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Universidade de Lisboa
Faculdade de Medicina de Lisboa
Estudo epidemiológico e molecular da infecção por Rotavírus,
numa população pediátrica
Ana Cristina Faria Boto
Mestrado em Microbiologia Clínica
2008
Esta dissertação foi aprovada pela Comissão Coordenadora do
Conselho Científico da Faculdade de Medicina da Universidade de
Lisboa em 23 de Setembro de 2008
Universidade de Lisboa
Faculdade de Medicina de Lisboa
Estudo epidemiológico e molecular da infecção por Rotavírus,
numa população pediátrica
Ana Cristina Faria Boto
Mestrado em Microbiologia Clínica
Dissertação Orientada pelo Professor Doutor Pedro Simas
Todas as afirmações efectuadas no presente documento são da exclusiva
responsabilidade da sua autora, não cabendo qualquer responsabilidade à Faculdade de
Medicina de Lisboa pelos conteúdos nele apresentados.
iii
“ A alegria de ver e entender é o dom mais perfeito da natureza”
Albert Einstein
Este projecto é dedicado ao Pedro, Lourenço e Inês,
Fontes de inspiração diária!
iv
Agradecimentos
À Professora Doutora Ana Serrão Neto, coordenadora da Unidade Funcional de
Pediatria do Hospital Cuf Descobertas. Quando nos conhecemos há três anos
compreendi que tínhamos objectivos comuns e que a nossa actividade conjunta poderia
levar à concretização de projectos muito positivos. Este trabalho é resultado dessa
vontade!
Ao Professor Doutor Pedro Simas, pelo interesse e motivação demonstrados desde o
início deste projecto. Pela confiança nas capacidades de aprendizagem de novas
metodologias e de adaptação a um ritmo de trabalho tão distinto do meu dia-a-dia.
Obrigado!
A todo o grupo de investigadoras da Unidade de Patogénese Viral no IMM: à Sofia, à
Teresa, à Lénia, à Filipa, à Marta Miranda e à Marta Alenquer. Foram óptimas
orientadoras, excelente companhia e tornaram o meu trabalho de laboratório, um prazer.
Foram um incentivo permanente, uma fonte de motivação semanal e, acima de tudo,
tornaram-se amigas!
A todos os meus amigos que, desde sempre, torcem pelos meus sucessos!
Índice
1
Índice
Índice de figuras
Índice de tabelas
Resumo
Abstract
Abreviaturas
1. Introdução
1.1. Introdução Geral
1.2 Rotavírus
1.2.1. História
1.2.2. Classificação Taxonómica do Rotavírus
1.2.3. Morfologia e Estrutura Tridimensional
1.2.4. Propriedades Físico-Químicas do Rotavírus
1.2.5. Estrutura Genética e Proteica
1.2.6. Composição antigénica
1.2.7. Classificação do Rotavírus
1.2.7.1. Grupo e Subgrupo
1.2.7.2. Serótipos e Genótipos
1.2.8. Replicação viral e Patogénese
1.2.9 Transmissão
1.2.10. Imunidade natural
1.2.11. Manifestações Clínicas, Diagnóstico e Tratamento
1.2.12. Epidemiologia da Infecção a Rotavírus
1.2.13. Mecanismos Evolutivos do Rotavírus
1.2.14. Prevenção e Controle da Doença
1.2.15. Objectivos do estudo
2. Materiais e Métodos
2.1. Materiais
2.1.1. População
2.1.2. Amostras
2.1.2.1. Determinação de antigénio de Rotavírus nas fezes
2.2. Trabalho Experimental
3
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55
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57
Índice
2
2.3. Procedimentos Laboratoriais
2.3.1. Extracção do RNA Viral
2.3.2. Transcrição Reversa
2.3.3. Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR)
2.3.4. Electroforese em Gel de Agarose
2.3.5. Sequenciação de DNA
2.4. Análise estatística
3. Resultados e Discussão
3.1. Genotipagem
3.2. Sequenciação
3.3. Características demográficas e epidemiológicas dos dois grupos amostrais
3.3.1. Dados demográficos e epidemiológicos do grupo amostral Rotavírus
positivo
3.3.2. Dados demográficos e epidemiológicos do grupo amostral controle
3.4. Comparação entre os dois grupos
4. Conclusões
5. Perspectivas Futuras
Referências Bibliográficas
Anexo I
Anexo II
58
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59
61
65
66
69
71
71
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80
80
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94
98
101
118
120
Índice
3
Índice de Figuras
Figura 1.1
Figura 1.2
Figura 1.3
Figura 2.1
Figura 2.2
Figura 3.1
Figura 3.2
Figura 3.3
Figura 3.4
Figura 3.5
13
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56
58
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73
73
74
74
Índice
4
Índice de Tabelas
Tabela 2.1
Tabela 2.2
Tabela 2.3
Tabela 2.4
Tabela 3.1
Tabela 3.2
Tabela 3.3
Tabela 3.4
Tabela 3.5
Tabela 3.6
Tabela 3.7
Tabela 3.8
Tabela 3.9
Tabela 3.10
Tabela 3.11
Tabela 3.12
Tabela 3.13
64
64
64
65
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79
79
79
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81
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88
Resumo
5
Resumo
A gastroenterite aguda (GEA) infecciosa é muito frequente na idade pediátrica e os
agentes etiológicos mais frequentes são os vírus. O Rotavírus é considerado o principal
causador de GEA em crianças e está associado às formas mais graves desta doença.
Esta infecção tem uma distribuição universal e afecta todos os grupos sociais,
independentemente dos cuidados de saneamento, recursos sociais e económicos. A
incidência anual é muito elevada e semelhante em diferentes regiões do globo.
O Rotavírus é um vírus sem invólucro, de forma icosaédrica, com dupla cadeia de RNA.
O genoma formado por 11 segmentos de RNA, origina 12 proteínas virais. Duas destas
proteínas, a VP4 e VP7, são responsáveis pela indução de anticorpos neutralizadores e
levam à aquisição de memória imunológica pelo hospedeiro. Estas mesmas proteínas
estão na base da classificação em genótipos. A infecção humana está associada,
sobretudo, aos genótipos G1, G2, G3, G4 e G9, em associação frequente com os
genótipos P[8] e P[4]. A ocorrência frequente de fenómenos de reassortment e mutação
pontual condiciona o aparecimento de novos genótipos e modificação temporal na sua
frequência, por isso, o conhecimento da epidemiologia regional é imprescindível na
vigilância desta doença.
Em Portugal não se efectua a recolha de dados epidemiológicos e moleculares sobre a
infecção a Rotavírus. O seu conhecimento pode condicionar a aplicação das vacinas e
ajudar na adopção de orientações esclarecidas sobre esta matéria.
O presente projecto teve como objectivo principal a identificação dos genótipos de
Rotavírus mais prevalentes na região de Lisboa durante treze meses consecutivos (1 de
Resumo
6
Dezembro de 2006 a 31 de Dezembro de 2007). Usou-se como população em estudo um
conjunto de crianças com menos de cinco anos, internadas por GEA.
Adicionalmente procurou definir-se a importância relativa desta infecção em relação aos
internamentos por GEA, em crianças da mesma idade, na mesma área e no mesmo
período de tempo. A caracterização demográfica e epidemiológica das duas populações
(amostral e controle) procurou comparar características destes grupos de GEA e
determinar possíveis factores de risco para infecção a Rotavírus.
Palavras-chave: Rotavírus, GEA, epidemiologia, genótipos, vacina.
Abstract
7
Abstract
Acute gastroenteritis (AGE) is a common disease in childhood. Viruses are among the
most frequent etiological agents and Rotavírus is the principal virus associated with
AGE in children less than five years, specially the most severe cases. Rotavirus
infection is universal affecting all economic and social groups, in industrialized
countries as well as in development countries. Annual incidence is high and similar in
different regions.
Rotavírus is a small, non-enveloped, icosaedric virus, with dsRNA. His genome is
divided in 11 segments responsible for the production of 12 proteins. Of these, VP4 and
VP7 are responsible for the induction of neutralizing antibodies, which in turn are the
basis of acquired immunity to Rotavirus. Human infection is specially associated with
five G genotypes, G1, G2, G3, G4 and G9, in association with P genotypes P[8] and
P[4]. The occurrence of reassortment and point mutations are the basis for the
emergence of new genotypes and temporal modifications in their incidence so this
knowledge is important for disease surveillance and control.
In Portugal there aren’t epidemiological and molecular data on this matter and this
knowledge may determine the decision to recommend childhood vaccination for
Rotavirus.
The present study pretended to determine Rotavirus genotypes prevalence in a selected
population of children less than five years, hospitalized in three Lisbon Pediatric
hospitals, during a 13 month period (from December, 1st, 2006 to December, 31st,
2007). Additionally Rotavirus isolates were compared with a control population in order
to access its clinical importance in childhood GEA hospitalization during this period in
Abstract
8
the same area. Demographic and epidemiologic population characteristics were
evaluated and compared with the selected control population. Possible risk factors for
Rotavirus AGE were determined for the population study.
Keywords: Rotavirus, AGE, epidemiology, genotypes, vaccine.
Abreviaturas
9
Abreviaturas
AAP American Academy of Paediatrics
ACIP Advisory Committee on Immunization Practices
BLAST Basic Local Alignment and Search Tool
cDNA Ácido Desoxirribonucleico complementar
CVI Children’s Vaccine Initiative
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DNase Desoxirribonuclease
dNTP Desoxirribonucleotídeos Trifosfatos
dsDNA double stranded DNA
EDTA Ácido EtilenoDiaminaTetracético
ELISA Enzyme Lynked ImmunoSorbent Assay
EVL Enteric Virus Laboratory
GAVI Global Alliance for Vaccines and Immunization
GEA Gastroenterite Aguda
HPA Health Protection Agency
ID Intestino Delgado
IMM Instituto de Medicina Molecular
IOM Institute of Medicicne
M-MLV Moloney Murine Leukemia Virus
mRNA RNA mensageiro
NCBI National Center for Biological Information
ND Não Determinado
NIH National Institute of Health
Nm Nanómetro
NSP Non Structural Protein
NTPase Nucleósido Trifosfatase
OMS Organização Mundial de Saúde
ORF Open Reading Frame
PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
PBS Phosphate-Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
Abreviaturas
10
RNA Ácido Ribonucleico
RNase Ribonuclease
rpm Rotações por minuto
RT-PCR Reverse Transcription-PCR
SG Subgrupo
SNE Sistema Nervoso Entérico
ss-DNA single stranded DNA
TAE Tris-Ácido Acético-EDTA
TBE Tris-Borato-EDTA
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
UNICEF United Nations Children’s Fund
VP Viral Proteins
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
Introdução
12
1. Introdução
1.1. Introdução Geral
A GEA é uma das principais doenças infecciosas da infância a nível global. O seu peso
social, económico e de saúde pública é enorme e estima-se que esteja entre as cinco
maiores causas de morbilidade e mortalidade infantil no mundo, a par de outras
afecções potencialmente tratáveis, tais como, pneumonia bacteriana, malária, sarampo e
mal nutrição (50, 62, 100, 139, 153).
As GEA podem ser causadas por vírus, bactérias, fungos e parasitas, mas o Rotavírus é
considerado o principal agente etiológico desta infecção. O facto de ser ubiquitário, com
uma distribuição universal, e ter uma elevada facilidade de contágio torna-o difícil de
erradicar e confere-lhe uma grande importância clínica e epidemiológica (22, 27, 31, 61, 64, 65,
88, 117, 120, 143). Ao longo das duas últimas décadas tem sido possível diminuir a
mortalidade associada ao Rotavírus mas, mesmo assim, calcula-se que ocorram mais de
100 milhões de episódios de GEA rotavírica por ano, com 25 milhões de consultas
médicas associadas e 2 milhões de hospitalizações, em crianças com menos de 5 anos.
A mortalidade é significativa nos países menos favorecidos, com menores recursos
socio-económicos. Nestas regiões ocorrem 85 a 90% dos óbitos relacionados com
Rotavírus. Pelo contrário, nas zonas mais ricas do globo os custos sociais e morbilidade
são elevados, embora a mortalidade seja reduzida (2, 9, 15, 20, 25, 47, 53, 54, 59, 60, 61, 65, 68, 117, 144).
A incidência anual tem permanecido estável ao longo dos anos em todas as regiões do
globo, facto que traduz a ineficácia das medidas de controlo de infecção nesta doença
(153). Os estudos epidemiológicos referem que cada criança poderá ter cerca de dois
episódios de diarreia por ano e que aos cinco anos já todas terão tido pelo menos um
Introdução
13
episódio de GEA por Rotavírus (1, 19, 22, 100). A figura 1.2 mostra a sua incidência global,
com especial ênfase para as zonas onde a mortalidade é significativa.
Figura 1.1 Estimativa da distribuição/ incidência anual da infecção a Rotavírus (118)
Cada ponteado corresponde a uma mortalidade> 1.000 crianças/ano
A descoberta do Rotavírus, na década de 70, foi seguida de múltiplos estudos, que têm
procurado caracterizar a constituição molecular, funções das diferentes proteínas virais,
mecanismos fisiopatológicos associados à GEA, resposta imunológica à infecção e
formas de simular a infecção natural através de vacinas.
O Rotavírus, pertencente à família Reoviridae, infecta humanos e animais e está
classificado em 7 grupos, de A até G, de acordo com diferenças ao nível da principal
proteína estrutural da sua membrana externa. O Rotavírus A é o que se associa a
infecção humana sistemática e significativa (9, 40, 68).
O Rotavírus é classificado através de um sistema binário, baseado na caracterização
serotípica ou genotípica, de duas proteínas estruturais da cápside externa, a VP4 e VP7.
Estas proteínas são as principais indutoras da produção de anticorpos específicos para o
Rotavírus (47, 57, 68, 107, 149).
Introdução
14
As diferenças encontradas nestas proteínas permitem a distinção em serótipos ou
genótipos, consoante se utilizem métodos serológicos ou moleculares (9, 49, 57). Os
estudos epidemiológicos têm revelado uma prevalência elevada e mantida de quatro
genótipos, a saber G1P[8], G2P[4], G3P[8] e G4P[8]. Nos últimos anos emergiu outro
genótipo, o G9P[8], que é considerado actualmente com o quinto genótipo significativo
(16, 17, 28, 57, 62, 68, 99, 101).
A prevenção desta infecção baseia-se na criação de vacinas específicas. Estas são
desenvolvidas a partir do conhecimento da composição molecular do vírus e do tipo de
imunidade que desencadeia. A variabilidade regional e temporal na incidência dos cinco
principais genótipos tem criado dificuldades na aplicação das vacinas e na aferição da
sua adequação. É essencial conhecer a realidade regional dos genótipos de Rotavírus
mais prevalentes e acompanhar a sua variação ao longo do tempo (49, 99, 132, 133, 137, 145).
A inexistência de dados epidemiológicos e genotípicos referentes à população infantil
portuguesa tem impossibilitado compreender a dimensão desta doença no nosso país,
embora se aceite a sua elevada incidência e importância clínica. Como consequência
desconhece-se a vantagem real das vacinas que estão a ser introduzidas e
comercializadas em Portugal, desde Outubro de 2006 (1, 42, 129).
Na presente dissertação identificaram-se os principais genótipos de Rotavírus
circulantes numa área geográfica portuguesa. O padrão molecular encontrado, na
amostra seleccionada durante um ano consecutivo, pretendeu ser demonstrativo da
circulação de Rotavírus nesse período de tempo.
Introdução
15
1.2 Rotavírus
1.2.1. História A descoberta do Rotavírus em 1973 veio revolucionar o conhecimento microbiológico
das gastroenterites agudas pediátricas (9, 94, 95). Até então aceitava-se que a maioria dos
episódios de GEA na infância era de natureza infecciosa, causada por vírus, bactérias ou
parasitas, mas a etiologia ficava por esclarecer em mais de 50-60% dos casos.
Nessa altura já era possível cultivar e identificar vírus a partir de sistemas de cultura
celular mas, os vírus entéricos conhecidos até então tinham pouca importância clínica.
Em 1972 foi descoberto o vírus Norwalk que foi, desde logo, associado a surtos de GEA
(18, 32, 94, 95). Esta notícia foi seguida, em 1973, pela descoberta do Rotavírus humano por
Ruth Bishop.
Esta investigadora australiana observava imagens de microscopia electrónica de
extractos de mucosa intestinal de crianças, internadas com diagnóstico de GEA, quando
detectou partículas virais. Este novo vírus apresentava uma forma particular, descrita
como muito semelhante a uma roda dentada e que esteve na origem do seu nome
(derivado do latim, rota). Esta designação foi posteriormente adoptada pelo Comité
Internacional de Classificação Taxonómica de Vírus. Este novo vírus foi também
identificado em muitas outras espécies com um contacto mais ou menos próximo com o
Homem e sempre associado a quadro clínico de GEA (64).
A investigação mais aprofundada sobre o Rotavírus ocorreu a partir de 1980 com a
identificação dos primeiros serótipos (7, 32).
Introdução
16
Nos anos subsequentes, o vírus Norwalk foi associado a surtos de GEA em adolescentes
e adultos, com uma taxa de incidência até 50% dos casos adquiridos na comunidade. No
entanto, tinha pouco significado como agente de infecções gastrointestinais em lactentes
e crianças até à idade escolar (12, 32, 94). Ao mesmo tempo, a identificação crescente de
Rotavírus em fezes de crianças com quadros de diarreia e desidratação, colocou-o no
topo da etiologia de GEA pediátricas. Esta evidência, obtida em diferentes regiões do
globo, mostrou ser o Rotavírus a principal causa de GEA severa nas idades pediátricas,
sobretudo abaixo dos cinco anos. Isoladamente, ou em associação com outros agentes, é
responsável por 20 a 50% dos quadros de GEA graves, com necessidade de
internamento hospitalar (12, 14, 25, 27, 95, 131).
1.2.2. Classificação Taxonómica do Rotavírus O Rotavírus está classificado no género Rotavírus, um dos onze pertencentes à família
Reoviridae (41). O nome da família, Reoviridae, deriva de Respiratory Enteric Orphan
Vírus. Os vírus nela incluídos foram identificados (a partir de 1959) nas mucosas
respiratória e intestinal de diferentes espécies, sem se associarem a doença conhecida –
eram por isso designados de “orphan virus” (http://cancerweb.ncl.ac.uk/cgi-bin/omd?
orphan%20viruses). Actualmente, esta ideia está ultrapassada, mas a designação
permaneceu.
