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TSH MTODO:

ELISA

FINALIDADE: Teste de ELISA para a determinao quantitativa de Tirotropina (TSH) em soro

humano. Para uso profissional. Somente para uso diagnstico in vitro.

SIGNIFICADO CLNICO: A Tirotropina (TSH) um hormnio glicoproteco de aproximadamente 28 kD,

secretado na glndula pituitria anterior. Ele considerado como o mais sensvel

indicador disponvel para o diagnstico do hipotireoidismo primrio e secundrio

(pituitrio) (1,2). Aumento na concentrao srica de TSH um indicador precoce e sensvel do decrscimo da reserva na tireide e em associao com o decrscimo de

T4 diagnstico do hipotireoidismo primrio. O aumento previsto em TSH

demonstra o clssico sistema de feedback negativo entre as glndulas pituitria e

tireide. Em adio, a determinao de TSH utilizada para diferenciao de

hipotireoidismo secundrio e tercirio da doena primria da tireide. Em hipotireoidismo secundrio e tercirio, concentraes de T4 esto geralmente baixas

e nveis de TSH esto geralmente baixos ou normais.

PRINCPIO: O teste TSH ELISA se baseia na tcnica clssica de ELISA sandwich. Como um teste

de segunda gerao, ele faz uso de um anticorpo monoclonal anti-TSH altamente

especfico que cobre a superfcie das cavidades das tiras de microtitulao. Na

primeira etapa de incubao, amostras, calibradores ou controles, e enzima conjugado (anticorpo anti-TSH peroxidase-marcado) so misturados para formar o

complexo sandwicch que ligado superfcie das cavidades pela interao com o

anticorpo imobilizado. No final da incubao, o excesso de enzima-conjugado

retirado por meio de lavagem. O reagente substrato adicionado (etapa 2) e a cor

resultante, que torna-se amarela aps a finalizao com a adio da Soluo STOP,

medida fotometricamente. A intensidade da cor diretamente proporcional concentrao de TSH na amostra.

A absorbncia dos calibradores e amostras determinada usando-se uma leitora de

placas ou tiras de ELISA ou um sistema automatizado ELISA (Linha Humareader ou

ELYSIS da Human). A concentrao avaliada por meio de uma curva de calibrao que estabelecida a partir dos calibradores fornecidos com o kit.

IDENTIFICAO E ARMAZENAMENTO:

Conservar entre 2-8C.

MIC 12 Tiras de Microtitulao (em suporte para tiras)

Tiras descartveis com 8 cavidades cobertas com anti-TSH (monoclonal

rato).

CAL 6 x 2 mL Calibradores de A - F _ Pronto para uso. Tampas

coloridas (A: branca, B: amarela, C: verde, D: vermelha, E: azul,

F: preta)

Calibradores (humanos) para TSH nas concentraes de 0,0 (A); 0,5 (B); 3,0 (C); 6,0 (D); 15,0 (E); 30,0 mUI/L (F) de TSH; sodium azide

0,95g/L. Conservantes.

Ver precaues.

CON 13 mL Enzima Conjugado _ tampa branca

pH 6,25 0,1 Pronto para uso, cor vermelha.

Anti-TSH (goat), HRP labelled. Conservantes.

WS 50 mL Soluo de lavagem _ tampa branca

pH 7,2 0,2

Concentrada para 1000 mL, Tris-Buffer 10 mmol/L, NaCl 8 g/L.

Conservantes.

SUB 13 mL Reagente Substrato _ tampa preta

pH 3,6 0,25 Pronto para uso

3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB) 1,2 mmol/L, Hidrogen Peroxide 6,0 mmol/L

STOP 15 mL Soluo Stop _ tampa vermelha

Sulphuric acid 0,5 mol/L

Tiras Adesivas

Conservantes: Concentrao total < 0,1%.

PADRONIZAO:

Os calibradores do kit foram padronizados contra o WHO 2nd IRP 80/558.

ESTABILIDADE: Os reagentes so estveis at o vencimento da data de validade descrita em seus

rtulos individuais quando armazenados entre 2-8C. Depois de abertos os

reagentes devem ser armazenados entre 2 e 8C e usados dentro de 60 dias (ver

nota).

NOTA:

Os reagentes so estveis at a data de validade impressa no rtulo, quando

armazenados entre 2 e 8C, mesmo depois de abertos. Entretanto a contaminao

est diretamente relacionada com o nmero de vezes que os reagentes so abertos

e utilizados. O limite de 60 dias depois do primeiro uso por razes de segurana. O manuseio cuidadoso dentro das Boas Prticas de Laboratrio oferece a oportunidade

de utilizao dos reagentes aps os 60 dias (Isto inclui: frascos bem tampados aps

o uso, tirar da geladeira somente o reagente que vai ser usado, solues estoque

devem ser colocadas de volta na geladeira quando no estiverem sendo usadas). Os

critrios de validao devero sempre ser encontrados.

