universidade de sÃo paulo escola de engenharia de...

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

LEONARDO NOBUO HOSHINO

AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE TRABALHADORES MAIORES DE 60 ANOS À TOXICIDADE OCUPACIONAL INDUZIDA POR

BENZENO

LORENA – SP 2018

LEONARDO NOBUO HOSHINO

AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE TRABALHADORES MAIORES DE 60 ANOS À TOXICIDADE OCUPACIONAL INDUZIDA POR

BENZENO

Projeto de Trabalho de Conclusão de Curso,

apresentado a Escola de Engenharia de Lorena

da Universidade de São Paulo, como parte das

exigências para conclusão da Graduação do

curso de Engenharia Ambiental.

Orientador: Prof. Dr. Morun Bernardino Neto

Lorena – SP

2018

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIOCONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE

Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizadoda Escola de Engenharia de Lorena,

com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Hoshino, Leonardo Nobuo Avaliação da sensibilidade de trabalhadoresmaiores de 60 anos à toxicidade ocupacional induzidapor benzeno / Leonardo Nobuo Hoshino; orientadorMorun Bernardino Neto. - Lorena, 2018. 53 p.

Monografia apresentada como requisito parcialpara a conclusão de Graduação do Curso de EngenhariaAmbiental - Escola de Engenharia de Lorena daUniversidade de São Paulo. 2018

1. Avaliação ocupacional. 2. Benzeno. 3.Fragilidade osmótica eritrocitária. 4. Pessoasidosas. 5. Vulnerabilidade. I. Título. II. Neto,Morun Bernardino, orient.

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer primeiramente aos meus pais, Márcia e Eduardo, pelo

total apoio nestes 5 anos de formação, sempre estando ao meu lado, me motivando

a olhar o meu melhor futuro.

Ao meu irmão, Gustavo, por ter me dado todo o suporte que necessitei, bem

como suprir as necessidades cruciais para manter o meu estudo.

À minha namorada, Vitória, pela companhia e compreensão nos momentos

mais difíceis, fazendo eu me reerguer todas as vezes.

Aos Prof. Dr. Fabiano Fernando Bargos e Profa. Dra. Danúbia Caporusso

Bargos, pela amizade, companheirismo e apoio em minha formação acadêmica.

Ao Prof. Dr. Morun Bernardino Neto, pelo excelente trabalho e paciência com

relação ao desenvolvimento desta monografia, como também por todo auxílio

fornecido como professor e amigo.

Aos meus amigos de república, companheiros da MATOSTT e amigos de

faculdade, especialmente Maria Fernanda, Débora Teixeira, Giulia Moreira e Flávia

Ferraz, pela as risadas, as conversas e todo divertimento nesses 5 anos de jornada.

Ao apoio fornecido pela Secretaria Municipal de Saúde da Prefeitura de Lorena.

E a todos que direta ou indiretamente contribuíram com a minha formação, o

meu muito obrigado.

HOSHINO, L. N. Avaliação da sensibilidade de trabalhadores maiores de 60 anos à toxicidade ocupacional induzida por benzeno. 2018. Monografia (TCC) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2018.

RESUMO

O benzeno é um composto químico com alta aplicabilidade, tanto no ramo industrial

quanto no seu uso como matéria-prima e solvente. Dependendo da exposição por

este composto dos trabalhadores, pode causar anemia aplástica, leucemia, danos à

medula óssea, entre outros problemas de saúde. Diante da longevidade dos

indivíduos, haverá um maior número de idosos no mercado de trabalho informal

(postos de gasolina), necessitando de uma maior preocupação com a saúde destes

trabalhadores. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito do benzeno sobre a

estabilidade celular por meio de dX e H50 pelo método de Fragilidade Osmótica

Eritrocitária (FOE) e definir o perfil individual mais suscetível à intoxicação. Foram

feitas as curvas ajustadas à regressão sigmoidal de acordo com a equação de

Boltzmann, seguida das análises descritiva exploratória e o teste de comparação de

Wilcoxon, bem como a investigação por correlações entre as variáveis dos parâmetros

de estabilidade (dX e H50) com as variáveis do hemograma (gênero, eritograma e

lipidograma). O teste FOE e a análise descritiva mostraram que em concentrações

altas de NaCl as células sofrem menor lise. A análise comparativa demonstrou que o

meio com o benzeno gera maior estabilidade à membrana dos eritrócitos.

Palavras Chaves: Avaliação ocupacional; Benzeno; Fragilidade Osmótica Eritrocitária; Pessoas idosas; Vulnerabilidade

HOSHINO, L. N. Avaliação da sensibilidade de trabalhadores maiores de 60 anos à toxicidade ocupacional induzida por benzeno. 2018. Monografia (TCC) – Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2018.

ABSTRACT

Benzene is a chemical compound with high applicability in the industrial branch and

using like feedstock and solvent. Depending on the exposure of workers to this

compound, it can cause aplastic anemia, leukemia, bone marrow damage, among

other health problems. Given the longevity of individuals, there is a tendency for more

elderly people to enter the informal labor market (gas stations), necessitating a greater

concern for the health of these workers. This study aimed to evaluate the effect of

benzene on cell stability by means of dX and H50 by the Erythrocyte Osmotic Fragility

(EOF) method and to define the individual profile most susceptible to intoxication.The

adjusted curves were calculated according to the Boltzmann equation, followed by the

exploratory analysis and the Wilcoxon comparison test, as well as the correlations

between the variables of the stability parameters (dX and H50) with the variables of the

hemogram (gender, erythrogram and lipidogram). The EOF test and the descriptive

analysis showed that in high concentrations of NaCl the cells suffer less lysis. The

comparative analysis demonstrated that the benzene sample gives greater erythrocyte

membrane stability.

Keywords: Benzene; Erythrocyte Osmotic Fragility; Elderly people; Occupational evaluation; Vulnerability

SUMÁRIO LISTA DE GRÁFICOS ................................................................................................. 8

LISTA DE QUADROS ............................................................................................... 10

LISTA DE TABELAS ................................................................................................. 11

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................... 12

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 15

2.1 O BENZENO .................................................................................................... 15

2.1.1 TOXICIDADE DO BENZENO .................................................................... 16

2.1.2 EXPOSIÇÃO AO BENZENO ..................................................................... 19

2.2 OS BIOMARCADORES ................................................................................... 22

2.3 A POPULAÇÃO IDOSA E EXPECTATIVA DE TEMPO DE TRABALHO ........ 24

2.3.1 VULNERABILIDADE ................................................................................. 24

2.4 METODOLOGIA DA FRAGILIDADE OSMÓTICA DOS ERITRÓCITOS (FOE)

............................................................................................................................... 25

3 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 27

4 OBJETIVOS ........................................................................................................... 28

4.1 OBJETIVOS GERAIS ...................................................................................... 28

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 28

5 METODOLOGIA ..................................................................................................... 29

5.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ........................................................................... 29

5.2 AMOSTRAS DE MATERIAL BIOLÓGICO ....................................................... 29

5.3 REAGENTES ................................................................................................... 30

5.4 TESTES DE FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITARIA EM HUMANOS .. 30

5.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA DE DADOS .............................................................. 32

6 RESULTADOS ....................................................................................................... 33

6.1 TESTE DE FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITÁRIA (FOE) ................... 33

6.2 ANÁLISE DESCRITIVA EXPLORATÓRIA ...................................................... 34

6.3 TESTE DE NORMALIDADE LILLIEFORS ....................................................... 39

6.4 TESTE DE COMPARAÇÃO NÃO-PARAMÉTRICO DE WILCOXON .............. 41

6.5 BUSCAS DE CORRELAÇÕES A PARTIR DA CORRELAÇÃO DE RHÔ (ρ) DE

SPEARMAN ........................................................................................................... 42

7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ........................................................................ 45

8 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 48

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 49

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Informação existente sobre os efeitos na saúde do benzeno ................... 17

