universidade católica dom bosco programa de pós-graduação

UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU

MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ERVA MATE (Ilex paraguariensis) NO

PROCESSO DE NEOVASCULARIZAÇÃO EM CAMUNDONGOS.

Autora: Renata Moreira da Silva Orientadora: Dra. Susana Elisa Moreno

Campo Grande

Mato Grosso do Sul Abril de 2015

UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU

MESTRADO BIOTECNOLOGIA

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ERVA MATE (Ilex paraguariensis) NO PROCESSO DE NEOVASCULARIZAÇÃO EM CAMUNDONGOS.

Autora: Renata Moreira da Silva Orientadora: Dra. Susana Elisa Moreno

“Dissertação apresentada, como parte das exigências para a obtenção do título de MESTRE EM BIOTECNOLOGIA, no Programa de Pós-graduação em Stricto Sensu em Biotecnologia da Universidade Católica Dom Bosco - Área de Concentração e Biotecnologia em Saúde Animal e Humana”.

Campo Grande Mato Grosso do Sul

Abril de 2015

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

(Biblioteca da Universidade Católica Dom Bosco – UCDB, Campo Grande, MS, Brasil)

S586a Silva, Renata Moreira da

Avaliação do efeito da erva mate (Ilex paraguariensis) no processo de

neovascularização em camundongos./ Renata Moreira da Silva;

orientação Susana Elisa Moreno -- 2015.

57 f.

Dissertação (mestrado em biotecnologia) – Universidade

Católica Dom Bosco, Campo Grande, 2015.

. Inclui bibliografia

1. Biotecnologia 2. Neovascularização 3. Cafeína 4. Erva – mate

I Moreno, Susana Elisa II. Título

CDD – 660.6

“A menos que modifiquemos a nossa maneira de pensar, não seremos

capazes de resolver os problemas causados pela forma como nos

acostumamos a ver o mundo”. (Albert Einstein)

Dedicatória

Aos meus pais Gilberto (in memorian) e Ida

a minha eterna gratidão pelo incansável incentivo

e presença carinhosa.

A minha filha Rafaela, fonte de inspiração

da vida. Agradeço a Deus pela sua presença

cheia de vida e doçura que estimula o meu

caminhar. Mamãe é linda!

AGRADECIMENTOS

Não foi fácil chegar ao término de mais uma jornada. Confesso que nesses

dois anos tive momentos de alegrias, tristezas, correrias, perdas e conquistas. Mas

posso dizer que valeu apena cada etapa e hoje celebro um sonho realizado.

Mas que para esse sonho fosse realizado várias pessoas passaram pelo meu

caminho e que estiveram presente nessa conquista, assim esse é o momento de

agradecer.

A Deus, que me iluminou, deu força e sabedoria nos momentos de dúvidas,

fraquezas e dificuldades.

Ao meu pai pelo exemplo de vida e pelos ensinamentos, referências de

caráter, humildade e amor. A vida não permitiu que nesse momento estivesse ao

meu lado mais sei que estaria orgulhoso por me concluir esse trabalho. A minha

mãe pelo apoio incondicional e pelos valores que sempre me transmitiu, entre os

quais a força para nunca desistir de lutar. Amo vocês!

A minha pequena Rafaela que embora pouca idade, foi grande em

pensamentos, sabendo apoiar e compreender minhas dificuldades e ausências. É

para ela que me levanto todos os dias. Meu amor eterno.

A minha irmã Julyana que sempre se manteve presente em minha vida sendo

meu porto seguro. Ao meu cunhado Rafael pela paciência e amizade.

A minha família e amigos por apoiarem e torceram para que tudo desse certo.

Ao Lucas e Gabriel meu carinho especial, meus amores.

As minhas amigas Claudia, Priscilla, Michelle, Andrea, Rita, Bia, Camila e

Rosane que me apoiaram durantes todos esses anos, deixo meu carinho, respeito e

amizade.

Ao Centro Universitário da Grande Dourados – UNIGRAN – na figura da

magnífica reitora Rosa Maria D’Almato De Déa, pelo incentivo na busca de uma

melhor qualidade profissional.

A minha Orientadora Susana Elisa Moreno pela oportunidade, paciência e

pelos valiosos ensinamentos.

Aos meus colegas e a toda equipe do Programa de Pós-graduação em Stricto

Sensu em Biotecnologia da Universidade Católica Dom Bosco – UCDB.

As minhas amigas Claudia e Célia e ao meu amigo Miguel, que

compartilharam viagens e histórias durante esses dois anos. Obrigada por esses

momentos.

A Silvia, secretária do Programa de Pós-graduação em Stricto Sensu em

Biotecnologia da Universidade Católica Dom Bosco – UCDB – a minha gratidão e

reconhecimento pela disponibilidade e dedicação.

Aos meus alunos e alunas, pois são vocês que inspiram e nutrem a trajetória

da minha temporalidade de docente meu carinho e respeito.

A todos aqueles que colaboraram direta ou indiretamente para a realização

desse trabalho, meu muito obrigada!

BIOGRAFIA

Renata Moreira da Silva, filha de Gilberto Moreira da Silva e Ida Azevedo

Moreira, nascida em 10 de Junho de 1980 em Santa Mariana, no estado do Paraná,

graduou-se em Fisioterapia pelo Centro Universitário da Grande Dourados, 2003.

Pós-graduada em Fisioterapia Dermato-funcional e Cardiorrespiratória pela

Universidade de Ribeirão Preto – UNAERP/SP, ambas em 2004. Pós-Graduada em

MBA em Estética e Saúde pela Universidade Camilo Castelo Branco –

UNICASTELO/SP em 2009. Integrou no corpo docente do Centro Universitário da

Grande Dourados – UNIGRAN em 2006 permanecendo até os dias atuais nos

cursos presenciais e pós-graduação à distância. Em 2013 ingressou no Curso de

Mestrado Biotecnologia (Universidade Católica Dom Bosco - UCDB, área de

concentração em Biotecnologia em Saúde Animal e Humana). Atualmente

desenvolve pesquisa na área da Estética e Cosmetologia.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. IX

LISTA DE TABELA ..................................................................................................... X

Resumo ..................................................................................................................... XI

Abstract .................................................................................................................... XII

1INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 13

1.1 Biotecnologia e prospecção de moléculas de interesse farmacológico ..... 13

1.2 Erva Mate ........................................................................................................... 15

1.3 Compostos fitoquímicos da erva mate ............................................................ 18

1.4 Angiogênese ...................................................................................................... 22

1.4.1 Mediadores químicos envolvidos na angiogênese ........................................... 24

1.4.2 Modelo de estudo da angiogênese .................................................................. 26

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 28

2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 28

2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 28

3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 29

3.1 Extrato de erva mate ......................................................................................... 29

3.2 Animais .............................................................................................................. 29

3.3 Técnicas da implantação subcutânea de fragmentos de esponja ............... 30

3.3.1 Confecção e preparo dos fragmentos de esponja ............................................ 30

3.3.2 Implantação das esponjas ................................................................................ 30

3.3.3 Remoção dos fragmentos de esponjas ............................................................ 31

3.4 Dosagem de hemoglobina ................................................................................ 31

3.5 Análise histológica ............................................................................................ 32

3.5.1 Determinação do colágeno ............................................................................... 32

3.5.2 Análise histológica da inflamação e neovascularização .................................. 33

3.6 Análise estatística ............................................................................................ 33

4 RESULTADOS ....................................................................................................... 34

4.1 Resultados referentes do 1º ao 14º dia de implantação das esponjas ......... 34

4.2 Peso médio das esponjas ................................................................................. 35

4.3 Avaliação da hemoglobina ............................................................................... 36

4.4 Avaliação histológica dos discos de esponjas ............................................. 37

4.4.1 Avaliação do infiltrado e neovascularização ..................................................... 37

4.4.2 Avaliação do colágeno ..................................................................................... 37

5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 39

CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 44

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 45

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Distribuição geográfica da erva mate ....................................................... 15

Figura 2 – Aspectos botânicos da Ilex paraguariensis .............................................. 16

Figura 3 – Principais componentes orgânicos no extrato de Ilex paraguariensis ...... 19

Figura 4 – Estrutura molecular das Metilxantinas ...................................................... 21

Figura 5 – Esquema das vias da síntese e degradação da cafeína .......................... 21

Figura 6 – Processo de formação dos novos vasos capilares sanguíneos na

angiogênese .............................................................................................................. 23

Figura 7 – Etapa do processo de angiogênese ......................................................... 24

Figura 8 – Fatores do processo da angiogênese ...................................................... 25

Figura 9 – Modelo de matriz esponjosa .................................................................... 30

Figura 10 – Matriz esponjosa, apresentando alterações vasculares visíveis ao 14º

dia ............................................................................................................................. 34

Figura 11 – Avaliação do peso médio dos implantes das esponjas .......................... 35

Figura 12 – Determinação dos níveis de hemoglobina como indicativo da

neovascularização dos implantes de esponja em camundongos .............................. 36

Figura 13 – Avaliação do infiltrado inflamatório nos implantes de esponja em

camundongos ............................................................................................................ 38

Figura 14 – Avaliação histológica do infiltrado inflamatório nos implantes de esponja

em camundongos ...................................................................................................... 38

Figura 15 – Avaliação histológica da presença de colágeno nos implantes de

esponjas em camundongos....................................................................................... 38

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Formas de aplicações industriais da erva mate ...................................... 17

Tabela 2 – Compostos bioativos da erva mate e seus efeitos .................................. 20

Tabela 3 – Distribuição dos grupos experimentais .................................................... 31

RESUMO

A I. paraguariensis, popularmente conhecida como erva mate, é encontrada

principalmente na região sul do Brasil. Possui grande papel socioeconômico e

ambiental, podendo ser utilizada na indústria de alimentos, medicamentos,

cosméticos entre outras. Em sua composição fitoquímica destacam-se os ácidos

fenólicos e alcalóides purínicos, flavonóides, saponinas triterpênicas, taninos,

minerais e vitaminas. O Objetivo do presente estudo foi avaliar a ação do extrato

hexânico da erva mate sobre o processo de neovascularização, em modelo de

implante de esponjas de poliéster-poliuretano, em camundongos C57-black6.

Esponjas embebidas em 5, 10 e 30% do extrato hexânico da erva mate ou salina

(controle negativo) foram implantadas subcutaneamente no dorso dos animais. Após

14 dias as esponjas foram retiradas, sendo conduzida a avaliação da

neovascularização por meio da dosagem de hemoglobina e análise histológica para

investigação do infiltrado inflamatório e colagênese. Nossos resultados demonstram

que as esponjas tratadas com o extrato hexânico de I. paraguariensis nas

concentrações de 10 e 30% apresentaram maior quantidade de hemoglobina

quando comparado ao grupo controle negativo, indicando o aumento na

angiogênese. Por meio da análise histológica observou-se que as concentrações de

10 e 30% do extrato também foram capazes de induzir aumento no infiltrado de

células inflamatórias nas esponjas. Do mesmo modo, as mesmas concentrações do

extrato da erva-mate foram capazes de estimular a colagênese após o 14º dia de

implantação das esponjas. Em conjunto esses dados nos permitem concluir que o

extrato da erva mate possui substâncias bioativas capazes de aumentar a

neovascularização e a produção de colágeno, sugerindo o potencial uso da erva-

mate na cicatrização de feridas cutâneas, bem como em outros eventos onde seja

necessário o aumento da neovascularização local.

