UFRRJ INSTITUTO DE TECNOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

TESE

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPASE DE Aspergillus niger OBTIDA POR FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO UTILIZANDO

RESÍDUOS DA AGROINDÚSTRIA

Lívia Nolasco Macedo Muruci

2012

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE TECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA

DE ALIMENTOS

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPASE DE Aspergillus niger OBTIDA POR FERMENTAÇÃO NO ESTADO SÓLIDO UTILIZANDO

RESÍDUOS DA AGROINDÚSTRIA

LÍVIA NOLASCO MACEDO MURUCI

Sob a orientação da professora DSc. Mônica Caramez Triches Damaso

Co-orientação da Professora

DSc. Sonia Couri

Seropédica, RJ Dezembro de 2012

Tese submetida como requisito parcial para obtenção de Grau de Doutor em Ciências, no Programa de Pós - Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, área de concentração Ciência de Alimentos.

UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos

572.7 M984p T

Muruci, Lívia Nolasco Macedo, 1982- Produção e caracterização de lipase de Aspergillus niger obtida por fermentação no estado sólido utilizando resíduos da agroindústria / Lívia Nolasco Macedo Muruci – 2012. 107 f.: il. Orientador: Mônica Caramez Triches Damaso. Tese (doutorado) – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Bibliografia: f. 70-86. 1. Enzimas de fungos - Teses. 2. Enzimas – Aplicações industriais – Teses. 3. Lipase - Biotecnologia – Teses. 4. Fermentação – Teses. 5. Resíduos agrícolas – Teses. 6. Tecnologia de alimentos – Teses. I. Damaso, Mônica Caramez Triches, 1973-. II. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Curso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos. III. Título.

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE TECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

LÍVIA NOLASCO MACEDO MURUCI

Tese submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências, no Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, área de concentração em Ciência de Alimentos.

Ao meu marido, aos meus pais e irmãs, por todo o amor dedicado, incentivo constante, força e amizade!

Amo muito todos vocês! Dedico

AGRADECIMENTOS À Deus, por todas as bênçãos concedidas, por sempre iluminar meu caminho e me dar forças para alcançar meus objetivos.

Ao meu amado marido Rodrigo, pelo amor, cumplicidade, companheirismo e por acreditar em mim sempre.

Aos meus preciosos pais Ana Maria e Gilson, que nunca mediram esforços para nos proporcionar tudo de melhor. Obrigada por todo investimento na minha educação, pelo incentivo e principalmente pelo amor incondicional.

Às minhas amadas e maravilhosas irmãs que tanto amo, Laís e Luciana pela grande amizade, pela torcida, pela confiança, pelo apoio, carinho e grande amor que dedicamos umas às outras.

À minha orientadora Dra. Mônica Damaso, pelo exemplo de profissionalismo, atenção e por todos os ensinamentos compartilhados ao longo desses quatro anos.

À Dra. Sonia Couri, pela excelente co-orientação ao longo de todo o trabalho.

Aos pesquisadores do Laboratório de Processos Fermentativos da Embrapa Agroindústria de Alimentos Dr. Edmar Penha, Dra. Leda Gottschalk e Dra. Janine Passos, por toda ajuda e colaboração ao longo de toda a pesquisa.

Aos professores Dra. Lucielen dos Santos pela grande contribuição nas análises estatísticas, ao professor Dr. Marcelo Fraga pela colaboração na identificação da cultura fúngica e a Dra. Rosemar Antoniassi pela colaboração na realização das análises cromatográficas.

Aos colegas de mestrado e doutorado do Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologia de Alimentos – UFRRJ em especial: Regiane Ribeiro e Juan Ruano, pela grande contribuição nas análises estatísticas, pela parceria, amizade e troca de experiências. Às estagiárias do Laboratório de Processos Fermentativos da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Maíra Oliveira e Ludmila Araújo, pela amizade conquistada ao longo dos meses e, sobretudo pela indispensável ajuda nos experimentos.

Às técnicas do Laboratório de Processos Fermentativos da Embrapa Agroindústria de Alimentos Érika Fraga, pela amizade e grande auxílio nos experimentos e pelos bons momentos de descontração e Selma Terzi, pelo apoio técnico. Aos funcionários e estagiários da Embrapa Agroindústria de Alimentos, meus sinceros agradecimentos pela colaboração e gentileza de emprestar os equipamentos. Às Indústrias Bunge Alimentos S/A e Granfino S/A pela gentileza de ceder amostras necessárias e indispensáveis à realização desse trabalho.

A todos os Professores do Departamento de Tecnologia de Alimentos da UFRRJ por todo o conhecimento e experiência compartilhados ao longo dos anos.

A todos os amigos que de alguma maneira contribuíram para a realização deste trabalho o meu muito obrigado!!!

RESUMO MURUCI, Lívia Nolasco Macedo. Produção e caracterização de lipase de Aspergillus niger obtida por fermentação no estado sólido utilizando resíduos da agroindústria. 2012. 95p. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos). Instituto de Tecnologia, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal Rural do Rio de janeiro, Seropédica, RJ, 2012.

As lipases constituem um importante grupo de enzimas, principalmente por apresentarem grande versatilidade de aplicações. São enzimas que além de catalisar a hidrólise de óleos e gorduras, catalisam reações inversas, como esterificação, transesterificação e interesterificação. A produção de lipases por fermentação no estado sólido (FES) tem recebido grande atenção, principalmente pela possibilidade de utilizar resíduos agroindustriais. O objetivo deste trabalho foi produzir, concentrar e caracterizar lipase de Aspergillus niger obtida por (FES), utilizando borras alcalinas e farelo de trigo. A produção da enzima foi conduzida em colunas aeradas a 32°C, por 48 horas. Primeiramente, para selecionar as variáveis que influenciavam de forma significativa a produção de lipases foi conduzido um planejamento experimental de Plackett & Burman. Foram avaliadas quatro variáveis de processo: concentração de inóculo e de indutor (borra de milho e óleo de oliva), volume de solução de sulfato de amônio e aeração. Com base nos resultados obtidos, foi realizado o delineamento fatorial completo 22 que visou melhorar a produção da enzima. Neste caso, foram estudadas duas variáveis independentes: aeração em vvm (0; 0,5; 1) e concentração de borra de milho em % p/p (0; 0,5; 1). Resultados obtidos revelaram que a maior atividade lipásica (215 U/gms) e específica (11392 U/g de proteína) foram obtidas no ensaio 4 (1,0% de borra de milho, 1,0 vvm de aeração, 60 mL de solução de sulfato de amônio e 106 esporos/g de meio). Em seguida, a produção da enzima ocorreu em condições selecionadas como ótimas, testando-se outras duas borras: girassol e canola, além da borra de milho e na ausência de indutor. Verificou-se que a maior atividade lipásica (254 U/gms) foi obtida sem o uso de borra. Portanto, a presença das borras é dispensável para a produção de lipase de A. niger, nas condições estudadas. Um estudo cinético demonstrou que a produção de lipase ocorreu associada ao crescimento fúngico, e a maior produtividade (4 U/gms.h) ocorreu em 48 horas de fermentação, na ausência de borra. Em seguida, foi realizada a concentração enzimática por precipitação com sulfato de amônio em quatro condições de saturação (40, 60, 80 e 90%), e foram observados melhores resultados com 90% de saturação. O extrato enzimático também foi concentrado por liofilização. A caracterização parcial da enzima foi realizada com amostras concentradas. A lipase apresentou atividade ótima a pH entre 3,0 e 5,6 e a temperaturas de 30 a 55°C. Apresentou perfil de termoestabilidade semelhante para as temperaturas de 30, 40 e 50oC, retendo cerca de 42% de sua atividade por até 30 horas de incubação. Embora o perfil de estabilidade ao pH também tenha sido semelhante para os valores testados, após 30 horas de incubação, as maiores atividades lipásicas residuais foram observadas em pH ácido: pH 3,0 (59%), pH 4,0 (55%) e pH 5,0 (62%). A enzima manteve 100% da atividade em 150 dias estocada a -18°C. A avaliação da especificidade sob diferentes óleos vegetais demonstrou maior atividade hidrolítica sob o óleo de coco (201 U/mL). Portanto, sugere-se que a enzima possua afinidade por ácidos graxos de cadeia média.

Palavras-chave: enzima, fungos filamentosos, planejamento experimental, borras alcalinas.

ABSTRACT

MURUCI, Lívia Nolasco Macedo. Production and characterization of Aspergillus niger lipase obtained by solid state fermentation using agroindustrial residues. 2012. 95p. Thesis (DSc. in Food Science and Technology). Institute of Technology, Department of Food Technology, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2012. Lipases are an important group of enzymes, mainly because of the great versatility of applications. They are enzymes that, besides catalyzing the hydrolysis of oils and fats, catalyze reverse reactions, such as esterification, transesterification and interesterification. The lipase production by solid state fermentation (SSF) has received great attention, mainly by the possibility of using agroindustrial coproducts. The aim of this work was to produce, concentrate and characterize lipase of Aspergillus niger obtained by (SSF), using alkaline soapstocks and wheat bran. The enzyme production was performed in aerated columns at 32°C for 48 hours. First, in order to select the variables that significantly influenced the production of lipases, an experimental Plackett & Burman planning was conducted. Four process variables were evaluated: inoculum and inducer concentration (corn soapstock and olive oil), volume of solution of ammonium sulfate and aeration. Based on the results obtained, a full factorial design that aimed to improve the production of the enzyme was performed. In this case, two independent variables were studied: aeration, in vvm (0, 0.5, 1) and concentration of corn soapstock % w/w (0, 0.5, 1). Results obtained showed that the highest lipase activity (215 U/gds) and specific activity (11392.1 U/g protein) were obtained in test 4 (1.0% corn soapstock, 1.0 vvm aeration, 60 mL of solution of ammonium sulfate and 106 spores/g medium. Then, the enzyme production ocurred in conditions selected as optimal and other two samples of soapstock were tested: sunflower and canola, besides corn soapstock and in the absence of inducer. It was found that the highest lipase activity (254.4 U/gds) was obtained without the use of soapstock. Therefore, its presence is dispensable for the production of lipase A. niger under the conditions studied. A kinetic study showed that the lipase production occurred associated with fungal growth and an increased productivity (4 U/gds.h) occurred in 48 hours of fermentation in the absence of soapstock. Then, the enzyme concentration was performed by precipitation with ammonium sulfate in four saturation conditions (40, 60, 80 and 90%), and it was observed that best results were obtained with 90% saturation. The enzyme extract was also concentrated by lyophilization. Partial characterization of the enzyme was carried out with concentrated samples. The lipase showed optimum activity at pH between 3.0 and 5.6 and temperatures of 30 to 55°C. It presented thermostability profile similar to the temperatures of 30, 40 and 50°C, retaining about 42% of its activity for up to 30 hours of incubation. While the pH stability profile was also similar to the values tested after 30 h of incubation, the higher residual lipase activities were observed at acidic pH: pH 3.0 (59%), pH 4.0 (55%) and pH 5.0 (62%). The enzyme retained 100% of activity in 150 days stored at -18° C. The evaluation of the specificity in different vegetable oils showed higher hydrolytic activity in coconut oil (201 U/mL). Therefore, it is suggested that the enzyme has an affinity for the medium chain fatty acids. Keywords: enzyme, filamentous fungi, experimental design, alkaline soapstocks.

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Classificação das enzimas de acordo com a IUB 5

Tabela 2. Enzimas de diferentes espécies microbianas produzidas por fermentação no estado sólido

6

Tabela 3. Principais lipases comerciais produzidas por diferentes empresas 9

Tabela 4. Principais aplicações das lipases no setor alimentício 13

Tabela 5. Estudos da produção de lipase em FES utilizando resíduos agroindustriais e diferentes microrganismos

20

Tabela 6. Matérias-primas empregadas para a produção de lipase de Aspergillus niger por fermentação no estado sólido (FES)

28

Tabela 7. Composição do meio de ativação do microrganismo 29

Tabela 8. Resultados das análises físico-químicas realizadas nas borras 30

Tabela 9. Níveis e variáveis estudadas no planejamento de Plackett & Burman para a seleção de variáveis que influenciam na produção de lipase

32

Tabela 10. Matriz gerada para o planejamento experimental de Plackett & Burman para a produção de lipase com seus níveis codificados e valores reais (entre parênteses)

32

Tabela 11. Níveis e variáveis estudadas no planejamento fatorial completo 22 para o melhoramento das condições de produção de lipase

33

Tabela 12. Matriz gerada para o delineamento fatorial completo 22 com seus níveis codificados e valores reais (entre parênteses)

33

Tabela 13. Níveis e variáveis estudadas no delineamento composto central rotacional (DCCR 22) para avaliação da temperatura e pH ótimos da lipase de A. niger

38

Tabela 14. Matriz do delineamento composto central rotacional 22 com seus níveis codificados e reais para avaliação da temperatura e pH ótimos da lipase de A. niger

38

Tabela 15. Matriz do planejamento experimental de Plackett & Burman com seus níveis codificados e reais e com as respostas de atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína) para os indutores óleo de oliva e borra de milho, após 48h de fermentação

42

Tabela 16. Estimativa dos efeitos de atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína) utilizando borra de milho como fonte indutora para a produção de lipase de A. niger por FES

44

Tabela 17. Estimativa dos efeitos de atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína) utilizando óleo de oliva como fonte indutora para a produção de lipase de A. niger por FES

45

Tabela 18. Matriz para o delineamento fatorial completo 22 com seus níveis codificados e reais e com as respostas de atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína) para o indutor borra de milho, após 48h de fermentação

46

Tabela 19. Coeficiente de regressão e desvio padrão do primeiro planejamento fatorial completo (22), para a atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína)

47

Tabela 20. Análise de variância do primeiro delineamento fatorial completo 22 para atividade lipásica de A. niger

47

Tabela 21. Atividade lipásica (U/mL) dos ensaios do primeiro fatorial completo 49

Tabela 22. Matriz para o segundo delineamento fatorial completo 22 com seus níveis codificados e reais e com as respostas de atividade lipásica U/gms e específica aparente U/g de proteína para o indutor borra de milho, após 48h de fermentação

50

Tabela 23. Médias da produção de lipase em 48 h utilizando as diferentes borras de refino de óleo e os resultados do Teste de Tukey

51

Tabela 24. Avaliação da recuperação enzimática e do fator de purificação obtidos para a técnica de concentração por precipitação com sulfato de amônio a 40, 60, 80 e 90% de saturação e pela técnica de liofilização

56

Tabela 25. Matriz do delineamento composto central rotacional 22 com seus níveis codificados e reais da avaliação da temperatura e pH ótimos na atividade lipásica de A. niger

58

Tabela 26. Coeficientes de regressão e desvios padrão do planejamento fatorial composto central rotacional 22 da avaliação da temperatura e pH ótimos na atividade lipásica (U/mL) de A. niger

59

Tabela 27. Análise de variância da temperatura e pH ótimos na atividade lipásica de A. niger

59

Tabela 28. Perfil em ácidos graxos dos óleos de oliva, girassol e coco 64

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Principais reações catalisadas por lipases 11

Figura 2. Estrutura microscópica de A. niger 24

Figura 3. Fluxograma das etapas realizadas ao longo do trabalho 27

Figura 4. Borra de girassol (A), borra de canola (B), borra de milho (C) 29

Figura 5. Aparato instrumental para a fermentação de lipase conduzida em colunas aeradas. Rotâmetros (A), banho termostatizado (B), colunas contendo meio de cultivo já fermentado (C)

31

Figura 6. Meio reacional (A), reação de hidrólise em banho Maria a 35°C com agitação (B)

35

Figura 7. Curva de contorno para atividade lipásica U/gms 48

Figura 8. Perfil cinético da produção de lipase de A. niger em FES na ausência de borra.

54

Figura 9. Perfil cinético da produção de lipase de A. niger em FES na presença de 1% de borra de canola

55

Figura 10. Perfil cinético da produção de protease no extrato enzimático em FES na presença de 1% de borra de canola e sem indutor

55

Figura 11. Atividade lipásica (U/mL) dos sobrenadantes e do precipitado para as condições de 40, 60, 80 e 90% de saturação

57

Figura 12. Atividade específica U/g de proteína dos sobrenadantes e do precipitado para as condições de 40, 60, 80 e 90% de saturação

57

Figura 13. Curva de contorno para a atividade lipásica de A. niger em função das variáveis temperatura e pH.

59

Figura 14. Termoestabilidade da lipase de A. niger 61

Figura 15. Estabilidade da lipase de A. niger ao pH a 20°C 62

Figura 16. Estabilidade da lipase de A. niger a estocagem em geladeira a 5°C 63

Figura 17. Avaliação da atividade hidrolítica de lipase de A. niger liofilizada sobre diferentes óleos. Os resultados são médias de quatro repetições em triplicata

65

Figura 18. Câmara de Neubauer 88

LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS ANOVA Análise de variância °C Graus Celsius CV% Coeficiente de variação Da Dalton (unidade de massa molecular) DCCR Delineamento central composto rotacional FES Fermentação no estado sólido FS Fermentação submersa gms Grama de massa seca IUB União Internacional de Bioquímica L Litro mg Miligrama mL Mililitro min Minutos Mm Milímetro rpm Rotação por minuto BSA Albumina de soro bovino p. a. SSA Solução de sulfato de amônio U Unidade de atividade enzimática U/gms Unidade de atividade enzimática por grama de massa seca U/gms.h Unidade de atividade lipásica por grama de meio seco por hora IU Unidade Internacional (para quantificação de atividade enzimática) VSSA Volume de solução de sulfato de amônio (mL) vvm Volume de ar por volume de meio por minuto

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 1 2 OBJETIVOS 3 2.1 Objetivo Geral 3 2.2 Objetivos Específicos 3 3 REVISÃO DE LITERATURA 4 3.1 Enzimas 4 3.2 Lipases 7 3.3 Reações Catalizadas por Lipases 3.4 Aplicações Biotecnológicas das Lipases 3.4.1 Indústria alimentícia 3.4.2 Indústria de detergentes 3.4.3 Curtumes 3.4.4 Tratamento de efluentes 3.4.5 Produção de biodiesel 3.4.6 Indústria farmacêutica 3.4.7 Outras aplicações 3.5 Processos Fermentativos para a Produção de Lipases 3.5.1 Características gerais da FES 3.5.2 Características gerais da fermentação submersa (FS) 3.6 Fungos Filamentosos Utilizados para a Produção de Lipases 3.6.1 Aspergillus niger 3.7 Concentração Enzimática 3.8 Caracterização de Lipases 4 MATERIAIS E MÉTODOS

10 11 12 13 14 14 15 16 16 16 17 21 21 23 24 25 27

4.1 Microrganismo 4.2 Matérias-primas 4.3 Estocagem e Ativação do Microrganismo 4.4 Propagação de Esporos 4.5 Preparo do Inóculo para ser Utilizado na Fermentação 4.6 Microrganismo Meio de Fermentação para a Produção de Lipase em FES 4.7 Avaliação do Teor de Óleo Presente no Farelo de trigo

28 28 29 28 30 30 30

4.8 Composição das Borras Alcalinas Realizada por Santos (2012) 30 4.9 Condução da Fermentação para a Produção de Lipase 31 4.10 Obtenção do Extrato Enzimático 31 4.11 Estudo da Produção de Lipase por A. niger em FES e em Colunas Aeradas utilizando Planejamento de Experimentos Estudo da Produção de Lipase 4.11.1 Delineamento de Plackett & Burman

31

31 4.11.2 Delineamento fatorial completo 22

4.12 Produção de Lipases Empregando Distintas Borras Alcalinas 4.13 Cinética da Produção de Lipase por A. niger em FES e em Colunas Aeradas utilizando Planejamento de Experimentos 4.13.1 Determinação do crescimento microbiano

32 33 33 34

4.14 Determinação da Atividade Lipásica 4.15 Determinação de Proteínas Totais 4.16 Determinação da Umidade

34 35 35

4.17 Atividade Lipásica Específica Aparente 36

4.18 Determinação da Atividade Proteásica 4.19 Concentração do Extrato Enzimático 4.19.1 Precipitação com sulfato de amônio 4.19.2 Concentração por liofilização 4.20 Caracterização Bioquímica da Lipase

36 36 36 37 37

4.20.1 Determinação da temperatura e pH ótimos 4.20.2 Determinação da termoestabilidade 4.20.3 Determinação da estabilidade ao pH 4.20.4 Determinação da estabilidade a estocagem 4.20.5 Perfil de ácidos graxos de diferentes óleos e especificidade enzimática 4.20.5.1 Composição dos óleos 4.20.5.2 Especificidade 4.21 Estatística 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Avaliação do Teor de Óleo Presente no Farelo de Trigo Utilizado como Matéria-prima para a FES 5.2 Estudo da Produção de Lipase 5.2.1 Planejamento de Plackett & Burman 5.2.2 Primeiro delineamento fatorial completo 5.2.3 Segundo delineamento fatorial completo 5.3 Produção de Lipases com Distintas Borras alcalinas 5.4 Cinética de Produção da Lipase Utilizando Borra de Canola e na Ausência de Indutor 5.5 Concentração do Extrato Enzimático 5.6 Caracterização Bioquímica da Lipase 5.6.1 Determinação da temperatura e pH ótimos 5.6.2 Determinação da termoestabilidade 5.6.3 Determinação da estabilidade ao pH 5.6.4 Determinação da estabilidade a estocagem sob refrigeração e congelamento 5.7 Perfil de ácidos graxos de diferentes óleos e especificidade enzimática 5.7.1 Composição dos óleos 5.7.2 Avaliação da especificidade da lipase de A. niger sob diferentes óleos vegetais 6 CONCLUSÕES 7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS Anexo A - Cálculo da Contagem de Esporos/g de meio Anexo B - Preparo de Solução Tampão Fosfato de Sódio 0,1M Anexo C - Curva Padrão de Glicosamina Anexo D - Preparo de Solução Tampão Citrato de Sódio 0,05M Anexo E - Cálculos para Transformação de Atividade em U/mL para Atividade em U/g massa seca (U/gms) Anexo F - Curva Padrão de Proteína Anexo G - Reagentes e seus Respectivos Fornecedores Anexo H - Equipamentos e seus Respectivos Fabricantes

37 38 38 38 39 39 39 39 40 40 40 40 45 49 50 53 56 58 58 60 61 62 63 63 64 67 69 70 87 88 89 90 91 92 93 94 95

1

1 INTRODUÇÃO

Lipases são enzimas pertencentes à família das hidrolases (glicerol éster hidrolases E. C. 3.1.1.3) que tem como função biológica primordial catalisar a hidrólise de óleos e gorduras liberando ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol. Além disso, em baixas concentrações de água podem catalisar reações de esterificação, transesterificação e interesterificação. São biocatalisadores extremamente versáteis, podendo atuar em uma ampla faixa de pH e temperatura, inclusive valores extremos de atuação já foram reportados na literatura.

Características como a estabilidade a solventes orgânicos, não exigência de cofatores e especificidade ao substrato, tornam essas enzimas bastante atrativas para o setor de biotecnologia. O interesse da utilização de enzimas na indústria em substituição aos catalisadores químicos pode ser justificado, dentre outros fatores, pela sua biodegradabilidade e a crescente preocupação com o meio ambiente em todos os segmentos.

As lipases são as enzimas mais utilizadas em síntese orgânica e podem ser obtidas de tecidos animais, vegetais e de microrganismo, sendo que as suas propriedades variam de acordo com a fonte de obtenção.

As lipases de origem microbiana são as mais utilizadas industrialmente, pois apresentam grande variedade de atividade catalítica e são mais estáveis quando comparadas com lipases de outras fontes. Além disso, a produção de enzimas microbianas não estão sujeitas às limitações devido à sazonalidade, possuem maior facilidade de cultivo e os meios utilizados para a sua obtenção são geralmente de baixo custo, principalmente aqueles oriundos das agroindústrias.

Dentre as fontes microbianas, os fungos filamentosos são os melhores produtores de lipases, principalmente aqueles pertencentes aos gêneros Aspergillus, Fusarium, Geotrichum, Mucor, Penicillium, Rhizomucor e Thermomyces.

O fungo filamentoso Aspergillus niger é uma das espécies mais estudadas, está amplamente distribuída na natureza, estando presente na superfície terrestre, no ar e na água. É considerado um bom produtor de lipase extracelular e possui habilidade em fermentar grande variedade de matérias - primas. Além disso, é uma das poucas espécies de fungos que receberam o status de GRAS (generally regarded as safe) conferido pela Food and Drug Administration (FDA).