Figura 2 - Amostras de sangue cedidas à Universidade ........................................... 30

Figura 3 - Exemplo de amostras em duplicata sem o sangue ................................... 31

Figura 4 - Amostras após centrifugação sem caotrópico .......................................... 33

Figura 5 - Amostras após centrifugação com caotrópico .......................................... 33

Figura 6 - Processo ilustrativo da ação do benzeno em meio salino no eritrócito ..... 46

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Principais fontes de exposição ao benzeno para fumantes e não fumantes,

de acordo com o estudo da USEPA .......................................................................... 21

Gráfico 2 - Porcentagem de trabalhadores de postos de gasolina expostos a

concentrações diferentes de benzeno ....................................................................... 22

Gráfico 3 - Curva ajustada a regressão sigmoidal de acordo com a equação de

Boltzmann com os parâmetros de estabilidade ......................................................... 31

Gráfico 4 - Curva da dependência de hemólise sem benzeno .................................. 34

Gráfico 5 - Curva da dependência de hemólise com 10µL.mL-1 de benzeno ............ 34

Gráfico 6 - Teste de Comparação Wilcoxon de dX sem e com caotrópico ............... 41

Gráfico 7 - Teste de Comparação Wilcoxon de H50 sem e com caotrópico ............... 42

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Processos de produção e principais utilizações do benzeno como matéria-

prima ......................................................................................................................... 16

Quadro 2 - Vantagens e desvantagens de alguns biomarcadores de exposição ao

benzeno .................................................................................................................... 23

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Propriedades Químicas e Físicas do Benzeno ........................................ 15

Tabela 2 - Análise descritiva dos parâmetros de estabilidade sem o caotrópico ...... 36

Tabela 3 - Análise descritiva dos parâmetros de estabilidade com o caotrópico ...... 36

Tabela 4 - Análise descritiva exploratória das variáveis do eritograma e lipidograma

.................................................................................................................................. 38

Tabela 5 - Teste de normalidade Lilliefors para os parâmetros de estabilidade sem

caotrópico .................................................................................................................. 39

Tabela 6 - Teste de normalidade Lilliefors para os parâmetros de estabilidade com

caotrópico .................................................................................................................. 39

Tabela 7 - Teste de normalidade Lilliefors das variáveis do eritrograma e lipidograma

.................................................................................................................................. 40

Tabela 8 - Teste de comparação de Wilcoxon de dX sem e com caotrópico ............ 42

Tabela 9 - Teste de comparação de Wilcoxon de H50 sem e com caotrópico .......... 42

Tabela 10 - Coeficientes de correlações de Spearman (ρ) e os níveis de significância

(Sig) ........................................................................................................................... 44

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A1 Absorbância no platô de hemólise mínima

A2 Absorbância no platô de hemólise máxima

A540 Absorbância a comprimento de onda de 540 nm

ACS American Chemical Society

ASTDR Agency for Toxic Substances and Disease Registry

CalEPA California Environmental Protection Agency

CEP Comitê de Ética em Pesquisa com Humanos

CHCM Concentração da Hemoglobina Corpuscular Média

CNTP Condições Normais de Temperatura e Pressão

COV Composto Orgânico Volátil

dX Variação da concentração de NaCl que promove 100% de hemólise

EEL Escola de Engenharia de Lorena

FOE Fragilidade Osmótica Eritrócitos

H50 Concentração de NaCl que promove 50% de hemólise

Hb Hemoglobina

HCM Hemoglobina Corpuscular Média

HDL High Density Lipoproteins

Ht Hematócrito

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IIA Istituto Inquinamento Atmosferico

IPCS International Programme on Chemical Safety

LDL Low Density Lipoproteins

NaCl Cloreto de sódio

NOAEL No Observed Adverse Effect Level

PNAD Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios

Ppm Parte por milhão

Pt Plaquetas

t-Col t-Colesterol

TG Triglicerídeos

USEPA United States Environmental Protection Agency

USP Universidade de São Paulo

VCM Volume Corpuscular Médio

VLDL Very Low Density Lipoproteins

WHO World Health Organization

14

1 INTRODUÇÃO

O benzeno é um hidrocarboneto aromático cancerígeno derivado do petróleo

ou carvão mineral com uma alta aplicabilidade, principalmente no ramo industrial

siderúrgico e petroquímico além do seu uso como matéria-prima e solvente. A

exposição dos trabalhadores ao benzeno pode causar sérios problemas à saúde,

como leucemia, danos a medula óssea, entre outros. A gravidade dessas doenças

pode estar relacionada à concentração, ao período de tempo de exposição, a

frequência de exposições sucessivas e a características individuais como a idade das

pessoas expostas ao toxicante.

Dentro do cenário atual da indústria do petróleo, a taxa de longevidade e o

tempo necessário para a aposentadoria são fatores que estão em constante mudança,

o que pode levar a maior exposição a esta substância. Assim, é provável que a cada

dia haja maior quantidade de trabalhadores maiores de 60 anos sujeitos à exposição

ao benzeno. Esse cenário requer maior preocupação com a saúde dos idosos, afim

de que estes trabalhadores possam viver sem agravos à saúde decorrentes de

intoxicação ocupacional.

Esta intoxicação pode ocorrer principalmente por três formas: a oral, a inalatória

e a dérmica. No entanto, somente a via inalatória possui relatos que comprometem o

sistema imunológico, neurológico, reprodutivo, bem como problemas genotóxicos,

cancerígenos e causar até a morte.

Mediante ao contato do benzeno com o organismo, aquele que não foi

metabolizado no corpo pode ser analisado principalmente pelo ar exalado, pela urina

e pelo sangue. O sangue é um biomarcador específico e sensível, com emprego de

técnicas sofisticadas, ademais, também é um biomarcador de acesso fácil e não

invasivo, uma vez que se pode utilizar o método de fragilidade osmótica eritrocitária

(FOE) para analisar as concentrações do benzeno em amostras de pequeno volume.

Nesse trabalho, será usada a metodologia FOE para analisar a sensibilidade

de idosos à citotoxicidade induzida por benzeno e definir o perfil individual mais

suscetível à intoxicação.

15

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 O BENZENO

O benzeno é um hidrocarboneto aromático e um composto orgânico volátil

(COV) de fórmula molecular C6H6 descoberto em 1825. Em Condições Normais de

Temperatura e Pressão (CNTP) se encontra em forma líquida e incolor, podendo ser

encontrado no ar, água e solo. É um hidrocarboneto muito estudado com propriedades

químicas e físicas bem definidas conforme demonstrada na tabela 1 (ASTDR, 2002).

Uma das propriedades que se destaca é a sua volatilidade, devido ao ponto de

ebulição relativamente baixo (80,1ºC), na qual está relacionado as altas

concentrações ambientais alcançadas (MARTINS e SIQUEIRA, 2002).

Tabela 1 - Propriedades Químicas e Físicas do Benzeno

Nome Benzeno

Massa Molar 78,12 g/mol

Ponto de Fusão 5,5 °C

Ponto de Ebulição (760 mmHg) 80,1 °C

Massa Volumétrica (20 °C) 0,8794 g/cm³

Log. Coef. Partição octanos/água (logKow) 2,13

Cor Clara

Odor Característico

Viscosidade (absoluta) a 20 °C 0,6468 cP

Calor de Vaporização a 80,1 °C 33,871 kJ/kg.mol

Calor de Combustão a Pressão Constante a 25 °C 41,836 kJ/g

Solubilidade em Água a 25 °C 0,180 g/100 mL

Pressão de Vapor a 25 °C 95,2 mmHg (12,7 kP)

Temperatura de Auto-Ignição 562 °C

Flash Point -11 °C

Constante Dielétrica (20°C) 0,23

Fonte: Adaptado de SITTIG (1989), LEWIS (1991), USEPA (1979)

16

O benzeno é um dos principais componentes que são produzidos nas indústrias

petroquímicas e sua utilização como matéria-prima, na qual é apresentada no quadro

1.