Os onze géneros incluídos nesta família, correspondem a vírus ubiquitários, que
infectam uma grande diversidade de seres vivos (105). Apresentam como característica
comum, a sua composição genómica em dsRNA, dividido em 10, 11 ou 12 segmentos.
Em cada género da família Reoviridae os segmentos de dsRNA são agrupados por peso
molecular originando três agrupamentos de genes: os de elevado, médio e os de baixo
Introdução
17
peso molecular. Outra característica comum a esta família é o facto de os vírus se
replicarem no citoplasma das células infectadas, a partir de enzimas do próprio vírus.
1.2.3. Morfologia e Estrutura Tridimensional O Rotavírus é vírus RNA, sem invólucro, com cerca de 70 nm de diâmetro. As
partículas víricas completas, quando observadas por microscopia electrónica de
transmissão, apresentam uma forma icosaédrica, com uma região central envolta numa
cápside tripla. A organização tridimensional do vírus compreende, do centro para o
exterior (32, 40, 41):
(1) O core, composto por dsRNA dividido em 11 segmentos;
(2) Uma camada proteica interna;
(3) Uma camada proteica intermédia;
(4) Uma camada externa formada por proteínas e glicoproteínas.
Figura 1.2 (64)
A partícula completa (70 nm) tem a capacidade infecciosa que caracteriza o vírus. A
perda da camada externa da cápside leva ao desaparecimento da infecciosidade. Esta
pode ocorrer, por exemplo, através do tratamento com agentes quelantes do cálcio
(como o EDTA) que leva ao aparecimento de uma partícula com 55 nm de diâmetro: a
Introdução
18
partícula rugosa. Por fim, o centro do vírus tem uma estrutura hexagonal e mede cerca
de 37 nm de diâmetro.
1.2.4. Propriedades Físico-Químicas do Rotavírus As propriedades químicas do Rotavírus foram estudadas em estirpes animais (bovina e
símia), embora muitos destes resultados tenham sido confirmados no vírus humano.
O vírus é particularmente resistente no meio ambiente, sobrevivendo meses ou anos,
mesmo com condições ambientais adversas. Persiste de forma viável em superfícies
porosas e não porosas, como sejam papel, algodão, alumínio, látex e plástico. Nesses
locais permanece activo com variações acentuadas de pH (sobrevive entre pH 3 e 9) e
de temperatura. Suporta temperaturas na ordem de 4ºC, e mantém-se activo com o
aquecimento ambiental até aos 45ºC. Temperaturas mais elevadas ou variações
sucessivas da mesma são responsáveis pela perda de duas capacidades essenciais, a
infecciosa e a actividade de hemaglutinina (18).
Resiste ao tratamento com éter e clorofórmio e consideram-se adequados para a sua
inactivação, desinfectantes naturais como os fenóis e a formalina. De entre estes, o
álcool a 95% parece a forma mais eficaz de inactivação viral (41).
1.2.5. Estrutura Genética e Proteica O genoma viral é constituído por 11 segmentos de dsRNA, com cerca de 18 500 pares
de bases nucleotídeas. Os segmentos têm dimensões entre 0,6 e 3,3 kilobases. Estes 11
segmentos codificam as 12 proteínas virais e esta diferença numérica é explicada pelo
facto de cada segmento de RNA codificar uma proteína específica, excepto as proteínas
NSP5 e NSP6 que têm origem em diferentes ORF do mesmo segmento de RNA
(segmento 11).
Introdução
19
Os segmentos são agrupados de acordo com o peso molecular. A separação é feita por
sequenciação dos segmentos ou por electroforese em gel de poliacrilamida. O padrão de
migração em gel permite criar os seguintes grupos (ver figura 1.3):
• Grupo 1 (peso molecular elevado), composto pelos segmentos 1 até 4, com
migração mais lenta;
• Grupo 2, composto pelos segmentos 5 e 6 (grupo de peso molecular médio);
• Grupo 3 formado pelos segmentos 7, 8 e 9 (grupo de peso molecular baixo);
• Grupo 4 com os segmentos 10 e 11 (grupo de peso molecular muito baixo).
NSP6NSP6
Figura 1.3 (57)
A segmentação do genoma de RNA favorece o re-arranjo individual de cada um dos
genes e este facto ocorre com relativa frequência quando diferentes estirpes de
Rotavírus se encontram na mesma célula: casos de co-infecção, in vivo e in vitro. Esta
troca fácil de material genético está na origem da grande diversidade de estirpes de
Rotavírus circulantes. Outros mecanismos importantes que explicam a grande
diversidade genética encontrada no Rotavírus são fenómenos de mutação pontual,
duplicação e delecção de segmentos de gene (41).
Introdução
20
A aplicação de metodologias moleculares ao estudo de Rotavírus tem permitido
conhecer a sequência nucleotídea dos vários segmento de dsRNA. Estas estão bem
definidas para diferentes estirpes de Rotavírus, humano ou animal.
Assim, cada segmento de RNA tem, no início da sua extremidade 5’, uma guanidina
seguida de uma sequência conservada que não codifica para proteínas. Após esta
sequência está uma ORF que codifica para a proteína viral, seguida por um codão de
terminação e nova sequência não codificadora, que termina na extremidade conservada
3’ por duas citidinas. O comprimento das sequências conservadas, não codificadoras, é
variável entre os diferentes segmentos de RNA e não existe sinal de poli-adenilação na
extremidade 3’. Em todos os segmentos sequenciados é comum o aparecimento de pelo
menos uma ORF a seguir ao codão de iniciação (40, 41).
O Rotavírus contém na sua estrutura uma RNA-polimerase específica, responsável pela
transcrição dos diferentes segmentos de material nucleico em distintos RNA
mensageiros, dentro da célula infectada. Estes, por sua vez, são fulcrais na constituição
das proteínas virais e posterior reconstituição de novas partículas de vírus.
A interacção entre RNA e proteínas virais é extensa e, desta interacção, resulta a grande
flexibilidade do genoma, que será “empacotado” dentro da cápside viral (40,41).
As 12 proteínas virais dividem-se em dois grupos, seis proteínas estruturais (Viral
Proteins) e seis proteínas não estruturais (Non Structural Proteins). São designadas por
VP ou NSP, seguido de um número árabe que é atribuído por ordem decrescente de
peso molecular (40,41). A sua determinação foi realizada a partir da estirpe de macaco,
SA11 (simian agent 11), mas aplicam-se a todos os Rotavírus, incluindo o humano.
Introdução
21
A distinção entre VP e NSP relaciona-se com a função proteica: as primeiras têm
funções estruturais, assegurando a morfologia tridimensional do vírus, e são
fundamentais na capacidade de infecção; as segundas não têm função estrutural, não
estão presentes na partícula não infectante, mas têm acção importante a nível da
replicação (caso de NSP1, NSP2, NSP3, NSP5 e NSP6) e da morfogénese (caso da
NSP4) (32, 41, 95).
A distribuição espacial das proteínas, visualizada por métodos de reconstituição
tridimensional, é a seguinte (figura 1.2):
(1) Proteínas estruturais do centro, VP1 e VP3;
(2) Proteínas não estruturais, NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 e NSP6, também
incluídas no centro do vírus;
(3) Proteína estrutural da camada interna da cápside, VP2.
(4) Proteína estrutural da camada intermédia da cápside, VP6.
(5) Proteínas estruturais da camada externa da cápside, VP4 e VP7.
Descrição das diversas proteínas virais (1, 40, 41, 95):
As proteínas VP1, VP2 e VP3 têm um papel essencial no processo de transcrição de
RNA e na replicação viral. Derivam dos segmentos 1, 2 e 3 do genoma,
respectivamente. Diversos estudos apontam para o papel relevante da VP1 como RNA
polimerase, tendo ainda funções de transcriptase e replicase. Ao mesmo tempo,
demonstram a necessidade da VP2 para se activar a função enzimática de replicase, pela
sua capacidade de se ligar ao RNA mensageiro de modo inespecífico.
Introdução
22
A VP3 é, destas três proteínas, aquela cuja função é menos conhecida. No entanto,
diversos estudos evidenciam a sua multi-funcionalidade enzimática, com diferentes
acções de transferase. Sabe-se que forma um complexo de transcrição em conjunto com
a VP1.
A NSP1, codificada pelo segmento 5, não é essencial para a replicação viral. Esta é de
todas as proteínas do Rotavírus a que apresenta maior variação nucleotídea entre
estirpes. Estão descritas estirpes mutantes, nas quais a região conservada desta proteína
desaparece e que mantêm a capacidade de replicação viral.
A NSP2, codificada pelo segmento 8, tem actividade de NTPase e helicase e é essencial
para a síntese de dsRNA, através de funções de ligação não específica ao ssRNA e de
participação nos processos de formação da cápside de RNA. Tem ainda funções na
virulência do vírus.
A NSP3, codificada pelo segmento 7, é outra proteína com função de ligação ao RNA,
sabendo-se que necessita de uma sequência de apenas quatro nucleotídeos para
reconhecimento da zona de ligação específica.
A NSP5, codificada pelo segmento 11, é uma proteína glicosilada e fosforilada, com
forma dimérica e com funções de autocinase. Apresenta uma relação estreita com as
NSP2 e NSP6 e é desta interacção próxima que resulta a sua função enzimática. É
essencial na replicação viral.
A NSP6 é codificada pela segunda ORF do segmento 11. Tem uma interacção estreita
com a NSP5, codificada pelo mesmo segmento.
A NSP4, codificada pelo segmento 10, é a mais extensamente estudada de todas as
proteínas não estruturais. Tem funções a nível da morfogénese do vírus, como factor de
virulência e como enterotoxina. É uma proteína glicosilada que se vai localizar a nível
Introdução
23
trans-membranar no retículo endoplasmático da célula infectada e, nesta posição,
proporciona a ligação entre as partículas virais recém-formadas e o lúmen do retículo
endoplasmático.
O seu papel como enterotoxina tem sido avaliado em variados modelos animais, nos
quais se evidencia a sua acção como indutora de diarreia. A sua presença no espaço
extra-celular da mucosa intestinal leva à mobilização de cálcio ionizado intracelular,
secreção aumentada de cloretos e diminuição da absorção da glicose pelas células
intestinais. Estas alterações no funcionamento celular são muito precoces, ocorrendo
antes do início das alterações histopatológicas típicas da infecção gastrointestinal por
Rotavírus. Todas as evidências apontam para o início da diarreia secretória logo nas
primeiras 12 horas após a infecção, antes da replicação viral que demora 24 a 72 horas,
e pensa-se que este facto esteja relacionado com a acção de enterotoxina da NSP4 (18).
A VP4 é codificada pelo segmento 4 do genoma viral. É uma proteína não glicosilada,
com um peso molecular de 88 000 kd, e constitui cerca de 1,5% da proteína viral.
Integra a camada externa da cápside em conjunto com a VP7 e é visualizada, em
imagens tridimensionais, como pequenas espículas (cerca de 60) que se projectam da
cápside, no meio da outra proteína. Apesar de ser pouco abundante quando comparada
com outras proteínas virais, sabe-se que tem funções vitais na infecciosidade do vírus e
na indução de imunidade.
Após o contacto com a célula epitelial, sofre um processo de clivagem pela enzima
proteolítica tripsina. Desta clivagem resultam duas novas proteínas, VP5* e VP8*, e
esta transformação aumenta o potencial de infecciosidade viral. Por enquanto, os
estudos de sequenciação molecular ou bioquímicos não explicam o modo exacto como
esta clivagem da VP4 pode aumentar a sua função.
Introdução
24
Tem ainda outras funções importantes: (1) como hemaglutinina; (2) como antigénio
indutor da produção de anticorpos neutralizadores por parte do hospedeiro. Esta última
função é determinante para a aquisição de imunidade para novos episódios de diarreia
por Rotavírus. É partir desta proteína, ou do seu genoma, que se estabelece a
classificação no serótipo ou genótipo P (1, 40, 41, 95, 109, 149).
A proteína VP6 é a principal proteína viral, correspondendo a cerca de 51% do total de
conteúdo proteico do vírus. Esta proteína existe numa forma trimérica e é muito estável.
Localiza-se na camada intermédia da cápside e tem um papel chave na manutenção da
estrutura tridimensional do vírus, ao interagir em simultâneo com as proteínas da
camada externa (VP4 e VP7) e da camada interna (VP2). Tem uma particularidade
importante de apresentar epítopos conservados entre diferentes estirpes de Rotavírus,
sendo por isso determinante para a classificação dos Rotavírus em Grupo e Subgrupo
(descrito na secção 1.2.7.1).
Deste modo, é o principal antigénio viral e aquele que é utilizado na criação de diversos
testes para diagnóstico de infecção por Rotavírus (1, 40, 41, 95).
A última grande proteína estrutural do Rotavírus é a VP7. É uma glicoproteína que se
encontra na camada externa da cápside, sendo o componente maioritário da mesma.
Tem uma organização trimérica e uma relação próxima com outras duas proteínas, VP4
e NSP4, durante a replicação no interior da célula infectada. É considerada o principal
antigénio indutor de anticorpos específicos neutralizadores, presentes em soro hiper-
imune para Rotavírus. É a responsável pela classificação em serótipos e genótipos G (1,
40, 41, 95).
Introdução
25
1.2.6. Composição antigénica De entre as 12 proteínas virais descritas, três têm uma grande capacidade antigénica e
são as que conferem a especificidade que possibilita a classificação do vírus em Grupos,
Subgrupos e Serótipos ou Genótipos. São a VP4, VP6 e VP7 (95).
Esta propriedade antigénica tem grande interesse uma vez que permite a distinção do
Rotavírus de outros vírus gastrointestinais (como sucede com a VP6) e porque separa
distintos grupos de Rotavírus entre si (VP6). Outro aspecto importante é a indução de
anticorpos neutralizadores que protegem o hospedeiro de posteriores infecções pelo
mesmo vírus (caso da VP4 e VP7).
1.2.7. Classificação do Rotavírus
1.2.7.1. Grupo e Subgrupo
Estão descritos sete grupos de Rotavírus (A, B, C, D, E, F e G) baseados na semelhança
dos epítopos antigénicos da proteína VP6 dentro da cada grupo. A VP6 é a principal
proteína viral pelo que não é de estranhar que seja a responsável pela distinção entre
grupos (95). Para o Homem é relevante a infecção por Rotavírus do grupo A, sendo
insignificante ou nula a infecção pelos restantes grupos.
Assim, o Rotavírus A é responsável por 90% dos casos, a nível global, e é endémico em
todos os continentes. Consoante os climas, tropicais ou temperados, as infecções
ocorrem ao longo do ano ou em surtos sazonais, respectivamente. Os surtos surgem
habitualmente na comunidade e atingem a população mais susceptível, crianças e
idosos, sobretudo quando permanecem em infantários, lares, centros de dia ou outras
instituições (9, 49). Com alguma frequência são referidos casos de GEA nosocomial, em
enfermarias pediátricas.
Introdução
26
Dos restantes seis grupos de Rotavírus, sabe-se que o grupo B está descrito em surtos de
GEA em adultos e recém-nascidos, na China, e em adultos na Índia. Não estão relatados
casos de infecção por Rotavírus B em humanos, noutros locais. O Rotavírus C foi
descrito em casos esporádicos de diarreia infantil em zonas restritas (são exemplos, o
Japão e Inglaterra) e sempre com uma expressão clínica pouco significativa (40, 43, 92). Os
restantes grupos de Rotavírus foram apenas descritos em infecção animal.
A especificidade antigénica da VP6 permitiu criar uma outra classificação em
subgrupos, com interesse epidemiológico. Estão descritos quatro subgrupos: SG I, SG
II, SG I+II e SG não I e não II. As estirpes de Rotavírus A pertencem maioritariamente
aos SG I e SG II (8, 26, 32, 39, 40, 47). A distinção entre eles é feita por PAGE, no entanto,
existe dificuldade na interpretação dos resultados obtidos por electroforese. A elevada
frequência de amostras difíceis de encaixar nos SG já conhecidos, levou à necessidade
de criar outras formas de classificação do Rotavírus.
Esta questão foi ultrapassada pela aplicação de métodos de serotipagem e genotipagem.
1.2.7.2. Serótipos e Genótipos
A descoberta do papel relevante da VP4 e da VP7 na activação do sistema imunitário,
nomeadamente na indução de anticorpos específicos, neutralizadores e protectores para
episódios subsequentes de GEA, levou a que a investigação se centrasse nestas duas
proteínas (107).
Inicialmente a maior actividade antigénica foi estabelecida para a VP7, sendo esta
considerada a determinante major da indução de anticorpos específicos.
Introdução
27
O conhecimento progressivo do papel relevante da VP4 como antigénio, aliado à
compreensão da segregação independente destas proteínas virais, levou à reavaliação do
sistema de classificação.
A partir de 1980, foi possível realizar serotipagem de Rotavírus usando soro com
anticorpos específicos para a VP7 (7, 8, 32, 40, 46). Nos anos subsequentes foram
descobertos diferentes serótipos, designados por serótipos G por se relacionarem com
esta glicoproteína. Até à data, estão estabelecidos mais de 15 serótipos G, dos quais 10
se associam a infecção humana (26, 62).
A aplicação de métodos moleculares, com sequenciação do gene 9 (codificador da
VP7), permitiu definir genótipos G e, neste caso, verificou-se uma concordância entre
serótipos e genótipos. Ou seja, a determinação genotípica G de um isolado de Rotavírus
permite prever o serótipo G, caso seja testado pelos métodos tradicionais serológicos (69,
70). Hoje em dia, usa-se de modo indistinto a denominação serótipo G ou genótipo G
embora a maioria dos estudos realizados sejam de natureza molecular.
A identificação de serótipos P baseou-se em diferenças serológicas detectadas em
relação à VP4. A designação P advém do facto de esta ser uma proteína sensível à
protease. No entanto, a identificação destes serótipos nunca foi muito eficaz (14, 39). São
frequentes fenómenos de reacção cruzada entre serótipos P distintos e existem amostras
impossíveis de determinar por este método. A dificuldade na determinação dos
serótipos P foi ultrapassada com a aplicação de metodologias moleculares.
A análise do genoma viral, por métodos de hibridação de ácidos nucleicos e
sequenciação, permitiu caracterizar o segmento 4 de um modo preciso e possibilitou
Introdução
28
uma melhor caracterização das estirpes. Rapidamente a genotipagem P substituiu a
serotipagem P, sendo internacionalmente aceite como o método de eleição. Na
actualidade estão descritos cerca de 24 genótipos P, dos quais apenas 13 são
identificados por serotipagem (26, 43, 49, 62).