É sabido que uma mesma espécie microbiana pode produzir enzimas com características completamente ou parcialmente diferenciadas. Portanto, a busca por novas linhagens potenciais produtoras de lipases tem crescido nos últimos anos, uma vez que o microrganismo utilizado é fundamental para alcançar o sucesso dos bioprocessos. Além disso, novas tecnologias como a recombinação gênica, a engenharia de proteínas e a evolução dirigida propiciam a obtenção de enzimas com maior estabilidade, seletividade e especificidade, e dessa forma, promovem a diversificação da aplicação enzimática.

A produção de lipases pode ser realizada por dois métodos: fermentação submersa (FS) e por fermentação no estado sólido (FES), sendo este último empregado no presente trabalho.

A fermentação no estado sólido tem ganho atenção dos pesquisadores nos últimos 20 anos. A técnica de FES envolve o crescimento e metabolismo dos microrganismos na ausência ou quase ausência de água livre, empregando um substrato sólido ou suporte.

A FES apresenta uma série de vantagens sobre a fermentação submersa, como por exemplo, menor demanda de energia, maior produtividade, utilização de meios mais simples e de baixo custo, possibilita maiores semelhanças com o habitat da maioria dos fungos filamentosos, os quais são capazes de crescer em baixas concentrações de atividade de água e

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o biocatalisador geralmente é produzido de forma mais concentrada, o que facilita a sua recuperação do meio de cultura.

O meio de cultura utilizado em uma fermentação deve atender à demanda nutricional do microrganismo produtor, aos objetivos do processo e à escala de operação, e pode representar até 70% dos custos gerados. No Brasil, país com abundância em agroindústrias, a utilização de resíduos como substrato para a produção de bioprodutos, como enzimas, contribuem para a redução dos custos dos bioprocessos e para a despoluição ambiental, além de agregar valor a esses materiais. Neste contexto, a fermentação no estado sólido (FES) é uma alternativa interessante para a produção de enzimas.

Dentre os resíduos gerados pelas indústrias alimentícias, encontram-se quantidades apreciáveis de farelos, tortas, cascas, caroços e borras. Esses materiais, além de fonte de matéria orgânica, podem ser utilizados como fonte de proteínas, lipídeos e óleos essenciais, os quais são passíveis de recuperação e aproveitamento.

A borra alcalina é um resíduo gerado pelas indústrias de refino de óleos comestíveis durante a etapa de neutralização alcalina do óleo. Ela consiste de uma mistura de sabão, óleo arrastado, substâncias insaponificáveis, gomas, fosfatídeos, pigmentos, água e ácidos graxos. Além da importância da seleção das matérias-primas e/ou meios cultivos para a produção enzimática, outros fatores são de extrema importância para garantir o sucesso dos bioprocessos, como por exemplo: seleção da linhagem microbiana, concentração de inóculo, composição do meio de fermentação, aeração, pH do meio, temperatura, entre outros fatores, tornando-se essencial a definição das condições que maximizem a produção de enzimas.

Neste sentido, no presente trabalho foram realizados estudos a fim de alcançar melhores condições de produção de lipase de A. niger, utilizando a ferramenta estatística de delineamentos experimentais. O uso de ferramentas estatísticas, como delineamentos de Plackett & Burman e planejamento fatorial completo, possibilita um menor número de experimentos quando comparado às metodologias convencionais, permitindo a investigação do processo em uma ampla faixa de variação, com redução de tempo e custos, tornando essa ferramenta bastante atrativa para a produção enzimática.

As lipases possuem inúmeras aplicações: podem ser utilizadas na modificação de óleos e gorduras, na formulação de detergentes, na fabricação de alimentos, na fabricação de papel, na indústria farmacêutica, nos curtumes, no tratamento de efluentes e na produção de biodiesel. No entanto, a aplicação das enzimas depende também da sua pureza, sendo a precipitação com sulfato de amônio uma das técnicas iniciais mais eficientes e utilizadas na etapa de pré-purificação ou concentração de enzimas. A ausência ou redução de impurezas no extrato enzimático contribui para o alto nível de atividade, que permite a utilização de pequenas quantidades da enzima.

As enzimas devem apresentar características cinéticas adequadas ao processo industrial no qual será aplicada. Portanto, considerando o grande potencial biotecnológico das lipases, a busca por novas enzimas com elevada termoestabilidade, especificidade por diferentes substratos, estabilidade a estocagem entre outras propriedades físico-químicas, bioquímicas e cinéticas, torna-se um importante campo de pesquisa.

Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo melhorar a produção, concentrar e caracterizar lipase de Aspergillus niger por fermentação no estado sólido (FES) utilizando resíduos agroindustriais como borras alcalinas e farelo de trigo, visando o conhecimento das suas propriedades a fim de possibilitar a indicação de uma aplicação industrial para esta enzima.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral Produzir, concentrar e caracterizar uma lipase de Aspergillus niger obtida por fermentação no estado sólido em colunas aeradas utilizando resíduos agroindustriais. 2.2 Objetivos Específicos

Produzir lipases de A. niger por fermentação no estado sólido e melhorar as condições de produção utilizando planejamento experimental;

Estudar a influência de diferentes indutores na produção da enzima; Estudar o perfil cinético da produção de lipase, na condição de processo selecionada; Realizar a concentração enzimática, com a finalidade de obter uma lipase com maiores

níveis de atividade; Caracterizar a lipase quanto a temperatura e pH ótimos, termoestabilidade,

estabilidade ao pH e a estocagem e especificidade a diferentes óleos vegetais.

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3 REVISAO DE LITERATURA

3.1 Enzimas

As enzimas são proteínas, com exceção das ribozimas, especializadas em catalisar reações biológicas, atuando de modo seletivo, rápido e em condições brandas de reação. Elas estão presentes em células animais, vegetais e microbianas, e são essenciais para os processos biológicos de todos os organismos vivos (BAILEY e OLLIS, 1986).

Os biocatalisadores são substâncias capazes de acelerar as reações bioquímicas, até torná-las instantâneas ou quase instantâneas ao diminuírem a energia de ativação. Além disso, as enzimas são capazes de atuar em pequenas quantidades, uma grande vantagem frente aos catalisadores químicos (NASCIMENTO et al., 2002).

As reações catalisadas por enzimas são 1012 a 1017 vezes mais rápidas do que as reações correspondentes não catalisadas (SUAN e SARDIMI, 2004; CASTRO et al., 2004). Segundo Coelho, Salgado e Ribeiro (2008), para apresentar atividade catalítica, algumas enzimas requerem a participação de moléculas menores de natureza não protéica, chamadas de cofatores, que são divididos em: metais e coenzimas. As lipases, por exemplo, não requerem essas moléculas, uma das características que as tornam bastante atrativas (TORRES et al., 2006).

As enzimas são biocatalisadores versáteis e com propriedades que as tornam indispensáveis na biotecnologia, principalmente por serem capazes de atuar em condições brandas de reação, sendo um atrativo no mercado industrial (MUSSATTO, FERNANDES e MILAGRES, 2007).

A expressão da atividade de uma enzima é medida através de sua velocidade de reação determinada em condições experimentais estabelecidas. Segundo Scriban (1985), esta atividade é função direta da estrutura terciária ou quaternária da molécula. Qualquer modificação que venha alterar a estrutura do sítio ativo da enzima implicará em alterações das propriedades catalíticas.

A velocidade da reação enzimática é influenciada por vários fatores: concentração da enzima, concentração de substrato, presença de inibidores e cofatores, temperatura e pH (MAGALHÃES, 2004).

Segundo a Enzyme Commission, uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micromol de substrato ou a formação de 1 micromol de produto por minuto, nas condições de ensaio estabelecidas (temperatura, pH, concentração de substrato). Em muitas situações emprega-se a atividade específica, que é expressa em unidades (U) por massa de proteína (U/mg) (LIMA et al., 2001).

As enzimas são classificadas de acordo com as reações que catalisam. As lipases constituem um grupo específico de enzimas, classificadas internacionalmente pela Comissão de Enzimas como triacilglicerol acil hidrolases (E.C. 3.1.1.3), pois catalisam a hidrólise de triacilgliceróis na ligação éster-carboxílica, fornecendo glicerol e ácidos graxos livres (SAXENA et al., 2003a).

De acordo com a Enzyme Commission (EC) da International Union of Biochemistry (IUB), as enzimas foram divididas em seis grandes grupos (Tabela 1).

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Tabela 1. Classificação das enzimas de acordo com a IUB.

Fonte: (KIELING, 2002). As enzimas podem ser de origem vegetal, animal ou microbiana. Dentre as enzimas de

origem animal, tem importância a pancreatina; tripsina, renina e catalase, dentre as enzimas de origem vegetal, a papaína e bromelina (LIMA et al. 2001) e de origem microbiana as lipases, amilases e proteases são destaque no mercado industrial (MUSSATTO, FERNANDES e MILAGRES, 2007).

O mercado mundial de enzimas apresenta valor comercial de US$ 2 bilhões de dólares anuais e vem crescendo a cada ano com taxas de 8 a 10%. A indústria de alimentos é a que mais tem se beneficiado com o uso das enzimas, sendo utilizadas em 15% dos processos industriais. Além disso, este setor está em crescente expansão faturando trilhões de dólares anuais (AQUINO, 2008).

A demanda mundial de enzimas tem crescido anualmente, sendo mais de 90 % do seu comércio efetuado pelos Estados Unidos, Europa e Japão. Existe uma expectativa de crescimento deste mercado, e espera-se para o ano de 2012, gastos superiores a 2,7 bilhões de dólares, com previsões futuras de aumento em torno de 4 % (IYER e ANANTHANARAYAN, 2008).

Cerca de 4.000 enzimas são conhecidas e destas, 200 são de uso comercial. A maior parte é de origem microbiana. Entretanto, apenas cerca de 2% dos microrganismos encontrados na natureza já foram testados como fontes de enzimas (HASAN; SHAH e HAMEED, 2006).

Cerca de 60% de toda produção mundial de enzimas é oriunda da Comunidade Européia (SHARMA, CHISTI e BANERJEE, 2001). Segundo Paques e Macedo (2006) as enzimas hidrolíticas: proteases, celulases, amilases e lipases, são as mais utilizadas na química orgânica. As lipases são consideradas a terceira enzima mais vendida, perdendo apenas para as proteases e amilases (RIGO et al., 2010).

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Cerca de 37% da produção de enzimas no mercado mundial é utilizado em detergentes, 12% em têxteis, 11% em amido, 8% em panificação, 6% em ração animal, que somam em torno de 75% das enzimas produzidas industrialmente, sendo que aproximadamente 10% do mercado total de enzimas são produzidas para o uso interno (COELHO, SALGADO e RIBEIRO, 2008).

Segundo Mussato, Fernandes e Milagres (2007) o mercado brasileiro de enzimas, possui grande potencial, devido principalmente à enorme geração de resíduos agroindustriais os quais podem ser utilizados para produção enzimática.

Entre as maiores empresas produtoras de enzimas estão a Amano Pharmaceuticals (Japão), Novozyme (Dinamarca), Genencor International (USA), Unilever (Holanda), Biocatalysts (Inglaterra) e Meito Sankyo (Japão) (KRISHNA, 2002).

Uma gama de enzimas estão disponíves no mercado e são produzidas por diferentes espécies microbianas, como pode ser observado na Tabela 2.

Tabela 2. Enzimas de diferentes espécies microbianas produzidas por fermentação no estado sólido. Fonte: (PANDEY, SOCCOL e MITCHELL, 2000).

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3.2 Lipases

As lipases (hidrolases de triacilglicerol E.C 3.1.1.3) são enzimas que catalisam a hidrólise das ligações ésteres presentes nas moléculas de triacilgliceróis, liberando ácidos graxos livres, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol. Além da hidrólise, catalisam reações de esterificação, transesterificação e interesterificação de lipídios (JAEGER et al., 1993). Ao contrário das esterases (EC 3.1.1.1, hidrolases de ésteres carboxílicos), as lipases são capazes de hidrolisar os ésteres de cadeia longa de ácidos graxos (GUNCHEVA e ZHIRYAKOVA, 2011). Além disso, as lipases apresentam a capacidade de atuar na interface óleo/água, já as esterases agem em ésteres solúveis em água (CARVALHO et al., 2003). Além das características citadas anteriormente, a especificidade da lipase é um fator crucial para destinar a sua aplicação. Segundo Jensen, Dejong e Clark (1983) a especificidade das lipases é controlada pelas propriedades moleculares da enzima, estrutura do substrato e por fatores que afetam a ligação enzima-substrato. As lipases podem ser de origem animal (pancreática, hepática e gástrica), vegetal e microbiana (bactérias e fungos) (MARTINS et al., 2008). No que diz respeito a sua atuação sobre determinada região do triacilglicerol, as lipases microbianas podem ser classificadas em três grupos (CASTRO et al., 2004; CARVALHO et al., 2003).

(a) Lipases não específicas: não apresentam especificidade com relação à natureza do grupo acil ou à posição em que está esterificado. São enzimas que catalisam a hidrólise das moléculas de acilglicerol de forma aleatória. Exemplos: lipases produzidas por Candida rugosa, Staphylococcus aureus, Chromobacterium viscosum e Pseudomonas sp.

(b) Lipases 1,3 específicas: catalisam a liberação de ácidos graxos especificamente nas posições 1 e 3 dos triacilglicerol e formam produtos diferentes daqueles obtidos por lipases não regiosseletivas. Exemplos: lipases de Aspergillus niger, Rhizopus delemar, Penicillium roquefortii, e Mucor miehei.

(c) Lipases ácido graxo específicas: catalisam a hidrólise de ésteres cujos ácidos graxos são de cadeia longa insaturada, contendo dupla ligação cis no carbono 9. Este tipo de especificidade não é comum entre as lipases e o exemplo mais estudado até hoje é a lipase de Geotrichum candidum. Dentre as lipases vegetais, as mais estudadas são as extraídas de cereais e óleos de sementes (PAQUES e MACEDO, 2006) e as de origem animal as mais utilizadas são aquelas extraídas do pâncreas de porco (FABER, 1997). Dentre as fontes de lipases, as microbianas são as mais utilizadas industrialmente, principalmente porque as enzimas de microrganismos apresentam procedimentos mais simples de isolamento e maior possibilidade de manipulação genética (COLEN, JUNQUEIRA e MORAES-SANTOS, 2006), apresentam grande variedade de atividade catalítica e são mais estáveis que as lipases de outras fontes (JAYAPRAKASH e EBENEZER, 2010), não estão sujeitas às limitações de produção devido à sazonalidade, como pode ocorrer com as enzimas de origem vegetal; possuem rápido crescimento em meios relativamente de baixo custo (JOSEPH et al., 2007) e são mais suscetíveis à imobilização, quando comparadas a outras enzimas (ARAVINDAN et al., 2007).

As lipases microbianas podem ser constitutivas, que são aquelas produzidas pelos microrganismos independentemente da presença de algum tipo de indutor, e lipases induzíveis, as quais são estimuladas por indutores presentes no meio de cultivo (ROVEDA, HEMKEMEIER e COLLA, 2010). O uso de óleos vegetais tem sido apontado como a principal fonte de carbono indutora para a produção de lipase em fermentação no estado sólido (SILVA et al., 2005; DALMAU et al., 2000; COUTO e SANROMÁN, 2006). Além dos óleos vegetais, as borras e tortas, resíduos da indústria de óleos, também são consideradas

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uma importante fonte de nutrientes para o crescimento de microrganismo, podendo ser utilizadas também como fonte indutora (DAMASO et al., 2008).

As lipases microbianas em geral são extracelulares, sendo excretadas através da membrana externa para o meio de cultura (TAN et al., 2003). As lipases extracelulares são produzidas por muitos microrganismos quando em condições favoráveis. Os fungos filamentosos são os melhores produtores de lipases, principalmente os pertencentes aos gêneros Aspergillus, Fusarium, Geotrichum, Mucor, Penicillium, Rhizomucor e Thermomyces (CARDENAS et al., 2001).

Dentre as lipases bacterianas destacam-se aquelas produzidas por Pseudomonas, principalmente por apresentar produção extracelular (CASTIGLIONI, 2009) e dentre as leveduras, Candida rugosa tem sido a mais empregada em processos industriais (CIHANGIR e SARIKAYA, 2004; ELLAIAH et al., 2004).

As lipases encontram-se amplamente distribuídas na natureza e apresentam ampla faixa de atuação em pH, variando entre 3,0 a 11,0 (GUPTA et al., 2004). Podem apresentar peso molecular entre 20-75 KDa e faixa ótima de temperatura encontra-se entre 30°C e 40ºC, entretanto, algumas lipases tem mostrado níveis de estabilidade consideráveis mesmo em temperaturas extremas, como 5°C e 70°C. Sua termoestabilidade pode variar consideravelmente em função da origem, sendo as lipases microbianas as de melhor estabilidade (CASTRO et al., 2004).

Segundo Vecchia, Nascimento e Soldi (2004) um dos campos de pesquisa que podem solucionar os problemas enfrentados quanto à estabilidade enzimática, é o desenvolvimento de técnicas de imobilização, as quais visam minimizar os efeitos causados pelo seu uso em ambientes adversos, tais como solventes orgânicos, variações no pH e altas temperaturas.

Wang et al. (1995) isolaram Bacillus sp. de uma fonte térmica e verificaram que a lipase produzida por este microrganismo apresenta máxima atividade em pH 9,5 e que reteve 100% de atividade após 30 minutos à 75º C. Na literatura são reportados vários outros exemplos de lipases microbianas estáveis em temperaturas acima de 50°C, como as lipases de B.circulans (KADEMI et al., 2000); de Arthrobacter sp. (SHARMA, BARDHAN e PATEL, 2009); de Thermus thermophilus (DOMINGUEZ et al., 2005) e de Burkholderia multivorans (GUPTA et al., 2007). Segundo Fuciños et al. (2005) um dos principais problemas enfrentados pelas indústrias consiste em encontrar enzimas que sejam estáveis a altas temperaturas e a drásticas condições de pH. As extremozimas e as enzimas termofílicas podem solucionar este problema, pois exercem função catalítica em condições extremas e são mais resistentes à desnaturação por proteólise e agentes químicos do que enzimas mesofílicas. As enzimas termofílicas tem se mostrado tolerantes a desnaturantes como detergentes e solventes orgânicos, portanto, são de grande interesse em reações de síntese orgânica (ATOMI, 2005).

Segundo Jaeger e Eggert (2002), milhares de microrganismos foram isolados do solo e avaliados quanto a sua capacidade de produzir lipases, sendo que 20% mostraram-se úteis em tal aplicação. As enzimas microbianas produzidas comercialmente são provenientes principalmente de bactérias e fungos (filamentosos e leveduras), sendo na sua maioria extracelulares, da classe das hidrolases.

Em 1994, a Novo Nordisk introduziu a primeira lipase comercial recombinante denominada “lipolase”, oriunda do fungo Thermomyces lanuginosus e expressa em Aspergillus oryzae (JAEGER e REETZ, 1998).

Atualmente as principais lipases comerciais são produzidas por diversas empresas e a partir de diferentes microrganismos, conforme ilustrado na Tabela 3.

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Tabela 3. Principais lipases comerciais produzidas por diferentes empresas.

a nomes comerciais de lipases recombinantes. Fonte: adaptado de Salihu et al., 2012.

Fonte Microbiana Nome Comercial Empresa Produtora Aplicações Setor industrial

Bactérias Alcaligenes sp. Lipase PL Meito Sangyo, Co. Modificação de óleos e gorduras Alimentos

Chromobacterium viscosum Lipase CV Genzyme Diagnósticos/análises Saúde Pseudomonas cepacia Lipase SL Amano Síntese quiral Alimentos

Pseudomonas menodocina Lumafast Genencor

International Hidrólise de óleos e gorduras Produção de detergentes

Fungos

Aspergillus niger Lipase DS Amano Suplemento dietético Biofarmacêutico

Lipase Sigma Síntese orgânica Alimentos

Rhizopus oryzae

Lipopan Fa Novozyme Fortalecimento de massas alimentícias Alimentos Lipomod TM 627P-

L627P Biocatalysts Melhoramento de massa e de vida de

prateleira Alimentos Lipomod TM 36P-

L036P Biocatalysts Suplemento dietético Biofarmacêutico

Rhizomucor miehei Palatase a Novozyme Melhoramento do flavor de queijo

chedar Alimentos/laticíneos Leveduras

Candida cylindracea

Lipase MY Meito Sangyo, Co. Suplemento dietético Biofarmacêutico

Resinase a Novozyme Hidrólise dos componentes

hidrofóbicos da madeira (pitch) Produtos Florestais

Candida antarctica Novozym 435 a Novozyme Produtos a base de óleo Alimentos Noopazyme a Novozyme Massas/macarrão Alimentos

Candida cylindracea/porção pancreática

Lipomod TM 29P-L029P Biocatalysts Sabor tipo cheddar

Aromas/Alimentos/Laticíneos

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3.3 Reações Catalisadas por Lipases

Segundo Castro et al. (2005) a maioria das reações orgânicas podem ser realizadas utilizando catalisadores químicos ou biocatalisadores. Uma das grandes vantagens do uso dos biocatalisadores frente aos catalisadores químicos é a redução de tempo, redução de gasto de energia e redução do impacto ambiental.

Entre os processos bioquímicos de maior interesse industrial estão as reações catalisadas pelas lipases, as quais representam aproximadamente 20% das biotransformações realizadas atualmente (JAYAPRAKASH e EBENEZER, 2010). As lipases são muito utilizadas em síntese orgânica porque não requerem cofatores, atuam em uma ampla faixa de pH, são muito estáveis nesse meio, apresentam especificidade, regiosseletividade, quimiosseletividade e enantiosseletividade (TORRES et al., 2006).

A quimiosseletividade refere-se à capacidade de atuar sobre um determinado grupamento químico; a regiosseletividade refere-se à capacidade da enzima em distinguir grupos funcionais que estão situados em diferentes regiões da mesma molécula do substrato e a enantiosseletividade refere-se à capacidade da enzima em reconhecer qualquer tipo de quiralidade presente na molécula do substrato (CARLI, 2006). As principais reações catalisadas pelas lipases, além da hidrólise são: esterificação, interesterificação, alcoólise, acidólise e aminólise (GHANEM, 2007).

O deslocamento do equilíbrio na reação, no sentido direto (hidrólise) ou inverso (esterificação), é controlado pela quantidade de água presente na mistura reacional (NASCIMENTO, DALLA-VECCHIA e SOLDI, 2004).

Segundo Castro et al. (2004) os principais produtos obtidos por esterificação são: isopropilmiristato, isopropilpalmitato e 2-etilexilpalmitato, os quais são comumente empregados no setor famacêutico, como, por exemplo, em formulação de cosméticos e outros produtos de higiene. Os ésteres de carboidratos, também são obtidos em reações de esterificação e são empregados na produção de aromas (THAKAR e MADAMWAR, 2005) e de óleos essenciais (YADAV e LATHI, 2004).

A reação de transesterificação refere-se à troca de radicais acil entre um éster e um ácido (acidólise), um éster e um álcool (alcoólise), um éster e outro éster, na forma de glicerídeos ou de mono-éster (interesterificação) e a reação de aminólise, síntese de amidas (CARVALHO, et al., 2003). A Figura 1 ilustra as principais reações catalisadas por lipases.

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Figura 1. Principais reações catalisadas por lipases Fonte: (GHANEM, 2007).

As reações de interesterificação são empregadas principalmente em processos que visam à obtenção de lipídeos estruturados e as reações de transesterificação são comumente empregadas para a produção de biodiesel (HANSAN, SHAH e HAMEED, 2006).

A interesterificação é um processo utilizado na obtenção de óleos e gorduras com propriedades nutricionais, funcionais e físicas desejáveis, devido a um rearranjo ou modificação de ácidos graxos nas moléculas de triacilgriceróis (ISEO, 2006).

Segundo Baron (2003) os principais substratos das lipases são os triacilgliceróis, além de atuarem sobre uma gama de substratos não-naturais (ésteres não-lipídicos) de diversos tamanhos (BARON, 2003). Em geral, a maior atividade catalítica de lipases ocorre na interface água/lipídeo, através do fenômeno chamado de ativação interfacial e tanto a qualidade quanto a área interfacial têm papel importante na atividade catalítica dessas enzimas (BALCÃO, PAIVA e MALCATA, 1996).

3.4 Aplicações Biotecnológicas das Lipases

As lipases possuem inúmeras aplicações industriais, principalmente, por apresentarem

ampla faixa de atuação em pH, 3 a 11, e temperatura, de 30 a 60°C (GUPTA et al., 2004). Além disso, características como a estabilidade a solventes orgânicos, não exigência de cofatores e especificidade ao substrato, tornam essas enzimas bastante atrativas para o setor

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de biotecnologia (ROH e VILLATTE, 2008). No entanto, muitas vezes, os altos custos de produção destes biocatalisadores restringem sua utilização (FREIRE e CASTILHO, 2000).