Quadro 1 - Processos de produção e principais utilizações do benzeno como matéria-prima

COMPOSTO TIPO DE

PROCESSO PROCESSO

Benzeno

Processos de produção

Reforma Catalítica Produção de Etileno Dealquilação do Tolueno Destilação dos óleos leves de forno de coque Isomerização do Xileno

Processos que se utiliza como matéria-prima

Etilbenzeno / Estireno Cumeno / Fenol Ciclohexano Nitrobenzeno / Anilina Alquilbenzenos Clorobenzenos Outros processos (Adição aos Combustíveis)

Fonte: Adaptado de (SOUSA, 2008).

Além desse hidrocarboneto ser utilizado nas indústrias químicas, é comum ver

sua utilização como solvente de gorduras para a produção de ceras, óleos, tintas,

borrachas, bem como na fabricação de detergentes, explosivos, corantes e produtos

farmacêuticos, entre outras diversas aplicabilidades (SITTIG, 1989; ASTDR, 2007).

O benzeno pode ser liberado no ar através de fontes naturais e antropogênicas.

Entre estas fontes, a segunda destaca-se pelo seu maior impacto ao meio ambiente,

devido à grande quantidade liberada por meio de gases oriundos de queimadas,

fumaça de cigarros, emissões industriais e processo de combustão de combustíveis

fósseis (IPCS, 1993b; IIA, 1998; ASTDR, 2002).

2.1.1 TOXICIDADE DO BENZENO

Além de possuir propriedades físicas e químicas bem definidas, o benzeno é

uma substância química que está sendo pesquisada frequentemente, devido ao seu

17

potencial cancerígeno, hemotóxico e genotóxico para o ser humano, como pode ser

observado na figura 1.

Figura 1 - Informação existente sobre os efeitos na saúde do benzeno

Fonte: Adaptada de (Agency for Toxic Substances and DIsease Registry, 2007).

● Estudos existentes.

Desde os estudos de Delore e Borgomano (1928), há informações suficientes

para justificar a associação entre a exposição ocupacional ao benzeno e o

desenvolvimento de leucemia, o que foi cientificamente aceito devido à forte

correlação entre altas exposições e o desenvolvimento de pancitopenia, anemia

aplásica e leucemia miocárdica aguda. Posteriormente, após uma breve revisão das

publicações clínicas sobre o benzeno, Van Raalte (1982) concluiu que a

hemotoxicidade estava relacionada as concentrações superiores a 50ppm e que entre

as faixas de 20 a 25ppm não havia evidência de hemotoxicidade devido a não possuir

nenhum relato.

A toxicidade do benzeno está relacionada à forma com que o ser humano é

exposto. Segunda a USEPA (1979), quando inalado pode provocar sintomas

neurológicos e alterações sanguíneas. Quando ingerido em quantidades maiores

pode provocar vômitos, tonturas e convulsões. Já quando se é exposto ao líquido e

ao vapor, pode ocorrer irritação na pele, olhos e no trato respiratório superior.

Segundo SOUSA (2008), a USEPA não definiu nenhum valor de concentração

e dose de referência. Entretanto, a CalEPA estabeleceu 0,06 mg.m-³ como valor de

referência, o que é um valor abaixo do que se espera que ocorra efeitos à saúde

humana.

18

Por sua vez, a ATSDR (2002) estabeleceu como valor mínimo para inalação

capaz de gerar intoxicação aguda a concentração de 0,2 mg/m³ e valor intermediário

de risco mínimo o valor de concentração de 0,01 mg/m³, sendo que estes valores são

baseados em efeitos imunológicos e neurológicos em ratos. Já o Brasil faz uso dos

mesmos limites impostos pela Alemanha, ou seja, os valores de referências

tecnológicos com níveis de 1,0 ppm (3,3 mg.m-3) e 2,5 ppm (8,1 mg.m-3), dependendo

da tecnologia da fonte emissora (PEZZAGNO, 1995; BRASIL, 1995).

2.1.1.1 TOXICOCINÉTICA E TOXICODINÂMICA DO BENZENO

Após o benzeno ser absorvido, ele é distribuído rapidamente pelos tecidos e

atinge maior concentração nos tecidos ricos em lipídios como o fígado, o baço, a

medula óssea e as lipoproteínas sanguíneas, devido as interações de van-der-Waals.

No entanto, apenas 30% do benzeno absorvido é eliminado sem alterações por vias

respiratórias, enquanto o restante é biotransformado no fígado e na medula óssea em

substâncias mais solúveis em água como o fenol e catecóis os quais são eliminados

pela urina em forma de conjugados com ácidos glicurônicos. Destaca-se o fato de que

após o benzeno ter adentrado no organismo, ele atua como um elemento tóxico e

torna-se perigoso independente do grau de exposição (CAZARIN, 2005).

2.1.1.2 NÍVEIS DE INTOXICAÇÃO

Os níveis de intoxicação podem ser diferenciados a partir de critérios

decorrentes de suas características. Dessa forma, ela pode variar tanto quanto a

rapidez de absorção da substância tóxica, quanto sua rapidez de aparecimento de

sinais e sintomas e sua severidade dos sintomas (CHASIN, 2003 apud LAUWERYS,

1972).

A classificação geralmente utilizada está relacionada à duração da exposição

ao agente tóxico para o aparecimento da sintomatologia. Dessa forma, a intoxicação

poderá ser:

• Aguda (curto prazo): quando a exposição e a absorção do agente tóxico são

rápidas. Geralmente, as manifestações da intoxicação se desenvolvem

rapidamente (CHASIN e AZEVEDO, 2003);

19

• Subaguda (médio prazo): quando as exposições são frequentes ou repetidas

num período de vários dias antes que os sintomas apareçam (CHASIN e

AZEVEDO, 2003);

• Crônica (longo prazo): quando as exposições repetidas durante um longo

período de tempo precisam ocorrer para se dar a intoxicação. Os sinais clínicos

podem se manifestar através da acumulação do tóxico no organismo ou pela

adição dos efeitos causados por exposições repetidas, sem a acumulação do

tóxico no organismo (CHASIN e AZEVEDO, 2003).

2.1.2 EXPOSIÇÃO AO BENZENO

Em geral, as pessoas são expostas todos os dias à uma pequena quantidade

de benzeno, oriunda de ambientes externos e internos. As formas mais comuns de

exposição são as fumaças de cigarros, as estações de serviços automobilísticos,

exaustão dos motores veiculares, as emissões industriais e os vapores dos produtos

que contem benzeno em sua composição (ASTDR, 2007). Com isso, a fim de realizar

uma avaliação na qualidade do ar de um ambiente é necessário identificar como a

saúde populacional é afetada sob uma qualidade de ar baixa e uma das formas de se

conseguir isto é realizando uma quantificação da concentração exposta (KOISTINEN

e KOTZIAS, 2008).

Dessa forma, a exposição ao benzeno é determinada pela sua concentração e

pela frequência ao longo da vida, podendo ser classificada em duas formas: a pessoal

e a populacional. A primeira tem relação a um único individuo em um dado local e um

determinado tempo e a segunda é a exposição média da população à que se fez

referência (WHO, 1999). Já com relação à exposição da população, ela pode ser

dividida em ambiental e ocupacional, podendo ocorrer através da via respiratória e da

ingestão de água ou alimento contaminado.

Destaca-se também o fato de que o composto em destaque pode inferir

diferentes sintomas para subgrupos de pessoas quanto ao sexo e a idade. Com

relação ao fator idade, verifica-se uma toxidade maior para um grupo populacional do

que ao outro, por exemplo, os idosos podem ser mais suscetíveis a alguns agentes,

20

devido a uma menor capacidade hepática de biotransformar e a renal de excretar

(CHASIN e AZEVEDO, 2003).