TRANSPORTE:

O transporte do kit deve ser feito pela rota mais direta evitando-se as chegadas nos

finais de semana e feriados no local de destino. O kit no afetado pelo transporte desde que seja entregue ao destinatrio no perodo mximo de 07 dias e em uma

temperatura de at 37C.

TERMOS E CONDIES DE GARANTIA:

O fabricante garante a qualidade do produto, se este for armazenado como descrito

acima e em sua embalagem original.

PREPARO DOS REAGENTES:

Todos os reagentes devem estar a temperatura ambiente (15 a 25 C) antes do uso.

Reagentes no utilizados devem ser sempre armazenados entre 2 e 8 C.

Soluo de Lavagem de Uso WASH

Diluir a Soluo de lavagem concentrada WS 1 + 20 mL com gua recm destilada

ou deionizada em um recipiente adequado. Ex.: 50 mL de WS + 1000 mL = 1050

mL. Estabilidade: At 60 dias entre 15 e 25 C.

Tiras de Microtitulao MIC

As tiras so lacradas em uma bolsa de alumnio com dessecante.

Antes de serem abertas, as tiras devem ficar a temperatura ambiente. As tiras no

utilizadas devem retornar para a bolsa plstica com o dessecante. Manter o adesivo selante intacto. As tiras armazenadas desta maneira entre 2 e 8 C

podem ser usadas at o vencimento da data de validade impressa no rtulo de

caixa.

No tocar na borda superior ou no fundo das cavidades com os dedos.

AMOSTRA:

SORO. No usar amostras altamente lipmicas ou hemolisadas. Amostras podem ser armazenadas por 5 dias entre 2 e 8C, at 30 dias a - 20C. Congelar e descongelar somente uma vez. Amostras descongeladas devem ser homogeneizadas. Eliminar material em suspenso por centrifugao ou filtrao.

PRECAUES: No ingerir ou aspirar os reagentes. Evitar contato com a pele e as mucosas.

O produto contm derivados de fluido humano e foi testado para a presena de

HBsAg e anticorpos HCV e HIV apresentando resultados negativos. Apesar de terem

sido utilizados testes validados com alto grau de confiabilidade, nenhum deles pode assegurar que produtos que contenham derivados de fluidos humanos sejam

incapazes de provocar doenas. Portanto, os cuidados habituais de biossegurana

devem ser aplicados na manipulao desse produto.

Todo o material contendo amostras de pacientes ou controles deve ser inativado

por procedimentos validados (autoclavao ou tratamento qumico).

Para o descarte seguro dos reagentes e materiais biolgicos, sugerimos utilizar as

regulamentaes normativas locais, estaduais ou federais para a preservao

ambiental.

A Soluo Stop STOP contm cido sulfrico, manuse-la com cuidado porque

pode irritar os olhos e a pele. Em contato com os olhos enxaguar abundantemente e contatar um mdico.

MATERIAL NECESSRIO E NO FORNECIDO:

Cronmetro

Pipetas e ponteiras

Leitora de ELISA

Lavadora de ELISA

PROCEDIMENTOS:

Seguir os procedimentos exatamente como descritos.

Importante:

P1. No misturar ou usar componentes com nmero de lote diferente. No trocar a tampa dos frascos (risco de contaminao). No usar reagentes aps o vencimento

da data de validade.

P2. No usar reagentes que possam estar contaminados ou tenham a aparncia ou

cheiro diferente do usual.

P3. Marcar CAL, amostras e controles cuidadosamente na folha fornecida junto com

o kit.

P4. Selecionar o nmero necessrio de MIC, e coloca-las firmemente no suporte.

P5. Realizar duplicatas dos CAL, amostras e controles. Pipet-los no fundo da

cavidade.

P6. Adicionar sempre os reagentes na mesma ordem, cronometrando para

minimizar a diferena do tempo de reao entre as cavidades. Isto

importante para a reprodutibilidade dos resultados. A pipetagem das amostras no deve exceder a 10 minutos. Se o tempo for superior a 10 minutos, pipetar os

calibradores nas posies indicadas na metade do tempo da pipetagem das

amostras. Se mais de 1 placa for utilizada, realizar uma curva para cada placa.

P7. Evitar/remover bolhas de ar antes das incubaes e leitura de absorbncia.