As lipases podem ser utilizadas na modificação de óleos e gorduras (MATSUOKA et al., 2009), na formulação de detergentes (LIU et al., 2008), na indústria farmacêutica (VIEIRA et al., 2009), no setor alimentício (GANDRA et al., 2008), na produção de biodiesel (RANGANATHAN, NARASIMHAN e MUTHUKUMAR, 2008), nos curtumes, no tratamento de efluentes, dentre outras aplicações (SALIHU et al., 2012). Essas enzimas vem conquistando o mercado global, sendo as indústrias que fabricam detergentes para lavagem de roupas o principal setor que faz uso de lipases (HASAN; SHAH e HAMEED, 2006). 3.4.1 Indústria alimentícia

As lipases são empregadas em diversos campos da tecnologia de alimentos e são utilizadas, principalmente, com a finalidade de aprimorar o aroma e a textura dos mesmos. Estas enzimas são utilizadas na hidrólise da gordura do leite; na intensificação do sabor dos queijos e na aceleração do processo de maturação, contribuindo para o desenvolvimento de aromas e sabores nesses produtos (SAXENA et al., 1999).

Uma das principais aplicações das lipases no setor de laticínios é na manufatura de queijos duros, como provolone. O sabor característico desse produto é devido aos ácidos graxos de cadeias curtas produzidos pela ação das lipases presente no coalho de bezerro. No processo de maturação, no qual ocorrem as reações responsáveis pelo realce do sabor e textura, existe interesse em acelerar o processo, que geralmente é lento. Dessa forma, a adição de lipases e peptidases na etapa de maturação dos queijos, torna-se interessante (BON, FERRARA e CORVO, 2008).

Na panificação, a adição de lipases a massas de pães e bolos tem a finalidade de aumentar o volume do pão, melhorar a textura e o aroma, além de retardar a sinerese, aumentando a vida de prateleira do produto (GANDHI, 1997).

Gandra et al. (2008) estudaram a aplicação da enzima lipase e do emulsificante monoglicerídeo em pão de forma enriquecido com fibras, visando a melhoria das características do produto, tais como textura e aumento da vida de prateleira. Os autores concluíram que nas condições em que os ensaios foram conduzidos e para as faixas de lipase (0 a 50 ppm) e monoglicerídeo (0 a 2%) estudadas, verificou-se a possibilidade de substituição do emulsificante pela enzima em formulação de pão de forma enriquecido com fibras.

Lipases de Rhizomucor miehei foram empregadas para acelerar o processo de maturação de salsichas fermentadas e contribuir para o desenvolvimento de sabor (RATHI, SAXENA e GUPTA, 2001).

Lipases também são utilizadas na remoção de gordura em carnes e pescados e na melhoria do aroma de produtos embutidos (SHARMA, CHISTI e BANERJEE, 2001).

Segundo Watanabe et al. (2004) as lipases podem ser empregadas na produção de emulsificantes, como monoacilgliceróis contendo ácido linoléico.

As reações de hidrogenação, hidrólise e interesterificação promovem a alteração da composição básica dos óleos e gorduras, visando a obtenção de lipídeos estruturados, que são obtidos através da modificação e/ou substituição de um ou mais ácidos graxos na molécula de triacilglicerol, dando origem a lipídeos que apresentam propriedades nutricionais, funcionais e físicas diferentes dos óleos e gorduras originais (SHARMA, CHISTI e BANERJEE, 2001).

Métodos químicos convencionais para transformação de óleos e gorduras envolvem a produção de triacilglicerol na presença de catalisadores ácidos ou básicos. No entanto, o ácido leva à formação de subprodutos indesejáveis que podem ser difíceis de serem separados do

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produto final. As lipases surgem então, como uma excelente perspectiva para produção de óleos e gorduras com maior valor agregado (OLIVEIRA et al., 2004).

Uma das principais aplicações da lipase em processos de interesterificação de óleos e gorduras é o aproveitamento de óleos de baixo custo visando à obtenção de substitutos da manteiga de cacau (UNDURRAGA, MARKOVITS e ERAZO, 2001).

Os substitutos da manteiga de cacau geralmente são produtos derivados da hidrogenação e/ou fracionamento de óleos vegetais, principalmente dos óleos de coco, palmiste, dendê e soja, e de algumas gorduras não vegetais como óleo de peixe ou sebo comestível. Os principais substitutos são também conhecidos como Cocoa butter substitut (CBS) e Cocoa butter equivalent (CBE) (MINIM, CECCHI e MINIM, 1999).

Geralmente os produtos de chocolate contêm 30% de manteiga de cacau, e devido ao alto custo do cacau e seus derivados, o setor alimentício vem buscando soluções mais econômicas para a substituição total ou parcial da manteiga de cacau nesses produtos, dessa forma, lipases específicas podem ser empregadas na modificação de óleos visando à obtenção de substitutos da manteiga de cacau (UNDURRAGA, MARKOVITS e ERAZO, 2001).

Na Tabela 4 podem ser observadas de forma sintetizada as principais aplicações das lipases no setor alimentício. Tabela 4. Principais aplicações das lipases no setor alimentício.

Fonte: adaptada de Castro et al. (2004). 3.4.2 Indústrias de detergentes

A utilização de enzimas nas formulações de detergentes iniciou-se em 1914, ano em que foi produzido o primeiro detergente em pastilhas que utilizava proteases de pâncreas de porco. Porém, somente nos anos 60 que a aplicação dessas enzimas passou a ser efetiva (COELHO, SALGADO e RIBEIRO, 2008). O maior segmento de aplicação de enzimas industriais, principalmente das lipases, é o setor de fabricação de detergentes para uso domiciliar (HASAN; SHAH e HAMEED, 2006). Neste tipo de produto, a principal função

Setor Área Aplicação Produto

Alimentício

Laticínio Hidrólise da gordura do leite Agente aromatizante para produtos lácteos

Panificação Melhoramento do sabor e/ou qualidade, prolongamento do

tempo de prateleira Confeitos e bolos

Bebidas Melhoramento do aroma e aceleração da fermentação,

por remoção de lipídeos

Bebidas alcoólicas (vinho e outras)

Processamento de derivados

do ovo

Melhoramento da qualidade do ovo por hidrólise dos

lipídeos

Maionese, molhos e cremes

Processamento de carne e

peixe

Desenvolvimento de aromas e remoção de excesso de

gorduras Produtos embutidos

Processamento de óleos

Transesterificaçao de óleos naturais; hidrólise de óleos

(ácidos graxos), diacilglicerol

Óleos e gorduras modificadas

(substitutos da manteiga de cacau)

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das enzimas é a remoção de manchas. Muitos detergentes atuais são caracterizados por formulações de multi-enzimas. O efeito combinado de proteases, amilases, lipases e celulases resulta em uma limpeza sinergística e possibilita a manutenção das cores do tecido (NOVOZYMES, 2008).

Segundo Sharma, Christi e Banerjee (2001), o emprego de lipases nesse setor é responsável pela venda de cerca de 1.000 toneladas de lipases por ano. Devido a habilidade em hidrolisar gorduras, as lipases são utilizadas para facilitar o rompimento de ligações presentes nos triacilgliceróis e, conseqüentemente solubilizar gorduras aderidas ao tecido. As principais características necessárias a esta finalidade são: ter baixa especificidade em relação ao substrato, pois isto possibilita a hidrólise de gorduras distintas; estabilidade nas condições severas de lavagem (pH 10-11, 30 - 60ºC); habilidade de resistir a presença de componentes da formulação, como por exemplo: surfactantes e proteases, que são ingredientes importantes na formulação de detergentes (CARDENAS et al., 2001).

Várias enzimas comerciais são aplicadas neste setor, são elas: Lipolase® (Novozymes), obtida do fungo Thermomyces lanuginosa e expressa em A. oryzae; a Lumafast® (Genencor, USA) e a Lipomax® (Gist-Brocades, Holanda), lipases bacterianas oriundas de Pseudomonas mendocina e Pseudomonas. alcaligenes (JAEGER e REETZ, 1998). 3.4.3 Curtumes

Nas indústrias de fabricação de couro são comumente utilizadas proteases e lipases. Essas enzimas têm sido utilizadas principalmente na etapa de desengraxe como alternativa aos tensoativos e solventes, não interferindo na estrutura do produto final apenas hidrolisando a gordura.(COELHO, SALGADO e RIBEIRO, 2008).

Os couros crus e peles contem grandes quantidades de proteínas e gorduras, e antes que as peças sejam curtidas, essas substâncias devem ser removidas. A remoção da carne, sangue, pelos e gordura garante um produto de melhor qualidade (GANDHI, 1997).

A utilização das lipases apresenta vantagens já que estas não interferem na estrutura do produto final

A utilização de enzimas em curtumes contribui para a redução do consumo de água durante o processo inicial de limpeza das peles, substitui o uso de produtos químicos agressivos, tornando o processo industrial mais seguro para os técnicos, mais rápido, mais eficiente e ambientalmente correto (NOVOZYMES, 2008).

O processamento do couro envolve a remoção de gordura subcutânea e de pelos através de etapas de lavagem e de retirada dos pelos em vários banhos, com níveis de pH na faixa de 8 a 13 e possivelmente na presença de surfactantes e sequestrantes. O uso de um preparado enzimático contendo lipases e outras enzimas, tais como proteases, pode melhorar o processamento do couro (PANDEY et al., 1999). 3.4.4 Tratamento de efluentes

Na literatura tem sido relatado o uso de enzimas no tratamento de efluentes dos mais diversos tipos: contaminantes fenólicos, pesticidas, surfactantes, metais pesados, resíduos da indústria de celulose e papel, resíduos da agroindústria, assim como na desidratação de lodos, na bioconversão de cascas de crustáceos e na degradação de pectina (JORDAN e MULLEN, 2007; KARAM e NICELL, 1997).

As lipases podem ser empregadas no tratamento de efluentes com alto teor de gorduras como os gerados pela indústria de carnes, laticínios e de óleos. Essas enzimas tem sido utilizadas na remoção de gorduras de aeradores de estações de tratamento que empregam lodo

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ativado. A camada de gordura impede a transferência de oxigênio, comprometendo a reposição de oxigênio necessário à biomassa na degradação da matéria orgânica (MENDES et al., 2005).

Pereira, Castro e Furigo (2003) utilizaram lipase microbiana de Candida rugosa para tratar efluentes gerados em frigoríficos avícolas. As maiores porcentagens de hidrólise foram alcançadas em efluentes tamponados em pH 7,0.

A utilização de enzimas para o tratamento de resíduos gerados pelas indústrias em substituição ao uso de agentes químicos contribui para a preservação do meio ambiente, pois reduz a presença de produtos residuais que agridem e poluem os rios e o solo.

3.4.5 Produção de biodiesel

As lipases também têm sido testadas na produção de biodiesel por transesterificação a partir de diferentes óleos vegetais e metanol ou etanol (NOUREDDINI, GAO e PHILKANA, 2005; OLIVEIRA et al., 2004).

O biodiesel é um monoalquil éster de ácidos graxos, proveniente de fontes renováveis como óleos vegetais ou gordura animal, cuja utilização está associada à substituição parcial ou integral dos combustíveis fósseis, como, por exemplo, o diesel. O biodiesel apresenta baixa toxidez, é isento de compostos aromáticos e possui propriedades semelhantes ao diesel comum, além de baixo risco de explosão e ação como ótimo lubrificante (COSTA NETO, 2000).

A produção de biodiesel pode ser gerada por diversos processos, tais como pirólise, emulsificação ou transesterificação, sendo este último o mais utilizado por apresentar fatores técnicos e econômicos mais atrativos (CANDEIA et al., 2006).

Para a produção de biodiesel por transesterificação, é necessária a presença de um catalisador, que pode ser ácido, básico ou enzimático, geralmente em processos químicos, a escolha é pelo catalisador básico, por ser mais rápido. Segundo Knothe et al. (2006), o metanol é o álcool mais utilizado para a produção industrial de biodiesel por ser mais barato, apesar de sua substituição por etanol estar sendo estudada, principalmente pelo fato de ser menos tóxico que o metanol, por ser oriundo de biomassa e ser produzido em grandes quantidades no Brasil.

A aplicação de lipase para produção de biodiesel a partir de óleos vegetais tem atraído a atenção das indústrias e pesquisadores, pois estas enzimas possui a capacidade de esterificar ácidos graxos livres, o glicerol é facilmente recuperado, menor demanda de energia e menor quantidade de efluentes gerados. Os principais óleos vegetais empregados para a produção de biodiesel são: soja, milho, amendoim, algodão, babaçu e palma (RANGANATHAN, NARASIMHAN e MUTHUKUMAR, 2008).

Hernández-Martín e Otero (2008) estudaram a síntese enzimática do biodiesel via alcoólise para distintos óleos vegetais: girassol, oliva, soja e borragem. Os autores utilizaram duas lipases comerciais: (Novozym® 435) e Lipozyme® TL IM. As duas lipases converteram após 48 horas (Novozym® 435) e 96 horas (Lipozyme® TL IM), 84% da reação para éster etílico. Os autores optaram pela enzima Novozym® 435, uma vez que após nove ciclos num reator tipo batelada (25 °C), a lipase ainda apresentava 85 % da atividade inicial.

Chen, Du e Liu (2008), produziram biodiesel utilizando 2 lipases dos microrganismos geneticamente modificados Aspergillus oryzae e Aspergillus niger e observaram que a concentração da enzima, temperatura da reação, razão molar metanol/resíduo de óleo ácido e velocidade de agitação foram as variáveis mais significativas na produção de biodiesel. A previsão da produção de biodiesel foi de 0,915 (m/m), sob as condições ideais.

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3.4.6 Indústria farmacêutica

As características de enanciosseletividade e enantioespecificidade das lipases permitem a obtenção de produtos opticamente puros, como, por exemplo, a síntese de drogas enancio-puras, o que é extremamente vantajoso, já que em muitos casos, normalmente, apenas um dos enantiômeros apresenta atividade terapêutica (GULTEKIN et al., 2004).

Adicionalmente, as lipases vem sendo empregadas na produção de antidepressivos, anti-hipertensivos, vasodilatadores e drogas antiasmáticas (FREIRE e CASTILHO, 2000; BEVILAQUA et al., 2005); na produção de cosméticos, perfumaria, produção de aromas, surfactantes ou de emolientes usados em cremes para a pele e cremes bronzeadores (SAXENA et al., 1999; SHARMA, CHISTI e BANERJEE, 2001). 3.4.7 Outras aplicações

Vários outros campos de atividade tem utilizado lipases, como, por exemplo, na indústria de papel e celulose para a remoção do “pitch”, que são componentes hidrofóbicos da madeira, como triacilgliceróis e ceras, que são indesejáveis na manufatura de papel (NGUYEN et al., 2008). Além disso, elas podem reduzir drasticamente a quantidade de cloro necessária para o branqueamento do papel. Podem ainda encontrar aplicação na limpeza de sistemas de membranas (MAARTENS, SWART e JACOB, 1996), na produção de poliésteres orgânicos e aromáticos (LINKO et al., 1998), entre outras aplicações.

3.5 Processos Fermentativos para a Produção de Lipases

Para a produção de enzimas microbianas são aplicados dois tipos de fermentação: fermentação submersa (FS) e fermentação no estado sólido (FES). Na FES, o microrganismo cresce na superfície das partículas sólidas na ausência ou redução de água livre, entretanto, o meio deve conter umidade suficiente para permitir o crescimento e o metabolismo dos microrganismos (SCHMIDELL et al., 2001).

A fermentação submersa é aquela que tem como característica principal a utilização de um meio fermentativo líquido, normalmente, com nutrientes solúveis. Dessa forma, os microrganismos consomem o substrato do meio e secretam metabólitos, como, por exemplo, as enzimas (MITCHELL et al., 2006).

A eficiência dos processos fermentativos seja em FS ou FES depende de vários fatores, a saber: pH, temperatura, aeração, tipo de substrato e umidade. Esta última é um fator crítico na viabilidade do processo, pois o aumento ou diminuição do conteúdo de água no meio pode afetar o crescimento do microrganismo e, consequentemente, a produção de metabólitos (SINGHANIA et al., 2009). Além disso, a concentração de inóculo, fontes de carbono e de nitrogênio, presença de indutores e inibidores, são fatores que influenciam na síntese destas enzimas (DOMINGUEZ et al., 2003).

Em ambas as técnicas de fermentação, o meio de cultivo utilizado deve atender à demanda nutricional do microrganismo produtor, aos objetivos do processo e à escala de operação. Para a seleção do meio de cultivo é avaliado principalmente o custo das matérias-primas a serem utilizadas, a disponibilidade e as características dos seus componentes (LIMA et al., 2001). Segundo Schmidell et al. (2001) os meios de cultivo são divididos em sintéticos e naturais. Os sintéticos apresentam composição química bem definida e os naturais apresentam composição química complexa, geralmente desconhecida, porém geralmente preferidos por

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apresentar custo reduzido. Os dois métodos fermentativos (FES e FS) apresentam vantagens e desvantagens. 3.5.1 Características gerais da FES

A fermentação no estado sólido apresenta como vantagens o baixo custo e simplicidade

das matérias-primas empregadas como meio de cultivo durante a fermentação, menor probabilidade de contaminação, devido a menor quantidade de água presente no meio e a possibilidade de obtenção da enzima extracelular mais concentrada (PANDEY, 2003). Outra questão interessante é a alta produtividade obtida com esta técnica (COUTO e SANROMÁN, 2006).

Os biorreatores mais comumente utilizados em FES são do tipo bandeja, tambor rotatório, reatores de leito fixo e de leito fluidizado (ROBINSON e NIGAM, 2003; BIANCHI, MORAES e CAPALBO, 2001) e em colunas de vidro aeradas (SANTOS, 2012; DAMASO et al., 2008; COURI et al., 2000).

Apesar de inúmeras vantagens apresentadas pela FES, existem também algumas desvantagens, a saber: é um processo restrito a microrganismos capazes de crescer em ambientes com baixa atividade de água, embora já existam relatos sobre a aplicação de bactérias nos processos de FES; dificuldades no “scale-up” e no controle de parâmetros relacionados à transferência de massa e de calor (PANDEY, 2003). Devido a essas dificuldades apresentadas, alguns autores tentam solucionar ou minimizar tais problemas, desenvolvendo biorreatores mais adequados para o processo.

O ambiente fornecido seja por FES ou FS irá influenciar a adaptação do microrganismo ao meio de cultura. A produção de enzimas em FES favorece o crescimento de fungos que são microrganismos mais resistentes em ambientes com baixa atividade de água quando comparados com bactérias e leveduras (COUTO e SANROMÁM, 2006). Além disso, o crescimento das hifas confere ao fungo maior habilidade de penetração via sistema mecânico e enzimático, consequentemente, absorvendo maior quantidade de nutrientes presentes no meio (MITCHELL, BEROVIC e KRIEGER, 2002). No entanto, algumas bactérias tem sido reportadas em processos de fermentação no estado sólido (MAHANTA, GUPTA e KHARE, 2008; BRADOO et al., 2002).

Segundo Couto e Sanromán (2006), a comparação dos processos fermentativos para a produção de lipases por FES e FS, investigada por vários autores, mostrou que a FES apresenta maiores rendimentos e estabilidade em relação à submersa. Entretanto, apesar da FES apresentar várias vantagens, ainda é pouco aplicada industrialmente para produção de enzimas, principalmente pela falta de tecnologias de biorreatores, poucos dados sobre a cinética microbiana e formação do produto (WANG e YANG, 2007).

A FES vem sendo utilizada com diferentes finalidades, tais como produção de enzimas, aromas, produtos bioativos, biopesticidas, ácidos orgânicos e alimentos fermentados, assim como para a biorremediação e biodegradação de compostos e destoxificação biológica de resíduos agroindustriais (SOCCOL e VANDENBERGHE, 2003; PANDEY et al., 2000).

Nas últimas décadas, atenção especial vem sendo dada para o reaproveitamento de resíduos e/ou coprodutos da agroindústria. Considerando que o Brasil é um país com abundância em matérias-primas agroindustriais, torna-se interessante aproveitá-las em bioprocessos, sendo que os principais coprodutos utilizados na produção de lipases através de fermentação no estado sólido são os óleos vegetais: babaçu, girassol, oliva, soja, palma, canola, milho (SILVA et al., 2005); farelo de trigo (DUTRA et al., 2008; SUN, XU e WANG, 2009) e farelo de soja (COLLA et al., 2010; VARDANEGA et al., 2010; GRIEBELER et al., 2011; GARLAPATI e BANERJEE, 2010).

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Vários coprodutos e/ou resíduos como tortas (GODOY et al., 2011) e borras alcalinas (SANTOS, 2012) tem sido reportados na literatura, como suporte e/ou indutores para a produção em estado sólido de lipases, como por exemplo: bagaço de cana de açúcar (DIAZ et al., 2006); torta de mamona, torta de babaçu, casca de abacate e borra de café (DANTAS e AQUINO, 2010); torta de pinhão manso (MAHANTA, GUPTA e KHARE, 2008); farelo de soja (GRIEBELER et al., 2011); farelo de trigo (CONTESINI et al., 2009); torta do óleo de gergelim (MALA et al., 2007); farelo de arroz (ELLAIAH et al., 2004); farelo de cevada (DOMINGUEZ et al., 2003) e borra alcalina de milho (DAMASO et al., 2008).

A borra é o principal subproduto gerado pelas indústrias de refino de óleos comestíveis durante a etapa de neutralização alcalina do óleo. Os sabões são formados durante o primeiro refino do óleo bruto através da reação de neutralização para extração dos ácidos graxos livres com hidróxido de sódio. Esses sabões e a maioria dos materiais não oleosos são separados do óleo por centrifugação e denominados de borra alcalina (DOWD, 1998).

A borra é constituída por sais de sódio, ácidos graxos e outras substâncias como água, triacilgliceróis, fosfolipídeos, matéria insaponificável, produtos de degradação e outros materiais não oleosos incorporados ao sabão (FRÉ, 2009).

Segundo Salihu et al., (2012) o conteúdo de óleo residual presente nas borras, pode servir como indutor para a produção de lipases. Dessa forma, a fermentação no estado sólido (FES) aparece como uma tecnologia promissora para produção de enzimas, pois além de usar substratos de baixo custo, como por exemplo, resíduos agroindustriais, o biocatalisador pode ser produzido de forma mais concentrada, o que pode facilitar a sua recuperação do meio de cultura (MITCHELL et al., 2006).

Os substratos que compõem os meios devem conter fontes de energia, fontes de nitrogênio, substâncias minerais e fatores de crescimento como vitamina B, aminoácidos, nucleotídeos e ácidos graxos (LIMA et al., 2001). Em se tratando de FES, um outro fator importante é o tamanho das partículas sólidas. Partículas pequenas favorecem a compactação do sólido e poderão dificultar a difusão de gases no meio. Em contrapartida, partículas grandes favorecem a aeração, mas limitam a superfície de contato. Portanto, o tamanho ideal da partícula deve representar a acessibilidade dos nutrientes e a disponibilidade de oxigênio (PANDEY et al., 1999; MITCHELL et al., 2006).

Kamini et al. (1998) utilizaram diferentes resíduos para a produção de lipases de Arpergillus niger em FES. As maiores atividades lipásicas obtidas foram de 363 U/gms em 72 horas quando utilizou-se torta de óleo de gengibre e de 303 U/gms em 96 horas de fermentação fazendo uso de farelo de trigo como substrato. Neste estudo, a adição de fontes de nitrogênio e de indutores foram ineficazes para o aumento da produção da enzima.

Santos (2012) estudou a produção de lipase de A. niger mutante em FES empregando resíduos da indústria de refino de óleo, como a borra de milho, de girassol e de canola, além da ausência de borra. Resultados satisfatórios foram obtidos na ausência de indutor (182,35 U/gms), entretanto, quando comparado com a presença de 3,0% de borra de girassol a atividade lipásica foi significativamente maior (p< 0,1). A maior atividade foi de (201,81 U/gms) nas seguintes condições: 0,5% de nitrogênio presente em 80 mL de solução de sulfato de amônio, 108 esporos/gm e 3,0% de borra de girassol.

Domínguez et al. (2003) investigaram a produção de lipases por Yarrowia lipolytica por fermentação no estado sólido. Resultados obtidos revelaram que a utilização de nozes trituradas como substrato gerou cerca de 69 U/gms de atividade em 10 dias de fermentação, superando os resultados obtidos com farelo de cevada, suplementado com óleo de girassol, milho e oliva. Os autores concluíram que o uso de materiais orgânicos como suporte para a produção de lipases além de diminuir os custos de produção da enzima proporcionou maiores atividades quando comparado ao uso de suportes sintéticos.