Em resumo, a denominação de qualquer isolado de Rotavírus é feita através de um
sistema binário, que inclui:
(1) A denominação do serótipo ou genótipo G, seguida de um número árabe;
(2) O genótipo P, seguido por um número escrito entre parêntesis rectos; por exemplo
G1P[8] (22, 137).
Desta forma é possível uniformizar a linguagem quando se descrevem os Rotavírus
identificados em diferentes regiões.
As combinações possíveis entre genótipos G e P são inúmeras, dada a possibilidade de
variação individual e independente de cada gene. No entanto, a infecção por Rotavírus
em humanos está associada, na maioria dos casos a cinco genótipos, ditos
predominantes: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] e G9P[8] (15, 22, 27, 72).
1.2.8. Replicação viral e Patogénese
O Rotavírus percorre o sistema digestivo até chegar ao intestino delgado, local onde se
encontram as células para as quais o vírus tem tropismo: enterócito – célula madura do
epitélio intestinal. Apenas aí ocorrerá a entrada na célula, seguida de replicação viral,
com as alterações fisiopatológicas típicas da doença. No Homem, o vírus localiza-se
preferencialmente na região proximal do ID, em particular no jejuno (22, 41, 63, 68, 95, 125).
Introdução
29
O vírus entra na célula por um processo de endocitose e forma vesículas designadas por
endossomas. Este fenómeno depende da VP4, que se torna activa após clivagem em
duas subunidades, na presença de enzimas intestinais como a tripsina, a elastase e a
pancreatina. A replicação do vírus ocorre no citoplasma. Numa fase inicial as proteínas
da camada externa da cápside, promovem a ruptura da membrana do endossoma e este
processo desencadeia variações no cálcio intracelular que, por sua vez, condicionam a
separação das camadas mais externas da cápside. O genoma mantém-se protegido no
interior da camada interna da cápside, enquanto a enzima polimerase do RNA cria RNA
mensageiro, responsável pela síntese de novas proteínas virais. Nesta fase de transcrição
ocorre a acumulação de proteínas virais dentro de estruturas designadas por viroplasmas
(21, 41, 49, 95, 125).
Os viroplasmas, constituídos a partir da NSP2 e NSP5, constituem verdadeiras fábricas
de construção de novas partículas virais, que permanecem incompletas, apenas com as
duas camadas proteicas à volta do centro. Estas partículas imaturas migram até ao
retículo endoplasmático, local onde se completa a constituição do Rotavírus, com a
adição da camada externa. Os novos vírus são libertados da célula por lise e dirigem-se
para células epiteliais contíguas, perpetuando o ciclo de replicação.
Ao longo das primeiras 24 horas ocorre a descamação rápida do epitélio, por morte das
células maduras. Esta descamação, leva a uma substituição dos enterócitos maduros por
células imaturas, provenientes das criptas. Estas não são o alvo típico do Rotavírus mas
contribuem para a diarreia, porque não possuem uma boa capacidade de absorção de
nutrientes. A deficiente capacidade de absorção verifica-se para glicose, sódio, água,
entre outros, e acompanha-se de diminuição acentuada dos níveis de enzimas intestinais
Introdução
30
como lactase, maltase, sucrase e fosfatase. Origina-se por isso uma diarreia por má-
absorção.
Em paralelo, a acção de enterotoxina, demonstrada para a NSP4, vem agravar toda esta
alteração funcional. Esta proteína condiciona uma secreção aumentada de cloretos, por
mecanismos dependentes do cálcio, e a diarreia agrava-se pois à menor absorção
associa-se a secreção activa de metabolitos – é o componente secretório da diarreia por
Rotavírus.
A alteração da arquitectura intestinal (com diminuição e atrofia vilositária) associa-se às
alterações intracelulares (com distorção do retículo endoplasmático e edema
mitocondrial) e à presença de um infiltrado inflamatório na lâmina própria e placas de
Peyer intestinal. Este infiltrado é constituído por células mononucleares e leva à
activação do SNE (sistema nervoso entérico) que aumenta, quer o carácter secretório da
diarreia, quer a motilidade intestinal (18, 22, 41, 49, 68, 95, 125). Outra alteração demonstrada é
a diminuição da motilidade gástrica que explica a presença frequente de náuseas e
vómitos associados.
Os diversos mecanismos descritos (mal-absorção, componente osmótico e secretório)
potenciam-se e aumentam a gravidade do quadro clínico da GEA por Rotavírus.
A regeneração do epitélio intestinal é lenta, com uma demora de 7 a 10 dias até ao
amadurecimento de novas células epiteliais. Só nessa altura atingem o topo das
vilosidades e apresentam uma funcionalidade normal. A reposição enzimática
(nomeadamente de sacaridases) é mais lenta e pode demorar mais de duas semanas a
ocorrer. Por isso, os quadros diarreicos associados ao Rotavírus, para além da
gravidade, tendem a ser prolongados e levam, em muitos casos, ao recurso de cuidados
de saúde.
Introdução
31
Para além da gravidade inerente ao próprio agente, sabe-se que factores do hospedeiro
ou do ambiente podem predispor para uma maior gravidade clínica e, de entre eles,
salientam-se a idade precoce, o estado nutricional, a ausência de aleitamento materno, a
presença de doenças gastrointestinais concomitantes e a existência de imunodeficiência
(22, 125).
1.2.9. Transmissão A infecção por Rotavírus é universal, com uma incidência globalmente elevada e
semelhante entre regiões muito distintas. O facto de a maior acessibilidade a recursos de
saúde e melhores condições sanitárias não alterarem de modo significativo esta
incidência tem colocado questões pertinentes em relação à transmissibilidade do vírus.
Sabe-se que o Rotavírus é ubiquitário, estável e resistente em condições ambientais
adversas. A forma preferencial de transmissão é a via fecal-oral, através de partículas
virais presentes nas mãos e de objectos contaminados. A via respiratória (por gotículas)
parece ser uma forma adicional de transmissão embora de menor relevância. Está
demonstrado que as fezes de um indivíduo infectado podem conter mais de 10 milhões
de vírus/grama fecal e que uma ingestão mínima de 10 a 100 partículas é suficiente para
que ocorra a transmissão entre humanos (9, 18, 27, 32, 64, 95). A fácil transmissibilidade e a
capacidade de “escapar” aos mecanismos mais habituais de desinfecção de objectos,
brinquedos e das próprias mãos explicam o facto deste vírus ser o principal agente de
GEA na comunidade e em enfermarias pediátricas (55, 65, 68, 127, 128).
Introdução
32
1.2.10. Imunidade natural
Desde o início da década de 80 que se procura compreender a forma como é adquirida a
imunidade após um primeiro episódio de infecção por Rotavírus.
Sabe-se que é possível e frequente a re-infecção. As crianças têm um primeiro episódio
de GEA rotavírica de maior gravidade e, em contactos subsequentes com o vírus,
apresentam quadros mais ligeiros. As infecções recorrentes são típicas da infância, com
a primo-infecção a apresentar um pico de incidência entre os três meses e os dois anos
(22, 146).
Com a serotipagem e genotipagem compreendeu-se que os episódios subsequentes de
GEA por Rotavírus eram na sua maioria causados por serótipos/genótipos distintos (8).
Muitos trabalhos de investigação têm procurado determinar o tipo de imunidade
desencadeada pela infecção natural a Rotavírus.
Os resultados da investigação nesta área sugerem:
1. O papel importante da IgA secretória, intestinal.
A IgA secretória, presente na mucosa intestinal, tem sido referida como o marcador de
protecção para novos episódios de infecção rotavírica. Após uma primeira infecção a
titulação de IgA nas fezes sobe para valores muito elevados, sendo este aumento
acompanhado por uma subida do título sérico de IgA (subida três vezes superior ao
normal). Outros anticorpos, como IgG, podem ter um papel relevante, mas não tem sido
demonstrada uma subida consistente e que possa relacionar-se com uma imunidade
relevante para infecções subsequentes (22, 23, 29, 38, 48, 62, 68, 95, 147).
Está demonstrada a subida de IgG e IgM séricas, correlacionadas com a ocorrência de
períodos de antigenémia e virémia, no entanto, não existe consenso sobre a sua
relevância na indução de uma resposta imunitária eficaz após a infecção natural.
Introdução
33
2. A natureza homotípica e heterotípica da imunidade.
A IgA secretória tem uma duração curta, de meses. Este facto pode explicar a
ocorrência, na mesma criança, de novas infecções pelo mesmo serótipo de Rotavírus,
numa estação sazonal consecutiva.
No entanto, mais frequentemente, após um episódio de GEA originado por determinado
serótipo de Rotavírus criou-se uma imunidade para outros isolados do mesmo serótipo.
Esta imunidade específica é designada de imunidade homotípica. Adicionalmente, sabe-
se que um episódio de GEA confere algum grau de protecção para infecções originadas
por serótipos distintos: imunidade dita heterotípica. Este fenómeno explica a menor
gravidade de episódios posteriores de infecção por Rotavírus (22, 29, 49, 95, 146).
3. O papel adicional de outras células efectoras do sistema imunitário.
A IgA secretória tem um papel essencial na imunidade para o Rotavírus. No entanto,
tem sido pesquisado o papel adicional de outras células e componentes do sistema
imunitário, como linfócitos T e células B de memória. Estudos em modelo animal
sugerem que os primeiros participam na eliminação do vírus e as segundas na produção
de anticorpos IgA. No entanto, estes dados são ainda insuficientes para uma
compreensão real sobre o seu papel na imunidade (1, 22, 48, 49).
4. O papel da antigenémia e virémia na evolução da infecção.
Durante a fase aguda da doença o Rotavírus é detectado noutros locais do organismo. O
vírus tem tropismo para o enterócito mas, estudos em modelo animal com
imunodeficiência e confirmados em biopsia de tecidos humanos e líquidos estéreis,
permitem identificar antigénios de Rotavírus e RNA viral em locais distantes tais como
Introdução
34
o fígado, rins, sangue e sistema nervoso central. Estes dados questionam a ideia de que
exista uma localização restrita do Rotavírus às células epiteliais do intestino delgado (11,
32, 45, 68, 86, 125).
Por enquanto, não está esclarecido o real significado da presença viral fora do intestino:
poderá representar uma passagem através das placas de Peyer com posterior entrada na
circulação sanguínea, ou poderá representar apenas contaminação ocorrida durante a
recolha ou processamento laboratorial de amostra biológicas.
De qualquer modo, a disseminação do vírus por outros órgãos (fígado, vias biliares,
rins, miocárdio e sistema nervoso central) foi detectada em casos de maior gravidade.
Estes relatos surgem em estudos post-mortem ou em casos que apresentaram
manifestações atípicas associadas ao quadro gastrointestinal, tais como, convulsões na
fase febril da doença, encefalopatia ou cerebelite, durante ou logo após o episódio
agudo de GEA. Está ainda por confirmar a viabilidade e potencial infeccioso das
partículas encontradas. É possível que representem apenas processos transitórios e com
pouca expressão clínica ou que se possam relacionar com um maior inóculo do vírus (11,
45, 86, 103, 126).
5. Existência de imunidade distinta no lactente com menos de seis meses.
Estão descritos casos de infecção por Rotavírus em recém-nascidos, desde 1985. Estes
casos apresentam particularidades interessantes: os estudos referem-se a recém-nascidos
que permaneceram internados em Unidades de Cuidados Especiais Neonatais e relatam
surtos de infecção assintomática ou com pouca intensidade clínica. Os primeiros
isolados descritos foram de genótipos raros, G9P[11] e G9P[6], mas pareceram conferir
uma protecção parcial para outras infecções rotavíricas no primeiro ano de vida.
Introdução
35
Estes lactentes, quando expostos novamente ao Rotavírus, apresentavam um quadro
clínico de GEA menos intenso e de resolução mais rápida (34, 39, 47, 60, 68, 71).
A manifestação distinta no recém-nascido pode ser explicada por diversos mecanismos.
Por um lado, o facto de as estirpes infectantes serem menos frequentes pode implicar
uma menor virulência. Por outro lado, a presença de anticorpos maternos, transmitidos
por via placentária, parece conferir uma protecção adicional. E, por fim, a menor
quantidade de enzimas presentes a nível da mucosa intestinal pode condicionar uma
menor intensidade das queixas (27, 32, 36, 47, 60, 71, 95).
1.2.11. Manifestações Clínicas, Diagnóstico e Tratamento
O quadro clínico típico da infecção por Rotavírus é a gastroenterite aguda.
Após a entrada do vírus no intestino surge a tríade de febre, vómitos e diarreia. É
frequente a coexistência destes três sinais, mas não é obrigatória e nem sempre tem uma
ordem bem definida. A febre pode ser elevada (superior a 39ºC) e persiste
habitualmente entre um e três dias. Os vómitos são muito frequentes neste quadro e
condicionam dificuldade na tolerância de alimentos per os. A diarreia, pela sua natureza
multifactorial, rapidamente se torna profusa com mais de cinco dejecções/dia (152).
Em conjunto, os vómitos frequentes e a diarreia abundante conduzem ao desequilíbrio
hídrico e electrolítico, característicos das GEA mais graves. Quando comparada com
outras GEA infantis, a intensidade dos sintomas é maior e faz com que esta infecção
seja a principal responsável por internamentos pediátricos relacionados com
complicações de GEA. Os estudos epidemiológicos mostram uma incidência entre 25 e
55% em relação ao total de internamentos por GEA até aos cinco anos de vida (19, 23, 25,
29, 32, 47, 58, 120).
Introdução
36
Não é possível efectuar um diagnóstico definitivo de GEA por Rotavírus, com base nos
sinais e sintomas, uma vez que as queixas se sobrepõem às de outras GEA. O
diagnóstico etiológico, tal como em muitas outras doenças infecciosas, depende do
isolamento e identificação do agente em produtos biológicos. Alternativamente, usa-se a
subida de anticorpos séricos entre a fase aguda e convalescença da doença.
Detecção do vírus em amostras fecais
Após a descoberta do Rotavírus por microscopia electrónica (ME), este tornou-se o
método de eleição para o seu diagnóstico (14, 47). A elevada especificidade e
sensibilidade do método na fase aguda da doença, quando existe uma grande eliminação
de vírus nas fezes, alia-se à possibilidade de obter um diagnóstico alternativo noutros
casos de GEA. No entanto, tem uma disponibilidade limitada e exige uma concentração
elevada partículas nas fezes (superior a 106/ml) para manter bons níveis de
sensibilidade, pelo que é impraticável a sua aplicação em larga escala (18, 22, 88).
Foram criados métodos alternativos baseados na detecção rápida de antigénios virais
específicos, localizados na proteína VP6. Deste modo é possível obter um diagnóstico
rápido e em fase aguda, motivo pelo qual se tornaram populares.
Os ELISA (ensaios imunoenzimáticos), a imunocromatografia e a aglutinação em látex
são os mais utilizados na rotina do laboratório. Estes métodos têm como vantagens a
elevada sensibilidade e especificidade, aliada a uma grande disponibilidade, facilidade
de uso (sem recurso a técnicos especializados) e rapidez na resposta. São muito fiáveis
entre o primeiro e o décimo dia de doença (14, 18, 22, 30, 32, 35, 47, 68, 102).
Quando comparados entre si, apresentam sensibilidade de 95%, 68% e 99%
respectivamente para ELISA, aglutinação em látex e imunocromatografia, e uma
Introdução
37
especificidade de 99%, 99% e 96% (151). No entanto, têm associada uma taxa de
resultados falsos positivos entre cinco e dez por cento, facto que justifica a sua
confirmação por métodos laboratoriais mais específicos (89, 95, 115).
Actualmente, o método mais sensível e considerado de eleição para detecção de
Rotavírus é a RT-PCR (transcrição reversa seguida de Polymerase Chain Reaction) (43,
87, 95).
Após obtenção de amostra fecal é feita a extracção de RNA e transcrição reversa para se
obter um segmento de cDNA. Segue-se uma dupla reacção de PCR: Numa primeira
etapa, ocorre a hibridação do cDNA com sequências de nucleótidos específicas para a
VP7 e VP4 (primers consensuais). Numa segunda etapa, o produto final dessa reacção é
exposto, numa nova reacção de PCR, a múltiplos primers específicos para os genótipos
G e P mais frequentes. Esta segunda PCR é designada de semi-nested multiplex PCR.
Os produtos finais da segunda PCR são submetidos a electroforese em gel de agarose,
ocorrendo a migração de bandas de acordo com o peso molecular do segmento
identificado. O tamanho de cada segmento é comparado com os pesos moleculares dos
principais genótipos G e P e deste modo é feita a identificação do genótipo em estudo
(43, 56, 66, 82).
Recentemente, foi introduzida a PCR em tempo real no diagnóstico de Rotavírus (68, 102,
115). Esta variante da PCR segue os princípios anteriormente descritos mas implica
menor manipulação das amostras, menor risco de contaminação e permite uma maior
rapidez na obtenção de resultados uma vez que se elimina o passo de electroforese em
gel de agarose.
Introdução
38
A PCR tem a grande vantagem de ser um método muito sensível e específico para a
detecção do Rotavírus (9, 102). Permite a detecção viral mesmo quando a concentração
fecal é baixa e, neste aspecto, ultrapassa largamente os métodos anteriormente referidos.
Tem um limite de detecção de 104 partículas/ml. A grande desvantagem é o custo
elevado e a necessidade de técnicos com experiência em PCR. Por isso, está restringida
a laboratórios de referência.
A elevada sensibilidade e especificidade da PCR depende da selecção de primers
específicos que possibilitam a determinação dos genótipos circulantes. A variação
pontual e frequente das sequências nucleotídeas de alguns genótipos faz com que os
primers criados se tornem desajustados. Nalgumas zonas do globo, onde a diversidade é
mais frequente, existem dificuldades na determinação de certos genótipos e houve
necessidade de reajustar a sequência dos primers às mutações ocorridas no vírus.
Em cerca de 5% dos casos não é possível determinar o genótipo por RT-PCR. Nestes
casos recorre-se à sequenciação do segmento obtido no final da primeira PCR. A
determinação de homologia nucleotídea com outros segmentos já sequenciados permite
a sua identificação e, nestes casos, adapta-se o primer que não reconheceu esse
segmento. Noutros casos, a não determinação do genótipo resulta da presença de um
genótipo distinto, raro, que não híbridou com os primers habitualmente utilizados (124).