P8. A adio da SUB inicia uma reao cintica, que finalizada pela adio da

STOP. Evitar luz forte durante o desenvolvimento de cor.

P9. Aps cada etapa de pipetagem homogeneizar as cavidade por 20-30

segundos, sem deixar derramar seu contedo (aspirar e dispensar o contedo da cavidade de 3 a 5 vezes utilizando a ponteira do ltimo reagente. Deve-se utilizar 1

ponteira para cada cavidade). Se possvel utilizar um mixer para placas de

microtitulao.

PROCEDIMENTO DE LAVAGEM:

O Procedimento de lavagem crtico. Como em qualquer teste de microtitulao

sensvel, leituras inconsistentes podem ser obtidas devido a lavagem inadequada.

Entretanto, importante aspirar completamente as cavidades antes de adicionar a Soluo de lavagem ou reagentes lquidos. Lavagem insuficiente resulta em pouca

preciso ou absorbncias falsamente elevadas.

L1: Aspirar o contedo das cavidades, adicionar a Soluo de Lavagem WS, aspirar

novamente o contedo das cavidades aps 30 segundos de tempo de espera.

Repetir a lavagem 4 vezes. L2: No caso de lavadoras automticas, realizar um prime com a soluo de lavagem

(WS) e lavar as tiras 5 vezes. Verificar se a lavadora encheu todas as cavidades

completamente e aspirar aps 30 segundos eficientemente (lquido remanescente

deve ser < 15 L).

L3: Aps a lavagem, remover o lquido remanescente batendo a placa invertida em

um papel absorvente.

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ESQUEMA DE PIPETAGEM:

Todos os reagentes devem estar a temperatura ambiente (15 a 25C) antes

do uso.

CAVIDADE ( L)

ETAPA1 A1...D2

Calibradores

E2

Amostras

CAL A-F, em duplicata

Amostras, Controles, em duplicata

CON

50

--- 100

---

50 100

Homogeneizar. Cobrir as MIC com a tira adesiva.

Incubar 60 minutos entre 20-25C

Lavar 5 vezes como descrito em Procedimento de Lavagem

WASH 300 300

ETAPA 2

SUB 100 100

Incubar 15 minutos entre 20-25C (ver p8)

STOP 100 100

Homogeneizar cuidadosamente

Medir a absorbncia em 450 nm o mais rpido possvel ou no mximo dentro de 30 minutos aps o trmino da reao. Utilizar como comprimento de

onda de referncia 630-690 nm (se disponvel).

VALIDAO DO TESTE:

Os resultados dos testes so vlidos desde que os seguintes critrios sejam encontrados:

A mdia da absorbncia [OD] de CAL F 1,2.

A diferena entre as duplicatas de CAL F no deve exceder 10%.

CLCULO:

Plotar as absorbncias medidas contra as concentraes de CAL em um grfico

linear. A interpolao apropriada dos pontos de medio plotados resulta em uma

curva de calibrao, onde a concentrao do analito de cada amostra pode ser

determinada. Para o clculo das concentraes do analito, selecionar a opo de curva apropriada

e validada (recomendao: ponto a ponto).

CONTROLE DE QUALIDADE Boas prticas de laboratrio exigem controles a serem testados com cada curva de

calibrao. Um nmero significativo de controles deve ser executado para

estabelecer os valores mdios e limites aceitveis para garantir um desempenho

adequado. Amostras de controle de qualidade devem ser executadas de acordo com as regulamentaes locais. Os resultados devem estar dentro das faixas

estabelecidas.

INTERPRETAO DOS RESULTADOS: A concentrao srica total de TSH dependente de uma multiplicidade de fatores:

funo da glndula do hipotlamo, funo da glndula tireide, e a sensibilidade da

pituitria para TRH. Assim, a concentrao isolada de tirotropina no suficiente

para avaliar o estado clnico. O TSH pode estar elevado por interveno

farmacolgica. Domperidona, amiodazona, iodo, fenobarbital e fenitona causam aumento no nvel de TSH. Um decrscimo em TSH foi relatado com a administrao

de propanolol, metimazol, dopamina e D-tiroxina. Variaes genticas ou

degradaes de TSH intacto em subunidades podem afetar as ligaes

caractersticas de anticorpos e influenciar no resultado final.

VALORES ESPERADOS:

Resultados a partir de estudos com uma populao eutireide:

Faixa normal: 0,3 4,0 mUI/L de TSH. Cada laboratrio deve estabelecer seu prprio valor esperado utilizando

equipamentos, mtodos de coleta de sangue e tcnicas de teste comumente usadas

num laboratrio.