Palavra-chave: Angiogênese, erva mate, cicatrização.

ABSTRACT

The I. paraguariensis, popularly known as mate, is found mainly in southern Brazil. It

has great socio-economic and environmental role and can be used in the food

industry, medicine, cosmetics and others. In its phytochemical composition stand out

phenolic acids and purine alkaloids, flavonoids, saponins, tannins, minerals and

vitamins. The objective of this study was to evaluate the effect of the hexane extract

of yerba mate on the neovascularization process in model implant polyester-

polyurethane sponges in C57-black6 mice. Sponges soaked in 5, 10 and 30% of

hexane of yerba mate extract or saline (negative control) were implanted

subcutaneously in the back of the animals. After 14 days sponges were removed,

conducted the evaluation of neovascularization by levels of hemoglobin and

histological analysis to investigate the inflammatory infiltrate and collagenesis. Our

results demonstrate that the sponges treated with the hexane extract of I.

paraguariensis in concentrations of 10 and 30% had higher amounts of hemoglobin

compared to the negative control group, indicating an increase in angiogenesis.

Through histological analysis it was observed that concentrations of 10 and 30% of

the extract were also able to induce increased inflammatory cell infiltrate in the

sponges. Similarly, the same yerba mate extract concentrations were able to

stimulate collagenesis after the 14th day of implementation of sponges. Together

these data allow us to conclude that the yerba mate extract has bioactive substances

capable of increasing neovascularization and collagen production, suggesting the

potential use of yerba mate in the healing of skin wounds, as well as other events

where necessary the increasing local neovascularization.

Keyword: Angiogenesis, Mate, Healing.

1 INTRODUÇÃO

O termo Biotecnologia nos remete a conceitos estabelecidos no séc. XX e XXI

e está diretamente ligada a melhoria na qualidade de vida da sociedade ao longo de

seu desenvolvimento. Apesar da contemporaneidade do termo, é importante

ressaltar que a presença dos estudos ligados a essa área remonta a um passado

não tão recente nas relações científicas, estando assim, presente mesmo que de

maneira oculta, nas grandes descobertas que envolveram e envolvem as relações

biológicas e tecnológicas (ALBAGLI, 1998; BRAUNNER, 2005, FELIPE, 2007;

PAES; BAPTISTA, 2014).

Para que a Biotecnologia seja definida de uma forma mais abrangente

Malajovich (2012) propõe como uma área baseada na qual o conhecimento é

multidisciplinar, utilizando agentes biológicos para fazer produtos úteis ou resolver

problemas.

1.1 Biotecnologia e prospecção de moléculas de interesse farmacológico

O avanço da Biotecnologia passou por uma ampla avaliação a respeito da

sua importância econômica e social, ocasionando o desenvolvimento de áreas

estratégicas como a descoberta e a fabricação dos primeiros produtos derivados de

estudos biotecnológicos (insulina, hormônios de crescimento humano, entre outros).

Essas descobertas estimularam o investimento em diversos outros produtos de base

biotecnológica, como alimentos e combustíveis (MAYOR, 1992; FELIPE, 2007).

Estudos com plantas são considerados um elo entre a comunidade científica

e a tradicional, compartilhando informações e interesses para o desenvolvimento e

aprimoramentos de estudos (LEAL, 2012).Cerca de 20% das plantas encontradas no

mundo já foram ou estão sendo submetidas a testes biológicos e/ou farmacológicos

(SUFFREDINI et al., 2004 apud ARRAIS, 2012).

Atualmente o uso de plantas como fonte de moléculas com aplicação

terapêutica representa ainda nos dias atuais um importante recurso para o

desenvolvimento de medicamentos (MORAES, 2008; MORAIS, 2011).

O uso de plantas na forma de infusão, por exemplo, atrai grande parte da

população devido à ampla variedade de aromas, sabores e benefícios a saúde,

sendo utilizada como um recurso a mais no tratamento de doenças. É caracterizada

como uma terapia não convencional, e sua eficácia ainda são questionadas pelo fato

de não haver estudos rigorosos para análise de resultados e pela falta de uma base

racional dos conhecimentos científicos atuais (CORDEIRO, 2011).

Através de novos estudos diferentes técnicas vêm sendo utilizadas para as

descobertas de novos produtos, uma vez que a descoberta de novos princípios

ativos mostrou à importância de uma padronização desses medicamentos a base de

plantas e produtos da biodiversidade (PEREIRA FILHO, 2013).

Recentemente, as plantas medicinais ganharam espaço com as

comprovações de ações farmacológicas por meio de pesquisas científicas, porém

não podemos esquecer que a existência de uma vasta literatura sobre um

determinado componente não comprova sua segurança no que diz respeito ao seu

uso, independente da forma de que será utilizado (alimentos, infusão, entre outros)

(ANVISA, 2007; MORAES, 2008; MORAIS, 2011).

Os estudos toxicológicos de vegetais possuem a finalidade de avaliar a ideia

de que plantas medicinais, por serem naturais, são isentas de efeitos tóxicos ou

adversos, sendo fundamental estabelecer segurança, eficácia e a qualidade das

preparações de produtos vegetais (BASTOS, 2011).

A Organização Mundial de Saúde (OMS) destaca a importância e o

conhecimento sobre produtos da biodiversidade, sendo considerado um importante

instrumento para o desenvolvimento de novos produtos. No Brasil, diretrizes do

Ministério da Saúde determinam prioridade na investigação das plantas medicinais

(PEREIRA FILHO, 2013).

O Brasil é considerado um grande detentor da biodiversidade do planeta,

possuindo numerosas espécies produtoras de substâncias bioativas, pertencentes

aos diferentes Reinos. Os grandes avanços científicos mostram a capacidade de

consolidar a competência cientifica em varias áreas do conhecimento, com destaque

a elucidação do potencial da biodiversidade na geração de produtos (MAYOR, 1992;

FELIPE, 2007, MORAES, 2008; ARRAIS, 2012).

1.2 Erva Mate

A Ilex paraguariensis St. Hil. Var. paraguariensis (Aquifoliaceae), conhecida

popularmente como erva-mate é uma espécie nativa da América do Sul como

ocorrência natural restrita a três países: Brasil, Paraguai e Argentina (Figura 1)

(VIEIRA et al., 2010). No Brasil o cultivo da erva mate está localizado principalmente

no Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul, São Paulo e

Rio de Janeiro (MAZUCHOWSKI, 1989; FILIP, FERRARO, 2004 apud EFING et al,

2009).

Figura 1 - Distribuição geográfica da erva-mate. GOOGLE IMAGE 2014.

As seguintes denominações para Ilex paraguariensis são referidas por Daniel

(2009) erva-mate, caaguaçu, orelha de burro, caá, erva mate de talo branco, erva

piriquita, carvalho branco, mate, erva. Em espanhol, yerba mate; em Inglês, maté; no

Paraguai ka’a.

A primeira descrição sobre a Ilex paraguariensis, foi realizada pelo naturalista

francês Auguste de Saint-Hilaire (A. St.-Hil. (abreviatura oficial)) no qual suas

observações faziam a descrição de uma árvore perene com muitos ramos e folhas.

Sua altura varia de 8 a 15 metros em seu habitat natural, mas em cultivo (plantação)

devido às podas o seu tamanho pode não ultrapassar os sete metros (BERTÉ,

2011).

Apresenta um crescimento lento, florescendo entre os meses de setembro e

dezembro com a maturação de frutos entre janeiro a abril (EFING, 2008 apud

CUNHA, 2011). Possui caule cinza, folhas ovais e fruto pequeno verde a vermelho-

arroxeado, sendo as folhas da erva-mate aproveitadas na culinária, de várias

formas, conforme Figura 2 (DALLA NORA, 2008; NASCIMENTO, 2013).

Castaldelli e colaboradores (2011) relatam que o consumo da planta foi

promovido à categoria de tradição em algumas partes da América do Sul durante a

colonização, tendo o chimarrão como bebida típica, com consumo diário por pessoa

variando de 1,5 a 6 litros. Destaca-se no preparo de outras bebidas como tererê, chá

mate e mate cozido (SILVA, 2007; BARG, 2010; JACOB, 2012).

Figura 2–Aspectos Botânicos da Ilex paraguariensis. (BERTÉ, 2011).

A utilização da erva mate foi difundida através das nações Guarani e Quíchua

através da ingestão de infusões com as folhas sendo um hábito popular consumindo

principalmente no Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul, Paraguai, Uruguai e

Argentina (DALLA NORA, 2008).

Segundo Esmelindro e colaboradores (2002), cerca de 80% da área de

ocorrência da erva mate pertencem ao Brasil, sendo a região Sul a maior produtora,

com 596 municípios envolvidos na atividade ervateira, com a maior parte são

extraídos de ervais nativos.

O valor social e econômico da Ilex paraguariensis é considerado indiscutível,

tanto que importantes grupos de pesquisadores têm investigado a utilização da erva

mate na área genética, da produção e da industrialização (STORCK et al., 2002;

BARG, 2010).

A ampla variedade de empregos para a erva mate está associada a sua

composição fitoquímica. Em sua composição pode-se citar os alcalóides (cafeína,

teofilina e teobromina), compostos fenólicos, vitaminas (A, B1, B2, C e E), sais

minerais (alumínio, cálcio, fósforo, ferro, magnésio, manganês e potássio), proteínas

(aminoácidos essenciais) glicídios (frutose, glicose, rafinose e sacarose), lipídeos

(óleos essenciais e substâncias ceráceas), além de celulose, dextrina e gomas

(FRIZON, 2011; NASCIMENTO, 2013).

Apesar de a Ilex paraguariensis possuir inúmeras possibilidades de emprego

(Tabela 1), a literatura aponta que há necessidade de aprimoramento na qualidade

dos seus produtos e na projeção das suas potencialidades (CORREA et al., 2011;

COLPO, 2012).

Tabela 1 – Formas de aplicações industriais da erva mate

Aplicação Industrial Sub-produtos Comerciais Forma de Consumo

Bebidas Chimarrão e tererê Chá mate Mate solúvel

Infusão quente ou fria

Refrigerantes e sucos, cerveja; vinho

Extrato de folha diluído

Insumos de alimentos Corante natural e conservante alimentar

Clorofila e óleo essencial

Sorvete, balas, bombons, chicletes e gomas

Medicamentos Estimulantes do Sistema Nervoso Central

Extrato de cafeína e teobromina

Compostos pra o tratamento de hipertensão, bronquite e pneumonia

Extrato de flavonóides

Higiene Geral Bactericida e antioxidante hospitalar e doméstico Esterilizante e emulsificante

Extrato de saponinas e óleo essencial

Tratamento de esgoto

Reciclagem de lixo urbano

Produtos de uso pessoal Perfumes, desodorantes, cosméticos e sabonetes

Extrato de folhas seletivo e clorofila

Fonte: Adaptado MACCARI JUNIOR (2005).

O uso da erva mate tem sido explorada tanto pela indústria de alimentos

(tererê, chimarrão, chá mate solúvel, chá mate verde, chá mate tostado, refrigerante,

bebidas energéticas, balas, ingredientes para produtos alimentícios) quanto pela

indústria química (tintas e resinas, medicamentos, desinfetantes, adstringentes,

cosméticos e perfumaria) (PAGLIOSA, 2009).