2.1.2.1 EXPOSIÇÃO AMBIENTAL

As principais fontes de exposição ambiental são os cigarros, emissões

industriais e veiculares, os vapores da gasolina dos veículos ou dos postos de

abastecimento população, bem como a contaminação de água e do solo (GALBRAITH

et al., 2000; COSTA et al., 2002; CARRIERI et al., 2012). Dessa forma, pode-se inferir

que grande parte da população já está exposta ao benzeno devido as fontes citadas

anteriormente (WALLACE, 1996; IIA, 1998).

Ademais, uma pesquisa foi feita para retratar a diferença entre pessoas

fumantes ativos e passivos e não fumantes, com isso, Gilli et al. (1996) pode afirmar

que pessoas não fumantes possuem uma menor quantidade de benzeno detectada

com relação as pessoas fumantes.

Outro estudo, desta vez realizado pela USEPA, de 1980 a 1987, avaliou a

exposição da população aos COV e pôde fornecer dados sobre a contaminação pelo

benzeno através do monitoramento de 800 pessoas que representasse uma média de

800.000 pessoas em oito áreas dos Estados Unidos. Analisando-se o gráfico 1,

podemos observar que as principais fontes de exposição para fumantes e não

fumantes, foram a fumaça de cigarro e a inalação de vapores e combustão de gasolina

(WALLACE, 1996).

21

Gráfico 1 - Principais fontes de exposição ao benzeno para fumantes e não fumantes, de acordo com o estudo da USEPA

Fonte: (WALLACE, 1996).

Além da contaminação atmosférica, existe embasamentos teóricos que aborda

a contaminação por meios ambientais, como a água e o solo, devido a vazamentos

de tanques das indústrias petroquímicas e de postos de armazenamento e distribuição

de combustíveis (BARATA-SILVA, MITRI, et al., 2014). Este tipo de contaminação é

preocupante, uma vez que se trata de um hidrocarboneto monoaromático que possui

uma rápida solubilidade em água, possibilitando a chegada deste composto nos

lençóis freáticos e consequentemente, afetar a população que faz uso de poços

artesianos (BRITO, OLIVEIRA, et al., 2005; TIBURTIUS, PERALTA-ZAMORA, et al.,

2005; ANJOS, 2012; LANDON e BELITZ, 2012).

2.1.2.2 EXPOSIÇÃO OCUPACIONAL

A exposição ocupacional ao benzeno retrata um complexo problema de Saúde

Pública, uma vez que aproximadamente dois milhões de trabalhadores por ano no

mundo são expostos ocupacionalmente a esta substância (NOGUEIRA, 2016). Desta

quantidade de trabalhadores, pode-se observar no gráfico 2, a porcentagem de

trabalhadores de acordo com a concentração exposta.

22

Gráfico 2 - Porcentagem de trabalhadores de postos de gasolina expostos a concentrações diferentes de benzeno

Fonte: Adaptada de (PEZZAGNO, 1995; COUTRIM, CARVALHO e ARCURI, 2000).

Mesmo o benzeno sendo um dos poluentes mais estudados no Brasil, em

termos de Saúde do Trabalhador, ainda não há dados adequados de notificação de

mortalidades, internações hospitalares e estimativas de trabalhadores expostos

(NOGUEIRA, 2016). Embora os limites estabelecidos pelo Brasil sejam baixos com

relação ao risco de contaminação, estes não asseguram uma proteção absoluta do

trabalhador pelo fato de não existir limite seguro de exposição para agentes

carcinogênicos (JOHNSON e LUCIER, 1992).

2.2 OS BIOMARCADORES

Os biomarcadores são compreendidos como toda e qualquer substância ou seu

produto de biotransformação, cuja a determinação quantitativa nos fluídos biológicos,

tecidos ou ar exalado, avalie a intensidade da exposição e o risco à saúde (WHO,

1996).

O benzeno não metabolizado pode ser determinado por três matrizes distintas:

no ar exalado, no sangue e na urina, na qual geralmente é utilizado o próprio

xenobiótico ou seus metabólitos, como o ácido trans,trans-mucônico e o ácido S-

fenilmercaptúrico. Cada biomarcador possui suas vantagens e desvantagens,

conforme segue o quadro 2.

1

4

95

Porcentagem de trabalhadores

Concentração > 10 ppm Concentração entre 1 a 5 ppm Concentração < 1 ppm

23

Quadro 2 - Vantagens e desvantagens de alguns biomarcadores de exposição ao benzeno

Biomarcador Vantagens Desvantagens

Benzeno no ar

Específico e sensível a baixas concentrações no ambiente

Amostra não homogênea

Benzeno no sangue

Biomarcador específico e sensível

Amostra muito heterogênea; processo invasivo de coleta

Benzeno urinário

Biomarcador específico e sensível

Apresentado na urina em uma pequena fração inalterada

Fenol urinário

Biomarcador sensível Ingestão de determinadas substâncias podem alterar as concentrações de fenol urinário

Ácido trans, trans-mucônico urinário

Apresenta boa correlação com benzeno no ar

Ácido sórbico como fator de confundimento; tabagismo como fator de confundimento

Ácido S-fenilmercaptúrico urinário

Biomarcador específico do benzeno

Apresenta uma baixa concentração na urina; tabagismo como fator de confundimento

Catecol e quinol urinários

Melhor correlação com benzeno no ar do que fenol

Exposição ao tolueno encontrado na gasolina causa interferência na concentração desses metabólitos

Benzenotriol ou triidroxibenzeno urinário

Apenas traços são excretados pela urina

N-Acetilcisteína e tiofenol urinários

Não são específicos, nem sensíveis

Hidroquinona urinária

Melhor correlação com benzeno no ar do que fenol

Exposição ao tolueno encontrado na gasolina causa interferência na concentração desses metabólitos

N-7 Fenilguanina urinária

Biomarcador de carcinogenicidade do benzeno, específico

Dificuldade de detecção em concentrações inferiores a 5 ppm de benzeno no ar

Adultos de hemoglobina, albumina e N-fenilvalina no sangue

Podem ser utilizados como biomarcadores de efeitos precoces; são específicos

Baixa sensibilidade devido às baixas concentrações no sangue

Aberrações cromossômicas em linfócitos no sangue e outros biomarcadores de genotoxicidade

Biomarcadores sensíveis

Podem responder a qualquer xenobiótico; não são específicos

Fonte: (CORRÊA DOS SANTOS, OLIVA FIGUEIREDO e ABEL ARCURI, 2017).

24

Embora o benzeno no sangue seja um biomarcador específico, sensível e as

concentrações de benzeno seja baixa, verifica-se a possibilidade de análise através

do método de FOE, na qual analisa-se a concentração necessário para que ocorra

algum agravo à saúde.

2.3 A POPULAÇÃO IDOSA E EXPECTATIVA DE TEMPO DE TRABALHO

O envelhecimento populacional é um processo natural que ocorre em todos os

países devido ao avanço tecnológico na área da saúde e uma maior preocupação com

a qualidade de vida vivida pela sociedade. Tal processo tem uma ocorrência maior em

populações que se tem uma baixa taxa de natalidade e elevada expectativa de vida

das pessoas.

Segundo dados da Secretaria de Direitos Humanos (2012), a quantidade de

idosos desde 2001 até 2011 aumentou em 55 %, totalizando 23,5 milhões. Atualmente

em 2018, a PNAD de 2018, verificou números superiores a 30 milhões de pessoas

maiores de 60 anos e com grande tendência a aumentar este número no decorrer dos

anos.

Conforme o aumento da população de idosos e da taxa de longevidade, muitas

dessas pessoas devem seguir em sua jornada de trabalho, na qual acarretará em uma

maior quantidade de idosos no mercado de trabalho, principalmente em tarefas em

que não necessitam estudo. No entanto, os trabalhadores maiores de 60 anos estarão

mais propícios a doenças, necessitando de um sistema de saúde mais qualificado e

versátil.