REPETIBILIDADE:

N Mdia (mUI/L) DP (U/mL) % CV

12 0,36 0,02 5,56

12 1,34 0,037 2,76

12 12,9 0,38 2,97

12 28,4 1,09 3,85

REPRODUTIBILIDADE:

N Mdia (mUI/L) DP (U/mL) % CV

12 0,36 0,016 4,58

12 1,34 0,04 3,32

12 12,7 0,59 4,68

12 27,2 1,62 5,9

SENSIBILIDADE ANALTICA:

A sensibilidade analtica de 0,03 mUI/L de TSH.

ESPECIFICIDADE ANALTICA: A especificidade analtica do TSH foi verificada testando substancias potenciais

reao cruzada. Estas substncias foram adicionadas a um soro de matriz normal

com vrias concentraes e suas respectivas doses respostas foram comparadas

com aquelas com tirotropina purificada.

Substncia Reatividade Cruzada, %

TSH 100

Gonadotrofina Corinica (hCG) < 0,01

Hormnio Folculo Estimulante (FSH) < 0,01

Hormnio Luteinizante < 0,01

SUBSTNCIDAS INTERFERENTES:

Substncias Concentraes

cido Acetilsaliclico 0,5 mg/mL

cido Ascrbico 0,4 mg/mL

Bilirrubina 0,3 mg/mL

Glicose 5 mg/L

Hemoglobina 12 mg/mL

Triglicrides 12 mg/mL

Fenilbutazona 0,17 mg/mL

Fenitoina 0,04 mg/mL

cido Saliclico 1 mg/mL

Nenhum interferente foi observado nas concentraes das amostras mostradas

acima. A recuperao da concentrao inicial de TSH (0,25; 1,15; 3; 7,5 e 15

mUI/mL) para as substncias testadas foi de 100%.

COMPARAO DE MTODOS - EXATIDO:

TSH foi comparado com um mtodo ELISA clssico e outro de quimioluminescncia.

Um total de 128 amostras foram utilizadas. As amostras foram provenientes de um

grupo de 69 hipertireoidiano, 47 eutiroidiano e 12 hipotireodianos.

Os resultados foram avaliados por uma analise de regresso no paramtrica de acordo com Passing & Bablok:

Mtodo de Quimioluminescncia

Y = 0,0000 + 1,0000 X A= 0,0000 (-0,0103 a 0,0166)

B= 1,0000 (0,9474 a 1,0301)

Mtodo de ELISA Clssico Y = 0,0000 + 1,0746 X

A= 0,0000 (-0,0103 a 0,0166)

B= 1,0746 (1,0438 a 1,1581)

Os resultados demonstram que existe apenas um bias insignificante entre os mtodos avaliados.

APRESENTAO:

Referncia N. testes

54030 96

DEPARTAMENTO DE SERVIOS ASSOCIADOS: Para esclarecimentos de dvidas do consumidor quanto ao produto:

Telefax (31) 3067-6400 E-mail: invitroms@invitro.com.br

N. DO LOTE, DATA DE FABRICAO, DATA DE VALIDADE VIDE RTULO DO

PRODUTO.

BIBLIOGRAFIA:

1. Barker, S.B., Determination of Protein Bound Iodine, Journal Biological Chemistry

173, 175 (1948). 2. Chopra, I.J. et al., A Radioimmunoassay of Triiodothyronine, J. Clinical Endocrinol.

33, 865 (1971).

3. Young, D.S. et al., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, Clinical

Chemistry 21, 3660 (1975)

4. Sterling, L., Diagnosis and treatment of Thyroid Disease, Cleveland CRC Press, p.19 - 51 (1975).

5. Demers L. M. et al., NACB Laboratory Medicine Practice Guidelines, Laboratory

Support for the Diagnosis of Thyroid Disease 13, 33 (2002)

6. Kratzsch J. et al., Clinical Chemistry 51, 1480 (2005)

Produzido por Human GmbH Max-Planck-Ring 21, D 65205, Wiesbaden, Alemanha

e Distribudo por In Vitro Diagnstica Ltda

Rua Cromita, 278, Distrito Industrial Itabira/MG. CEP: 35903-053 Telefone: 31-3067-6400 Fax: 31-3067-6401 e-mail: invitroms@invitro.com.br

Resp. Tc.: Patrcia C. C. Vilela CRF 4463 Reg. M.S. 10303460181

SIGNIFICADO DOS SMBOLOS UTILIZADOS NOS RTULOS DO PRODUTO

O contedo suficiente para testes

Data limite de utilizao

Limite de temperatura (conservar a)

Nmero do Catlogo

Consultar Instruo de Uso

Nmero do lote

Produto Diagnstico In Vitro

Data de Fabricao