Maccari Junior (2000 apud MACCARI JUNIOR, 2005) levantou através de

seus trabalhos informações sobre diversas formas de aplicação para a erva mate

como na produção de medicamentos, cosméticos produtos de limpeza e na indústria

de alimentos.

O consumo das bebidas derivadas da erva mate possuem efeitos benéficos

que envolvem a prevenção dos fatores de risco das doenças cardiovasculares, ação

hipocolesterolêmica e atividade vasodilatadora (SOUZA, 2009).

Quanto ao uso de produtos à base da erva mate, estudos tem demonstrado a

presença de substâncias nos extratos de erva mate com ação antioxidante, anti-

inflamatório, antimutagênico, agente antiglicação e redutor de peso (MATSUMOTO,

et al., 2009; HECK, MEJIA, 2007; FILIP et al., 2010; COLPO, 2012, BRACESCO, et

al., 2011).

Estudos recentes sobre os efeitos da Ilex paraguariensis mostram atividades

quimiopreventivas (prevenção do dano celular) efeitos coleréticos e propulsão

intestinal, efeitos vasodilatadores, inibição da glicação (reação enzimática entre

açúcares sanguíneos, proteínas e lipídeos, formando produtos que se acumulam e

promovem locais estáveis para a catalisação da formação de radicais livres e

aterosclerose). Em relação à ação antioxidante da erva mate, pesquisas mostram

uma atividade antioxidante equivalente ou superior à vitamina C e à vitamina E

(BARG, 2010; RIL et al., 2010).

1.3 Compostos Fitoquímicos da Erva mate

Entre os compostos fitoquímicos presentes em produtos a base de Ilex

paraguariensis, destaca-se principalmente a presença de minerais, vitaminas e

constituintes que são metabólitos secundários da planta (COLPO, 2012).

Veronese (1944) mostra que a erva mate é constituída de água, celulose,

gomas, dextrinas, micilagem, glicose, pentoses, substâncias graxas, resina

aromática, legumina, albumina, cafeína, teofilina, cafearina, cafamarina, ácido

matetânico, ácido fólico, ácido virídico, clorofila, colesterina e óleo essencial. As

cinzas são compostas por potássio, lítio, ácido fosfórico, sulfúrico, carbônico,

clorídrico e cítrico, além de magnésio, manganês, ferro, alumínio e traços de

arsênico (GIRARDI, 2010). As folhas de mate possuem ainda, em sua composição,

alcalóides, flavonóides, vitaminas, taninos, ácido clorogênico e saponinas; o nível de

polifenóis é maior do que aquele encontrado no chá-verde e no vinho tinto

(LUNCEFORD; GUGLIUCCI, 2005 apud SILVA, 2009; GIRARDI, 2010).

O perfil fitoquímico de Ilex paraguariensis apresenta diversos constituintes

químicos ativos que podem ser responsáveis pelas inúmeras atividades biológicas

desta espécie (SANTOS, 2011). Dentre os componentes (Figura 3) podemos citar

aqueles que apresentam em maior quantidade como os à classe dos ácidos

fenólicos (ácido clorogênico e seus derivados) e alcalóides purínicos (metilxantinas,

como cafeína, teobromina e teofilina) seguidos pelos flavonóides (quercetina,

canferol e rutina), saponinas triterpênicas, taninos, minerais e vitaminas (A,

complexo B, C e E) (JACOB, 2012).

Figuras 3 - Principais componentes orgânicos no extrato de Ilex paraguariensis. Adaptado e retirado BRACESCO, et al. (2011).

Barg (2010) afirma em seu estudo que a cafeína o ácido hexadecanóico,

flavonóides, minerais (P, Fe e Ca) e vitaminas C, B1 e B2 são os maiores

constituintes encontrados na erva mate. Alguns estudos indicam ainda que a

acumulação simultânea de cafeína e teobromina parece ser uma característica

particular da Ilex paraguariensis (SANTOS, 2011).

Para Esmelindro (2002) apesar da grande quantidade de estudos realizados

sobre a erva mate, grande parte não apresenta resultados que possam ser

considerados definitivos, particularmente quanto às determinações quantitativas de

substâncias na composição química. Deve-se ressaltar que a composição química

da erva mate, assim como de outras plantas, pode sofrer alterações qualitativas e

quantitativas em função de diversos fatores, como o tipo de cultivo, clima, solo,

idade da planta, e a época da colheita (PAGLIOSA, 2009; CUNHA, 2011; SANTOS

2011; NASCIMENTO, 2013).

Estudos demonstram que as saponina presentes na erva mate possuem

atividades antitumoral, anti-edematogênica e pode auxiliar na redução do colesterol.

Os polifenóis são antioxidantes, anti-inflamatórios e anticarcinogênicos. As

metilxantinas são compostos interessantes devido às propriedades farmacológicas,

como estimulantes do sistema nervoso central, inibição do sono, diminuição da

fadiga e diuréticos, sendo os mais abundantes na espécie (Tabela 2) (DANIEL,

2009; CUNHA, 2011).

Tabela 2 – Compostos bioativos da erva mate e seus efeitos biológicos

Compostos Efeitos biológicos

Metilxantinas (Cafeína, teobromina e teofilina)

- Estimulador do Sistema nervoso central, cardíaco, muscular e renal. - Diurético. - Regulador da saciedade, termogênese, lipólise e oxidação lipídica. - Antiinflamatório.

Flavonóides (Quercetina, rutina) - Antiinflamatório. - Antioxidante. - Hipocolesterolêmico. - Hepatoprotetor.

Cafeoil-derivados (Ácido cafeíco, ácido clorogênico, ácidos dicafeoilquinicos)

- Antioxidante. - Antiinflamatório. - Neuroprotetor.

Saponinas (Matesaponina) - Antiinflamatório. - Hipocolesterolêmico.

Fonte: Adaptado e retirado Yamada (2013).

Em relação a erva mate, a cafeína (C8H10N4O2) ou 1,3,7-trimetilxantina,

classificada como um alcalóide pertencente ao grupo de compostos químicos

denominados metilxantinas, a cafeína é a que mais atua sobre o sistema nervoso

central (Figura 4) (ARAÚJO, 2011).

Figura 4 – Estrutura molecular das metilxantinas; 1: cafeína, 2: teobromina e 3: teofilina. Adaptado e retirado Andrade (2011).

Os estudos relacionados à biossíntese da cafeína se iniciaram na década de

1970. A substância é um derivado de um composto chamado xantosina, que é

convertido em cafeína em uma reação de biossíntese na qual intervém a ação de

três enzimas (ZAMPIER, 2001; DUTRA, 2009; OLIVEIRA, 2007). A biossíntese da

cafeína (Figura 5) é regulada pelas enzimas N-metiltransferases, principalmente

pelas 7-Metilxantosina sintetase e cafeína sintetase ou em alguns casos pela

teobromina sintetase. A cafeína é sintetizada nos tecidos jovens e a cafeína

sintetase encontra-se nos cloroplastos das folhas em desenvolvimento.

Figura 5 – Esquema das vias de síntese (A) e de degradação (B) da cafeína (OLIVEIRA, 2007)

Os alcalóides são responsáveis pelas propriedades estimulantes do mate. A

cafeína e a teobromina estimulam e facilitam a atividade cortical inibindo o sono, a

sensação de fadiga, estimulam os centros respiratórios e vasomotores, aumenta a

velocidade do metabolismo, já a teofilina ativa diurese e os movimentos peristálticos

facilitando a micção e a evacuação respectivamente (NOWACKI, 2010,

NASCIMENTO, 2013).

Zampier (2001), Andrade (2011) e Nascimento (2013) afirmam que a cafeína

assume destaque por suas propriedades farmacológicas, e boa parte das ações

fisiológicas atribuídas a erva mate deve-se à presença da cafeína. É a droga mais

amplamente utilizada em todo o mundo, presente em vários tipos de bebidas e

medicamentos.

De acordo com estudos o teor de cafeína encontrado na erva mate (Ilex

paraguariensis) observa-se uma variação sobre a fertilidade do solo, tipo de cultivo

nativo ou reflorestamento, a exposição ao sol ou sombreamento, a idade da planta e

o mês do ano para coleta da amostra. No estudo de Zampier (2001), em erva mate

cultivada em solo com adubação orgânica houve um aumento no teor cafeína que

variaram de 1,10% a 1,32% referente a outros cultivos de erva mate (SANTOS,

2004; NASCIMENTO, 2013).

Com relação aos compostos fenólicos ou polifenóis são considerados uma

das principais classes de metabólicos secundários, no qual são conhecidos pela sua

capacidade antioxidantes no organismo humano. Estudos relacionam a presença

dos ácidos fenólicos, cumarinas, ligninas, taninos, flavonóides e fazendo parte de

alcalóides e terpenóides (BERTÉ, 2011; NASCIMENTO, 2011).

De acordo com literatura os compostos fenólicos apresentam uma ação de

defesa a radicais livres produzidos, normalmente, pelo metabolismo das células ou

em resposta a fatores externo, porém estudos recentes sugerem que essas ações

podem atuar interferindo em vias inflamatórias e na regulação do metabolismo

energético e na saúde do intestino (COLPO, 2012; SOTO VACA, 2012).

Conforme os estudos in vitro as metasaponinas contidas nas folhas de Ilex

paraguariensis evidenciaram ação antiinflamatória e inibiram a proliferação de

células de câncer de cólon (PUANGPRAPHANT, et al., 2011;COLPO, 2012).

A relação dos efeitos anti-inflamatórios e imuno-moduladores de plantas que

apresentam polifenóis na sua composição vêm sendo investigada e apresentando

resultados promissores, destacando o estudo realizado por Puangpraphant e Mejia

(2009), no qual a avaliação do potencial anti-inflamatório do extrato de erva mate

através da capacidade de alguns compostos fitoquímicos e suas interações

produzindo a inibição da COX2/PGE e INOS/NO.

1.4 Angiogênese

Para Folkman; Brem (1992 apud FERREIRA 2006) o termo angiogênese foi

utilizado pela primeira vez em 1935 por Hertig para descrever a vascularização na

placenta e progressivamente foram desenvolvidos vários modelos in vitro e in vivo

para o estudo de seus mecanismos moleculares, modulação e a sua importância

nos processos fisiológicos e patológicos.

Outros autores utilizam para definir a angiogênese como um processo de

neoformação de estruturas vasculares a partir de capilares e vênulas pós-capilares

pré-existentes em resposta a diversos estímulos, denominados estímulos

angiogênicos, que por sua vez levam a formação de novos vasos que necessitam da

migração e proliferação de células endoteliais, para que ocorra o crescimento

vascular (FOLKMAN; HAUDENSCHILD, 1980; FOLKMAN; KLAGSBRUN, 1987).

O desenvolvimento vascular obedece a uma sequência organizada de

diversos eventos os quais devem ser coordenados por células e moléculas

especificas (SILVA, 2012). Esses mecanismos celulares e moleculares envolvidos

no crescimento vascular são diferenciados nos vários tecidos existentes, assim, os

neovasos apresentarão aspectos morfológicos e funcionais de acordo com as

necessidades de cada tecido (FERREIRA, 2006).

Conforme Borba (2012) no processo denominado angiogênese, a rede

primária de vasos sofre uma remodelagem combinados a partir de eventos de morte

e regressão vascular iniciado pela sobrevivência e ramificações de capilares de

vasos pré-existentes.

