendo, portanto,

mais relevante (Stemler, 2004).

Quanto à detecção de microbiota alterada, temos que os desempenhos de

CC e CBL são muito similares, sendo a CC mais sensível que a CBL na detecção

de VB, com uma boa concordância entre as técnicas. Os resultados encontrados

por Singh e colegas mostram que uma microbiota alterada e casos de VB são

detectados com mais frequência pela CC. O mesmo ocorre para Candida spp.,

apesar da visualização das hifas serem muito mais facilmente vistas na CBL.

26

Entretanto, a detecção de Trichomonas vaginalis é facilitada na CC (Singh et al,

2015). Takei e colaboradores (2006) relatam que a detecção de determinados

microorganismos da flora cervicovaginal varia de acordo com a técnica utilizada,

sendo Trichomonas sp e VB detectadas mais frequentemente pela CC enquando a

Candida spp. pela CBL (Takei et al, 2006). Sharma e colaboradores reportam que

CC é melhor para observação tanto de espécies patogênicas quanto de comensais

(Sharma et al, 2016).

Os resultados encontrados neste estudo apontam que a CBL é ligeiramente

superior caso consideremos as sensibilidades dos testes. Entretanto, esta

superioridade encontrada não justificaria a troca da CC pela CBL no contexto do

rastreamento no Brasil ou em outros países em desenvolvimento, uma vez que a

CBL, apesar de prover um maior número de amostras adequadas, proporcionar

maior facilidade de leitura, menor área para análise, dar possibilidade de realização

de testes adicionais (Singh et al, 2015) e reduzir o tempo de leitura por lâmina (Singh

et al, 2015; Sharma et al, 2016); causou um aumento de custo de até 60% nos

países que adotaram esta forma de citologia, sendo o custo de análise oito vezes

maior por lâmina (Ilter et al, 2012; Anschau e Gonçalves, 2006). Adicionalmente, à

despeito destas vantagens da CBL, não existem fortes evidências na literatura de

que seja vantajosa a substituição da CC pela CBL em países nos quais o

rastreamento não inclui rotineiramente o teste de detecção de DNA do HPV como

co-teste ou teste “reflexo”, e nos quais o rastreamento é oportunístico (Taylor et al,

2006; Vesco et al, 2011).

6. CONCLUSÃO

Os resultados encontrados neste estudo apontaram para sensibilidade e

acurácia superiores da CBL para diagnóstico morfológico das lesões cervicais.

Entretanto, para o diagnóstico de vaginose bacteriana e outras infecções, a CC se

mostrou um pouco superior à CBL.

27

O estudo possui algumas limitações, como o pequeno espaço amostral.

Estudos envolvendo maior casuística são necessários para uma conclusão

inequívoca da superioridade da CBL em relação à CC para que o custo mais

elevado da CBL justifique a substituição da última no rastreamento do câncer de

colo de útero.

7. BIBLIOGRAFIA

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8. ANEXOS

ANEXO 1: Parecer Consubstanciado do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade

de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, número 346.238 de 01

de Agosto de 2013.

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