2.3.1 VULNERABILIDADE

A vulnerabilidade é um conceito definido como o estado de um grupo ou

individuo no qual se tem capacidade reduzida em sua totalidade dinâmica formadas

por aspectos que vão de suscetibilidades orgânicas à forma de estruturação de

programas de saúde, passando por aspectos comportamentais, culturais, econômicos

e políticos (AYRES, FRANÇA JÚNIOR, et al., 2003).

25

Para determinar uma maior ou menor vulnerabilidade, Ayres e França Júnior et

al. (2003) define três planos independentes: a vulnerabilidade individual, a social e a

programática, que estão associadas ao comportamento pessoal, contexto social e

ações do governo para o combate ao dano causado, respectivamente.

No presente estudo, estudaremos a vulnerabilidade de uma subpopulação

específica, uma vez que as alterações biológicas tornam o idoso um ser frágil e menos

capaz de manter a homeostase quando submetido a um estresse fisiológico. Dessa

forma, ele fica mais vulnerável às doenças e maior risco de morte (PAZ, LARA DOS

SANTOS e EIDT, 2006).

2.4 METODOLOGIA DA FRAGILIDADE OSMÓTICA DOS ERITRÓCITOS (FOE)

A fim de obter informações sobre a composição, a estrutura das membranas

eritrocitárias, bem como analisar os efeitos de substâncias na sua integridade, faz-se

necessário a aplicação de algumas abordagens bioquímicas e técnicas morfológicas,

na qual entre elas, destaca-se o teste de FOE, uma vez que trata-se de um teste de

baixo custo e eficiente na avaliação da estabilidade das membranas (MOECKEL,

SHADMAN, et al., 2002; ELIAS, LUCAS, et al., 2004; ALDRICH e SAUNDERS, 2006;

IVANOV, TOLEDOVA e CHAKAAROVA, 2007; RODRIGUES, BATISTA, et al., 2009).

Geralmente, a FOE é utilizada para diagnosticar as hemoglobinopatias

(principalmente esferocitoses), avaliar o efeito de drogas sobre a hematopoese e

identificar as alterações de membrana em portadores de câncer cervical e de apneia

obstrutiva do sono (OZTÜRK, MANSOR, et al., 2003 apud SIRICHOTIYAKUL,

TANYIPALAKON, et al., 2004).

Tal metodologia expressa a habilidade das membranas de manter sua

integridade estrutural quando são expostas a um estresse osmótico (ALDRICH e

SAUNDERS, 2006). Ao fazer uso deste tipo de teste faz-se necessário um

monitoramento da lise de eritrócitos mediante a leitura de absorbância da

hemoglobina em um espectrofotômetro com comprimento de onda ajustado em

540nm (MOECKEL, SHADMAN, et al., 2002). Destaca-se também o fato de que a

osmolaridade com que a célula sofre lise, em pacientes humanos, pode estar

26

influenciada mediante a quantidade de colesterol presente na membrana

citoplasmática, se são eritrócitos nucleados ou não nucleados, o tamanho dos

eritrócitos e a idade do paciente (MAEDE, 1980).

27

3 JUSTIFICATIVA

Com o avanço industrial, o benzeno vem sendo utilizado em processos de

produção, como também matéria-prima e solvente. A participação desse composto no

dia-a-dia da sociedade é expressiva, fazendo com que haja grande preocupação com

trabalhadores que estão expostos a tal componente, principalmente aqueles maiores

de 60 anos. Dessa forma, investigar o efeito caotrópico do benzeno (adotando uma

exposição ocupacional final do indivíduo à uma concentração de 10µL.mL-1) no

plasma sanguíneo de humanos e o perfil individual mais sensível a saúde humana por

meio da análise de citotoxicidade de eritrócitos é um estudo de interesse tanto da

saúde do trabalhador como da saúde pública.

28

4 OBJETIVOS

4.1 OBJETIVOS GERAIS

Avaliar a sensibilidade dos trabalhadores idosos à toxicidade ocupacional

induzida por benzeno pelo método de Fragilidade Osmótica Eritrocitária (FOE) e

definir o perfil individual mais suscetível à intoxicação.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Determinar os gráficos de fragilidade osmótica eritrocitária para cada indivíduo

usando uma concentração de benzeno de 10µL.mL-1 em meio de

concentrações de NaCl que variam de 0,3 a 0,6 g.dL-1;

• Ajustar cada gráfico obtido à uma sigmoide de Boltzmann e obter graficamente

os valores dos parâmetros H50, dX, Amáx e Amín;

• Comparar os parâmetros de estabilidade supracitados obtidos para os

experimentos com e sem ação caotrópica

• Avaliar os efeitos das variáveis moduladoras do eritrograma, lipidograma e

variáveis individuais (gênero e idade) e definir o perfil de maior sensibilidade à

toxicidade celular por esse toxicante.

29

5 METODOLOGIA

5.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Esse trabalho foi, previamente ao seu início, submetido ao Conselho de Ética

em Pesquisa com Humanos (CEP) por meio da Plataforma Brasil sob Certificado de

Apresentação para Apreciação Ética (CAAE) número 99728718.1.0000.5467 tendo

parecer de aprovação número 2.933.295.

5.2 AMOSTRAS DE MATERIAL BIOLÓGICO

Amostras de sangue (3,0 mL) foram coletadas de sujeitos saudáveis, não-

fumantes, não usuários de drogas ou medicamentos e, especialmente, não

consumidores de bebidas alcoólicas e maiores de 60 anos, no Laboratório Municipal

de Análises Clínicas da Prefeitura de Lorena através de punção venosa após um

período de jejum de 8-12 horas. Os sujeitos participantes foram codificados e

permaneceram incógnitos, não podendo ser identificados até mesmo se os resultados

da pesquisa puderem beneficiá-los. O sangue foi coletado em tubos evacuados

contendo 50,0 μL de K3EDTA a 25 mmol/L e seguiu a rotina de análise do laboratório

onde foram processados o eritrograma e lipidograma. O sangue total não usado e

considerado material de descarte foi, em no máximo 24 horas da sua obtenção,

cedidos à Universidade de São Paulo para o estudo a que se propõe esse trabalho,

conforme a figura 2. O sangue total foi transportado em recipiente acondicionado em

ambiente refrigerado e mantido entre 0oC a 4ºC até o momento da análise.

30

Figura 2 - Amostras de sangue cedidas à Universidade

Fonte: Próprio Autor.

5.3 REAGENTES

Os reagentes: benzeno e NaCl foram de grau ACS de pureza e obtidos por meio

do Laboratório de Engenharia Ambiental ligado ao Departamento de Ciências Básicas

e Ambientais da EEL-USP.

5.4 TESTES DE FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITARIA EM HUMANOS

Os experimentos foram processados pelo método FOE utilizado por Bernardino

Neto, De Avelar, et al. (2013). Para a determinação dos efeitos citotóxicos do benzeno

sobre a estabilidade dos eritrócitos humanos, foram usadas, para cada amostra de

sangue total, duas baterias de 8 tubos eppendorfs em duplicata (figura 3), sendo uma

com 20,0 µL de benzeno (concentração de 10µL.mL-1) por tubo e outra sem o

caotrópico. Em ambas o meio foi composto por 2,0 mL de NaCl cuja concentração

variou de 0,3 a 0,6 g.dL-1. Cada bateria de 16 tubos eppendorfs contendo solução

salina foi então pré-incubada a temperatura de 37.5ºC por 15 minutos sendo que, após

esse tempo, os tubos receberam por meio de pipeta automática 20,0 µL de sangue

total. Cada tubo eppendorf foi então homogeneizado e incubado a temperatura de

37.5º C por 30 minutos. Após a incubação os tubos foram centrifugados por 2 minutos

a 1600 x g e a 20oC, os sobrenadantes foram cuidadosamente removidos com pipeta

automática e submetidos a leitura de absorvância a 540 nm (A540) em

espectrofotômetro UV-VIS. Os gráficos de A540 em função à concentração salina do

31

meio foram ajustados à regressão sigmoidal de linhas, de acordo com a equação de

Boltzmann por meio da fórmula:

A540=Amáx - Amín

1+ e(X - H50)/dX + Amín

Onde Amáx e Amín são os valores que representam os patamares máximo e mínimo de

hemólise, X é a concentração de toxicante, H50 representa a concentração salina

capaz de provocar 50% de hemólise, e dX representa a amplitude de concentração

salina da transição sigmoidal entre Amáx e Amín, conforme demonstrada no gráfico 3.