Para Castro (2012) e Almeida (2014) a formação de novos vasos sanguíneos

é regulada por um equilíbrio entre fatores pró e anti-angiogênicos e ocorre tanto em

processos fisiológicos (duração de dias a semana) como patológicos (persiste por

meses).

Jain (2003 apud FERREIRA, 2006) relatam que as etapas que levam a

formação do processo de angiogênese envolvem vasodilatação e aumento da

permeabilidade vascular, degradação da membrana basal, perda das junções entre

as células endoteliais, migração e proliferação das células endoteliais, formação de

cordões endoteliais, formação da membrana basal, maturação e remodelamento,

recrutamento das células periendoteliais (Figura 6).

Figura 6: Processo de formação de novos capilares sanguíneos por angiogênese. (BORBA, 2012).

Jain (2003 apud FERREIRA, 2006) relatam que as etapas que levam a

formação do processo de angiogênese envolvem vasodilatação e aumento da

permeabilidade vascular, degradação da membrana basal, perda das junções entre

as células endoteliais, migração e proliferação das células endoteliais, formação de

cordões endoteliais, formação da membrana basal, maturação e remodelamento,

recrutamento das células periendoteliais.

Diferentes autores descrevem que o inicio da resposta angiogênica ocorre por

um estímulo desencadeador que leva a dilatação dos vasos adjacentes ativando as

células endoteliais que iniciam a produção de novas moléculas (enzimas

proteolíticas responsáveis pela degradação da membrana basal e da matriz

extracelular). (BRITO, 2007)

Seguindo a degradação da matriz, as células endoteliais migram em torno do

tecido em resposta a quimiocinas angiogênicas, no qual os fatores de crescimento

podem contribuir para a mobilidade das células endoteliais levando a um movimento

aleatório de células (quimiocinese) ou para a migração dirigida para um fator

estimulante (quimiotaxia) (ALMEIDA, 2014)

Após a degradação da membrana basal ocorre à liberação dos fatores

angiogênicos que por sua vez, estimulam a proliferação e migração de células

endoteliais e a invasão do tecido, esse processo leva à formação do tubo capilar, a

deposição de uma nova membrana basal e a anastomose leva ao fluxo sanguíneo

(Figura 7) (BRITO, 2007; CASTRO, 2012; COSTA, 2012, ALMEIDA, 2014).

Figura 7– Etapas do processo de neovascularização. (A) Células endoteliais. (B) As células endoteliais secretam proteases que degradam a membrana basal e matriz extracelular. (C) Formação do Broto capilar pelo resultado da migração direcionada das células endoteliais. (D) Crescimento por mitose e migração celular dos vasos. (E) formação de um lúmen e nova membrana basal. (F) A Alça capilar é formada pela união de dois brotos. (G) uma segunda geração de brotos capilares começa a se formar. Modificado Brito (2007).

Conforme Zhang e colaboradores (2011) e Almeida (2014), a angiogênese

pode ser o resultado de um aumento da atividade dos fatores pró-angiogênicos ou

de uma redução da atividade dos fatores anti-angiogênicos.

1.4.1 Mediadores químicos envolvidos na angiogênese

As primeiras observações sobre as etapas envolvidas no processo de

angiogênese foram descritas por Sandison (1924) e posteriormente por Ausprunk e

Folkman (1977) indicando que os vasos neoformados ocorrem por uma série de

eventos morfológicos e bioquímicos complexos em sequências independente do

estimulo angiogênico inicial (CASTRO 2012).

Conforme Zart (2007) e Borba (2012) o processo de angiogênese ocorre pela

interação entre células, fatores de crescimento e citocinas que determinam o

surgimento de uma rede capilar a partir de um único vaso capilar. Esse processo

complexo chamado angiogênese é resultado de um balanço entre ativadores e

inibidores (Figura 8) em um equilíbrio dinâmico de concentrações estritamente

controladas, mas que pode ser rapidamente estimulado ou inibido o processo.

Figura 8 – Fatores do processo da angiogênese. Adaptado e retirado BORBA (2012).

O processo de angiogênese pode ser dividido em dois grandes subgrupos: os

fatores de crescimento e as citocinas. O fator de crescimento mais importante é uma

proteína conhecida como VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), que atua

seletivamente nas células endoteliais para estimular a angiogênese através da

migração e proliferação das células endoteliais. Os chamados fatores de

crescimento ligam-se a receptores na superfície das células e ativam a proliferação

e/ou diferenciação celular. Dentre os fatores de crescimento mais investigados

estão: o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o fator transformador

(TFG-beta), o fator de crescimento fibroblástico (FGF), o fator de crescimento

semelhante à insulina (IGF) e o fatores estimulantes da multiplicação de granulócitos

e monócitos (GM-CSF) (WENDT, 2005; ZHANG et al, 2011; ALMEIDA, 2014).

Entre as citocinas pode-se ressaltar as interlucina6 (IL-6) e a interlucina 8 (IL-

8), que estimulam a proliferação queratinócita. As citocinas são polipeptídeos que

induzem uma ou mais etapas do processo de angiogênese interagindo com

receptores específicos nas células endoteliais e/ou recrutando e ativando células

como os macrófagos e leucócitos, que possuem a capacidade de produzir os fatores

angiogênicos (BRITO, 2007; CASTRO, 2012; ALMEIDA, 2014).

Visto que para um novo vaso estar estável e funcional impedindo uma ruptura

ou deformações, são necessários outros componentes como a lâmina basal,

pericitos e músculo liso. As células da musculatura lisa vascular também agem na

estabilização dos vasos recém-formados, inibindo a migração de proliferação de

células endoteliais. Neste contexto a matriz extracelular é essencial para a

maturação e desenvolvimentos vascular, sendo ela responsável pelo suporte dos

vasos durante o crescimento, e por armazenar e mobilizar peptídeos, fatores de

crescimento e citocinas. E o pericitos ou células murais, participam da manutenção

do tônus vascular, maturação e a consolidação dos vasos recém formados

(ARROYO et al., 2010; DIAS, 2010) .

1.4.2 Modelos de estudo da angiogênese

Atualmente diversos estudos na área de biomateriais, biotecnologia, e

engenharia tecidual têm permitido a criação de dispositivos implantáveis com

aplicação médica e/ou farmacêutica no intuito de oferecer novas estratégias para a

restauração da estrutura e função de tecidos lesionados (CASTRO, 2012).

Existe uma variedade de modelos experimentais in vitro e in vivo para

mensurar o processo da angiogênese, onde a maioria das etapas da cascata

angiogênica pode ser monitorada (SILVA, 2012).

Diante desse fato Ferreira (2006) e Araujoet al. (2010) mostram o modelo de

implantação de esponjas subcutâneas em animais que foi descrito inicialmente por

Grindlay e Waugh(1951) e modificado por Andrade et al. (1987),no qual a

implantação de matrizes sintéticas induzem uma reação inflamatória levando a

formação do tecido de granulação rico em novos vasos sanguíneos, representando

um excelente ensaio para o estudo da angiogênese inflamatória.

Conforme Silva (2012) a matriz sintética induz um processo inflamatório, ou

seja, ocorre uma reação inflamatória tipo corpo estranho formando o tecido de

granulação rico em células inflamatórias e consequentemente a formação de novos

vasos sanguíneos, sendo a matriz esponjosa envolvida por uma cápsula fibrosa,

considerada um excelente modelo para estudo da angiogênese inflamatória.

Outra informação importante sobre a utilização do modelo de implante de

esponja auxilia na caracterização de alterações histológicas na formação do tecido

de granulação, monitorar a cinética de proliferação celular além de permitir o estudo

do infiltrado inflamatório, da angiogênese e da deposição da matriz extracelular, bem

como o efeito de drogas ou outro estímulo sobre o processo (COSTA, 2012).

Nesse contexto o presente trabalho tem como objetivo avaliar o modelo de

matriz esponjosa após 14 dias, o efeito do extrato hexânico de erva mate (Ilex

paraguariensis) no processo de neovascularização em camundongos.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o efeito do extrato hexânico de erva mate (Ilex paraguariensis) no

processo de neovascularização em camundongos.

2.2 Objetivos específicos

- Analisar a capacidade do extrato hexânico de erva mate em induzir a formação de

novos vasos sanguíneos em camundongos no modelo de implante de esponja;

- Avaliar a neovascularização por meio da dosagem de hemoglobina nas esponjas

na presença do extrato hexânico da erva mate.

- Avaliar a neovascularização por meio de análise histológicas das esponjas na

presença do extrato hexânico da erva mate.

- Avaliar a produção de colágeno induzido pela implantação das esponjas na

presença do extrato hexânico da erva mate.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Extrato de erva mate

A matéria-prima vegetal, composta de folhas e talos de Ilex paraguariensis

erva mate foi coletada pela mestranda, no mês de novembro de 2013 na empresa

Erva Mate Caseira, localizada na Avenida José Roberto Teixeira, 288 - CEP 79822-

090 - Dourados / MS, no qual foi separado manualmente, triturada e macerado com

hexano. Para a realização do extrato foi utilizado 1 kg aproximadamente de material

vegetal composto por folhas.

As folhas foram trituradas e colocadas no Erlenmeyer e na sequência foi

adicionado o solvente hexânico (até a cobertura de todo o material vegetal),

permanecendo em temperatura ambiente com agitação ocasional por uma semana.

Após o período pré-estabelecido de uma semana o macerado entre erva mate e o

solvente hexânico foi submetido ao processo de filtração, no qual o extrato líquido foi

filtrado em papel filtro e submetido à evaporação do solvente hexânico em

rotaevaporador à 40ºC, sendo armazenado em recipiente hermético.

3.2 Animais

Os animais utilizados foram fêmeas da linhagem C57 Black6, com idade de 6

a 8 semanas, pesando aproximadamente 20 gramas, provenientes do Biotério da

Universidade Católica Dom Bosco – UCDB – Esses animais permaneceram no

Biotério de Manutenção – Sala E 103/UCDB, com livre acesso a água e ração, e sob

o ciclo claro/escuro, até o momento dos experimentos.Todas as fases dos

experimentos e procedimentos foram realizadas de acordo com as normas

internacionais de ética em pesquisa com animais, com o protocolo número

014/2013.

No delineamento experimental, cada grupo de animais recebeu um implante

de esponja subcutânea (região cervical) embebido por 200 μL de salina e 200 μL de

extrato hexânico de erva mate em diferentes concentrações (5%, 10% e 30%),

conforme a tabela 3

Tabela 3 – Distribuição dos grupos experimentais.

GRUPOS Tratamento

Grupo 1 Salina

Grupo 2 Extrato hexânico 5%



n= 6 animais por grupo

A escolha para avaliação dos parâmetros bioquímicos e histológicos para o

estudo da neovascularização teve como base diferentes trabalhos anteriores que

evidenciaram importantes fenômenos de recrutamento celular e formação de tecido

fibrovascular em um período de 14 dias após o implante subcutâneo de esponja.

