faculdade de medicina veterinária - core.ac.uk ?· universidade de lisboa faculdade de medicina...

Download Faculdade de Medicina Veterinária - core.ac.uk ?· universidade de lisboa faculdade de medicina veterinária…

Post on 09-Dec-2018

215 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

UNIVERSIDADE DE LISBOA

Faculdade de Medicina Veterinria

INTERAO ENTRE ESCHERICHIA COLI UTEROPATOGNICA E AS CLULAS

EPITELIAIS E DO ESTROMA DO ENDOMTRIO CANINO

MARTA FILIPA SERRA DA SILVA

2014

LISBOA

CONSTITUIO DO JRI

Doutora Graa Maria Leito Ferreira Dias

Doutora Lusa Maria Freire Leal Mateus

Doutora Maria Manuela Castilho Monteiro

de Oliveira

ORIENTADOR Doutora Lusa Maria Freire Leal Mateus

CO-ORIENTADOR

Doutora Maria Elisabete Tom Sousa Silva

UNIVERSIDADE DE LISBOA

Faculdade de Medicina Veterinria

INTERAO ENTRE ESCHERICHIA COLI UTEROPATOGNICA E AS CLULAS

EPITELIAIS E DO ESTROMA DO ENDOMTRIO CANINO

MARTA FILIPA SERRA DA SILVA

DISSERTAO DE MESTRADO INTEGRADO EM MEDICINA VETERINRIA

2014

LISBOA

CONSTITUIO DO JRI

Doutora Graa Maria Leito Ferreira Dias

Doutora Lusa Maria Freire Leal Mateus

Doutora Maria Manuela Castilho Monteiro

de Oliveira

ORIENTADOR Doutora Lusa Maria Freire Leal Mateus

CO-ORIENTADOR

Doutora Maria Elisabete Tom Sousa Silva

i

AGRADECIMENTOS

Neste percurso acadmico foram vrias as pessoas que me apoiaram e a quem no posso deixar

de agradecer.

Agradeo minha orientadora, a Professora Doutora Lusa Mateus, que no 4 ano me deu a

conhecer o trabalho que se desenvolvia no laboratrio na rea da Reproduo e Obstetrcia e

que posteriormente aceitou orientar-me. Obrigada por todos os conhecimentos que me

transmitiu e pelo tempo que me dedicou nesta orientao.

minha co-orientadora, a Doutora Elisabete Silva, que muito me ensinou neste ltimo ano.

Obrigada por toda a preocupao, ajuda e disponibilidade, tanto dentro do horrio de trabalho

como fora dele.

Dr. Sofia Henriques que me acompanhou durante este ano, agradeo por toda a pacincia e

dedicao com que me ensinou a executar tcnicas de laboratrio com as quais nunca tinha

contactado, e por toda a ajuda prestada na elaborao deste trabalho.

Engenheira Patrcia Diniz por tudo o que ensinou a respeito de cultura de clulas. Agradeo

tambm Mestre Mariana Batista por todo o auxlio que nos deu neste trabalho.

A todos da equipa da Reproduo e Obstetrcia que me receberam to bem. Nunca irei esquecer

alguns dos momentos deste estgio, particularmente os momentos de convvio e alimentao.

Ao Centro de Investigao Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA) pelo apoio financeiro

concedido e por ter permitido a utilizao das suas instalaes e equipamentos para a elaborao

deste trabalho. Agradeo tambm a todos os que trabalham no laboratrio pela simpatia com

que me receberam.

Dra. Slvia Cruz e ao Tiago Gonalves, voluntrio no Canil Municipal de Sintra, pelas

ovariohisterectomias realizadas, essenciais para a obteno de material biolgico. Ao Canil

Municipal de Sintra, Hospital Veterinrio da Faculdade de Medicina Veterinria

Universidade de Lisboa, Consultrio Veterinrio do Instituto Zofilo Quinta Carbone, Clnica

da Liga Portuguesa dos Direitos dos Animais e aos seus corpos clnicos por colaborarem na

realizao deste trabalho.

equipa de Anatomia Patolgica, particularmente D Maria do Rosrio Lus e Sandra

Carvalho pela disponibilidade e servios prestados no processamento do material para anlise

histopatolgica.

ii

Deixo tambm um agradecimento muito especial minha me, que me tornou naquilo que sou

hoje. Na realidade no existem palavras que expressem o quanto me sinto agradecida pessoa

que capaz de me aquecer por dentro com um simples sorriso e que me conforta diariamente.

Agradeo tambm ao meu pai por ter permitido que realizasse este sonho de me tornar Mdica

Veterinria.

Aos meus amigos que me acompanham desde os primeiros dias em que pisei o cho desta

faculdade. A Catarina, a Lara, a Andreia, o Jos, a Eva e a Ins, que me apoiaram nos bons e

maus momentos dos ltimos seis anos. Sem dvida que esta jornada no teria sido to boa sem

a vossa companhia e todos os momentos felizes que juntos crimos.