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A FES vem corroborar com a sustentabilidade ambiental na utilização de resíduos agroindustriais, além de agregar valor aos mesmos. Na Tabela 5 estão apresentados resultados de produção de lipase em FES utilizando-se diferentes microrganismos e resíduos.

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Tabela 5. Estudos da produção de lipase em FES utilizando resíduos agroindustriais e diferentes microrganismos.

Microrganismos Resíduos agroindustriais Tempo de

fermentação (horas) Atividade lipásica

máxima Produtividade

(U/gms.h) Referências A. niger mutante Borra de girassol 72 201,81 U/gms 2,8 Santos (2012) A. niger mutante Farelo de trigo e óleo de mamona 96 23,7 U/mL 0,24 Dutra et al. (2008) A. niger mutante Farelo de trigo e borra de milho 48 62,7U/gms 1,3 Damaso et al. (2008)

A. niger Torta de babaçu 96 24,6U/gms 0,25 Dantas e Aquino (2010) A. niger Farelo de trigo 96 33.03 U/mL 0,34 Contesini et al. (2009)

A. niger Bolo de óleo de coco, farelo de trigo e trigo

rawa (WR) 96 628,7 U/gms

6,5 Edwinoliver et al. (2010) Aspergillus sp Farelo de soja 96 25,07 U 0,26 Colla et al. (2010) A. fumigatus Óleo de soja 120 119,46 U/gms 0,99 Martins et al. (2008)

Yarrowia lipolytica Bagaço de cana e farelo de trigo 168 9,3 U/gms 0,05 Babu e Rao (2007)

Pseudomonas aeruginosa Torta de semente de pinhão manso 120 1084 U/gms

9,03 Mahanta, Gupta e Khare

(2008)

Burkholderia cepacia Farelo de trigo, enriquecido com 5% de

óleo de milho. 72 108 U/gms

1,5 Fernandes et al. (2007) P. simplicissimum Torta de soja 100 21 U/gms 0,21 Di Luccio et al. (2004)

Penicillium simplicissimum Torta de mamona 96 155.8 U/g

1,62 Godoy et al. (2011)

Penicillium sp. Farelo de soja 48 186 U/g 3,87 Vardanega et al. (2010) Penicillium

brevicompactum Torta de babaçu 96 98.78 U/g

1,02 Silva et al. (2011) Penicillium sp. Farelo de soja 48 19,2 U/g 0,4 Griebeler et al. (2011)

Rhizopus chinensis Farelo de trigo 72 24 U/g 0,3 Sun, Xu e Wang (2009)

Rhizopus oryzae Farelo de soja 120 96.52 U/g

0,8 Garlapati e Banerjee

(2010) *U/gms: unidade de atividade lipásica por grama de meio seco U/g: unidade de atividade lipásica por grama de meio U/gms.h: unidade de atividade lipásica por grama de meio seco por hora U/mL: unidade de atividade lipásica por mililitro de meio

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3.5.2 Características gerais da fermentação submersa (FS)

Na fermentação submersa o crescimento microbiano ocorre em meio líquido (SCHMIDELL et al., 2001). Este tipo de fermentação geralmente é conduzido em fermentadores equipados com agitadores, dispositivos de aeração, camisas e serpentinas para o controle da temperatura (LIMA et al., 2001).

A FS é amplamente utilizada em escala industrial para a produção de enzimas e apresenta algumas vantagens frente a FES: melhor controle de processo, como temperatura e pH, melhor transferência de massa e meios de cultura mais homogêneos (COLLA et al., 2010). Segundo Graminha et al. (2008) quanto maior a homogeneidade do meio de cultura, mais precisos são os resultados.

Apesar da FS ser mais utilizada industrialmente para a produção de enzimas, apresenta algumas desvantagens, como por exemplo: maior dificuldade operacional em relação a transferência de oxigênio para os microrganismos, devido à baixa solubilidade do oxigênio em água (DURAND, 2003), investimento elevado, maiores custos com aeração e agitação (BON, FERRARA e CORVO, 2008) e geração de grande volume de efluentes (BALAJI e EBENEZER, 2008).

Freire et al. (1997) estudaram a produção de lipase e protease em fermentação submersa por uma cepa de Penicillium restrictum. Empregaram o meio de cultura com a seguinte composição (%; p/v): óleo de oliva (1,0); peptona (2,0); NaCl (0,5); extrato de levedura (0,1). O pH inicial foi de 5,5 e a incubação foi de 30° C, com agitação de 250 rpm. A atividade lipolítica máxima foi observada após 80 h de cultivo e coincidiu com a exaustão da fonte de carbono. Os autores observaram início de lise celular a partir de 75 h e aumento da concentração de protease no caldo fermentado em paralelo. O pH aumentou até 8,0 com 90 h ocorrendo também neste tempo queda da atividade lipolítica, como conseqüência provável de inativação da enzima ou sua proteólise, ou mesmo devido a ação conjunta dos dois fatores.

Estudos foram realizados por Tan et al. (2004) para a otimização das condições de cultivo de Penicillium camembertii por fermentação submersa em frascos agitados visando a produção de lipase. A melhor formulação do meio de cultura, após a avaliação de fontes de nitrogênio, fontes de carbono e sais minerais diversos foi (em %; p/v): farelo de soja desengordurado (4,0); óleo de jojoba (0,5); (NH4)2HPO4 (0,1); Tween 60 (0,1). Foi utilizado o pH inicial de 6,4. A melhor temperatura de incubação foi de 28° C e o tempo de fermentação foi de 96 h.

Maliszewska e Mastalerz (1992) estudaram a produção de lipase de Penicillium citrinum por fermentação submersa em frascos agitados. Foi estudado o efeito da adição de Tween 80 e óleo de oliva (0,1 a 1,0 %; p/v) bem como de ácidos graxos (láurico, palmítico, linoléico, linolênico e oléico) na concentração de 4 mM. Os autores observaram um aumento significativo da produção de lipase com a menor concentração do óleo de oliva e efeito estimulante crescente com aumento da concentração de Tween 80, até 0,7%. Foi detectado também, efeito positivo com os ácidos linoléico, linolênico e oléico, mas, inibição com o ácido láurico. A lipase não foi detectada no micélio tendo sido totalmente liberada no meio de cultivo. 3.6 Fungos Filamentosos Utilizados para a Produção de Lipases

A seleção do microrganismo é um dos critérios mais importantes a serem avaliados para utilização em processos fermentativos. Segundo Schmidell et al. (2001), de maneira geral, eles devem apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto; não devem produzir substâncias incompatíveis com o produto; não apresentar inconstância quanto ao comportamento fisiológico, não serem patogênicos e não serem exigentes quanto ao meio

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de cultura. Uma grande variedade de microrganismos tem habilidade de produzir lipases. No entanto, do ponto de vista industrial, os fungos filamentosos são os preferidos como fontes dessas enzimas, pois geralmente as produzem extracelularmente, fator de grande importância, pois torna o processo de extração e obtenção menos oneroso (MAHADIK et al., 2002).

Segundo Colen, Junqueira e Moraes-Santos (2006), os fungos filamentosos quando estão sendo cultivados em condições favoráveis de crescimento são capazes de secretar quantidades significativas de lipases, sendo as espécies pertencentes aos gêneros Geotrichum, Penicillium, Aspergillus e Rhizomucor, as melhores produtoras.

Geralmente, a produção de lipase atinge seu ponto máximo quando a cultura entra na fase estacionária de crescimento, em seguida, a atividade diminui rapidamente, pois ocorre a proteólise catalisada por proteases produzidas durante a fase de crescimento celular (ZAREVUCKA et al., 2005; DALMAU et al., 2000).

Um dos primeiros requisitos para a produção de enzimas, como as lipases, em geral é a identificação e aquisição da linhagem microbiana, a qual deverá ser segura, sob o ponto de vista biológico. Além de serem seguros, os microrganismos utilizados nos processos fermentativos devem suportar condições adversas, manter constância fisiológica, ser de fácil cultivo, e ser tolerante à presença de substâncias tóxicas que podem ser geradas pelo metabolismo celular e apresentar alto rendimento (BON et al., 2008). De acordo com Mahadik et al. (2002), a fermentação no estado sólido pode auxiliar na obtenção de lipases ácidas, como a produzida pelo fungo Aspergillus niger (pH de 1,5 a 2,5).

Para a obtenção de metabólitos gerados pelos microrganismos, é necessário amplo estudo sobre a sua fisiologia. Portanto, para alcançar o êxito nos bioprocessos, as condições de fermentação e o estágio de desenvolvimento do microrganismo devem ser bem estabelecidos (PAPAGIANNE, 2004).

Os fungos são seres vivos eucarióticos, apresentam alta capacidade de adaptação, são pouco exigentes quanto aos nutrientes disponíveis e o seu crescimento pode ocorrer praticamente em qualquer tipo de substrato, pois apresentam uma variabilidade enzimática muito grande (ZAITZ, 1998). Além disso, os fungos podem crescer em condições de umidade e temperatura extremamente variáveis (LAZZARI, 1997). Já foram descritas mais de 100.000 espécies fúngicas, distribuídas em aproximadamente 3.000 gêneros (MENEZES, 2006).

Segundo Mitchell, Berovic e Krieger (2000) os fungos filamentosos são bastante atrativos para utilização na fermentação no estado sólido, principalmente devido a facilidade de crescimento em meios ácidos e capacidade de esporular, o que facilita o preparo do inóculo. Além disso, são os microrganismos mais adaptáveis a esse tipo de processo, pois são capazes de crescer em meios com baixo teor de água e com muitos sólidos presentes, além de apresentar crescimento por meio de hifas que favorecem a colonização no meio de fermentação (DURAND, 2003).

Fungos são organismos heterotróficos ou parasitas, podendo estar presentes no solo, nos vegetais, na água e nos mais variados ambientes, uma vez que possuem alta capacidade de dispersão. Podem ser pluricelulares, conhecidos como fungos filamentosos e os unicelulares, conhecidos como leveduras. O corpo de um fungo filamentoso consiste de filamentos longos de células conectadas denominadas hifas e o conjunto dessas hifas é denominado micélio (CORRÊA,1995). Essa estrutura é dividida em micélio vegetativo, cujas hifas penetram no meio onde absorvem nutrientes e micélio aéreo ou reprodutivo, cujas hifas se projetam acima da superfície, dando suporte às células reprodutivas ou esporos (PAPAGIANNI, 2004). Os fungos filamentosos podem formar colônias com diferentes aspectos e colorações. O micélio é usualmente incolor e as diferentes tonalidades das colônias são decorrentes da produção de esporos assexuais, resultando em coloração verde, verde azulada, laranja, castanha, cinza ou preta. Os genêros Penicillium, Aspergillus, Mucor e Rhizopus apresentam coloração bastante

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característica e que auxiliam na identificação das espécies (LEITÃO et al., 1988; TRABULSI e TOLEDO, 1991).

Os fungos filamentosos, popularmente conhecidos como mofo ou bolor, produzem vários tipos de metabólicos, como por exemplo: enzimas, álcoois, ácidos orgânicos, vitaminas, pigmentos corantes, polissacarídeos, esteróis e substâncias antibióticas. Além disso, algumas espécies são utilizadas no controle biológico de insetos/pragas da agricultura, são utilizados em processos de maturação de vários queijos e são ainda empregados em processos de biorremediação (ESPOSITO e AZEVEDO, 2004). 3.6.1 Aspergillus niger

Segundo Gautam et al. (2011) o uso de Aspergillus niger em processos fermentativos apresenta vantagens em relação a outras espécies, como por exemplo, facilidade de manipulação e habilidade em fermentar uma grande variedade de matérias primas de baixo custo. Além disso, segundo Schuster et al. (2002), é um microrganismo considerado seguro para o uso industrial, em relação a patogenicidade, hipersensibilidade e produção de toxinas.

Existem cerca de 200 espécies, as quais são comumente isoladas do solo, de plantas em decomposição, do ar e de rejeitos industriais (SOARES, 2010). A maioria das espécies fúngicas apresenta temperatura ótima de crescimento entre 20-25ºC, entretanto, existem espécies que podem crescer em temperaturas mais elevadas, acima de 35ºC.

Na literatura são reportadas várias enzimas com relevância comercial e aplicação em biotecnologia produzidas pela espécie Aspergillus niger, como por exemplo: poligalacturonase, utilizada na clarificação de sucos de frutas (SANTOS e MACEDO, 2008); celulase, utilizada para o amaciamento de tecidos de algodão, limpeza e clarificação (AGUIAR, MARGONAR e LUCENA, 2008); protease, utilizada na remoção de manchas de proteínas e purga do couro (PARANTHAMAN, ALAGUSUNDARAM e INDHUMATHI, 2009); amilase, utilizada para melhorar a maciez e volume do pão (GUPTA et al., 2008).

A enzima que será produzida dependerá do tipo de substrato a ser utilizado na fermentação (PANDEY et al.,1999).

Além da produção de enzimas úteis, várias linhagens de A. niger são utilizadas na produção industrial de ácido cítrico e ácido glucónico, os quais foram avaliados como aceitáveis para ingestão diária pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e do Food and Drug Administration (FDA) (SCHUSTER et al., 2002).

Aspergillus niger é o principal microrganismo produtor de ácido cítrico, pois é capaz de crescer em meio contendo açúcares e sais e em pH de 2,5-3,5, excretando ao longo do seu crescimento grandes quantidades deste ácido. O ácido cítrico é bastante utilizado em grande escala industrial, como por exemplo, em refrigerantes e em produtos farmacêuticos (MAX et al., 2010). Segundo Baker (2006), a espécie A. niger, também desempenha um papel importante no ciclo global do carbono.

Aspergillus niger é um fungo comumente denominado como “mofo negro” (WAINWRIGHT, 1995). É um ascomiceto imperfeito (classe dos Deuteromicetos) que pode se desenvolver em meios líquidos e sólidos, apresentam colônias brancas a amarelo pálido, mas rapidamente esporulam e, consequentemente, tornam as colônias negras. Os conídios são esféricos, medem de 3 a 5 µm, apresentam hifas finas, septadas e conidióforos com vesículas recobertas por conídios negros (RODRIGUES, 2006). Imagens da estrutura microscópica desse fungo pode ser observada na Figura 2.

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Figura 2. Estrutura microscópica de A. niger Fonte: (MAKIMURA, 2002).

Aspergillus niger é uma das poucas espécies de fungos que receberam o status de

GRAS (generally regarded as safe) conferido pela Food and Drug Administration (FDA). O uso histórico dos gêneros Aspergillus e Penicillium na produção de alimentos e bebidas tradicionais, como queijos e saquê, elevam-os ao status GRAS (IWASHITA, 2002).

3.7 Concentração Enzimática

As lipases são enzimas que possuem um amplo campo de aplicações. No entanto, o

direcionamento para dada aplicação está relacionado também com o seu grau de pureza. Geralmente, os processos de separação da enzima envolve uma etapa de pré-purificação e posteriormente purificação por métodos cromatográficos (CASTIGLIONI, 2009).

A precipitação com sulfato de amônio é uma das técnicas mais utilizadas na etapa de pré-purificação ou concentração, sendo eficientes para a concentração de soluções protéicas e no fracionamento de mistura de proteínas (PESSOA JR e KILIKIAN, 2005).

De acordo com Lima et al. (2008) o sulfato de amônio tem sido o sal mais utilizado em precipitação devido a sua alta solubilidade, baixo custo e baixa toxicidade.

Após a fermentação e subsequente extração, a enzima encontra-se no meio contendo uma série de outros compostos que não são de interesse, dessa forma, uma das primeiras etapas geralmente realizadas é a separação das células do meio de cultura por meio de centrifugação e/ou microfiltração, seguida de concentração/pré-purificação.

A ausência ou redução de impurezas no extrato enzimático contribui para o aumento do nível de atividade, que permite a utilização de menores quantidades da enzima (PESSOA JR e KILIKIAN, 2005).

Segundo Neto (2007), a concentração enzimática pode ser realizada por várias técnicas: adição de um polímero do tipo Sephadex G-25; por ultrafiltração; liofilização ou precipitação. Os métodos de precipitação, por exemplo, além de concentrar o extrato enzimático, podem proporcionar, em alguns casos, uma purificação parcial da preparação enzimática.

Produtos destinados para uso terapêutico requerem maior grau de pureza e complexidade do processo de purificação. Já o seu uso em biocatálise pode requerer apenas processos parciais de purificação, caso os componentes presentes no extrato enzimático não interfiram na reação e no processo de obtenção dos produtos (KORNBERG, 1990).

A escolha do método de purificação da lipase é dependente do microrganismo utilizado, bem como do tipo de meio, das condições de cultura e das características da enzima. Devido o grande número de variáveis envolvidas, não há um processo de purificação que seja de aplicação geral (KORNBERG, 1990).

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A liofilização é um método de desidratação de um material previamente congelado, em que o volume de água é removido por sublimação. Para facilitar a sublimação, se mantém uma pressão muito baixa e o vapor deve ser eliminado por condensação à baixa temperatura. É reconhecidamente o melhor método para obtenção de produtos desidratados de alta qualidade, pois o material permanece congelado até estar completamente seco, retendo a forma original do material. É um método utilizado na produção de preparações enzimáticas, vacinas, frações de plasma e hormônios (PITOMBO, 2005).

A purificação enzimática tem dois objetivos básicos: obtenção de uma enzima pura para melhor estudo de suas características estruturais e bioquímicas e obtenção de um extrato com altos níveis de atividade, entretanto, processos de purificação costumam elevar consideravelmente o preço do produto final (PALEKAR, VASUDEVAN e YAN, 2000). No entanto, no presente trabalho foi realizado apenas o estudo da etapa anterior a purificação, são elas: concentração enzimática através da precipitação com sulfato de amônio e liofilização. 3.8 Caracterização de Lipases

Existe uma diversidade de lipases, as quais podem apresentar propriedades muito distintas entre si. Portanto, o estudo das propriedades bioquímicas das enzimas é de extrema importância para conhecer as particularidades de atuação enzimática e estabelecer as condições de processo, como por exemplo: a estabilidade em função da temperatura, do pH e a estocagem em baixas temperaturas (BACHA et al., 2005).

A termoestabilidade é uma das principais características requeridas para aplicação industrial de uma enzima, uma vez que muitos processos usam temperaturas em torno de 50°C ou maiores (SAXENA et al., 2003a), sendo que algumas enzimas são rapidamente inativadas a essas temperaturas.

Estas informações são relevantes para a aplicação industrial e são necessárias para manter o nível desejado de atividade da enzima por um longo período de tempo (SOUZA et al., 2010).

As lipases devem ser selecionadas para cada aplicação, sendo que estas podem ser baseadas na especificidade ao substrato, posição e estereoespecificidade, bem como, temperatura e pH ótimos e estabilidade a temperatura e ao pH (CARVALHO et al., 2008).

Na literatura são reportados vários trabalhos com o objetivo de caracterizar lipases de diferentes espécies microbianas e de diferentes origens. Os trabalhos demonstram que as faixas de atuação de lipases é bastante ampla, portanto, a caracterização torna-se fundamental após a otimização da produção de lipases.

Pastore, Costa e koblitz (2003) estudaram as propriedades de uma lipase produzida por nova linhagem fúngica de Rhizopus sp e verificaram que a enzima bruta apresentou condições ótimas de atividade a 40ºC e pH entre 6,0 e 6,5.

Estudo realizado por Tsuruda et al. (2006) constataram que a atividade máxima de lipases (0,65 U/mL) de Trichoderma sp. ocorreu em tampão citrato-fosfato pH 6,0 e a 50 °C. Benjamin e Pandey (2001) relataram que uma das lipases produzidas por Candida rugosa apresentou atividade ótima em pH 7,0 e temperatura de 40ºC.

Carvalho et al. (2005) estudaram estabilidade de lipase de Aspergillus niger isolada de amostras de solo brasileiro em reações de esterificação. Resultados revelaram que esse microrganismo apresentou a maior atividade (18,2 U/mL) e foi altamente termoestável, retendo 90% e 60% de atividade a 50°C e 60°C, respectivamente.

Vici et al. (2011) avaliaram a atividade das lipases intra e extracelulares produzidas por Aspergillus niger. Resultados obtidos pelos autores revelaram que a melhor faixa de temperatura de reação foi de 40° a 55°C para as lipases intracelulares e de 45° a 55°C para as extracelulares. Ambas as lipases obtiveram melhor atividade em pH de 3,0 a 6,0. Pinheiro

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(2006) concluiu que a temperatura e pH ótimos da lipase de Penicillium verrucosum foi de 44ºC e pH 7,0, enquanto Shu, Xu e Lin (2006) verificaram que a temperatura ótima da lipase de Antrodia cinnamomea foi de 45ºC e pH de 8,0.

Estudo realizado por Camargo et al. (2003), verificaram que a lipase produzida por Fusarium oxysporum apresentou atividade máxima a 37°C. Burket et al. (2001) realizaram a caracterização parcial da lipase de Geotrichum candidum obtida a partir de meio sintético contendo peptona e óleo de soja. Segundo os autores, a lipase apresentou pH e temperatura ótimos de 7,0 e 37ºC, já a estabilidade térmica da enzima foi relativamente baixa, com uma meia-vida de 3,6 h (37ºC e pH 7,0) e a atividade enzimática foi quase totalmente inibida pela presença de íons Cu2+ e Ag+ e, parcialmente inibida, pela presença de Fe2+ e Zn2+.

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4 MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados e desenvolvidos nos Laboratórios de Processos Fermentativos e Óleos Graxos da Embrapa Agroindústria de Alimentos, localizada em Pedra de Guaratiba, Rio de janeiro/RJ.

Na Figura 3 pode ser observado um fluxograma contendo as etapas realizadas ao longo do trabalho,de Tese.

Identificação da espécie fúngica -Identificada no Laboratório de Micologia da

UFRRJ

Produção de lipase com distintas borras nas condições melhoradas Substrato/indutores utilizados: farelo de trigo, borra de milho, canola, girassol,

ausência de indutor

Seleção de variáveis que influenciam a produção de lipase em FES Delineamento: Plackett & Burman

Variáveis estudadas: inóculo(esporos/g de meio), volume de solução de sulfato de amônio (mL), aeração (vvm) e concentração de indutor (%)

Substrato/indutores utilizados: farelo de trigo, óleo de oliva e borra de milho

Melhoramento das condições de produção de lipase em FES Delineamento: fatorial completo 22

Variáveis estudadas: aeração (vvm) e concentração de indutor (%) Substrato/indutores utilizados: farelo de trigo e borra de milho

Cinética da produção de lipase Substrato/indutores utilizados: farelo de trigo, borra

de canola e na ausência de indutor

Concentração enzimática Métodos:

- Precipitação com sulfato de amônio: 40, 60, 80 e 90% de saturação - Liofilização

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Continuação do fluxograma...

Figura 3. Fluxograma das etapas realizadas ao longo do trabalho

4.1 Microrganismo

A linhagem de Aspergillus niger utilizada neste trabalho foi isolada de amostras de manteiga e selecionada como boa produtora de lipase em um trabalho de screening realizado por Moreira et al. (2009). Posteriormente, o microrganismo foi identificado no Laboratório de Micologia e Micotoxicologia da UFRRJ, empregando-se a metodologia descrita em Samson et al. (2007) e verificou-se que se tratava da espécie A. niger. A cultura fúngica está depositada na Coleção de Microrganismos de interesse da Indústria de Alimentos e Agroenergia da Embrapa Agroindústria de Alimentos -RJ.

4.2 Matérias – primas

Na Tabela 6 estão apresentadas as principais matérias-primas utilizadas para a produção da enzima com seus respectivos fornecedores. O farelo de trigo e as borras alcalinas foram armazenados sob refrigeração. Na Figura 4 pode ser observado as amostras das borras utilizadas no presente trabalho.

Tabela 6. Matérias-primas empregadas para a produção de lipase de Aspergillus niger por fermentação no estado sólido (FES).

Matérias-primas Fornecedores

Borra alcalina de milho, canola e girassol Indústrias Granfino S/A, Nova Iguaçu, RJ, Brasil

Farelo de trigo Bunge Alimentos S.A

Óleo de oliva ®Faisão

Caracterização bioquímica: Com extrato enzimático concentrado a 90% de saturação

- Temperatura e pH ótimos; - Termoestabilidade; - Estabilidade ao pH;

- Estabilidade a estocagem.

Caracterização bioquímica: Com extrato enzimático liofilizado

- Especificidade ao substrato

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Figura 4. Borra de girassol (A), borra de canola (B), borra de milho (C).