3.3 Técnica da implantação subcutânea de fragmentos de esponja

3.3.1 Confecção e preparo dos fragmentos de esponja

A partir das placas de poliéster-poliuretano (espuma convencional) foram

obtidos fragmentos com tamanho de 8 mm de diâmetro e 5 mm de espessura. As

esponjas foram lavadas e fervidas em água destilada por aproximadamente 30

minutos, após foram secas em temperatura ambiente e mantidas em condições

estéreis até o momento do implante (ANDRADE et al., 1987). Para o implante, as

esponjas foram colocadas individualmente em placa de 96 poços, contendo 200µl de

salina ou dos extratos nas diferentes concentrações (Figura 9).

Figura 9 – Modelo de implante de esponja.

3.3.2 Implantação das esponjas

Para o implante dos fragmentos de esponjas, os animais foram anestesiados

com solução de Cetamina (150mg/kg) e Xylazina (10mg/kg) e submetidos à

tricotomia e assepsia da região cervical. Foi realizada uma incisão 1 cm na pele, que

foi em seguida divulsionada, formando uma cavidade onde foi implantada a esponja.

A incisão foi suturada com fio de nylon 3.0. Após, os animais receberam

intraperitonealmente solução de Dipirona (10mg/kg). Após a recuperação da

anestesia, 20 animais foram colocados em caixas individuais e receberam livre

acesso a água e ração durante 14 dias.

3.3.3 Remoção dos fragmentos de esponjas

Os implantes de esponjas foram retirados no 14º dia após a cirurgia. Para

remoção dos implantes, os animais foram submetidos à eutanásia com

aprofundamento da anestesia com Cetamina e Xylazina. Os discos de esponjas

foram dissecados, removidos e pesados. Cinco fragmentos de cada grupo foram

macerados em 0,5ml de solução salina para determinação dos níveis de

hemoglobina com indicativo da neovascularização. Uma amostra de cada grupo foi

congelada em substância criopreservadora (CryoGlueSlee Medical GmbH,

Alemanha) para posterior confecção de cortes histológicos (8µm) em criostato

(SleeCriostat MEV).

3.4 Dosagem de hemoglobina

Para a avaliação do processo de neovascularização foi medida o conteúdo de

hemoglobina dos implantes (esponjas) pelo método de Drabkin, com a utilização do

Kit para determinação de Hemoglobina (Labtest, São Paulo, Brasil. ref. 47 – MS

10009010028). A concentração da hemoglobina foi determinada pela leitura

espectrofotométrica em 540nm (Unicam 5625 UV/VIS Spectrometer).

3.5 Análises Histológicas

3.5.1 Determinação de Colágeno

A determinação do colágeno nas esponjas tratadas ou não com o extrato da

Ilex paraguariensis foi realizada por meio da coloração Tricrômico de Masson,

conforme descrito por Masson em 1929 (MOLINARO, 2010).

Resumidamente, as lâminas com os cortes histológicos foram mantidas em

solução de Bouinpor 1 hora na estufa a 60ºC. A solução de Bouin consiste de uma

mistura homogênea dos componentes: Solução saturada de ácido pícrico (75 ml),

formaldeído puro (25 ml) e ácido acético glacial (5 ml). Após 1 hora as peças

cirúrgicas foram lavadas em água corrente (5 min) até retirar todo o amarelo deixado

pela solução de Bouin. Na sequência lavou-se novamente com água destilada (5

min) e as laminas foram imersas na solução de Hematoxilina Férrica de Wigert (A e

B) por 10 min. A solução Hematoxilina Férrica Wigert (A) consiste na mistura de

hematoxilina pó (1g) com álcool 95% (100 ml) e a solução Hematoxilina Férrica

Wigert (B) consiste em uma solução aquosa de Cloreto Férrico a 29% (4 ml), Água

Destilada (95 ml) e Ácido Clorídrico Concentrado (1 ml). Após a mistura homogênea

da solução Hematoxilina Férrica Wigert (A e B) as peças foram lavadas em água

corrente (5 min) e em água destilada (5 min), seguida da imersão em fucsina ácida

(Escarlate de Biebrich) (5 min). Novamente foi realizado o procedimento de lavagem

em água corrente (5 min), e em água destilada (5 min). Após as laminas foram

colocadas na solução de Ácido Fosfotúgênico 5% e Ácido Fosfomolídico a 5% (15

min). As laminas foram lavadas novamente e imersas em Azul de Anilina (5 – 10

min). Finalmente foi feita a lavagem do material em água destilada (5 min) e

posteriormente em solução aquosa de Ácido Acético Glacial 1% (3 – 5 min) seguido

de lavagem em água destilada (5 min).

Após a coloração, as amostras foram analisadas por meio de software de

análise de imagens associado a uma câmera digital e um microscópio óptico

(1000X). Em cada lâmina foram aliados 5 campos. As imagens capturadas foram

analisadas usando o software ImageJ ( Rasband , WS ,ImageJ , US

NationalInstitutes da Saúde, Bethesda,Maryland , EUA , http://imagej.nih.gov/ij/ ,

1997-2012),com plugins específicos (Color Deconvolution , GabrieleLandini e 3D

Color Inspector, Kai Uwe Barthel ).

3.5.2. Analise Histológica do Infiltrado Inflamatório e Neovascularização

A partir das esponjas, foram confeccionadas três lâminas por grupo

experimental. As lâminas foram coradas em Panótico Rápido e avaliadas em

microscópio óptico (1000X). Foram avaliados cinco campos por lâmina, com a

contagem do número de vasos e infiltrado inflamatório (neutrófilos e mononucleares)

por campo.

3.6 Análise Estatística

Os resultados estão apresentados como médias ± E.P.M (erro padrão da

média). A comparação entre os grupos foi realizada através do teste de Bonferroni.

Quando comparado os demais grupos foi usado a análise de variância (ANOVA).

Todos os dados analisados foram submetidos ao teste de normalidade. Os

resultados foram considerados significativos para p˂0,05. Para a análise estatística

foi utilizado o programa Assistat.

4 RESULTADOS

4.1 Resultados referentes do 1º ao 14º dia de implantação das esponjas.

Os implantes esponjosos nas diferentes concentrações foram bem tolerados

pelos animais, não apresentando sinais de infecção ou rejeição no local do implante

durante o período experimental de 14 dias. A matriz esponjosa tornou-se

gradualmente mais aderida aos tecidos adjacentes, à figura 10 comprova esta ação.

No exame in situ a matriz esponjosa implantada mostrou um indicativo da presença

de vasos sanguíneos nos implantes durante o período experimental estudado.

Figura 10–Matriz esponjosa, apresentando alterações vasculares visíveis ao 14º dia. (A) Salina; (B)

5% de extrato de erva mate; (C) 10% de extrato de erva mate; (D) 30% de extrato de erva mate.

4.2 Peso médio das esponjas

Ao propor o uso da matriz esponjosa como forma de avaliar a

neovascularização, foi analisado o peso úmido das esponjas, resultando na

observação de que o peso úmido dos implantes dos animais do grupo salina foi

significativamente superior quando comparado aos grupos de 5%, 10% e 30%. O

grupo com 10% de extrato hexânico de erva mate foi superior quando comparado

aos grupos de 5% e 30% com extrato hexânico de erva mate. Em uma análise

morfométrica da matriz esponjosa foi evidenciado um aumento ao longo do período

de 14 dias de implantação nos diferentes grupos analisados (Figura 11).

Figura 11–Avaliação do peso dos implantes de esponjas. O peso das esponjas foi determinado antes do implante e 14 dias após no mento da retirada. Resultados expressos em mg. *p<0,05 quando comparado aos respectivos grupos controles tratados com salina. #p<0,05 quando comparado ao grupo tratado como extrato hexanico da erva-mate 10%. (ANOVA seguida de pós teste de Bonferroni; media ± EPM).

4.3 Avaliação da hemoglobina

A mensuração do conteúdo de hemoglobina nos implantes proporciona um

índice bem validado de neovascularização (CASTRO, 2012). Esta característica foi

utilizada como indicativo de neovascularização na matriz esponjosa dos diferentes

grupos do experimento, no qual a dosagem do conteúdo de hemoglobina pelo

método de Drabkin é uma medida indireta da formação de vasos sanguíneos. O teor

da hemoglobina em todos os grupos avaliados apresentou um aumento considerável

(Figura 12). Os grupos com 5%, 10% e 30% de extrato hexânico de erva mate nos

implantes de esponjas apresentaram um aumento, quando comparados ao grupo

salina. Os implantes com 30% de extrato hexânico de erva mate não mostrou um

aumento significativo quando comparado aos grupos com 10% de extrato hexânico

de erva mate.

Figura 12 – Determinação dos níveis de hemoglobina como indicativo da neovascularização nos implantes de esponja em camundongos. A neovascularização foi avaliada através da concentração de hemoglobina nos implantes após 14 dias. Os resultados estão expressos em Absorbância em 540nm. *p<0,05 quando comparado ao grupo controle tratado com salina. (ANOVA seguida de pós teste de Bonferroni; media ± EPM).

4.4 Avaliação histológica dos discos de esponja

4.4.1 Avaliação do Infiltrado Inflamatório e Neovascularização

Através da análise do infiltrado inflamatório, após a coloração por

Hematoxilina-Eosina (HE), presente no tecido fibrovascular dos implantes, foi

observada a presença das células inflamatórias (Figura 13), dos quais o grupo salina

apresentou uma menor concentração do número de células inflamatórias quando

comparada aos grupos com concentrações com 10% e 30% de extrato hexânico de

erva mate. Ao comparar o grupo de 5% de extrato hexânico de erva mate pode-se

verificar uma menor concentração de células inflamatórias evidenciando uma

diferença significativa quando comparado ao grupo com 30% de extrato hexânico de

erva mate, o que mostra uma maior quantidade de infiltrados inflamatórios (Figura

14).

Figura 13 – Avaliação do Infiltrado Inflamatório nos implantes de esponjas em camundongos. O infiltrado inflamatório foi avaliado em cortes histológicos feitos a partir dos implantes de esponjas retirados no 14ºdia. Foram avaliados 3 cortes por grupo e 6 sessões por corte ( 1000X; HE). Os resultados estão expressos como número de células. *p<0,05 quando comparado ao grupo controle tratado com salina. #p<0,05 quando comparado ao grupo controle tratado como extrato 30% (ANOVA seguida de pós teste de Bonferroni; media ± EPM).

Figura 14 – Avaliação histológica do Infiltrado Inflamatório nos implantes de esponjas em camundongos. Aumento 400X (coloração HE). Microscópio Zeiss Axiovert. O estroma fibrovascular no grupo salina e nos grupos com concentrações diferentes de extrato hexânico de erva mate (5%, 10% e 30%) evidenciam a presença de células no meio do tecido conjuntivo frouxo da matriz extracelular. O grupo com 30% de extrato hexânico de erva mate, mostrou uma maior quantidade de células no período de 14 dias com a matriz esponjosa.

4.4.2 Avaliação do colágeno

Com o método do Tricômico de Masson, o citoplasma, queratina e fibras

intercelulares apresentaram coloração vermelha, enquanto os núcleos foram

corados em preto. Fibras colágenas e muco foram evidenciados pela coloração azul.

Similar ao observado nas análises da neovascularização e infiltrado inflamatório, a

presença de colágeno nas esponjas tratadas com o extrato de erva mate nas

concentrações de 10 e 30% foi maior em relação ao grupo tratado com salina, como

está demonstrado no histograma de análises de cores referentes a cada grupo, no

qual se observa aumento na área (cor azul) representativa das fibras de colágeno

nos cortes histológicos (Figura 15).