Figura 3 – Exemplo de amostras em duplicata sem o sangue


Gráfico 3 - Curva ajustada a regressão sigmoidal de acordo com a equação de Boltzmann com os parâmetros de estabilidade

Fonte: (PARAISO, DE FREITAS, et al., 2014).

32

5.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA DE DADOS

Os efeitos citotóxicos do benzeno foram avaliados por meio dos parâmetros de

estabilidade supracitados. Tais parâmetros foram obtidos graficamente pelo Software

OriginPro 9.0 (MicroCal ™, Northampton, MA, EUA). Os grupos intervenção (com

caotrópico) e controle (sem caotrópico) foram comparados por meio de testes de

comparação de ranks de Wilcoxon e as características de base da população foram

descritas por meio do valor mínimo, primeiro quartil, mediana, terceiro quartil, valor

máximo e desvio interquartílico (DIQ).

No afã de avaliar associações entre a estabilidade celular e variáveis individuais

tanto no grupo intervenção quanto no grupo controle, as variáveis do eritrograma,

lipidograma e individuais foram testadas pelo teste de correlação de Spearman quanto

à sua correlação com os parâmetros de estabilidade. Todos os testes foram

processados visando erro tipo I não superior à 0,05.

33

6 RESULTADOS

6.1 TESTE DE FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITÁRIA (FOE)

Primeiramente, ao final do processo, pode-se observar os seguintes

sobrenadantes das amostras sem benzeno (figura 4) e com benzeno (figura 5). Após

a leitura destes sobrenadantes no espectrofotômetro UV-VIS a um comprimento de

onda de 540nm, obteve-se dados da concentração de hemoglobina e construiu-se

curvas de dependência de hemólise em função da concentração de NaCl, na qual

foram ajustadas segundo a equação de Boltzmann para um total de 12 amostras

diferentes de sangue, diferenciando-se na presença ou não do caotrópico (benzeno),

conforme pode-se observar nos gráficos 4 e 5, respectivamente.

Figura 4 - Amostras após centrifugação sem caotrópico


Figura 5 - Amostras após centrifugação com caotrópico


34

Gráfico 4 - Curva da dependência de hemólise sem benzeno


Gráfico 5 - Curva da dependência de hemólise com 10µL.mL-1 de benzeno


Utilizando o software OriginPro 9.5 (MicroCal ™, Northampton, MA, EUA),

ajustou-se a curva em linhas que seguem a regressão sigmoidal, a partir da qual

obtemos os parâmetros de estabilidade A1, A2, dX e H50, ou seja, valores de

identificação da estabilidade da membrana.

6.2 ANÁLISE DESCRITIVA EXPLORATÓRIA

Para obter uma melhor forma de análise estatística, utilizou-se inicialmente o

software Minitab ® 17 para realizar a análise descritiva exploratória dos parâmetros

de estabilidade A1, A2, dX, H50 e dX/H50, além das variáveis do eritrograma,

35

lipidograma e variáveis individuais. Para tal, foram calculados o valor mínimo, o

primeiro quartil, a mediana, o terceiro quartil, valor máximo e o intervalo interquartil,

além do teste de normalidade de Liliefors. Ressalta-se também que esses parâmetros,

foram tratados separadamente na ausência e na presença do caotrópico, conforme

as tabelas 2 e 3, respectivamente.

36

Tabela 2 - Análise descritiva dos parâmetros de estabilidade sem o caotrópico

Variável Tamanho da amostra Mínimo Primeiro Quartil (25%) Mediana Terceiro Quartil (75%) Máximo Desvio Interquartílico

A1 12 0.9626 1.0107 1.0956 1.2073 1.5308 0.1966

A2 12 -0.1498 0.0351 0.0916 0.1072 0.1458 0.0720

dX 12 0.01125 0.01294 0.02276 0.03886 0.05509 0.02592

H50 12 0.4324 0.4454 0.4594 0.4907 0.5693 0.0453

dX/H50 12 0.02513 0.02856 0.05004 0.07647 0.10573 0.04792 Fonte: Próprio autor.

Tabela 3 - Análise descritiva dos parâmetros de estabilidade com o caotrópico

Fonte: Próprio autor.

Variável Tamanho da amostra Mínimo Primeiro Quartil (25%) Mediana Terceiro Quartil (75%) Máximo Desvio Interquartílico

A1 12 1.0069 1.0465 1.0801 1.2271 1.4210 0.1806

A2 12 0.0985 0.1688 0.2103 0.3359 0.5308 0.1671

dX 12 0.00056 0.01483 0.02157 0.02681 0.03224 0.01198

H50 12 0.39954 0.40996 0.42436 0.44025 0.48174 0.03029

dX/H50 12 0.00116 0.03416 0.05024 0.06669 0.07769 0.03253

37

Após a análise descritiva dos parâmetros de estabilidade, realizou-se a mesma

análise paras as variáveis do eritrograma, lipidograma, idade e gênero, conforme

apresentado na tabela 4.

Diante dos dados amostrados, pode-se inferir que se analisou 8 amostras

sanguíneas do gênero feminino e 4 do gênero masculino, ou seja, cerca de 75 % das

amostras eram de sangue do gênero feminino. A variação das idades foi de no mínimo

61 anos ao máximo de 82, destacando uma mediana de 68 anos. No que se refere as

variáveis analisadas do eritrograma, observa-se que o grupo apresenta níveis

aceitáveis, entretanto, com referência ao lipidograma, vale realçar que os triglicerídeos

estão em classificação limítrofe.

38

Tabela 4 - Análise descritiva exploratória das variáveis do eritograma e lipidograma

Variável Tamanho da

amostra Mínimo

Primeiro Quartil (25%)

Mediana Terceiro Quartil

(75%) Máximo

Desvio Interquartílico

Idade (anos)

Gênero F (%)

12

75.00

61.00

-

65.00

-

68.00

-

77.75

-

82.00

-

12.75

-

Hemácias (milhões/mm³)

12 4.130 4.212 4.715 5.393 5.690 1.180

Hb (mg/dL) 12 11.100 12.175 13.300 15.275 17.000 3.100

Ht (%) 12 36.10 39.58 42.10 47.08 53.50 7.50

VCM (fL) 12 78.80 84.53 89.65 95.35 105.60 10.82

HCM (fL) 12 24.200 26.725 28.900 30.650 34.300 3.925

CHCM (%) 12 30.500 31.100 31.700 32.350 33.500 1.250

Pt (10³/mm³) 12 210.0 245.0 293.0 345.5 399.0 100.5

t-Col 12 120.0 151.0 186.0 214.8 234.0 63.8

LDL (mg/dL) 12 26.00 57.25 95.00 113.75 127.00 56.50

HDL (mg/dL) 12 33.00 42.75 50.00 56.75 113.00 14.00

VLDL (mg/dL) 12 20.00 37.25 46.00 54.75 66.00 17.50

TG (mg/dL) 12 100.0 185.0 230.0 274.3 330.0 89.3


39

6.3 TESTE DE NORMALIDADE LILLIEFORS

Para inferir qual tipo de teste estatístico de comparação realizar é necessário

investigar sobre a normalidade das amostras. Dessa forma, os resultados do teste

indicaram que alguns dados não são provenientes de uma população distribuída

normalmente. Diante disso, optou-se pelo teste de normalidade de Lilliefors para

verificar a normalidade das variáveis.