4.3 Estocagem e Ativação do Microrganismo

O fungo foi estocado em solo congelado, previamente esterilizado por sete vezes, e ativado em gelose inclinada constituída pelos nutrientes descritos na Tabela 7 (COURI e FARIAS, 1995). O pH do meio de cultura foi ajustado para pH 5,5 e, em seguida, esterilizado a 121°C por 15 min. Para a ativação da linhagem, foram realizados dois repiques sucessivos e incubados em B.O.D. por 5 dias a 32°C, para o seu desenvolvimento. Tabela 7. Composição do meio de ativação do microrganismo

Componentes Fornecedores Concentração (g/L) Nitrato de sódio (NaNO3) Reagen 3,00

Sulfato de magnésio (MgSO4) Reagen 0,5 Cloreto de potássio (KCl) Vetec 0,5

Sulfato ferroso (FeSO4.7H2O) Baker Chemical 0,01 Fosfato dibásico de potássio (K2HPO4) Grupo química 1,0

Agar-ágar Isofar 30,0 Óleo de oliva Faisão 20,0 (mL/L)

4.4 Propagação de Esporos

Após a ativação, foram adicionados aproximadamente 10 mL de solução 0,1% de Tween 80 nos tubos de gelose para o desprendimento dos conídios de Aspergillus niger. Posteriormente, 1,0 mL da suspensão foi transferido para frascos cônicos contendo meio de sabugo de milho. Este meio é bastante utilizado para produzir grandes quantidades de esporos, pois apresenta maior superfície de contato se comparado com a gelose descrita na Tabela 7. Os frascos inoculados foram incubados por 5 dias a 32°C para a propagação de conídios. Para o preparo desse meio, primeiramente, o milho é obtido no comércio local, em seguida é cozido, debulhado e seco em estufa a 100°C, por aproximadamente 4 horas. Posteriormente, o sabugo é moído em moinho de facas utilizando peneira de 6 mm e mantido em freezer.

Segundo metodologia descrita por Gomes (1995), para cada frasco cônico, utilizou-se 4,6 g de sabugo de milho (seco e triturado) enriquecido com 6 mL de uma solução constituída por peptona, HCl, fosfato de potássio e sulfato de zinco. Os frascos foram esterilizados a 121ºC por 1 hora.

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4.5 Preparo do Inóculo para ser Utilizado na Fermentação

Após o período de 5 dias para a propagação de conídios foram adicionados aos frascos cônicos aproximadamente 20 mL de solução 1% de Tween 80 seguido de homogeneização. Posteriormente, foi realizada a filtração em gaze estéril para a obtenção da suspensão, cuja concentração foi determinada através de contagem ao microscópio óptico em câmara de Neubauer (ANEXO A). 4.6 Meio de Fermentação para a Produção de Lipase em FES

Os meios foram preparados em frascos cônicos contendo 100g de farelo de trigo triturado (tamanho do grão ≤ 5 mm), umedecidos com solução de sulfato de amônio (VSSA) a 1,2% (p/v) pH 7,0 e acrescidos ou não com diferentes concentrações de indutores: óleo de oliva e borras alcalinas (Figura 4). Os meios foram homogeneizados e esterilizados a 1 atm por 15 minutos, sendo posteriormente inoculados com suspensão de conídios, conforme os planejamentos experimentais descritos nos itens 4.11.1 e 4.11.2 4.7 Avaliação do Teor de Óleo Presente no Farelo de Trigo O farelo de trigo coproduto utilizado como substrato durante a FES, foi avaliado quanto o teor de óleo, no laboratório de físico-química da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. A extração foi realizada em equipamento de soxhlet através do uso do solvente éter de petróleo, conforme metodologia descrita pelo Instituto Adolfo Lutz (IAL, 1985).

4.8 Composição das Borras Alcalinas Realizada por Santos (2012) As borras alcalinas são resíduos provenientes do refino de óleos e sua composição depende de vários fatores, como por exemplo, condições do refino e concentração e tipo do agente neutralizante (FRÉ, 2009).

Santos (2012) estudou a produção de lipases por uma linhagem mutante de A. niger codificada como 11T53A14 e utilizou como fonte indutora as mesmas borras alcalinas utilizadas no presente trabalho. O autor realizou a caracterização físico-química das borras de canola, milho e girassol, apresentados na Tabela 8. Tabela 8. Resultados das análises físico-químicas realizadas nas borras

Borra de canola Borra de milho Borra de girassol Análises Média CV(%) Média CV(%) Média CV(%)

Umidade (%) 41,88±1,36 3,24 52,59±1,77 3,36 29,72±0,94 3,15 Resíduo de sabão*(%) 39,34±1,16 2,95 31,82±0,42 1,33 47,50±1,20 2,52 Óleo neutro (%) 16,98±0,82 4,83 25,09±1,10 4,37 18,11±3,21 17,71 Cinzas (g/100g) 5,37±0,15 2,77 3,56±0,04 1,19 7,15±0,01 0,20 pH 8,22 - 8,80 - 8,60 - *Resíduo de sabão foi expresso em oleato de sódio. CV = coeficiente de variação (SANTOS, 2012)

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4.9 Condução da Fermentação para a Produção de Lipase A fermentação para a produção da lipase foi conduzida em colunas cilíndricas

(21,0 cm x 2,2 cm) aeradas, contendo aproximadamente 17g do meio de cultivo e imersas em banho termostático com circulação de ar a 32°C por 48 horas (Figura 5).

4.10 Obtenção do Extrato Enzimático

Após a produção da enzima por fermentação no estado sólido, procedeu-se a extração enzimática através da adição de 2,5 mL de tampão fosfato de sódio pH 7,0 (ANEXO B) por grama de meio fermentado e, sob agitação, em banho Maria a 100 rpm por uma hora a 32oC.

Posteriormente, os meios fermentados foram homogeneizados e filtrados em papel filtro quantitativo J.Prolab® e em seguida microfiltrados através de membranas de celulose milipore® com porosidade de 0,45µm. Dessa forma, pode-se obter o extrato enzimático bruto. 4.11 Estudo da Produção de Lipase por A. niger em FES em Colunas Aeradas Utilizando Planejamento de Experimentos 4.11.1 Delineamento de Plackett & Burman

A necessidade crescente da otimização ou melhoramento dos processos biotecnológicos, minimizando custos e tempo, maximizando rendimento, produtividade e qualidade de produtos, tem levado vários pesquisadores a buscarem técnicas de planejamento de experimentos (RODRIGUES e IEMMA, 2005). Neste contexto, foram utilizados dois planejamentos de experimentos, a saber: Plackett & Burman e Fatorial Completo.

O planejamento experimental de Plackett & Burman foi utilizado com o objetivo de selecionar as variáveis que influenciam de forma significativa a produção de lipases por fermentação no estado sólido (Tabelas 9 e 10). Para o estudo das condições da produção de lipases por fermentação no estado sólido foram analisadas quatro variáveis: concentração de inóculo, concentração de fontes lipídicas, volumes de solução de sulfato de amônio (VSSA) e aeração, em três níveis de valores conforme apresentado na Tabela 9. As fontes lipídicas utilizadas nos experimentos distintos foram: borra alcalina de milho e óleo de oliva ®Faisão.

Figura 5. Aparato instrumental para a fermentação de lipase conduzida em colunas aeradas. Rotâmetros (A), banho termostatizado (B), colunas contendo meio de cultivo já fermentado (C).

A

B C

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Para cada planejamento foram realizados 12 ensaios e três pontos centrais (13, 14 e 15), como pode ser observado na Tabela 10.

Segundo Singhania et al. (2009), as variáveis estudadas no presente trabalho, são os principais fatores relacionados com a eficiência dos processos fermentativos, e por isso foram estudadas.

Tabela 9. Níveis e variáveis estudadas no planejamento de Plackett & Burman para a seleção de variáveis que influenciam na produção de lipase.

VSSA = volume de solução de sulfato de amônio Tabela 10. Matriz gerada para o planejamento experimental de Plackett & Burman para a produção de lipase com seus níveis codificados e valores reais (entre parênteses).

*Pontos centrais VSSA = volume de solução de sulfato de amônio 4.11.2 Delineamento fatorial completo 22

Após a seleção das variáveis que influenciaram de forma significativa a produção de

lipases, foi realizado o delineamento fatorial completo para 2 variáveis independentes, sendo elas: aeração e concentração de borra de milho (Tabela 11). O objetivo deste delineamento foi verificar a melhor condição para a produção de lipase de A. niger. Foram realizados 4 ensaios

Níveis Variáveis Inóculo

(esporos/g de meio) VSSA (mL)

Aeração (vvm)

Concentração de indutor (%)

-1 106 40 0,5 0,5 0 107 60 1,0 1,5

+1 108 80 1,5 2,5

Ensaios Inóculo

(esporos/g de meio)

VSSA (mL) Aeração (vvm)

Indutor (%) (borra de milho

ou óleo de oliva)

1 +1(108) -1(40) +1(1,5) -1(0,5) 2 +1(108) +1(80) -1(0,5) +1(2,5) 3 -1(106) +1(80) +1(1,5) -1(0,5) 4 +1(108) -1(40) +1(1,5) +1(2,5) 5 +1(108) +1(80) -1(0,5) +1(2,5) 6 +1(108) +1(80) +1(1,5) -1(0,5) 7 -1(106) +1(80) +1(1,5) +1(2,5) 8 -1(106) -1(40) +1(1,5) +1(2,5) 9 -1(106) -1(40) -1(0,5) +1(2,5)

10 +1(108) -1(40) -1(0,5) -1(0,5) 11 -1(106) +1(80) -1(0,5) -1(0,5) 12 -1(106) -1(40) -1(0,5) -1(0,5) 13* 0(107) 0(60) 0(1,0) 0(1,5) 14* 0(107) 0(60) 0(1,0) 0(1,5) 15* 0(107) 0(60) 0(1,0) 0(1,5)

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e três pontos centrais (5, 6 e 7), como podem ser observados nas Tabelas 12. Este delineamento foi realizado em duplicata. Tabela 11. Níveis e variáveis estudadas no planejamento fatorial completo 22 para o melhoramento das condições de produção de lipase.

Tabela 12. Matriz gerada para o delineamento fatorial completo 22 com seus níveis codificados e valores reais (entre parênteses).

Ensaios Aeração (vvm) Concentração de borra de milho (%) 1 -1(0,0) -1(0,0) 2 +1(1,0) -1(0,0) 3 -1(0,0) +1(1,0) 4 +1(1,0) +1(1,0)

5* 0(0,5) 0(0,5) 6* 0(0,5) 0(0,5) 7* 0(0,5) 0(0,5)

* Pontos centrais 4.12 Produção de Lipases Empregando Distintas Borras Alcalinas

Com o objetivo de avaliar a capacidade de outras borras induzirem a produção de

lipase de A. niger, bem como de se avaliar a capacidade do fungo filamentoso em produzir a enzima sem a adição de fontes lipídicas, foram realizados ensaios utilizando-se as borras de girassol e de canola, além da borra de milho e sem adição de indutor. Os ensaios foram realizados nas condições de processo selecionadas no delineamento fatorial completo 22: 106 esporos/g de meio; 1 vvm de aeração; 1% de borra e 60 mL de VSSA. Os extratos enzimáticos obtidos foram avaliados em termos de atividades lipásica, proteásica e específica aparente. 4.13 Cinética da Produção de Lipase por A. niger em FES e em Colunas Aeradas utilizando Planejamento de Experimentos

A cinética foi realizada com o intuito de conhecer o perfil de produção da lipase e identificar o tempo ótimo da produção da enzima, nas condições estudadas. Os meios foram preparados de acordo com a melhor condição obtida no planejamento fatorial completo 22. As colunas contendo o meio fermentado foram retiradas nos tempos 0, 24, 48, 72 e 96 horas. Os

Níveis Variáveis

Aeração (vvm) Concentração de borra de milho (%)

-1 0 0 0 0,5 0,5

+1 1 1

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pontos foram preparados em duplicata e, de cada um deles, foram retirados 2g de meio para determinação da umidade e após seco foi determinado o teor de glicosamina.

Os meios foram extraídos com solução tampão, filtrados e microfiltrados até a obtenção do extrato enzimático bruto, como descrito no item 4.10 e posteriormente foram avaliados quanto as atividades lipásica (U/gms) e proteásica (U/mL) descrita nos itens 4.14 e 4.18, respectivamente.

4.13.1 Determinação do crescimento microbiano A glicosamina é um açúcar presente na parede celular dos fungos, no ergoesterol e no açúcar total. Para avaliação do crescimento microbiano foi seguida a metodologia descrita por Blix (1948); Sakurai, Lee e Shiota (1977). Este método divide-se em quatro etapas: extração, neutralização, acetilação e condensação. Foram adicionados 2 mL de solução de ácido sulfúrico a 70% nas amostras contendo 0,5g de meio fermentado referente a cada ponto de fermentação (0, 24, 48, 72 e 96 horas) e permaneceram por 24 horas nesta solução para promover a digestão das amostras. Em seguida, foram diluídas em 5 mL de água destilada e autoclavadas por 1 hora a 1atm. Posteriormente foram filtradas quantitativamente em papel de filtro J.Prolab®.

O filtrado foi neutralizado com hidróxido de sódio 5N até alcançar pH 7, em seguida avolumados para 100mL em balão volumétrico. Para a realização da etapa de acetilação, foi retirado 1mL da solução neutralizada, adicionados 1mL da acetilacetona e submetidas a fervura por 20 minutos. Em seguida, procedeu-se a etapa de condensação, através da adição de 5 mL de etanol seguido imediatamente de 1mL da solução de p-dimetilaminobenzaldeido e mais 5mL de etanol, agitando vigorosamente com o vortex até completa dissolução do condensado formado. Após 45 minutos de reação, realizou-se a leitura de absorvância em espectrofotômetro a 530nm e para a construção da curva padrão utilizou-se glicosamina em água (ANEXO C).

4.14 Determinação da Atividade Lipásica

A atividade lipásica do extrato bruto foi determinada pelo método titulométrico, segundo o procedimento descrito por Pereira et al. (2001), com pequenas modificações.

Para a determinação da atividade lipásica foi preparada uma emulsão constituída por água e óleo de oliva extra-virgem Borges® na proporção de 1:1 e 7% de goma arábica. Desta emulsão, foram adicionados 5mL em frascos de vidro, juntamente com 4 mL de tampão citrato 0,05M pH 4,0 (ANEXO D) e 1mL do extrato bruto de cada ensaio, separadamente. As amostras foram mantidas em banho Maria, sob agitação a 100 rpm a 35ºC por 15 minutos, para condução da reação de hidrólise (Figura 6).

Após este período, a reação foi interrompida com a adição de 10 mL de uma solução 1:1:1 v/v de acetona/etanol/água. Os ácidos graxos liberados durante a reação foram então quantificados em titulador automático com NaOH 0,05N até pH final de 11,0. As amostras foram preparadas em triplicata e como controle foram preparados brancos em duplicata, nos quais 1mL do extrato enzimático foi adicionado somente no momento da titulação. Uma unidade de atividade lipásica foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1mol de ácidos graxos por minuto, sob as condições de ensaio padrão. O valor da atividade lipásica em U/mL foi calculado conforme a equação 1 descrita a seguir:

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A = (Va – Vb) . N .1000 Vext . t Onde: A = atividade lipásica (U/mL) Va = volume de solução de NaOH 0,05 N, de fator de correção conhecido, gasto para titular os ácidos graxos da reação enzimática (mL) Vb = volume de solução de NaOH 0,05 N, de fator de correção conhecido, gasto para titular os ácidos graxos presentes no branco da amostra (controle) N = normalidade da solução de NaOH Vext = volume do extrato enzimático usado na reação (mL) = 1mL t = tempo de reação (minutos) = 15 min.

Após calculada a atividade lipásica em U/mL, foi feito o cálculo da atividade em U/g de massa seca (U/gms), considerado-se a massa seca e a umidade do meio fermentado (ANEXO E). 4.15 Determinação de Proteínas Totais

A determinação da concentração de proteína no extrato bruto foi realizada por método colorimétrico conforme metodologia descrita por Lowry et al. (1951). Este método baseia-se na produção de um composto azul formado a partir da reação entre o reagente Folin-Ciocalteu e o complexo cobre-proteína. Os dados de absorvância foram medidos utilizando espectrofotômetro a 660 nm e albumina de soro bovino (BSA) foi utilizada como padrão de proteína, para a construção da curva de calibração (ANEXO F). 4.16 Determinação da Umidade

A umidade das amostras do meio de cultivo foi realizada antes da fermentação e determinada por gravimetria, através da perda de água sofrida até atingir peso constante conforme equação 2.

Umidade % = massa inicial (g) - massa final (g) x 100 (Eq. 2) massa inicial

(Eq. 1)

A B

Figura 6. Meio reacional (A), reação de hidrólise em banho Maria a 35°C com agitação (B).

36

4.17 Atividade Lipásica Específica Aparente

A atividade lipásica específica aparente (U/g de proteína) foi calculada pela razão entre os resultados de atividade lipásica U/mL e concentração de proteínas g/mL (Equação 3).

Atividade específica aparente = Atividade enzimática (U/mL) (Eq. 3)

Concentração de proteína (g/mL) 4.18 Determinação da Atividade Proteásica

A determinação da atividade proteásica no extrato enzimático tem grande influência na

atividade lipásica final, pois as proteases podem hidrolisar as lipases. A determinação da atividade das enzimas proteolíticas foi realizada conforme

metodologia descrita por Charney e Tomarelli (1947). O método baseia-se na formação de derivados corados em meio alcalino, a partir da digestão de uma solução de azocaseína. A mistura reacional foi constituída por 0,5 mL de solução 0,5% de azocaseína em tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0 e 0,5 mL do extrato enzimático. Após 40 min de reação a 37°C, foi adicionado 0,5 mL de ácido tricloroacético (TCA), como agente de precipitação.

Após a precipitação, a amostra foi centrifugada a 2000 rpm por 10 min a 10°C, para precipitação de sólidos em suspensão. Em seguida, foi recolhido 1 mL do sobrenadante e adicionado a 1 mL de solução hidróxido de sódio (KOH) 5 N, para formação do composto cromóforo. Para cada amostra foi feito um branco utilizando-se extrato enzimático inativado em banho-maria a 100ºC por 20 min. A atividade enzimática foi expressa pela diferença de absorvância entre os ensaios com preparados enzimáticos e os seus respectivos brancos, medida a 428 nm, em espectrofotômetro da marca Biospecto modelo SP-220. Toda a análise foi feita em duplicata e a atividade proteásica foi expressa em U/mL. Uma unidade de atividade proteásica foi definida como a quantidade de enzima que produz uma diferença de 0,01 de absorvância por minuto de reação entre o branco reacional e a amostra nas condições de ensaio. 4.19 Concentração do Extrato Enzimático 4.19.1 Precipitação com sulfato de amônio

Com o objetivo de verificar o efeito do processo de precipitação por sulfato de amônio sobre a atividade lipásica, foram realizadas quatro condições de saturação (40, 60, 80 e 90%) e após a avaliação da melhor condição, foi realizada a caracterização bioquímica com a amostra concentrada. Para o processo de precipitação por sulfato de amônio seguiu-se a metodologia descrita por Englard e Seifter (1990).

A volumes de 30 a 60 mL do extrato enzimático bruto foram adicionadas, lentamente, quantidades determinadas de sulfato de amônio, sob agitação a 20°C, até obter as saturações pretendidas. Em seguida, as amostras foram mantidas refrigeradas over night. Decorrido este tempo, as amostras foram centrifugadas a 4500 rpm a 4°C por 20 minutos. O sobrenadante foi removido, e o precipitado ressuspendido em 5-10mL de tampão fosfato de sódio pH 7,0. Em seguida, as amostras (precipitado e sobrenadante) de cada tratamento foram submetidas à dessalinização por processo de diálise a 4°C por 24h com trocas sucessivas de tampão. Após a diálise, o volume final foi medido, e as análises de atividade lipásica e proteína total foram realizadas. A eficiência do processo de precipitação com sulfato de amônio foi avaliada pela

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recuperação da atividade enzimática (RA) e pelo fator de purificação (FP), dados pelas equações 4 e 5, respectivamente (BIAZUS et al., 2006; SANTOS, 2001; TOLEDO et al., 2007).

4.19.2 Concentração por liofilização

A concentração do extrato enzimático bruto por liofilização foi realizada em liofilizador sob vácuo 1,5 x10 -3 torr, a -55°C. Para este processo foi utilizado 480 mL de extrato enzimático, o qual foi concentrado em 6,4 vezes. Após a concentração por aproximadamente 24 horas, entretanto, não foi realizada de forma contínua, o volume final foi medido, e a análise de atividade lipásica e proteína total foram realizadas. A amostra liofilizada foi utilizada para os testes de especificidade em diferentes óleos. 4.20 Caracterização Bioquímica da Lipase

Toda a caracterização bioquímica, exceto as análises de especificidade, foram realizadas com extrato enzimático concentrado por precipitação com sulfato de amônio a 90% de saturação, conforme descrito no item 4.19.1.

4.20.1 Determinação da temperatura e pH ótimos

Para a determinação da temperatura e pH ótimos da lipase, foi realizado um delineamento composto central rotacional (DCCR 22) para duas variáveis independentes, sendo elas: temperatura e pH em cinco níveis de valores conforme apresentado na Tabela 13. Foram realizados oito ensaios e quatro pontos centrais (9, 10, 11 e 12) (Tabela 14).

A atividade lipásica foi determinada conforme metodologia descrita anteriormente, substituindo apenas os valores da temperatura de reação e do pH das soluções tampões pelos valores apresentados na Tabela 14. Para os valores de pH de 3 a 5,6 utilizou-se tampão citrato de sódio 0,05M (ANEXO D), e para os valores de 7,3 e 8,0 foi utilizado tampão fosfato de sódio 0,1M (ANEXO B). As análises dos resultados foram feitas utilizando-se o software Statistica versão 6.0, considerando 5% de significância.

RA = Atividade enzimática total do concentrado x 100 Atividade enzimática total da amostra

FP = Atividade enzimática específica do concentrado x 100 Atividade enzimática específica da amostra

(Eq. 4)

(Eq. 5)

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Tabela 13. Níveis e variáveis estudadas no delineamento composto central rotacional (DCCR 22) para avaliação da temperatura e pH ótimos da lipase de A. niger.

Variáveis

Níveis

-1,41 -1 0 1 1,41 Temperatura (°C) 30 37 55 73 80

pH 3 3,6 5,6 7,3 8 Tabela 14. Matriz do delineamento composto central rotacional 22 com seus níveis codificados e reais para avaliação da temperatura e pH ótimos da lipase de A. niger.

Variáveis Ensaios Temperatura (°C) pH

1 -1(37) -1 (3,6) 2 +1(73) -1 (3,6) 3 -1 (37) +1 (7,3) 4 +1 (73) +1 (7,3) 5 -1,41 (30) 0 (5,6) 6 +1,41 (80) 0 (5,6) 7 0 (55) -1,41 (3,0) 8 0 (55) +1,41 (8,0)

9* 0 (55) 0 (5,6) 10* 0 (55) 0 (5,6) 11* 0 (55) 0 (5,6) 12* 0 (55) 0 (5,6)

*Pontos centrais 4.20.2 Determinação da termoestabilidade

A investigação do efeito desnaturante da temperatura sobre a enzima foi realizada incubando-se, em banho Maria, 30mL de extrato enzimático a temperaturas de 30°C, 40°C, 50°C e 60°C. Em intervalos de 2h, 4h, 6h, 24h e 30h, alíquotas foram retiradas e a atividade residual da lipase foi mensurada, conforme descrito anteriormente. 4.20.3 Determinação da estabilidade ao pH

A investigação do efeito desnaturante do pH sobre a enzima foi realizada incubando-se o extrato enzimático em banho Maria a 20°C. O extrato foi diluído na relação 1:2 enzima:tampão, com tampões de diferentes valores de pH. As soluções tampões utilizadas foram: tampão citrato de sódio 0,05M para os valores de pH: 3,0; 4,0 e 5,0 e tampão fosfato de sódio 0,1M para pH 6,0; 7,0 e 8,0. Em intervalos de 2h, 4h, 6h, 24h e 30h, alíquotas foram retiradas e a atividade residual da lipase foi mensurada. 4.20.4 Determinação da estabilidade a estocagem

Para avaliar a estabilidade da lipase a estocagem, o extrato enzimático foi mantido em geladeira a 5°C e em freezer a -18ºC, por 150 dias. Alíquotas foram retiradas em intervalos de 3, 6, 15, 30, 60, 90, 120 e 150 dias, e análises de atividade residual da lipase foram realizadas.

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Para a estabilidade a temperatura de congelamento foram considerados intervalos a partir de 30 dias de estocagem. 4.20.5 Perfil de ácidos graxos de diferentes óleos e especificidade enzimática 4.20.5.1 Composição dos óleos

Foram obtidos no comércio local três óleos com características distintas, a saber: óleo de oliva extra virgem ®Borges, óleo de girassol ®Liza e óleo de coco extra virgem ®Copra.