Assim, a sequenciação tem grande interesse epidemiológico, pois permite detectar a
evolução temporal dos segmentos do genoma viral e, ao mesmo tempo, permite manter
uma vigilância relativa aos tipos mais prevalentes em cada ano, em regiões distintas (43).
Introdução
39
O diagnóstico é importante em termos epidemiológicos mas não influencia a terapêutica
da GEA. O tratamento consiste na reposição das perdas de água e electrólitos, através de
soro de rehidratação (soro composto com glicose e electrólitos em proporções bem
definidas). No domicílio a reposição de líquidos é feita por via oral mas, quando existe
desidratação com necessidade de internamento, a reposição é feita por via endovenosa
(23, 152).
Mesmo com uma boa acessibilidade a cuidados hospitalares, existe mortalidade
associada ao Rotavírus. Este facto reflecte a gravidade potencial desta infecção, assim
como, a rapidez com que a desidratação e descompensação metabólica se podem
instalar (50).
1.2.12. Epidemiologia da Infecção a Rotavírus
A infecção por Rotavírus é inevitável. A ubiquidade do vírus e contágio muito fácil leva
a que a probabilidade de cada criança, até aos cinco anos de vida, ter tido uma infecção
rotavírica e ter adquirido anticorpos seja de 100% (9).
Este padrão de incidência na infância é muito semelhante nas diferentes regiões do
globo, embora o risco de doença grave, internamento e mortalidade varie de modo
significativo com as condições socio-económicas e a qualidade de prestação de
cuidados de saúde.
Nos Estados Unidos da América a incidência de GEA por Rotavírus, por criança com
menos de cinco anos, por ano, ronda os 18% (20, 95). Mas, estas infecções são
responsáveis por uma taxa de internamento entre 25 e 60% do total de internamentos
por GEA, no mesmo grupo etário. Ou seja, um em cada seis episódios de diarreia aguda,
por criança, por ano é da responsabilidade do Rotavírus mas, quase metade das crianças
Introdução
40
internadas por desidratação associada a GEA tem como agente causal o Rotavírus. Estes
dados são confirmados por muitos outros estudos epidemiológicos, nomeadamente
realizados na Europa (31, 37, 52, 54, 58, 59, 88, 92, 106, 144).
Na Europa Ocidental e EUA a maioria desses episódios evolui para a cura, mas noutras
regiões, menos desenvolvidas, a mortalidade aumenta exponencialmente. A comparação
de estimativas internacionais confirma: verifica-se uma incidência anual de cerca de 2,7
milhões de episódios de GEA rotavírica nos EUA, com cerca de 400.000 consultas de
ambulatório por episódio, 160.000 idas ao serviço de urgência e 50.000 hospitalizações.
A mortalidade associada está estimada em cerca de 20 mortes, por ano (15, 18, 20, 23, 24, 27,
49, 95).
Por outro lado, os dados referentes a vários países de África e da Ásia são distintos e
evidenciam a grande importância das doenças infecciosas gastrointestinais. Estas são
uma das principais causas de morbilidade e mortalidade infantil, com o Rotavírus a ser
o principal agente etiológico identificado. Anualmente, estão estimados 18 milhões de
episódios graves de GEA, com uma mortalidade superior a 500.000 crianças com
menos de cinco anos, por ano (uma em cada 160 crianças com GEA a Rotavírus) (60, 117).
As diferentes consequências explicam-se pela melhor acessibilidade e rapidez na
prestação de cuidados de saúde, por variações significativas nas condições de
saneamento básico e higiene e no controle de infecção hospitalar. Mas, a elevada
incidência e carácter universal da infecção mantém-se entre regiões (9, 36, 55).
Estudos epidemiológicos realizados nos cinco continentes mostram ao longo dos anos
uma relativa constância nos principais genótipos circulantes. De entre as possibilidades
Introdução
41
de combinações G-P, os quatro genótipos G responsáveis pela maioria dos surtos a nível
mundial são os G1, G2, G3 e G4, e apresentam uma incidência global entre 80 e 95%.
O estudo adicional dos genótipos P tem associado os genótipos G1, G3 e G4 com o P[8]
e o G2 com o P[4] (13, 17, 22, 26, 27, 28, 37, 51, 84, 88, 111, 137, 145).
Estes genótipos são predominantes, mas estão bem documentadas variações sazonais,
não previsíveis, na mesma região e entre regiões vizinhas.
A distribuição genotípica descrita corresponde ao padrão epidemiológico observado na
Europa, nos países da América do Norte, Austrália e Nova Zelândia (14, 49). Nos países
tropicais e subtropicais, os quatro genótipos G descritos tem uma incidência menor com
valores na ordem dos 70 % na América do Sul e próximo dos 50% nalgumas regiões
africanas. Nessas zonas emergem genótipos atípicos, que se mantêm relevantes durante
algumas estações. São exemplos: G1P[4] na Argentina; G5P[8], G2P[8] e G1P[6] no
Brasil; G3P[6] no México; G9P[6] no Bangladesh; G9P[6], G2P[6], G1P[4], G10P[11]
e diversos G12 na Índia; G8P[6] no Malawi; G2P[6] na Guiné-Bissau; e G4P[6],
G1P[6] e G3P[6] na Africa do Sul. Estes novos genótipos correspondem a 1,5 % das
infecções a nível mundial, embora a nível regional tenham uma relevância muito
superior (3, 4, 5, 9, 13, 16, 17, 33, 37, 44, 57, 89, 92, 93, 123, 127, 137, 142).
De entre os genótipos mais raros, aquele que se tem evidenciado com potencial
patogénico elevado é o G9. Este é considerado o quinto genótipo G dominante e tem um
significado epidemiológico cada vez mais relevante e persistente desde a sua primeira
detecção, na Índia e nos EUA, na década de 80. O G9 está frequentemente associado ao
P[8] e mais raramente ao P[6]. O seu aparecimento quase simultâneo em distintas
regiões climatéricas e em diferentes continentes, sugere que a mutação que levou ao seu
Introdução
42
aparecimento tem um potencial de infecciosidade e de adaptação suficiente para
prevalecer entre os mais frequentes (6, 28, 72, 89, 97, 136, 141, 145).
Outro aspecto interessante da epidemiologia do Rotavírus é a variação sazonal, que é
diferente nas zonas temperadas e nos climas tropicais. Nas primeiras verifica-se um pico
de incidência da GEA no Inverno e Primavera, coincidente com o pico sazonal dos vírus
respiratórios, e posterior diminuição e desaparecimento de casos no Verão e Outono (9,
93, 140, 145). Em oposição, nas zonas equatoriais e tropicais a incidência é quase constante,
sendo possível detectar Rotavírus ao longo dos 12 meses (15, 27, 31, 47, 101).
A distribuição da doença por grupos etários é clara: a criança até aos cinco anos é a
mais afectada, com o pico de incidência entre os seis os 24 meses. A infecção surge
raramente em jovens, adultos e idosos, habitualmente por contágio com crianças e em
época de surto, quando a circulação de Rotavírus é elevada. Estes grupos etários são
mais susceptíveis aos novos genótipos circulantes pela ausência de contacto anterior
com estirpes semelhantes. O aleitamento materno, pela passagem de anticorpos, em
conjunto com a imunidade conferida pela passagem transplacentar de anticorpos podem
interferir na intensidade da infecção durante os primeiros meses de vida. Esta é outra
explicação para o facto dos recém-nascidos apresentarem infecção assintomática ou
com pouca gravidade clínica (2, 4, 22, 27, 34, 36).
As condições socio-económicas, o grau de riqueza e os recursos de saúde do país, não
influenciam a incidência da infecção embora os genótipos virais sejam um pouco
distintos entre estas regiões. A primo-infecção tende a ocorrer nos primeiros meses de
Introdução
43
vida em zonas mais pobres e apresenta o pico de incidência a partir dos 12 meses, nas
regiões mais ricas (3, 4).
Outra diferença geográfica é a percentagem de infecções mistas (2, 26, 72, 124, 142).
Embora variável, existe uma tendência para valores baixos de infecção mista na Europa
Ocidental e EUA. Em média são referidos valores inferiores a 20% no total das GEA
por Rotavírus e, nalguns países, este valor está próximo dos 0%. Em regiões tropicais e
menos favorecidas, a taxa de infecção mista pode chegar aos 30-50%. As menores
condições de saneamento, a existência de famílias alargadas (muitos membros no
mesmo agregado familiar), a habitação precária com casas pequenas e com poucas
divisões e o contacto próximo entre Homem e animais domésticos, favorecem o
aparecimento de infecção mista.
Estes factores, associados à grande capacidade de mutação do vírus e facilidade de troca
de material genético, intra e inter-espécie, levam ao aparecimento de combinações
distintas e à diferença regional na prevalência de genótipos (3, 26, 39, 44, 57, 89, 91, 92, 123, 127).
1.2.13. Mecanismos Evolutivos do Rotavírus
O Rotavírus é um vírus RNA e como tal tem um potencial elevado de apresentar
variações genómicas.
Esta capacidade está na base da grande diversidade de isolados de Rotavírus e estão
descritos diversos mecanismos para esta evolução (9, 33, 37, 46, 47, 57, 77, 137):
• Mutação pontual na sequência nucleotídea (antigenic drift);
• Recombinação entre segmentos de gene distintos (antigenic shift), quando
estirpes diferentes se cruzam e infectam o mesmo hospedeiro;
Introdução
44
• Rearranjos nos genes, sobretudo relacionados com as NSP (fenómenos de
duplicação e delecção nos nucleótidos de um determinado segmento de RNA).
A mutação pontual é muito frequente e pode levar a variações antigénicas suficientes
para condicionar falência na serotipagem e genotipagem (5, 83, 85, 87, 114, 122, 135).
Por seu lado, a recombinação de genes, reassortment, parece ser o processo mais
importante na evolução do Rotavírus e aquele que mais condiciona a diversidade de
estirpes selvagens. O reassortment pode ocorrer quando dois Rotavírus humanos
distintos infectam a mesma célula. A troca de genes é também possível entre estirpes de
diferentes espécies e explica a introdução de genes animais em Rotavírus humanos (26, 44,
57, 68, 76, 84, 114, 134). Embora estes fenómenos ocorram com frequência, o vírus resultante
tem um potencial de sobrevivência fraco, pelo que, adquire pouca expressão clínica e
desaparece naturalmente.
Ainda está por perceber o significado real destes novos dados epidemiológicos uma vez
que, até à data, apenas o G9 se configurou predominante (4, 57, 127).
1.2.14. Prevenção e Controle da Doença
O impacto mundial desta infecção, em termos de morbilidade e mortalidade infantil,
custos sociais e económicos é muito elevado.
Desde os anos 90, a OMS incluiu o combate à infecção por Rotavírus como prioridade
nos seus programas de diminuição da mortalidade infantil mundial. Esta medida foi
apoiada e seguida por outras estruturas, governamentais e não governamentais, como
IOM, UNICEF, CVI (fundada por Bill e Melinda Gates) e a GAVI (19, 42, 61, 62, 119). No
início do século XXI foram estabelecidos os Millenium Development Goals, objectivos
Introdução
45
globais com vista a atingir um maior equilíbrio entre regiões e uma melhor
redistribuição de recursos. O Objectivo 4, redução de dois terços na mortalidade infantil
em crianças com menos de cinco anos, entre 1990 e 2015, inclui a diminuição da
infecção por Rotavírus como uma das estratégias principais para se atingir esse
objectivo (www.wpro.who.int/NR/rdonlyres/7904DEC3-12C2-4E2A-BBD8-
2FE80EF2DAFC/0/Item11_1CHD.pdf). Nesse sentido, a OMS recomenda vivamente a
inclusão de vacinas para o Rotavírus nos programas de imunização nacionais, desde que
exista documentação relativa ao impacto da doença (119, 150, 153).
Tendo em conta que o principal grupo alvo da doença é a criança nos primeiros anos, é
desejável uma vacinação alargada logo nos primeiros meses de vida de forma a
antecipar a ocorrência da infecção natural.
A investigação na área de desenvolvimento de vacinas depende da avaliação de
requisitos muito precisos. Qualquer vacina a ser testada para implementação no
mercado, tem de obedecer a vários pressupostos:
• Ser imunogénica, ou seja, deve induzir uma resposta imunitária significativa que
confira protecção comparável à da infecção natural;
• Ser eficaz, ou seja, deve assegurar um grau de protecção elevado contra doença em
questão;
• Apresentar um bom perfil de segurança, ou seja, os potenciais efeitos acessórios
devem ser ligeiros, transitórios e aceitáveis.
No caso das vacinas para o Rotavírus, os estudos sobre imunidade após a infecção
natural demonstram a importância dos anticorpos localizados na mucosa intestinal,
Introdução
46
como factor major de protecção contra infecções subsequentes. Por este motivo, parece
lógica a criação de vacinas vivas atenuadas, administradas por via oral, que irão
mimetizar a doença e originar uma resposta local, protectora e eficaz (110, 116).
Por outro lado, sabe-se que a imunidade natural após uma primeira infecção por
Rotavírus não é totalmente protectora. É possível nova infecção por outras estirpes
virais, embora os contactos subsequentes com o vírus levem a manifestações clínicas
cada vez menos importantes até serem assintomáticas.
Em consequência, a vacinação deve induzir um grau de imunidade elevado, que permita
evitar a doença ou ter somente manifestações ligeiras de GEA. Isto será obtido pela
administração oral de várias doses da mesma vacina (27, 112, 143, 150).
A criação de vacinas para o Rotavírus começou logo após a sua descoberta (22, 23, 62, 64, 95,
116).
Em 1983 (dez anos após a descoberta do vírus), iniciaram-se os primeiros ensaios
clínicos de uma candidata a vacina. Esta candidata, designada RIT 4237, derivava de
uma estirpe bovina e foi desenvolvida por Timo Vesikari e colaboradores. Era uma
vacina naturalmente atenuada para o Homem, por ter origem numa estirpe animal, que
foi submetida a processos laboratoriais de passagem celular sucessiva para diminuir a
virulência, mas mantendo a capacidade imunogénica de indução de anticorpos. Esta
vacina passou à fase de ensaio clínico, tendo um bom perfil de segurança. No entanto, o
grau de protecção conferido era muito variável e, por isso mesmo, não reprodutível. Não
passou para estudos clínicos em escala alargada e não foi implementada (15, 22, 23, 61, 131).
Introdução
47
Sucederam-se outros estudos laboratoriais, usando estirpes de Rotavírus animais
monovalentes, sujeitas a processos de atenuação e crescimento em sistemas de cultura
celular, embora nenhuma candidata tenha conseguido atingir os resultados desejáveis.
O passo seguinte foi a criação de vacinas recombinantes humana-animal. Na base destas
vacinas está o conceito que genes de Rotavírus animal são naturalmente atenuados no
Homem, por serem originários de uma espécie distinta, e que a junção com genes de
Rotavírus humano irá aumentar o potencial imunogénico e desencadear uma resposta
imunológica parecida à da infecção natural (15, 23, 61).
Em 1998 foi desenvolvida, e licenciada nos EUA, a primeira vacina recombinante
designada RotaShield® (vacina tetravalente recombinante rhesus-humano). Esta vacina
foi testada em mais de 10 000 crianças antes de ser aplicada em larga escala.
Apresentou boas características de imunogenicidade, sendo eficaz na prevenção de
GEA severa (90%) e também na prevenção de qualquer tipo de infecção por Rotavírus
(68%) (1).
A sua comercialização foi acompanhada pela recomendação de vacinação universal de
lactentes, pelos principais organismos reguladores da introdução de vacinas nos EUA –
AAP e ACIP. No entanto, nove meses após a sua introdução, e depois da administração
de mais de 600.000 doses, foi retirada de circulação pela suspeita de associação com
quadros de invaginação intestinal.
A invaginação intestinal é uma doença pediátrica, rara, de etiologia não totalmente
esclarecida, na qual ocorre uma movimentação anómala e aumentada do intestino com
encarceramento de um segmento intestinal noutro e subsequente isquémia tecidular,
Introdução
48
seguida de necrose. É uma situação grave que, se não for tratada atempadamente, pode
conduzir à morte. Os quadros de invaginação intestinal estão associados a infecções
víricas diversas, sobretudo se existe um componente gastrointestinal. No entanto,
nenhum vírus foi directamente relacionado com invaginação intestinal.
No caso da RotaShield® verificou-se que após a administração vacinal, sobretudo na
quinzena seguinte e na sequência da primeira dose administrada, existiu um aumento de
casos de invaginação intestinal (22, 63, 79). Nos anos seguintes, múltiplos autores
procuraram explicar esta relação de causalidade mas, nenhum estudo foi conclusivo. A
possível relação entre invaginação intestinal e vacina RotaShield® continua em aberto,
havendo um risco calculado de 1 em cada 10 000 casos de lactentes vacinados,
sobretudo quando o esquema vacinal se inicia após os seis meses de vida (23, 61, 98, 104,
121).
O embate negativo desta notícia na estratégia de vacinação foi grande e levou á
remodelação do processo de avaliação de segurança na geração seguinte de vacinas. Na
altura em que a RotaShield® foi retirada de comercialização já estavam em estudo
outras duas candidatas a vacinas. Elaboradas com base em conceitos imunológicos
distintos, estas duas candidatas foram sujeitas a testes de segurança muito superiores aos
anteriormente utilizados na elaboração de qualquer vacina.
Em 2004 foi comercializada, no México e noutros países da América Latina, a vacina
Rotarix®. Em 2006 foi comercializada nos EUA, e em diversos países europeus, a
vacina RotaTeq®.
Introdução
49
A Rotarix® deriva de uma estirpe humana, designada 89-12, pertencente ao genótipo
G1P[8]. A escolha deste genótipo deveu-se ao facto de ser globalmente o mais
representativo e induzir uma protecção cruzada para outros genótipos. Esta vacina é
atenuada por múltiplas passagens em sistema de cultura celular, mas mantém o seu
potencial imunogénico. A RotaTeq® é uma vacina pentavalente recombinante bovina-
humana, dirigida para os genótipos G1, G2, G3, G4 e P[8]. Na sua base está uma estirpe
bovina WC3, que corresponde ao genótipo G6 P[5], à qual se associaram genes das
proteínas VP4 e VP7 humanas, relacionados com os principais genótipos G e P
circulantes. Neste caso aliou-se o fenómeno de atenuação natural, conferido pela
proveniência de espécie distinta, ao de imunogenicidade elevada dada pela exposição
aos antigénios mais significativos para o Homem (15, 24, 49, 61, 62, 63, 64, 98, 110, 138).