Conforme pode ser visto nas tabelas 5, 6 e 7, os dados mostraram ser

distribuídos de forma normal em sua maioria, visto que os resultados dos testes de

normalidade de Lilliefors geraram p-valor maior do que o nível de significância de 5%

(0.05), deixando-se de rejeitar assim a hipótese nula de distribuição normal. No

entanto, como não foi provada normalidade em todas as variáveis, a estratégia não-

paramétrica de análise foi escolhida.

Tabela 5 - Teste de normalidade Lilliefors para os parâmetros de estabilidade sem caotrópico

Sem caotrópico

A1 A2 dX H50 dX/H50

Tamanho da Amostra

12 12 12 12 12

Desvio máximo 0.1622 0.3533 0.1671 0.2060 0.1663 Valor crítico (0.05) 0.2420 0.2420 0.2420 0.2420 0.2420 Valor crítico (0.01) 0.2750 0.2750 0.2750 0.2750 0.2750

p(valor) Ns <0.01 ns ns Ns


Tabela 6 - Teste de normalidade Lilliefors para os parâmetros de estabilidade com caotrópico

Com caotrópico

A1 A2 dX H50 dX/H50

Tamanho da Amostra

12 12 12 12 12

Desvio máximo 0.2343 0.1891 0.1612 0.1878 0.1481 Valor crítico (0.05) 0.2420 0.2420 0.2420 0.2420 0.2420 Valor crítico (0.01) 0.2750 0.2750 0.2750 0.2750 0.2750

p(valor) Ns ns ns ns Ns


40

Tabela 7 - Teste de normalidade Lilliefors das variáveis do eritrograma e lipidograma

Tamanho da Amostra Desvio máximo

Valor crítico p(valor)

(0.05) (0.01)

Idade (anos) 12 0.1784 0.2420 0.2750 ns

Hemácias (milhões/mm³) 12 0.1672 0.2420 0.2750 ns

Hemoglobina (mg/dL) 12 0.1797 0.2420 0.2750 ns

Hematócito (%) 12 0.1708 0.2420 0.2750 ns

VCM (fL) 12 0.0934 0.2420 0.2750 ns

HCM (pg) 12 0.1440 0.2420 0.2750 ns

CHCM (%) 12 0.1039 0.2420 0.2750 ns

Plaquetas (10³/mm³) 12 0.1606 0.2420 0.2750 ns

t-Colesterol (mg/dL) 12 0.1301 0.2420 0.2750 ns

LDL (mg/dL) 12 0.1687 0.2420 0.2750 ns

HDL (mg/dL) 12 0.2654 0.2420 0.2750 <0.05

VLDL (mg/dL) 12 0.1423 0.2420 0.2750 ns

Triglicerídeos (mg/dL) 12 0.1331 0.2420 0.2750 ns


41

6.4 TESTE DE COMPARAÇÃO NÃO-PARAMÉTRICO DE WILCOXON

O teste de comparação de Wilcoxon (Wilcoxon Matched-Pairs; Wilcoxon

signed-ranks test) é um teste não-paramétrico para comparação de duas amostras

pareadas com objetivo de verificar a existência de diferenças significativas entre os

resultados nas situações propostas.

A comparação dos valores de dX entre os grupos tratamento e controle não

mostrou diferença significante (p = 0.4328) (tabela 8). Entretanto a comparação dos

valores de H50 entre os mesmos grupos mostrou diferença significante (p-valor =

0.0022) (tabela 9).

Gráfico 6 - Teste de Comparação Wilcoxon de dX sem e com caotrópico


42

Gráfico 7 - Teste de Comparação Wilcoxon de H50 sem e com caotrópico


Tabela 8 - Teste de comparação de Wilcoxon de dX sem e com caotrópico

Grupo intervenção x Grupo controle

Número de pares 12

Z 0.7845

p-valor (bilateral) 0.4328


Tabela 9 - Teste de comparação de Wilcoxon de H50 sem e com caotrópico

Grupo intervenção x Grupo controle

Número de pares 12

Z 3.0594

p-valor (bilateral) 0.0022


6.5 BUSCAS DE CORRELAÇÕES A PARTIR DA CORRELAÇÃO DE RHÔ (ρ) DE

SPEARMAN

Como visto anteriormente, as variáveis em análise não apresentam distribuição

normal. Sendo assim, a busca de correlações deve ser processada por meio de testes

43

não paramétricos e, nesse estudo, optou-se pelo teste de Spearman (ρ). Este

coeficiente pode evidenciar tanto relação crescente quanto decrescente e o valor de

ρ pode variar de -1 a 1, sendo que quanto mais distante de zero, maior será a

associação entre as variáveis. Convenciona-se coeficiente menor do que 0.3 como

correlação fraca, entre 0.3 e 0.7 moderada e maior que 0.7 correlação forte.

Os resultados dos testes de correlação das variáveis do eritrograma,

lipidograma e variáveis individuais com os parâmetros de estabilidade em ambos os

grupos estudados, foram organizados na tabela 10. Apenas 4 correlações

significantes foram encontradas com os parâmetros de estabilidade. O grupo

intervenção mostrou correlação moderada, inversa e significante entre Ht e dx ou

dx/H50 (p =0.04737), ao passo que o grupo controle mostrou correlação moderada,

inversa e significante entre CHCM e dx (p = 0,04574) ou dx/H50 (p = 0.0382). Algumas

correlações conhecidas na literatura com os parâmetros de estabilidade não foram

encontradas. Não houve significância as correlações entre dx, H50 ou dx/H50 e idade,

gênero, colesterol total, LDL e HDL.

44

Tabela 10 - Coeficientes de correlações de Spearman (ρ) e os níveis de significância (Sig)