Os óleos foram caracterizados quanto a composição em ácidos graxos. Os ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) de cada substrato foram preparados de acordo com o método descrito por Hartman e Lago (1973) e analisado por cromatografia em fase gasosa em equipamento Agilent Technologies modelo 6890 N, equipado com detector de ionização por chama, operado a 280ºC. Utilizou-se coluna capilar de sílica fundida de filme de cianopropilsiloxano (60m x 0,32mm x 0,25m). Realizou-se a identificação por comparação dos tempos de retenção com os padrões da NU-CHEK PREP, Inc. (Elysian, MN). 4.20.5.2 Especificidade

A especificidade das lipases é fator crucial na determinação de suas aplicações industriais. A capacidade de atuarem seletivamente sobre seus substratos depende da fonte da enzima (CASTRO et al., 2004), do tamanho da cadeia carbônica ou do grau de insaturação do grupo acil em questão (GUPTA, GUPTA e RATHI, 2004).

Após a caracterização do perfil em ácidos graxos de cada óleo, realizou-se os testes de especificidade do extrato enzimático liofilizado.

A hidrólise enzimática foi conduzida conforme descrito no item 4.14 e realizadas 4 repetições em triplicata. A taxa de hidrólise para cada óleo foi calculada conforme a equação 6.

% de ácidos graxos livres = N* (Va – Vb) * f *100 *100 A* (d*v)/V Onde: N = normalidade da solução de NaOH (0,05) Va = volume de solução de NaOH 0,05 N gasto para titular os ácidos graxos da reação enzimática (mL) Vb = volume de solução de NaOH 0,05 N, gasto para titular os ácidos graxos presentes no branco da amostra (controle) f = fator de conversão do ácido oléico (28,2) A = alíquota utilizada na titulação d = densidade do óleo (0,9) v = volume de óleo utilizado no preparo da emulsão V = volume final da emulsão 4.21 Estatística

Os planejamentos experimentais foram avaliados com 90% de confiança através do programa Statistica 6.0. No planejamento de Plackett & Burman avaliou-se os efeitos das variáveis e no delineamento fatorial completo utilizou-se a análise de variância (ANOVA).

(Eq. 6)

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Foi utilizado o teste de comparação de médias (Tukey) para identificar se houve diferenças significativas ao nível de 90% de confiabilidade, entre as três distintas borras alcalinas e na ausência de indutor através do programa Sisvar, versão 5.3.

O delineamento composto central rotacional (DCCR 22) utilizado para a determinação da temperatura e pH ótimos da lipase foi avaliado com 95% de confiabilidade através da análise de variância (ANOVA).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Avaliação do Teor de Óleo Presente no Farelo de Trigo Utilizado como Matéria-prima para a FES. Vários resíduos agroindustriais tem sido utilizados como substrato/suporte para a produção de enzimas, entre eles destaca-se o farelo de trigo.

Verificou-se a presença de 3,55% (±0,92) de óleo no farelo de trigo, que podem agir como indutores para a produção da lipase. O resultado obtido no presente trabalho é próximo aos encontrados por outros autores, 3,34% (HENZ et al., 2009) e 2,8% (FRANCO, 2007). Schuber et al. (2012) utilizaram farelo de trigo fornecido pela Bunge alimentos, como substrato para a produção de β-galactosidase em FES. Os autores realizaram a composição físico-química do farelo e verificaram a presença de 61,15% de carboidratos, 17,32% de proteínas, 4,3% de cinzas, 45,3% de fibra bruta e 4,29% de lipídeo, este último é próximo ao valor encontrado no presente trabalho. 5.2 Estudo da Produção de Lipase

Os experimentos conduzidos para produção de lipases buscaram determinar condições de meio e de processo que pudessem melhorar os níveis de atividade da enzima. Primeiramente, foram feitos estudos de seleção de variáveis (5.2.1) e em seguida, com as variáveis que demonstraram ser significativas para o processo foi realizado um planejamento fatorial completo, visando aumentar os níveis de atividade de lipase (5.2.2). 5.2.1 Planejamento de Plackett & Burman

O planejamento experimental de Plackett & Burman foi utilizado com o objetivo de selecionar as variáveis que influenciam de forma significativa a produção de lipases. Foram estudadas quatro variáveis de processo: concentração de inóculo, concentração de fontes lipídicas, volumes de solução de sulfato de amônio (VSSA) e aeração, como descrito no item 4.11.1.

O nível de umidade do meio é um fator importantíssimo para a FES, pois é preciso conter água livre suficiente para permitir o crescimento do microrganismo. Os volumes de solução de sulfato de amônio adicionados ao meio (40, 60 e 80 mL), propiciaram diferentes porcentagens de umidade, fator comumente testado na FES. A concentração do indutor também é de suma importância, pois as enzimas que são produzidas de forma induzida necessitam de quantidades adequadas de indutores.

No planejamento de Plackett & Burman avaliou-se os efeitos das variáveis sobre a produção da enzima, com 90% de confiabilidade. Este nível de confiança foi utilizado devido a heterogeneidade do meio de produção (em virtude de no processo fermentativo no estado sólido existir heterogeneidade do meio de produção), além de falta de sensibilidade no

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controle de aeração e umidade nas colunas aeradas que foram utilizadas. Os resultados de atividade lipásica (U/g de massa seca) e de atividade específica aparente (U/g de proteína) obtidos utilizando-se os indutores óleo de oliva comercial e borra de milho podem ser observados na Tabela 15.

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Tabela 15. Matriz do planejamento experimental de Plackett & Burman com seus níveis codificados e reais e com as respostas de atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína) para os indutores óleo de oliva e borra de milho, após 48h de fermentação.

Ativ. Lipásica

U/gms Ativ. Específica U/g

de proteína

Ensaios

Inóculo (esporos/g de meio) VSSA (mL) Aeração (vvm) Indutor (%)

Óleo de oliva

Borra de milho

Óleo de oliva

Borra de milho

1 +1(108) -1(40) +1(1,5) -1(0,5) 85 77 1373 1871 2 +1(108) +1(80) -1(0,5) +1(2,5) 129 99 2682 3831 3 -1(106) +1(80) +1(1,5) -1(0,5) 128 99 4205 2260 4 +1(108) -1(40) +1(1,5) +1(2,5) 109 129 2801 3155 5 +1(108) +1(80) -1(0,5) +1(2,5) 144 106 3801 2928 6 +1(108) +1(80) +1(1,5) -1(0,5) 172 176 4946 5345 7 -1(106) +1(80) +1(1,5) +1(2,5) 147 144 3808 4038 8 -1(106) -1(40) +1(1,5) +1(2,5) 108 79 2401 1661 9 -1(106) -1(40) -1(0,5) +1(2,5) 143 151 4789 3578

10 +1(108) -1(40) -1(0,5) -1(0,5) 161 139 3469 2578 11 -1(106) +1(80) -1(0,5) -1(0,5) 148 279 4275 7270 12 -1(106) -1(40) -1(0,5) -1(0,5) 92 277 2008 5194 13* 0(107) 0(60) 0(1,0) 0(1,5) 97 139 2671 2716 14* 0(107) 0(60) 0(1,0) 0(1,5) 113 128 3745 4048 15* 0(107) 0(60) 0(1,0) 0(1,5) 154 185 3740 4310

*Pontos centrais VSSA = volume de solução de sulfato de amônio

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Os níveis mais altos de atividade lipásica U/gms foram obtidos com a adição de borra de milho quando comparado ao uso do óleo de oliva (Tabela 15), além disso, os melhores resultados de atividade foram obtidos nas condições que utilizavam a menor concentração deste resíduo (0,5%).

Nos ensaios contendo borra de milho como fonte indutora, a maior atividade lipásica (279 U/gms) foi obtida no ensaio 11 (0,5% de borra; 0,5 vvm de aeração; 80 mL (VSSA) e 106 esporos/g de meio), enquanto que a menor atividade (77 U/gms) foi obtida no ensaio 1 (0,5% de borra; 1,5 vvm de aeração; 40mL (VSSA) e 108 esporos/g de meio).

Estes resultados indicam que quando se eleva a aeração (ensaio 11: 0,5 vvm; ensaio 1: 1,5 vvm) pode haver um ressecamento do meio, e consequente perda de umidade, principalmente nas condições em que o teor de umidade já é mais baixo, o que prejudica a fermentação para produção da enzima. Além disso, com base nestes resultados, o VSSA adicionado ao meio, aparentemente, possui efeito positivo, provavelmente, porque a aeração é inversamente proporcional a umidade no meio de cultivo ao longo do processo fermentativo.

A menor atividade específica aparente (1661 U/g de proteína) foi observada no ensaio 8 (2,5% de borra, 1,5 vvm de aeração, 40 mL (VSSA) e 106 esporos/g de meio), enquanto que a maior atividade específica aparente (7270 U/g de proteína) também foi observada no ensaio 11.

A análise estatística dos resultados obtidos de atividade enzimática e de atividade específica aparente indicou que as variáveis aeração e concentração de borra de milho foram significativas (p<0,1), de forma negativa para a atividade enzimática, enquanto que para a atividade específica, nenhuma variável influenciou de forma significativa o processo (Tabela 16). Entretanto, apesar de não significativo, a concentração de indutor, aeração e inóculo apresentaram efeitos negativos, corroborando com os resultados obtidos para atividade lipásica. Esses resultados indicaram que a borra pode estar agindo como indutor, porém, as menores concentrações, como por exemplo, 0,5%, são as mais indicadas para a obtenção de atividade lipásica. Como a borra é um resíduo do refino de óleos, pode haver a presença de inibidores/contaminantes neste material, que em concentrações um pouco mais altas de borra (2,5%) estejam inibindo a síntese da enzima. Além disso, a presença da borra pode alterar a transferência de massa no meio, um dos principais problemas encontrados para a FES.

Santos (2012) concluiu que a produção de lipase de A. niger mutante em FES por 72 h na presença de 3,0% de borra de girassol, a atividade lipásica (201,8 U/gms) foi significativamente maior (p< 0,1), quando comparado a ausência de indutor (182,35 U/gms). Neste caso, níveis mais elevados de borra (3%) contribuíram para a elevação da atividade lipásica.

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Tabela 16. Estimativa dos efeitos de atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína) utilizando borra de milho como fonte indutora para a produção de lipase de A. niger por FES.

Atividade Lipásica (U/gms) Indutor Borra de milho

Efeitos Desvio padrão t(10) p Média* 147,45 13,11 11,25 5,35509E-07

(1) Inóculo -50,42 29,31 -1,72 0,1162 (2) VSSA 8,68 29,31 0,30 0,7731

(3) Aeração* -57,92 29,31 -1,98 0,0764 (4) Indutor* -56,72 29,31 -1,93 0,0818

Atividade Específica Aparente (U/g de proteína) Efeitos Desvio padrão t(10) p

Média* 3652,37 347,24 10,52 9,98344-07 (1) Inóculo -715,45 776,44 -0,92 0,3785 (2) VSSA 1272,42 776,44 1,64 0,1323

(3) Aeração -1174,88 776,44 -1,51 0,1612 (4) Indutor -887,85 776,44 -1,14 0,2795

* Fatores estatisticamente significativos (90% confiança). Nos ensaios contendo óleo de oliva como fonte indutora, a maior atividade lipásica

(172 U/gms) foi obtida no ensaio 6 (0,5% de óleo; 1,5 vvm de aeração; 80mL (VSSA) e 108 esporos/g de meio), enquanto que a menor atividade (85 U/gms) foi obtida no ensaio 1 (0,5% de óleo; 1,5 vvm de aeração; 40mL (VSSA) e 108 esporos/g de meio). ´

A menor atividade específica aparente (1373 U/g de proteína) foi observada no ensaio 1, enquanto que a maior (4946 U/g de proteína) foi observada no ensaio 6, corroborando os resultados obtidos para atividade lipásica.

Analisando-se os resultados obtidos, pode-se verificar que o aumento do volume de sulfato de amônio (VSSA) (comparação entre os ensaios 1 e 6) foi crucial para o aumento das atividades lipásica e específica aparente. Esta interpretação foi corroborada pela análise estatística, por meio da qual a variável VSSA mostrou ser significativa (p< 0,10) de forma positiva, tanto para atividade específica como para a atividade enzimática (Tabela 17). Em contrapartida, as variáveis aeração e concentração de óleo de oliva não tiveram nenhuma influência significativa para a produção de lipase. Entretanto, os efeitos dessas últimas variáveis foram negativos, apesar de não significativos, para a produção de lipase, assim como ocorreu na produção da enzima contendo borra de milho (Tabela 16).

Resultados similares foram obtidos por Kamini et al. (1998) que estudaram diferentes fontes lipídicas para a produção de lipases por Aspergillus niger, e constataram que a adição de óleo de oliva não influenciou significativamente o processo de produção de lipases.

Martins et al. (2008) produziram lipase de A. fumigatus em colunas aeradas em FES por 120 horas de fermentação. Foi utilizado óleo de soja como fonte de carbono adicional e obtiveram atividade lipásica igual a 119,46 U/gms, valores inferiores aos obtidos no presente trabalho.

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Tabela 17. Estimativa dos efeitos de atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína) utilizando óleo de oliva como fonte indutora para a produção de lipase de A. niger por FES.

Atividade Lipásica (U/gms) Indutor Óleo de oliva

Efeitos Desvio padrão t(10) p Média* 128,81 6,89 18,70 4,14284E-09

(1) Inóculo 5,57 15,40 0,36 0,7254 (2) VSSA* 28,40 15,40 1,84 0,0950 (3) Aeração -11,30 15,40 -0,73 0,4801 (4) Indutor -1,03 15,40 -0,07 0,9478

Atividade Específica Aparente (U/g de proteína) Efeitos Desvio padrão t(10) p

Média* 3381,05 259,94 13,01 1,3643E-07 (1) Inóculo -402,68 581,24 -0,69 0,5042 (2) VSSA* 1145,98 581,24 1,97 0,0769 (3) Aeração -248,38 581,24 -0,43 0,6782 (4) Indutor 1,15 581,24 0,00 0,9985

* Fatores estatisticamente significativos (90% confiança). VSSA = volume de solução de sulfato de amônio

As matérias- primas são responsáveis por grande parte dos custos de produção de

enzimas, podendo chegar até 70% dos custos gerados. Portanto, a utilização de diferentes resíduos e/ou coprodutos, como a borra de milho, nos processos fermentativos contribuem para agregar valor a estes materiais; tornando os processos menos onerosos e contribuindo para a minimização da poluição ambiental, que poderia ser causada caso os mesmos não fossem adequadamente disponibilizados.

Os melhores resultados de atividade lipásica foram obtidos com a adição de borra de milho quando comparado com a adição de óleo de oliva (Tabela 15). Dessa forma, o resíduo da indústria de refino do óleo, que tem valor de mercado inferior ao óleo de oliva, pode ser empregado em baixas concentrações para produção de lipases. Por estes motivos, foi escolhida a borra de milho para dar continuidade aos experimentos de melhoramento da produção de lipase, através do delineamento fatorial completo 22 com os níveis mais baixos (0,0; 0,5;1,0) tanto para aeração (vvm) como para a concentração de indutor (%).

5.2.2 Primeiro delineamento fatorial completo

Para alcançar as melhores condições da produção de lipases foi utilizado o delineamento fatorial completo com as variáveis significativas selecionadas no item 5.2.1: concentração de borra de milho e aeração. Foram mantidos 60 mL de sol. de sulfato de amônio (VSSA) e 106 esporos/g de meio em todos os ensaios, pois foram variáveis que não influenciaram de forma significativa o processo, dessa forma manter a concentração de inóculo em 106 é mais viável técnica e economicamente que mantê-la em 108, o mesmo ocorre para o volume de solução de sulfato de amônio.

Como pode ser observado na Tabela 18, as maiores atividades lipásica (216 U/gms) e específica aparente (11392 U/g de proteína) foram obtidas no ensaio 4 (1,0% de borra, 1,0

46

vvm de aeração), enquanto que as menores atividades lipásica (81 U/gms) e específica (4352 U/g de proteína) foram obtidas no ensaio 3 (1,0% de borra e 0,0 vvm).

Tabela 18. Matriz para o delineamento fatorial completo 22 com seus níveis codificados e reais e com as respostas de atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína) para o indutor borra de milho, após 48h de fermentação.

*Pontos centrais. Baseado nos resultados obtidos, verificou-se que a presença da aeração no sistema é

importante para uma maior produção de lipase (comparação da variável entre o ensaio 3 e 4), enquanto a presença ou ausência de borra de milho não se mostrou fundamental para o processo (comparação entre todos os ensaios) (Tabela 18 e 19).

Na Tabela 19 estão representados os coeficientes de regressão e desvio padrão do primeiro planejamento fatorial completo (22), para a atividade lipásica e específica aparente. O coeficiente de correlação obtido para atividade lipásica foi de 0,92. Em relação à análise estatística dos resultados de atividade lipásica, a variável aeração e a sua interação com a concentração de indutor foram estatisticamente significativas (p<0,1) de forma positiva a um nível de confiança de 90%, enquanto o efeito das variáveis principais e sua interação não foram significativas para a atividade específica (Tabela 19). Estes dados corroboram a discussão feita nos parágrafos anteriores, com base nos dados reais de atividade obtidos.

Ensaios Aeração (vvm) Concentração de borra de

milho (%) Ativ. Lipásica

U/gms

Ativ. Específica Aparente U/g de

proteína

1 -1(0,0) -1(0,0) 176 7318 2 +1(1,0) -1(0,0) 189 7637 3 -1(0,0) +1(1,0) 81 4352 4 +1(1,0) +1(1,0) 216 11392

5* 0(0,5) 0(0,5) 137 5522 6* 0(0,5) 0(0,5) 170 5241 7* 0(0,5) 0(0,5) 170 5907

47

Tabela 19. Coeficiente de regressão e desvio padrão do primeiro planejamento fatorial completo (22), para a atividade lipásica (U/gms) e específica aparente (U/g de proteína).

Atividade Lipásica (U/gms) Coeficiente de

regressão Desvio padrão t(3) p Média/Inter.* 162,5 6,14 26,48 0,000118 (1)Aeracão* 37,05 8,12 4,56 0,019719

(2)Concentração -17,05 8,12 -2,10 0,126494 1 x 2* 30,4 8,12 3,75 0,033222

Atividade Específica Aparente (U/g de proteína) Coeficiente de

regressão Desvio padrão t(3) p Média/Inter.* 6767 613,93 11,02 0,001599 (1) Aeração 1839,7 812,15 2,27 0,108401

(2) Concentração 197,45 812,15 0,24 0,823587 1 x 2 1680,15 812,15 2,07 0,130395

* Variáveis estatisticamente significativas (90% confiança).

A fim de verificar se o modelo estatístico obtido é adequado para descrever os dados e construir a curva de contorno e superfície de resposta pertinente a produção da lipase, foi realizada a análise de variância (ANOVA) conforme apresentado na Tabela 20.

Tabela 20. Análise de variância do primeiro delineamento fatorial completo 22 para atividade lipásica de A. niger.

F tabelado (2;4) = 4,32; R2= 0,929.

Com os resultados da ANOVA (Tabela 18) verificou-se que o F calculado (9,41) para a regressão foi maior que o F tabelado (4,32), portanto, validou-se o (p<0,1) modelo e pôde-se obter a equação de segunda ordem (equação 7) que representa a atividade lipásica U/gms em relação aos valores concentração do indutor e aeração.

Atividade lipásica U/gms = 162,5+37,05A + 30,4A*C (Eq.7)

Onde: A = aeração C = concentração do indutor

Como o modelo definido para a atividade lipásica foi validado, pôde-se construir a

curva de contorno em função das variáveis: concentração de indutor e aeração (Figura 7).

Fonte de Variação

Soma dos Quadrados

Graus de Liberdade

Quadrado Médio F calculado

Regressão 9187,45 2 4593,725 9,41 Resíduos 1953,39 4 488,3475

Total 11140,84 6

48

Figura 7. Curva de contorno para atividade lipásica U/gms

Analisando-se a curva de contorno do planejamento fatorial completo (Figura 7),

pode-se verificar que as maiores atividades lipásicas foram obtidas em níveis superiores de aeração e concentração de borra de milho. Portanto, dentre as condições estudadas, a melhor condição para a produção de lipase de A. niger em FES foi observada no ensaio 4 (106 de inóculo; 1 vvm de aeração; 1% de borra e 60 mL de sol. de sulfato de sódio) com atividade lipásica de 216 U/gms. Entretanto, o ensaio 2 (106 de inóculo; 1 vvm de aeração; 60 mL de sol. de sulfato de sódio e sem adição de borra) também apresentou uma atividade lipásica elevada (189 U/gms), sugerindo que a presença de borra possa ser dispensável. Além disso, resultados obtidos revelaram a presença de aproximadamente 3,55% de lipídeos no farelo de trigo, substrato utilizado para a produção de lipase, dessa forma, pode ter ocorrido a indução da produção de lipase, mesmo na ausência de borra, causada pela presença destes lipídeos do farelo.

Com base nos resultados obtidos no planejamento de Plackett & Burman (5.2.1) e no de planejamento fatorial completo (5.2.2), provavelmente, o melhor valor de atividade deve estar entre 1,0 e 1,5 vvm de aeração e 1 a 2% de borra, no entanto, em virtude do equipamento rotâmetro que estabelece o volume de ar por volume de meio por minuto, não possuir sensibilidade que possibilite avaliar valores dentro desta faixa, a condição de ensaio 4 do planejamento fatorial completo foi utilizada nos próximos experimentos a serem detalhados nos itens 5.3; 5.4 e 5.5.

Para fins informativos e comparativos, na Tabela 21 estão apresentados os resultados de atividade lipásica (U/mL) do primeiro delineamento fatorial completo, onde a maior atividade obtida foi de 47 U/mL.

49

Tabela 21. Atividade lipásica (U/mL) dos ensaios do primeiro fatorial completo. *Pontos centrais

Resultados superiores foram encontrados no presente trabalho (47 U/mL) (Tabela 21), quando comparado com outros autores (CASTILHO et al., 2000; GOMES e FREIRE, 2012; SALIHU et al., 2011; POKORNY, CIMERMAN e STEINER, 1997; DUTRA et al., 2008), cujos trabalhos serão detalhados a seguir:

Castilho et al. (2000) compararam a produção de lipases fúngicas de Penicillium restrictum por FES (torta de babaçu e 2 % óleo de oliva) e por FS (peptona de carne, extrato de leveduras e óleo de oliva). Os autores verificaram uma menor atividade lipolítica na FES (5,8 U/mL em 24 h) em relação à FS (17 U/mL em 64 h), mas com níveis de produtividades semelhantes na FES (0,24 U/mL/h) e na FS (0,26 U/mL/h).

Gomes e Freire (2012) realizaram um estudo com objetivo de avaliar as condições de cultivo, em fermentação submersa para a produção de lipases pelo fungo Penicillium restrictum, tendo o seguinte meio (p/v): peptona de carne 2,0%; extrato de levedura 0,1%; óleo de oliva 1,0%; NaCl 0,5%; pH 5,5. O óleo de oliva (fonte de carbono) foi substituído por triacilgliceróis, ácidos graxos e Tween 80, enquanto a peptona (fonte de nitrogênio) foi substituída por milhocina. Os experimentos foram realizados a 30°C em frascos agitados. Os pesquisadores observaram que o óleo de milho foi a melhor fonte de carbono (C/N=5,0), resultando em 24 U.mL-1; 3,5 U.mg-1; 0,333 U.mL-1.h-1 (atividade lipásica máxima, rendimento específico e produtividade, respectivamente). A milhocina (fonte de nitrogênio) não apresentou bons níveis de atividade lipásica.

Salihu et al. (2011) produziram lipase de Candida cylindracea em fermentação submersa (FS) utilizando o efluente da indústria de óleo de palma como um dos meios de fermentação. Os autores obtiveram atividade máxima de 20,26 U/mL.