Figura 15 – Avaliação histológica da presença de colágeno nos implantes de esponjas em camundongos. Aumento 400X (coloração Tricômico de Masson). Microscópio Zeiss Axiovert. Os histogramas representam a intensidade de cores referentes à presença de células (vermelho) e colágeno (azul).

5 DISCUSSÃO

Dentro da pesquisa científica, diferentes estudos utilizando extratos vegetais

vêm sendo realizados, o que comprova a relevância dessa análise, uma vez que o

efeito do extrato de erva mate usado para auxiliar na formação de novos vasos não

foi totalmente especificada, o que aponta para uma oportunidade de investigação

acadêmica.

O estudo apresentado mostra o desenvolvimento do processo de

neovascularização induzido por esponja de poliéster-poliuretano em camundongos

fêmeas da linhagem C57 Black 6, sendo um modelo frequentemente utilizado em

investigações in vivo a partir de diferentes parâmetros.

Considerando que grandes partes dos estudos biológicos realizados com a

Ilex paraguariensis, mostram os principais compostos fitoquímicos encontrados

nesse vegetal, procurou-se investigar os efeitos do extrato hexânico de erva mate na

formação de novos vasos sanguíneos.

Tem sido relatado na literatura que as propriedades estimulantes da erva

mate estão relacionadas à presença de metilxantinas, destacando a cafeína e a

teobromina que atualmente é considerada o estimulante mais utilizado em

alimentos, bebidas e medicamentos.

Os efeitos relacionados as metilxantinas são descritos como estimulantes do

sistema nervoso central e cardiorrespiratório, analgésico, relaxante da musculatura

lisa (CUNHA, 2011; GOMES, 2012; COLPO, 2012). Esta relação pode ser alterada

dependendo da forma de cultivo e da época na qual a folha será colhida, sendo esta,

uma abordagem para estudos complementares. Sob esta ótica, a cafeína apresenta

ação no sistema nervoso central aumentando as funções psíquicas melhorando a

atividade mental, acelerando o metabolismo basal e consumo de oxigênio pelos

tecidos, estimulando a termogênese e a oxidação de gordura (GOMES, 2012).

Em relação aos compostos fenólicos da erva mate, podemos destacar a

capacidade para realizar atividade antioxidante pelo sequestro de radicais livres,

dentre eles, os derivados do óxido nítrico, o que pode acelerar a cicatrização de

feridas cutâneas (MOURA, 2009).

Diferentes efeitos benéficos da erva mate têm sido identificados na

comunidade científica, proteção contra o dano no DNA (MIRANDA et al., 2008),

atividade vasodilatadora (SOUZA, 2009), efeito termogênico (GOMES, 2012).

Quanto à ingestão da infusão da erva mate é possível destacar uma

importante fonte de minerais essenciais e vitaminas (CARMO, 2007). Na medicina

popular a Ilex paraguariensis tem sido utilizada no combate à fadiga, digestão e

doenças hepáticas (BARLETTE, 2011).

Embora os efeitos da Ilex paraguariensis já tenham sido avaliados em

diferentes estudos, não encontramos na literatura qualquer trabalho que investigou

os componentes (recrutamento celular, neovascularização e deposição de matriz

extracelular) da angiogênese inflamatória.

No entanto, já está bem descrito na literatura que o uso de matriz esponjosa

de poliéster-poliuretano, é capaz de induzir uma resposta inflamatória de forma local

ou temporal. O modelo de implante permite analisar uma gama de mediadores

químicos da inflamação, fatores de crescimento, além do perfil e a dinâmica da

migração celular e o reparo tecidual na matriz esponjosa (ANDRADE et al, 1987;

COSTA, 2012).

A primeira etapa da abordagem experimental utilizada neste estudo consistiu

na avaliação da capacidade do extrato hexânico de erva mate na formação de novos

vasos, induzidos pela implantação da matriz esponjosa. O resultado mostrou um

crescimento fibrovascular localizado, permitindo visualizar a presença de achados

vasculares após o 14º dia de implantação. Um dos aspectos possíveis para que

ocorresse a neovascularização pode estar associado à reação inflamatória local em

decorrência do processo cirúrgico para a implantação ou, ainda, pela presença da

matriz esponjosa durante o período do experimento.

Nos grupos de animais que receberam concentrações de 5%, 10% e 30% do

extrato hexânico de erva mate e no grupo salina, foi evidenciada a presença de

vasos sanguíneos após o período de 14 dias da implantação das matrizes

esponjosas. Os resultados obtidos, são consistentes com o pensamento que, ao

fazer uso de matriz esponjosa de poliéster-poliuretano, podemos induzir uma

resposta inflamatória, uma vez que no período estipulado já existem alterações

histomorfológicas suficientes para serem observadas e analisadas.

Os poros da matriz esponjosa implantadas foram ocupados por tecido

fibrovascular novo preenchendo os implantes do grupo salina e daqueles com

diferentes concentrações de extrato hexânico de erva mate. O peso úmido dos

implantes mostrou diferença em relação aos grupos, entretanto, o grupo salina

apresentou um aumento no peso após os 14 dias de implantação o que leva ao

pensamento que os grupos com variadas concentrações de extrato hexânico de erva

mate estavam mais leves. Outro achado importante foi que o grupo com 10% de

extrato hexânico de erva mate apresentou um aumento do peso em relação aos

grupos com 5% e 30% do extrato hexânico de erva mate.

As evidências são consideráveis ao se tratar do processo de angiogênese em

condições fisiológicas e patológicas (CASTRO, 2012; COSTA, 2012). Vários estudos

investigaram a resposta inflamatória do hospedeiro, a reação ao corpo estranho e a

neovascularização de materiais implantados em vários tecidos animais (CASTRO,

2012), porém, estudos comparativos desse processo fazendo o uso do extrato

hexânico de erva mate em diferentes concentrações não foram discutidos ainda na

literatura.

Através de eventos celulares, o processo de angiogênese é controlado pela

interação entre os inibidores e ativadores que formam um equilíbrio apropriado

iniciando e mantendo esse processo. Destacam-se nesse processo as citocinas,

incluindo os fatores de crescimento e as quimiocinas (importantes marcadores

inflamatórios), capazes de regular diretamente o recrutamento e ativação de células

endoteliais (BRITO, 2007). Considerando o uso de extrato hexânico de erva mate

como um estímulo angiogênico, mostrou um efeito no processo de

neovascularização, provocando a migração de células inflamatórias.

Ferrara (2000) e Lima (2012) descreveram que o VEGF é uma citocina

importante, envolvida na angiogênese, no qual é produzida por células endoteliais,

fibroblastos, células musculares lisas e pela maioria das células inflamatórias

(macrófagos, linfócitos, neutrófilos e eosinófilos).

Para verificar a resposta angiogênica da aplicação extrato hexânico de erva

matena matriz esponjosa, outro método foi utilizado, a quantificação do teor de

hemoglobina contida em cada implante. Os resultados mostraram que as matrizes

esponjosas apresentaram um aumento considerável em todos os grupos estudados,

sendo um indicativo para o aumento da neovascularização.

Podemos ressaltar que a vasodilatação ocorre em condições inflamatórias

que resulta em um aumento do fluxo sanguíneo que, por sua vez, leva à formação

de novos vasos (CASTRO, 2012), assim, os resultados evidenciados confirmam um

aumento da quantidade de sangue local realizado pela dosagem de hemoglobina na

matriz esponjosa.

Ao analisar o grupo com concentração de 30% de extrato hexânico de erva

mate, o conteúdo de hemoglobina foi diferenciado quando comparado ao grupo

salina. Em relação ao grupo com concentração de 5% de extrato hexânico de erva

mate o conteúdo de hemoglobina foi significativamente menor quando comparado

ao grupo com 10% de extrato hexânico de erva mate.

Os resultados evidenciaram uma diferença estatística na quantidade de

infiltrados inflamatórios presente nas esponjas com tecido fibrovascular formado.

Entre os grupos salina e os grupos que receberam as diferentes concentrações do

extrato hexânico de erva mate a indicação da ação de células inflamatórias foi

confirmada pela presença do número de células, a qual foi predominante no grupo

com 30% de extrato hexânico de erva mate.

O estudo possibilitou verificar a indução de uma reação inflamatória, através

de um corpo estranho e, consequentemente, verificou-se a presença de um tecido

de granulação composto por novos vasos sanguíneos e o aumento das células

inflamatórias. Portanto, destacamos um bom achado para o estudo da angiogênese

inflamatória (ANDRADE et al.,1987).

A deposição de colágeno está ligada ao reparo do tecido lesionado, estudos

demonstram que as fibras da área cicatricial são chamadas de colágeno tipo I e

colágeno tipo II. (MOURA, 2009). A análise da deposição de colágeno foi avaliada

pelo método histológico do Tricrômico de Masson, evidenciando a presença

aumentada da deposição de colágeno no período de experimento. Esse método

proporciona visualizar e analisar quantitativamente as fibras colágenas do tecido

conjuntivo conferindo a coloração azul a todas (PASINI, et al., 2014).

Diante desses resultados, podemos sugerir que o extrato de erva mate

influenciou em uma série de eventos biológicos, bioquímicos e histológicos, nos

quais o modelo experimental de matriz esponjosa com extrato hexânico de erva

mate induziu à formação de tecido fibrovascular e, consequentemente, levou ao

processo de neovascularização. Durante o trabalho, foi avaliado o efeito do extrato

hexânico de erva mate no processo da angiogênese inflamatória, evidenciando um

efeito positivo no processo de neovascularização.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

O modelo de matriz esponjosa se mostrou eficaz na avaliação do processo de

neovascularização na linhagem de camundongo utilizada, uma vez que induziu a

formação de tecido fibrovascular proliferativo e permitiu a determinação da cinética

da formação de novos vasos.

Neste estudo procurou-se mostrar uma combinação de metodologias para

avaliar a formação de novos vasos induzida por uma matriz esponjosa com extrato

de erva mate em diferentes concentrações.

Os resultados deste estudo evidenciam os efeitos positivos da Ilex

paraguariensis no processo de angiogênese inflamatória induzida por matriz

esponjosa o que permitiu avaliar as presenças de neovascularização e de infiltrados

inflamatórios nos diferentes grupos estudados.

Os achados no teor de hemoglobina e na avaliação histológica confirmam que

o extrato hexânico de erva mate contribuiu para o processo de neovascularização

nos quatros grupos usados no experimento.