dX* dX** H50* H50** dX/H50* dX/H50**

Gênero Corr. 0.19512 0.13937 -0.08362 0.02787 0.25087 0.13937

Gênero Sig. 0.54337 0.66574 0.79611 9.31E-01 4.32E-01 0.66574

Idade (anos) Corr. 0.19684 0.10896 -0.15817 0.12654 0.22847 0.10896

Idade (anos) Sig. 0.53976 0.73604 0.62344 6.95E-01 4.75E-01 0.73604

Hemácias (mi/mm³) Corr. 0.32168 -0.51748 0.30769 0.36364 0.20979 -0.51748

Hemácias (mi/mm³) Sig. 0.30791 0.08487 0.33059 2.45E-01 5.13E-01 0.08487

Hb (mg/dL) Corr. -0.08757 -0.42382 0.32224 0.15061 -0.14711 -0.42382

Hb (mg/dL) Sig. 0.78669 0.16975 0.30701 6.40E-01 6.48E-01 0.16975

Ht (%) Corr. 0.08757 -0.58144 0.43082 0.28722 0.03503 -0.58144

Ht (%) Sig. 0.78669 0.04737 0.16206 3.65E-01 9.14E-01 0.04737

VCM (fL) Corr. -0.21678 0.00699 0.20979 -0.07692 -0.16084 0.00699

VCM (fL) Sig. 0.49856 0.98279 0.51284 8.12E-01 6.18E-01 0.98279

HCM (pg) Corr. -0.23776 -0.05594 0.23077 -0.02098 -0.1958 -0.05594

HCM (pg) Sig. 0.4568 0.8629 0.47053 9.48E-01 5.42E-01 0.8629

CHCM (%) Corr. -0.58494 0.01751 -0.12259 -0.31524 -0.60245 0.01751

CHCM (%) Sig. 0.04574 0.95692 0.70427 3.18E-01 3.82E-02 0.95692

Plaquetas (10³/mm³) Corr. -0.00701 0.15061 -0.06305 -0.07005 0.08406 0.15061

Plaquetas (10³/mm³) Sig. 0.98276 0.64033 0.84566 8.29E-01 7.95E-01 0.64033

t-Col (mg/dL) Corr. 0 0.19965 -0.30473 -0.16112 0.09807 0.19965

t-Col (mg/dL) Sig. 1 0.53387 0.3355 6.17E-01 7.62E-01 0.53387

LDL (mg/dL) Corr. -0.17483 0.29371 -0.3986 -0.18881 -0.09091 0.29371

LDL (mg/dL) Sig. 0.58682 0.35415 0.19933 5.57E-01 7.79E-01 0.35415

HDL (mg/dL) Corr. 0.23199 0.24956 0.04921 0.03515 0.28823 0.24956

HDL (mg/dL) Sig. 0.46812 0.43407 0.87929 9.14E-01 3.64E-01 0.43407

VLDL (mg/dL) Corr. 0.06294 -0.3986 0.18182 0.2028 0.04895 -0.3986

VLDL (mg/dL) Sig. 0.84593 0.19933 0.5717 5.27E-01 8.80E-01 0.19933

Triglicerídeos (mg/dL) Corr. 0.06294 -0.3986 0.18182 0.2028 0.04895 -0.3986

Triglicerídeos (mg/dL) Sig. 0.84593 0.19933 0.5717 5.27E-01 8.80E-01 0.19933

* Sem caotrópico; ** Com caotrópico


45

7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

Neste presente estudo, analisou-se o efeito da concentração crescente de

NaCL (0.3 a 0.6 g.dL-1) com relação a exposição final do indivíduo de 10µL.mL-1 sobre

12 indivíduos distintos com mais de 60 anos, sendo 75% dos indivíduos do gênero

feminino. Para o teste de FOE, observou-se que conforme aumentava a concentração

do sal, o gradiente da lise de eritrócitos decrescia, ou seja, quanto maior concentração

salina, mais estáveis serão os eritrócitos.

A análise descritiva exploratória dos indivíduos não demonstrou nenhuma

variável com comportamento anormal que poderia ter influenciado no método

utilizado. Os experimentos foram processados de modo pareado, destarte, as

variáveis externas moduladoras não exercem influência sobre análises realizadas na

amostragem com ou sem caotrópico.

O teste não paramétrico de Wilcoxon foi utilizado para comparar as variáveis

dX e H50 entre os grupos intervenção e controle. A partir deste teste, identificou-se

que a variável H50, concentração de NaCl que promove 50% de hemólise, mostrou

diferenças significantes entre os grupos analisados. No entanto, ao comparar pelo

mesmo teste a variável dX, variação da concentração de NaCl capaz de levar células

integras à lise, percebe-se que o benzeno não provocou diferença significante.

De acordo com Cunha (2013), as variáveis dX e H50 estão relacionadas

diretamente com a estabilidade da membrana. Enquanto a variável dX é diretamente

proporcional, o H50 é inversamente proporcional à estabilidade. Mediante a este fato,

mesmo que o parâmetro dX nas análises descritivas seja menor nos experimentos

com benzeno, não se pode inferir nada sobre a estabilidade celular, uma vez que não

apresentou diferença significativa no teste de Wilcoxon. Entretanto, com relação ao

parâmetro H50, além deste ser menor na presença do caotrópico, o teste de

comparação demonstrou diferença significativa, o que indica uma maior estabilidade

celular e consequentemente, menor fragilidade osmótica dos eritrócitos.

Era de se esperar que os experimentos com benzeno fossem gerar menor

estabilidade celular e então a ocorrência de maior lise da célula. Contudo, conforme

as curvas, as análises descritivas e testes de comparação fornecidos por este

trabalho, pode-se inferir que o meio com o composto tóxico aumentou a estabilidade

46

celular. Tal ocorrência pode ser explicada pelo fato de que uma substância hidrofóbica

como um solvente orgânico, provoca aumento da entropia do meio através da

formação de uma camada de moléculas de água organizadas ao seu redor. Essa

camada organizada de moléculas de água minimiza o contato do solvente orgânico

com o meio e reduzir a perturbação produzida por ele no sistema. Ao prender

moléculas de água, o caotrópico diminui a disponibilidade de água extracelular, o que

leva a perda de água por parte dos eritrócitos, assim, os eritrócitos murcham. Este

fato pode ser observado na figura 6. A redução do volume das células provoca

aproximação dos fosfolipídios de membrana com consequente aumento da

intensidade das forças atrativas de van-der-Waals e maior estabilidade da membrana.

Figura 6 - Processo ilustrativo da ação do benzeno em meio salino no eritrócito

Fonte: Próprio autor.

Posteriormente a comparação feita pelo teste de Wilcoxon, prosseguiu-se para

a busca de correlações das variáveis dos parâmetros de estabilidade celular com as

variáveis fornecidas pelo hemograma (eritrograma, lipidograma, idade e gênero). Tal

investigação tem como objetivo identificar o perfil mais suscetível à ação do benzeno,

ou seja, identificar as variáveis do eritrograma, lipidograma e variáveis individuais que

caracterizam o indivíduo mais vulnerável à ação caotrópica do agente em estudo. Para

se buscar tais correlações, utilizou-se do teste de ρ de Spearman, teste utilizado para

47

amostras consideradas distribuídas não normalmente. O resultado não encontrou

correlações já vistas na literatura como entre os parâmetros de estabilidade e idade,

gênero, t-Col, LDL, VLDL e triglicerídeos.

De acordo com Bernardino Neto (2011), o parâmetro dX apresenta

dependência significante com o t-Col e o LDL, enquanto o parâmetro H50 apresenta

dependência significante com o LDL, o VLDL e os triglicerídeos. Já com relação aos

parâmetros de estabilidade com idade e gênero, Garrote Filho (2014) explicita bem

que as mulheres possuem menores quantidades de eritrócitos e os eritrócitos de

idosos são osmoticamente mais resistentes, ou seja, deixando claro a relação com os

parâmetros de estabilidade. A não correlação encontrada no presente estudo, pode

estar associada à não equivalência entre mulheres e homens, bem como os altos

valores de triglicerídeos dos indivíduos analisados e o tamanho n-amostral.

Algumas correlações significantes encontradas foram contraditórias, ou seja, a

correlação não condiz com aquelas já descritas na literatura. Destaca-se para a

correlação inversa entre o dX e o dX/H50 (grupo intervenção) com o Ht. Sendo o

hematócrito a porcentagem de volume ocupada pelos eritrócitos, deveria apresentar

relação direta com a estabilidade celular e, portanto, com o dX. Também a correlação

inversa do dX e o dX/H50 (grupo controle) com o CHCM, não foi verificada no grupo

intervenção. Era de se esperar correlação direta entre concentração do meio e CHCM,

visto que quanto menor diferença de gradiente de concentração menor choque

osmótico e maior estabilidade celular. Seguramente o n-amostral levou à algumas

associações enganosas ou falácias ecológicas que estão estreitamente ligadas à

população em estudo, mas não pode ser estendida à população em geral.

48

8 CONCLUSÃO

Com a finalidade de avaliar o efeito do benzeno sobre a estabilidade celular por

meio de dX e H5. Os resultados encontrados nesse trabalho evidenciaram que esse

hidrocarboneto aromático, em pequenas quantidades, gera uma maior estabilidade

dos eritrócitos, diminuindo sua fragilidade osmótica. Contudo, apesar do composto

químico tornar as células mais estáveis, não significa que elas sejam mais saudáveis,

uma vez que estabilidade de membrana aumentada pode levar a célula à menor

flexibilidade e/ou externalização de receptores e menor funcionalidade. Estudos

posteriores com maior n-amostral são necessários para se estabelecer o perfil de

maior suscetibilidade à citotoxicidade por benzeno, perfil esse que não pôde ser

definido pela população em estudo nesse trabalho.

49

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