Pokorny, Cimerman e Steiner (1997) utilizaram Aspergillus niger MZKI Al 16 para produzir enzimas lipolíticas em fermentação submersa (FS). A produção de lipase foi induzida pela adição de azeite a um meio complexo com um pH inicial de 5,0. Atividade máxima (5,0 U/mL) foi atingida após 70 h, em biorreator a 30°C. Dutra et al. (2008) produziu lipase de A. niger mutante 11T53A14 em FES por 96 horas utilizando óleo de mamona e farelo de trigo e obtiveram atividade inferior (23,7 U/mL) a encontrada no presente trabalho (Tabela 21). 5.2.3 Segundo delineamento fatorial completo

Um segundo delineamento fatorial completo foi realizado com o intuito de confirmar os resultados obtidos no primeiro planejamento fatorial, pois foi necessário utilizar um novo

Ensaios Ativ. Lipásica U/mL

1 37 2 40 3 17 4 47

5* 30 6* 36 7* 36

50

lote de borra de milho para o desenvolvimento da tese. Além disso, os resultados que serão abordados a seguir foram obtidos em um outro laboratório, com outros equipamentos, dessa forma, apesar dos resultados terem seguido a mesma tendência do primeiro fatorial completo, sabe-se que o ideal é manter as condições de análise idênticas para que se tenha reprodutibilidade e repetibilidade dos resultados.

Os resultados obtidos revelaram que a maior atividade lipásica (330 U/gms) e específica aparente (6362 U/g de proteína) foram obtidas novamente no ensaio 4 (1,0% de borra, 1,0 vvm de aeração, 60mL de SSA e 106 esporos/g de meio), enquanto que a menor atividade lipásica (4,7 U/gms) foi obtida no ensaio 1 (sem adição de borra e sem aeração) (Tabela 22). Entretanto, durante a fermentação, a coluna que continha o meio referente ao ensaio 1 apresentou um vazamento e encheu-se de água, isso explicaria a baixa atividade lipásica encontrada (4,7 U/gms). Apesar do problema apresentado no ensaio 1, o resultado mais importante para o trabalho, que se trata da maior produção da enzima, foi a confirmação de que o ensaio 4 (1,0% de borra, 1,0 vvm de aeração) com valores de atividade ainda maiores (330 U/gms) que no primeiro fatorial completo (216 U/gms), manteve-se como a melhor condição experimental. Dessa forma, a tendência de produção de lipase de A. niger encontrada em ambos os delineamentos fatoriais completos (primeiro e segundo) foram similares. Apesar de ambos os delineamentos terem apresentado a mesma tendência, ou seja, o ensaio 4 com a maior atividade lipásica, achou-se prudente realizar um terceiro delineamento fatorial completo, entretanto, os resultados obtidos nos pontos centrais foram muito díspares, não apresentando correlação adequada entre os dados, dessa forma, não foram apresentados no presente trabalho. Tabela 22. Matriz para o segundo delineamento fatorial completo 22 com seus níveis codificados e reais e com as respostas de atividade lipásica U/gms e específica aparente U/g de proteína para o indutor borra de milho, após 48h de fermentação.

*Pontos centrais 5.3 Produção de Lipases com Distintas Borras alcalinas

Com o intuito de avaliar a capacidade de outras borras induzirem a produção de lipase, foram realizados ensaios utilizando-se as borras de girassol e canola, além da própria borra de milho utilizada no segundo fatorial completo. Ensaios na ausência de indutor também foram realizados. A idéia de se testar esta condição surgiu com base nos resultados obtidos no planejamento fatorial completo (5.2.2), que mostraram que a concentração do indutor, na faixa estudada (0; 0,5 e 1,0), não foi significativa para produção da lipase. Além disso, foram

Ensaios Aeração (vvm) Concentração de borra

de milho (%) Ativ. Lipásica

U/g massa seca

Ativ. Específica Aparente U/g de

proteína 1 -1(0,0) -1(0,0) 4,7 687 2 +1(1,0) -1(0,0) 190 4952 3 -1(0,0) +1(1,0) 171 3028 4 +1(1,0) +1(1,0) 330 6362

5* 0(0,5) 0(0,5) 133 2582 6* 0(0,5) 0(0,5) 141 2808 7* 0(0,5) 0(0,5) 196 3364

51

obtidos valores elevados de atividade lipásica (189 U/gms) (Tabela 18) mesmo na ausência de indutor.

A condição de processo selecionada como a mais produtiva no planejamento fatorial (5.2.2) foi mantida para esta etapa do trabalho. Nesta condição, as variáveis concentração de inóculo, aeração, concentração de indutor e VSSA, a saber:106 esporos por grama de meio; 1 vvm de aeração; 1% de borra e 60 mL de SSA, respectivamente, foram mantidas constantes, exceto pelo ensaio que não continha borra, no qual não havia a presença do indutor. Os experimentos foram conduzidos por 48 horas e realizadas 4 repetições em triplicata, para cada uma das condições testadas.

Os valores de atividades lipásicas U/gms, atividade específica aparente U/g de proteína e das atividades proteásicas U/mL, e suas respectivas médias estão apresentados na (Tabela 23). Tabela 23. Médias da produção de lipase em 48 h utilizando as diferentes borras de refino de óleo e os resultados do Teste de Tukey.

INDUTORES Atividade

lipásica U/gms* Atividade específica

aparente U/g de proteína* Atividade proteásica

U/mL* Sem borra 254,4a 7570,7a 7,3a

Borra de girassol 221,8ab 6357,0bc 6,9a Borra de canola 216,1ab 6603,9b 6,8a Borra de milho 191,9b 5558,7c 7,8a

Diferença mínima significativa DMS: 40,23

DMS: 916,3 DMS: 1,29

*Valores médios de 4 repetições em triplicata. Letras diferentes na mesma coluna são significativamente diferentes (p<0,1).

Verificou-se que a maior atividade lipásica (254 U/gms) foi obtida na ausência do

indutor, entretanto, quando comparado com a adição de borra de canola (216 U/gms) e de borra de girassol (222 U/gms), não houve diferenças significativas entre os resultados. Entretanto, quando comparado com a adição de borra de milho (192 U/gms), a atividade na ausência de indutor foi significativamente maior (p<0,1).

Para a atividade específica aparente foram obtidas atividades significativamente maiores (p<0,1) (7571 U/g de proteína) para a condição de ausência de indutor, quando comparado com a adição de borra de girassol (6357 U/g de proteína), canola (6604 U/g de proteína) e de milho (5559 U/g de proteína). Não houve diferenças significativas (p<0,1) entre as atividades proteásicas na ausência (7,3 U/mL) e na presença de indutores: borra de milho (7,8 U/mL), borra de girassol (6,9 U/mL) e borra de canola (6,8 U/mL).

Os dados obtidos indicaram que todas as borras testadas tem potencial para serem utilizadas como indutoras, uma vez que possibilitaram a obtenção de resultados próximos quando comparados com as atividades na ausência de borra. Entretanto, verificou-se que elas são dispensáveis ao processo de obtenção da lipase com o microrganismo utilizado, A. niger e nas condições avaliadas no presente trabalho. Fato este animador, uma vez que torna ainda menos onerosa a obtenção da enzima.

Sugere-se que a quantidade de lipídeos (3,55%) encontrada no farelo de trigo, uma das matérias-primas da fermentação (item 5.1), tenha sido suficiente para agir como indutor da produção de lipase, mesmo não sendo este lipídeo tão disponível quanto aquele que está presente quando a borra é adicionada ao meio de cultivo (Tabela 8).

Uma outra hipótese, é que com o passar do tempo, as borras possam sofrer uma série de reações químicas e, consequentemente, alterações de textura e composição de nutrientes.

52

Esta hipótese, explicaria em parte os resultados obtidos nos planejamentos (itens 5.2.2 e 5.2.3) por terem sido melhores com a borra de milho do lote mais recente, e em fermentações posteriores a sua presença ter sido dispensável (item 5.3).

Santos (2012) realizou a caracterização das borras utilizadas no presente trabalho e obteve os seguintes resultados (Tabela 8): a borra de girassol apresentou o maior teor de resíduo de sabão (47,5%), seguido da borra de canola (39,3%) e de milho (31,8%). A borra de girassol apresentou maior teor de sódio (2,8%). Segundo relato de Damaso et al. (2008) a presença de cátions é fator benéfico para o crescimento fúngico e, consequentemente, produção da enzima.

Segundo Mag, Green e Kwong, (1983) dentre os inúmeros componentes que compõem as borras alcalinas, de 5-30% é constituído por lipídeos e desse material, a maior parte (60-70%) está na forma de sabões de sódio de ácidos graxos.

As borras de girassol e de milho apresentaram predominância nos ácidos graxos linoléico (42,6% e 42,7%, respectivamente) e oléico (33,2% e 37,4%, respectivamente), já a borra de canola apresentou predominância dos ácidos graxos oléico (57,19%), seguido pelo linoléico (12,0%) e por último o palmítico (6,6%). De acordo com Wang, Xu e Shan (2008), o ácido graxo linoléico proporciona aumento na atividade lipásica, a qual pode ser significativamente maior na presença do ácido oléico.

Resultados de caracterização das borras alcalinas obtidos por Santos (2012) descrito no item 4.8, pouco explica os resultados obtidos no presente trabalho, uma vez que a melhor condição foi na ausência de borra, contradizendo os resultados obtidos por este autor, que estudou a produção de lipase de A. niger 11T53A14, uma linhagem mutante, com três borras distintas: milho, canola e girassol, além da ausência de borra e verificou que a maior atividade lipásica (201,81 U/gms) (p< 0,1) foi obtida na presença de 3% de borra de girassol.

A produção de lipases em FES utilizando resíduos gerados no refino de óleos vegetais foi relatado por Navarro et al. (2011). As lipases foram produzidas por um consórcio microbiano obtido a partir de uma mistura de lamas de águas residuais e estudadas em meio contendo resíduos sólidos industriais ricos em gorduras, em condições termofílicas, com temperatura acima de 45°C por 35 dias. Os autores observaram que em 14 dias de fermentação obtiveram 120 U/gms, resultados inferiores aos obtidos no presente trabalho e após este período houve um decréscimo de atividade.

Contesini et al. (2009) estudou a produção de lipase de A. niger em FES e obteve atividade de 33,03 U/g, resultados estes, inferiores aos obtidos no presente trabalho.

Dantas e Aquino (2010) obtiveram máxima atividade enzimática de 25 U/g empregando torta de babaçu e 20 U/g empregando borra de café, resultados estes, menores que os obtidos no presente trabalho. Palma et al. (2000) estudaram a produção de lipases de Penicillium restrictum por (FES) e constataram que a maior atividade lipásica (27,8 U/g) foi obtida com torta de babaçu enriquecido com peptona. Resultados superiores foram obtidos no presente trabalho com a utilização de borras oriundas do refino de óleos.

Colla et al. (2010), estudaram a produção de lipases de Aspergillus sp. em FES e em FS com o objetivo de comparar os resultados de processo. Resultados obtidos pelos autores revelaram que a atividade lipolítica máxima obtida na FS foi de 4,52 U, enquanto que na FES foi de 25,07 U.

Damaso et al. (2008) utilizaram diferentes fontes indutoras para a produção de lipases de Arpergillus niger mutante 11T53A14 em fermentação semi-sólida. Segundo os autores, os melhores resultados foram obtidos com a utilização de borra de milho e estearina, atingindo valores de 62,7 e 37,7 U/g, respectivamente.

Mala et al. (2007) estudaram diferentes combinações de indutores para a produção de lipases de Arpergillus niger em fermentação semi-sólida. Segundo os autores, a associação de

53

farelo de trigo e de resíduo agroindustrial torta do óleo de gergelim na proporção 3:1, umedecidos com água, possibilitou a obtenção de atividade lipásica de 384 U/g.

Mahanta, Gupta e Khare (2008) estudaram a produção de lipase de Pseudomonas aeruginosa em FES por 120 h, utilizando como substrato torta de semente de pinhão manso com 50% de umidade. Os autores encontraram valores elevados de atividade lipásica (625 U/gms).

5.4 Cinética de Produção da Lipase Utilizando Borra de Canola e na Ausência de Indutor

A cinética foi realizada com o intuito de identificar o tempo ótimo da produção de lipase de A. niger e de maior produtividade, nas condições melhoradas obtidas no planejamento fatorial completo 22 (106 de inóculo; 1 vvm de aeração e 60 mL de SSA). O estudo foi conduzido na ausência de borra, pois com base nos resultados obtidos no item 5.3, a borra é dispensável para o processo de obtenção da enzima. Além disso, foi realizada a cinética contendo 1% de borra de canola, pois apesar de apresentar atividades inferiores aos ensaios na ausência de borra, a diferença entre os valores de atividade obtidos não foi significativa (p<0,1) (Tabela 23).

A borra de canola apresentou uma atividade inferior (216 U/gms) quando comparada com a borra de girassol (221 U/gms), entretanto, a diferença não foi significativa (p<0,1) (Tabela 23). Dessa forma, escolheu-se a borra de canola para realizar a cinética de produção, principalmente devido à borra de girassol ter apresentado mudanças visíveis de textura e de cor durante a estocagem. Portanto, como a borra de canola estava com suas características mais próximas das originais e com atividade lipásica semelhante a borra de girassol, achou-se mais prudente utilizá-la para este teste.

Nas Figuras 8 e 9 podem ser observados os valores de atividade lipásica (U/gms) e glicosamina (mg/gms) na ausência de borra e na presença de borra de canola respectivamente, em função do tempo de fermentação.

Utilizou-se a quantificação de glicosamina para determinar a estimativa de biomassa presente no meio. Esta análise baseia-se na medição do n-acetil-D-glicosamina, que é o monômero da quitina, um polissacarídeo presente na parede celular dos fungos.

Observando-se a Figura 8, verificou-se que o crescimento máximo do fungo ocorreu em aproximadamente 72 horas de fermentação, porém, apesar da maior atividade lipásica ter sido obtida com 72 horas de fermentação (218 U/gms) a maior produtividade foi observada com 48 horas de processo (4 U/gms.h). Como o comportamento da atividade lipásica e glicosamina foram semelhantes, sugere-se que a produção da enzima seja associada ao crescimento de A. niger.

54

Figura 8. Perfil cinético da produção de lipase de A. niger em FES na ausência de borra. Este resultado é bastante animador, principalmente para produções futuras em larga escala onde poderão ser economizados energia e tempo de processo, pois em poucas horas de fermentação (48h) consegue-se a maior produtividade (4 U/gms.h) na obtenção de lipase, com elevada atividade na ausência de borra (192 U/gms). Além disso, coincidentemente, a produção da enzima foi realizada desde o início do trabalho com 48 horas de fermentação, pois foi observado que a linhagem de A. niger utilizada no presente trabalho crescia rapidamente neste intervalo de tempo. Com o estudo de cinética, ficou confirmado que 48 h trata-se do melhor tempo para avaliação do processo, com o microrganismo em questão. Comparando os resultados obtidos no presente trabalho com os resultados de outros autores (Tabela 5), pode-se observar que a atividade lipásica de A. niger (192 U/gms) e produtividade (4 U/gms.h) foram superiores a maioria dos resultados obtidos pelos autores; 24,6 U/gms e 0,25 U/gms.h (DANTAS e AQUINO, 2010); 62,7U/gms e 1,3 U/gms.h (DAMASO et al., 2008) e 25,07 U e 0,26 U/gms.h (COLLA et al., 2010). Este resultado torna o uso da espécie de A. niger estudada no presente trabalho extremamente atrativa, pois em tempo reduzido de fermentação (48 h) valores elevados de atividade lipásica foram observados, consequentemente, menor gasto com energia foi despendido. O perfil cinético da fermentação na presença de 1% de borra de canola apresentado na Figura 9 foi semelhante ao perfil encontrado na ausência de borra. A maior produtividade foi observada também com 48 horas (3,75 U/gms.h), com uma atividade lipásica de 181 U/gms. Como o comportamento da atividade lipásica e glicosamina foram semelhantes, sugere-se que a produção também seja associada ao crescimento de A. niger.

55

Figura 9. Perfil cinético da produção de lipase de A. niger em FES na presença de 1% de borra de canola.

Além da cinética, foi realizado o acompanhamento da produção de proteases durante a produção de lipase de A. niger na ausência de borra de canola e na presença de 1% deste indutor. As proteases possuem a capacidade de hidrolisar proteínas, o que pode acarretar na diminuição da estabilidade das enzimas com o decorrer do tempo. Na Figura 10, podem ser observados os resultados de protease expressos em U/mL, ao longo do estudo cinético.

Figura 10. Perfil cinético da produção de protease no extrato enzimático em FES na presença de 1% de borra de canola e sem indutor.

Verificou-se que o perfil de produção de protease foi aumentando proporcionalmente

ao tempo de fermentação, tanto na ausência de borra quanto na presença de borra de canola (Figura 10). Ao contrário do observado para a atividade lipásica, onde ocorreu uma queda com 96 horas de fermentação (Figuras 8 e 9).

Foi observado que com 48 horas de fermentação, tempo de maior produtividade, a atividade proteásica foi menor do que no tempo de 72 horas, tanto na presença de borra, quanto na ausência de indutor. Foram observados valores de aproximadamente 6 U/mL na

56

presença de borra de canola e 4 U/mL, na ausência de borra. Portanto, a fermentação na ausência de borra gera melhores resultados para manter a atividade lipásica, uma vez que quanto maior a quantidade de protease maior o risco desta enzima hidrolisar a lipase.

5.5 Concentração do Extrato Enzimático

A purificação de lipases tem, em geral, dois objetivos básicos: obtenção da enzima virtualmente pura, para melhor estudo de suas características bioquímicas e de sua estrutura e obtenção de um produto com maior atividade específica (unidades de atividade/mg de proteína) para aplicação em diversos processos. Entretanto, processos de purificação costumam elevar consideravelmente o preço do produto final. Normalmente os protocolos de purificação de enzimas microbianas extracelulares são separados em duas etapas: pré-purificação e purificação por métodos cromatográficos (PALEKAR, VASUDEVAN e YAN, 2000).

O extrato enzimático foi submetido à concentração/pré-purificação através da técnica de precipitação por sulfato de amônio em quatro condições de saturação: 40, 60, 80 e 90%. Adicionalmente, a técnica de liofilização também foi avaliada para concentração da lipase. Os resultados obtidos podem ser observados na Tabela 24. Tabela 24. Avaliação da recuperação enzimática e do fator de purificação obtidos para a técnica de concentração por precipitação com sulfato de amônio a 40, 60, 80 e 90% de saturação e pela técnica de liofilização.

*Os resultados são médias de 2 repetições. 1 Calculada pela razão entre atividade enzimática U/mL pela massa de proteína. 2 Calculado conforme equação 4, item (4.19.1) 3Calculado conforme equação 5, item (4.19.1)

Analisando os resultados de atividade lipásica U/mL, o maior valor obtido (47 U/mL)

foi a 90% de saturação, nesta condição foi observada também a melhor taxa de recuperação (38 %) (Tabela 24 e Figura 11).

Tratamento

Atividade Lipásica U/mL

Atividade Específica U/g de proteína1

Recuperação % (RA)2

Fator de Purificação (FP)3

40% 14 71323 18 1,8 60% 38 9662 26 2,5 80% 40 4901 31 1,2 90% 47 5423 38 1,3

Liofilização 94 2158 61 -

57

Figura 11. Atividade lipásica (U/mL) dos sobrenadantes e do precipitado para as condições de 40, 60, 80 e 90% de saturação.

Com 60% de saturação, observou-se maior atividade específica (9662 U/g de proteína)

e maior fator de recuperação (2,52). A alta atividade específica foi devido a baixa concentração de proteína total no precipitado uma vez que foi encontrado também alta atividade específica no sobrenadante (Figura 12). Este resultado é bastante favorável quando se pretende purificar a enzima, porém, para a caracterização bioquímica da lipase optou-se em usar o precipitado obtido a 90% de saturação. Além disso, as Figuras 11 e 12 mostram que a concentração em 60% parece não ter sido eficiente, pois muita enzima ainda ficou no sobrenadante, principalmente em termos de atividade específica (Figura 11). Com base nos resultados obtidos, verificou-se que a concentração por sulfato de amônio a 90% foi a melhor condição.

Figura 12. Atividade específica U/g de proteína dos sobrenadantes e do precipitado para as condições de 40, 60, 80 e 90% de saturação.

A liofilização aparentemente foi a melhor técnica, pois obteve-se uma alta recuperação

da enzima (61 %) e alta atividade lipásica (94 U/mL). Entretanto, não houve um aumento proporcional da atividade enzimática (4,0 vezes) em relação a diminuição do volume, que foi de 6,4 vezes. Provavelmente, nas etapas de congelamento e descongelamento do extrato

58

durante a liofilização, que não foi feita de forma contínua, possa ter contribuído com a perda de atividade. A técnica de liofilização tem a finalidade de apenas concentrar e não pré-purificar a enzima. Como pode ser observado na Tabela 24, o resultado de atividade específica do extrato enzimático liofilizado foi inferior aos resultados obtidos com a técnica de precipitação com sulfato de amônio.

Mhetras, Bastawde e Gokhale (2009) realizaram a pré-purificação de lipase de Aspergillus niger NCIM 1207 por precipitação com sulfato de amônio a 90% e posterior purificação por cromatografia em gel. Na etapa de pré-purificação os autores obtiveram atividade específica de 39,47 U/mg de proteína de e recuperação de 99,05% e ao final da purificação observou atividade de 1373.13 U/mg de proteína e recuperação final de 54%.

Pastore et al. (2003) realizaram a precipitação de lipase de Rhizopus sp. com 70% de saturação e alcançaram 103 U/mg de proteína. Abbas et al. (2002) realizaram a precipitação de lipases de Mucor sp. com 75% de saturação e observaram 129 U/mg de proteína.

Benjamin e Pandey (2001) realizaram a precipitação de lipase de Candida rugosa de 20% a 100% de saturação com sulfato de amônio e obtiveram 3,88 U/mg de proteína.

5.6 Caracterização Bioquímica da Lipase 5.6.1 Determinação da temperatura e pH ótimos

O estudo das propriedades bioquímicas das enzimas é de suma importância para conhecer as particularidades de atuação enzimática e destina-la a aplicação industrial mais adequada. O conhecimento da temperatura e pH ótimo é uma das primeiras características a serem investigadas para poder contribuir com o sucesso dos bioprocessos.

No presente trabalho foi utilizado delineamento composto central rotacional (DCCR 22) para determinação concomitante da temperatura e pH ótimos da lipase de A. niger. Os resultados podem ser observados na Tabela 25.

Tabela 25. Matriz do delineamento composto central rotacional 22 com seus níveis codificados e reais da avaliação da temperatura e pH ótimos na atividade lipásica de A. niger.

Variáveis Ensaios Temperatura (°C) pH Atividade Lipásica U/mL

1 -1(37) -1 (3,6) 35 2 +1(73) -1 (3,6) 13 3 -1 (37) +1 (7,3) 27 4 +1 (73) +1 (7,3) 0,5 5 -1,41 (30) 0 (5,6) 34 6 +1,41 (80) 0 (5,6) 0,8 7 0 (55) -1,41 (3,0) 31 8 0 (55) +1,41 (8,0) 5,0 9* 0 (55) 0 (5,6) 29

10* 0 (55) 0 (5,6) 28 11* 0 (55) 0 (5,6) 29 12* 0 (55) 0 (5,6) 29

*Pontos centrais

59

Os dados de atividade lipásica foram inseridos no programa computacional Statistica e os resultados dos coeficientes de regressão e desvio padrão com 5% de significância estão apresentados na Tabela 26.

Tabela 26. Coeficientes de regressão e desvios padrão do planejamento fatorial composto central rotacional 22 da avaliação da temperatura e pH ótimos na atividade lipásica (U/mL) de A. niger.

* Fatores estatisticamente significativos (95% confiança). Os resultados obtidos revelaram que todas as variáveis, exceto a interação entre pH e

temperatura, foram significativas de forma negativa a um nível de confiança de 95% (Tabela 26). Através da análise de variância (ANOVA), conforme apresentado na Tabela 27, obteve-se um F calculado (72,3) 24,4 vezes maior que o F tabelado (F = 2,96), portanto, validou-se estatisticamente o modelo (p<0,05) e permitiu a construção da curva de contorno (Figura 13). Tabela 27. Análise de variância da temperatura e pH ótimos na atividade lipásica de A. niger.

Fonte de Variação

Soma dos Quadrados

Graus de Liberdade

Quadrado Médio F calculado

Regressão 1840,28 4 460,07 72,33 Resíduo 44,52 7 6,36

Total 1884,8 11 F tabelado (4;7) = 2,96; R2 = 0,980

Figura 13. Curva de contorno para a atividade lipásica de A. niger em função das variáveis temperatura e pH.

Coeficiente de regressão

Erro Padrão t(6) p

Média* 28,84652 1,242859 23,20981 4,19E-07 (1) Temperatura (L)* -11,9221 0,880152 -13,5455 1E-05 Temperatura (Q)* -5,33117 0,98668 -5,40314 0,001659 (2) pH (L)* -7,24464 0,880152 -8,23112 0,000174 pH (Q)* -5,08747 0,98668 -5,15615 0,002103 1L x 2L -1,3645 1,24287 -1,09786 0,314357

60

O coeficiente de correlação obtido para este planejamento foi de 0,980. Após a validação do modelo através da ANOVA, pôde-se obter o modelo de segunda ordem (equação 8) que representa a atividade lipásica em relação aos valores de temperatura e pH.