Os ensaios clínicos de segurança realizados antes da implementação incluíram
populações infantis muito alargadas, com cerca de 63 000 lactentes testados para a
Rotarix® e 71 000 no caso da RotaTeq®. Em ambas, foi avaliada e negada qualquer
relação com invaginação intestinal, assim como, a existência de outros efeitos
acessórios de relevo, desde que seja cumprido o calendário de vacinação (10, 19, 27, 75, 101,
130, 148).
A RotaTeq® apresenta ainda estudos adicionais de segurança e eficácia em lactentes
prematuros, facto de importância crescente nalgumas zonas do globo (67).
Actualmente está a ser avaliado em diversos países na Europa, América e Ásia, o
impacto e incidência da doença, na comunidade e no internamento pediátrico e ainda a
relação custo-efectividade da vacinação (51, 52, 54, 59, 65, 68, 76, 78, 84, 90, 97, 108).
Introdução
50
Destas avaliações sairão recomendações para vacinação universal ou apenas de
determinados grupos de risco (27, 78, 81).
Para além da quantificação da importância da GEA a Rotavírus em relação às outras
GEA da infância, procura caracterizar-se os custos directos e indirectos da doença. Os
custos directos medem-se a partir dos gastos com medicação e despesas com assistência
médica e internamento hospitalar. Os custos indirectos relacionam-se com gastos
adicionais (fraldas, etc.), perda de dias de trabalho e menor rentabilidade laboral. Seja
qual for a medida utilizada estes custos são muito elevados (113).
Fora da Europa e dos E.U.A. têm sido investigadas outras candidatas a vacinas.
Existem, em diferentes fases de ensaio clínico (16, 22, 61, 62, 74, 96, 98):
• A LLR, Lanzhou Lamb Rotavírus, vacina derivada de estirpe animal com
genótipo G12P[10], produzida e comercializada na China desde 2000. Não
existem dados de eficácia e segurança descritos em publicações anglo-saxónicas.
• Uma candidata a vacina derivada de recombinação humana-bovina, investigada
pelo NIH (EUA). Os ensaios clínicos demonstram uma boa imunogenicidade e
segurança e está actualmente em fase de pré implementação em regiões mais
desfavorecidas.
• Duas vacinas derivadas de estirpes de Rotavírus neonatal. Uma delas está a ser
desenvolvida na Índia, a partir do isolado G9P[11], e a outra na Austrália, a
partir do isolado G3P[6]. Ambas estão em fase de investigação preliminar (66).
Várias questões permanecem em aberto relativamente ao desenvolvimento e aplicação
de vacinas para o Rotavírus (27, 61, 63, 64, 73, 74, 80, 101):
Introdução
51
O elevado custo das vacinas actualmente disponíveis e em fase de investigação, não
suportável pelos países com menores recursos económicos.
A sua adequação às regiões mais pobres, onde se prevê (com base em experiência
prévia) que a eficácia das vacinas seja inferior. Nestas zonas existem variados factores
locais que podem interferir com a eficácia vacinal. Sabe-se que as vacinas vivas
atenuadas dependem de um sistema imunitário eficiente, que responda de modo eficaz à
exposição ao agente inoculado. A má-nutrição, a existência de outras doenças tropicais
concomitantes, nomeadamente infestações intestinais, irão certamente interferir com
uma resposta imunitária adequada. Também a elevada incidência de infecção VIH e
SIDA irão condicionar negativamente a resposta a uma vacina viva.
As regiões mais pobres, à partida mais susceptíveis a falência vacinal, são ainda aquelas
onde se detectam genótipos atípicos e menos frequentes, distintos dos que estão
presentes nas vacinas.
Por enquanto, a investigação e implementação de vacinas para o Rotavírus está a meio
de um percurso cuja direcção será determinada pela vigilância dos genótipos
circulantes, eventual mudança de prevalência destes e investimento em vacinas mais
baratas e suportáveis em larga escala (43, 99).
O que é inquestionável é o peso mundial desta infecção e a necessidade de implementar
estratégias comuns, aplicáveis nas diferentes regiões, com distintos recursos
económicos.
Introdução
52
1.2.15. Objectivos do estudo
A importância da infecção por Rotavírus torna-a uma prioridade na investigação e
prevenção através de vacinas.
Cinco genótipos G e dois genótipos P são dominantes mas, este padrão de dominância
tem sofrido oscilações que se tornam significativas nalgumas zonas.
Até à data existem poucos dados epidemiológicos relativos à infecção por Rotavírus em
crianças portuguesas e, os estudos que existem, decorrem num período de tempo curto
(129).
Assim, o presente estudo teve como objectivo principal a caracterização molecular do
Rotavírus numa população pediátrica, ao longo de 13 meses. Esta caracterização
decorreu entre Dezembro de 2006 e Dezembro de 2007 em crianças menores de cinco
anos, residentes na área de Lisboa e arredores, internadas com o diagnóstico de GEA
(em três Unidades de Internamento Pediátrico Hospitalar).
A determinação destes genótipos, a primeira realizada durante 13 meses consecutivos
numa população infantil portuguesa, permitiu conhecer melhor a nossa realidade
epidemiológica e comparar os dados obtidos com populações similares noutros países
europeus.
Como objectivos secundários foram definidos:
• A determinação da importância clínica desta infecção em relação ao total de
internamentos por GEA no mesmo grupo etário, nesses hospitais.
Introdução
53
Criou-se um grupo amostral controle, constituído por crianças com a mesma
faixa etária, internadas nas mesmas Unidades Pediátricas, no mesmo período,
com diagnóstico de GEA, que foram negativas para antigénio de Rotavírus.
• A pesquisa de diferenças clínicas, demográficas ou epidemiológicas significativas
entre GEA por Rotavírus e GEA não rotavírica.
Este objectivo foi avaliado por comparação com o grupo amostral controle e
através de inquérito clínico e sócio-demográfico realizado a todas as crianças
incluídas no estudo.
• A pesquisa de factores de maior susceptibilidade para adquirir infecção, através
da recolha de dados socio-demográficos.
CAPÍTULO II
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
55
2. Materiais e Métodos
No presente capítulo são descritos os materiais e os métodos utilizados durante o
trabalho experimental realizado na presente dissertação de mestrado.
2.1. Materiais
2.1.1. População A população do estudo, designada grupo amostral Rotavírus positivo, foi seleccionada a
partir de cinco critérios:
1) Criança sem patologia crónica conhecida.
2) Idade inferior a cinco anos.
3) Diagnóstico de GEA, realizado durante observação em Serviço de Urgência
Pediátrico. Definição de caso: presença de vómitos incoercíveis e/ou diarreia aguda
manifestada por cinco ou mais dejecções/dia, ou número inferior a cinco desde que
as fezes sejam líquidas ou muito abundantes (características diferentes do habitual
para a criança em estudo).
4) Necessidade de internamento, em Unidade de Internamento de Curta Duração ou
Enfermaria, num de três hospitais da região de Lisboa: Hospital Cuf Descobertas,
Hospital Dona Estefânia e Hospital de São Francisco Xavier.
5) Positividade para antigénio de Rotavírus nas fezes.
2.1.2. Amostras O Rotavírus foi pesquisado a partir de amostra fecal.
A recolha de fezes foi realizada, durante 13 meses consecutivos (1 de Dezembro de
2006 a 31 Dezembro de 2007) a todas as crianças que cumpriram critérios de inclusão
no estudo.
Materiais e Métodos
56
2.1.2.1. Determinação de antigénio de Rotavírus nas fezes
As fezes foram testadas para a presença de antigénios da proteína VP6 do Rotavírus
utilizando um kit comercial de imunocromatografia, o VIKIA® Rota-Adeno
(laboratório bioMerieux, França – Figura 2.1).
No teste referido, ocorre a reacção de imunocromatografia na qual os anticorpos
específicos para determinantes antigénicos da VP6 entram em contacto com fezes que
contêm partículas de Rotavírus e originam uma reacção imunológica específica. A
leitura é feita pelo aparecimento de uma banda, num local pré-definido, quando ocorre
reacção, ou pela ausência de banda nas amostras que não contêm Rotavírus.
Neste teste ocorre o mesmo tipo de reacção para detecção de antigénios de adenovírus,
em simultâneo. Em todos os testes, existe um controle interno de qualidade que valida a
reacção e determina o aparecimento de uma terceira banda. A reacção decorre em cerca
de dez minutos.
Estão descritos, cerca de 5% de resultados falsos positivos e falsos negativos com este
teste de imunocromatografia (151).
FIGURA 2.1
Materiais e Métodos
57
As amostras que foram positivas para Rotavírus no teste rápido, foram conservadas a
4ºC até se proceder à genotipagem.
Em simultâneo, foi criado um grupo amostral controle, com as crianças que
preencheram os critérios de inclusão 1 até 4. Em ambos os grupos foi realizado um
inquérito clínico, epidemiológico e demográfico (ver secção 3.3).
2.2. Trabalho Experimental
A parte experimental do trabalho decorreu na Unidade de Patogénese Viral do Instituto
de Medicina Molecular, na Faculdade de Medicina de Lisboa.
Antes, efectuou-se uma visita a um laboratório europeu de referência em estudo
molecular de Rotavírus, o Enteric Virus Laboratory, Virus Reference Department, no
Health Protection Agency (EVL-HPA). Essa estadia foi orientada pelos investigadores
Miren Iturriza-Gomara e Jim Gray, que possibilitaram o contacto com os vários
procedimentos que utilizam no diagnóstico molecular de Rotavírus. Do contacto com
estes investigadores resultou um protocolo de colaboração, que incluiu a cedência de
informação relativa à metodologia aplicada e partilha de resultados. No IMM aplicaram-
se as mesmas metodologias com pequenas adaptações às condições locais, mas
conservando os princípios aprendidos.
A partir do quarto mês de recolha de amostras fecais procurou-se, sempre que possível,
obtê-las em duplicado de forma a realizar a genotipagem simultânea em Lisboa (IMM)
e em Londres (HPA). A duplicação de amostras teve como objectivo a aferição da
metodologia utilizada no IMM, tendo em conta que não existia experiência prévia nesta
matéria. Pareceu uma opção lógica a utilização de um laboratório de referência, com
técnicos experientes e utilizando a mesma metodologia.
Materiais e Métodos
58
2.3. Procedimentos Laboratoriais
As metodologias utilizadas para a genotipagem das amostras foram (87):
• Extracção do RNA Viral.
• Transcrição Reversa.
• Reacção em Cadeia da Polimerase (dupla reacção de PCR, semi-nested e
multiplex).
• Electroforese em Gel de Agarose.
• Sequenciação de DNA, realizada somente em algumas das amostras não
determinadas.
Na figura 2.2 apresenta-se em esquema a sequência das metodologias utilizadas.
Figura 2.2
Fezes
Positivo Negativo
Teste para detecçãode antigénio de Rotavírus
Extracção RNA
Transcrição reversa de RNA total(Random priming)
1ª PCRGenótipo G
1ª PCRGenótipo P
2ª PCRGenótipo G
2ª PCRGenótipo P
Electroforese em gel de agarose
Grupo controle
Materiais e Métodos
59
2.3.1. Extracção do RNA Viral A extracção do RNA do Rotavírus foi realizada a partir da suspensão da amostra fecal a
10-20%, numa solução salina tamponada. Este primeiro passo teve por objectivo
diminuir a contaminação da amostra, sobretudo por material nucleico de outras origens,
uma vez que a sua presença interfere com a etapa seguinte de purificação de RNA.
Foi utilizado um tubo de 2 ml contendo 2ml de PBS (solução salina tamponizada com
fosfato) no qual foi adicionado 150 a 200 μl de amostra fecal. Esta solução foi
misturada por agitação em vortex e centrifugada a 4000 rpm durante dez minutos, à
temperatura ambiente. Posteriormente recuperou-se a fase aquosa para ser utilizada na
extracção do ácido nucleico viral.
Utilizou-se o Kit comercial QIAamp® Viral RNA, da Qiagen, de acordo com as
instruções do fabricante. Resumidamente, foi realizada a extracção do RNA utilizando
membranas de sílica e gel, em colunas, com especificidade para este material nucleico.
Primeiro, a amostra foi lisada e desnaturada, com o tampão AVL que inactiva RNAses.
A adição de um carrier-RNA à solução anterior, possibilitou a ligação específica ao
ácido nucleico e evitou a sua eluição junto com o sobrenadante. Seguiram-se três passos
de “lavagem” seguida de centrifugação, utilizando tampões de limpeza que promovem a
remoção de contaminantes da amostra enquanto o material nucleico fica ligado à
coluna. O RNA obtido no final da extracção foi considerado livre de proteínas,
nucleases e outros contaminantes ou inibidores.
2.3.2. Transcrição Reversa A transcrição reversa permite a conversão do RNA em cDNA que servirá de modelo
(template) para a amplificação subsequente, por PCR.
Materiais e Métodos
60
A metodologia utilizada baseou-se no uso de random primers, pequenos segmentos de
ssDNA. As suas dimensões reduzidas, aliadas às inúmeras combinações possíveis de
nucleótidos, conferem-lhes a capacidade de se ligarem a qualquer sequência de material
genético. Através de ciclos sucessivos de desnaturação, annealing e polimerização
numa solução tamponada, contendo nucleótidos e enzima transcriptase reversa, foi
possível obter cópias de DNA complementar ao material genético inicial. Este foi o
modelo da etapa seguinte.
No protocolo utilizado no HPA, este passo usa a enzima M-MLV como transcriptase
reversa. No IMM efectuou-se a adaptação para a enzima Superscript III First-Strand
Synthesis Sistem for RT-PCR, da Invitrogen ®, por esta ser uma versão optimizada da
M-MLV. Como vantagens tem a menor actividade de RNase H e a maior estabilidade
térmica, facto que melhora a especificidade da reacção e a qualidade do template.
Descrição da metodologia:
Para cada amostra, adicionou-se uma alíquota de 20 μl da solução contendo RNA
purificado (obtido no passo anterior) a 2 μl de random primers e 2 μl de 10mM dNTP’s.
Seguiu-se um período de incubação a 95ºC durante 5 minutos (para desnaturar o
material nucleico) e depois procedeu-se a arrefecimento rápido, com gelo, durante dois
minutos. Nesta altura foi adicionada à amostra uma mistura contendo 4 μl de solução
tamponada, 8 μl de 25 mM MgCl2, 2μl de RNase out e 2 μl de enzima Supercript III.
Esta solução foi colocada no termociclador LightCicler® e a reacção decorreu nas
seguintes condições: 1 ciclo de annealing (10 minutos, 25ºC), 1 ciclo de transcrição
reversa (50 minutos, 50ºc) e um período de extensão (5 minutos, 85ºC). As amostras
foram novamente submetidas a arrefecimento rápido, em gelo, durante 2 minutos e
seguiu-se a adição de 2 μl de RNase H com novo período de incubação a 37 ºC.
Materiais e Métodos
61
No final, obtiveram-se alíquotas de 40 μl contendo o cDNA a utilizar na etapa seguinte,
amplificação por PCR.
2.3.3. Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) O protocolo utilizado para a amplificação do material genético incluiu a realização de
duas reacções de PCR em sequência, designadas por semi-nested PCR. Seguiu-se
metodologia descrita na literatura e utilizada no HPA (56, 66, 82, 87).
Na primeira reacção de PCR usou-se um par de primers responsáveis pela amplificação
do template utilizado (estes primers são designados de forward e reverse). Na segunda
reacção utilizaram-se um número superior de primers, todos distintos dos anteriores
excepto um que foi idêntico ao utilizado na primeira reacção.
Esta segunda reacção de PCR, para além de semi-nested, designa-se de multiplex,
porque se associam múltiplos primers em cada tubo, que são específicos para os
principais genótipos G e P. A identificação precisa do genótipo presente (desconhecido
à partida) é feita pela amplificação do segmento de DNA, reconhecido por um dos
primers. Adicionalmente serão detectados outros genótipos presentes na mesma
amostra, em casos de infecções mistas.
No presente trabalho foram utilizados primers desenhados ou adaptados pelos
investigadores do HPA, encomendados na BIOTECH®.
Nesta fase do trabalho cada amostra foi dividida em 2 aliquotas iguais (aliquota G e
aliquota P) e cada reacção de PCR ocorreu em duplicado.
Esta necessidade de duplicação deve-se ao facto de cada isolado de Rotavírus se
classificar duplamente (genótipo G e P) de acordo com variações nucleotídeas que têm
Materiais e Métodos
62
segregação independente. Por isso, foram utilizados em separado, logo na primeira
PCR, primers consensuais para o gene 9 e para o gene 4.
Cada amostra foi misturada num primeiro tubo com dois primers específicos para o
gene 9 (primer forward e primer reverse) e num segundo tubo com dois primers
específicos para o gene 4 (igualmente primer forward e primer reverse). Estas reacções
ocorreram sob as mesmas condições experimentais.
Na segunda PCR aplicou-se o mesmo princípio: o produto final da primeira PCR,
resultante da amplificação do segmento com determinado genótipo G, foi novamente
amplificado, utilizando primers específicos para os principais genótipos G circulantes.
No outro tubo, o produto amplificado pela primeira PCR foi exposto a primers
específicos para os principais genótipos P.
Descrição das metodologias:
Na primeira PCR adicionaram-se alíquotas de 5 μl de cDNA a uma mistura designada
Mix G, contendo 9 μl de 5x PCR buffer II, 4μl de 25mM MgCl2, 1 μl de 10mM
dNTP’s, 0,2 μl de Taq Polimerase (5U/μl), 1 μl de primer VP7-F (20pmoles/μl; ver
descrição de primers na tabela 2.1), 1 μl de primer VP7-R (20pmoles/μl; ver descrição
de primers na tabela 2.1) e 28,8 μl de água livre de RNase. O volume total da amostra,
50 μl, foi homogeneizado por breve passagem na centrifugadora e transferido para o
termociclador LightCicler®.
Em simultâneo, adicionou-se a mesma quantidade de cDNA a uma segunda mistura
designada Mix P, contendo 9 μl de 5x PCR buffer II, 5μl de 25mM MgCl2, 1 μl de
10mM dNTP’s, 0,2 μl de Taq Polimerase (5U/μl), 1 μl de primer VP4-F (20pmoles/μl;
Materiais e Métodos
63
ver descrição de primers na tabela 2.2), 1 μl de primer VP4-R (20pmoles/μl; ver
descrição de primers na tabela 2.2) e 27,8 μl de água livre de RNase. No final obteve-se
um volume total idêntico por amostra.