Podemos sugerir que a Ilex paraguariensis mostrou um efeito interessante

sobre a angiogênese em concentração de 30% de extrato hexânico de erva mate,

propondo um novo modelo experimental para a avaliação do processo de

neovascularização induzida por matriz esponjosa.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALBAGLI, Sarita. Da biodiversidade à biotecnologia: a nova fronteira da informação. Ci. Inf., Brasília, v. 27, n. 1, p. 7-10, jan./abr. 1998. ALMEIDA, Simone Aparecida de. Avaliação da atividade de peptídeos natriuréticos na angiogênese em modelo de implante de esponja. 2014. 92f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Fisiologia e Farmacologia, da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2014. ANDRADE, S. P., T. P. FAN, et al. Quantitative in-vivo studies on angiogenesis in a rat sponge model. Br J Exp Pathol, v.68, n.6, Dec, p.755-66, 1987. ANDRADE, Fernanda de. Estudo toxicológico e análise da estabilidade térmica do extrato nebulizado de erva mate. 2011. 105f. Dissertação (Mestrado Farmácia) – Programa de Pós Graduação em Farmácia, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). Florianópolis, 2011. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Gerência Geral de Alimentos Gerência de Produtos Especiais. Esclarecimentos sobre as avaliações de segurança realizadas de produtos contendo Morinda citrifolia, também conhecida como noni. Informe Técnico. n. 25, de maio de 2007. ARAÚJO, Tatiana O.P. et al. Benefícios da cafeína sobre os níveis séricos de colesterol e triglicerídeos. Revista Uniara, v.14, n.1, julho 2011. ARCARI, D.P., et al. The in vitro and in vivo effects of yerba mate (Ilex paraguariensis) extract on adipogenesis. Food Chemistry, 141 809–815, 2013. ARRAIS, Luciana Gomes. Estudo fitoquímico e avaliação da atividade antimicrobiana e farmacológica de Croton pulegioides Baill. (Euphorbiaceae). 2012. 109 f. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Pós-graduação em Biotecnologia industrial, 2012. ARROYO, A.G.; IRUELA-ARISPE, M.L. Extracellular matrix, inflammation, and angiogenic response. Cardiovasc Res, 86 (2), 236-35, 2010. BARG, Marlon. Avaliação do efeito protetor do extrato de Ilex paraguariensis sobre a prevenção do dano oxidativo causado por radiação ultravioleta. 2010. 59f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Programa de Pós-Graduação

em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). Criciúma/SC, 2010. BARLETTE, Adriana Gregory. Avaliação química e biológica do extrato hidroetanólico de erva mate (Ilex paraguariensis A. St. Hil.). 2011. 33f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Porto Alegre, 2011. BASTOS, I.V.G.A. et al. Estudo fitoquímico preliminar e avaliação da toxicidade aguda do extrato etanólico bruto de Caesalpinia echinata Lam.Rev. Bras. Farm. 92(3): 219-222, 2011. BERTÉ, Kleber Alves dos Santos. Tecnologia da erva-mate solúvel. 2011. 160f.

Tese (Doutorado em Tecnologia de Alimentos) – Programa de Pós-graduação em

Tecnologia de Alimentos Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia.

Curitiba, 2011.

BORBA, Fernanda Katharine de Souza Lins. Estudo da atividade dos sulfatos de condroitina e glucosamina na formação de vasos sanguíneos em modelos in vitro e in vivo. 2012. 186f. Tese (Doutorado em Biociência Animal) – Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRP). Programa de Pós- Graduação em Biociência Animal. Recife, 2012. BRACESCO, Nelson. et al. Antioxidant activity of a botanical extract preparation of Ilex paraguariensis, prevention of DNA double-strand breaksin Saccharomyces Cerevisiae and human low-density lipoprotein oxidation. Journal of Alternative and Complementary Medicine. v. 9:378-387, 2003. BRAUNER, Maria Claudia Crespo. Ciência, biotecnologia e normatividade. Cienc. Cult., São Paulo, v. 57, n. 1, Mar. 2005. BRITO, Rodrigo Guabiraba. Papel dos receptores canabinóides em um modelo experimental de angiogênese inflamatória. 2007. 142f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Belo Horizonte, 2007. CAPP, Clarissa et al. Papel do fator de crescimento endotelial vascular nos carcinomas de tireóide.Revista HCPA 2009; 29(1):51-59. CARMO, Claudia Barbosa do. Erva mate: potencialidades e inovação tecnológica do processo produtivo em área de fronteira do estado de Mato Grosso do Sul. 2007. 129f. Dissertação (Mestrado Acadêmico) – Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento Local, Universidade Católica Dom Bosco (UCDB). Campo Grande/MS, 2007. CASTALDELLI, Ana Paula Almeida; et al. Efeito da erva mate (Ilex paraguariensis A. St. -Hil.) no comportamento e fisiologia de ratos Wistar. R. bras. Bioci., Porto Alegre, v. 9, n. 4, p. 514-519, out./dez. 2011.

CASTRO, Pollyana Ribeiro. Cinética da angiogênese inflamatória induzida por implante De esponja na musculatura abdominal em camundongos. 2012. 96f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia). Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas – Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Belo Horizonte/MG, 2012. CANTERLE, Liana Pedrolo. Erva mate e atividade antioxidante. 2005, 100f. Dissertação (Mestrado em Ciências e Tecnologia dos Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologia dos Alimentos, Centro de Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2005. CHORILLI, Marlus, et al.Efeito de Emulsão Contendo Extrato Seco de Guaraná sobre os Vasos Sanguíneos da Derme Papilar de Ratos.Saúde Rev., Piracicaba, 6(14): 07-12, 2004. COLPO, Ana Zilda Ceolin.Perfilfitoquímico e capacidade antioxidante de extratos de erva-mate (Ilex paraguariensis A. St. Hil.) 2012. 102f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) – Pós-Graduação em Bioquímica, Universidade Federal do Pampa (UNIPAMPA) – Uruguaiana/RS, 2012. CORDEIRO, Y.G. Relatório de estágio curricular obrigatório voltado à oncologia experimental e comparada: pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos com ênfase nos efeitos da fitoterapia sobre a célula cancerosa. 2011. 52 f. TCC (Trabalho de Conclusão de Curso). Universidade Federal do Paraná, 2011. CORREA, G. et al. Carbona 4: Desenvolvimento de uma progênie biclonal de erva-mate em Machadinho, RS. Colombo, Paraná: Embrapa Florestas, 2011 (Série Documentos). COSTA, Suzane Mota Marques. Influência do background genético na angiogênese inflamatória em camundongos hétero- e isogênicos. 2012. 93f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2012.

CUNHA, Fernanda Monte de. Efeito de extratos de erva mate (Ilex paraguariensis A. St. Hil) sobre linhagem celular humana de tumor de bexiga T24. 2011. 38f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Nutrição) – Faculdade de Nutrição, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Porto Alegre, 2011. CRESPO, Isabel Merlo. Um estudo sobre o comportamento de busca e uso de informação de pesquisadores das áreas de biologia molecular e biotecnologia: impactos dos periódicos científicos eletrônicos. 2005. 120f. Dissertação (Mestrado em Comunicação) – Programa de Pós-Graduação em Comunicação e Informação, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Porto Alegre, 2005.

DANIEL, Omar. Erva-mate: sistema de produção e processamento industrial. Dourados/MS: UFGD, 2009. DIAS, Rodrigo YukiShiroma. Caracterização dos efeitos do Amblyomin-X sobre a angiogênese e a célula endotelial. 2010. 86 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas). Programa de Pós-Graduação em Toxicologia e Análise Toxicológica, Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, 2010. DUKAN, P. Dicionário de dietética e de nutrição. Petrópolis/RJ: Vozes, 2005. DUTRA, Fabiana Lemos Goularte. Compostos fenólicos e metilxantinas em erva-mate armazenada em sistemas de estacionamento natural e acelerado. 2009. 73 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) – Programa de Pós - Graduação em Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Paraná, 2009. EFING, L.M.A.C. Compostos bioativo do material resinoso, subproduto do processamento da erva-mate (Ilex paraguariensis A.St.-Hil.). 2008. 110f. Tese (Doutorado em Tecnologia de Alimentos) – Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Paraná. Curitiba, 2008. EFING, L.C.; et al. Caracterização química e capacidade antioxidante da erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) Boletim Ceppa, Curitiba. v.27, n. 2, p. 241-246, 2009. ESMELINDRO, Maria Carolina, et al. Caracterização físico-quimica da erva mate: influencia das etapas do processamento industrial. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 22(2): 193-204, maio-ago. 2002. FELIPE, Maria Sueli Soares. Desenvolvimento tecnológico e inovação no Brasil: desafios da área biotecnológica. In: Novos estudos – CEBRAP. n. 78. São Paulo: Julho, 2007. FERNANDES, E. S., et al. Yerba mate (Ilex paraguariensis) enhances the gene modulation and activity of paraoxonase-2: In vitro and in vivo studies. Nutrition, 28, 1157– 1164, 2012. FERRARA, N. Vascular endothelial growth factor and the regulation of angiogenesis. Prog Horm Res, 55:15-35, 2000. FERREIRA, Mônica Alves Neves Diniz. Avaliação da angiogênese, inflamação e crescimento tumoral em camundongos com deleção gênica dos receptores para o PAF (PAFR-KO). 2006. 162f. Tese (Doutorado em Fisiologia) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Belo Horizonte, 2006. FILIP, R; FERRARO, G.R. Researching on new species of “Mate”. Ilex brevicuspis. European Journal of Nutrition.42:50-54, 2003.

FILIP, R.; DAVICINO, R.; ANESINI, C. Antifungal Activity of the Aqueous Extract of Ilex paraguariensis Against Malassezia furfur. Phytotherapy research. v. 24: 715-719, 2010. FOLKMAN, J; HAUDENSCHILD, C. Angiogenesis in vitro. Nature. Dec 11; 288(5791): 551-6, 1980. FOLKMAN, J; KLAGSBRUN, M. Vascular physiology. A family of angiogenic peptides. Nature. Oct 22-28;329(6141):671-2, 1987. FRIZON, Cátia Nara Tobaldini. Propriedades físico-químicas, sensoriais e estabilidade de uma nova bebida contendo extrato de erva-mate (llex paraguariensis St. Hil.) e soja (gliycinemax). 2011. 79f. Dissertação (Mestrado Tecnologia de Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Paraná (UFPR). Curitiba, 2011. GIRARDI, Jonathan dos Santos. Avaliação da influência das condições de cultivo sobre os teores de compostos de interesse presente nos extratos de erva mate (Ilex paraguariensis) obtidos por CO2 a altas pressões. 2010. 95f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) – Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, 2010. GOMES, Luana Ferreira. Efeito da erva mate (Ilex Paraguariensis) sobre o metabolismo de ratos tratados com dieta hiperlipídica. 2012. 74f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Porto Alegre, 2012. HECK, C.I.; MEJIA, E.G. Yerba Mate Tea (Ilex paraguariensis): A Comprehensive Review on Chemistry, Health Implications, and Technological Considerations. Journal of food science. v: 72:138-151, 2007. HEINRISCH, Reges; MALAVOLTA, Eurípedes. Composição mineral do produto comercial da erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.). Ciência Rural, Santa Maria, v.31, n.5, p.781-785, 2001. JACOB, Patricia Silva. Efeito da erva-mate (Ilex paraguariensis) sobre a resposta inflamatória e via da sinalização da insulina no fígado de ratos. 2012. 161f. Dissertação (Mestrado em Saúde Pública) – Programa de Pós-Graduação em Nutrição em Saúde Pública, Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Saúde Pública. São Paulo, 2012. JOTZ, Geraldo Pereira et al. Estudo experimental da erva mate (Ilex paraguariensis) como agente etiológico de neoplasia do trato aéro-digestivo. Arq. Int. Otorrinolaringol. / Intl. Arch. Otorhinolaryngol., São Paulo, v.10, n.4, p. 306-311, 2006. LEAL, Ana Paula Ferreira. Avaliação das propriedades farmacológicas dos extratos brutos de duas variedades da Capsicum chinense jacq. 2012. 52f.

Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Universidade Dom Bosco (UCDB), Campo Grande, 2012. LIMA, Maria Eduarda de. Caenorhabditis elegans: um modelo experimental para a análise dos efeitos agudos de extratos de erva-mate (Ilex paraguariensis) e uma ferramenta para a potencialização do Ensino de Ciências na Escola Básica. 2013. 91f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) – Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Universidade Federal do Pampa, UNIPAMPA, Uruguaiana, 2013. LUNCEFORD N; GUGLIUCCI A. Ilex paraguariensis extracts inhibit AGE formation more efficiently than green tea. Fitoerapia. 719-427. 2005. MACCARI JUNIOR, Agenor. Análise do pré-processamento da erva-mate para Chimarrão. 2005. 199f. Tese (Doutorado em Engenharia Agrícola). Faculdade de Engenharia Agrícola. Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2005. MALAJOVICH, M.A. Biotecnologia 2011. Rio de Janeiro, Edições da Biblioteca Max Feffer do Instituto de Tecnologia ORT, 2012. MATOS, Lohana Picolo Carreira de. Compostos fitoquímicos e atividade antioxidante de casca de café. 2014. 31f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Tecnologia em Alimentos) – Departamento de Alimentos, Universidade Tecnológica Federal do Paraná, campo Mourão, 2014. MATSUMOTO, R.L. et al. Effects of mate tea (Ilex paraguariensis) ingestion on mRNA expression of antioxidant enzymes ,lipid peroxidation, and total antioxidants status in healthy young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v:57: 1775–1780, 2009. MAZUCHOWSKI, J. Z. Manual da erva-mate. Curitiba: Empresa Paranaense de Assistência Técnica e Extensão Rural – EMATTER/PR, 1989. 104p. MAYOR, Federico. As biotecnologias no início dos anos noventa: êxitos, perspectivas e desafios. Estud. av. São Paulo, v. 6, n. 16, Dec. 1992 . MIRANDA, D. D., et al. Protective effects of mate tea (Ilex paraguariensis) on H2O2- induced DNA damage and DNA repair in mice. Mutagenesis, 23(4), 261–265, 2008. MOLINARO, Etelcia Moraes. Conceitos e métodos para formação de profissionais

em laboratórios de saúde: volume 2. / Organização de Etelcia Moraes Molinaro,

Luzia Fátima Gonçalves Caputo e Maria Regina Reis Amendoeira. Rio de Janeiro:

EPSJV; IOC, 2010; capítulo 3:89-188.

MORAES, Lígia Tereza de. Prospecção de substâncias ativas de Serjania recta Raldk como estimulantes da memória. 2008. 70f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP). Ribeirão Preto, 2008. MORAIS, Verlândia Medeiros de. Etnobotânica nos quintais da comunidade de abderramant em Caraúbas – RN. 2011. 112f. Tese (Doutorado em Agronomia) –

Programa de Pós-Graduação em Fitotecnia, Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA). Mossoró, 2011. MOURA, Sandra Aparecida Lima de. Estudo dos efeitos do extrato de própolis em um modelo murino de angiogênese inflamatória. 2009. 100 f.Tese (Doutorado em Patologia) – Programa de Pós-graduação em Patologia da Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, 2009. NASCIMENTO, Adão Aparecido. Elaboração de bebida fermentada de erva mate (Ilex Paraguariensis). 2013. 46f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação Tecnologia em Alimentos) – Cursos de Tecnologia e Engenharia de Alimentos, Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR). Campo Mourão, 2013. NORA, Cleice Dalla. Erva-Mate. 2009. 47f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Química de Alimentos) – Departamento de Ciências dos Alimentos, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2008. NOWACKI, Luciana Cristina. Avaliação das propriedades farmacológicas e tóxicas dos extratos fracionados da erva mate (Ilex paraguariensis) tostada e solúvel. In: XIV Seminário de Pesquisa e IX Seminário de Iniciação Científica, 3 a 5 de novembro Curitiba/PR, 2010. OLIVEIRA, Michelle de Paula Abreu de. Expressão de genes da biossíntese de cafeína em frutos e endospermas de coffea arabica: sem cafeína. 2007. 75 f. Dissertação (Mestrado em Agricultura Tropical e Subtropical). Instituto Agronômico. Curso de Pós-graduação em Agricultura Tropical e Subtropical, Campinas, 2007. PAES, M.C.; BAPTISTA, T.A.Biotecnologia no Rio de Janeiro: análise de cenário com foco em recursos humanos.Cadernos do Desenvolvimento Fluminense, Rio de Janeiro, n. 4, mai. 2014. PAGLIOSA, Cristiane Manfé. Caracterização Química dos Resíduos dos Ervais e Folhas in natura de Erva-Mate (Ilex paraguariensis St. Hil.). 2009. 145f. Dissertação (Mestrado em Ciência dos Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos do Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis SC, 2009. PASINI, M.M., et al. Análise histoquímica de fibras colágenas: Tricrômico de Masson e Picrosirius Red. In: 4º amostra de banners do Centro de Ciências da Saúde, 26 a 28 de Novembro de 2014 Santa Maria/RS. Anais....Santa Maria: UFSM, 2014, n150. PEDROSO, Gabriela Lima et al. Efeito do extrato aquoso de Ilex paraguariensis sobre o metabolismo de ratos machos. Rev HCPA 2010;30(3). PEREIRA FILHO, R.N. Efeito da administração oral de própolis verde sobre carcinogênese dérmica induzida por 9,10 dimetil 1,2 benzantraceno (DMBA). 2013. 88f. Dissertação (Mestrado Saúde e Ambiente). UniversidadeTiradentes, 2013. PUANGPRAPHANT, S., MEJIA E. G. Saponins in Yerba Mate Tea (Ilex paraguariensis A. St.-Hil) and Quercetin Synergistically Inhibit iNOS and COX-2 in

lipopolysaccharide-induced macrophages through NF kappaB pathways. Journal of Agricultural and Food Chemistry. v: 57: 8873–8883, 2009. PUANGPRAPHANT, S., et al. Dicaffeoylquinic acids in Yerba mate (Ilex paraguariensis St. Hilaire) inhibit NF-kappaB nucleus translocation in macrophages and induce apoptosis by activating caspases-8 and -3 in human colon cancer cells. Molecular Nutrition and Food Research, 5 (10), 1509–1522, 2011. RIL, FrancieleTaís et al. Nota Científica: Perfil bioquímico de ratos alimentados com iogurte contendo extrato de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil). Braz. J. Food Technol., Campinas, v. 14, n. 4, p. 332-337, out./dez. 2011. RIVELI, D.R. Biodisponibilidade, distribuição tecidual e atividade antioxidante

do extrato hidroetanólico de Ilex paraguariensis hidrolisado e não hidrolisado.

2010. 68f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências

Farmacêutica, Universidade de São Paulo, 2010.

SANTOS, Kleber Alves. Estabilidade da erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hill.)

em embalagens plásticas. 2004. 109f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de

Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos,

Universidade Federal do Paraná - Curitiba, 2004.

SANTOS, Evelyn Cristina da Silva. Investigação da atividade neurofarmacológica

de Ilex paraguariensis em camundongos. 2011. 107f. Dissertação (Mestrado em

Farmacologia) - Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Universidade

Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Florianópolis, 2011.

SILVA, Francilene Amaral da.Avaliação tecnológica e atividade antioxidante de produtos secos por spray-drying de Ilex paraguariensis A. St. Hil. – Aquifoliaceae (erva-mate). 2007. 243f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS). Porto Alegre, 2007. SILVA, Alexandre Roberto. Efeito de extratos vegetais com potencial antioxidante em fibroblastos submetidos à radiação UV. 2009. 102f. Dissertação (Mestrado Ciências Farmacêuticas) – Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Paraná (UFPR). Curitiba, 2009. SILVA, Francisca Hildemagna Guedes da. Avaliação da angiogênese inflamatória em camundongos induzida por antígenos da cepa Y do Trypanosoma cruzi. 2012. 61f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Ouro Preto, 2012. SOUZA, Marina Figueiredo Ferreira de. Chá mate (Ilex paraguariensis): compostos bioativos e relação com a atividade biológica. 2009. 147f. Dissertação (Mestrado em Nutrição em Saúde Pública). Programa de Pós-

Graduação em Nutrição, Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Saúde Pública São Paulo, 2009. SOTO-VACA, A.; GUTIERREZ, A.; LOSSO, J.N.; XU, Z.; FINLEY, J.W. Evolution of phenolic compounds from color and flavor problems to health benefits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 60, p. 6658−6677, 2012. SCHUBERT, Alexandre etal.Variação anual de metilxantinas totais em amostras de Ilex paraguariensis A. St. - Hil. (erva-mate) em Ijuí e Santa Maria, estado do Rio Grande do Sul. Quim. Nova, Vol. 29, No. 6, 1233-1236, 2006. STORCK, Lindolfo et al. Precisão experimental em erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) Ciência Florestal, Santa Maria, v. 12, n. 1, p. 159-161, 2012. SUFFREDINI, I.B et al. Screening of antibacterial extracts from plants native to the Brazilian Amazon Rain Forest and Atlantic Forest. Brazilian Journal of Medical and Biological. Research, 37, 379-84, 2004. VALDUGA, Eunice et al. Caracterização química da folha de ilex paraguariensis st.hil. (erva-mate) e de outras espécies utilizadas na adulteração do mate. B.CEPPA, Curitiba, v. 15, n. 1, p. 25-36, jan./jun.1997. VIEIRA, Alno Poiares, et al. Ação dos flavonóides na cicatrização por segunda intenção em feridas limpas induzidas cirurgicamente em ratos Wistar.Semina: Ciências Biológicas e da Saúde, Londrina, v. 29, n. 1, p. 65-74, jan./jun. 2008. VIEIRA, M.A. et al. Phenolic acids and methylxanthines composition and antioxidant properties of mate (Ilex paraguariensis) Residue. Journal of food science. v: 75: 283- 285, 2010. YAMADA, Mônica. Efeito da ingestão do extrato aquoso de erva-mate (Ilex paraguariensis) sobre a resposta inflamatória no tecido adiposo branco de ratos alimentados com ração hiperlipídica. 2013. 64f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Saúde Pública. São Paulo, 2013. WENDT, Simone Ballão Taques. Comparação da eficácia da calêndula e do óleo de girassol na cicatrização por segunda intenção de feridas em pequenos animais. 2005. 85f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) – Pós- Graduação em Ciências Veterinárias, Setor de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Paraná. Curitiba, 2005. ZAMPIER, Ana Cláudia. Avaliação dos níveis de nutrientes, cafeína e taninos após adubação mineral e orgânica, e sua relação com a produtividade na erva-mate (Ilex paraguariensis St Hil.). 2001. 104 f. Dissertação (Mestrado) – Pós-

Graduação em Engenharia Florestal, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2001.

ZART, Ronald Paulo Pinto. Identificação da expressão do vascualar endothelial growth factor (VEGF) pela contagem de células marcadas imunoisquimicamente no omento de ratos após ligadura arterial e após

ligadura venosa. 2007. 84 f. Dissertação (Mestrado em Cirurgia). Faculdade de Medicina. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2007. ZHANG, K.; LU J.; MORI T.; et al. Baicalin increases VEGF expression and angiogenesis by activation the ERRα/PGC-1αpathway.Cardiovasc.res, v.89, p.426-435, 2011.

universidade católica dom bosco programa de pós-graduação

Documents