Ativ. (U/ml) = 28,84652-11,9221T-5,33117T2 -7,24464pH-5,08747pH2 Eq. (8) De posse do modelo de segunda ordem (Eq. 8), foi possível calcular a temperatura e o

pH ótimos como sendo, respectivamente, 36°C e 4,0. Após a obtenção dos resultados, foi realizada a repetição do ponto ótimo e de outros pontos selecionados aleatoriamente dentro da região ótima do delineamento (Figura 13). Com base nos resultados obtidos, foi possível confirmar a obtenção de resultados máximos de atividade dentro da região ótima encontrada.

Os valores de temperatura e pH ótimos obtidos são praticamente iguais aos que foram utilizados ao longo de todo o trabalho (35 oC e 4,0), portanto, optou-se por continuar a usar esses valores, por estarem dentro da região de ótimo, além da vantagem em saber que todas as determinações já estudadas foram realizadas dentro desta região. Os resultados obtidos indicaram que a enzima de A. niger apresenta caráter ácido.

Nas condições estudadas, a lipase de A. niger apresentou ótimo de atividade na faixa de pH entre 3,0 e 5,6 e temperatura entre 30 e 55°C (Figura 13). Portanto, apresentou um perfil de acordo com o esperado para enzimas mesofílicas. Resultados semelhantes foram obtidos no trabalho de Vici et al. (2011), no qual a melhor faixa de temperatura foi entre 40° e 55°C e em pH de 3,0 a 6,0.

Alguns autores relatam que a maior parte dos estudos relacionados a atividade ótima de lipases se encontra na faixa de 30 a 65°C (GAUR, GUPTA e KHARE, 2008; BACHA et al., 2005), dados que corroboram com o presente trabalho.

Ülker e Karaoglu (2012) verificaram que o pH e temperatura ótimos de lipase purificada de Mucor f. Corticola foi de 7,0 e 40°C respectivamente, resultados próximos, porém com espécies diferentes, foram reportados por Shu, Yang e Yan (2007), (pH=7,0 e 40°C) para lipase de A. niger purificada pelas técnicas de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de troca aniônica e cromatografia de filtração em gel, neste caso, a enzima apresentou melhor perfil de atividade em pH dentro da neutralidade.

Menoncin et al. (2010) estudaram lipase de Penicillium verrucosum e verificaram que a enzima pré-purificada através da técnica de precipitação por sulfato de amônio (60% de saturação) apresentou condições ótimas a 42ºC e pH 8,5.

Rajesh et al. (2010) reportaram que a lipase de Trichoderma reesei parcialmente purificada por precipitação com sulfato de amônio, apresentou atividade ótima a pH 5,0 e temperatura de 50°C.

Com estes dados, foi possível corroborar informações de outros autores de que as lipases, mesmo dentro da classe de fungos filamentosos, tem diferentes faixas de temperatura e pH ótimos de atuação.

5.6.2 Determinação da termoestabilidade

A termoestabilidade é uma das características requeridas para as enzimas com aplicação industrial, visto que muitos processos utilizam faixas extremas de temperatura (JAEGER e REETZ, 1998). Os resultados obtidos da termoestabilidade de A. niger podem ser observados na Figura 14.

61

Figura 14. Termoestabilidade da lipase de A. niger.

A lipase de A. niger apresentou perfis semelhantes nas temperaturas de 30, 40 e 50°C, embora na maior temperatura tenha ocorrido uma perda de atividade mais pronunciada nas primeiras quatro horas de incubação. A atividade residual após 30 h de incubação nas referidas temperaturas foi de cerca de 40%. Na temperatura de 60°C a enzima perdeu 97% de sua atividade, portanto, verificou-se que temperaturas acima de 50°C causam uma inativação mais rápida da lipase. Segundo Sharma et al. (2001), a estabilidade térmica de muitas lipases pode ser melhorada na presença de alguns cátions como Ca2+, Na+ e por meio da utilização de técnicas de imobilização de enzimas. Dantas e Aquino (2010) relataram que a lipase bruta de A. niger obtida por FES obteve a maior atividade em temperatura de 30°C após 60 minutos de reação de hidrólise.

Ülker e Karaoglu (2012) estudaram a termoestabilidade de lipase purificada de Mucor hiemalis f. Corticola em temperaturas de 30 a 80°C e observaram que a enzima reteve 50% de atividade a 50°C por até 90 minutos de incubação. No entanto a 60 e 80°C a enzima perdeu completamente sua atividade, enquanto que Carvalho et al. (2005) concluiram que a lipase de Aspergillus niger liofilizada foi altamente termoestável, retendo 90% e 60% de atividade a 50°C e 60°C respectivamente após 1 hora de incubação.

Kamini, Mala e Puvanakrishnan (1998) estudaram a produção de lipases de A. niger, por fermentação no estado sólido (FES), e verificaram que a enzima bruta apresentou estabilidade máxima entre 4 e 50°C e 73,4% de atividade relativa a 60°C após uma hora de incubação. Resultados distintos foram encontrados neste trabalho. O que se observa é que a estabilidade destas enzimas varia entre os gêneros, as espécies e até entre isoformas produzidas por uma mesma cepa (LIMA et al., 2004).

5.6.3 Determinação da estabilidade ao pH

Os resultados obtidos durante a avaliação da estabilidade da lipase ao pH estão

apresentados na Figura 15.

62

Figura 15. Estabilidade da lipase de A. niger ao pH a 20°C

A lipase de A. niger manteve 62% da atividade inicial em 30 horas de incubação em

tampão citrato de sódio pH 5,0. Pôde-se observar que os perfis foram bastante semelhantes para todos os valores de pH testados, principalmente, a partir de 6 horas de incubação. Contudo, em até 30 horas a enzima apresentou estabilidade um pouco maior em valores de pH ácido: pH 3,0 (59%); pH 4,0 (55%) e pH 5,0 (62%).

Dheeman et al. (2011) relataram que a lipase pré-purificada de Bacillus sp, apresentou maior estabilidade em pH 5,0 e 37°C após 5 horas. Ülker e Karaoglu (2012) estudaram a estabilidade ao pH de lipase purificada de Mucor hiemalis f. Corticola em valores de pH de 5,0 a 11,0 e determinaram a atividade lipásica após 24 e 72 horas de incubação a 4°C. Os autores constataram que a lipase foi extremamente estável a todos os valores de pH testados por até 24 h, além disso, a lipase reteve 75% de atividade em pH de 7,0 a 9,0 por até 72 h de incubação a 4ºC.

Romero, Baigori e Pera (2007) avaliaram a estabilidade da lipase bruta de A. niger e verificaram que dentro da faixa de pH 7 a 10, a enzima manteve-se com 100% de atividade relativa após 1 hora a 37°C, resultados diferentes foram obtidos no presente trabalho. Dantas e Aquino (2010) relataram que a lipase bruta de A. niger obtida por FES obteve maior atividade em pH 2,0 após 60 minutos a 30°C. Sugere-se que a a lipase de A. niger estudada no presente trabalho, poderá ser aplicada em processos que utilizem faixas de pH relativamente ácidas, como por exemplo, maturação de queijos e em processos com temperaturas não superiores a 50°C. 5.6.4 Determinação da estabilidade a estocagem sob refrigeração e congelamento Uma etapa importante para se avaliar a capacidade da enzima manter sua atividade intacta ao longo do tempo consiste na estabilidade a estocagem. Este fator torna-se fundamental quando se deseja utilizar esta enzima em escala industrial.

Os resultados encontrados para a estabilidade da atividade lipásica sob armazenamento em geladeira (cerca de 5°C) durante 150 dias estão apresentados na Figura 16.

63

Figura 16. Estabilidade da lipase de A. niger a estocagem em geladeira a 5°C Pode-se observar que em até 15 dias de estocagem a 5°C, não houve grandes perdas de

atividade (24%), entretanto, com 30 dias a perda de atividade foi mais acentuada (47%) e a partir de 60 dias, a atividade lipásica foi sendo reduzida drasticamente, com perda de 94% após 150 dias de estocagem. Entretanto, após 150 dias sob temperatura de congelamento, a lipase reteve 100% de sua atividade inicial.

Portanto, a lipase de A. niger apresentou boa estabilidade a refrigeração por até 15 dias de estocagem a 5°C e por até 150 dias sob -18°C. Dessa forma, a lipase obtida no presente trabalho, deverá ser mantida em congelador para fins de uso comercial e/ou bancada.

Lazari (2010) verificou perda total da atividade lipásica do extrato bruto de lipase de S. thermophilum, após 1 dia a -20°C, resultados contrários aos obtidos no presente trabalho. Quando mantida em geladeira a atividade também decaiu rapidamente, retendo 50% do valor inicial em 7 dias.

Brígida (2010) verificou que o extrato bruto de lipase de Yarrowia lipolytica reteve 100% de sua atividade inicial após sete meses de estocagem a -10°C, e após 91 dias a lipase concentrada a 60% de Penicillium verrucosum reteve praticamente 100% de sua atividade inicial tanto a 4°C como a -10°C (MENONCIN et al., 2010).

As propriedades de estabilidade das enzimas podem variar significativamente, em função da origem ou mesmo entre isoformas produzidas por um mesmo microrganismo (LOPEZ et al., 2004). Estas variações também dependem das condições do ensaio, como tempo de incubação, pH e temperatura e do método utilizado, tornando, muitas vezes, a comparação difícil (CARVALHO et al., 2005). 5.7 Perfil de ácidos graxos de diferentes óleos e especificidade enzimática 5.7.1 Composição dos óleos

Segundo Castro et al. (2004) a especificidade das lipases é fator crucial na

determinação de suas aplicações industriais. Elas são divididas em três grupos baseados em sua especificidade: lipases não específicas, lipases 1,3 específicas e lipase ácido graxo específica. A capacidade de atuarem seletivamente sobre seus substratos depende da fonte da enzima (CASTRO et al., 2004), do tamanho da cadeia carbônica ou grau de insaturação do grupo acil em questão (GUPTA, GUPTA e RATHI, 2004).

64

Para a realização dos testes de especificidade, os óleos utilizados foram previamente caracterizados quanto à composição em ácidos graxos por cromatografia gasosa.

Como pode ser observado na Tabela 28, no óleo de coco predominam sequencialmente os ácidos graxos láurico (C12:0 - 50,28%); mirístico (C14:0 - 18,88%) e palmítico (C16:0 - 8,09%), outros ácidos graxos também foram encontrados, porém em percentagens menores. No óleo de girassol predominam os ácidos graxos linoléico (C18:2 - 56,21%); oléico (C18:1 - 32,13%) e palmítico (C16:0 - 6,15%). Já no óleo de oliva predominam ácidos graxos oléico (C 18:1 - 73,13%); palmítico (C16:0 – 12,20%) e linoléico (C18:2 - 8,64%). Portanto, o óleo de coco apresentou predominância dos ácidos graxos de cadeia média e nos óleos de girassol e oliva, predominam ácidos graxos de cadeia longa, sendo que estes dois últimos que apresentam altos teores de linoléico e oléico, respectivamente, são úteis para avaliar especificidade a estes ácidos graxos.

Os triacilgliceróis de cadeia média (TCM) são formados por ésteres de glicerol contendo ácidos graxos com 6 a 12 átomos de carbono e os triacilgriceróis de cadeia longa (TCL) contém ácidos graxos com mais de 12 átomos de carbono (LOPEZ; GARCIA e HILL, 2005).

Tabela 28. Perfil em ácidos graxos dos óleos de oliva, girassol e coco.

*Valores médios

5.7.2 Avaliação da especificidade da lipase de A. niger sob diferentes óleos vegetais

Uma enzima pode apresentar diferentes taxas de hidrólise sobre os triacilgliceróis,

principalmente quanto ao comprimento da cadeia e número de insaturações (JENSEN et al., 1983). No presente trabalho, foram obtidas as seguintes taxas de hidrólise: óleo de coco (40%), óleo de girassol (26%) e óleo de oliva (20%), resultantes de quatro repetições em triplicata, nas condições avaliadas.

Óleos vegetais OLIVA GIRASSOL COCO

Ácidos graxos Teor (%) C8:0 - - 7,06 C12:0 - - 50,28 C14:0 - 0,07 18,88 C16:0 12,2 6,15 8,09 C16:1 1,06 0,09 - C16:1t 0,12 - - C18:0 3,16 3,66 3,2 C18:1 73,13 32,13 5,02

C18:2 cis/trans - 0,09 - C18:2 8,64 56,21 0,86 C18:3 0,64 0,19 - C20:0 0,4 0,28 - C20:1 0,25 0,18 - C22:0 - 0,7 -

65

Para o teste de especificidade, a lipase de A. niger produzida em FES foi concentrada pela técnica de liofilização com o intuito de aumentar a atividade da enzima e poder elucidar a eficiência da hidrólise enzimática frente aos óleos de diferentes características. Os resultados obtidos podem ser observados na Figura 17.

Figura 17. Avaliação da atividade hidrolítica de lipase de A. niger liofilizada sobre diferentes óleos. Os resultados são médias de quatro repetições em triplicata.

O extrato enzimático liofilizado catalisou a hidrólise de todos os substratos utilizados, porém, a maior atividade lipásica (201 U/mL) e taxa de hidrólise (40%), foram obtidas com a utilização de óleo de coco, como pode ser observado na Figura 17. Resultados similares foram obtidos por Couri, Dutra e Damaso (2007), que observaram que a maior atividade lipásica de A. niger 11T53A14 foi obtida também com óleo de coco (193,2 U/g massa seca) e por Pastore, Costa e Koblitz (2003), que constataram que a lipase de Rhizopus sp. apresentou maior atividade hidrolítica sobre óleo de coco, indicando boa afinidade por ácidos graxos de cadeia média, como o láurico (C12:0). Além disso, deve se considerar a especificidade quanto à posição do ácido graxo no triacilglicerol. Óleos láuricos como óleo de coco (coconut oil) apresentam cerca de 50% de ácido láurico na composição em ácidos graxos, mas aproximadamente 80% deste ácido graxo na posição 2 do triacilglicerol, segundo Gunstone, Harwood e Padley (1994). É possível, portanto, que se trate de uma lipase 2 específica, com maior atividade por ácidos graxos saturados de cadeia média.

Diaz et al. (2006) verificaram que a lipase de R. homothallicus, um fungo termotolerante, apresentou máxima atividade sobre ésteres de cadeia média (C8:0).

Bradoo et al. (2002) avaliaram a atividade hidrolítica de lipase de Bacillus stearothermophilus SB-1 e Burkholderia cepacia RGP-10 em diferentes triacilgliceróis (C4:0 – C18:2), metil ésteres (C12:0 – C18:1) e segundo os autores, as lipases de ambas culturas apresentaram seletividade por alguns óleos ricos em ácidos graxos insaturados, bem como por triglicerídeos de cadeia média (C14:0) para B. stearothermophilus SB-1 e longa (C18:2) para B. cepacia RGP-10. Resultados similares foram obtidos para a lipase purificada de Aspergillus carneus, que apresentou preferência por triacilglicerídeos com ácidos graxos de cadeia média (C12:0) (SAXENA et al., 2003b).

A maioria dos fungos termofílicos estudados por Mateos et al. (2007) também apresentaram maior atividade sobre ésteres com cadeias de 6 a 8 carbonos, mostrando baixa atividade sobre substratos com cadeias curtas.

Ruiz et al. (2001) observaram que a lipase de Penicillium candidum mostrou maior atividade sobre ésteres de p-nitrofenila com cadeia entre 10 e 16 carbonos.

66

Outros fatores a considerar, no caso de extratos não imobilizados, são as condições de análise durante a hidrólise lipásica, já que a emulsificação é fundamental para o contato entre enzima e substrato, sendo mais favoráveis para óleos com ácidos graxos de menor comprimento de cadeia, em relação aos óleos com ácidos graxos de cadeia longa.

Segundo Jensen (1983) a especificidade das lipases depende de propriedades moleculares da enzima, estrutura do substrato e fatores que afetam a ligação entre a enzima e substrato.

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6 CONCLUSÕES

A melhor condição para a produção de lipase de Aspergillus niger em colunas aeradas por FES utilizando planejamento fatorial completo, foi observada com 1,0% de borra de milho, 1vvm de aeração, 106 esporos/g de meio e 60 mL de solução de sulfato de amônio, nessas condições obteve-se atividade lipásica em torno de 216 U/gms.

As borras de canola, milho e girassol, podem ser utilizadas como indutoras para a produção de lipase de A. niger em colunas aeradas por FES, entretanto, a presença das mesmas é dispensável para a produção da enzima nas condições estudadas. A maior atividade lipásica foi observada na ausência de borra, e na condição de processo de 1vvm de aeração, 60 mL de solução de sulfato de amônio (VSSA) e 106 esporos/g de meio, obtendo-se atividade em torno de 254 U/gms e produtividade de 5,3 U/gms.h.

A lipase de A. niger apresenta nível de atividade e de produtividade elevados quando comparados aos valores encontrados na literatura. Altos níveis de atividade foram observados em tempos reduzidos de fermentação (48 horas) e na presença, somente, de farelo de trigo, sem adição de indutor, dessa forma, reduzindo custos com o meio de produção.

A produção de lipase de A. niger ocorreu associada ao crescimento fúngico, e a maior produtividade (4 U/gms.h) foi observada com 48 horas de fermentação e atividade lipásica de aproximadamente 192 U/gms na ausência de borra. Os níveis da atividade proteásica foram menores (4 U/mL) quando comparados com os valores obtidos na presença de borra de canola (6 U/mL).

A concentração enzimática através da precipitação com sulfato de amônio, a 90% de saturação, foi a melhor condição observada. Foi obtido 47 U/mL de atividade e 38 % de recuperação enzimática.

A lipase de A. niger apresentou um perfil esperado para enzimas mesofílicas, com ótimo de atividade em pH de 3,0 a 5,6 e temperatura de 30°C a 55°C.

A lipase apresentou um perfil de termoestabilidade semelhante para as temperaturas de 30°, 40° e 50oC, retendo cerca de 42% de sua atividade inicial por até 30 horas de incubação. Embora o perfil de estabilidade ao pH, com os valores testados, também tenha sido semelhante, após 30 horas de incubação as maiores atividades lipásicas residuais foram observadas em pH ácido: pH 3,0 (59%); pH 4,0 (55%) e pH 5,0 (62%).

A enzima possui boa estabilidade em até 15 dias de estocagem a 5°C, retendo até 76% de sua atividade. Na temperatura de congelamento (-18°C) a lipase apresentou ótima estabilidade por até 150 dias, retendo 100% de sua atividade inicial.

Sugere-se que a enzima possua afinidade por ácidos graxos de cadeia média, obtendo maior atividade hidrolítica (201 U/mL), quando o substrato testado foi óleo de coco.

68

Sugere-se que a enzima poderá ser aplicada em processos que utilizem faixas de pH relativamente ácidas, como por exemplo, maturação de queijos que visa aprimorar o aroma do produto. Além disso, a enzima estudada no presente trabalho poderá ser utilizada em faixas de temperatura de até 50°C e poderá ser congelada por períodos de até 150 dias, sem perder sua atividade.

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7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Realizar estudo mais aprofundado da especificidade de lipase de Aspergillus niger, visando elucidar a afinidade pelo tamanho de cadeia e/ou saturação.

Realizar os testes de especificidade com maior variedade de óleos vegetais com diferentes características.

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ANEXOS

ANEXO A - Cálculo da Contagem de Esporos/g de meio

ANEXO B - Preparo de Solução Tampão Fosfato de Sódio 0,1M ANEXO C – Curva Padrão de Glicosamina

ANEXO D - Preparo de Solução Tampão Citrato de Sódio 0,05M ANEXO E - Cálculos para Transformação de Atividade em U/mL para Atividade em U/g massa seca (U/gms) ANEXO F - Curva Padrão de Proteína ANEXO G - Reagentes e seus Respectivos Fornecedores

ANEXO H - Equipamentos e seus Respectivos Fabricantes

88

ANEXO A - Cálculo da Contagem de Esporos/g de meio

Considerando-se que a câmara de Neubauer contém 25 quadrículos. Entre a câmara e a lamínula, forma-se um filme líquido da diluição preparada de 0,1 mm de espessura. A dimensão de cada quadrículo é de 0,2 mm x 0,2 mm, portanto o volume de cada quadrículo é de 4x 10-3 mm3, que multiplicado pelo número total de quadrículos (25) é igual a 10-4 cm3.

Figura 18. Câmara de Neubauer C = nº de esporos * D * 25*104

5

Onde: C= concentração de esporos/ mL D= diluição. nº de esporos = quantidade de esporos contados. V= m * Esporos

C

Onde: C= Concentração de esporos. Esporos = esporos/g de meio a ser inoculado. V= volume de extrato enzimático a ser inoculado.

89

ANEXO B - Preparo de Solução Tampão Fosfato de Sódio 0,1M

Solução (A): Solução fosfato de sódio monobásico 0,2M Solução (B): Solução fosfato de sódio dibásico 0,2M

90

ANEXO C – Curva Padrão de Glicosamina

Preparo de soluções para curva padrão de glicosamina (BLIX, 1948; SAKURAI, LEE e SHIOTA, 1977).

Solução-mãe (mL) Água destilada (mL)

Concentração final (mg/mL)

1 9 10 2 8 20 3 7 30 4 6 40 5 5 50 6 4 60 7 3 70 8 2 80 9 1 90

91

ANEXO D - Preparo de Solução Tampão Citrato de Sódio 0,05M

Solução (A): Solução ácido cítrico 0,1M Solução (B): Solução citrato de sódio 0,1M

92

ANEXO E - Cálculos para Transformação de Atividade em U/mL para Atividade em U/g massa seca (U/gms)

a) 40 g meio--------100%

x-----------------% umidade (meio inoculado) x = g meio úmido

b) 40 – x = W g meio seco

c) U/mL (atividade)----------------1 mL y-----------------------------------100 mL y= U em 100 mL de tampão (que são usados para 40 g de meio)

d) Y---------W g Z---------------------1g Z= U/g massa seca

93

ANEXO F - Curva Padrão de Proteína

Preparo de soluções para curva padrão de proteína utilizando soro albumina bovina (SBA) (LOWRY et al., 1951).

SOLUÇÃO MÃE (ML)

ÁGUA DESTILADA (ML)

CONCENTRAÇÃO FINAL (mg/L)

10 90 10

20 80 20

30 70 30

40 60 40

50 50 50

60 40 60

70 30 70

80 20 80

90 10 90

94

ANEXO G - Reagentes e seus Respectivos Fornecedores

Reagentes Fornecedores Acetona Isofar

Ácido acético Merck Ácido cítrico Grupo Química

Ácido clorídrico Isofar Ácido sulfúrico Vetec

Ácido tricloracético Carlo Erba Ágar-ágar Isofar

Azocaseína Sigma Biftalato de potássio (KOH) Isofar

Carbonato de sódio Isofar Citrato de sódio Merck

Cloreto de potássio (KCl) Vetec Etanol Vetec

Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) Vetec Fosfato de sódio dibásico (NaHPO4) Merck

Fosfato de sódio monobásico (Na2HPO4) Merck Fosfato dibásico de potássio (K2HPO4) Grupo Química

Goma arábica Vetec Hidróxido de potássio (KOH) Reagen Hidróxido de sódio (NaOH) Merck Nitrato de sódio (NaNO3) Reagen

Peptona de soja Himedia Soro Albumina (BSA) Sigma

Sulfato de amônio (NH4)2SO4 Vetec Sulfato de magnésio (MgSO4) Reagen

Sulfato de manganês (MnSO4H2O) Reagen Sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O) Reagen Sulfato ferroso (FeSO4.7H2O) Baker Chemical

Twen 80 Reagen

95

ANEXO H - Equipamentos e seus Respectivos Fabricantes

Equipamentos Fabricantes Modelo

Autoclave Prismatec _

Balança analítica Mettler AT201_

Banho Maria com agitação Precision ScientificCarl _

Banho Maria com circulação Marconi _

Bomba de vácuo Solab _

Cabine de controle biológico Nuaire 425-200 Câmara de Neubauer Boeco Germany _

Capela Scientech _

Centrífuga Sorvall _

Espectrofotômetro Biospectro SP 220

Estufa B.O.D. Fanem 347CDG

Estufa para secagem Ética _

Fluxo laminar Nuaire 425-200

Liofilizador Supermodulyo 220

Microscópio Zeiss Jena _

Mix Philips Walita _

Placas de agitação Nova Tecnica _

Potenciomêtro Analyser pH300M

Titulador automático Metrohm 794 basic titrino