Condições da primeira reacção de PCR:
Um ciclo de desnaturação inicial de 2 minutos a 94ºC, 35 ciclos de amplificação
compostos por desnaturação (1 minuto a 94ºC), hibridação dos oligonucleótidos (1
minuto a 51ºC) e extensão (1 minuto a 72ºC). No final realizou-se mais um ciclo de
extensão (7 minutos a 72ºC) e as amostras permaneceram a 15ºC até ao passo seguinte.
Para a segunda reacção de PCR, prepararam-se duas misturas em paralelo, cada uma
com 48 μl de volume.
Uma das misturas (Mix2 G) continha 9,6 μl de 5x PCR buffer II, 5μl de 25mM MgCl2,
1μl de 10mM dNTP’s, 0,2 μl de Taq Polimerase (5U/μl) e 1 μl de cada um dos
seguintes primers, VP7-R, G1, G2, G3, G4, G8, G9, G10 e G12, todos com a
concentração de 20pmole/μl (ver descrição de primers nas tabelas 2.1 e 2.3). A esta
mistura foi adicionado 2 μl do produto final da primeiro PCR amplificado com os
primers VP7-F e VP7-R.
A segunda mistura (Mix2 P) continha 9,6 μl de 5x PCR buffer II, 5μl de 25mM MgCl2,
1 μl de 10mM dNTP’s, 0,2 μl de Taq Polimerase (5U/μl) e 1 μl de cada um dos
seguintes primers, VP4-F, P[4], P[6], P[8], P[9], P[10] e P[11], com a concentração
individual de 20pmole/μl (ver descrição de primers nas tabelas 2.2 e 2.4). Neste caso
adicionou-se, a cada alíquota de 48 μl, 2 μl do produto final da primeira PCR
amplificado com os primers VP4-F e VP4-R.
Materiais e Métodos
64
Condições da segunda reacção de PCR:
Um ciclo de desnaturação inicial de 4 minutos a 94ºC, 30 ciclos de amplificação
compostos por desnaturação (1 minuto a 94ºC), hibridação dos oligonucleótidos (2
minutos a 43ºC) e extensão (1 minuto a 72ºC). No final realizou-se mais um ciclo de
extensão (7 minutos a 72ºC) e as amostras permaneceram a 15ºC até ao passo seguinte.
TABELA 2.1
TABELA 2.2
TABELA 2.3
y = c/t ; r = g/a Os primers aBT1, aCT2, aDT4 e aAT8 foram os originais e ainda se utilizam; Os restantes primers foram adaptados da sequência inicial para acompanhar a variação genética (G3 e G9) ou foram criados recentemente após detecção de novos genótipos com relevância clínica (G10 e G12).
aac ttg cca cca ttt ttt cc914 - 932VP7-R
atg tat ggt att gaa tat acc ac51 – 71VP7-F
Sequência 5’ – 3’Posição - ntPrimer
Primers utilizados na primeira PCR - Oligonucleótidos para genotipagem GProduto final: segmento com 881 bp (85,87)
aac ttg cca cca ttt ttt cc914 - 932VP7-R
atg tat ggt att gaa tat acc ac51 – 71VP7-F
Sequência 5’ – 3’Posição - ntPrimer
Primers utilizados na primeira PCR - Oligonucleótidos para genotipagem GProduto final: segmento com 881 bp (85,87)
att gca ttt ctt tcc ata atg775 - 795VP4-R
tat gct cca gtn aat tgg132 - 149VP4-F
Sequência 5’ – 3’Posição - ntPrimer
Primers utilizados na primeira PCR - Oligonucleótidos para genotipagem PProduto final: segmento com 663 bp (56)
att gca ttt ctt tcc ata atg775 - 795VP4-R
tat gct cca gtn aat tgg132 - 149VP4-F
Sequência 5’ – 3’Posição - ntPrimer
Primers utilizados na primeira PCR - Oligonucleótidos para genotipagem PProduto final: segmento com 663 bp (56)
atg tca gac tac ara tac tgg666 – 687 (266 bp)G10
ctt gat gtg act aya aat ac757 – 776 (179 bp)G9
gtc aca cca ttt gta aat tcg178 – 198 (754 bp)G8 / aAT8
cgt ttc tgg tga gga gtt g480 – 499 (452 bp)G4 / aDT4
acg aac tca aca cga gag g250 – 269 (682 bp)G3
caa tga tat taa cac att ttc tgt g411 – 435 (521 bp)G2 / aCT2
ccg atg gac gta acg ttg ta548 – 567 (387 bp)G12
caa gta ctc aaa tca atg atg g314 – 335 (618 bp)G1 / aBT1
Sequência 5’ – 3’Posição-nt (dimensões)Primer
Primers utilizados na PCR multiplex para genotipagem G(Gouvea e tal, 1990; Iturriza Gómara et al, 2004)
atg tca gac tac ara tac tgg666 – 687 (266 bp)G10
ctt gat gtg act aya aat ac757 – 776 (179 bp)G9
gtc aca cca ttt gta aat tcg178 – 198 (754 bp)G8 / aAT8
cgt ttc tgg tga gga gtt g480 – 499 (452 bp)G4 / aDT4
acg aac tca aca cga gag g250 – 269 (682 bp)G3
caa tga tat taa cac att ttc tgt g411 – 435 (521 bp)G2 / aCT2
ccg atg gac gta acg ttg ta548 – 567 (387 bp)G12
caa gta ctc aaa tca atg atg g314 – 335 (618 bp)G1 / aBT1
Sequência 5’ – 3’Posição-nt (dimensões)Primer
Primers utilizados na PCR multiplex para genotipagem G(Gouvea e tal, 1990; Iturriza Gómara et al, 2004)
Materiais e Métodos
65
TABELA 2.4
n = a/c/g/t ; r = g/a Os primers 1T-1, 2T-1, 3T-1, 4T-1 e 5T-1 foram os originais e ainda se utilizam; O genótipo P[11] foi criado recentemente após detecção com relevância clínica.
2.3.4. Electroforese em Gel de Agarose
A partir do produto final obtido no passo anterior foi realizada electroforese em gel de
agarose, seguida de leitura dos fragmentos obtidos sob luz ultravioleta.
A electroforese é um método preferencial para separação de fragmentos de DNA.
Baseia-se na maior ou menor facilidade de migração dos fragmentos através dos poros
do gel de agarose, de acordo com o seu peso molecular. A modificação da concentração
do gel permite variar a dimensão dos poros (o gel menos concentrado apresenta os
poros maiores e vice versa) e, deste modo, possibilita a separação de fragmentos de
muito baixo peso molecular até peso molecular próximo de 20 000 kDa.
A leitura dos fragmentos é feita por comparação com marcadores de peso molecular
estandardizados.
gta aac atc cag aat gtg305 - 323 (312 bp)P[11]
atc ata gtt agt agt cgg575 - 594 (583 bp)P[10] / 5T-1
tga gac atg caa ttg gac385 - 402 (391 bp)P[9] / 4T-1
tct act ggr ttr acn tgc339 - 356 (345 bp)P[8] / 1T-1
tgt tga tta gtt gga ttc aa259 - 278 (267 bp)P[6] / 3T-1
cta ttg tta gag gtt aga gtc474 - 494 (483 bp)P[4] / 2T-1
Sequência 5’ – 3’Posição-nt (dimensões)Primer
Primers utilizados na PCR multiplex para genotipagem P (56,87)
gta aac atc cag aat gtg305 - 323 (312 bp)P[11]
atc ata gtt agt agt cgg575 - 594 (583 bp)P[10] / 5T-1
tga gac atg caa ttg gac385 - 402 (391 bp)P[9] / 4T-1
tct act ggr ttr acn tgc339 - 356 (345 bp)P[8] / 1T-1
tgt tga tta gtt gga ttc aa259 - 278 (267 bp)P[6] / 3T-1
cta ttg tta gag gtt aga gtc474 - 494 (483 bp)P[4] / 2T-1
Sequência 5’ – 3’Posição-nt (dimensões)Primer
Primers utilizados na PCR multiplex para genotipagem P (56,87)
Materiais e Métodos
66
No trabalho experimental utilizou-se gel de agarose a 2%, em tampão de electroforese
TAE (0,4 M Tris base, 0,2 M ácido acético, 10 mM EDTA pH 8,0). Ao gel foi
adicionado brometo de etídio (concentração 1μg/ml).
Em cada poço do gel foi colocada mistura contendo 10 μl do produto final da segunda
PCR e 2 μl de loading buffer concentrado 10x. Usou-se como marcador molecular o
GelPilot 100bp Plus Ladder® da Qiagen. Este marcador permite separar bandas com
diferença de 100 bp entre 100 e 1000 bp, tendo uma banda adicional nos 1500 bp.
O gel correu a voltagem constante de cerca de 100 volts. No final procedeu-se à leitura
dos fragmentos obtidos, sob luz ultra-violeta.
2.3.5. Sequenciação de DNA Apesar da elevada sensibilidade e especificidade da metodologia descrita, estão
previstas entre 5 e 10% de amostras não determinadas. Este fenómeno pode acontecer
por vários motivos:
1. Ocorrência de resultado falso positivo para Rotavírus no teste de
imunocromatografia;
2. Amostra positiva para Rotavírus mas com genótipo diferente dos que são
pesquisados na PCR multiplex;
3. Amostra positiva para Rotavírus e o genótipo presente é um dos pesquisados na
PCR, mas existem alterações na sequência nucleotídea que impossibilitam a
detecção pelo primer específico.
A sequenciação procura esclarecer a causa da não determinação do genótipo.
Materiais e Métodos
67
Nalgumas amostras ND foi possível sequenciar o material genético amplificado na
primeira PCR. Antes da sequenciação de DNA realizaram-se dois passos, extracção do
fragmento de DNA, a partir de gel de agarose, e purificação do mesmo.
Descrição dos procedimentos realizados:
Utilizou-se 20 μl do produto final da primeira PCR (o fragmento de DNA com 881 bp
na genotipagem G ou o fragmento com 663 bp, na genotipagem P) para realizar
electroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio. A banda foi
identificada com luz ultravioleta, excisada com o auxílio de lâmina de bisturi e colocada
em tubo de microcentrifuga.
Seguidamente procedeu-se à purificação do DNA utilizando o QIAquick Gel Extraction
Kit® da Qiagen, de acordo com as instruções do fabricante.
Adicionou-se a amostra a um tampão QG, numa proporção de volume de 1:3. Incubou-
se a 50ºC durante 10 minutos (para dissolver o gel), adicionou-se um volume
equivalente de isopropanol e misturou-se num agitador vortex. A solução foi colocada
numa coluna e centrifugada a 13 000 rpm durante 1 minuto. Rejeitou-se o soluto eluído,
adicionou-se novamente tampão QG e repetiu-se a centrifugação a 13 000 rpm, durante
1 minuto. Seguidamente foi adicionado um segundo tampão, QE, à coluna tendo-se
prosseguido com centrifugação, a 13 000 rpm durante 1 minuto. Desperdiçou-se o
soluto eluído e repetiu-se a centrifugação, para eliminar vestígios de álcool ainda
presentes. A coluna foi colocada em tubo de 1,5 ml e efectuou-se a eluição do DNA
purificado com recurso a tampão EB (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) e posterior centrifugação
(13 000 rpm durante 1 minuto). Obteve-se uma solução correspondendo a DNA
purificado, com um volume final de 50 μl.
Materiais e Métodos
68
Nesta fase determinou-se a concentração de DNA através da medição da absorvância da
amostra, por espectofotometria (ND-1000, Nanodrop).
O passo seguinte foi a sequenciação, de acordo com protocolo utilizado no IMM.
Adicionou-se um volume suficiente de DNA purificado para obter uma concentração
entre 30 e 90 ng, a 2 μl de tampão, 2 μl de ready reaction mix, 1 μl de primer (VP7 ou
VP4, consoante a sequenciação pretendida) e água, para obter um volume final de 10 μl.
A mistura foi colocada no termociclador e sujeita a reacção de amplificação composta
pelos seguintes passos: desnaturação inicial (1 minuto a 96ºC), seguida de 25 ciclos de
desnaturação (10 segundos a 96ºC), hibridação de oligonucleótidos (5 segundos a 50ºC)
e extensão (4 minutos a 60ºC).
O passo seguinte foi a precipitação do DNA pela adição de soluto contendo etanol e
acetato de sódio, de acordo com o seguinte protocolo:
1. Adição de 10 μl de DNA purificado a solução com 3M acetato de sódio (pH 4,6), 50
μl de etanol a 100% e 10 μl de água.
2. Incubação à temperatura ambiente durante 60 minutos e centrifugação a 14 000 rpm,
durante 30 minutos.
3. Aspiração do sobrenadante e adição de 200 μl de etanol a 70% com nova
centrifugação a 14 000 rpm durante 15 minutos.
4. Após aspiração do sobrenadante o precipitado final ficou em ar ambiente, para
secagem natural.
Materiais e Métodos
69
O tubo que continha o DNA foi analisado na Unidade de Sequenciação do Instituto
Gulbenkian de Ciência (Oeiras), utilizando um sequenciador automático 377 DNA
sequencer (ABI Prism).
As sequências nucleotídeas foram analisadas através do programa Chromas e foram
comparadas com sequências depositadas no NCBI, utilizando o programa BLAST (site:
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
2.4. Análise estatística
Os resultados moleculares foram analisados com recurso ao programa Intercooled
Stata®, versão 8.2. O limite de significância estatística considerado foi de 5% (p <0,05),
a análise de variáveis foi feita pelo teste exacto de Fisher e pelo modelo de regressão
linear.
Os dados clínicos, epidemiológicos e demográficos referentes aos dois grupos amostrais
foram analisados e comparados pela mesma metodologia.
CAPÍTULO III
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Resultados e Discussão
71
3. Resultados e Discussão
A parte clínica do projecto, recolha de amostras fecais, decorreu nas três Unidades de
Internamento Pediátrico de Hospitais da área de Lisboa. Foi realizada a pesquisa de
antigénio de Rotavírus nas fezes às crianças internadas com menos de cinco anos de
idade, com o diagnóstico de GEA. A detecção rápida do antigénio viral foi feita com o
kit VIKIA® Rota-Adeno.
Ao longo dos 13 meses foram realizados 180 testes VIKIA® Rota-Adeno, dos quais
102 foram positivos para Rotavírus. O grupo amostral Rotavírus positivo foi constituída
por essas 102 amostras e o grupo amostral controle compreendeu as restantes 78
amostras, negativas para Rotavírus.
A parte experimental da presente dissertação decorreu em Lisboa (no IMM) e Londres
(no EVL-HPA).
3.1. Genotipagem
Nos primeiros quatro meses do estudo obtiveram-se 33 amostras positivas para
antigénio de Rotavírus, que foram genotipadas durante a estadia no EVL-HPA.
A partir de Março de 2007 as amostras obtidas foram testadas (sempre que possível) em
duplicado, no IMM e no EVL-HPA.
Das restantes amostras positivas, foi possível testar em simultâneo 39 amostras. Em 54
casos as amostras foram testadas apenas no EVL-HPA (as 33 amostras reccolhidas nos
primeiros quatro meses e 21 amostras no restante tempo de estudo) e em 9 casos a
Resultados e Discussão
72
genotipagem foi efectuado apenas no IMM. Quando não foi possível duplicar amostras
optou-se por mantê-las no estudo e testá-las apenas num dos laboratórios (tabela 3.1).
Tabela 3.1 Total de amostras testadas = 102
Genotipagem no IMM:
Nas figuras 3.1 a 3.5 apresentam-se os resultados das amostras genotipadas no IMM.
As amostras foram numeradas consecutivamente de A1 até A48 e foram genotipadas em
grupos de 10, excepto o último grupo que incluiu apenas 8 amostras. Cada figura mostra
a fotografia obtida para cada gel realizado.
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10L L
Genotipo G
Genotipo P
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10L L
Genotipo G
Genotipo P
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10L L
Genotipo G
Genotipo P
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
Figura 3.1 L = ladder / marcador de pesos moleculares; A = amostra A1 até A10.
9348total
549Amostras testadas num laboratório
3939Amostras testadas duplamente
EVD-HPAIMMlaboratório
9348total
549Amostras testadas num laboratório
3939Amostras testadas duplamente
EVD-HPAIMMlaboratório
Resultados e Discussão
73
A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20L L
Genotipo G
Genotipo P
C
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20L L
Genotipo G
Genotipo P
CA11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18 A19 A20L L
Genotipo G
Genotipo P
C
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
Figura 3.2 L = ladder / marcador de pesos moleculares; A = amostra A11 até A20;
C = controle negativo.
A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29 A30L L
Genotipo G
Genotipo P
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29 A30L L
Genotipo G
Genotipo P
A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29 A30L L
Genotipo G
Genotipo P
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
Figura 3.3 L = ladder / marcador de pesos moleculares; A = amostra A21 até A30;
C = controle negativo.
Resultados e Discussão
74
A31 A32 A33 A34 A35 A36 A37 A38 A39 A40L L
Genotipo G
Genotipo P
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
A31 A32 A33 A34 A35 A36 A37 A38 A39 A40L L
Genotipo G
Genotipo P
A31 A32 A33 A34 A35 A36 A37 A38 A39 A40L L
Genotipo G
Genotipo P
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
Figura 3.4 L = ladder / marcador de pesos moleculares; A = amostra A31 até A40
A41 A42 A43 A44 A45 A46 A47 A48
Genotipo G
Genotipo P
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
A41 A42 A43 A44 A45 A46 A47 A48
Genotipo G
Genotipo P
100 bp
600 bp
100 bp
600 bp
Figura 3.5
L = ladder / marcador de pesos moleculares; A = amostra A41 até A48
Resultados e Discussão
75
No Anexo I está descrito o resultado individual de cada uma das 48 amostras testadas
no IMM. Evidencia-se o genótipo encontrado, ou não determinado quando não foi
possível obter um resultado, seguido do respectivo peso molecular. Mostra-se também o
resultado obtido, para as mesmas amostras, no EVL-HPA
Nas amostras nas quais a genotipagem foi efectuada em duplicado, verificou-se uma
concordância total para os genótipos encontrados. Em nenhum caso foi diagnosticado
um genótipo distinto para a mesma amostra.
Resultados finais da genotipagem
Na tabela 3.2 apresentam-se os resultados finais da genotipagem, obtidos pela junção
dos resultados dos dois laboratórios. Correspondem por isso, à totalidade de amostras
testadas (n=102).