A todos aqueles que me fizeram e fazem sorrir, um sincero obrigada.

Este trabalho foi realizado no mbito do projeto CIISA/FMV 74 Hiperplasia do endomtrio,

tendo sido financiado pelo Centro de Investigao Interdisciplinar em Sanidade Animal

(CIISA).

iii

RESUMO

Interao entre Escherichia coli uteropatognica e as clulas epiteliais e do estroma do

endomtrio canino

A pimetra uma doena de diestro comum em cadelas adultas, sendo Escherichia coli o agente

mais frequentemente isolado. Neste estudo estabeleceu-se um modelo de cultura primria de

clulas epiteliais e do estroma, para avaliar: a) adeso e internalizao de E. coli; b) resposta

imunitria inata.

Os ensaios de adeso e internalizao, com duas estirpes de E. coli de diferente gentipo de

virulncia, demonstraram que E. coli aderiu s clulas epiteliais e do estroma. Os resultados de

internalizao sugerem que este mecanismo no dever estar envolvido na patogenicidade deste

agente na pimetra. Nas clulas epiteliais, E. coli conduziu a um aumento da transcrio de

genes de quimiocinas, citocinas pr-inflamatrias e interfero-. No estroma observou-se

principalmente aumento da transcrio de genes de citocinas pr-inflamatrias. Contudo, a

transcrio do gene da citocina pr-inflamatria IL-1e da anti-inflamatria IL-10 foi inibida

nestas clulas por uma das estirpes de E. coli. Conclui-se que (1) o sistema de cultura de clulas

implementado uma ferramenta til para estudo da fase inicial de infeo por E. coli na

pimetra (2) as clulas epiteliais e do estroma desempenham um papel importante na resposta

inflamatria; (3) a resposta imunitria desencadeada parece depender da virulncia da estirpe

de E. coli.

Palavras-chave: Pimetra; Escherichia coli; Adeso; Internalizao; Imunidade inata;

Citocinas.

iv

v

ABSTRACT

Interaction between uteropathogenic Escherichia coli and epithelial and stromal cells of

the canine endometrium

Pyometra is a common diestrous disease of bitches and Escherichia coli is the most frequently

isolated bacteria. In this study we established primary epithelial and stromal cell cultures to

assess: a) adhesion and invasion of E. coli; b) the innate immune response.

Adhesion and invasion assays with two E. coli strains of different virulence genotypes showed

that E. coli adhered to epithelial and stromal cells. The invasion results suggest that this

mechanism is probably not involved in the pathogenicity of E. coli in pyometra. In epithelial

cells, E. coli induced an increased transcription of the chemokine, pro-inflammatory cytokine

and interferon-genes. In stromal cells, it was observed mainly an increased transcription in

the pro-inflammatory cytokine genes. However, the transcription of the gene for the pro-

inflammatory cytokine IL-1 and for the anti-inflammatory cytokine IL-10 was inhibited in

stromal cells by one of the strains. The results obtained suggest that (1) the established cell

culture system is an useful model to study the early phase of E. coli infection, in the scope of

uterine infection; (2) both epithelial and stromal cells have a key role in the inflammatory

response; (3) The immune response triggered seems to depend of the virulence genotype.

Key words: Pyometra; Escherichia coli; Adhesion; Invasion; Innate immunity; Cytokines.

vi

vii

NDICE GERAL

AGRADECIMENTOS i

RESUMO. iii

ABSTRACT. v

NDICE GERAL.. vii

NDICE DE FIGURAS x

NDICE DE TABELAS x

NDICE DE SMBOLOS E ABREVIATURAS.. xi

RELATRIO DE ESTGIO........... 1

REVISO BIBLIOGRFICA..... 2

I. Pimetra... 2

1. Epidemiologia... 2

2. Fisiopatologia 3

2.1 Fatores hormonais. 4

2.1.1 Imunossupresso no diestro... 4

2.2 Complexo Hiperplasia Qustica do Endomtrio - Pimetra.. 5

2.2.1 Alteraes na expresso de recetores hormonais e fatores de crescimento.. 6

2.3 Agentes infecciosos... 7

II. Escherichia coli.. 8

1. Fatores de virulncia. 9

1.1 Lipopolissacrido.. 9

1.2 Adesinas.... 10

1.3 Sistemas de captao de ferro... 11

1.4 Toxinas.. 12

1.3.1Fator Citotxico Necrosante 1... 12

1.3.2 -hemolisina.. 13

1.5 Evaso das defesas do hospedeiro..... 13

III. Imunidade no tero 14

1. Recetores do tipo Toll 14

1.1 Via de sinalizao dos recetores do tipo Toll... 16

viii

1.2 Efetores: citocinas e quimiocinas.. 18

OBJETIVOS. 22

MATERIAIS E MTODOS.... 23

1. Colheita e caracterizao das amostras..... 23

1.1 Animais.. 23

1.2 Colheita de amostras.. 23

1.3 Determinao da fase do ciclo strico...