EXTRAÇÃO DE DNA E RNAENZIMAS DE RESTRIÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINACENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICASLABORATÓRIO DE POLIMORFISMOS GENÉTICOS

Coleta de material biológico:

Quando?De quem?Como?Tratamentos?Quanto mais fresco melhor!Quantidade aceitávelBoa conservação

EPI!Contenção!

Extração de DNA

• Sangue• Tecidos• Células de cultura• Extração plasmídeos de células bacterianas• Purificação de DNA de gel• ...

1. Extração de DNA

De onde podemos extrair DNA?

Material de pacientes e controles - Lapoge

Sangue total

Buffy coats

Amostras de tecido

1. Extração de DNA

ObjetivosObjetivos?

Genotipagem?

Sequenciamento?

IntegridadePureza

Quantidade

PCR – tamanho?

Quantificação de RNA - Expressão?

1. Extração de DNA

1. Extração de DNA

Fundamentos

1. Lisar eritrócitos (choque osmótico)

2. Lisar leucócitos (detergentes)

3. Inativar DNAse (quelante -EDTA)

4. Precipitar/degradar proteínas (sais/proteinase)

5. Precipitar DNA (etanol)

6. Reidratação do DNA em água ou tampão

Principais Métodos

1.Fenol-Cloróformio

2.Salting-out

3. Kits com colunas

1. Extração de DNA

1. Lise I: eritrócitos

2. Lise II: leucócitos

3. Fenol-clorofórmio

4. Precipitação etanol

Fenol-Cloróformio

1. Extração de DNA

• Barato• Simples• Boa quantidade• Boa qualidade• Estabilidade do DNA

• Contaminação da amostra por fenol

• Reagentes tóxicos!

1. Extração de DNA

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962008000300002

Salting-out 1. Extração de DNA

BaratoSimplesBoa quantidadeBoa qualidadeNão tóxico

Estabilidade do DNA?Sais contaminantes

1. Extração de DNA

1. Extração de DNA Kits

MUITO SimplesBoa quantidadeBoa qualidadeNão tóxico

CaroEstabilidade do DNA

1. Extração de DNA

• Similar a extração de DNA• Protocolo bem mais cuidadoso• Molécula muito mais instável• Amostra pode ser bem conservado em TRIzol,

RNAlater, etc.) - snapshot• É preciso separá-la do DNA

2. Extração de RNA

Extração de RNA: Análises de expressão

• TRIzol• RNAlater• Kit com colunas

2. Extração de RNA

1. Lise I: eritrócitos

2. TRIzol (fenol-guanidina)

3. Clorofórmio

4. Precipitação etanol

TRIzol

Pode ser usado para extração de RNA, DNA e Proteínas!

Kit com colunas

Transcrição reversa

(Quebit)

(Nanodrop)

Espectrofotômetro - Nanodrop

260nm – DNA/RNA280nm – proteína, fenol,..230nm – contaminantes (carboidratos, fenol,..)

260/230 ~1,8260/230 ~2,0

Armazenar?

DNA: -20◦C

Estoque

Uso (diluído)

RNA: -80◦C

Enzimas de

restrição

• Endonucleases produzidas por bactérias para se defender de vírus.

• Quebram o DNA em fragmentos menores, não infecciosos.

• Reconhecem sítios específicos (sítios de restrição) no genoma e a corta.

• São conhecidos mais de 3000 enzimas

Enzima de restrição:

Enzima de restrição: tipos de clivagem

Fragmentação DNA!Clonagem!Genotipagem!...

RFPL: Polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição

Detecção dos polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs – single nucleotide polymorphisms).

Os primers utilizados na PCR flanqueiam a região que contém, ou não, o sítio de clivagem reconhecido pela enzima de restrição utilizada.

O produto da PCR é posteriormente submetido à ação da enzima de restrição.

Enzima de restrição: Detecção de SNPs

Enzima de restrição: como ocorre a clivagem

3´ CGTAAATCTATACGAGAATTCACGTACGTA5´5´ GCATTTAGATATGCTCTTAAGTGCATGCAT3´

3´ CGTAAATCTATACGAGTATTCACGTACGTA5´ 5´ GCATTTAGATATGCTCATAAGTGCATGCAT3´

2

1

2/21/22/2 1/21/12/2 1/1

2/2 1/2 1/1

Enzima de restrição: resultado da restrição