Tabela 3.2
Distribuição de genótipos:
Durante o estudo existiu a circulação dos cincos genótipos predominantes, com
destaque para dois deles. Houve um claro predomínio do genótipo G2P[4] que esteve
presente em 40,2% de casos, sendo o segundo genótipo mais prevalente o G9P[8] com
24,5%. Estes dois genótipos em conjunto com o G1P[8], o terceiro mais prevalente,
100%11,94024,54,96,840,216,7PERCENTAGEM
102124025574117NUMERO
TOTALGENOTIP NEGATIVA
INF. MISTAGENOTIPOS
NDOUTROS
GENOTIPOSG9P[ 8]G4P[ 8]G3P[ 8]G2P[4]G1P[8]GENOTIPOS
100%11,94024,54,96,840,216,7PERCENTAGEM
102124025574117NUMERO
TOTALGENOTIP NEGATIVA
INF. MISTAGENOTIPOS
NDOUTROS
GENOTIPOSG9P[ 8]G4P[ 8]G3P[ 8]G2P[4]G1P[8]GENOTIPOS
Resultados e Discussão
76
corresponderam a cerca de 80% da população em estudo. Os restantes genótipos,
G3P[8] e G4P[8], tiveram individualmente uma expressão pouco significativa.
Não foram detectados genótipos atípicos, que são pouco frequentes na Europa, mas que
se têm tornado significativos nalgumas regiões do globo. A sua ausência tem ainda mais
significado, uma vez que se utilizaram primers específicos, dirigidos a estes. A saber:
G10, G12, P[4], P[6], P[9], P[10] e P[11].
Até à data, a descrição desses genótipos na Europa tem ocorrido como formas
esporádicas, sem relação com surtos relevantes a nível de saúde pública.
Ao longo dos 13 meses verificou-se apenas um caso de detecção de antigénio de
Rotavírus positiva, com resultado negativo por genotipagem (amostra A32, negativa em
ambos os laboratórios). Este resultado sugere a boa sensibilidade do teste rápido, com
um valor próximo de 1% de falsos positivos. De qualquer modo, existiram amostras
com genotipagem negativa em Lisboa e positiva em Londres (A31 e A33 até A37) que
levantam a possibilidade de degradação do material nucleico. Esta poderá ser uma
explicação adicional para a diferença entre o teste de detecção rápida e o método
molecular.
No IMM, em 13 amostras não foi possível determinar o genótipo, G ou P, pelo método
de RT-PCR.
A não determinação (ND) de genótipo ocorreu também em seis amostras testadas em
Londres.
Resultados e Discussão
77
Relativamente às amostras ND no IMM verificou-se:
1. Em nove casos tinha sido possível encontrar o genótipo no EVL-HPA e este foi
aceite como resultado definitivo (A14, A25, A29, A31, A33, A34, A35, A36,
A37).
2. Num caso houve concordância com resultado negativo obtido no EVL-HPA e
esta amostra foi considerada negativa (A32).
3. Em três casos, verificou-se que no EVL-HPA houve apenas determinação de
genótipo P (A4) ou as amostras não foram testadas (A42, A43). Nestes casos, a
ausência de banda no gel impossibilitou a etapa de sequenciação.
Em relação às seis amostras ND em Londres, verificou-se:
1. Uma amostra foi negativa para os dois genótipos, tendo-se obtido resultado
idêntico no IMM – A32. Esta amostra foi considerada negativa para Rotavírus.
2. Uma amostra foi ND para o genótipo G, sendo o resultado não conclusivo no
IMM – A4. Por sequenciação correspondeu ao genótipo G3 (ver secção 3.2).
3. Numa amostra o genótipo P era ND e correspondeu a P[8] por RT-PCR no IMM
– A19.
4. Nos restantes três casos o resultado foi considerado negativo (2) ou ND (1) para
o genótipo P e não foi realizada genotipagem no IMM (dados não apresentados).
Nestes casos não foi possível realizar a sequenciação.
A concordância de resultados de genotipagem entre os dois laboratórios permitiu aceitar
como válidos os resultados que foram testados apenas num deles.
Resultados e Discussão
78
Em resumo, no final do estudo, de entre os casos em que não houve determinação do
genótipo num dos laboratórios foi possível resolver a maioria ficando apenas quatro
casos considerados negativos ou ND (tabela 3.3).
Tabela 3.3
3.2. Sequenciação
No IMM, foi realizada a sequenciação do DNA em quatro amostras. Corresponderam a
quatro casos nos quais houve dificuldade na leitura do genótipo G, devido a
interferência com bandas adicionais.
As hipóteses a esclarecer foram:
• (H1) Genótipo distinto não identificado pelos primers;
• (H2) Genótipo frequente com variações nucleotídeas específicas que o tornam
não reconhecível pelos primers em uso.
As quatro amostras sequenciadas foram A4, A14, A25 e A29. Os resultados obtidos
apresentam-se de acordo com a identidade encontrada pela pesquisa BLAST, que foi
superior a 94% em todas as sequências encontradas.
9 – genotipadas EVD / HPA
1 – genotipagem IMM
3 - ND
1 - negativa
1 – sequenciação IMM6EVL / HPA
3 - ND
1 - negativa13IMM
Resultado finalAmostras ND por genotipagemLaboratório
9 – genotipadas EVD / HPA
1 – genotipagem IMM
3 - ND
1 - negativa
1 – sequenciação IMM6EVL / HPA
3 - ND
1 - negativa13IMM
Resultado finalAmostras ND por genotipagemLaboratório
Resultados e Discussão
79
A amostra A4 tinha sido G negativa no EVD-HPA e ND no IMM e apresentou
identidade com o genótipo G3 (tabela 3.4).
As amostras A14 e A29, ND no IMM, apresentaram identidade com o genótipo G3,
idêntico ao resultado obtido no EVD-HPA (tabelas 3.5 e 3.6).
A amostra A25 foi ND para o genótipo G e apresentou identidade com o genótipo G9
(tabela 3.7).
Tabela 3.4 (Amostra A4)
Tabela 3.5 (Amostra A14)
Tabela 3.6 (Amostra A29)
Tabela 3.7 (Amostra A25)
Ou seja, por sequenciação confirmou-se a hipótese H2.
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-374 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsDQ995489.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-392 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsDQ995490.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-545 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495121.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-582 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495122.1
Max identQuery coverageDescriptionAccession
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-374 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsDQ995489.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-392 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsDQ995490.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-545 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495121.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-582 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495122.1
Max identQuery coverageDescriptionAccession
97%98%Human rotavirus G3 isolate Chi-3 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495118.1
97%98%Human rotavirus G3 isolate VN-545 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495121.1
97%98%Human rotavirus G3 isolate VN-582 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495122.1
97%98%Human rotavirus A strain 2116Madrid outer capsid protein gene, partial cdsDQ440619.1
Max identQuery coverageDescriptionAccession
97%98%Human rotavirus G3 isolate Chi-3 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495118.1
97%98%Human rotavirus G3 isolate VN-545 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495121.1
97%98%Human rotavirus G3 isolate VN-582 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495122.1
97%98%Human rotavirus A strain 2116Madrid outer capsid protein gene, partial cdsDQ440619.1
Max identQuery coverageDescriptionAccession
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-374 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsDQ995489.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-392 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsDQ995490.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-545 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495121.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-582 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495122.1
Max identQuery coverageDescriptionAccession
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-374 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsDQ995489.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-392 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsDQ995490.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-545 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495121.1
95%99%Human rotavirus G3 isolate VN-582 outer capsid protein VP7 gene, complete cdsEF495122.1
Max identQuery coverageDescriptionAccession
94%96%Human rotavirus G9 strain 01TW1288 outer capsid protein VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ097010.1
94%96%Human rotavirus G9 strain 02TW465 outer capsid protein VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ097012.1
94%96%Human rotavirus G9 strain 02TW1532 outer capsid protein VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ097015.1
94%96%Human rotavirus A strain 99TW1832 outer capsid protein VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ109980.1
94%96%Rotavirus A strain 15vp4w VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ674947.1
Max identQuery coverageDescriptionAccession
94%96%Human rotavirus G9 strain 01TW1288 outer capsid protein VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ097010.1
94%96%Human rotavirus G9 strain 02TW465 outer capsid protein VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ097012.1
94%96%Human rotavirus G9 strain 02TW1532 outer capsid protein VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ097015.1
94%96%Human rotavirus A strain 99TW1832 outer capsid protein VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ109980.1
94%96%Rotavirus A strain 15vp4w VP4 (VP4) gene, partial cdsDQ674947.1
Max identQuery coverageDescriptionAccession
Resultados e Discussão
80
3.3. Características demográficas e epidemiológicas dos dois grupos amostrais
Em todas as crianças incluídas no estudo foi realizado um inquérito demográfico e
epidemiológico (ver Anexo II).
Cada inquérito incluiu informação sobre sexo, idade, duração de sintomas antes do
internamento, data de internamento, duração de internamento, sintomas presentes na
admissão hospitalar, em particular diarreia, vómitos e febre, medicação efectuada,
especificando o soro endovenoso e a necessidade de antibiótico, contacto conhecido
com indivíduos doentes, ingestão de alimentos suspeitos, frequência de
infantário/escola, ama ou permanência em casa e resultado do teste rápido para pesquisa
de antigénio de Rotavírus.
Realizaram-se 180 inquéritos que corresponderam às 102 crianças do grupo amostral
Rotavírus positivo e às 78 crianças internadas por GEA devida a outro agente etiológico
(grupo amostral controle).
3.3.1. Dados demográficos e epidemiológicos do grupo amostral Rotavírus positivo
No estudo, a incidência de GEA a Rotavírus em relação ao total de internamentos por
GEA, nas idades compreendidas entre 0 e 60 meses, foi de 56,7%. Estes valores são
concordantes com os dados da literatura relativos a diversos países da União Europeia,
que mostram uma incidência em internamento entre 25 e 55% e confirmam a
importância do Rotavírus enquanto agente causal de GEA severa até aos cinco anos.
No entanto, relembra-se que a população do estudo não abrangeu distintas regiões e que
estes resultados necessitam ser confirmados por estudos nacionais, em escala alargada.
Resultados e Discussão
81
Características do grupo amostral
Em relação a este grupo (n = 102), são apresentados os resultados de 96 inquéritos. Em
seis inquéritos a informação coligida estava incompleta e, nestes casos, optou-se pela
não inclusão dos dados na avaliação estatística.
1. Distribuição por sexo e idade
A distribuição por sexo foi equilibrada, com 53 crianças do sexo masculino e 43 do
sexo feminino (55 % rapazes vs 45% raparigas). De facto, esta é uma doença para a qual
não existe predisposição de sexos.
Em relação ao grupo etário, verificou-se uma predominância clara da infecção nos
primeiros 36 meses de vida. O pico maior ocorreu entre os 0 e 11meses (42,8% de
internamentos), seguido pelo grupo entre os 12 e 23 meses (27,1%). Apresentou ainda
significado o grupo entre os 24 e 35 meses (20,8%) e, em conjunto, estas três faixas
etárias corresponderam a mais de 90% dos internamentos (tabela 3.8).
Tabela 3.8 (Distribuição por idades; n = 96)
6 (6 ,2 )
3 6 – 4 7 m
3 (3 ,1 )2 0 (2 0 ,8 )2 6 (2 7 ,1 )4 1 (4 2 ,8 )N ú m ero (P e rcen tag e m )
4 8 – 5 9 m2 4 – 3 5 m1 2 – 2 3 m0 - 1 1 mId ad e
6 (6 ,2 )
3 6 – 4 7 m
3 (3 ,1 )2 0 (2 0 ,8 )2 6 (2 7 ,1 )4 1 (4 2 ,8 )N ú m ero (P e rcen tag e m )
4 8 – 5 9 m2 4 – 3 5 m1 2 – 2 3 m0 - 1 1 mId ad e
Resultados e Discussão
82
Esta distribuição reflecte o carácter mais grave da doença nos primeiros anos de vida,
associada à maior imaturidade do sistema imunitário e maior probabilidade de se estar
perante uma primo-infecção.
A pesquisa de uma associação entre genótipo G e idade e entre genótipo G e sexo, não
evidenciou nenhuma associação entre estas variáveis (sobreposição de intervalos de
confiança de 95% e p <0,15 pelo Teste exacto de Fisher).
2. Sintomatologia associada ao episódio
Foi muito frequente a ocorrência de vómitos e diarreia associados, presentes em 89
casos (92,7%). Na data de internamento em três casos havia apenas diarreia (3,1%) e em
quatro casos (4,1%) existiam somente vómitos. Nesta última situação a diarreia surgiu
após a admissão e, só então, teve lugar a recolha de fezes para o estudo.
A febre esteve presente em 58 casos (60,4%) e, em todos, acompanhou a restante
sintomatologia gastrointestinal (tabela 3.9).
A duração média da sintomatologia antes do internamento foi de 2,3 dias (variou entre
algumas horas e 10 dias).
Tabela 3.9
(Sintomatologia presente no dia de internamento; n = 96)
Não se encontrou associação entre a sintomatologia presente na data de internamento e
genótipo G (p <0,94 na associação com diarreia e vómitos e p <0,93 na associação com
febre; Teste exacto de Fisher).
58 / 96(60,4)
Febre
3 / 96(3,1)
4 / 96(4,1)
89 / 96(92,7)
Número (Percentagem)
DiarreiaVómitos Vómitos + Diarreia Sintomatologia
58 / 96(60,4)
Febre
3 / 96(3,1)
4 / 96(4,1)
89 / 96(92,7)
Número (Percentagem)
DiarreiaVómitos Vómitos + Diarreia Sintomatologia
Resultados e Discussão
83
3. Terapêutica realizada durante o internamento
A medicação instituída incluiu sempre soro de rehidratação endovenoso. Em 82 casos
(85,4%) esta foi a única terapêutica realizada. Em 14 crianças (14,6%) para além do
soro endovenoso, recorreu-se à prescrição de antibióticos. Apenas num caso existiu
necessidade de efectuar medicação adicional, broncodilatador e anti-inflamatório,
dirigida para sintomas respiratórios associados.
Não foi encontrada associação entre uso de antibiótico e a presença simultânea de
diarreia e vómitos (p <0,22 no Teste exacto de Fisher), nem entre uso de antibiótico e
existência de febre (p <0,55 no Teste exacto de Fisher).
4. Duração média de internamento
A duração do internamento foi registada apenas nos inquéritos referentes a crianças
internadas em dois dos três hospitais (em relação ao HDE não foi possível obter esta
informação). Foram avaliados 73 casos e, neste subgrupo amostral, verificou-se uma
duração média de estadia no hospital de 2,4 dias. O intervalo de tempo variou entre um
mínimo de algumas horas e um máximo de 10 dias.
Na procura de associação entre idade, sexo, genótipo, sintomas presentes na data de
internamento, terapêutica realizada e a duração do internamento, verificou-se uma
associação positiva entre sexo feminino e internamento mais prolongado (pelo modelo
de regressão linear múltipla, usando como variável dependente a duração do
internamento).
Na literatura não existe nenhuma descrição relativa a esta associação encontrada.
Resultados e Discussão
84
De qualquer modo, foi feita a pesquisa de associação entre genótipo e sexo, que seria
um possível factor de viés, e foi negada associação entre ambos (p <0,154 no Teste
exacto de Fisher).
Foi encontrada também uma associação entre G3 e internamento mais prolongado (p
<0,01, no modelo de regressão linear múltipla usando como variável dummy o
genótipo). A duração do internamento nos sete casos de G3 distribuiu-se por 1 (1x), 2
(1x), 3 (2x), 6 (1x) e 7 dias (2x) e condicionou um desvio que foi significativo da
duração média. Este tema tem sido objecto de alguns estudos mas, não foi encontrada
até à data relação entre estas duas variáveis (genótipo e duração de internamento). Seria
necessário um número maior de amostras deste genótipo para se tirarem conclusões
mais consistentes.
5. Contacto conhecido com indivíduos com os mesmos sintomas
Em 27 casos (28,1%) foi considerado relevante o contacto com pessoas doentes, em
diferentes ambientes (casa, ama ou infantário).
6. Ingestão de alimentos suspeitos
Apenas num caso houve referência a ingestão de alimento considerado suspeito. Nesse
caso não se discriminou qual o alimento ingerido. Esta suspeita não condicionou a
terapêutica efectuada, nomeadamente não houve prescrição de antibiótico, nem a
duração do internamento.
Estes dois aspectos (contacto com pessoa doente e ausência de associação com ingestão
de alimentos de suspeitos) apoiam a ideia da transmissão fecal-oral como a principal via
de transmissão e, ao mesmo tempo, o papel menos relevante da contaminação alimentar
na transmissão de Rotavírus.
Resultados e Discussão
85
7. O contexto social
Os contactos sociais da criança foram pesquisados pela discriminação do local de
permanência da criança durante os dias de semana. Foi inquirida a frequência de
infantário/escola, ama ou permanência em casa.
Os resultados obtidos mostraram uma dispersão das crianças sobretudo entre o
infantário (52%) e a permanência em casa (30,2%). Em cerca de 9,5% dos inquéritos
este item não foi discriminado (Tabela 3.10).
Tabela 3.10
(Contexto social)
Não foi encontrada relação entre genótipo e frequência de infantário ou ama, nem entre
frequência destes dois espaços e terapêutica instituída no internamento (p <0,41 no
Teste exacto de Fisher).
8. Relação entre genótipos e características do grupo amostral
Não foi encontrada nenhuma correlação entre genótipo e sexo ou idade: o Rotavírus
afecta de modo indiferente rapazes e raparigas (p <0,16) e nenhum genótipo tem
incidência predominante em determinada idade (sobreposição parcial dos intervalos de
confiança de 95%).
Também não foi estabelecida relação entre genótipo e duração de sintomas antes do
internamento, ou seja, nenhum genótipo se apresentou com maior intensidade de
sintomas que justificasse o internamento mais precoce.
9 (9,4)
NãoDeterminado
96 (100)29 (30,2)8 (8,4)50 (52)Valor (Percentagem)
TOTALCasaAmaInfantário
EscolaLocal de permanência
durante o dia
9 (9,4)
NãoDeterminado
96 (100)29 (30,2)8 (8,4)50 (52)Valor (Percentagem)
TOTALCasaAmaInfantário
EscolaLocal de permanência
durante o dia
Resultados e Discussão
86
Não foi encontrada associação entre genótipo e sintomas específicos (p <0,95 para
vómitos e diarreia; p <0,94 para febre).
O internamento foi significativamente mais prolongado nos casos de genótipo G3 (p
<0,01), mas relembra-se a reduzida dimensão deste grupo.
3.3.2. Dados demográficos e epidemiológicos do grupo amostral controle
O grupo amostral controle foi constituído por 78 crianças internadas no mesmo período
de tempo, nas mesmas Unidades Pediátricas, com o mesmo diagnóstico, GEA, mas com
pesquisa de antigénio de Rotavírus negativa.
1. Distribuição por sexo e idade
Neste grupo foram incluídos 40 rapazes (51,2%) e 38 raparigas (48,8%).
A distribuição por idades evidenciou um predomínio no primeiro ano de vida
(43,6%), seguido do grupo entre os 12 e 23 meses (32%). Em conjunto incluíram cerca
de 75,6% da população controle. Se considerarmos as crianças entre os 0 e os 36 meses
veremos que estas representaram 88,5% do total do grupo (Tabela 3.11).
Tabela 3.11 (Distribuição por idades; n = 78)
2 (2,6)
36 – 47 m
7 (8,9)10 (12,9)25 (32)34 (43,6)Número (Percentagem)
48 – 59 m24 – 35 m12 – 23 m0 - 11 mIdade
2 (2,6)
36 – 47 m
7 (8,9)10 (12,9)25 (32)34 (43,6)Número (Percentagem)
48 – 59 m24 – 35 m12 – 23 m0 - 11 mIdade
Resultados e Discussão
87
Os itens seguintes foram avaliados em 77 das 78 crianças do grupo amostral controle,
pois num caso a informação recolhida estava incompleta e esse inquérito não foi
utilizado.
2. Sintomatologia associada
A sintomatologia presente na data do internamento apresentou uma distribuição
distinta. Em 52 casos foi descrita a associação de diarreia e vómitos (67,5%), em 19
casos apenas existiu diarreia (24,7%) e em seis casos os vómitos surgiram como
sintoma isolado na data de internamento. A febre coexistiu em 49 casos (Tabela 3.12).
As queixas estiveram presentes, em média, 2,9 dias antes do internamento (variando
entre algumas horas e 10 dias).
Tabela 3.12
(Sintomas presentes na data do internamento; n = 77)
3. Terapêutica realizada durante o internamento
Em todos os casos, foi realizada terapêutica com soro endovenoso. Em 57 crianças foi a
única medicação efectuada (74%) e em 20 casos foi associado antibiótico por suspeita
de infecção bacteriana (26%). Num caso foi ainda associada outro tipo de medicação
(dirigida para queixas não gastrointestinais).
49 (63,6)
Febre
19 (24,7)6 (7,8)52 (67,5)Número (Percentagem)
DiarreiaVómitos Vómitos +Diarreia Sintomatologia
49 (63,6)
Febre
19 (24,7)6 (7,8)52 (67,5)Número (Percentagem)
DiarreiaVómitos Vómitos +Diarreia Sintomatologia
Resultados e Discussão
88
4. Duração média de internamento
Este item foi novamente apenas avaliado em dois hospitais. A duração do internamento
foi determinada em apenas 26 casos, nos quais existiu uma duração média de estadia no
hospital de 2,3 dias, com um mínimo de algumas horas e um máximo de 9 dias.
5. Contacto conhecido com indivíduos com os mesmos sintomas
Em 19 casos (25%) foi referido o contacto próximo com pessoas doentes, antes do
início dos sintomas.
6. Ingestão de alimentos suspeitos
Em 7 crianças (9%) foi considerada relevante a ingestão de possível alimento
contaminado.
7. O contexto social
Neste grupo amostral a distribuição foi, por ordem decrescente, permanência em casa
(46,8%), frequência de infantário ou escola (32,5%) e frequência de ama (9%). Em 9
casos este item não foi determinado (Tabela 3.13).
Tabela 3.13 (Contexto social)
77(100)
9(11,7)
36(46,8)
7 (9)
25(32,5)
Número(Percentagem)
NãoDeterminado
TOTALCasaAmaInfantário
EscolaLocal de permanência
durante o dia
77(100)
9(11,7)
36(46,8)
7 (9)
25(32,5)
Número(Percentagem)
NãoDeterminado
TOTALCasaAmaInfantário
EscolaLocal de permanência
durante o dia
Resultados e Discussão
89
3.4. Comparação entre os dois grupos
1. Distribuição por sexo e idade
De um modo geral, os dois grupos amostrais são semelhantes na distribuição por sexo e
na distribuição por idades.
Em ambos, houve um predomínio no internamento até aos 36 meses, facto que reflecte a
importância das infecções gastrointestinais nessas idades e a maior susceptibilidade para
ocorrerem complicações associadas.
Esta tendência verificou-se independentemente da etiologia, Rotavírus ou outro agente
não identificado.
2. Sintomatologia associada ao episódio
Os sinais e sintomas presentes foram semelhantes nos dois grupos: vómitos, diarreia e
febre. De facto é consensual a impossibilidade de atribuir a causalidade da GEA ao
Rotavírus apenas pelos sintomas presentes.
Apesar de tudo, se for usado como marcador de intensidade a coexistência de vómitos e
diarreia, existiu uma tendência para as GEA por Rotavírus apresentarem uma maior
intensidade das queixas. A associação destes dois sintomas existiu em 92,7% dos casos
no grupo amostral Rotavírus positivo vs 67,5% no grupo amostral controle, sendo esta
diferença estatisticamente significativa (p <0,01).
Em relação à febre, este sinal clínico nunca foi encontrado isoladamente, e teve uma
incidência pouco distinta nos dois grupos: 60,4% no grupo amostral Rotavírus positivo
vs 63,6% no grupo amostral controle. Esta diferença não teve significado estatístico (p
<0,40).
Resultados e Discussão
90
A duração da sintomatologia antes do internamento foi maior no grupo amostral
controle, 2,9 dias vs 2,3 dias no grupo amostral Rotavírus positivo. Esta diferença não
teve significado estatístico (sobreposição parcial dos intervalos de confiança de 95%),
embora sugira uma maior intensidade clínica da GEA a Rotavírus a justificar avaliação,
ou internamento, mais precocemente na evolução da doença.
3. Terapêutica realizada durante o internamento
A terapêutica instituída foi invariavelmente o soro de rehidratação endovenoso, pois
esta é a terapêutica standard da GEA com desidratação, independentemente da etiologia.
O recurso ao antibiótico aconteceu em 14,5% no grupo amostral Rotavírus positivo vs
26% no grupo amostral controle. Esta diferença não foi estatisticamente significativa
(p<0,12 no teste exacto de Fisher).
De qualquer modo pareceu existir maior tendência a medicar com antibiótico na
ausência de diagnóstico etiológico.
4. Duração média de internamento
A duração de internamento não foi significativamente diferente nos dois grupos, embora
este dado tenha sido incompletamente avaliado.
5. Contacto conhecido com indivíduos com os mesmos sintomas
O contacto com eventuais pessoas doentes foi semelhante nos dois grupos (28,1% vs
25%). Este facto traduz a grande transmissibilidade das GEA infecciosas, seja qual for o
agente causal. A possibilidade de contágio ainda em fase de incubação facilita a
transmissão da doença e promove a existência de casos agrupados em detrimento de
casos isolados.
Resultados e Discussão
91
6. Ingestão de alimentos suspeitos
A ingestão de alimentos suspeitos ocorreu com maior frequência no grupo amostral
controle com 9 casos vs 1 caso no grupo amostral Rotavírus positivo. A diferença
encontrada é estatisticamente significativa (p <0,02) e talvez a ausência de etiologia
conhecida possa ter influenciado a pesquisa mais sistemática deste factor.
7. O contexto social
A frequência regular de infantário, escola ou ama foi pesquisada pela maior
proximidade com outras crianças nestes locais e serem potenciais factores de risco para
a ocorrência de GEA por Rotavírus. Verificou-se que 60,4% das crianças do grupo
amostral Rotavírus positivo frequentavam um destes locais, por oposição ao grupo
amostral controle no qual tal aconteceu em 41,5% (p <0,035 pelo teste χ2).
Em resumo,
No presente estudo foi realizada a genotipagem de Rotavírus em 102 amostras,
existindo um predomínio de dois genótipos, G2P[4] e G9P[8]. Houve detecção embora
com pouca expressão clínica dos restantes três genótipos predominantes e não se
encontraram genótipos atípicos.
Foi encontrada uma associação entre genótipo G3 e internamento mais prolongado, e
entre sexo feminino e internamento mais prolongado, factos que devem ser investigados
de futuro.
Resultados e Discussão
92
A análise das características epidemiológicas do grupo amostral Rotavírus positivo e do
grupo amostral controle evidenciou algumas associações das quais se salienta a maior
frequência de vómitos e diarreia, no grupo amostral Rotavírus positivo.
Está descrita, na GEA por Rotavírus, uma maior intensidade destes sintomas que podem
levar rapidamente à desidratação e, portanto, ao internamento.
Por seu lado, a febre foi um sinal pouco característico, não havendo predominância em
nenhum dos grupos.
Houve uma menor duração da doença antes do internamento no grupo amostral
Rotavírus positivo, mas sem significado estatístico.
A frequência de infantário, escola ou ama associou-se à infecção por Rotavírus,
traduzindo a sua importância como fontes de contágio.
Por fim, houve diferença na suspeita de ingestão de alimentos adulterados, com maior
tendência para serem considerados como factor de risco, nas GEA não rotavíricas.
Não se observou diferença na duração do internamento, nem na terapêutica instituída.
CAPÍTULO IV
CONCLUSÕES
Conclusões
94
4. Conclusões
O Rotavírus, descoberto em 1973, veio preencher uma lacuna diagnóstica há muito
investigada sem sucesso, a etiologia das GEA na infância. Rapidamente passou de
agente recém-descoberto de GEA pediátrica para principal responsável pela mesma.
A sua relevância a nível regional e mundial é indiscutível. Ainda no século XXI, as
GEA permanecem uma das causas de maior de morbilidade e mortalidade infantil e
estão entre as principais prioridades de intervenção global e de empenhamento
estratégico preventivo.
As características da infecção, como o carácter universal e predomínio nos primeiros
anos de vida, com conjunto com ineficácia das medidas de controlo de infecção, levam
a preconizar a vacinação como o meio mais eficaz no combate à doença. As vacinas
para Rotavírus devem estar adaptadas aos genótipos circulantes e, dada a diversidade
existente, é imperativo um conhecimento epidemiológico aprofundado e actualizado.
A vigilância dos genótipos apresenta-se como a melhor maneira de conhecer a variação
geográfica e evolução temporal do vírus. Na Europa, esta vigilância tem decorrido de
forma irregular, existindo regiões com um bom conhecimento dos genótipos que
circulam e suas variações temporais, enquanto noutras zonas não se realizam estudos ou
estes são de pequena dimensão e curta duração.
Na presente dissertação relatou-se o primeiro estudo realizado em Portugal de
genotipagem de Rotavírus, com uma duração de um ano e abrangendo uma região
geográfica e demograficamente relevante, Lisboa e arredores. O intervalo de tempo
escolhido para recolha de amostras, 13 meses, foi o considerado internacionalmente
Conclusões
95
como mínimo aceitável para estudo de vigilância epidemiológica e molecular de
Rotavírus (um ano consecutivo). A caracterização demográfica e epidemiológica do
grupo amostral Rotavírus positivo e comparação com grupo amostral controle
permitiram uma melhor caracterização da infecção nesta população pediátrica.
Os resultados obtidos reflectem a importância da GEA por Rotavírus no internamento
pediátrico de três hospitais de Lisboa. Verificou-se que o Rotavírus foi o responsável
por mais de 50% dos internamentos abaixo dos cinco anos, quando o diagnóstico foi
GEA. Estes resultados são concordantes com a evidência internacional que associa este
vírus aos casos de GEA mais graves.
Os genótipos encontrados foram semelhantes aos principais genótipos que circulam na
Europa nos últimos anos. No entanto, o predomínio foi distinto do relatado nas regiões
vizinhas, Espanha e França, em anos recentes (133, 145). Confirma-se a necessidade de
estudos moleculares em cada região e a impossibilidade de extrapolação de resultados
entre países vizinhos.
A ausência de genótipos atípicos era esperada dada a sua baixa incidência nesta região.
A incidência de infecções mistas foi reduzida e este facto que associa-se à existência
condições adequadas de saneamento básico e de agrupamento populacional.
No estudo não foi pesquisada a variação de genótipos entre o primeiro e o segundo
semestre do estudo e esta seria uma informação pertinente no que concerne à evolução
temporal de genótipos.
Conclusões
96
Prevê-se o início da vigilância epidemiológica regular de Rotavírus em Portugal a partir
de 2009. A inclusão de um número superior de crianças, provenientes de ambientes
distintos, dará uma “imagem” epidemiológica mais rigorosa sobre a incidência de
Rotavírus, o peso desta infecção no internamento pediátrico, quais os genótipos
circulantes e suas variações anuais.
Espera-se que algumas das questões que ficam por responder neste projecto possam ser
resolvidas nessa altura.
Também a comparação de dados epidemiológicos entre grupo amostral Rotavírus
positivo e grupo amostral controle, mostrou algumas associações interessantes, apesar
do número de amostra reduzido. Poderá ser um ponto de partida para novos projectos,
com inclusão de maior número de crianças, que permitam compreender melhor as
relações estabelecidas ou sugeridas.
CAPÍTULO V
PERSPECTIVAS FUTURAS
Perspectivas Futuras
98
5. Perspectivas Futuras
O Rotavírus tem suscitado um grande interesse científico desde a sua descoberta e
muito se tem evoluído no seu conhecimento e em formas de prevenção da infecção.
A história recente das vacinas para o Rotavírus demonstra que, mesmo quando as
evidencias apontam para um sucesso na luta contra esta infecção, é obrigatório manter
medidas de vigilância clínica de forma a detectar problemas na sua aplicação em larga
escala. Após o desaire com a Rotashield®, novas e distintas vacinas estão prontas e a
ser comercializadas.
A variação temporal dos genótipos e a emergência de novas estirpes demonstram a
necessidade de se manter, de modo permanente e estruturado, uma vigilância do
Rotavírus. Apenas o acompanhamento da evolução do vírus permitirá adequar futuras
estratégias preventivas.
Em Portugal é esperada a criação de um sistema de vigilância de Rotavírus que se
deseja alargado, incluindo diferentes regiões geográficas e com características
demográficas, sociais e económicas distintas. A detecção de Rotavírus permitirá obter
uma boa informação epidemiológica, que deverá ser complementada com posterior
estudo molecular. Espera-se que os dados obtidos sejam um bom suporte para
recomendações relativas à adequação e implementação das vacinas no nosso país.
No entanto, é possível que se esteja ainda a meio de um percurso estratégico preventivo.
O combate à infecção por Rotavírus passa pela implementação alargada de vacinas e no
Perspectivas Futuras
99
contexto económico internacional estas vacinas são demasiado dispendiosas para
aplicação em muitas regiões.
Outras vacinas estão em fase de investigação e poderão ser alternativas viáveis mas,
mesmo nessa altura, será necessário perceber quais as implicações ecológicas do
combate ao Rotavírus.
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diarrhoeal diseases among young children: rotavirus and cholera immunization.
Bulletin of the World Health Organization. 63: 569-583.
Anexo I
119
Amostras Genótipo Peso molecular (bp) Genótipos (EVL-HPA)
A1 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A2 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A3 G9, P[8] 179, 224 G9, P[8]
A4 ( seq ) ND, P[8] -, 224 NEG, P[8] A5 G9, P[8] 179, 224 G9, P[8] A6 G9, P[8] 179, 224 G9, P[8] A7 G9, P[8] 179, 224 G9, P[8] A8 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A9 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4]
A10 G1, P[8] 618, 224 G1, P[8]
A11 G4, P[8] 452, 224 G4, P[8] A12 G4, P[8] 452, 224 G4, P[8] A13 G4, P[8] 452, 224 G4, P[8]
A14 ( seq ) ND, P[8] -, 224 G3, P[8] A15 G1, P[8] 618, 224 G1, P[8] A16 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A17 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A18 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A19 G1, P[8] 618, 224 G1, ND A20 G9, P[8] 179, 224 G9, P[8]
A21 G3, P[8] 682, 224 NÃO REALIZADO A22 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A23 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A24 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4]
A25 ( seq ) ND, P[8] -, 224 G9, P[8] A26 G9, P[8] 179, 224 G9, P[8] A27 G1, P[8] 618, 224 G1, P[8] A28 G9, P[8] 179, 224 NÃO REALIZADO
A29 ( seq ) ND, P[8] -, 224 G3, P[8] A30 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4]
A31 NEG, NEG - G9, P[8] A32 NEG, NEG - NEG A33 NEG, NEG - G1, P[8] A34 NEG, NEG - G9, P[8] A35 NEG, NEG - G4, P[8] A36 NEG, NEG - G1, P[8] A37 NEG, NEG - G1, P[8] A38 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A39 G2, P[4] 521, 362 G2, P[4] A40 G1, P[8] 618, 224 G1, P[8]
A41 G1, P[8] 618, 224 G1, P[8] A42 G1, ND 618, - NÃO REALIZADO A43 G9, ND 179, - NÃO REALIZADO A44 G4, P[8] 452, 224 NÃO REALIZADO A45 G9, P[8] 179, 224 NÃO REALIZADO A46 G9, P[8] 179, 224 NÃO REALIZADO A47 G9, P[8] 179, 224 NÃO REALIZADO A48 G9, P[8] 179, 224 NÃO REALIZADO
Anexo II
ESTUDO DE ROTAVIRUS
Identificação e Genotipagem
especificar
especificar
ANTECEDENTES PESSOAIS:
Doença anterior
Internamentos prévios
S N
S N
_____________________________________________________________________
______________________________________________________________________
TESTE RÁPIDO: Positivo Negativo
Nome
Nº Processo HCD
Data de Nascimento Idade meses Sexo
Data de Internamento Data da Alta
F M
Soro EV Antibiótico Outro
quantificar
quantificar
especificar
especificar
EPIDEMIOLOGIA:
Frequência de:
Casos semelhantes em contactos próximos?
Inicio dos Sintomas
Febre
Vómitos
Diarreia
Outros sinais ou sintomas
Ingestão de alimentos suspeitos
Tratamento
S N
S N
S N
S N
S N
S N
Infantário Ama Outro
_____________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
DATA DA COLHEITA DA AMOSTRA: