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i
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
COORDENADORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
“INVESTIGAÇÃO DOS EFEITOS DOS PROCEDIMENTOS DE
IMOBILIZAÇÃO EM MONOCAMADAS AUTO-ORGANIZADAS DA
ENZIMA PEROXIDASE NO DESENVOLVIMENTO DE UM
BIOSSENSOR”
TESE DE DOUTORADO
Aluna: Renata Kelly Mendes
Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota
Campinas, dezembro de 2006
ii
iii
Dedico este trabalho a toda a minha família,
especialmente a meus pais Antonio e Luci pelo
amor, apoio e carinho que sempre tiveram por
mim.
iv
Ao Marcelo, pelo amor, compreensão e por
estar sempre ao meu lado e ao meu filho
Thiago por tornar meus dias mais especiais e
por me fazer acreditar que valeu a pena.
v
AGRADECIMENTOS
- Ao Prof. Lauro Tatsuo Kubota, pela orientação, apoio, competência e incentivo que
contribuíram para a realização deste trabalho.
- Aos meus irmãos César e Rita, meus cunhados Carlos e Alexandra e meus cinco
sobrinhos: Marcela, Gustavo, Guilherme, Caio e Arthur, minha sogra Vera e meu sogro
Fábio, pelo grande apoio e por estarem sempre ao meu lado.
- A Rafaela Fernanda Carvalhal, pela parceria, amizade, paciência e pelos bons dias de
diversão.
- Aos colegas de laboratório: Alexandre, Arnaldo, Diogo, Jailson, Lucilene, Reinaldo,
Maurício, Alaécio, Phabyanno, Wilney e Samanta pela boa convivência e contribuições
neste trabalho.
- Aos que já passaram pelo laboratório, mas se tornaram bons amigos: Pilar, Rosângela,
Bárbara e Jequié.
- Aos colegas do LAQQA: Alessandra, Danilo, Gilmare, Jez, Renato, Marcelo, Patrícia e
Paulo pelos momentos de alegria e diversão.
- Aos meus grandes amigos de Campinas, pela paciência, apoio e ausência algumas vezes.
- Ao Instituto de Química da UNICAMP por possibilitar a realização deste trabalho.
- Á Capes pela bolsa concedida.
- Principalmente a Deus, pela proteção, paz e saúde.
vi
Dados Curriculares Renata Kelly Mendes
1. Formação Acadêmica Graduação
Licenciatura em Química. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR. Início: Março de 2000 / Conclusão: Dezembro de 2002 Bacharelado em Química. Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR. Início: Março de 1995 / Conclusão: Dezembro de 1999. Pós Graduação
Mestrado em Química Universidade Federal de São Carlos, UFSCAR. Título: Desenvolvimento e aplicação de eletrodos compósitos grafite/poliuretana. Início: Março de 2000/ Obtenção: Junho de 2002. Orientador: Éder Tadeu Gomes Cavalheiro. Bolsista da: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP. 2. Produção Científica 2.1 Participação e Trabalhos Apresentados em Congressos 1. Efeitos da forma de imobilização da enzima peroxidase em um biossensor para determinação de peróxido de hidrogênio usando eletrodos de ouro modificados com monocamadas auto-organizadas. Mendes, R.K.; Carvalhal, R.F.; Kubota, L. T. In: XVII Congresso da Sociedade Iberoamericana de Eletroquímica, 2006, La Plata. Livro dos Anais, 2006. p. 219-219. 2. Biossensor para álcool a base de nanotubos de carbono com azul de meldola e álcool desidrogenase. Santos, A.S.; Pereira, A.C., Mendes, R.K.; Duran, N.; Kubota, L.T. XVII Congresso da Sociedade Iberoamericana de Eletroquímica, SIBAE, 2006, La Plata. Livro dos Anais, 2006. p. 218-218. 3. Determinação de hidroquinona usando um sensor a base de um catalisador biomimético à tirosinase. Carvalhal, R.F.; Sotomayor, M.P.T.; Mendes, R.K.; Freire, R.S.; Kubota, L.T. In: XVII Congresso da Sociedade Iberoamericana de Eletroquímica, SIBAE, 2006, La Plata. Livro dos Anais, 2006. p. 217-217. 4. Adsorption/Reorganization studies of self-assembled monolayers on polycrystalline gold by electrochemical reductive desorption. Carvalhal, R.F.; Mendes, R.K.; Possari, R.; Kubota, L.T., Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, SIBEE, 2005, Londrina. Livro de Resumos, 2005. 5. Electrochemical detection of cysteine in a flow system based on reductive desorption of thiols from gold. Carvalhal, R.F.; Mendes, R.K.; Possari, R.; Kubota, L.T., Simpósio
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Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, SIBEE, 2005, Londrina. Livro de Resumos, 2005 6. A comparative electrochemical and SPR studies of different thiols self-assembled monolayers on gold. Mendes, R.K.; Carvalhal, R.F.; Kubota, L.T., Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, SIBEE, 2005, Londrina. Livro de Resumos, 2005. 7. Influência do pH nas Propriedades de Monocamadas Auto-Organizadas de Diferentes Ácidos Mercapto-Carboxílicos Sobre Eletrodos de Ouro. Mendes, R.K.; Reis, A.P.; Kubota, L.T., 13º Encontro Nacional de Química Analítica / 1º Congresso Ibero-Americano de Química Analítica, ENQA, 2005, Niteroi-RJ. Anais. v. 1. p. 94. 8. Comportamento eletroquímico da ftalocianina de cobre (II) tetrasulfonada imobilizada em um eletrodo de ouro modificado com monocamada auto-organizada. Mendes, R.K.; Tanaka, A.A, Gushikem, Y.; Kubota, L.T. 27 Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, SBQ, 2004, Salvador, 2004. 9. Estudo de diferentes monocamadas de ácidos mercapto-carboxílicos auto-organizadas sobre eletrodos de ouro. Mendes, R.K.; Fonseca, C.P.; Neves, S.; Freire, R.S.; Kubota, L. T 26 Sociedade Brasileira de Química, SBQ, 2003, Poços de Caldas. Livro de Resumos, 2003. 10. Estudo cinético in situ de formação de monocamadas auto-organizadas de ácidos mercapto-carboxílicos por ressonância de plasma de superfície. Mendes, R.K.; Damos, F.S.; Kubota, L.T.12a. Encontro Nacional de Química Analítica, ENQA, 2003, São Luís.Livro de Resumos. v. 1. p. EQ050. 11. Desenvolvimento de eletrodos compósitos a base de polímeros e grafite: Oliveira, A.C.; Cervini, P.; Mendes, R.K.; Cavalheiro, E.T.G. XIV Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química, 2003, São Carlos. Livro de Resumos, 2003. p. 17. 12. A new graphite-castor oil polyurethane composite as an electrode material and its use in Cd (II) determination in water. In: Mendes, R.K.; Claro Neto, S.; Cavalheiro, E.T.G. 12. Euroanalysis, 2002, Dortmund. 12. Euroanalysis, 2002. v. 1. p. 479 13. Avaliação do eletrodo compósito grafite/poliuretana em técnica voltamétrica de redissolução. Mendes, R.K.; Cavalheiro, E.T.G., 11 Encontro Nacional de Química Analítica, ENQA, 2001, Campinas, 2001. 14. Desenvolvimento de um novo compósito à base de grafite e resina poliuretana, para aplicações eletroanalíticas. Mendes, R.K.; Cavalheiro, E.T.G, Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalíticas, 2001, Gramado. XII SIBEE, 2001. 15. Avaliação da potencialidade do uso de eletrodo compósito à base de grafite/poliuretana na determinação de cátions metálicos. Mendes, R.K.; Cavalheiro, E.T.G., XII Encontro Regional de Química da Sociedade Brasileira de Química, 2001, Araraquara. Livro de Resumos, 2001. p. 95.
viii
2.2 Trabalhos Científicos Publicados ou Submetidos 2.2.1 Trabalhos Publicados
1. MENDES, R.K.; CERVINI, P.; CAVALHEIRO, E.T.G. The use of a graphite-castor oil polyurethane composite electrode for the determination of hydroquinone in photographic. Talanta, v. 68, n. 3, p. 708-712, 2006. 2. POSSARI, R.; CARVALHAL, R.F.; MENDES, R.K.; KUBOTA, L.T. Electrochemical detection of cysteine in a flow system based on reductive desorption of thiols from gold. Analytica Chimica Acta, v. 575, p. 172-179, 2006. 3. MENDES, R.K.; FONSECA, C.P.; NEVES, S.; FREIRE, R.S.; KUBOTA, L.T. Characterization of self-assembled thiols monolayers on gold surface by electrochemical impedance spectroscopy. Journal of Brazilian Chemical Society, v. 15, n. 6, p. 849-855, 2004. 4. DAMOS, F.S.; MENDES, R.K. ; KUBOTA, L.T. Aplicações da MCQ, RPS e EIS em investigações de superfícies e interfaces para o desenvolvimento de (bio)sensores. Química Nova, v. 27, n. 6, p. 970-979, 2003. 5. MENDES, R.K.; CLARO NETO, S.; CAVALHEIRO, E.T.G. Evaluation of a new rigid carbon-castor oil polyurethane composite as an electrode material. Talanta, v. 57, n. 5, p. 909-917, 2001. 2.2.2 Artigos Aceitos para Publicação
1. DUTRA, R.F.; MENDES, R.K.; SILVA, V.L.; KUBOTA, L.T. Surface plasmon resonance immunosensor for human cardiac troponin T based on self-assembled monolayer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006.
ix
RESUMO
Título: “Investigação dos efeitos dos procedimentos de imobilização em monocamadas
auto-organizadas da enzima peroxidase no desenvolvimento de um biossensor”.
Autora: Renata Kelly Mendes
Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota
Palavras-chave: biossensor, monocamadas auto-organizadas, peroxidase, imobilização
enzimática e peróxido de hidrogênio
Neste trabalho foram investigados diferentes métodos de imobilização da enzima
HRP empregando como matrizes as monocamadas auto-organizadas formadas sobre
eletrodos de ouro, bem como a avaliação da influência do processo de imobilização do
elemento biológico no desempenho analítico do biossensor. Para isso, as monocamadas
utilizadas foram formadas por meio de tióis com diferentes estruturas, tamanho de suas
cadeias carbônicas e grupos terminais. Foi possível constatar que o tamanho da cadeia
carbônica de um tiol influencia especialmente no empacotamento da monocamada e,
conseqüentemente, na eficácia da imobilização das biomoléculas. Pelos estudos realizados
visando a caracterização das SAM sobre a superfície eletródica foi possível verificar que os
tióis que possuem em sua cadeia um número menor de carbonos (< 9) tendem a formar
monocamadas com uma quantidade considerável de defeitos na superfície do ouro, o que
leva a um recobrimento mais baixo. No entanto, os tióis que contém um número mais
elevado de carbonos na cadeia apresentam um grau de recobrimento mais elevado e, no
entanto, não são boas matrizes para biossensores eletroquímicos, pois podem passivar a
superfície, diminuindo a transferência de elétrons e, como conseqüência, a sensibilidade do
eletrodo. Quanto a imobilização da enzima nos eletrodos de ouro, verificou-se, por
diferentes técnicas, que as monocamadas que possuem grupo terminal –NH2 foram aquelas
que proporcionaram os melhores resultados, provavelmente devido ao uso do glutaraldeído
como ligante no processo de imobilização. Ao analisar adicionalmente o desempenho do
biossensor para a determinação de peróxido de hidrogênio, verificou-se que a SAM
formada pela cisteamina é a mais adequada para a imobilização da HRP, por propiciar tanto
uma melhor eficácia na adsorção enzima quanto uma sensibilidade mais elevada para H2O2.
x
ABSTRACT
Title: "Investigations of the effect of the immobilization procedures on self-assembled
monolayers of the peroxidase in the biosensor development ".
Author: Renata Kelly Mendes
Adviser: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota
Keywords: biosensor, self-assembled monolayers, peroxidase, enzyme immobilization and
hydrogen peroxide.
In this work different immobilization procedures of HRP were investigated using as
support m1atrices the self-assembled monolayers formed on gold electrodes, as well as the
evaluation of the influence of these immobilization processes in the biosensor performance.
For this, the used monolayers were prepared by thiols with different structures, carbon
chains size and terminal groups. It was possible to have evidence that the thiol carbon chain
size influences especially in the coverage monolayer and, consequently, in the efficiency of
the biomolecule immobilization. From the studies carried out for the SAM characterization
on the electrode surface it was possible to verify that thiols with smaller chain (n<9) trends
to form monolayers with a considerable amount of defects on gold surface, that it leads to a
lower coverage. However, the thiols with a higher carbon chain present a higher coverage
degree, are not being good matrices for electrochemical biosensors, because it can passive
the surface, making difficult the electron transfer and, consequently, the electrode
sensitivity. In relation to the enzyme immobilization on gold electrodes it was verified, for
different techniques, that monolayers that possess -NH2 terminal group provided the best
results, probably due to the use of glutharaldeyde as ligant at the immobilization process.
Analyzing the biosensor performance for the hydrogen peroxide determination was verified
that SAM formed by cysteamine is more adequate for HRP immobilization, because
provide the better efficiency in the enzyme immobilization associated to high sensitivity for
H2O2.
xi
ÍNDICE RESUMO xv
ABSTRACT xvii
ÍNDICE DE FIGURAS xxii
ÍNDICE DE TABELAS xvi
GLOSSÁRIO xxix
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO 01
1.1 Monocamadas Auto-Organizadas e Biossensores 08
1.2 Preparação das Monocamadas Auto-Organizadas 11
1.3 Adsorção de Tióis de Solução 15
1.4 Caracterização das SAM 17
1.4.1 Caracterização de Defeitos nas SAM 20
1.4.2 Métodos para a Caracterização de SAM 22
1.4.3 Aspectos Teóricos de Ressonância de Plásmon de Superfície 23
1.5 Removendo as SAM da Superfície 26
1.6 A Funcionalização de SAM 28
1.7 SAM e o Desenvolvimento de Biossensores para a Determinação de
Peróxido de Hidrogênio 32
CAPÍTULO 2 – OBJETIVOS 36
CAPÍTULO 3 – PARTE EXPERIMENTAL 37
3.1 Reagentes Utilizados 37
3.2 Materiais e Equipamentos 37
3.2.1 Medidas Voltamétricas 37
3.2.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS) 38
3.2.3 Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR) 38
3.3 Procedimentos Experimentais 38
3.3.1 Limpeza dos Eletrodos de Ouro 38
3.3.2 Preparação das Monocamadas Auto-Organizadas 39
3.3.3 Estudo do Tempo de Imobilização da HRP em Monocamada
Auto-Organizada 40
3.3.4 Imobilização da HRP na Superfície Eletródica 41
xii
3.3.5 Estudos Voltamétricos 42
3.3.6 Estudos da Espectroscopia de Impedância Eletroquímica 43
3.3.7 Estudos de Ressonância de Plásmon de Superfície 44
3.4 Avaliação do Desempenho Analítico do Biossensor 45
3.4.1 Influência da Concentração Enzimática 45
3.4.2 Efeito do Potencial Aplicado 45
3.4.3 Influência do Tipo de Solução Tampão e pH 46
3.4.4 Estudo da Concentração do Mediador 46
3.4.5 Avaliação do Biossensor 47
3.4.6 Estudo da Repetibilidade de Medida e de Preparação dos
Biossensores 47
3.4.7 Avaliação do Efeito de Memória 47
3.4.8 Estuda Estabilidade do Biossensor 48
3.4.9 Aplicação do Biossensor em Amostras para Clareamento Dental 48
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO 49
4.1 Caracterização das Monocamadas Auto-Organizadas 49
4.1.1 Voltametria Cíclica 50
4.1.2 Dessorção Eletroquímica 51
4.1.3 Estudos Hidrodinâmicos 57
4.2 Estudo do Tempo de Imobilização da HRP na Monocamada
Auto-Organizada 64
4.3 Avaliação da Imobilização Enzimática em SAM – Medidas
Voltamétricas 65
4.4 Avaliação da Imobilização Enzimática em SAM – Medidas de
Espectroscopia de Impedância Eletroquímica 71
4.5 Avaliação da Imobilização Enzimática em SAM – Medidas de
Ressonância de Plásmon de Superfície 73
4.6 Estudos Voltamétricos do Biossensor Au-CISTE-GLU-HRP:
Otimização e Determinação de Parâmetros 79
4.7 Determinação de Peróxido de Hidrogênio em Amostras
Odontológicas usando o biossensor Au-CISTE-GLU-HRP 90
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES 94
xiii
CAPÍTULO 6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 97
xiv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Esquema de um biossensor........................................................................ 02
Figura 2 Produção científica relacionada aos diferentes transdutores usados em
biossensores de 1980 a 2006, pesquisada na base de dados do ISI®5
(Institute for Scientific Information), acessado em
13/09/2006.........................................................
03
Figura 3 Esquema dos principais métodos de imobilização do elemento biológico
em biossensores.........................................................................................
05
Figura 4 Esquema de monocamadas auto-organizadas formadas a partir de
alcanotióis adsorvidos sobre superfície de ouro........................................
10
Figura 5 Representação esquemática da disposição de uma molécula de tiol, na
qual se observa a inclinação das cadeias carbônicas perpendiculares à
superfície de ouro.......................................................................................
19
Figura 6 Ilustração esquemática de alguns dos defeitos intrínsecos ou extrínsecos
encontrados em SAM formadas em substrato de ouro policristalino. A
linha preta contínua na interface metal-enxofre indica as variações
topográficas do substrato...........................................................................
21
Figura 7 Esquema da configuração de Kretschmann baseada na reflexão total
atenuada, onde E é o campo evanescente, Kx o vetor da luz incidente e
Ksp o vetor de plasma de superfície...........................................................
24
Figura 8 Representação esquemática de um instrumento típico de SPR. Em
destaque uma curva mostrando a diferença no ângulo de incidência
quando há interação de um ligante com a camada imobilizada na
superfície, sendo (I) sem interação e (II) após interação, e uma curva de
associação, na qual há um aumento do ângulo de incidência com o
tempo..........................................................................................................
26
Figura 9 (a) Inserção de um adsorbato com um grupo funcional em regiões de
defeitos de uma SAM pré-formada e (b) transformação de uma SAM
com um grupo funcional (círculos) ou por reação química ou adsorção
de um outro material..................................................................................
29
Figura 10 Tióis utilizados na imobilização da enzima HRP...................................... 40
xv
Figura 11 Representação esquemática de um processo de associação e dissociação
de biomoléculas na superfície do sensor usando SPR. A mudança no
valor do ângulo SPR é usada para monitorar a extensão da adsorção na
superficial...................................................................................................
45
Figura 12 Voltamogramas cíclicos obtidos para os eletrodos de ouro recobertos
com diferentes SAM em solução 5 mmol L –1 de Fe(CN)63- em tampão
fosfato 0,1 mol L –1 pH 6,5, a 100 mV s-1.................................................
50
Figura 13 Voltamogramas de pulso diferencial obtidos para as diferentes SAM em
solução de KOH 0,1 mol L-1, sendo A – MPA, B – ALP, C – MBA, D –
MUA, E – CYS e F – CISTE. Potencial: 0,1 a –1,3 V. Velocidade de
varredura: 20 mV s-1 e 25 mV de amplitude de pulso...............................
53
Figura 14 Curvas de potencial-corrente obtidas com eletrodo de ouro modificado
com cisteamina, em uma solução 350 µmol L-1 de ferro/ferricianeto de
potássio em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5, em diferentes
velocidades de rotação do eletrodo............................................................
59
Figura 15 Gráfico de Levich para várias concentrações de ferro/ferricianto de
potássio em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 usando o eletrodo de
ouro modificado com cisteamina...............................................................
60
Figura 16 Gráfico de Koutecky-Levich da redução do par ferro/ferricianeto de
potássio em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5, para o eletrodo de ouro
modificado com cisteamina para várias concentrações da espécie
eletroativa..................................................................................................
61
Figura 17 IK em função da concentração do par redox em tampão fosfato 0,1 mol
L-1 pH 6,5, usando o eletrodo de ouro modificado com cisteamina para
obtenção da constante de transferência de elétrons (k).............................
62
Figura 18 Voltamogramas cíclicos obtidos para o eletrodo de ouro modificado
com a SAM após imobilização enzimática pelos métodos A, B, C e D,
apenas em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 e após adição de
850 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio e 25 µmol L-1 de hidroquinona.
Velocidade de varredura: 50 mV s-1..........................................................
65
xvi
Figura 19 Voltamogramas cíclicos obtidos a 50 mV s-1 para o eletrodo de ouro
modificado com CISTE SAM em solução contendo 850 µmol L-1 de
H2O2 e 25 µmol L-1 de hidroquinona em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH
6,5. Linha preta: biossensor Au-CISTE-HRP apenas na solução tampão.
67
Figura 20 Diagramas de Nyquist obtidos para o eletrodo de ouro modificado com
a SAM antes e após imobilização enzimática. Faixa de freqüência de 10-
2 a 105 Hz, 10mV de amplitude de pulso. Potencial: 0,2 V..................
72
Figura 21 Sensorgrama obtido para o disco de ouro modificado com cisteamina e
a imobilização da enzima usando glutaraldeído........................................
74
Figura 22 Efeito da quantidade de enzima na resposta voltamétrica do biossensor
Au-CISTE-GLU-HRP em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5
contendo 85 µmol L-1 de H2O2 e 25 µmol L-1 do mediador
hidroquinona. Velocidade de varredura: 50 mV s-1..................................
79
Figura 23 Efeito do potencial aplicado na resposta amperométrica obtido para o
biossensor Au-CISTE-GLU-HRP em 85 µmol L-1 de peróxido de
hidrogênio e 25 µmol L-1 de hidroquinona em tampão fosfato 0,1 mol L-
1 pH 6,5..................................................................................................
80
Figura 24 Dependência do pH na resposta amperométrica do biossensor Au-
CISTE-GLU-HRP em solução contendo 85 µmol L-1 de peróxido de
hidrogênio e 25 µmol L-1 de hidroquinona em tampão fosfato 0,1 mol L-
1 pH 6,5. E aplicado: -50 mV (vs. ECS)................................................
82
Figura 25 Influência da concentração do mediador hidroquinona na resposta do
biossensor Au-CISTE-GLU-HRP em 85 µmol L-1 de peróxido de
hidrogênio em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 e potencial aplicado
de -50 mV.................................................................................................
83
Figura 26 Curva analítica típica obtida para o biossensor Au-CISTE-GLU-HRP
em diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio e quantidade
constante de 25 µmol L-1 de hidroquinona em tampão fosfato 0,1 mol L-
1 pH 6,5. E aplicado: -50 mV (vs. ECS)....................................................
84
xvii
Figura 27 Estudo da estabilidade operacional do biossensor em solução tampão
fosfato 0,1 mol L-1 contendo 25 µmol L-1 de hidroquinona e 85 µmol L-1
de peróxido de hidrogênio. Potencial aplicado: -50 mV (vs. ECS)........
85
Figura 28 Curva referente ao tempo de vida do biossensor Au-CISTE-GLU-HRP
para análise diária em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5
contendo 25 µmol L-1 de hidroquinona e 85 µmol L-1 de peróxido de
hidrogênio. Potencial aplicado: -50 mV (vs. ECS)...................................
86
Figura 29 Resposta amperométrica do biossensor Au-CISTE-GLU-HRP.
Experimento realizado em baixa e em alta concentração de peróxido de
hidrogênio: 0,85 µmol L-1 e 85 µmol L-1, respectivamente. Potencial
aplicado de -50 mV (vs. ECS) em 0,1 mol L-1 de tampão fosfato pH 6,5
e 25 µmol L-1 de hidroquinona..................................................................
89
Figura 30 Amperograma obtido para a adição de padrão usada na determinação de
peróxido de hidrogênio em amostras odontológicas. Solução tampão 0,1
mol L-1 pH 6,5 contendo 25 µmol L-1 de hidroquinona. Potencial
aplicado: - 50 mV (vs. ECS), (n=4)...........................................................
91
xviii
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 Características relevantes dos materiais utilizados como elemento de
reconhecimento na construção de biossensores......................................
04
Tabela 2 Procedimentos de imobilização de biomoléculas na superfície de
sensores....................................................................................................
07
Tabela 3 Valores dos graus de recobrimentos do eletrodo de Au recoberto com
diferentes SAM e os respectivos potenciais de pico de dessorção..........
55
Tabela 4 Cálculo teórico da quantidade de moléculas de tiol por eletrodo............ 56
Tabela 5 Valores das constantes de transferência de elétrons obtidas para o
eletrodo limpo e após modificação com os diferentes tióis.....................
62
Tabela 6 Características do biossensor obtidas com diferentes métodos de
imobilização da peroxidase em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5.
Potencial: 300 a -200 mV. Velocidade de varredura 50 mV s-1 (n=6)....
68
Tabela 7 Porcentagens de perda de resposta voltamétrica após 100 ciclos de
varredura para os eletrodos de ouro modificados com SAM e HRP.......
70
Tabela 8 Valores das Rct obtidas para os eletrodos modificados com diferentes
tióis e após imobilização enzimática, usando EIS. Faixa de freqüência:
10-2 a 105 Hz, 10mV de amplitude de pulso. Potencial: 0,2 V................
71
Tabela 9 Variação dos ângulos SPR para o disco de ouro modificados com
diferentes tipos de SAM para avaliação do método de imobilização da
peroxidase................................................................................................
75
Tabela 10 Quantidade de enzima imobilizada na superfície determinada usando a
técnica de SPR.........................................................................................
76
Tabela 11 Quantidade de enzima imobilizada na superfície determinada usando a
técnica de SPR......................................................................................
77
Tabela 12 Estudo da influência da natureza do eletrólito suporte na resposta
amperométrica do biossensor pH = 7,0. (n=3)........................................
81
Tabela 13 Comparação do desempenho amperométrico de biossensores a base da
enzima HRP para a determinação de peróxido de hidrogênio................
87
Tabela 14 Determinação da concentração de peróxido de hidrogênio em amostras
odontológicas, usando o biossensor proposto.........................................
92
xix
Tabela 15 Porcentagem de recuperação em diferentes amostras da solução usada
em clareamento dental obtida com o biossensor Au-CISTE-GLU-HRP
93
xx
GLOSSÁRIO
Γ Grau de recobrimento
∆j Variação da densidade de corrente
ALP Ácido lipóico
CISTE Cisteamina
CYS Cistamina
E Potencial
ECS Eletrodo de calomelano saturado
EDC Cloreto de N-(3-Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida
EIS Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
F Constante de Faraday
GLU Glutaraldeído
HRP Peroxidase de raiz forte
I Corrente
k Constante de transferência de elétrons
LB Langmuir-Blodgett
MBA Ácido mercaptobenzóico
MPA Ácido mercaptopropiônico
MUA Ácido mercaptoundecanóico
NHS N-Hidroxisuccinimida
QCM Microbalança de cristal de quartzo
RDE Eletrodo de disco rotatório
SAM Monocamadas auto-organizadas
SPR Ressonância de Plásmon de Superfície
VC Voltamograma cíclicos
1
CAPÍTULO 1
1. INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas as ciências analíticas têm experimentado um avanço
relacionado à capacidade de obtenção de informações químicas em diversos
sistemas, proporcionando um elevado desenvolvimento analítico, resultando na
automação, miniaturização e simplificação destes objetos em estudo (MURPHY,
2006). Neste contexto, os biossensores têm adquirido primordial importância
devido à possibilidade de avaliação de processos sintéticos ou biológicos, além do
entendimento destes processos (ZHANG et al., 2000). Desta forma, estes
dispositivos têm sido usados em diferentes áreas de aplicação, destacando-se os
vários setores da indústria, como as de alimentos, farmacêuticas e clínicas e na
agricultura, devido ao fato destes ramos de atividade necessitarem de métodos
analíticos rápidos, exatos e confiáveis na determinação das espécies de interesse.
Além disso, os biossensores possibilitam análises com monitoramento contínuo e
in vivo em tempo real, apresentando-se como substituintes potenciais das técnicas
analíticas destrutivas ou que exijam elevadas quantidades de amostras,
aumentando sua potencialidade para o uso comercial.
Segundo a IUPAC (THÉVENOT et al., 2001), os biossensores são um
subgrupo de sensores químicos que são capazes de proporcionar informação
analítica quantitativa ou semi-quantitativa, usando um elemento de
reconhecimento biológico (como enzimas, anticorpos, proteínas ou
microorganismos) em contato a transdutores (como os eletroquímicos, ópticos,
térmicos, etc), conforme apresentado na Figura 1. A descrição sistemática de um
biossensor inclui cinco características principais: (i) a espécie de interesse
analítico ou o parâmetro medido, (ii) o princípio de leitura do transdutor, (iii) o
modelo físico ou (bio)químico do sistema, (iv) a aplicação e (v) a tecnologia e
materiais para a fabricação do sensor.
2
Figura 1. Esquema de um biossensor
Dentre as partes que constituem os biossensores, o processador de sinal
eletrônico é provavelmente a parte menos dependente do tipo de sensor e é
somente uma conseqüência do rápido desenvolvimento no campo da eletrônica.
O sinal físico químico proveniente do sistema de reconhecimento biológico
é convertido em um sinal mensurável pelo transdutor. As características do
transdutor de sinal determinam o custo do instrumento, do sensor e as limitações
físicas (ROGERS, 2000). Diferentes transdutores têm sido empregados, tal como
observado na Figura 2, na qual pode ser verificado que os eletroquímicos são os
mais utilizados, seguidos pelos transdutores ópticos, cujo uso têm crescido
bastante atualmente.
3
Figura 2. Produção científica relacionada aos diferentes transdutores
usados em biossensores de 1980 a 2006, pesquisada na base de dados do ISI®
(Institute for Scientific Information), acessado em 13/09/2006.
O sistema de reconhecimento biológico transforma as informações do
domínio bioquímico, gerando sinais químicos ou físicos com sensibilidade definida.
O principal propósito deste sistema é proporcionar ao sensor um elevado grau de
seletividade para uma determinada espécie de interesse analítico. Os elementos
biológicos mais regularmente empregados são as enzimas, que podem ser
utilizadas na sua forma purificada, estarem presentes em microorganismos ou em
porções de tecido animal ou vegetal. As enzimas são catalisadores biológicos
usados em reações com um substrato específico, porém com maior reversibilidade
do complexo enzima-substrato formado. Os anticorpos são a segunda classe de
elementos biológicos mais utilizados no desenvolvimento de biossensores. Porém,
seu modo de ação é diferente daquele encontrado nas enzimas, pois eles se ligam
especificamente com o antígeno correspondente, mas, na maioria das vezes, sem
nenhum efeito catalítico. Devido a alta força da ligação que ocorre entre os
anticorpos e os antígenos, os imunossensores são capazes de proporcionar alta
sensibilidade para seus biossensores. Os ácidos nucléicos também são utilizados
como elementos de reconhecimento, mas em menor freqüência, por serem difíceis
de isolar. Eles podem operar seletivamente devido às características dos pares de
0
10
20
30
40
50
60
eletroquímico óptico piezoelétrico térmico
% de artigos
4
bases nitrogenadas. E, bem menos utilizados, existem os chamados receptores,
que são proteínas que se situam na membrana plasmática de bicamadas lipídicas
e possuem propriedades específicas de reconhecimento. Alguns materiais
abióticos são atualmente classificados como elementos de reconhecimento, pois
possuem a capacidade de mimetizar os sistemas biológicos (CUNNINGHAM,
1998). Dentre estes materiais podemos destacar os éteres de coroa e os
polímeros molecularmente impressos. As vantagens e desvantagens de cada
elemento de reconhecimento estão melhores descritas na Tabela 1.
Tabela 1. Características relevantes dos materiais utilizados como elemento de
reconhecimento na construção de biossensores (EGGINS, 1996).
Elemento de
Reconhecimento
Vantagens Desvantagens
Enzimas -formam complexos
estáveis com a espécie de
interesse
- são bastante seletivas
- possuem resposta rápida
- podem perder a atividade após
imobilização
- são estáveis por um período
relativamente curto de tempo
Anticorpos - são altamente seletivas
- são bastante sensíveis
- a ligação com o
anticorpo é muito estável
- não possuem efeito catalítico
- o imunocomplexo antígeno-
anticorpo formado é irreversível
na maioria das vezes
Ácidos Nucléicos - são bastante específicos - por gerarem baixa resposta, na
maioria das vezes, há
necessidade do uso de
marcadores
Receptores - muito utilizados em
análises específicas
- biossensores difíceis de
construir
- possuem custo muito elevado
- são difíceis de isolar
5
Para permitir o uso contínuo dos biossensores, é essencial uma
incorporação estável dos elementos de reconhecimento e esta tem sido uma
etapa crítica no desenvolvimento destes dispositivos analíticos. Isso porque os
biocomponentes, quando imobilizados, precisam reter a maior parte de sua
atividade biológica, para que o biossensor possa apresentar sensibilidade
significativa para o composto alvo. Existem várias técnicas para a imobilização das
biomoléculas, porém as mais comuns são a ligação covalente, a ligação covalente
cruzada, a oclusão em gel e a adsorção física (Figura 3). Todos esses métodos
possuem numerosas variantes e se faz necessário selecionar o método mais
apropriado para cada caso em particular, considerando-se o tipo de aplicação que
será realizada e o transdutor utilizado.
Figura 3. Esquema dos principais métodos de imobilização do elemento
biológico em biossensores.
Na adsorção, o material biológico é fixado fisicamente na superfície do
sensor por meio de forças de Van der Waals, pontes de hidrogênio ou interações
6
hidrofóbicas, apresentando a vantagem de ser extremamente simples. Entretanto,
as biomoléculas podem ser facilmente lixiviadas para a solução por fatores como
variação da força iônica, solvente e pH do meio. Em geral, este tipo de
procedimento de imobilização é raramente utilizado na construção de
biossensores, devido ao fato de proporcionar aparatos pouco sensíveis e/ou
pouco estáveis.
O método de ligação covalente proporciona uma maior estabilidade aos
biossensores e é mais amplamente utilizado. A ligação é realizada quimicamente
por meio de grupos funcionais do material biológico que não sejam essenciais a
sua atividade catalítica, sendo necessário certo conhecimento de sua estrutura,
com os grupamentos ativos do suporte, tais como –OH, -NH2, -COOH, -SH. O
ataque covalente geralmente envolve três etapas: (i) a ativação da superfície do
sensor, (ii) o acoplamento do elemento de reconhecimento e (iii) remoção das
moléculas fracamente ligadas. As condições experimentais ótimas para cada
etapa devem ser determinadas. É importante que os sítios ativos nas biomoléculas
não sejam afetados pelo processo de imobilização, para que não se perca a sua
atividade (LOJOU & BIANCO, 2006).
O procedimento de ligação covalente cruzada baseia-se na ligação cruzada
entre os grupos amino do suporte com os grupos amino das biomoléculas,
empregando-se reagente bi ou multifuncionais. Porém, apesar de ser um método
bastante simples, nem sempre é fácil controlar as condições experimentais e a
integridade do elemento biológico pode não ser totalmente conservada.
Na oclusão, o material biológico é confinado na grade de uma matriz
polimérica ou em membranas semipermeáveis, usando condições moderadas.
Neste processo uma ampla variedade de materiais pode ser avaliada e altas
concentrações de biomoléculas ativas são imobilizadas. As matrizes mais
comumente empregadas são as gelatinas, poliacrilamida, colágeno, triacetato de
celulose, alginato e outros. Teoricamente, este tipo de imobilização pode ser
aplicado a qualquer biocomposto, porém podem ocorrer problemas relacionados à
lixiviação dos elementos de reconhecimento para a solução devido aos diferentes
tamanhos dos poros dos polímeros ou membranas, além de impedimentos
7
estéricos para o substrato interagir com a biomolécula, quando os poros das
matrizes são menores que as moléculas.
Na Tabela 2 é mostrado um resumo de todos os tipos de imobilização
tratados anteriormente, apresentando-se as vantagens e desvantagens dos
métodos.
Tabela 2. Procedimentos de imobilização de biomoléculas na superfície de
sensores.
Tipo de Imobilização Vantagens Desvantagens
Adsorção
- simples
- realizados em condições
brandas
- menos destrutiva para o
material biológico
- ligações das
biomoléculas são
dependentes do pH,
solvente e temperatura
- alta taxa de lixiviação
para a solução,
comprometendo a
estabilidade do sistema
Ligação Covalente
- complexo estável
biomolécula-substrato
- lixiviação das moléculas
é minimizada
- maior sensibilidade
- procedimentos mais
laboriosos com consumo
de tempo
- possibilidade de perda
da atividade biológica do
material
Ligação Covalente
Cruzada
- procedimento simples
- forte ligação química das
biomoléculas
- dificuldade de controle
da reação
- pode ocorrer falta de
rigidez da superfície
Oclusão
- podem ser utilizados
diversos materiais
- preservação da atividade
biológica
- o efeito do tamanho dos
poros dos materiais pode
comprometer a adsorção
- perda da biomolécula por
lixiviação
8
Os procedimentos citados na Tabela 2, apesar de serem os métodos de
imobilização do elemento de reconhecimento mais amplamente empregados, são
artifícios que normalmente produzem uma superfície altamente desorganizada,
com as biomoléculas orientadas randomicamente, provocando mudanças
conformacionais que afetam a atividade funcional do componente bioativo. Assim,
somente uma pequena porcentagem das biomoléculas na superfície sensora
permanece ativa e mantém a capacidade de interagir seletivamente com as
espécies de interesse analítico (CHAKI & VIJAYAMOHANAN, 2002).
O uso de monocamadas auto-organizadas (SAM, do inglês “self-assembled
monolayer”) tem se tornado um procedimento de derivação de superfície bastante
empregado para a imobilização do material biológico (DONG & LI, 1997),
principalmente devido a sua simplicidade, versatilidade e possibilidade de produzir
estruturas altamente ordenadas.
1.1 Monocamadas Auto-Organizadas e Biossensores
O uso de monocamadas auto-organizadas tem crescido intensamente nos
últimos 20 anos, e sua aplicação mais freqüente pode ser constatada dentro da
eletroanalítica, principalmente na modificação de superfícies eletródicas para a
construção de (bio)sensores (GOODING et al., 2003). Este tipo de modificação
emprega camadas monomoleculares que exibem alta organização e que são
formadas espontaneamente como conseqüência da imersão de uma superfície
sólida em uma solução constituída de moléculas anfóteras. Enquanto que a
adsorção deste tipo de molécula é o resultado da afinidade de um grupo funcional
do adsorvente, que interage fortemente com o substrato, a força motriz para a
organização origina-se a partir de interações hidrofóbicas (do tipo Van der Waals,
por exemplo) das cadeias carbônicas ligadas ao grupo cabeça (SELLERS et al.,
1993).
Existem basicamente três abordagens por meio das quais as SAMs têm
sido desenvolvidas e aplicadas em eletroanalítica. Elas podem ser classificadas de
acordo com o mecanismo de fixação da monocamada sobre superfícies sólidas. A
mais remota delas tem sido as SAMs formadas a partir de alquilclorosilanos,
9
alquilalquoxisilanos e alquilaminosilanos que requerem superfícies hidroxiladas
como substratos para sua formação. A força que dirige para a auto organização é
a formação de polisilanos, o qual está conectado a grupos silanóis na superfície (-
SiOH) via ligação Si-O-Si (ULMAN, 1996).
A segunda técnica para a confecção de monocamadas está relacionada a
técnica de Langmuir-Blodgett (LB) na qual um filme monomolecular, em geral, é
formado sobre uma superfície de uma subfase aquosa, denominado filme de
Langmuir, e depois transferido para um substrato sólido, através da imersão e
retirada do substrato, verticalmente, da subfase. A repetição dos processos de
imersão e retirada permite deposição de camadas, que podem ser altamente
organizadas. Os materiais tradicionais empregados com a técnica LB são os
anfifílicos, com partes polares e apolares bem definidas, tais como os ácidos
graxos, álcoois, ésteres e fosfolipídios de cadeias longas (FERREIRA et al., 2005).
A produção de filmes LB de boa qualidade requer a obtenção de filmes de
Langmuir estáveis sobre a subfase aquosa, o que nem sempre é trivial,
principalmente para as macromoléculas.
A terceira categoria de monocamadas auto-organizadas tem crescido
constantemente no decorrer dos últimos anos (MENDLER & TURYAN, 1996;
GOODING & VIJAYAMOHANAN, 1999; CHAKI & VIJAYAMOHANAN, 2002) e foi
a SAM usada neste trabalho e que será melhor comentada. Este tipo de formação
de SAM envolve uma adsorção irreversível de alcanos funcionalizados sobre
superfícies metálicas, sendo que os sistemas mais comumente usados têm sido
os tióis sobre superfícies de ouro (ULMAN,1996; O´DWYER et al., 2004), devido à
estabilidade da ligação RS-Au, resultando na obtenção de uma estrutura
molecular ordenada, especificamente orientada (Figura 4). Além disso, a
capacidade do uso de tióis com diferentes grupos funcionais torna possível o
desenvolvimento de superfícies com propriedades e funções distintas, viabilizando
interações quase específicas entre a superfície eletródica e o material biológico,
com alto grau de controle sobre sua arquitetura molecular (FREIRE et al., 2003).
Essas características têm levado a um uso extensivo de eletrodos modificados
com esta última abordagem de formação de SAMs, incluindo estudos
fundamentais da interação de proteínas com superfícies metálicas, no contato
10
elétrico direto entre proteínas redox e eletrodos, bem como na fabricação de
imunossensores e biossensores enzimáticos (FERRETTI et al., 2000).
Adicionalmente, o uso de monocamadas auto-organizadas está associado a
outras vantagens, particularmente no desenvolvimento de biossensores
eletroquímicos, devido a redução observada na corrente relacionada à dupla
camada elétrica e o subsequente aumento na sensibilidade, aumentando a
reprodutibilidade e robustez destes sistemas (CHAKI & VIJAYAMOHANAN, 2002).
Figura 4. Esquema de monocamadas auto-organizadas formadas a partir
de alcanotióis adsorvidos sobre superfície de ouro.
Dentre as vantagens mais importantes do uso das SAMs para a fabricação
de (bio)sensores, podemos destacar (ALLARA, 1995):
1. As monocamadas são fáceis de serem formadas, são estáveis e formam
estruturas ordenadas;
2. As SAMs podem formar membranas que lembram ambientes celulares,
tornando-se adequadas para a imobilização de biomoléculas;
3. A versatilidade na variação do grupo terminal, através de grupos
funcionais diferentes, permite que se obtenham superfícies com características
hidrofóbicas ou hidrofílicas e ainda permitindo reações de imobilização;
4. É necessária uma quantidade mínima de biomolécula para a imobilização
na monocamada, diminuindo custos com reagentes;
5. As monocamadas apresentam razoável estabilidade por um período
longo de tempo, permitindo que sejam utilizadas para a realização de um grande
número de medidas.
Ouro
Enxofre
Cadeia carbônica
11
Porém, SAMs com características hidrofóbicas podem acumular vários
contaminantes e adsorver impurezas, bloqueando o reconhecimento dos sítios da
espécie de interesse analítico.
1.2 Preparação das Monocamadas Auto-Organizadas
A maioria dos estudos que envolvem a formação de monocamadas, desde
os primeiros relatos, está focada na adsorção de tiocompostos em substratos
planares metálicos (NUZZO & ALLARA, 1983; PORTER et al., 1987; BAIN et al.,
1989; BOUBOUR & LENNOX, 2000), devido ao fato de serem mais fáceis de
preparar e por serem compatíveis com um número grande de técnicas de análise
superficial. Estes trabalhos empregam três tipos principais de compostos para a
formação das SAM: alcanotióis (SH(CH2)nX), dialquil dissulfetos (X(CH2)mS-
S(CH2)nX) e dialquil sulfetos (X(CH2)mS(CH2)nX), onde n e m são os números de
unidades de grupos metil e X representa o grupo terminal da cadeia alquílica (-
CH3, -OH, -COOH). O processo adsortivo pode ocorrer via imersão do substrato
sólido em uma solução com as moléculas de interesse e também por meio dos
constituintes tiolados em fase gasosa em superfícies sólidas ou líquidas (no caso
do mercúrio). Porém, o processo de construção da SAM que utiliza o adsorvente
sob forma de gás pode desenvolver monocamadas nas quais o controle estrutural
é dificultado. Adicionalmente, o uso de tióis em solução é uma metodologia mais
simples e conveniente de se preparar em laboratórios sendo, portanto, a mais
amplamente empregada.
Os tióis adsorvem espontaneamente em diversos metais, porém o ouro é o
mais utilizado. Isso ocorre, pois o ouro forma monocamadas bastante estáveis e é
fácil de ser obtido (tanto na forma de filmes finos como colóides), é um metal
razoavelmente inerte (não reage com o oxigênio atmosférico), os filmes de ouro
são substratos usados em um número razoável de técnicas espectroscópicas e
analíticas e é compatível com estruturas celulares sem toxicidade (YANG et al.,
1995).
Outros materiais podem oferecer propriedades similares, mas as SAM
formadas com esses materiais têm sido menos estudadas que o ouro. A prata é o
12
metal mais encontrado na literatura em trabalhos envolvendo a formação de
monocamadas depois do ouro, porém o mesmo se oxida facilmente quando
exposto ao ar e também é tóxico para células (DOWLING et al., 2001). O cobre
possui também propriedades interessantes para a construção de SAM, mas é
mais susceptível a oxidação que a prata (LAIBINIS et al., 1991).
O paládio tem se tornado uma alternativa prática para algumas aplicações
envolvendo SAM, embora seja bem menos estudado que os metais citados
anteriormente. Seu uso é atribuído a formação de monocamadas com menores
irregularidades, devido ao fato de ser 2 ou 3 vezes menos rugoso que superfícies
de ouro, (CARVALHO et al., 2002; LOVE et al., 2002) e por sua
biocompatibilidade, podendo ser utilizado em estudos de aderência celular.
Porém, a ligação com moléculas tioladas é menos estável que com os suportes de
ouro, prejudicando a estabilidade do sistema.
Há, entretanto, um número de fatores experimentais que podem afetar a
estrutura da monocamada resultante, a reprodutibiidade e a sua taxa de formação.
Algumas aplicações das SAM exigem o aparecimento de irregularidades na
monocamada construída, porém outras requerem a otimização das condições a
fim de minimizar a formação de defeitos estruturais, principalmente em estudos de
corrosão. Os fatores principais que influenciam no desenvolvimento das SAM são:
• Solventes: etanol é o solvente mais utilizado, por dissolver uma variedade de
tiocompostos, com diferentes polaridades e tamanho das cadeias carbônicas, ser
pouco tóxico, ser de baixo custo e de pureza elevada.
Os efeitos da escolha do solvente na cinética de formação e mecanismo de
organização são complexos e pouco estudados. O parâmetro mais importante
que governa a adsorção do tiol está relacionado a interações solvente-substrato e
solvente-adsorbato. Se as moléculas tioladas possuem mais afinidade pelo
solvente que pela superfície metálica, a taxa de formação da SAM será altamente
afetada. E se o solvente possuir grande afinidade pelo substrato, pode ocorrer um
impedimento da troca das moléculas do solvente pelas do adorbato, dificultando a
adsorção do tiol.
13
Estudos sugerem que a taxa de formação de SAM a partir de alcanotióis é
mais rápida em certos solventes apolares de cadeias carbônicas curtas (heptano,
hexano) que em etanol (PETERLINZ & GEORGIADIS, 1996; DANNENERGER et
al., 1998). Os solventes com longos hidrocarbonetos apresentam forte interação
com o adsorbato em solução, dificultando o processo adsortivo do tiol. Medidas
eletroquímicas e de ângulos de contato de SAM formadas de tióis em solventes
orgânicos não polares mostram que estas monocamadas são menos organizadas
que aquelas formadas em etanol (BAIN et al., 1989; YAMADA et al., 1999).
Neste contexto, estudos dos efeitos do solvente no empacotamento das
monocamadas indicam que a escolha do solvente influencia claramente na
qualidade da SAM depositada por meio de soluções, mas permanece uma falta de
entendimento mais efetivo da relação solvente, superfície e adsorbatos durante o
processo de formação.
• Temperatura: O preparo de SAM em temperaturas superiores a 25 °C pode
melhorar a cinética de formação e reduzir o número de defeitos produzidos.
YAMADA et al. (2000) sugerem que a quantidade de vacâncias diminui
linearmente com o aumento da temperatura, mas em relação ao arranjo estrutural
as monocamadas não variaram significativamente. Porém, as SAM em altas
temperaturas (acima de 80 °C) podem dessorver da superfície metálica
(NAKAMURA et al., 2002).
• Concentração e Tempo de Imersão: Estes dois parâmetros são inversamente
proporcionais, ou seja, baixas concentrações de tióis em solução requerem
tempos maiores de imersão (BENSEBAA et al., 1997). Experimentalmente, as
SAM formadas em soluções bem diluídas, menores que 1 µmol L-1, mesmo em
tempos longos de imersão, como os de uma semana, não exibem as mesmas
propriedades físicas que aquelas formadas em soluções mais concentradas (BAIN
et al., 1989). Isto ocorre, pois a quantidade de impurezas ou outros os compostos
produzidos pela oxidação dos tióis, podem complicar o uso de soluções
extremamente diluídas para formar as monocamadas.
14
Muitos estudos empregando espectroscopia e eletroquímica sugerem que
as SAM formadas em soluções contendo 10 µmol L-1do respectivo tiol, não
mudam significativamente com o aumento do tempo de imersão acima de 18
horas. Porém outros estudos indicam que a estrutura das SAM pode continuar a
se desenvolver acima de 7 dias e implicam que a cobertura da superfície aumenta
com tempos de imersão extensos, diminuindo o número de defeitos (LI &
CROOKS, 1991).
A maioria dos trabalhos típicos encontrados na literatura para a formação
de monocamadas não utiliza tempos superiores a 12 horas, pois fornece SAM
com propriedades convenientes para várias aplicações. Entretanto, tempos de
imersão maiores podem melhorar a reprodutibilidade das SAM e aumentar a
confiabilidade, principalmente em estudos de transferência de elétrons.
• Limpeza do Substrato: este provavelmente seja o fator mais crítico para a
obtenção de SAM reprodutíveis e com minimização dos defeitos. Superfícies
contendo impurezas diminuem a adsorção dos tióis que ocorre por meio de um
processo de troca. As impurezas presentes na superfície são dessorvidas e
trocadas pelas moléculas de tiol e, conseqüentemente, esta taxa de dessorção
dos contaminantes afeta a cinética de formação das SAM. Na literatura, são
encontradas metodologias diferentes para a realização da limpeza superficial, que
variam de acordo com o tipo de substrato utilizado para a preparação das
monocamadas. CREAGER & OLSEN (1995) limparam eletrodos de ouro
policristalino com polimento em alumina e imersão por 1-2 minutos em água régia
diluída. GIZ et al. (1999) usaram a metodologia de aquecimento em chama de H2
para os eletrodos de ouro monocristalino (111) antes dos experimentos. WANG et
al. (2000) empregaram uma solução sulfocrômica para limpeza de eletrodos de
ouro, seguida de polimento em alumina e ainda uma limpeza eletroquímica
realizada em solução 0,5 mol L-1 de H2SO4 entre –1,5 e 1,8 V (vs. Eletrodo de
calomelano saturado-ECS) durante 25 ciclos. O método mais empregado para a
limpeza de superfícies eletródicas para a preparação de SAM envolve a imersão
dos eletrodos, após polimento, por alguns minutos em solução “piranha” recém
15
preparada, consistindo de 1:3 H2O2 30% - H2SO4 concentrado (CARVALHAL et
al., 2005).
A exposição prolongada das superfícies limpas às condições ambientes
pode permitir novamente a adsorção de impurezas nos eletrodos e, desta forma, a
formação das SAM deve ocorrer imediatamente após a etapa de limpeza
superficial.
1.3 Adsorção de Tióis de Solução
Estudos envolvendo a adsorção de tióis (RSH) ou seus dissulfetos análogos
(RSSR) em superfícies de ouro sugerem que as monocamadas formadas por
estas duas substâncias apresentam estruturas similares (BAIN et al, 1989;
BIEBUYCH et al., 1994). Um dos fatores que tem levado ao uso predominante dos
tióis na escolha dos reagentes para a construção de SAM é que os tióis
apresentam solubilidade mais elevada que seus respectivos dissulfetos.
Os dialquilsulfetos (RSR’) formam SAM que são similares àquelas formadas
por tióis e dissulfetos, porém com uma diminuição na estabilidade (JUNG et al.,
1998). Isto ocorre pois os sulfetos não adsorvem da mesma maneira que os outros
tiocompostos, pois existe a necessidade da quebra da lição C-S durante o
processo de formação de SAM e, adicionalmente, alguns trabalhos indicam que as
monocamadas são menos organizadas quando se utiliza sulfeto (NOH et al., 2000;
NOH et al., 2002). Entre as vantagens de se utilizar os sulfetos podemos citar que
estes são menos susceptíveis a oxidação que tióis e ainda, se possuírem estrutura
RSR’, serão convenientes para formar SAM com grupamentos R diferentes na
superfície, denominadas, neste caso, de SAM mistas.
A coadsorção de uma mistura de tióis com grupamentos R distintos (RSH +
R’SH) e a adsorção de dissulfetos assimétricos (RSSR’) são outras maneiras de
preparação de SAM mistas, que permitem uma ampla variedade de composições
estruturais. Teoricamente a fração molar de um adsorbato específico na SAM
reflete a fração molar deste adsorbato em solução, desde que as afinidades dos
compostos pela superfície sejam similares. Entretanto, o processo de organização
é um equilíbrio dinâmico que favorece a formação da SAM mais energicamente
16
estável e, neste contexto, a composição da SAM pode ser desviada da taxa inicial
de componentes estabelecido pela estequiometria dos precursores, no sentido de
favorecer um composto em relação a outro. Esta taxa de constituintes moleculares
das SAM pode ser também alterada por meio da modificação das condições
experimentais, por exemplo, pela escolha do solvente, se compostos com
polaridades distintas forem utilizados (KANG et al., 1998).
O mecanismo pelo qual as SAM são adsorvidas na superfície metálica
ainda é muito divergente, principalmente em relação a estudos cinéticos, como os
da taxa de formação. Em um dos recentes trabalhos, BAIN et al. (1989) estudaram
a cinética de adsorção de alcanotióis de cadeias longas com concentrações
variando entre 10-4 a 1 mmol L-1 em etanol, usando elipsometria e medidas de
ângulo de contato. Os autores reportaram um processo adsortivo constituído de
dois estágios. Durante os primeiros dois minutos a espessura do filme alcança de
80-90% do valor final. O processo é seguido por uma etapa mais lenta, 10-20h, na
qual ocorre a organização dos filmes com a finalidade de se obter monocamadas
mais perfeitas. SHIMAZU et al. (1992) empregaram microbalança de cristal de
quartzo (QCM) para avaliar a cinética de adsorção de ferrocenil undecanotiol 0,5
mmol L-1 em hexano e também reportaram um processo de duas etapas, sendo o
primeiro deles mais rápido, em torno de 10s, seguido por um passo mais lento que
é duas ordens de magnitude maior que o tempo inicial, no qual as moléculas
adsorvidas sofrem uma melhora no empacotamento e/ou organização. Uma
cinética de duas etapas também foi verificada por KIM et al. (1998) mas somente
para tióis de cadeia curta (menores que 10 carbonos). KARPOVICH &
BLANCHARD (1994) estudaram que a adsorção de 0,3 mmol L-1 de
octanodecanotiol em hexano em eletrodos de ouro policristalino e verificaram que
esta ocorre rapidamente, dentro de 3 a 4 s. Os autores também mostraram que a
adsorção segue uma isoterma simples de Langmuir. HU & BARD (1998)
examinaram o processo adsortivo do ácido mercaptoundecanóico em solução
alcalina e observaram duas etapas de adsorção, sendo que no primeiro passo é
alcançada uma cobertura superficial de aproximadamente 60% em um tempo de
15 min, seguido por um processo de organização mais lento que se estende a 3h.
Os autores também acreditam que o processo seja descrito segundo uma
17
isoterma de Langmuir. Entretanto, BENSEBAA et al. (1997) encontraram que o
processo adsortivo de um tiol de cadeia longa em ouro policristalino leva menos
de um minuto, até mesmo em concentrações abaixo de 5 µmol L-1. DE BONO et
al. (1996) encontraram que para uma solução 10 µmol L-1 de dodecanotiol o
processo de adsorção ocorre por 1000 s formando 50-80% da monocamada e
uma segunda etapa de organização com duração de 8 h.
Embora as discussões acima indiquem divergências quanto ao tempo de
adsorção dos tióis e organização das monocamadas, há um consenso geral de
que a formação de SAM de tióis ocorre em duas etapas, segundo um processo
adsortivo descrito pelo modelo de Langmuir: inicialmente uma quimissorção
caótica, seguida de uma etapa organizacional que é dependente do tempo.
Porém, é evidente que a duração destas etapas varia bastante entre os trabalhos,
mesmo quando a mesma técnica é utilizada, como no caso da microbalança de
quartzo.
1.4 Caracterização das SAM
As estruturas das monocamadas auto-organizadas e o mecanismo pelo
qual as mesmas se organizam ainda são objetos de estudo e a quantidade de
técnicas usadas nestas caracterizações aumentou consideravelmente desde o
primeiro relato de formação das SAM.
A extensa literatura sobre as monocamadas tem estabelecido uma idéia
consensual, embora simples, de que as SAM exibem naturalmente um alto grau
de ordem estrutural após a organização lateral sobre substratos limpos. Mas
deve-se considerar, entretanto, que as SAM são materiais dinâmicos que
possuem formas estruturais complexas, especialmente quando formadas a partir
de soluções (BADIA et al., 2000; POIRIER, 1997, YANG & LIU, 2003). As
monocamadas apresentam uma diversidade de defeitos na superfície, intrínsecos
ou extrínsecos, que a natureza termodinâmica do processo de organização muitas
vezes não consegue remover.
As monocamadas de interesse prático são formadas em uma superfície
reativa e o mecanismo envolvido na adsorção de tióis em ouro é, em princípio, o
18
mais empregado mas permanece ainda o mais enigmático. Isso porque o ouro não
forma óxido facilmente na superfície (como a prata) e a formação de SAM de tióis
é quimicamente menos complicada se a adsorção ocorrer por meio de troca ou
redução dos óxidos metálicos na superfície. Porém, o detalhamento da natureza
da ligação enxofre-metal e o arranjo espacial dos átomos de enxofre no substrato
de ouro permanecem controversos. E ainda menos conhecida é a ligação de
tiocompostos com outros metais, como paládio, cobre e mercúrio, que possuem
reatividades distintas com os adsorbatos. Sabe-se, porém, que a organização
ocorre espontaneamente e epitaxialmente, ou seja, segundo o arranjo cristalino do
metal (LOVE et al., 2005) e origina-se a partir de interações hidrofóbicas (por
exemplo, do tipo van der Waals) das cadeias carbônicas ligadas ao grupo
funcional. Os grupamentos alquílicos se encontram inclinados a um ângulo α entre
26 a 28° em relação à superfície de ouro (SCHREIBER, 2000), conforme se
observa na Figura 5. Porém, estes valores de ângulos são mais freqüentes
quando se utilizam tióis com grupo terminal –CH3 com cadeia linear (alcanos).
Estudos indicam que a variação na estrutura da cadeia e mesmo no grupo
terminal pode alterar o ângulo de inclinação para valores maiores ou menores. O
mesmo ocorre quando se modifica o metal usado para substrato, como no caso da
prata em que o α possui valor de aproximadamente 10 ° ou do mercúrio, no qual
este valor é de 0 ° (LOVE et al., 2005). Estes dados sugerem que a organização
química é uma das etapas mais influenciada pela contribuição da ligação Enxofre-
Metal e pelas interações laterais dos grupos orgânicos.
19
Figura 5. Representação esquemática da disposição de uma molécula do tiol, na
qual se observa a inclinação das cadeias carbônicas perpendiculares à superfície
de ouro.
Com relação à estabilidade termodinâmica dos tiocompostos ligados a
superfície de ouro, estudos revelam que tióis de cadeia longa são mais robustos
em suas aplicações que os adsorbatos de cadeia curta (n < 10) devido,
provavelmente, a diferença na força das interações não covalentes entre as
cadeias orgânicas (CAMPUZANO et al., 2006). A organização da camada
orgânica resulta na interação lateral máxima (van der Waals, pontes de
hidrogênio) dentro da limitação geométrica imposta pela estrutura dos tióis. A
interação cadeia-cadeia contribui~1,0 kcal mol-1 com a estabilidade da SAM para
cada grupamento metil presente na camada orgânica (FINKLEA et al., 1987). E,
dessa forma, os grupos orgânicos também restringem a densidade de cobertura:
efeitos estéricos das cadeias carbônicas podem limitar o arranjo dos átomos de
enxofre na superfície metálica.
20
1.4.1 Caracterização de Defeitos nas SAM
Devido as SAM serem formadas por uma auto-organização e por adotarem
uma estrutura termodinamicamente direcionada por meio de um processo
quimissortivo complexo, as monocamadas proporcionam, na teoria, um acesso
conveniente a uma interface altamente organizada, nas quais estruturas
moleculares podem ser variadas com a finalidade de alteração de suas
propriedades. Apesar desta elevada ordem no sistema, muitas vezes torna-se
inevitável que irregularidades sejam produzidas nas monocamadas e a
caracterização dos defeitos é de extrema importância, uma vez que os mesmos
podem prejudicar algumas aplicações que envolvam as SAM, tais como processos
de corrosão e de tunelamento de elétrons, bem como tornar possível outras
avaliações, como os estudos de transferência de elétrons e formação de
microeletrodos.
As causas para a formação de defeitos nas monocamadas podem ser
explicadas por fatores intrínsecos ou extrínsecos: fatores externos, tais como os
métodos de preparação e de limpeza do substrato, a pureza das soluções dos
adsorbatos, e por fatores resultantes do simples fato das SAM se apresentarem
como sistemas dinâmicos com comportamento complexo, neste caso com
influência principal da estrutura e tamanho das cadeias orgânicas dos
tiocompostos.
Podem ser caracterizados nas SAM basicamente os defeitos de ordem
estrutural e os sítios em colapso. A diferença entre eles é que nos defeitos
estruturais os íons do eletrólito podem alcançar a superfície eletródica, enquanto
que os íons somente se aproximam da superfície a uma distância pequena nos
sítios em colapso (DIAO et al., 2001). SUN & CROOK (1991) estudaram a
distribuição das irregularidades na SAM usando microscopia de varredura por
tunelamento (STM) e observaram que os defeitos possuíam diâmetro de cerca de
1-5 nm. Também com o emprego da STM, KIM & BARD (1992) encontraram
defeitos com diâmetros de alguns nanômetros e com profundidade de 8 Å. BECKA
& MILLER (1992) estudaram a influência dos sítios em colapso em medidas
cinéticas. Os autores avaliaram uma SAM formada pelo octanecanotiol, preparada
21
em etanol por 24 ou 48 h, e encontraram que essas monocamadas possuíam
sítios em colapso, embora resultados voltamétricos indicaram uma passivação da
superfície eletródica, concluindo que a SAM não apresentou defeitos estruturais.
Utilizando-se de octadecanotiol e espectroscopia de impedância eletroquímica,
DIAO et al. (2001) mostraram que os defeitos estruturais da SAM formada a partir
deste tiol vão diminuindo conforme se aumenta o tempo de adsorção. Em tempos
maiores que 24 h, estes defeitos praticamente desaparecem. Porém, como os
autores observaram um aumento do raio de defeitos com o passar do tempo, eles
atribuíram estes raios aos sítios em colapso, que podem ser vistos mesmo com a
monocamada com alto grau de empacotamento. A Figura 6 ilustra alguns dos
defeitos produzidos em uma superfície recoberta com monocamadas.
Figura 6. Ilustração esquemática de alguns dos defeitos intrínsecos ou extrínsecos
encontrados em SAM formadas em substrato de ouro policristalino. A linha preta
contínua na interface metal-enxofre indica as variações topográficas do substrato.
Um dos tipos de defeitos inerentes à construção da SAM em superfície de
ouro é a vacância monoatômica, ou seja, algumas regiões da SAM que possuem
um desnível das regiões vizinhas, ocasionado pela diminuição de átomos de ouro
presentes na superfície em determinados locais. A provável origem das vacâncias
é facilmente entendida se considerarmos uma superfície de ouro monocristalino
(111). A adsorção de tióis na superfície limpa induz a uma mudança na densidade
de átomos superficiais. Na relaxação da superfície, pode ocorrer um desnível ou
22
até mesmo espaços vagos dos átomos de ouro, prejudicando o desenvolvimento
da monocamada nestes pontos (LOVE et al., 2005).
1.4.2 Métodos para a Caracterização de SAM
Uma variedade de métodos experimentais tem sido usada para constatar a
qualidade e a natureza química de monocamadas, desde as técnicas
macroscópicas até técnicas mais pontuais, como a microscopia de tunelamento
com varredura (STM) e a microscopia de força atômica (AFM). Embora as
técnicas microscópicas proporcionem uma informação mais detalhada a respeito
da estrutura e ordem das monocamadas, elas não são capazes de avaliar as
propriedades dos filmes. Para estas características são mais empregadas as
medidas de Ângulo de Contato que são freqüentemente utilizadas para examinar a
hidrofilicidade ou hidrofobicidade da superfície (CASSIE, 1948); a espessura dos
filmes são comumente verificados com Elipsometria (PORTER et al., 1987); as
medidas de Espectroscopia de Fotoelétrons Excitados por Raio-X (XPS) mostram
a natureza química das SAM, como o tipo de ligação entre o enxofre e o metal e
os estados de oxidação dos átomos constituintes das SAM (NUZZO et al., 1990);
para medir as freqüências vibracionais das ligações entre as moléculas são
utilizados resultados obtidos com o auxílio da Espectroscopia de Infravermelho
com Transformada de Fourier (FTIR) (PORTER et al., 1987); para o
acompanhamento de processos cinéticos, como constantes de associação,
dissociação e taxas de adsorção dos tiocompostos, podem ser empregadas as
medidas de Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR) (PETERLINZ &
GEORGIADIS, 1996) ou de Microbalança de Cristal de Quartzo (QCM) (PAN et
al., 1996); a combinação de SAM e eletroquímica proporcionam análises
sofisticadas dos filmes e o controle da reatividade da SAM com as espécies
presentes no eletrólito, que podem propiciar informações relativas ao grau de
cobertura, as taxas de transferência de elétrons, a capacitância e resistência do
sistema, sendo que para a medida destes últimos parâmetros, normalmente se
emprega a Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS).
23
Para a caracterização das monocamadas auto-organizadas estudadas
neste trabalho foram utilizadas as técnicas eletroquímicas (voltametria cíclica,
amperometria, impedância) e a SPR. Como as técnicas eletroquímicas já estão
bem consolidadas na literatura, optou-se por fornecer uma explicação mais
detalhada a respeito da Ressonância de Plásmons de Superfície, devido a sua
relativa novidade na avaliação das SAM.
1.4.3 Aspectos Teóricos da Ressonância de Plásmon de Superfície
O plásmon de superfície (SP) é uma onda eletromagnética longitudinal que
se propaga na interface entre dois meios contendo constantes dielétricas distintas,
como um metal e um dielétrico. Os plásmons de superfície são criados quando a
energia da luz p-polarizada provoca uma oscilação na densidade de elétrons livres
presentes no filme metálico e, desta forma, a escolha do metal é um fator crítico,
pois o mesmo deve exibir um comportamento de elétrons livres. O metal mais
utilizado é o ouro, porém outros metais também podem ser usados como a prata,
o cobre e o alumínio. Os SPs possuem intensidade máxima na interface e decaem
exponencialmente conforme se distanciam da interface (LIEDBERG et al., 1993)).
Para excitação do plásmon de superfície, diferentes sistemas foram
desenvolvidos como as configurações por grades de difração e de Kretschmann. A
configuração baseada na reflectância total atenuada, desenvolvida por
Kretschmann, é a mais utilizada na maior parte dos instrumentos de SPR, pois
geralmente apresentam maior sensibilidade e resolução em relação à outra
configuração (SAMBLES et al., 1991).
Nos sistemas que operam na configuração Kretschmann, quando um feixe
de luz monocromático se propaga em um meio óptico denso, como o prisma, e
alcança uma interface entre este meio e um meio de densidade óptica menor, por
exemplo o ar, a luz é totalmente refletida na interface e propaga de volta ao meio
contendo uma densidade óptica maior. Embora o feixe de luz seja completamente
refletido, uma fração da onda incidente penetra no meio menos denso e se
estende até o ambiente gerando uma onda evanescente. Se o prisma é recoberto
com uma camada de um condutor adequado, como um metal, com uma
24
espessura adequada, o componente p-polarizado do campo evanescente pode
penetrar na camada metálica e excitar as ondas eletromagnéticas de plasma de
superfície (HOMOLA et al., 1999), como apresentado na Figura 7.
Figura 7. Esquema da configuração de Kretschmann baseada na reflexão
total atenuada, onde E é o campo evanescente, Kx o vetor da luz incidente e Ksp o
vetor de plasma de superfície.
Em um determinado ângulo de incidência do feixe de luz, quando a
constante de propagação da onda de SP é igual ao vetor da luz incidente (Ksp=Kx),
ocorre o acoplamento dos elétrons oscilantes do filme metálico promovendo a
excitação ressonante do plasma de superfície. Como conseqüência, ocorre uma
perda da energia da luz incidente para o filme metálico, resultando na diminuição
da intensidade da luz refletida.
Sabendo-se que o vetor da luz incidente é dado por:
Kx= θsengon
c
W (1)
onde Wo é a frequência da luz incidente, c é a velocidade da luz no vácuo, ng é o
índice de refração do meio denso (prisma) e θ é o ângulo de incidência de luz, e
25
que o vetor de onda de plasma de superfície está relacionado com a equação a
seguir:
Ksp=
2/1
2sm
2smo
n
n
c
W
+ε
ε (2)
onde, εm é a constante dielétrica do filme metálico e ns é o índice de refração do
meio dielétrico, então, quando Ksp=Kx, tem-se:
senθ=g
2/1
2sm
2sm
n
1
n
n
+ε
ε (3)
O vetor de onda de SP está diretamente relacionado ao índice de refração
do meio sobre o filme metálico. Se este meio sofre alguma alteração, pela
adsorção de uma camada, por exemplo protéica, uma mudança no ângulo de
incidência é requerida para que a excitação ressonante do plasma de superfície
ocorra (CARVALHO et al., 2003). Desta forma, é possível aplicar o fenômeno da
ressonância de plasma de superfície ao monitoramento de alterações na
superfície, mediante um acompanhamento da reflectividade da luz incidente ou do
ângulo de ressonância pelo tempo. Neste contexto, é possível obter informações
sobre a velocidade e extensão da adsorção possibilitando determinação de
propriedades dielétricas, constantes cinéticas, como as de associação e
dissociação, bem como as constantes de afinidade em interações específicas
(JUNG et al., 1996).
Uma configuração esquemática de um instrumento típico de SPR é
apresentada na Figura 8. A superfície, neste caso, foi modificada para monitorar
os processos de adsorção/interação.
26
Figura 8. Representação esquemática de um instrumento típico de SPR.
Em destaque uma curva mostrando a diferença no ângulo de incidência quando
há interação de um ligante com a camada imobilizada na superfície, sendo (I) sem
interação e (II) após interação, e uma curva de associação, na qual há um
aumento do ângulo de incidência com o tempo.
1.5 Removendo as SAM da Superfície
Há diferentes técnicas para remover monocamadas da superfície de ouro,
prata e outros substratos. A dessorção térmica (LOVE et al., 2005) é a mais
conveniente para a remoção de SAM de monocristais usando UHV (ultra vácuo).
O polimento, visto que as monocamadas são mecanicamente frágeis, e o
tratamento com oxidantes ou redutores químicos, tais como ácido ou bases
concentrados e solução “piranha”, são procedimentos efetivos na limpeza
superficial (CARVALHAL et al., 2005) bem como de suspensão de nanopartículas,
como os colóides (LOVE et al., 2005). Porém, existem três metodologias que têm
sido amplamente utilizadas para a remoção das monocamadas e, dessa forma,
usadas também em estudos de caracterização de SAM. São elas:
• Dessorção Eletroquímica: os tióis sofrem dessorção redutiva quando
potenciais mais negativos são aplicados em eletrodos metálicos (WIDRIG et al.,
1991; FINKLEA, 1996; IMABAYASHI et al., 1997). Para que ocorra a dessorção
27
eletroquímica, as superfícies recobertas são imersas em solução aquosa ou
etanólica (pH neutro ou básico) (MUNAKATA et al., 2004). O processo dessortivo
de tióis dos substratos pode ser explicado pela seguinte reação:
RS-M + é RS- + M0
Tanto o tiolato como a superfície metálica se tornam solvatados, o que faz
com que o tiolato de difunda para longe da superfície. O processo é reversível, ou
seja, pode ocorrer a readsorção dos tióis nos metais em potenciais mais positivos.
Os estudos do mecanismo deste processo sugerem que a dessorção ocorre
primeiramente nas regiões de defeitos das SAM para prosseguir para regiões
melhores organizadas e mais empacotadas (MULDER et al., 2001). O potencial no
qual ocorre a dessorção dos tióis depende de vários fatores, incluindo o tamanho
da cadeia, o grau de organização da SAM, a força das interações intermoleculares
no filme orgânico e a cristalinidade dos substratos (KAWAGUCHI et al., 2000).
Um potencial típico de dessorção para alcanotióis encontrado na literatura
é de –1,0 V (vs. Eletrodo de Calomelano Saturado - ECS), mas este valor pode
variar em torno de ± 0,25 V conforme se altera a estrutura da cadeia carbônica.
Com esta variação dos potenciais de dessorção com a mudança do tiol, se torna
possível dessorver um componente de uma SAM mista seletivamente pelo
controle do potencial aplicado (IMABAYASHI et al., 1997).
• Deslocamento de SAM por Troca: as moléculas que constituem uma SAM,
quando expostas a soluções contendo outros tióis ou dissulfetos, trocam de
posições gradualmente, num período que pode levar de minutos a horas. Esta
reação de troca geralmente não produz uma monocamada homogênea ou
uniforme e também não retorna a superfície ao seu estado de limpeza inicial.
Porém, a metodologia pode proporcionar uma rota alternativa para gerar uma
nova superfície orgânica em um substrato já recoberto com uma SAM.
Estas trocas ocorrem mais rapidamente em regiões de defeitos ou
desordens nas SAM, similarmente à metodologia de dessorção eletroquímica. A
troca de moléculas presentes em regiões de maior empacotamento é mais lenta,
28
podendo levar até alguns dias (CHIDSEY et al., 1990; COLLARD & FOX, 1991;
YANG et al., 2004).
Para alcanotióis é via de regra afirmar que os de cadeias menores realizam
este processo de troca mais rapidamente que os tióis de cadeias mais longa
(LOVE et al., 2002). Esta característica torna possível a troca de um dos
componentes de uma SAM mista de forma seletiva.
• Fotooxidação de SAM: As monocamadas de tióis formadas em superfícies de
ouro sofrem oxidação quando expostas a irradiação ultravioleta (UV) (HUANG &
HEMMINGER, 1993). Os grupos tióis são convertidos a sulfatos e a SAM
oxidada é facilmente “lavada” da superfície usando solventes polares como água
ou etanol. O mecanismo deste processo ainda não é completamente entendido.
Alguns autores sugerem que a espécie responsável pelo processo de oxidação é
o ozônio produzido pela fotólise de O2 pelo UV (NORROD & ROWLEN, 1998;
ZHANG et al., 1999). Porém, sabe-se que a taxa de oxidação diminui conforme o
aumento do número de carbonos no alcanotiol que forma a SAM (LAIBINIS &
WHITESIDES, 1992).
1.6 A Funcionalização de SAM
As monocamadas formadas por alcanotióis possibilitam gerar superfícies
orgânicas que apresentam uma ampla variedade de grupos funcionais (polares,
apolares, eletroativos, biologicamente ativos). Existem três estratégias para a
composição de superfícies a partir de SAM: (1) por meio da síntese de tióis
funcionalizados e posterior adsorção em superfícies metálicas (BAIN &
WHITESIDES, 1988; BAIN & WHITESIDES, 1989); (2) inserção de tióis
funcionalizados nas regiões de defeitos de uma SAM pré-formada (LEWIS et al.,
2001) (Figura 9a) e (3) modificação da composição da superfície (Figura 9b).
Tanto as reações covalentes como as interações não covalentes (forças de Van
der Waals, pontes de hidrogênio) podem gerar interfaces novas para as SAM.
29
Figura 9. (a) Inserção de um adsorbato com um grupo funcional em regiões
de defeitos de uma SAM pré-formada e (b) transformação de uma SAM com um
grupo funcional (círculos) ou por reação química ou adsorção de um outro
material.
Os grupos funcionais mais comumente estudados são –CH3, –COOH, -OH
e –NH2, devido as suas propriedades relevantes para a ciência de materiais como
a resistência à corrosão (JENNINGS et al., 2003), adesão (HOUSTON & KIM,
2002), fricção (LEGGET, 2003). O método para a modificação de SAM utilizando-
se a síntese de tióis funcionalizados é usualmente laborioso, mesmo para
moléculas simples, como alcanotióis de cadeia normal. No entanto, a modificação
de SAM após a sua formação oferece algumas vantagens, tais como: (1) emprega
procedimentos sintéticos comuns e, dessa forma, simplifica a preparação das
superfícies funcionalizadas; (2) podem gerar SAM com diferentes grupos terminais
em um curto período de tempo; (3) preserva a organização estrutural da
monocamada e (4) requer uma menor quantidade de ligante para a modificação
(<1014 moléculas), fato que minimiza os custos para uma possível aplicação deste
tipo de monocamada, principalmente se for de ordem biológica.
30
Há uma grande variedade de classes diferentes de reações orgânicas que
têm sido empregadas para a modificação do grupo terminal das SAM, incluindo as
substituições nucleofílicas, esterificação, acilação e adição nucleofílica.
Uma maneira bastante simples de se modificar os grupos terminais
presentes nas monocamadas é realizando a sua imersão em uma solução
contendo os ligantes apropriados, sob condições reacionais adequadas, que
podem, dessa forma, reagir diretamente com as moléculas presentes em solução.
Muitas técnicas de imobilização de biomoléculas (DNA, polipeptídeos, proteínas)
têm se utilizado das ligações diretas nas monocamadas para a modificação de
superfícies (SONG et al., 2006)
Um outro procedimento empregado na funcionalização de superfícies à
base de SAM é formar um intermediário reativo, o qual é posteriormente acoplado
ao ligante. A principal vantagem desta estratégia é que o intermediário formado
pode reagir com uma variedade maior de ligantes e, por isso, tem sido uma das
mais utilizadas para a construção de sensores.
As reações que envolvem os grupos terminais funcionais das
monocamadas são fortemente influenciadas pela estrutura da SAM e outros
fatores como distância entre os grupos funcionais da interface entre a SAM e a
solução que contém os ligantes, os efeitos estéricos laterais, a organização das
cadeias (empacotamento, grau de desordem), a densidade e a orientação dos
grupos funcionalizados na superfície. Dordi et al. (2003) verificaram que a hidrólise
alcalina de grupos terminais éster hidroxisuccimida em SAM ocorre mais
rapidamente em monocamadas com cadeia carbônica menor (C10) que em
cadeias maiores (C16), e que ambas as reações são mais lentas que a hidrólise
dos tíóis precursores em solução.
A reação dos grupos funcionais terminais é uma estratégia muito
conveniente para a preparação das monocamadas para posteriores aplicações.
Muitas vezes, ao invés de se sintetizar novos tióis, é possível simplesmente a
modificação da sua estrutura final de tióis já imobilizados, o que pode diminuir
custos e aumentar o potencial de uso das SAM (SULLIVAN & HUCK, 2003).
As aplicações das monocamadas formadas a partir de tióis estão
intimamente ligadas às suas características hidrofóbicas ou hidrofílicas, ou até à
31
sua facilidade de carregar positiva ou negativamente a superfície, características
estas que são atingidas, principalmente, por meio de seus grupos terminais.
As monocamadas formadas por alcanotióis são mais utilizadas em
aplicações envolvendo estudos de molhabilidade (WHITESIDES & LAIBINIS,
1990; COLORADO & LEE, 2003), corrosão (JENNINGS et al., 2003), fenômenos
de interface (SUBRAMANIAN & LAKSHMINARAYANAN, 2000), adesão celular.
As monocamadas contendo grupos terminais –NH2, –COOH e –OH são mais
utilizadas em estudos de transferência de elétrons (MENDES et al., 2004), catálise
(FREIRE & KUBOTA, 2004), interações biológicas (MANSUY-SCHLICK et al.,
2006), imobilização/adsorção de proteínas (SMITH et al., 2004) e, principalmente,
no desenvolvimento de (bio)sensores (FREIRE et al., 2003), sendo esta última a
aplicação mais utilizada com as monocamadas auto-organizadas atualmente. No
caso dos biossensores, como discutido anteriormente, as SAM são usadas como
matrizes para a imobilização das biomolécula.
Vários métodos de imobilização para acoplar biomoléculas a superfícies de
eletrodos modificados com SAMs são empregados , dentre elas:
1. Ligação covalente entre os elementos biológicos e a superfície contendo
monocamadas com grupos terminais livres tais como aminas, através da formação
de uma ligação direta da biomolécula com a amina ou ligação cruzada da enzima
com a superfície da monocamada usando um reagente bifuncional. Se o grupo
funcional da SAM tiver um grupo ácido livre (-COOH), normalmente utiliza-se
carbodiimida para tornar possível a ligação;
2. Ligação não covalente entre a monocamada e os biocomponentes via
interação hidrofóbica, hidrofílica ou eletrostática, sendo que neste último caso
sofre influência do pH do meio;
3. Através da afinidade da interação entre o receptor e o reconhecedor,
como o que ocorre quando se utiliza o par antígeno-anticorpo, sendo o sistema
mais utilizado o do biotina-avidina neste tipo de imobilização, sendo que as
enzimas as mais utilizadas.
32
1.7 SAM e o Desenvolvimento de Biossensores para a
Determinação de Peróxido de Hidrogênio
O peróxido de hidrogênio é uma substância importante nas áreas
envolvidas com alimentos (SCHRECK et al., 1996), medicamentos (WANG et al.,
1993; CORVELEYN et al., 1997; CAMPANELLA et al., 1998), monitoramento de
processos (WESTBROEK et al., 1996), dentre outras. Está presente em inúmeras
reações biológicas como principal produto de várias oxidases (GORTON et al.,
1991), e é um parâmetro relevante na quantificação destes bio-processos
(GORTON et al., 1991).
O H2O2 pode ser determinado por volumetria (DIDENKO & PUGACH, 1994;
KLASSEN et al., 1994), espectrofotometria (MATSUBARA et al., 1992; VIEIRA &
FATIBELLO-FILHO, 1998), fluorimetria (HOLM et al., 1987; SAKURAGAWA et al.,
1998), quimiluminescência (QIN et al., 1998; NAVAS), cromatografia
(PINKERNELL et al., 1997; HONG et al., 1998) e por métodos eletroquímicos (LIU
et al., 1995; ZHANG et al., 1999). Com exceção dos métodos eletroquímicos, os
outros métodos citados são vulneráveis a espécies interferentes, apresentando
morosidade no tocante ao preparo de amostra e geralmente requerem o uso de
reagentes de preços elevados. As propostas que utilizam as técnicas
eletroquímicas demonstram, por outro lado, boas seletividade e sensibilidade
(limite de detecção da ordem de 1 µmol L-1), amplo intervalo de determinação e
rápida resposta do eletrodo. Normalmente, o princípio da detecção de H2O2 é pela
oxidação direta em eletrodos de platina ou carbono (MOODY et al., 1986),
entretanto devido a elevados valores de potencial (em torno de 300 a 600 mV vs.
Ag/AgCl) aplicados nos eletrodos de trabalho, estes sensores também se tornam
susceptíveis a outras espécies eletroativas. Para solucionar este problema,
diversos procedimentos de modificações químicas nas superfícies dos eletrodos
têm sido pesquisados (PEREIRA et al., 2002), principalmente aqueles
relacionados à construção de biossensores.
A peroxidase de raiz forte (HRP, do inglês horseradish peroxidase) é o
material biológico mais amplamente utilizado no desenvolvimento de sensores
eletroquímicos enzimáticos para a detecção de peróxido de hidrogênio, devido
33
principalmente a sua alta estabilidade e resistência a um intervalo grande de pH
(RUZGAS et al., 1996). Suas propriedades catalíticas, estruturais e eletroquímicas
foram recentemente revisadas, demonstrando a sua importância e adequação
para as mais diversas matrizes (DEQUAIRE et al., 2002; LIMOGES et al., 2003).
Alguns trabalhos interessantes foram publicados na literatura recentemente,
envolvendo o desenvolvimento de novos biossensores para a determinação de
H2O2 via reação catalítica com a HRP, como o de Santos et al. (2005) que
utilizaram um eletrodo de pasta de carbono contendo sílica gel modificada, a
enzima e diferentes tipos de mediadores . Os autores verificaram que a melhor
resposta foi encontrada usando o azul de metileno como mediador, obtendo-se
uma faixa linear de 1 a 700 µmol L-1 e um limite de detecção em torno de 0,5 µmol
L-1. Com o uso de eletrodos de carbono vítreo, YAO et al. (2005) construíram um
biossensor usando HRP imobilizada em uma matriz de gelatina e azul de metileno
como mediador. Os autores conseguiram uma imobilização enzimática eficiente,
pois o eletrodo apresentou estabilidade por 3 meses, em uma faixa de trabalho de
10 a 1200 µmol L-1 e um limite de detecção de 4 µmol L-1. Um outro tipo de
modificação da superfície de eletrodos de carbono vítreo para a determinação de
H2O2 foi realizado por TANG et al. (2003) utilizando camadas lipídicas para a
imobilização da enzima HRP. Os autores atingiram uma transferência de elétrons
direta entre a enzima e a superfície eletródica, porém foi verificada uma baixa
estabilidade do biossensor, com perda de resposta pela lixiviação do elemento de
reconhecimento em apenas uma semana.
Com a finalidade de preparar eletrodos com maiores estabilidade e
sensibilidade, até mesmo para análises em fluxo, tem sido freqüentemente
utilizada a modificação da superfície de ouro por monocamadas auto-organizadas.
CAMPUZANO et al. (2005) desenvolveram um biossensor amperométrico para a
determinação de peróxido de hidrogênio em amostras de leite e tintura de cabelo
sob fluxo contínuo. O dispositivo baseou-se na imobilização da enzima HRP e do
mediador tetratiofulvaleno em SAM formada pelo ácido mercaptopropiônico por
meio de ligação cruzada com glutaraldeído. A faixa linear encontrada com o
biossensor foi de 20 a 100 µmol L-1, com um limite de detecção de 0,7 µmol L-1 e
uma perda de 20% de sua resposta original após 17 dias de uso. Para preparar
34
biossensores de terceira geração para a determinação de H2O2, SONG et al.
(2006) utilizaram um eletrodo de ouro modificado com SAM para a imobilização,
por interações eletrostáticas, de DNA que, posteriormente, serviu como matriz
para a adsorção da enzima HRP. Embora o efeito positivo do DNA não tenha sido
esclarecido, o eletrodo apresentou faixa linear de 10 a 9700 µmol L-1, com um
limite de detecção de 0,5 µmol L-1.
Atualmente, com relação a construção de biossensores para a
determinação de H2O2, a maior aplicação das monocamadas auto-organizadas
têm sido a sua utilização como matrizes para a adsorção de nanopartículas de
metais. Liu et al. (2005) modificaram eletrodos de ouro com monocamadas de
cistamina que, após reação com glutaraldéido, serviram como matrizes para a
imobilização de dendrímeros com grupos funcionais -NH2. Com a ajuda dos
grupos terminais básicos, as nanopartículas de ouro foram adsorvidas e, sobre
estes, as enzimas HRP. O biossensor apresentou uma faixa linear entre 10 a 2500
µmol L-1 e um limite de detecção de 2 µmol L-1. Além disso, a análise em amostras
reais indicou uma boa exatidão com o método clássico de titulação.
Utilizando-se eletrodos de ouro modificados com SAM de cisteamina, Li et
al. (2004) adsorveram nanopartículas de ouro, nas quais a enzima HRP foi
imobilizada. A faixa de trabalho obtida para o biossensor em solução de peróxido
de hidrogênio foi de 0,3 a 2000 µmol L-1, com limite de detecção de 0,1 µmol L-1.
Um sensor para peróxido de hidrogênio baseado na adsorção eletrostática
de nanopartículas de prata sobre superfícies de ouro modificadas com cisteamina
foi desenvolvido por REN et al. (2005) para a imobilização da enzima HRP. O
eletrodo apresentou resposta linear de 3,3 a 9400 µmol L-1, com limite de detecção
de 0,8 µmol L-1. Apesar da boa sensibilidade do dispositivo, os autores não
relatam experimentos quanto a estabilidade, que seria bastante importante uma
vez que a adsorção das nanopartículas e da HRP foram realizadas fisicamente.
Apesar do elevado número de trabalhos envolvendo a formação de
monocamadas auto-organizadas como matrizes para a imobilização da enzima
HRP, nenhum deles estudou a dependência da estrutura do tiol utilizado na
resposta analítica do biossensor obtido. E, como já foi discutido anteriormente,
quando se varia o tiol empregado no desenvolvimento das SAM, modificam-se
35
também as propriedades da superfície que, certamente, causará influência na taxa
de imobilização enzimática, que é uma etapa crítica na avaliação da sensibilidade
do eletrodo para determinada espécie.
36
CAPÍTULO 2
2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo investigar diferentes métodos de
imobilização da enzima HRP, empregando como suportes as monocamadas auto-
organizadas formadas sobre superfícies de ouro policristalino e verificar a
influência da imobilização no desempenho do biossensor. Para esta finalidade,
foram utilizados diferentes tipos de SAM que variaram na estrutura do tiol, no
tamanho de sua cadeia carbônica e no grupo terminal que se ligará a enzima.
Como objetivos específicos deste projeto, podemos destacar:
A caracterização das monocamadas auto-organizadas formadas,
principalmente quanto ao seu grau de recobrimento sobre a superfície
eletródica e a formação de defeitos;.
A otimização do processo de imobilização enzimática por meio da avaliação
da sensibilidade dos biossensores e da quantidade de elemento de
reconhecimento adsorvido à superfície;
A investigação das melhores condições de pH, concentrações da enzima e
mediador, potencial aplicado e tipo de solução tampão empregada, visando
o aumento do desempenho analítico do biossensor;
A utilização do biossensor proposto na determinação de peróxido de
hidrogênio em amostras comerciais.
37
CAPÍTULO 3
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Reagentes Utilizados
O Glutaraldeído 25% (m/v), Horseradish Peroxidase (HRP) (EC 1.11.1.7)
148 U/mg liofilizada, Cloreto de N-(3-Dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida
(EDC), Ácido mercaptoundecanóico, Ácido mercaptobenzóico e Cloreto de 2-
Aminoetanotiol (Cisteamina) foram obtidos da Aldrich (EUA). Ácido Lipóico,
Cistamina e 3-Ácido mercaptopropiônico foram adquiridos pela Sigma (EUA). A
Hidroquinona utilizada é da marca Merck-Schuchardt (Alemanha). Peróxido de
hidrogênio 30% (m/v), KOH e Etanol (99.5%) são da Synth (Brasil). K3[Fe(CN)6] foi
adquirido pela J.T. Baker (EUA) . N-Hidroxisuccinimida (NHS) é da marca Fluka
(Suíca). Todos os outros reagentes químicos utilizados foram de grau analítico. A
solução tampão fosfato que foi utilizada como eletrólito suporte foi obtida pela
mistura das soluções de 0,1 mol L-1 de Na2HPO4 e 0,1 mol L-1 de NaH2PO4. Todas
as soluções foram preparadas com água deionizada (> 18 MΩ cm, Milli-Q).
3.2 Materiais e Equipamentos
3.2.1 Medidas Voltamétricas
Os experimentos voltamétricos foram realizados em um Potenciostato
GPSTAT 10 da AUTOLAB (Eco Chemie), acoplado a um microcomputador e
controlado pelo software GPES 4.9. Para as medidas hidrodinâmicas, foram
acoplados ao potenciostato um controlador de rotações e um eletrodo de disco
rotatório (RDE), ambos da Methrom. Para tais experimentos, utilizou-se uma
célula eletroquímica de três eletrodos, contendo um eletrodo de ouro da Methrom,
com 0,07 cm2 de área geométrica, como o de trabalho, um contra-eletrodo de
38
platina e o eletrodo de calomelano saturado (ECS) como referência. As medidas
foram realizadas na temperatura ambiente e sem deaeração.
3.2.2 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS)
Os experimentos envolvendo a técnica de EIS foram realizados em um
Potenciostato GPSTAT 30 da AUTOLAB (Eco Chemie), acoplado a um
microcomputador e controlado pelo software FRA. Para tais experimentos, utilizou-
se também uma célula eletroquímica de três eletrodos, contendo um eletrodo de
ouro da Methrom, com 0,07 cm2 de área geométrica, como o de trabalho, um
contra-eletrodo de platina e o eletrodo de calomelano saturado (ECS) como
referência. As medidas foram realizadas na temperatura ambiente e sem
deaeração.
3.2.3 Ressonância de Plásmon de Superfície (SPR)
As medidas ópticas do ângulo de ressonância de plásmon de superfície
foram realizadas em um equipamento ESPRIT da AUTOLAB (Eco Chemie) de
duplo canal e monitoramento contínuo do sinal. O equipamento possui como fonte
de luz um laser com comprimento de onda de 670 nm. Os discos de ouro
utilizados foram obtidos pela Xantec e possuem 50 nm de espessura de ouro.
3.3 Procedimentos Experimentais
3.3.1 Limpeza dos Eletrodos de Ouro
A limpeza da superfície de ouro é uma etapa de grande influência na
formação das monocamadas auto-organizadas e deve ser realizada de forma
sistemática. O pré-tratamento dos eletrodos consistiu de um polimento em politriz,
usando alumina 0,5 µm, até que suas superfícies apresentassem um aspecto
espelhado e, então, foram sonicados em etanol por 5 min. Após a limpeza
39
mecânica, as superfícies metálicas sofreram tratamento químico, com a imersão
dos eletrodos em uma solução piranha (1:3 H2O2 – H2SO4 conc.) a quente por
mais 10 min. Finalmente, após lavagem com água, os eletrodos de ouro foram
limpos eletroquimicamente em solução de H2SO4 0,5 mol L-1, variando o potencial
entre 0,1 a 1,4 V (vs. Eletrodo de Calomelano Saturado – ECS) durante 25 ciclos.
O voltamograma cíclico final foi comparado com aquele reportado por
CARVALHAL et al. (2005), para a confirmação da eficiência da limpeza superficial.
Após intensa lavagem dos eletrodos com água deionizada, foram submetidos a
formação das SAM.
3.3.2 Preparação das Monocamadas Auto-Organizadas
A adsorção dos tióis na superfície eletródica previamente limpa foi
alcançada por meio da imersão dos eletrodos de ouro na solução de etanol do
respectivo tiol, na concentração de 10 mmol L-1, durante 3 horas. Após este
período, foram novamente lavados com etanol, para retirar as moléculas
fisicamente adsorvidas, com água deionizada e secos na temperatura ambiente,
antes de serem utilizados nos experimentos. Os seguintes tióis foram utilizados
neste estudo: ácido mercaptopropiônico (MPA), ácido mercaptobenzóico (MBA),
ácido lipóico (ALP), ácido mercaptoundecanóico (MUA), cistamina (CYS) e a
cisteamina (CISTE) e estão mostrados na Figura 10.
40
Figura 10. Tióis utilizados na imobilização da enzima HRP.
3.3.3 Estudo do Tempo de Imobilização da HRP na Monocamada
Auto-Organizada
Como foram utilizadas diferentes monocamadas, cada uma delas com um
tempo de formação e organização, houve a necessidade de se estudar tanto o
tempo de reação destes tióis com a superfície metálica, quanto o tempo de reação
das SAM com os ligantes EDC/NHS ou glutaraldeído. Para isso, foi selecionado o
tiol mais empregado na literatura para estudos envolvendo as monocamadas auto-
organizadas, no caso, o ácido mercaptopropiônico – MPA.
Primeiramente, foi selecionado um tempo de formação de SAM de 2 horas.
Após lavagem deste eletrodo com etanol e água, foi realizada a reação dos grupos
terminais –COOH da SAM com os ligantes EDC e NHS por 3 horas, por meio da
imersão dos eletrodos em solução aquosa contendo 2 mmol L-1 de EDC e 5mmol
L-1 de NHS. Após uma nova lavagem do eletrodo, foi então colocado em solução
tampão fosfato pH 7,0 contendo 2 mg de enzima em 1 mL de solução. Após este
processo, o eletrodo foi testado em solução contendo 850 µmol L-1 de peróxido de
C
OHO
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
SH
Ácido Mercaptoundecanóico
(MUA)
C
OHO
SH
Ácido Mercaptobenzóico
(MBA)
HS CH2 C
O
OH
CH2
Ácido Mercaptopropiônico
(MPA)
S
SCH
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
C O
OH
Ácido Lipóico(ALP)
HS CH2CH2 NH2
CH2CH2 NH2
CH2CH2 NH2
S
S
Cisteamina(CISTE)
Cistamina(CYS)
TIÓIS
41
hidrogênio e 25 µmol L-1 de hidroquinona em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1,
pH 6,5, usando a técnica de voltametria cíclica, variando o potencial de 300 a –
200 mV, a 50 mV s-1. Como os resultados não foram satisfatórios, uma nova
metodologia foi utilizada com a finalidade de se elevar a quantidade de enzima
imobilizada e, conseqüentemente, a obtenção de uma melhora da resposta
voltamétrica.
Para o segundo procedimento o tempo de formação da SAM foi aumentado
para 3 horas, na tentativa de diminuir os defeitos no eletrodo de ouro e um
aumento dos grupos terminais funcionais na superfície, o que poderia também
aumentar os sítios para reação com a enzima. As outras condições do
procedimento anterior foram mantidas.
No intuito de se conseguir um aumento do sinal, um terceiro procedimento
foi testado. Neste caso, a SAM foi formada na superfície de ouro por 3 horas,
seguida pela reação com os ligantes EDC e NHS por 3 horas, porém com um
tempo de reação para imobilização enzimática de 18 horas.
Após nova avaliação do biossensor, optou-se por um quarto e último
procedimento para verificar se o sinal voltamétrico aumentava. Neste
procedimento, foi mantido o tempo de formação da monocamada por 3 horas,
porém agora o eletrodo modificado foi imerso em uma solução tampão fosfato pH
7,0 contendo EDC e NHS, além de 2 mg da enzima HRP em 1 mL de solução. O
eletrodo permaneceu nesta solução por 18 h, sob refrigeração. Após lavagem do
eletrodo, este foi então testado na solução contendo peróxido de hidrogênio.
3.3.4 Imobilização da HRP na Superfície Eletródica
Após o ajuste do tempo de reação da enzima com o eletrodo recoberto com
a SAM, foram realizados estudos utilizando-se diferentes formas de imobilização
da enzima na superfície eletródica. A enzima peroxidase utilizada neste trabalho
foi a HRP, devido a ampla informação existente na literatura sobre esta
biomolécula. Para sua adsorção na superfície do eletrodo, foram testadas
monocamadas contendo tióis com diferentes estruturas, tamanhos da cadeia
carbônica e grupos terminais. Foram estudadas diversas formas de imobilização
42
para avaliação do método mais eficiente, ou seja, aquele que proporcionaria uma
interação mais estável entre a enzima e a SAM. As metodologias utilizadas na
imobilização do material biológico foram realizadas da seguinte forma:
1. Adsorção física: foram colocados em um béquer 2 mg da enzima, juntamente
com 1 mL de uma solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0. O eletrodo
modificado com a SAM foi imerso nessa solução e permaneceu em geladeira por
18 horas.
2. Carbodiimida (EDC) e N-Hidroxisuccinimida (NHS): foram colocados em um
béquer 2 mg da enzima, 200 µL de solução de N-(3-Dimetilaminopropil)-N’-
etilcarbodiimida 2 mmol L-1, 200 µL de solução de NHS 5 mmol L-1e 600 µL da
solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0. O eletrodo foi imerso nessa solução e
permaneceu em geladeira por 18 horas.
3. Glutaraldeído: foram colocados em um béquer 2 mg da enzima, 200 µL de
solução de glutaraldéido a 25% (m/v) e 800 µL de tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH
7,0. O eletrodo foi imerso nessa solução e permaneceu em geladeira por 18 horas.
O método 1 foi empregado para todas as monocamadas estudadas. O
método 2 foi desenvolvido apenas para SAM com grupo final –COOH e o método
3, apenas para SAM com grupo terminal -NH2.
3.3.5 Estudos Voltamétricos
Para a caracterização das monocamadas auto-organizadas foram
registrados voltamogramas de pulso diferencial para dessorção eletroquímica em
solução de KOH 0,1 mol L-1, variando o potencial de 0,1 a –1,3 V a 20 mV s-1 de
velocidade de varredura e 25 mV de amplitude de pulso, conforme estudo prévio
realizado por IMABAYASHI et al (1997).
43
Como estudos de caracterização dos eletrodos com as diferentes SAM,
foram realizados voltamogramas cíclicos do eletrodo de ouro limpo e dos
modificados com os diferentes tióis. O potencial foi variado entre –100 e 400 mV
em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 contendo 5 mmol L-1 de ferricianeto
de potássio.
Estudos hidrodinâmicos foram realizados com voltametria linear, variando a
concentração de ferro/ferricianeto de potássio de 50 a 350 µmol L-1 em tampão
fosfato pH 7,0. Foram registrados voltamogramas num intervalo de potencial de -
250 a 600 mV (vs. ECS) a uma velocidade de varredura de 10 mV s-1, usando
velocidades de rotação do eletrodo de 0 a 2500 rpm, para cada concentração da
espécie redox.
Para os estudos da sensibilidade dos eletrodos modificados com os
diferentes tipos de tióis e a enzima HRP foram registrados voltamogramas cíclicos
dos eletrodos de 300 a –200 e mV em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5
contendo 25 µmol L-1 de hidroquinona e variando a concentração de peróxido de
hidrogênio de 170 a 1000 µmol L-1 (n=6) a 50 mV s-1.
O estudo da estabilidade dos eletrodos modificados com SAM e HRP foi
avaliado em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 contendo 25 µmol L-1 de
hidroquinona e 85 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio usando voltametria cíclica. A
perda de resposta dos biossensores foi analisada após 100 ciclos de varredura
entre –200 a 300 mV, a uma velocidade de 50 mV s-1.
3.3.6 Estudos de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
Para os estudos de impedância foi aplicado ao eletrodo de trabalho uma
onda senoidal com 10 mV de amplitude a um potencial de 0,2 V (vs. SCE) em uma
faixa de freqüência de 10-2 a 105 Hz em solução de ferricianeto de potássio 5
mmol L-1 em KCl 0,1 mol L-1. O circuito modelo utilizado neste estudo foi o circuito
44
de Randles: Rs(C[RctW]) onde Rs é a resistência da solução, Rct é a resistência de
transferência de carga, W é a impedância de Warburg e C é a capacitância da
dupla camada. Os espectros de impedância foram ajustados pelo programa FRA.
3.3.7 Estudos de Ressonância de Plásmon de Superfície
Uma representação esquemática das curvas obtidas pela ressonância de
plásmon de superfície é apresentada na Figura 11. Para os estudos de SPR
realizado neste trabalho, primeiramente foi feita uma linha de base com tampão
fosfato pH 7,0 do disco de ouro modificado com a SAM, durante 300 s (curva 1 da
Figura 11). Então, a solução enzimática foi injetada na célula óptica e a interação
da HRP com a superfície foi acompanhada por mais 1200 s (curva 2 da Figura
11). Conforme a biomolécula adsorve na monocamada, ocorre uma alteração do
ângulo para que ocorra a ressonância de plásmons de superfície, que é
acompanhada pelo equipamento até que todas as biomoléculas estejam
adsorvidas na superfície do disco (curva 3 da Figura 11). Após este tempo, o disco
de ouro modificado foi lavado novamente com a solução tampão, para a retirada
das moléculas fracamente adsorvidas à superfície e essa lavagem foi
acompanhada por mais 300 s (curva 4). A diferença entre os ângulos obtidos nas
curvas 4 e 1, nos fornece a extensão da adsorção enzimática.
45
Figura 11. Representação esquemática de um processo de associação e
dissociação de biomoléculas na superfície do sensor usando SPR. A mudança no
valor do ângulo SPR é usada para monitorar a extensão da adsorção superficial.
3.4 Avaliação do Desempenho Analítico do Biossensor
3.4.1 Influência da Concentração Enzimática
A avaliação da influência da concentração da enzima HRP no processo de
imobilização foi verificada em função da resposta voltamétrica dos biossensores.
Para isso, foram registrados voltamogramas cíclicos dos eletrodos variando o
potencial de 300 a –200 mV a 50 mV s-1, em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1
pH 6,5, contendo 85 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio e 25 µmol L-1 de
hidroquinona. As concentrações avaliadas da enzima foram de 1,0; 2,0; 3,0 e 4,0
mg mL-1.
3.4.2 Efeito do Potencial Aplicado
Cada experimento foi iniciado com o registro da corrente em função do
tempo, em um dado potencial aplicado, na presença apenas da solução tampão e
46
do mediador, até que a corrente alcançasse um valor constante. Esta corrente é
denominada corrente de fundo ou corrente residual. Neste ponto, o peróxido de
hidrogênio, que é o substrato da enzima, foi adicionado e, com o auxílio de um
agitador magnético, fez-se a homogeneização da solução por 10 s e, após este
tempo, registrou-se a variação de corrente obtida com o passar do tempo. As
respostas foram calculadas comparando-se cada corrente obtida após a injeção
do H2O2, com a corrente de fundo gerada na ausência do substrato.
Por meio destas avaliações, foi verificado o efeito do potencial aplicado na
resposta amperométrica do biossensor em uma solução tampão fosfato 0,1 mol L-1
pH 6,5 contendo 85 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio e 25 µmol L-1 de
hidroquinona. Os potenciais aplicados estudados variaram entre –200 a 50 mV
(vs. ECS).
3.4.3 Influência do Tipo de Solução Tampão e pH
A dependência da resposta amperométrica com o tipo de solução tampão
(FOSFATO, HEPES, PIPES, TRIS e BRITTON-ROBINSON) utilizada como
eletrólito suporte foi avaliada usando o biossensor com melhor desempenho na
imobilização enzimática. Todas as soluções tampão foram testadas em pH 7,0 e
na concentração de 0,1 mol L-1. Selecionada a melhor solução tampão, foi
verificada a dependência do pH na resposta eletródica, variando o pH desta
solução de 5,0 a 8,0.
3.4.4 Estudo da Concentração do Mediador
A influência da concentração do mediador na resposta amperométrica do
biossensor a base de HRP foi investigada em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1,
pH 6,5, na presença de 85 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio. A concentração de
hidroquinona foi variada de 5 a 25 µmol L-1 em um potencial aplicado de –50 mV
(vs. ECS).
47
3.4.5 Avaliação do Biossensor
Alguns parâmetros como sensibilidade, limite de detecção e região linear do
biossensor a base de HRP, foram obtidos por meio da investigação da
característica do sinal amperométrico com o aumento da concentração de
peróxido de hidrogênio em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 em pH 6,5 e com
quantidade constante de hidroquinona.
3.4.6 Estudo da Repetibilidade de Medida e de Preparação dos
Biossensores
A repetibilidade de medida dos biossensores foi obtida por meio da
avaliação da resposta amperométrica do biossensor a base de HRP em solução
tampão fosfato 0,1 mol L-1, pH 6,5, na presença de 85 µmol L-1 de peróxido de
hidrogênio e 25 µmol L-1 de hidroquinona (Eaplicado: -50 mV vs. ECS), para n=6. A
repetibilidade de preparação do biossensor também foi avaliada, nas mesmas
condições descritas acima, usando a resposta de 5 eletrodos diferentes,
construídos com o mesmo procedimento.
3.4.7 Avaliação do Efeito de Memória
O efeito de memória do biossensor foi avaliado empregando soluções com
concentrações diferentes de peróxido de hidrogênio. A concentração mais baixa
continha 8,5 µmol L-1 do substrato e a concentração mais elevada 85 µmol L-1, em
solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5. Para cada concentração de H2O2,
foram realizadas 4 medidas de amperometria seguidas e, estas duas soluções
foram alternadas por 6 vezes para a obtenção dos resultados.
48
3.4.8 Estudo da Estabilidade do Biossensor
Para a determinação do tempo de vida útil do biossensor, realizou-se o
monitoramento da resposta do dispositivo para peróxido de hidrogênio, dia após
dia, usando o mesmo eletrodo de trabalho.
Durante a avaliação do tempo de vida do biossensor, a estocagem foi feita
em geladeira, a 4°C, em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 7,0.
3.4.9 Aplicação do Biossensor em Amostras de Clareamento
Dental
A determinação amperométrica de peróxido de hidrogênio em amostras
odontológicas foi realizada por meio do método de adição de padrão, ou seja,
além da amostra ainda foram adicionados mais quatro volumes de solução
conhecida de padrão de H2O2. A amostra foi diluída em tampão fosfato 0,1 mol L-1
pH 6,5. Para cada adição, tanto da amostra quanto dos padrões, foi realizada uma
medida amperométrica. Destas medidas foram descontadas os valores de
corrente obtidos para o eletrodo de trabalho apenas na solução tampão contendo
25 µmol L-1 do mediador.
Com a finalidade de se verificar a exatidão de determinações
amperométricas de peróxido de hidrogênio, os resultados foram comparados com
o método de referência, ou seja, titulação com tiossulfato de sódio descrita pela
farmacopéia (USP). Para este fim, foi preparada uma solução de tiossulfato 0,1
mol L-1 que foi padronizada com o dicromato de potássio, usado como padrão
primário. Após esta etapa, uma alíquota de H2O2 foi titulada com a solução
padrão. Foi utilizada uma solução de amido como indicador visual do ponto de
viragem (solução passa de azul a incolor).
49
CAPÍTULO 4
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização das Monocamadas Auto-Organizadas
As monocamadas auto-organizadas, como já se discutiu na introdução,
possuem uma metodologia bastante simples de preparação. Porém, alguns
parâmetros foram previamente estudados com a finalidade de se obter as SAM de
forma reprodutível. Foram selecionados para este trabalho, os tióis mais
freqüentemente citados na literatura, tanto os com grupos terminais carboxílicos
como os com grupos amina. A seleção ocorreu, principalmente, considerando-se
os tamanhos distintos das cadeias carbônicas bem como suas diferenças
estruturais.
O solvente utilizado na formação da SAM foi o etanol, devido ao fato de
dissolver com eficiência os tióis utilizados neste trabalho e por não ser tóxico. O
tempo de formação das monocamadas exigiu um estudo mais elaborado. Na
literatura, o tempo de 2 horas de formação é o mais citado. No entanto, estudos
realizados previamente utilizando-se a espectroscopia de impedância
eletroquímica, mostraram que há uma diferença considerável no empacotamento
das SAM se este tempo for aumentado por mais uma hora. Dessa forma, optou-se
por utilizar um tempo de formação de 3 horas, que além de aumentar o
empacotamento das monocamadas, evita que haja passivação da superfície, o
que poderia ocorrer em tempos maiores que este.
Após a formação das monocamadas auto-organizadas, foram realizados
estudos para a caracterização das SAM, com a finalidade de se verificar a
eficiência do processo de formação das mesmas sobre a superfície de ouro.
50
4.1.1 Voltametria Cíclica
A caracterização das monocamadas auto-organizadas é uma etapa muito
importante dentro deste trabalho, pois por meio dela, é possível obter algumas
informações com relação ao grau de recobrimento das SAM bem como as
irregularidades superficiais após a sua formação.
A primeira análise foi realizada observando o comportamento das diferentes
monocamadas frente a uma espécie eletroativa. Para isso, foram registrados
voltamogramas cíclicos do eletrodo de ouro limpo e após ser recoberto pelas SAM
em solução tampão fosfato pH 7,0 contendo 5 mmol L-1 de [Fe(CN)6]3-, a 100 mV
s-1. Os resultados estão apresentados na Figura 12.
Figura 12. Voltamogramas cíclicos obtidos para os eletrodos de ouro
recobertos com diferentes SAM em solução 5 mmol L –1 de Fe(CN)63- em tampão
fosfato 0,1 mol L –1 pH 6,5, a 100 mV s-1.
Observando a Figura 12, verificamos que a monocamada formada pela
CYS apresenta um baixo recobrimento superficial, pois a sua formação bloqueia
-100 0 100 200 300 400
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
I / µ
A
E / mV (vs. ECS)
Au Au-CYS Au-CISTE Au-MPA Au-MBA Au-ALP Au-MUA
51
muito pouco os processos de oxidação e redução quando comparados ao eletrodo
de ouro limpo. Com a CISTE, verifica-se uma redução um pouco maior dos
processos eletroquímicos da espécie Fe(CN)63- , porém estes ainda são elevados,
um indicativo de que esta monocamada também apresenta pouca barreira e,
provavelmente, um número elevado de defeitos na superfície eletródica. O MPA e
o MBA diminuem ainda mais as correntes de oxidação e redução e o ALP, diminui
consideravelmente os valores de corrente, além de distorcer o voltamograma,
indicando que o seu grau de recobrimento é maior. Porém, quando se verifica o
voltamograma obtido pelo MUA, constata-se que há uma passivação da superfície
eletródica, pois não é possível observar as correntes de oxidação e redução da
espécie. Isto ocorre, pois o seu grau de recobrimento é bastante elevado e
apresenta poucas irregularidades superficiais, o que dificulta a transferência de
elétrons. A fim de confirmar estes resultados obtidos pelos voltamogramas
cíclicos, foram realizados estudos de dessorção eletroquímica e uma possível
explicação para esta diferença de recobrimento obtida para as diferentes SAM
será detalhada a seguir.
4.1.2 Dessorção Eletroquímica
Com a finalidade de dar continuidade à caracterização das diferentes
monocamadas auto-organizadas formadas sobre eletrodos de ouro, foram
registrados voltamogramas de pulso diferencial para dessorção eletroquímica em
solução de KOH 0,1 mol L-1, variando o potencial de 0,1 a -1,3 V, a 20 mV s-1 de
velocidade de varredura e 25 mV de amplitude de pulso. Os voltamogramas
obtidos estão apresentados na Figura 13.
Já é bastante conhecido na literatura que os tióis dessorvem da superfície
metálica quando sobre esta superfície são aplicados potenciais suficientemente
negativos. Após a dessorção, tanto o tiolato, quanto a superfície exposta de ouro
se solvatam. Parte do tiolato solvatado se difunde da superfície, enquanto parte
pode ser readsorvido se o potencial aplicado retornar para valores positivos. O
potencial de dessorção depende do tamanho da cadeia carbônica da mercaptana,
52
da cristalinidade da superfície e dos grupos funcionais terminais do tiol. A
reprodutibilidade dos resultados é influenciada também pela cristalinidade da
superfície metálica e pelas condições de pré-tratamento superficial.
Quando se observa a Figura 13, percebe-se que todas as monocamadas de
tióis estudadas apresentam mais de um pico de redução. A presença desses picos
de dessorção é motivo de especulações e controvérsia na literatura, porque
segundo a teoria da redução dessortiva (WIDRIG et al., 1991), este fenômeno é
realizado via um processo monoeletrônico, o que não explica o aparecimento de
mais de um pico de redução.
53
- 1 , 4 - 1 , 2 - 1 , 0 - 0 , 8 - 0 , 6 - 0 , 4
I / µµ µµA
E / V
5 µ A
F
E
D
C
B
A
Figura 13. Voltamogramas de pulso diferencial obtidos para as diferentes SAM em
solução de KOH 0,1 mol L-1, sendo A – MPA, B – ALP, C – MBA, D – MUA, E –
CYS e F – CISTE. Potencial: 0,1 a –1,3 V. Velocidade de varredura: 20 mV s-1 e
25 mV de amplitude de pulso.
O surgimento de outros picos pode ser atribuído tanto aos diferentes
domínios cristalinos na superfície do ouro (WEISSHAAR et al., 1992) quanto a um
54
rearranjo de aglomerados de tióis formados devido a uma orientação de campo
elétrico durante a dessorção destas espécies (YANG et al., 2001). IMABAYASHI et
al. (1997) sugerem que picos de dessorção que aparecem em potenciais menos
negativos existam devido à presença de moléculas de tióis fracamente ligadas à
superfície eletródica, formando um grupo de tióis que se instalam em regiões de
defeitos da SAM ou sobre regiões com irregularidades sobre a superfície de ouro.
Este comportamento é uma forte evidência de que o pico localizado em potenciais
mais negativos seria devido à clivagem da ligação S-Au, e pode ser utilizado para
o cálculo do recobrimento da superfície de ouro pela mercaptana, por ser o pico
mais estável.
A diferença entre a quantidade e a magnitude dos picos para as superfícies
modificadas com os distintos tióis pode ser atribuída a diferenças na estrutura da
cadeia carbônica dos monômeros. E estas diferenças podem acarretar em
distinções no empacotamento das SAM formadas por estes tióis. Baseado nisso, a
localização e a intensidade (área) dos picos de dessorção podem ser utilizados na
caracterização das monocamadas, com relação ao seu grau de recobrimento e
estabilidade, a partir dos voltamogramas da Figura 13 e seguindo a equação (4)
descrita abaixo:
nFA
Q=Γ (4)
Sendo Γ o grau de recobrimento da superfície, Q a carga (obtida pela
integração da área do pico de dessorção), n o número de elétrons, F a constante
de Faraday e A é a área do eletrodo. Os resultados obtidos são apresentados na
Tabela 3.
55
Tabela 3. Valores dos graus de recobrimentos do eletrodo de Au recoberto com
diferentes SAM e os respectivos potenciais de pico de dessorção
Método ΓΓΓΓ / mol cm-2 Ep/ mV
Au-MPA
Au-ALP
Au-MUA
Au-MBA
Au-CISTE
Au-CYS
7,4 ± 0,5 10-9
1,1 ± 0,8 10-8
2,3 ± 0,2 10-8
8,6 ± 0,3 10-9
7,0 ± 0,4 10-9
4,2 ± 0,5 10-9
-1058
-1008
-1049
-1048
-1159
-1088
Observando os dados apresentados na Tabela 3, nota-se que o MPA e a
CISTE, que são tióis de cadeias menores, possuem um recobrimento
relativamente baixo, sugerindo que as SAM por eles formadas apresentem um
número elevado de defeitos. Verifica-se, entretanto, que a monocamada formada
pela CISTE é mais estável, pois dessorve em um potencial mais negativo,
indicativo de que necessita de maior energia para se despreender do metal. É
possível constatar na Tabela que o CYS é o tiol cuja SAM possui o menor grau de
recobrimento na superfície. Isto pode ocorrer pois a cistamina é um dissulfeto. E é
conhecido na literatura que para formação da SAM usando dissulfetos, necessita-
se que haja quebra da ligação S-S (SMITH et al., 2004), fato que costuma
ocasionar irregularidades nas monocamadas formadas desta maneira. Já o ALP,
apesar de ser também dissulfeto, possui uma cadeia alquílica longa e assimétrica,
diferentemente da CYS. Este fato poderia justificar o grau de recobrimento com
um valor elevado. Contudo, estudos específicos deste tiol mostram que ele forma
uma SAM instável e com dificuldades de reprodutibilidade (DIJKSMA et al., 2000).
O MBA apresentou um recobrimento satisfatório para o tamanho de sua cadeia e
o MUA, que possui a cadeia mais longa destes tióis, apresentou um valor alto de
recobrimento superficial. Este fato era esperado, uma vez que tióis de cadeia
longa produzem SAM com poucos defeitos e, consequentemente, alto grau de
empacotamento da monocamada (IMABAYASHI et al., 1997).
Com a finalidade de confirmação dos dados obtidos a partir do estudo
envolvendo a dessorção eletroquímica, foram calculados os valores teóricos da
56
quantidade de tiol necessária para ocupar a área de um eletrodo de ouro,
supondo-se 100% de recobrimento superficial.
Para isso, foram feitas estimativas dos diâmetros de cada uma das
moléculas dos diferentes tióis utilizados, por meio dos comprimentos das ligações
das respectivas moléculas (COSTA et al., 2003), considerando também os
diferentes ângulos das moléculas. A partir do diâmetro do tiol (mostrado na Tabela
4), foi possível calcular a área ocupada por uma molécula. Desta forma, se a área
geométrica do eletrodo é conhecida (0,07 cm2), calcula-se a quantidade de
moléculas capaz de ocupar a superfície do eletrodo de ouro. Os dados obtidos são
apresentados na Tabela 4.
A partir dos dados de recobrimento obtidos pela dessorção eletroquímica,
também foi possível calcular a quantidade de moléculas de tiol que ocupa a
superfície do eletrodo. Desta forma, os dados obtidos experimentalmente e os
dados teóricos podem ser comparados.
Tabela 4. Cálculo teórico da quantidade de moléculas de tiol por eletrodo.
Tiol Diâmetro / Å Quantidade
teórica de tiol /
moléculas cm-2
Quantidade de tiol pela
dessorção eletroquímica/
moléculas cm-2
ALP
MPA
MUA
MBA
CISTE
CYS
9,1
3,3
3,3
4,7
2,0
2,0
1,8 1013
8,2 1013
8,2 1013
4,1 1013
2,2 1014
2,2 1014
4,6 1014
3,1 1014
9,7 1014
3,6 1014
3,0 1014
1,8 1014
Observando os resultados da Tabela 4 verifica-se que as quantidades de
moléculas de tiol por eletrodo obtidas por meio da dessorção eletroquímica é
maior que aquelas obtidas por cálculos teóricos (assumindo-se 100% de
recobrimento da superfície pela SAM), principalmente nos casos dos tióis com
grupos terminais –COOH. Isso ocorre porque pode estar havendo contribuição da
corrente capacitiva na obtenção do pico de dessorção, o que influencia nos
57
cálculos realizados a partir destes resultados. A capacitância do eletrodo de ouro
limpo (sem a SAM) é elevada e, após adsorção do tiol, diminui drasticamente e
este efeito pode levar a um valor maior de recobrimento da superfície do que o
real. Uma outra hipótese para a quantidade de tiol por eletrodo calculado
experimentalmente ser maior que a teórica, seria o fato do eletrodo de ouro, por
ser policristalino, poder apresentar certa rugosidade, que estaria influenciando no
valor da área do dispositivo e afetando os valores obtidos nos cálculos teóricos.
Desta forma, podemos verificar que o cálculo do recobrimento superficial
usando dessorção eletroquímica, apesar de ser bastante simples, pode não ser
muito confiável, por não mostrar a realidade da situação superficial. Cabe ressaltar
que a dessorção de monocamadas é um processo amplamente utilizado na
literatura no cálculo do recobrimento superficial pelas SAM e, no entanto, os
resultados obtidos a partir desta metodologia exigem avaliações severas ou até
mesmo complementares.
4.1.3 Estudos Hidrodinâmicos
Experimentos de voltametria de varredura linear foram realizados
empregando-se o eletrodo de disco rotatório de ouro limpo e modificado com as
SAM, com o objetivo de se determinar a constante cinética (k) para a obtenção de
maiores informações sobre o processo no eletrodo modificado frente a uma
substância redox. Neste estudo, provoca-se a convecção do sistema e as
varreduras de potencial são registradas a baixa velocidade, para que as leituras
sejam reflexo da interação da espécie eletroativa com o eletrodo.
A corrente de redução e/ou oxidação de ferro/ferricianeto de potássio em
eletrodo de disco rotatório pode ser limitada pelo transporte de massa (Id) de
ferro/ferricianeto de potássio para a superfície do eletrodo e/ou pela cinética da
reação de transferência (IK). As correntes de redução/oxidação (I) são
combinações das correntes de difusão e cinética de transferência de elétrons (Id e
IK):
1/I = 1/ Id + 1/ Ik (5)
58
A corrente limitada pelo transporte de massa para um sistema reversível
depende da velocidade de rotação do eletrodo e da concentração de
ferro/ferricianeto de potássio, e é determinada pela equação (6) de Levich (BARD
& FAULKER, 1990):
Id= 0,620nFAC0*D0
2/3ν-1/6ω1/2 (6)
onde n é o número de elétrons transferidos durante a reação, C0* é a concentração
da espécie eletroativa, F é a constante de Faraday, A é a área geométrica do
eletrodo, D0 é o coeficiente de difusão, ν é a viscosidade cinemática e ω é a
velocidade de rotação do eletrodo.
Os voltamogramas de varredura linear foram obtidos em soluções de
ferro/ferricianeto (1:1) de concentrações de 50 a 350 µmol L-1 e em diferentes
velocidades de rotação do eletrodo, para todas as SAM. A Figura 14 mostra os
voltamogramas registrados em solução de ferro/ferricianeto 350 10-6 mol L-1 em
tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 para o eletrodo de ouro recoberto com
cisteamina (Au-CISTE), na qual é possível se observar um aumento da corrente
limite (Id) em função da velocidade de rotação do eletrodo, demonstrando a
dependência do transporte de massa no processo de redox. Cabe ressaltar que
serão apresentados somente os gráficos referentes ao eletrodo de ouro
modificado com cisteamina, porém este estudo foi realizado da mesma maneira
para as outras monocamadas, bem como para o eletrodo de ouro limpo.
59
-400 -200 0 200 400 600 800-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
200 rpm 400 rpm 600 rpm 800 rpm 1000 rpm 1200 rpm 1500 rpm 1800 rpm 2000 rpm 2200 rpm 2500 rpm
Au-CISTE350 µM
I / µ
A
E / mV
Figura 14. Curvas de potencial-corrente obtidas com eletrodo de ouro
modificado com cisteamina, em uma solução 350 µmol L-1 de ferro/ferricianeto de
potássio em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5, em diferentes velocidades de
rotação do eletrodo.
Um gráfico de Id vs. ω1/2, Figura 15, foi construído para cada concentração
de ferro/ferricianeto de potássio, obtendo-se uma relação linear para velocidades
de rotação entre 200 e 1500 rpm, sendo que para velocidades maiores observa-se
um desvio da linearidade. Este comportamento e o fato da reta não passar pela
origem sugere uma contribuição da etapa cinética envolvida na reação de
transferência de elétrons.
60
4 6 8 10 12 14 16 180
1
2
3
4
5
6
7
I / µ
A
ω1/2 / rad1/2s-1
50 µM 150 µM 250 µM 350 µM
Figura 15. Gráfico de Levich para várias concentrações de ferro/ferricianeto
de potássio em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 usando o eletrodo de ouro
modificado com cisteamina.
Para avaliar as etapas limitantes do desempenho do eletrodo de disco
rotatório, as correntes medidas em diferentes velocidades de rotação são
usualmente plotadas em coordenadas de Koutecky-Levich (I-1 vs. ω-1/2) dada pela
equação:
1/I = 1/IK + 1/(0,620 nFAC0* D0
2/3 ν-1/6 ω-1/2) (7)
As correntes de redução de ferricianeto de potássio obtidas com eletrodo de
ouro em diferentes concentrações das espécies eletroativas e velocidades de
rotação são apresentadas como o gráfico de Koutecky-Levich na Figura 16. Nota-
se que a corrente do eletrodo depende da velocidade de rotação no intervalo
inteiro de concentrações da espécie eletroativa.
61
0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,240
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
50 µM 150 µM 250 µM 350 µM
I-1 /
A-1
ω-1/2 / rad-1/2 s1/2
Figura 16. Gráfico de Koutecky-Levich da redução do ferricianeto de
potássio em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5, para o eletrodo de ouro modificado
com cisteamina para várias concentrações da espécie eletroativa.
A partir do intercepto do gráfico de Koutecky-Levich foram obtidos os
valores de 1/IK e IK para cada concentração do par redox. Obtendo-se o valor de IK
para cada concentração do par redox, foi construído o gráfico da Figura 17, a
partir do qual é determinado o valor da constante de transferência de elétrons (k)
usando o valor da inclinação da reta na equação (8).
IK = nFAkC0* (8)
onde n = 1 elétron, F = 96500 A s-1, A = 0,07 cm2.
62
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
k = 1,30 10-2 cm s-1
I k / m
A
[Fe(CN)6
3-/4-] / mmol L-1
Au-CISTE
Figura 17. IK em função da concentração do par redox em tampão fosfato
0,1 mol L-1 pH 6,5, usando o eletrodo de ouro modificado com cisteamina para
obtenção da constante de transferência de elétrons (k).
Foram obtidas, a partir da metodologia descrita, o valor da constante de
transferência de elétrons para o eletrodo de ouro modificado com cada um dos
tióis. Os dados são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Valores das constantes de transferência de elétrons obtidas para
o eletrodo limpo e após modificação com os diferentes tióis.
SAM k / cm s-1
Au
Au-MPA
Au-ALP
Au-MUA
Au-MBA
Au-CISTE
Au-CYS
2,9 10-1
9,9 10-3
7,4 10-3
-
9,2 10-3
1,3 10-2
5,9 10-2
63
O valor de k não pode ser obtido para o eletrodo de ouro modificado com o
MUA pois como este tiol passiva a superfície eletródica, o mesmo acaba
impedindo que ocorra a transferência de elétrons, tornando-se impossível o
cálculo da constante. A Tabela 5 mostra que os valores de k estão bastante
condizentes com os dados obtidos por voltametria cíclica, apresentados
anteriormente. Novamente, é possível verificar um valor elevado de k para o
eletrodo de ouro modificado com a CYS, o que era esperado uma vez que o seu
grau de recobrimento possui um valor pequeno, indicando que esta SAM
apresentada muitos defeitos superficiais, o que facilita a transferência de elétrons.
Comparado com o valor de k para o eletrodo de ouro limpo, que possui uma
constante elevada, verifica-se que a CYS é formada na superfície metálica, visto
que o valor de k diminui com a modificação eletródica. Mas, mesmo assim, o valor
de k para esta SAM permanece alto, comparado aos outros tióis. A CISTE e o
MPA apresentaram os valores de k bem próximos, confirmando os resultados
obtidos com as outras metodologias. Isto pode ser explicado pela grande
semelhança existente entre estes dois tióis, que se distinguem apenas pelo grupo
terminal. Mas, de certa maneira, a constante é ligeiramente maior para a CISTE, o
que indica que o grupo terminal –NH2 facilite um pouco a transferência de
elétrons, nestas condições. Isto pode ter ocorrido pela solução apresentar um pH
levemente ácido (6,5), o que causa a protonação do grupo –NH2, favorecendo a
atração pelas espécies redox, que possuem cargas negativas. Da mesma
maneira, as monocamadas com grupos terminais –COOH sofrem um processo de
desprotonação do grupo, ocasionando certa repulsão da espécie eletroativa em
questão. O MBA, como possui um grau de recobrimento intermediário, causa uma
maior resistência ao processo de transferência de elétrons que o MPA. E o ALP,
que possui um grau de recobrimento elevado, apresenta o menor valor de
constante de transferência de elétrons, o que também é confirmado pelas outras
metodologias usadas na caracterização das SAM.
Após a conclusão da etapa de caracterização das monocamadas auto-
organizadas, foi possível verificar a influência destas características distintas na
imobilização do material biológico.
64
4.2 Estudo do Tempo de Imobilização da HRP na Monocamada
Auto-Organizada
Um estudo do tempo de formação das monocamadas auto-organizadas e
dos tempos de interação dos ligantes e da enzima da HRP foram realizados com a
finalidade de se otimizar os procedimentos de imobilização enzimática, utilizando-
se apenas uma SAM (aquela mais amplamente citada na literatura) e variando-se
as condições experimentais.
Conforme anteriormente relatado na parte experimental, o tiol empregado
neste estudo foi o ácido mercaptopropiônico e a primeira metodologia (A) baseou-
se na imersão do eletrodo de ouro limpo na solução do tiol por 2 horas, seguida da
interação com os ligantes EDC e NHS por 3 horas e, finalmente, imersão na
solução enzimática por 6 horas. Após lavagem e secagem do biossensor, foi então
registrados voltamogramas cíclicos em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5,
contendo 850 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio e 25 µmol L-1 de hidroquinona,
para a verificação da eficácia da imobilização do elemento biológico. Como pode
ser verificado na Figura 18, o aumento de corrente de redução não foi significativo.
Desta forma, foi testada uma nova metodologia (B), na qual foram mantidas as
mesmas condições da metodologia (A), porém o tempo de formação da SAM foi
aumentado para 3 h. É possível constatar também na Figura 18, que houve um
pequeno aumento da corrente de redução nestas condições. Baseado nisso, uma
nova metodologia (C) foi testada, mantendo-se as mesmas condições na
metodologia B, mas aumentando-se o tempo de imobilização enzimática para 18
h. Observa-se, agora, um aumento de corrente de redução mais significativo.
Como última alternativa, uma nova metodologia foi proposta (Método D), que
consistia em formar a SAM no eletrodo de ouro por 3 horas, seguida da imersão
deste eletrodo em uma solução contendo os ligantes EDC e NHS e também a
enzima HRP por 18 horas. Verifica-se, pela Figura 18, que houve um ganho de
corrente considerável com esta metodologia, que foi selecionada para realizar a
imobilização enzimática nas monocamadas com grupos terminais carboxílicos.
65
Para as SAM com terminais –NH2 utilizou-se o método D, porém o ligante
empregado foi o glutaraldeído.
-200 -100 0 100 200 300-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
tampão Método A Método B Método C Método D
I / µ
A
E / mV
Figura 18. Voltamogramas cíclicos obtidos para o eletrodo de ouro
modificado com a SAM após imobilização enzimática pelos métodos A, B, C e D,
apenas em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 e após adição de 850 µmol
L-1 de peróxido de hidrogênio e 25 µmol L-1 de hidroquinona. Velocidade de
varredura: 50 mV s-1.
4.3 Avaliação da Imobilização Enzimática em SAM – Medidas
Voltamétricas
Embora possam ser encontrados na literatura muitos biossensores
eletroquímicos construídos a partir de eletrodos de ouro modificados com
diferentes tipos de SAM, nenhum destes trabalhos exibe a influência da SAM na
imobilização enzimática e sua consequência na resposta eletródica, apesar de
existirem diversos estudos envolvendo a caracterização destas monocamadas
usando técnicas eletroquímicas. Além disso, o método escolhido para a
imobilização do elemento de reconhecimento também interfere em parâmetros de
desempenho do biossensor, tais como sensibilidade, seletividade e,
66
principalmente estabilidade, que nos biossensores em geral, pode ser um
problema. Ao mesmo tempo em que manter a enzima ativa depois de imobilizada
no eletrodo é crucial e método de imobilização também influencia neste aspecto.
Neste contexto, as propriedades diferentes das SAM e sua relação com a
adsorção do material biológico foram avaliadas por diversas técnicas, com a
finalidade de se obter um biossensor com o melhor comportamento dentro destas
condições. Para uma prévia constatação da imobilização da HRP na superfície
eletródica, foram registrados voltamogramas cíclicos (VC) do eletrodo de ouro
modificado com as monocamadas, antes e após a imobilização enzimática usando
as metodologias distintas.
A Figura 19 apresenta os VC obtidos neste estudo para uma das SAM
formadas, no caso a cisteamina, usando glutaraldeído para a ligação covalente da
biomolécula (método 3). É possível verificar que ocorre um aumento considerável
da corrente catódica, relacionada à decomposição do H2O2 após a adsorção da
HRP na monocamada. Neste contexto, a SAM, além de servir como matriz de
imobilização enzimática, também fornece respostas voltamétricas com pequena
corrente capacitiva. Quando este mesmo estudo é realizado com o eletrodo
metálico sem qualquer modificação, a corrente capacitiva é elevada e não varia
muito com a concentração de peróxido de hidrogênio. Este fato é muito importante
para se certificar que a SAM ainda está sobre a superfície metálica, uma vez que
concentrações altas de H2O2 poderiam afetar a monocamada.
67
-200 -100 0 100 200 300-25
-20
-15
-10
-5
0
5
tampão Au-SAM Au-SAM-HRP
I / µ
A
E / mV
Figura 19. Voltamogramas cíclicos obtidos a 50 mV s-1 para o eletrodo de ouro
modificado com CISTE em solução contendo 850 µmol L-1 de H2O2 e 25 µmol L-1
de hidroquinona em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5. Linha preta: biossensor Au-
CISTE-HRP apenas na solução tampão.
Após a verificação do aumento do sinal voltamétrico quando a HRP está
presente no eletrodo, foram então realizados estudos para a verificação da
influência da SAM e do método de imobilização na sensibilidade dos
biossensores. A Tabela 6 apresenta os resultados obtidos.
Observando esta tabela é possível verificar que a modificação física (HRP
ligada eletrostaticamente à SAM) fornece as sensibilidades mais baixas, em todos
os casos. Isto ocorre, pois a enzima, neste caso, pode entrar em contato com a
superfície metálica, que é um ambiente agressivo para biocompostos,
aumentando a probabilidade de desnaturação da HRP (GOODING et al., 2001) ou
a quantidade de enzima que adsorveu na superfície é pequena, o que ocasiona
valores de sensibilidade menores. Resultados mais interessantes são obtidos
quando se realiza a ligação covalente da enzima com a SAM. Isto já era esperado,
uma vez que imobilizações através de ligações covalentes formam eletrodos
modificados com SAM mais estáveis (CHAKI & VIJAYAMOHANAN, 2002). Além
68
disso, a reação da SAM com outros compostos aumenta a proteção da enzima se
ligar diretamente à superfície metálica.
Tabela 6. Características do biossensor obtidas com diferentes métodos de
imobilização da peroxidase em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5. Potencial: 300 a
-200 mV. Velocidade de varredura 50 mV s-1 (n=6).
Método de imobilização
[H2O2]: 170-1000 µµµµmol L-1
Sensibilidade /
nA mmol L-1 Coeficiente de
Correlação
C.V. / %
Au-ALP-HRP 47 ± 5 0,98 9,8
Au-ALP-EDC/NHS-HRP 75 ±±±± 5 0,96 6,6
Au-MPA-HRP 36 ± 1 0,98 4,0
Au-MPA-EDC/NHS-HRP 62 ±±±± 3 0,99 4,4
Au-MBA-HRP 305 ± 3 0,99 7,7
Au-MBA-EDC/NHS-HRP 555 ±±±± 2 0,99 0,3
Au-MUA-HRP 97± 4 0,98 4,8
Au-MUA-EDC/NHS-HRP 273 ±±±± 2 0,99 0,6
Au-CYS-HRP 30± 6 0,98 6,5
Au-CYS-GLU-HRP 1161 ±±±± 2 0,99 0,1
Au-CISTE-HRP 38 ± 5 0,98 1,8
Au-CISTE-GLU-HRP 6354 ±±±± 13 0,99 0,2
Au-SAM-HRP: método 1; Au-SAM-EDC/NHS-HRP: método 2 e Au-SAM-GLU-HRP: método 3; C.V. =-
coeficiente de variação.
Quando apenas as SAM com grupos terminais –COOH são avaliadas,
observa-se que melhores resultados foram encontrados quando se utiliza uma
monocamada formada pelo MBA. Isto ocorre devido ao MBA recobrir
satisfatoriamente a superfície do ouro, permitindo que a ligação com a enzima seja
mais efetiva. Já o MPA, apesar de também conter uma cadeia alquílica pequena,
recobre menos a superfície que o MBA e, portanto, diminui os sítios para ligação
da enzima. Baseado nos procedimentos obtidos para a caracterização das SAM
usando dessorção redutiva, era esperado que o ALP fornecesse uma resposta
69
mais desejável quanto ao desempenho do biossensor. No entanto, por ser um
dissulfeto assimétrico, quando ocorre a quebra da ligação S-S, apenas um dos
“fragmentos” possui o grupo funcional terminal –COOH, o que ocasiona uma
diminuição da imobilização enzimática, pela quantidade de sítios disponíveis para
a ligação com a HRP, exibindo valores baixos de sensibilidade para este sensor,
apesar de um alto grau de recobrimento superficial. No entanto o MUA, por ser um
tiol de cadeia carbônica grande, se organiza mais lentamente e, como neste
estudo as SAM foram formadas por um período de 3 horas, não foi suficiente para
sua completa orientação, o que prejudicou sua ligação covalente com a HRP.
Relata-se na literatura que tióis de cadeia longa necessitam de, pelo menos, 12
horas para gerar monocamadas bem orientadas (DIJKSMA et al., 2000). Além
disso, tióis de cadeia com um número maior de carbono podem passivar a
superfície e diminuir a transferência eletrônica e, portanto, a sensibilidade do
eletrodo.
Ao se analisar os valores de sensibilidade obtidos para as SAM com grupos
terminais –NH2 verifica-se que estes são bem maiores que aqueles obtidos
usando a imobilização da enzima em SAM com terminais ácidos. E entre estes
valores, contata-se que o eletrodo modificado com cisteamina é aquele mais
sensível, provavelmente devido ao fato de possuir um maior recobrimento que a
cistamina. No entanto, as monocamadas de grupos terminais -NH2 foram as que
apresentaram os valores menores de recobrimento e, desta forma, acredita-se que
o glutaraldeído esteja contribuindo mais na eficiência da imobilização da
peroxidase que o par EDC/NHS, provavelmente devido a esta molécula formar
uma camada reticulada na superfície do eletrodo, o que torna o ambiente mais
propício para a atividade enzimática.
O estudo da estabilidade destes biossensores também foi avaliado a fim de
se verificar a SAM que proporcionou uma adsorção enzimática mais eficiente na
superfície do eletrodo, sem prejudicar a sua atividade. Este experimento foi
analisado em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 contendo 85 µmol L-1 de peróxido
de hidrogênio e 25 µmol L-1 de hidroquinona, usando voltametria cíclica, apenas
para os biossensores construídos através de ligação covalente entre a SAM e a
HRP, pois foram os que apresentaram os melhores desempenhos. A Tabela 7
70
apresenta os valores de perda de resposta obtidos após 100 ciclos de varredura, a
uma velocidade de 50 mV s-1.
Tabela 7. Porcentagens de perda de resposta voltamétrica após 100 ciclos de
varredura para os eletrodos de ouro modificados com SAM e HRP.
Biossensores Perda de resposta voltamétrica / %
Au-CISTE-GLU-HRP 5,0
Au-CYS-GLU-HRP 5,6
Au-MUA-EDC/NHS-HRP 10,4
Au-MBA-EDC/NHS-HRP 10,2
Au-MPA-EDC/NHS-HRP 17,4
Au-ALP-EDC/NHS-HRP 29,9
Observando a Tabela 7 é possível verificar que a SAM formada pela
cisteamina, além de apresentar melhor sensibilidade, também forma uma ligação
bastante estável com a enzima e, portanto, a sua perda na resposta após 100
ciclos é a menor. Os resultados obtidos usando dessorção eletroquímica
mostraram que a CISTE forma uma SAM estável, devido ao fato de possuir um
pico catódico em potencial mais negativo. Valores satisfatórios foram obtidos para
o MUA e o MBA. Apesar do biossensor desenvolvido a partir da SAM de MUA não
mostrar boa sensibilidade com o biossensor, a sua ligação com a enzima é eficaz,
pois este tiol forma uma monocamada estável. Já o ALP, como a SAM por ele
formada é bastante instável, assim também é a sua ligação com a HRP, sendo
sua perda de resposta voltamétrica bem elevada. Estes resultados sugerem que a
estabilidade dos biossensores a base de monocamadas auto-organizadas está
mais associada à estabilidade na SAM na superfície eletródica do que a ligação da
HRP com a respectiva SAM.
Foram realizados estudos com outras técnicas, além das voltamétricas, a
fim de se avaliar melhor a eficácia da imobilização enzimática em diferentes
monocamadas, conforme será discutido a seguir.
71
4.4 Avaliação da Imobilização Enzimática em SAM – Medidas de
Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
Adicionalmente, foram realizados estudos envolvendo a técnica de
espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) para a análise do método de
imobilização mais eficiente.
Para isso, foram obtidos os valores de resistência de transferência de carga
(Rct) para uma espécie eletroativa, no caso o Fe(CN)63- 5 mmol L-1 em tampão
fosfato pH 7,0, usando os eletrodos modificados apenas com a SAM e após a
imobilização da enzima. Utilizou-se o Circuito de Randles para a análise dos
resultados, por ser o mais citado na literatura para estudos com formação de SAM
e adsorção dos elementos de reconhecimento sobre estas (GOODING et al.,
2001). Os resultados obtidos estão apresentados na Figura 20.
Valores mais altos de Rct após a imobilização de biomoléculas são
esperados, uma vez que aumentam a impedância do sistema (DING et al., 2005).
No caso deste estudo, devido aos valores bastante discrepantes de Rct entre as
SAM, não foi possível compará-los separadamente. Desta forma, encontrou-se
uma razão entre as Rct obtidas para os eletrodos de ouro com as monocamadas e
após imobilização da HRP. Os dados estão apresentados na Tabela 8.
Tabela 8. Valores das Rct obtidas para os eletrodos modificados com diferentes
tióis e após imobilização enzimática, usando EIS. Faixa de freqüência: 10-2 a 105
Hz, 10mV de amplitude de pulso. Potencial: 0,2 V.
SAM Rct / ΩΩΩΩ Método Rct / ΩΩΩΩ Razão*
Au-CISTE
Au-CYS
Au-MUA
Au-MPA
Au-MBA
Au-ALP
11,3
13,6
12930,1
68,6
127,4
28090,2
Au-CISTE-GLU-HRP
Au-CYS –GLU-HRP
Au-MUA-EDC-NHS-HRP
Au-MPA-EDC-NHS-HRP
Au-MBA-EDC-NHS-HRP
Au-ALP-EDC-NHS-HRP
278,4
295,5
145600,3
274,4
1445,5
98400,7
24,6
21,7
11,2
4,0
11,3
3,5
*Razão = Rct Au-SAM-HRP / Rct Au-SAM
72
Figura 20. Diagramas de Nyquist obtidos para o eletrodo de ouro
modificado com a SAM antes e após imobilização enzimática. Solução KCl 0,1 mol
L-1 contendo 5 mmol L-1 de Fe(CN)63-. Faixa de freqüência de 10-2 a 105 Hz, 10mV
de amplitude de pulso. Potencial: 0,2 V.
0 50000 100000 150000 200000
0
50000
100000
150000
200000
-Z"
/ kΩ
Z' / kΩ
Au-ALP Au-ALP-EDC-NHS-HRP
0 2000 4000 6000 8000 10000
0
2000
4000
6000
8000
10000
0 100 200 300 400 500 600 7000
100
200
300
400
500
600
700
-Z''
/ kΩ
Z' / kΩ
Au-CISTE Au-CISTE-GLU-HRP
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 100 200 300 400 500
0
100
200
300
400
500
-Z"
/ kΩ
Z' / kΩ
Au-CYS Au-CYS-GLU-HRP
0 100000 200000 300000 400000
0
100000
200000
300000
400000
-Z"
/ kΩ
Z' / kΩ
Au-MUA Au-MUA-EDC-NHS-HRP
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
-Z"
/ kΩ
Z' / kΩ
Au-MPA Au-MPA-EDC-NHS-HRP
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
-Z"
/ kΩ
Z' / kΩ
Au-MBA Au-MBA-EDC-NHS-HRP
73
Observando Tabela 8 verifica-se que os menores valores de razão foram
encontrados para o eletrodo de ouro modificado com o ALP e com MPA, uma vez
que estas SAM possuem menos sítios para a ligação com a enzima. No entanto, o
MUA e o MBA apresentaram valores de razão também próximos, apesar da
sensibilidade do MBA ser maior. A sensibilidade maior para o MBA pode ser
explicada pela sua Rct apresentar um valor bem mais baixo quando comparada a
Rct do MUA. Já as SAM com terminais básicos, novamente mostram valores de
razão mais elevados, indicando que uma maior quantidade de enzima
permaneceu imobilizada nestas condições, sendo que a cisteamina foi a que
apresentou a maior razão, confirmando os resultados obtidos usando a voltametria
cíclica. Mesmo após a imobilização da HRP na superfície do eletrodo, a Rct das
monocamadas com grupos terminais amina ainda permanece com um valor baixo,
o que poderia justificar seus valores de sensibilidade maiores.
4.5 Avaliação da Imobilização Enzimática em SAM – Medidas de
Ressonância de Plásmon de Superfície
A técnica de SPR é uma ferramenta valiosa para investigar um número
grande de eventos dinâmicos. Sua diversidade permite análises interfaciais, de
interações e/ou afinidade (bio)moleculares em diferentes camadas orgânicas
formadas sobre superfícies metálicas (CARVALHO et al., 2003) . Além disso, a
SPR permite a determinação de propriedades dielétricas (índice de refração),
espessura do filme, além de ser hábil para monitoramento de processos
interfaciais in situ como adsorção/dessorção, hidratação e desidratação (DAMOS
et al., 2004). O uso da técnica em fluxo admite o estudo destes processos sob
condições relevantes, como temperatura, velocidade de fluxo, pH e força iônica
(CARVALHO et al., 2003).
No caso específico deste trabalho, foram realizados experimentos
empregando a técnica de SPR com a finalidade de se avaliar a extensão da
adsorção da HRP na superfície de ouro modificado com um filme formado pela
SAM. As medidas foram realizadas para os métodos 2 e 3 citados na Parte
Experimental. A Figura 21 mostra um dos resultados obtidos com o disco de ouro,
74
no caso, modificado com cisteamina que foi o que proporcionou a resposta mais
eficiente.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Au-CISTE-GLU-HRP
∆θ
C
B
A
θ /
mg
rau
tempo / s
Figura 21. Sensorgrama obtido para o disco de ouro modificado com
cisteamina e a imobilização da enzima usando glutaraldeído.
A curva A se refere a linha base, obtida com o disco de ouro modificado
com a SAM em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 por 300 s. Então, foram
injetados 100 µL da solução da enzima com glutaraldeído e a adsorção foi
acompanhada por 1200 s (curva B). É possível verificar um aumento do ângulo de
ressonância, conforme a HRP se adsorve sobre a SAM. A curva C foi obtida após
lavagem do sistema com a solução tampão fosfato, para a eliminação das
moléculas fracamente ligadas, e a dissociação foi acompanhada por mais 300 s.
Nesta etapa, permanece na SAM apenas as biomoléculas cujas ligações são mais
estáveis. A diferença entre os ângulos obtidos nas curvas A e C, nos fornece a
extensão da imobilização enzimática. Para todos os métodos usando as SAM o
perfil do sensorgrama foi o mesmo, com distinção da magnitude das diferenças
entre os ângulos SRP entre as curvas A e C. Os resultados da variação do ângulo
SPR com a adsorção enzimática no disco de ouro modificados com vários tipos de
SAM e diferentes métodos de imobilização são apresentados na Tabela 9.
75
Tabela 9. Variação dos ângulos SPR para o disco de ouro modificados com
diferentes tipos de SAM para avaliação do método de imobilização da peroxidase
Método de imobilização Variação do ângulo SPR / mgrau
Au-ALP-EDC/NHS-HRP 200± 11
Au-MPA-EDC/NHS-HRP 205 ± 7
Au-MBA-EDC/NHS-HRP 239 ± 3
Au-MUA-EDC/NHS-HRP 361 ± 4
Au-CYS-GLU-HRP 382 ± 5
Au-CISTE-GLU-HRP 392 ± 3
Au-SAM-EDC/NHS-HRP: método 2 e Au-SAM-GLU-HRP: método 3
Analisando a Tabela acima é possível verificar que não é regra afirmar que
maiores adsorções significam melhores respostas voltamétricas. Isto pode ser
bem caracterizado observando os dados obtidos para o MUA. De acordo com a
técnica de SPR, o MUA apresentou um alto deslocamento do ângulo de SPR
indicando uma considerável imobilização enzimática. Porém, quando é avaliada a
resposta voltamétrica do biossensor formado através deste tiol, constata-se que a
sua sensibilidade é relativamente baixa, menor que a obtida para o MBA. Isto
mostra que a imobilização pode ser eficiente, mas é necessária a análise do
comportamento do eletrodo no método proposto, que no caso do MUA, por possuir
uma cadeia carbônica longa, impede a transferência de elétrons entre as espécies
e a superfície metálica.
Os outros resultados estão em concordância com aqueles obtidos usando a
voltametria cíclica, verificando-se que a cisteamina apresentou um alto
deslocamento do ângulo SPR, o que indica uma elevada imobilização da HRP na
superfície do disco e coerente com os resultados da sensibilidade e de
impedância, concluindo que esta imobilização enzimática ocorreu de forma
adequada sobre o disco de ouro.
Com a técnica de SPR é possível obter várias informações úteis com
respeito a adsorção de biomoléculas na superfície do disco. Com este trabalho foi
possível, pioneiramente, obter a quantidade de enzima que permaneceu ligada à
superfície, que é um parâmetro muito importante no desenvolvimento de
76
biossensores e no entendimento do desempenho do dispositivo. Segundo o
manual do equipamento, cada 120 mθ de deslocamento do ângulo de SPR
correspondem a 1 ng mm-2 de enzima adsorvida na SAM. A partir destes dados,
portanto, foi possível calcular a quantidade da HRP que permaneceu imobilizada
na SAM, conforme se observa na Tabela 10.
Tabela 10. Quantidade de enzima imobilizada na superfície determinada usando a
técnica de SPR.
Método de
imobilização
Quantidade de
HRP / mol cm-2
Au-ALP-EDC/NHS-HRP 3,8 10-12
Au-MPA-EDC/NHS-HRP 3,9 10-12
Au-MBA-EDC/NHS-HRP 4,6 10-12
Au-MUA-EDC/NHS-HRP 6,8 10-12
Au-CYS-GLU-HRP 7,3 10-12
Au-CISTE-GLU-HRP 7,5 10-12
Os resultados obtidos na Tabela 10 foram utilizados para o cálculo da
quantidade de moléculas de enzima que permaneceu imobilizada na superfície do
disco e a relação do número de tiol por enzima imobilizada. Além disso, estes
dados obtidos com a técnica de SPR foram comparados com dados obtidos pela
estimativa teórica da quantidade máxima de enzima que poderia permanecer
imobilizada na superfície. Para os cálculos teóricos foi considerado como diâmetro
da molécula de HRP o valor de 30 Å (HERREN et al., 1997). Como o diâmetro da
enzima é o mesmo em todas as SAM, a quantidade máxima de HRP que pode se
imobilizar na superfície do disco é de 1,4 1013 moléculas cm-2. Os resultados estão
apresentados na Tabela 11
77
Tabela 11. Quantidade de enzima imobilizada na superfície determinada usando a
técnica de SPR.
Quantidade de Tiol1 /
mol cm-2
Quantidade experimental de HRP
imobilizada / moléculas cm-2
Relação Tiol /
Enzima2
ALP = 9,4 10-10 2,3 1012 247
MPA = 6,3 10-10 2,2 1012 162
MBA = 7,3 10-10 2,8 1012 159
MUA = 2,0 10-9 4,1 1012 294
CYS = 3,4 10-10 4,4 1012 47
CISTE = 6,0 10-10 4,5 1012 80
1Dados obtidos pela realização da dessorção eletroquímica e corrigidos por um fator 2Relação Tiol/Enzima: Quantidade de Tiol / Quantidade de HRP imobilizada
Na Tabela 11, para os dados relacionados a quantidade de tiol adsorvida na
superfície de ouro, utilizou-se os resultados obtidos por meio da dessorção
eletroquímica. Como os cálculos teóricos demonstraram que poderia haver uma
contribuição da corrente capacitiva ou mesmo da rugosidade do eletrodo na
obtenção dos picos de dessorção, foi calculado um fator de correção na tentativa
de suprir estas interferências no cálculo. O fator de correção foi obtido com os
dados da monocamada mais bem formada na superfície, no caso, o ácido
mercaptoundecanóico (MUA). Para isso, dividiu-se a quantidade de moléculas de
tiol obtida pelos cálculos teóricos pelos dados obtidos experimentalmente
(dessorção eletroquímica). Desta forma, os resultados obtidos experimentalmente
foram corrigidos, de modo que puderam ser utilizados para os cálculos da relação
tiol/enzima.
Observando a Tabela 11, ao analisarmos as SAM apenas com grupos
terminais –COOH, é possível verificar que certas monocamadas necessitam de
mais moléculas de tiol para imobilizar uma única molécula de HRP, fato que pode
gerar alguns sítios livres na SAM, pois nem todos irão reagir com os grupamentos
aminos da biomolécula, como pode ser verificado no caso do MUA e do ALP. Isto
78
ocorre principalmente porque, apesar de algumas monocamadas recobrirem
satisfatoriamente a superfície metálica, o processo de imobilização pode não ser
eficiente, gerando muitos sítios livres que não reagiram com a enzima, até mesmo
devido ao seu elevado peso molecular. Quando analisamos o MBA e o MPA,
verifica-se que como estas SAM possuem um recobrimento intermediário, utilizam
menos moléculas de tiol para a imobilização eficiente de uma única biomolécula,
diminuindo a ociosidade dos grupos que não reagiram com a HRP.
Ao avaliarmos as SAM com grupos terminais –NH2, verifica-se que as
mesmas utilizam menores quantidades de moléculas de tiol para a imobilização da
mesma quantidade de enzima que as SAM com grupamentos ácidos,
demonstrando que estas SAM não proporcionam muitos sítios reativos ociosos e,
neste caso, a imobilização é mais eficiente. No entanto, como esta relação está
diretamente ligada ao recobrimento das monocamadas sobre a superfície, pode-
se concluir um fato importante ao observarmos estes dois últimos tióis. Primeiro, o
grau de recobrimento da CYS é cerca de 40% menor que o da CISTE. Se
normalizarmos os recobrimentos destas monocamadas, necessitaríamos de mais
moléculas de CISTE por HRP. No entanto, constata-se novamente que a
cisteamina é a monocamada mais adequada, nestas condições, para a
imobilização eficiente na enzima HRP na superfície do eletrodo de ouro.
Se compararmos os dados da imobilização da HRP obtidos com o SPR
com os dados teóricos (1,4 1013 moléculas cm-2), verifica-se que não foi
imobilizada a quantidade máxima de enzima permitida pelo disco, provavelmente
pela influência das SAM, que não recobrem totalmente a superfície de ouro.
Assim, devido aos resultados obtidos usando as técnicas propostas para a
caracterização da imobilização da HRP em superfície metálica, apontarem os
eletrodos de ouro modificados com cisteamina como os mais promissores, este foi
selecionado para a otimização dos parâmetros analíticos do biossensor e,
posteriormente, determinação da espécie de interesse, o peróxido de hidrogênio.
79
4.6 Estudos Voltamétricos do Biossensor Au-CISTE-GLU-HRP:
Otimização e Determinação de Parâmetros
Depois de selecionado o melhor método para imobilização da enzima
peroxidase, iniciou-se a avaliação do desempenho analítico do biossensor. A
resposta voltamétrica foi examinada em função da concentração de enzima no
processo de imobilização, enquanto que os volumes dos outros componentes da
solução permaneceram constantes. A Figura 22 mostra o efeito da quantidade da
HRP nos valores de corrente, em solução contendo 85 µmol L-1 de H2O2 e 25 µmol
L-1 do mediador hidroquinona. É possível constatar que não houve aumento
significativo na resposta, com a concentração da HRP maior que 2 mg mL-1 e,
portanto, esta foi a concentração selecionada para os outros experimentos.
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
I / µ
A
concentração de HRP / mg mL-1
Figura 22. Efeito da quantidade de enzima na resposta voltamétrica do
biossensor Au-CISTE-GLU-HRP em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5
contendo 85 µmol L-1 de H2O2 e 25 µmol L-1 do mediador hidroquinona.
Velocidade de varredura: 50 mV s-1.
80
Como um dos objetivos deste trabalho era a determinação amperométrica
de peróxido de hidrogênio, foram também otimizados alguns parâmetros para esta
técnica. O principal deles é a escolha do potencial aplicado, pois este tem um forte
efeito na resposta do biossensor. Assim, fez-se um estudo da dependência do
potencial aplicado na corrente de redução do biossensor em solução tampão
fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 contendo 85 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio e 25
µmol L-1 de hidroquinona. Os resultados obtidos são apresentados na Figura 23 e,
como pode ser observado, a resposta aumenta conforme o potencial é alterado
para valores mais positivos, e alcança um máximo de intensidade de corrente em -
50 mV (vs. ECS). Isto ocorre, pois em potenciais mais negativos pode ocorrer a
formação de uma forma inativa da HRP, pela redução do estado de (III) para (II)
de ferro presente no sítio ativo da enzima (SANTOS et al., 2006). Acima do
potencial de -50 mV, a corrente diminui consideravelmente. Isto porque em
potenciais positivos pode ocorrer certa dificuldade de redução das espécies de
benzoquinona. Desta forma, o potencial de -50 mV foi selecionado para ser
utilizado nos outros experimentos.
-200 -150 -100 -50 0 500
10
20
30
40
∆j /
µA
cm
-2
Potencial / mV vs. ECS
Figura 23. Efeito do potencial aplicado na resposta amperométrica obtido
para o biossensor Au-CISTE-GLU-HRP em 85 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio
e 25 µmol L-1 de hidroquinona em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5.
81
Foi verificado também o efeito do eletrólito na resposta amperométrica do
biossensor Au-CISTE-GLU-HRP em solução contendo 85 µmol L-1 de peróxido de
hidrogênio e 25 µmol L-1 de hidroquinona. Todas as soluções, antes do uso,
tiveram o seu pH ajustado para 7,0. Os resultados são observados na Tabela 12.
Tabela 12. Estudo da influência da natureza do eletrólito suporte na resposta
amperométrica do biossensor pH = 7,0. (n=3).
Soluções Tampão 0,1
mol L-1
Corrente / µµµµA
Fosfato 3,1 ± 0,3
Hepes 2,2 ± 0,8
Pipes 2,3 ± 0,6
Tris 2,3 ± 0,9
Britton-Robinson 3,0 ± 0,4
Observando a Tabela 12, é possível verificar que os maiores valores de
corrente foram obtidos para o biossensor em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 e,
desta forma, este foi selecionado para os experimentos posteriores.
A influência do pH na resposta voltamétrica do biossensor para peróxido de
hidrogênio foi examinada na faixa de pH entre 5,0 e 8,0. Os resultados estão
apresentados na Figura 24, e observa-se o aumento da corrente de redução com
o aumento do pH até adquirir um valor máximo em pH igual a 6,5. A partir desta
condição, a corrente diminui novamente. Por conseguinte, um pH de 6,5 foi
adotado para os estudos posteriores e está condizente com os valores ótimos de
pH para outros biossensores a base de HRP encontrados na literatura.
82
5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,0
I / µ
A
pH
Figura 24. Dependência do pH na resposta amperométrica do biossensor
Au-CISTE-GLU-HRP em solução contendo 85 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio
e 25 µmol L-1 de hidroquinona em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5. E aplicado: -
50 mV (vs. ECS).
A influência da concentração do mediador na resposta do biossensor a
base de HRP foi investigado na presença de em 85 µmol L-1 de peróxido de
hidrogênio (tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 e -50 mV vs. ECS) e é mostrada na
Figura 25. O sinal do biossensor aumenta com a concentração de hidroquinona de
5 a 25 µmol L-1 e acima deste valor, torna-se praticamente constante. Isto ocorre,
porque em baixas concentrações de hidroquinona, a resposta do biossensor é
mediador-dependente. Somente quando a concentração de hidroquinona é alta o
suficiente, a resposta do eletrodo se torna substrato-dependente. Portanto, o valor
de 25 µmol L-1 foi empregado nos experimentos subsequentes.
83
0 10 20 30 40 50
20
25
30
35
40
45
∆j /
µA
cm
-2
concentração hidroquinona / µmol L-1
Figura 25. Influência da concentração do mediador hidroquinona na
resposta do biossensor Au-CISTE-GLU-HRP em 85 µmol L-1 de peróxido de
hidrogênio em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 e potencial aplicado de -50 mV.
Adicionalmente investigou-se a característica do sinal amperométrico do
biossensor com o aumento contínuo da concentração de peróxido de hidrogênio
em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 e quantidade constante de
mediador. A Figura 26 apresenta a curva que mostra a dependência da corrente
de reduçã,0com a adição de H2O2.
84
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
∆I
/ µA
concentração peróxido / µmol L-1
Figura 26. Curva analítica típica obtida para o biossensor Au-CISTE-GLU-
HRP em diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio e quantidade
constante de 25 µmol L-1 de hidroquinona em tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5. E
aplicado: -50 mV (vs. ECS).
A corrente possui uma boa linearidade relacionada com a concentração de
H2O2 na faixa de 3,0 a 100 µmol L-1. A sensibilidade encontrada para o biossensor
nestas condições foi de 8,4 mA µmol L-1 e o limite de detecção de 0,6 µmol L-1
estimado através do desvio padrão dos ensaios no tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH
6,5 (n=10) multiplicado por 3. A repetibilidade também foi avaliada usando o
desvio padrão relativo (DPR) e foi de 2,3%, para n=6 e em 85 µmol L-1 da espécie
de interesse. Além disso, a repetibilidade de preparação dos biossensores foi
estimada usando a resposta de 5 eletrodos diferentes e foi de 4,3%.
A estabilidade operacional do biossensor foi verificada utilizando-se o
eletrodo em análises repetidas com intervalo de 5 minutos sobre um longo período
de utilização. A Figura 27 mostra os resultados obtidos e é possível verificar que
95% da resposta inicial foi mantida após 200 determinações em solução tampão
fosfato 0,1 mol L-1 contendo 25 µmol L-1 do mediador e 85 µmol L-1 de H2O2.
85
0 50 100 150 200
20
40
60
80
100
120
Re
spo
sta
Re
lativ
a /
%
número de determinações
Figura 27. Estudo da estabilidade operacional do biossensor em solução
tampão fosfato 0,1 mol L-1 contendo 25 µmol L-1 de hidroquinona e 85 µmol L-1 de
peróxido de hidrogênio. Potencial aplicado: -50 mV (vs. ECS).
Para verificar o tempo de vida do biossensor procedeu-se por meio de
medidas diárias usando sempre o mesmo biossensor. Os resultados estão
apresentados na Figura 28, na qual é possível notar uma considerável
estabilidade até o trigésimo dia e, após este período, a resposta do biossensor
começa a apresentar uma redução diária. Cabe ressaltar que mesmo com esta
diminuição na resposta, o biossensor ainda apresenta sensibilidade suficiente para
ser utilizado em análises de rotina.
86
0 10 20 30 40 50 60 70 8020
40
60
80
100
120
Re
spo
sta
re
lativ
a /
%
tempo / dias
tempo de vida
Figura 28. Curva referente ao tempo de vida do biossensor Au-CISTE-GLU-
HRP para análise diária em solução tampão fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5 contendo
25 µmol L-1 de hidroquinona e 85 µmol L-1 de peróxido de hidrogênio. Potencial
aplicado: -50 mV (vs. ECS).
Os dados analíticos obtidos com este biossensor foi comparado com outros
dados da literatura, que também utilizaram a enzima HRP na forma imobilizada
para a determinação de peróxido de hidrogênio. Os resultados estão apresentados
na Tabela 13.
87
Tabela 13. Tabela 13. Comparação das respostas amperométricas de
biossensores a base da enzima HRP para a determinação de peróxido de
hidrogênio.
Eletrodo Mediador
Redox
E (V) Procedimento
de Imobilização
Características
Analíticas
Tempo
de Vida
Útil
Referência
Carbono vítreo Azul de
Metileno
-0,2 20 mg de HRp é
encapsulada com
uma proteína da
fibra da seda e
adsorvida no
eletrodo
0,1 µmol L-1 30 dias LIU et al.,
1995
Carbono vítreo Ferroceno -0,2 HRP foi
imobilizada com
ferroceno via
polimerização de
poliestireno e poli-
L-Lisina no
eletrodo
0,5 µmol L-1 YABUKI et
al., 2000
Pasta de
Carbono
Ferroceno 0,05 HRP foi
imobilizada com o
ferroceno em pasta
de carbono via
eletropolimerizaçã
o de poli-o-
aminofenol
8,5 µmol L-1 7 dias GARCÍA et
al., 1998
Biocompósito -0,05 HRP foi trapeada
em uma mistura de
grafite e resina
epóxi e platina
MORALES et
al., 1996
Ouro Tetratiofulvale
no
0,0 Coimobilização da
HRP e mediador
com glutaraldeído
em SAM de MPA
0,7 µmol L-1 15 dias CAMPUZAN
O et al., 2005
88
Ouro -0,2 Imobilização da
HRP em DNA
previamente
adsorvida em SAM
de cisteamina
0,5 µmol L-1 30 dias SONG et al.,
2006
Ouro
eletropolimeriz
a-do com
PPDA
Hidroquinona -0,1 Imobilização da
HRP em Au
coloidal adsorvido
em SAM de
cisteamina formada
sobre eletrodo
modificado
0,1 µmol L-1 21 dias LI et al., 2004
Ouro recoberto
com SAM de
cisteamina
Hidroquinona -0,2 Imobilização da
HRP em ouro
coloidal adsorvido
em um dendrímero
adsorvido sobre a
SAM
2 µmol L-1 30 dias LIU et al.,
2005
Nanotubos de
Ouro
Hidroquinona Nanotubos de ouro
foram modificados
com SAM MPA na
qual a HRP foi
covalentemente
imobilizada
DELVAUX et
al., 2004
Ouro Hidroquinona -0,05 Imobilização da
HRP com
glutaraldeído sobre
SAM de cisteamina
0,6 µmol L-1 30 dias Este trabalho6
Ouro -0,2 Imobilização da
HRP em DNA
previamente
adsorvida em SAM
de cisteamina
0,5 µmol L-1 30 dias SONG et al.,
2006
89
Observando a Tabela 13, é possível verificar que o biossensor Au-CISTE-
GLU-HRP apresentou bons resultados analíticos, quando comparado a outros
biossensores para peróxido de hidrogênio encontrados na literatura, até mesmo
para aqueles que se utilizam de nanomateriais para o seu desenvolvimento.
Principalmente, a robustez e tempo de vida do eletrodo proposto apresentaram
valores bastante promissores, ressaltando-se que o biossensor construído neste
trabalho possui um procedimento de preparação bem simples.
Em adição, avaliou-se o efeito de memória do biossensor empregando
soluções com diferentes quantidades de H2O2, tanto em baixas concentrações de
H2O2 (0,85 µmol L-1), como em concentrações mais altas (85 µmol L-1) em tampão
fosfato 0,1 mol L-1 pH 6,5. Os resultados estão apresentados na Figura 29 e pode
ser observado que o biossensor responde rapidamente a mudanças na
concentração do analito, não havendo alteração na resposta amperométrica. Este
tipo de análise é importante, pois indica que o biossensor proposto pode ser
acoplado a um sistema de injeção em fluxo ou usado para monitoramento em
tempo real.
0 8 17 25 33 42
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
∆I /
µA
tempo / min
Figura 29. Resposta amperométrica do biossensor Au-CISTE-GLU-HRP.
Experimento realizado em baixa e em alta concentração de peróxido de
90
hidrogênio: 0,85 µmol L-1 e 85 µmol L-1, respectivamente. Potencial aplicado de -
50 mV (vs. ECS) em 0,1 mol L-1 de tampão fosfato pH 6,5 e 25 µmol L-1 de
hidroquinona.
Os resultados obtidos com relação à resposta linear, limite de detecção,
sensibilidade e estabilidade do biossensor proposto indicam que este pode ser
usado na determinação quantitativa de peróxido de hidrogênio.
4.7 Determinação de Peróxido de Hidrogênio em Amostras
Odontológicas usando o Biossensor Au-CISTE-GLU-HRP
No mundo moderno e civilizado, dentes brancos, bem contornados e bem
alinhados estabelecem o padrão de beleza. O sorriso é o traço mais marcante de
nossa fisionomia. Através dele nos apresentamos e marcamos presença na
sociedade Os dentes brancos são, não apenas considerados atraentes, mas
indicam saúde nutricional, amor próprio e até status econômico.
Neste contexto, o clareamento dental tem se tornado um dos
procedimentos estéticos mais procurados pelas pessoas, devido a sua relativa
simplicidade de realização e rapidez na obtenção dos resultados.
O peróxido de hidrogênio ainda hoje é o produto mais efetivo e mais
utilizado nos procedimentos de clareamentos dentários. Mais comumente usado
nas concentrações de 30 a 35%, para aumentar ainda mais o poder de ação do
H2O2, tem sido recomendado o emprego de calor, como o laser. Porém, apesar de
muito eficaz, o peróxido de hidrogênio é muito cáustico, o que pode requer
cuidados e uma técnica muito apurada.
Embora a FDA (Food and Drug Administration) não tenha constatado que o
clareamento dental possa causar algum efeito maléfico à saúde, alguns órgãos
europeus como a SCCP (European Union’s Scientific Committee on Consumer
Products) tem verificado que a exposição a altas concentrações de H2O2 pode
aumentar o risco de desenvolver um câncer oral (MUNRO et al., 2006).
91
Os géis, a base de peróxido de hidrogênio, utilizados para clarear os dentes
nos consultórios odontológicos normalmente não possuem controle de qualidade e
a quantidade de princípio ativo presente nestes materiais pode variar muito.
Desta forma, a determinação de H2O2 é um procedimento importante, visto
que concentrações maiores que as indicadas podem causar riscos à saúde.
O teor de peróxido de hidrogênio presente em amostras odontológicas foi
determinado utilizando-se o biossensor proposto Au-CISTE-GLU-HRP. Estes
resultados foram comparados com o método oficial recomendado na Farmacopeia
(2000) que é baseado na titulação iodométrica. Porém, este método consome
tempo e gera uma grande quantidade de resíduos, tornando-se inadequada para
análises de rotina.
Para a análise usando o biossensor, foram realizados estudos de adição de
padrão empregando a técnica amperométrica, em solução tampão fosfato pH 6,5
contendo 25 µmol L-1 de hidroquinona. Foram realizadas quatro adições
sucessivas do padrão na amostra e a Figura 30 mostra o amperograma obtido
para uma das análises.
150 200 250 300 350 400 450
-0,40
-0,35
-0,30
-0,25
-0,20
-0,15
-0,10
-0,05
0,00
-20 -10 0 10 20 30 40 50 60
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
I / µ
A
concentração H2O
2 / µmol L-1
I / µ
A
tempo / s
Figura 30. Amperograma obtido para a adição de padrão usada na
determinação de peróxido de hidrogênio em amostras odontológicas. Solução
92
tampão 0,1 mol L-1 pH 6,5 contendo 25 µmol L-1 de hidroquinona. Potencial
aplicado: - 50 mV (vs. ECS), (n=4).
A Tabela 14 apresenta os resultados obtidos na determinação de peróxido
de hidrogênio com o biossensor e a comparação com o método oficial de titulação
iodométrica.
Tabela 14. Determinação da concentração de peróxido de hidrogênio em amostras
odontológicas, usando o biossensor proposto.
Amostra Valor
Rotulado
Biossensor
Proposto
Método
Oficial
Desvio
Relativo*
1 35% 36,4 ± 1,2% 36,1 ± 1,3% 0,8%
2 35% 37,1 ± 1,0% 36,9 ± 1,1% 0,6 %
3 35% 35,9 ± 0,8% 35,6 ± 1,2% 0,8 %
A estimativa do desvio padrão para n=3 foi realizada em todas as análises. * Estimativa do desvio
relativo obtido entre os métodos titulométrico e o biossensor proposto.
É possível verificar que os resultados obtidos com o biossensor Au-CISTE-
GLU-HRP estão muito próximos daqueles encontrados utilizando-se o método
oficial sugerido pela Farmacopéia. É interessante observar também que a
quantidade encontrada pelos dois métodos está cerca de 5% acima daquela
indicada no rótulo da amostra. Isso é muito comum de ocorrer, uma vez que
amostras farmacêuticas, na maioria das vezes, podem conter um excesso do
princípio ativo, especialmente em casos nos quais a substância pode sofrer
alguma degradação. Desta forma, uma vez que concentrações maiores que 35%
de peróxido de hidrogênio podem causar algum malefício à saúde, é muito
importante que haja um método fácil, robusto e sensível para o controle de
qualidade destas amostras, fato que torna o biossensor proposto uma ótima
alternativa para estas análises.
Na Tabela 15 encontram-se os valores de recuperação para o biossensor
aplicado nas amostras de clareamento dental. Por estes testes, pode-se concluir
93
que a matriz não interfere significativamente na resposta do biossensor, o que
evidencia alta seletividade para com a espécie de interesse analítico.
Tabela 15. Porcentagem de recuperação em diferentes amostras da solução
usada em clareamento dental obtida com o biossensor Au-CISTE-GLU-HRP.
Amostra Adicionado /
µµµµ mol L-1
Encontrado /
µµµµ mol L-1
Recuperação
/ %
1 0,0 14,7 ± 0,8 -
1 15,0 29,4 ± 0,5 99,0
1 30,0 45,0 ± 0,6 100,7
2 0,0 15,3 ± 0,3 -
2 15,0 30,8 ± 0,3 101,7
2 30,0 46,0 ± 0,7 100,4
3 0,0 14,6 ± 0,4 -
3 15,0 29,1 ± 0,4 98,3
3 30,0 44,8 ± 0,3 101,5
Com estas características o biossensor desenvolvido evidencia-se como
uma boa alternativa para a determinação de peróxido de hidrogênio em amostras
odontológicas usadas para clareamento dental, levando-se em conta que não há
necessidade da adição de nenhum reagente durante as análises e nem há
geração de resíduos tóxicos, ao contrário do que se verifica com o método de
referência. Além disso, o sensor apresentou uma boa faixa de resposta, boa
repetibilidade e estabilidade suficiente à realização de análises confiáveis.
Ressalta-se ainda que o sensor é construído de forma simples e com baixo
custo e seu tempo de vida pode se estender por alguns meses, se mantido em
ambiente limpo.
94
CAPÍTULO 5 5. Conclusões Gerais
i) Conclusões Relacionadas à Imobilização da Enzima HRP sobre
Monocamadas Auto-Organizadas
Na primeira etapa deste trabalho verificou-se que há influência do tipo de
SAM utilizada no processo de imobilização da enzima HRP. Uma das
influências mais notáveis é que nem sempre altos graus de recobrimento da
monocamada na superfície metálica significam uma maior imobilização
enzimática, como mostrou o ácido mercaptoundecanóico (MUA). Seu
recobrimento na superfície do eletrodo de ouro é a maior que dos outros tióis e,
no entanto, a sua sensibilidade frente ao peróxido de hidrogênio, substrato da
HRP, é baixa, devido a passivação da superfície, dificultando o processo de
transferência de elétrons.
Dentre as monocamadas com grupos terminais carboxílicos a monocamada
formada pelo ácido mercaptobenzóico (MBA) foi aquela que apresentou
resultados mais satisfatórios obedecendo a relação imobilização enzimática /
sensibilidade. Este resultado foi bastante surpreendente, pois o MBA não é
muito utilizado em outros trabalhos citados na literatura.
Porém, foi possível verificar que as monocamadas com grupos terminais –
NH2 foram aquelas que proporcionaram melhores resultados, tanto para a
imobilização da enzima HRP como na resposta eletroquímica para H2O2. Como
estas SAM foram as que apresentaram o menor grau de recobrimento e,
conseqüentemente, uma grande quantidade de defeitos na superfície do
eletrodo, acredita-se que o glutaraldeído esteja contribuindo de forma positiva
na imobilização enzimática. Estes resultados foram comprovados pelas
diferentes técnicas utilizadas neste trabalho. A técnica de SPR foi muito
importante na obtenção das informações relacionadas ao processo de
imobilização da HRP pois, foi possível, pela primeira vez, calcular a quantidade
de enzima que permaneceu imobilizada na superfície do disco.
95
Além disso, um outro fato importante de se observar é que nem sempre é
possível obter uma informação confiável com a utilização de apenas uma
técnica de caracterização do sistema. Por isso, na maioria das vezes, faz-se
necessário um estudo maior, envolvendo técnicas distintas, que possam
avaliar de forma diferente e/ou complementar o sistema de estudo.
ii) Conclusões sobre a Avaliação do Biossensor Proposto Au-CISTE-GLU-
HRP
O dispositivo proposto neste projeto demonstrou que é possível o
desenvolvimento de biossensores a base de monocamadas auto-organizadas
com excelente sensibilidade e estabilidade.
Embora muitos estudos ainda necessitem ser realizados a fim de se
aprimorar os parâmetros analíticos obtidos com este biossensor, o objetivo
mais importante do trabalho foi cumprido, uma vez que a verificação da
variação da resposta eletroquímica com o tipo de tiol utilizado na formação da
SAM foi avaliado.
E, neste sentido, a possibilidade de se vislumbrar as propriedades da
superfície previamente utilizada na imobilização enzimática é muito importante,
pois torna-se possível prever ou até mesmo estimar qual processo de
imobilização de biomoléculas pode se tornar mais eficiente para determinada
SAM.
Dentre os resultados obtidos com o biossensor proposto, verifica-se que o
limite de detecção encontrado possui um valor satisfatório, uma vez que é até
menor que alguns outros limites de detecção para H2O2 encontrados na
literatura, inclusive em casos nos quais de utilizam nanomateriais para o
desenvolvimento do biossensor. Os estudos de repetibilidade mostraram
resultados bastante interessantes com cisteamina e a reprodutibilidade entre
biossensores também foi boa, mostrando mais uma vez que a SAM é fácil de
construir. Adicionalmente, com o mesmo biossensor é possível realizar mais de
200 determinações mantendo-se ainda 95% da resposta inicial.
96
Merece destaque o alto tempo de vida útil encontrado para o sensor Au-
CISTE-GLU-HRP, que apresentou valores maiores que aqueles encontrados
na literatura, também utilizando-se o mesmo material biológico.
O dispositivo proposto neste trabalho possibilitou a realização da
determinação da concentração de peróxido de hidrogênio em amostras reais,
no caso amostras para clareamento dental, demonstrando excelente
desempenho. Em todas as amostras os resultados ficaram bem próximos dos
valores encontrados pelo método oficial.
O biossensor também foi avaliado frente aos testes de recuperação,
apresentando também bons resultados, indicando que a matriz não interfere
significativamente na resposta do biossensor. Este comportamento evidencia a
alta seletividade do dispositivo.
Como visto, o biossensor Au-CISTE-GLU-HRP além de comprovar que a
estratégia elaborada para a sua construção é bastante simples e reprodutível,
resultou em um excelente dispositivo para a determinação na concentração de
peróxido de hidrogênio em amostras reais, com boa estabilidade e exatidão.
97
CAPÍTULO 6 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALLARA, D.L. (1995). Critical issues in applications of self-assembled monolayers. Biosens. Bioelectron. 10, 771-783. BADIA, A.; LENNOX, R.B.; REVEN, L. (2000). A dynamic view of self-assembled monolayers. Acc. Chem. Res. 33 (7), 475-481. BAIN, C.D.; WHITESIDES, G.M. (1988). Formation of 2-component surfaces by the spontaneous assembly of monolayers on gold from solutions containing mixtures of organic thiols. J. Am. Chem. Soc. 110 (19), 6560-6561. BAIN, C.D.; BIEBUYCK, H.A.; WHITESIDES, G.M. (1989). Comparison of self-assembled monolayers on gold - coadsorption of thiols and disulfides. Langmuir 5 (3), 723-727. BAIN, C.D.; TROUGHTON, E.B.; TAO, Y.T.; EVALL, J.; WHITESIDES, G.M.; NUZZO, R.G. (1989). Formation of monolayer film by the spontaneous assembly of organic thiols from solution onto gold. J. Am. Chem. Soc. 111, 321-335. BAIN, C.D.; WHITESIDES, G.M. (1989). Formation of monolayers by the coadsorption of thiols on gold - variation in the length of the alkyl chain. J. Am. Chem. Soc. 111 (18), 7164-7175. BARD, A.J.; FAULKER, L.R. (1990). Electrochemical Methods, Fundamental and Apllications. Wiley, New York. BECKA, A.M.; MILLER, C.J. (1992). Electrochemistry at omega-hydroxy thiol coated electrodes .3. Voltage independence of the electron-tunneling barrier and measurements of redox kinetics at large overpotentials. J. Phys. Chem. 96 (6), 2657-2668. BENSEBAA, F.; VOICU, R.; HURON, L.; ELLIS, T.H.; KRUUS, E. (1997). Kinetics of formation of long-chain n-alkanethiolate monolayers on polycrystalline gold. Langmuir 13 (20), 5335-5340. BIEBUYCK, H.A.; BIAN, C.D.; WHITESIDES, G.M. (1994). Comparison of organic monolayers on polycrystalline gold spontaneously assembled from solutions containing dialkyl disulfides or alkenethiols. Langmuir 10 (6), 1825-1831. BOUBOUR, E.; LENNOX, R.B. (2000). Insulating properties of self-assembled monolayers monitored by impedance spectroscopy. Langmuir 16, 4222-4228.
98
CAMPANELLA, L.; ROVERSI, R.; SAMMARTINO, M.P.; TOMASSETTI, M. (1998). Hydrogen peroxide determination in pharmaceutical formulations and cosmetics using a new catalase biosensor. J. Pharm. Biomed. Anal. 18 (1-2), 105-116. CAMPUZANO, S.; PEDRERO, M.; PINGARRÓN. (2005). A peroxidase-tetrathiafulvalene biosensor base don self-assembled monolayer modified Au electrodes for the flow-injection determination of hydrogen peroxide. Talanta 66, 1310-1319. CAMPUZANO, S.; PEDRERO, M.; MONTEMAYOR, C.; FATÍAS, E.; PINGARRÓN, J.M. (2006). Characterization of alkanethiol-self-assembled monolayers-modified gold electrodes by electrochemical impedance spectrocopy. J. Electroanal. Chem. 586, 112-121. CARVALHAL, R.F.; FREIRE, R.S., KUBOTA, L.T. (2005). Polycrystalline gold electrodes: A comparative study of pretreatment procedures used for cleaning and thiol self-assembly monolayer formation. Electroanalysis 17 (14), 1251-1259. CARVALHO, A.; GEISSLER, M.; SCHMID, H.; MICHEL, B.; DELAMARCHE, E. (2002). Self-assembled monolayers of eicosanethiol on palladium and their use in microcontact printing. Langmuir 18 (6), 2406-2412. CARVALHO, R.M.; RATH, S.; KUBOTA, L.T. (2003). SPR – Uma nova ferramenta para biossensores. Quim. Nova 26 (1), 97-104. CASSIE, A.B.D. (1948). Contact angles. Discuss. Faraday Soc. 3, 11-16. CHAKI, N.K.; VIJAYAMOHANAN, K. (2002). Self-assembled monolayers as a tunable platform for biosensor applications. Biosens. Bioelectron. 17, 1-12. CHIDSEY, C.E.D.; BERTOZZI, C.R.; PUTVINSKI, T.M.; MUJSCE, A.M. (1990). Coadsorption of ferrocene-terminated and unsubstituted alkanethiols on gold - electroactive self-assembled monolayers. J. Am. Chem. Soc. 112 (11), 4301-4306. COLLARD, D.M.; FOX, M.A. (1991). Use of electroactive thiols to study the formation and exchange of alkanethiol monolayers on gold. Langmuir 7 (6), 1192, 1197. COLORADO, R.; LEE, T.R. (2003). Wettabilities of self-assembled monolayers on gold generated from progressively fluorinated alkanethiols. Langmuir 19 (8), 3288-3296. CORVELEYN, S.; VANDENBOSSCHE, G.M.R.; REMON, J.P. (1997). Near-infrared (NIR) monitoring of H2O2 vapor concentration during Vapor Hydrogen Peroxide (VHP) sterilization. Pharm. Res. 14 (3), 294-298. CREAGER, S.E.; OLSEN, K.G. (1995). Self-assembled monolayers and enzyme electrodes: progress, problems and prospects. Anal. Chim. Acta 307, 277-289.
99
CUNNINGHAM, A.J. (1998). Introduction to Bioanalytical Sensor. John Wiley & Sons, Inc. New York, 19-21. DAMOS, F.S.; MENDES, R.K.; KUBOTA, L.T. (2004). Aplicações de QCM, EIS e SPR na investigação de superfícies e interfaces para o desenvolvimento de (bio)sensores. Quim. Nova 27 (6), 970-979. DANNENBERGER, O.; WOLFF, J.J.; BUCK, M. (1998). Solvent dependence of the self-assembly process of an endgroup-modified alkanethiol. Langmuir 14 (17), 4679-4682.
DEBONO, R.F.; LOUCKS, G.D.; DELLAMANNA D., KRULL, U.J. (1996). Self-assembly of short and long-chain n-alkyl thiols onto gold surfaces: A real-time study using surface plasmon resonance techniques. Can. J. Chem. 74 (5), 677-688. DEQUAIRE, M.; LIMOGES, B.; MOIROUX, J.; SAVEANT, J.M. (2002). Mediated electrochemistry of horseradish peroxidase. Catalysis and inhibition. J. Am. Chem. Soc. 124 (2), 240-253. DIAO, P.; GUO, M.; TONG, R. (2001). Characterization of defects in the formation processo f self-assembled thiol monolayers by electrochemical impedance spectroscopy. J. Electroanal. Chem. 495, 98-105. DIDENKO, Y.T.; PUGACH, S.P. (1994). Spectra of water sonoluminescence. J. Phys. Chem. A 98 (39), 9742-9749. DIJKSMA, M.; KAMP, B.; HOOGVLIET, J.C.; VAN BENNEKOM, W.P. (2000). Formation and electrochemical characterization of self-assembled monolayers of thioctic acid on polycrystalline gold electrodes in phosphate buffer pH 7.4. Langmuir 16, 3852-3857. DING, S.J.; CHANG, B.W.; WU, C.C.; LAI, M.F.; CHANG, H.C. (2005). Electrochemical evaluation of avidin-biotin interaction on self-assembled gold electrodes. Electrochim. Acta 50 (18), 3660-3666. DONG, S.; LI, J. (1997). Self-assembled monolayers of thiols on gold electrodes for bioelectrochemistry and biosensors. Bioelectrochem. Bioenerg. 42, 7-13. DORDI, B.; SCHONHERR, H.; VANCSO, G.J. (2003). Reactivity in the confinement of self-assembled monolayers: Chain length effects on the hydrolysis of N-hydroxysuccinimide ester disulfides on gold. Langmuir, 19 (14), 5780-5786. DOWLING, D.P.; DONNELLY, K.; MC CONNELL, M.L.; ELOY, R.; ARNAUD, M.P. (2001). Deposition of anti-bacterial silver coatings on polymeric substrates. Thin Solid Films 398, 602-606. EGGINS, B.R. (1996). Biosensors: an introduction. J. Wiley, New York. p. 12-26.
100
FINKLEA, H.O. (1996). Electrochemistry of organized monolayers of thiols and related molecules on electrodes. Electroanal. Chem. 19, 109-235. FERREIRA, M.; CAETANO, W.; ITRI, R.; TABAK, M.; OLIVEIRA JR, O.N. (2005). Técnicas de caracterização para investigar interações no nível molecular em filmes de Langmuir-Blodgett (LB). Quim. Nova 28 (3), 502-510. FERRETTI, S.; PAYNTER, S.; RUSSELL, D.A.; SAPSFORD, K.E.; RICHARDSON, D.J. (2000). Self-assembled monolayers: a versatile tool for the formulation of bio-surfaces. Trend in Anal. Chem. 19 (9), 530-540. FINKLEA, H.O.; AVERY, S.; LYNCH, M. (1987). Blocking oriented monolayers of alkyl mercaptans on gold electrodes. Langmuir 3, 409-413. FREIRE, R.S.; PESSOA, C.A.; KUBOTA, L.T. (2003). Emprego de monocamadas auto-organizadas no desenvolvimento de sensores eletroquímicos. Quim. Nova 26 (3), 381-389. FREIRE, R.S.; KUBOTA, L.T. (2004). Application of self-assembled monolayer-based electrodes for voltammetric determination of copper at ppq-level. Electrochim. Acta 49, 3795-3800. GIZ, M.J.; DUONG, B.; TAO, N.J. (1999). In situ STM study of self-assembled mercaptopropionic acid monolayers for electrochemical detection of dopamine. J. Electroanal. Chem. 465, 72-79. GOODING, J.J.; HIBBERT, D.B. (1999). The application of alkanethiol self-assembled monolayers to enzyme electrodes. Trends in Anal. Chem. 18 (8), 525-533. GOODING, J.J.; MEARNS, F.; YANG, W.; Liu, J. (2003). Self-assembled monolayers into 21st century: recent advances and applications. Electroanalysis 15 (2), 81-96. GOODING, J.J.; EROKHIN, P.; LOSIC, D.; YANG, W.R.; POLICARPIO, V.; LIU, J.Q.; HO, F.M.; SITUMORANG, M.; HIBBERT, D.B.; SHAPTER, J.G. (2001). Parameters important in fabricating enzyme electrodes using self-assembled monolayers of alkanethiols. Anal. Sci. 17 (1), 3-9. GORTON, L.; CSOREGI, E.; DOMINGUEZ, E.; EMNEUS, J.; JONSSONPETTERSSON, G.; MARKOVARGA, G.; PERSSON, B. (1991). Selective detection in flow-analysis based on the combination of immobilized enzymes and chemically modified electrodes. Anal. Chim. Acta 250 (1), 203-248. HERREN, J.I.; KUNZELMAN, K.S.; VOCELKA, C.; COCHRAN, M.D.; SPIESS, B.D. (1997). Horseradish peroxidase as a histological indicator of mechanisms of porcine retinal vascular damage and protection with perfluorocarbons after massive air embolism. Stroke 28, 2025-2030.
101
HOLM, T.R.; GEORGE, G.K.; BARCELONA, M.J. (1987). Fluorometric-determination of hydrogen-peroxide in groundwater. Anal. Chem. 59 (4), 582-586. HOMOLA, J.; YEE, S.S.; GAUGLITZ, G. (1999). Surface plasmon resonance sensors: review. Sens. Actuators B 54 (1-2), 3-15. HONG, J.G.; MAGUHN, J.; FREITAG, D.; KETTRUP, A. (1998). Determination of H2O2 and organic peroxides by high-performance liquid chromatography with post-column UV irradiation, derivatization and fluorescence detection. Fresenius J. Anal. Chem. 361 (2), 124-128. HOUSTON, J.E.; KIM, H.I. (2002). Adhesion, friction, and mechanical properties of functionalized alkanethiol self-assembled monolayers. Acc. Chem. Res. 35 (7), 547-553. HU, K. & BARD, A.J. (1998). In situ monitoring of kinetics of charged thiol adsorption on gold using an atomic force microscope. Langmuir 14 (17), 4791-4794. HUANG, J.Y.; HEMMINGER, J.C. (1993). Photooxidation of thiols in self-assembled monolayers on gold. J. Am. Chem. Soc. 115 (8), 3342-3343.
IMABAYASHI, S.C.; IIDA, M.; HOBARA, D.; FENG, Z.Q.; NIKI, K.; KAKIUCHI, T. (1997). Reductive desorption of carboxylic-acid-terminated alkanethiol monolayers from Au (111 surfaces. J. Electroanal. Chem. 428, 33-38.
IMABAYASHI, S.C.; HOBARA, D.; KAKIUCHI, T.; KNOLL, W. (1997). Selective replacement of adsorbed alkanethiols in phase-separated binary self-assembled monolayers by electrochemical partial desorption. Langmuir 13 (17), 4502-4504.
IMABAYASHI, S.; IIDA, M.; HOBARA, D.; FENG, Z.Q.; NIKI, K.; KAKIUCHI, T. (1997). Reductive desorption of carboxylic-acid-terminated alkanethiol monolayers from Au(111) surfaces. J. Electroanal. Chem. 428 (1-2), 33-38.
JENNINGS, G.K.; YONG, T.H.; MUNRO, J.C.; LAIBINIS, P.E. (2003). Structural effects on the barrier properties of self-assembled monolayers formed from long-chain omega-alkoxy-n-alkanethiols on copper. J. Am. Chem. Soc. 125 (10), 2950-2957.
JUNG, C.C.; SABAN, S.B.; YEE, S.S.; DARLING, R.B. (1996). Chemical electrode surface plasmon resonance sensor. Sens. Actuators B 32 (2), 143-147. JUNG, C.; DANNENBERGER, O.; XU, Y.; BUCK, M.; GRUNZE, M. (1998). Self-assembled monolayers from organosulfur compounds: a comparison between sulfides, disulfides and thiols. Langmuir 14, 1103-1107.
102
KANG, J.F.; LIAO, S.; JORDAN, R.; ULMAN, A. (1998). Mixed self-assembled monolayers of rigid biphenyl thiols: Impact of solvent and dipole moment. J. Am. Chem. Soc. 120 (37), 9662-9667. KARPOVICH, D.S.; BLANCHARD, G.J. (1994). Direct measurement of the adsorption-kinetics of alkanethiolate self-assembled monolayers on a microcrystalline gold surface. Langmuir 10 (9), 3315-3322. KAWAGUCHI, T.; YASUDA, H.; SHIMAZU, K.; PORTER, M.D. (2000). Electrochemical quartz crystal microbalance investigation of the reductive desorption of self-assembled monolayers of alkanethiols and mercaptoalkanoic acids on Au. Langmuir 16 (25), 9830-9840. KIM, H.J.; KWAK, S.; KIM, Y.S.; SEO, B.I.; KIM, E.R.; LEE, H. (1998). Adsorption kinetics of alkanethiols studied by quartz crystal microbalance. Thin Solid Films 327, 191-194. KIM, Y.T.; BARD, A.J.(1992). Imaging and etching of self-assembled n-octadecanethiol layers on gold with the scanning tunneling microscope. Langmuir 8 (4), 1096-1102. KLASSEN, N.V.; MARCHINGTON, D.; MCGOWAN, H.C.E. (1994). H2O2 determination by the I-3(-) method and by KMnO4 titration. Anal. Chem. 66 (18), 2921-2925. LAIBINIS, P.E.; WHITESIDES, G.M.; ALLARA, D.L.; TAO, Y.T.; PARIKH, A.N.; NUZZO, R.G. (1991). Comparison of the structures and wetting properties of self-assembled monolayers of normal-alkanethiols on the coinage metal-surfaces, Cu, Ag, Au. J. Am. Chem. Soc. 113 (19), 7152-7167. LAIBINIS, P.E.; WHITESIDES, G.M. (1992). Self-assembled monolayers of n-alkanethiolates on copper are barrier films that protect the metal against oxidation by air. J. Am. Chem. Soc. 114 (23), 9022-9028. LEGGETT, G.J. (2003). Friction force microscopy of self-assembled monolayers: probing molecular organisation at the nanometre scale. Anal. Chim. Acta 479 (1), 17-38. LEWIS, P.A.; DONHAUSER, Z.J.; MANTOOTH, B.A.; SMITH, R.K.; BUMM, L.A.; KELLY, K.F.; WEISS, P.S. (2001). Control and placement of molecules via self-assembly. Nanotechnology 12 (3), 231-237. LI, S. & CROOKS, R.M. (1991). Imaging of defects contained within n-alkylthiol monolayers by combination of underpotential deposition and scanning tunneling microscopy - kinetics of self-assembly. J. Electrochem. Soc. 138 (8), L23-L25.
103
LIEDBERG, B.; LUNDSTROM, I.; STENBERG, E. (1993). Principles of biosensing with an extended coupling matrix and surface-plasmon resonance. Sens. Actuators B 11 (1-3), 63-72. LIMOGES, B.; SAVEANT, J.M.; YAZIDI, D. (2003). Quantitative analysis of catalysis and inhibition at horseradish peroxidase monolayers immobilized on an electrode surface. J. Am. Chem. Soc. 125 (30), 9192-9203. LI, C.X.; DENG, K.Q.; SHEN, G.L. YU, R.Q. (2004). Amperometric hydrogen peroxide biosensor based on horseradish peroxidase-labeled nano-Au colloids immobilized on poly(2,6-pyridinedicarboxylic acid) layer by cisteamine. Anal. Sci. 20, 1277-1281. LIU, Y.C.; LIU, H.Y.; QIAN, J.H.; DENG, J.Q.; YU, T.Y. (1995). Regenerated silk fibroin membrane as immobilization matrix for peroxidase and fabrication of a sensor for hydrogen-peroxide utilizing methylene-blue as electron shuttle. Anal. Chim. Acta 316 (1), 65-72. LIU, Z.M.; YANG, Y.; LIU, Y.L., SHEN, G.L., YU, R.Q. (2005). A hydrogen peroxide biosensor based on nano-Au/PAMAM dendrimer/cystamine modified gold electrode. Sens. Actuators B 106, 394-400. LOJOU, É.; BIANCO, P. (2006). Application of the electrochemical concepts and techniques to amperometric biosensor devices. J. Electroceram. 16, 79-91. LOVE, J.C.; WOLFE, D.B.; CHABINYC, M.L.; PAUL, K.E.; WHITESIDES, G.M. (2002). Self-assembled monolayers of alkanethiolates on palladium are good etch resists. J. Am. Chem. Soc. 124 (8), 1576-1577. LOVE, J.C.; ESTROFF, L.A.; KRIEBEL, J.K.; NUZZO, R.G.; WHITESIDES, G.M. (2005). Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem Rev. 105 (4), 1103-1170. MANDLER, D.; TURYAN, I. (1996). Applications of self-assembled monolayers in electroanalytical chemistry. Electroanalysis 8 (3), 207-213. MANSUY-SCHLICK, V.; DELAGE-MOURROUX, R.; JOUVENOT, M.; BOIREAU, W. (2006). Strategy of macromolecular grafting onto a gold substrate dedicated to protein-protein interaction measurements. Biosens. Bioelectron. 21 (9), 1830-1837. MATSUBARA, C.; KAWAMOTO, N.; TAKAMURA, K. (1992). Oxo[5,10,15,20-Tetra(4-Pyridyl)Porphyrinato]Titanium(IV) - an ultra-high sensitivity spectrophotometric reagent for hydrogen-peroxide. Analyst 117 (11), 1781-1784. MENDES, R.K.; FREIRE, R.S.; FONSECA, C.P.; NEVES, S.; KUBOTA, L.T. (2004). Characterization of self-assembled thiols monolayers on gold surface by electrochemical impedance spectroscopy. J. Braz. Chem. Soc. 15 (6), 849-855.
104
MOODY, G.J.; SANGHERA, G.S.; THOMAS, J.D.R. (1986). Amperometric enzyme electrode system for the flow-injection analysis of glucose. Analyst 111 (6), 605-609. MULDER, W.H.; CALVENTE, J.J.; ANDREU, R. (2001). A kinetic model for the reductive desorption of self-assembled thiol monolayers. Langmuir 17 (11), 3273-3280. MUNAKATA, H.; OYAMATSU, D.; KUWABATA, S. (2004). Effects of omega-functional groups on pH-dependent reductive desorption of alkanethiol self-assembled monolayers. Langmuir 20 (23), 10123-10128. MUNRO, I.C.; WILLIAMS, G.M.; HEYMANN, H.O.;KROES, R. (2006). Tooth whitening products and the risk of oral cancer. Food Chem. Toxicol. 44, 301-315. MURPHY, L.; (2006). Biosensors and bioelectrochemistry. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (2), 177-184. NAKAMURA, T.; AOKI, K.; CHEN, J. (2002). Temperature-variation of capacitance of alkanethiol monolayer films. Electrochim. Acta 47, 2407-2411. NOH ,J.; MURASE, T.; NAKAJIMA, K.; LEE, H.; HARA, M. (2000). Nanoscopic investigation of the self-assembly processes of dialkyl disulfides and dialkyl sulfides on Au(111). J. Phys. Chem. B 104 (31), 7411-7416. NOH, J.; NAKAMURA, F.; KIM, J.; LEE, H.; HARA, M. (2002). Structural study of dialkyl sulfide self-assembled monolayers on Au(111). Mol. Cryst. Liq. Cryst. 377, 165-168. NORROD, K.L.; ROWLEN, K.L. (1998). Ozone-induced oxidation of self-assembled decanethiol: Contributing mechanism for "photooxidation"?. J. Am. Chem. Soc. 120 (11), 2656-2657. NUZZO, R.G.; ALLARA, D.L. (1983). Adsorption of bifunctional organic disulfides on gold surfaces. J. Am. Chem. Soc. 105 (13), 4481-4483. NUZZO, R.G.; DUBOIS, L.H.; ALLARA, D.L. (1990). Fundamental-studies of microscopic wetting on organic-surfaces .1. Formation and structural characterization of a self-consistent series of polyfunctional organic monolayers. J. Am. Chem. Soc. 112 (2), 558-569. O'DWYER, C.; GAY, G.; LESEGNO, B.V.; WEINER, J. (2004). The nature of alkanethiol self-assembled monolayer adsorption on sputtered gold substrates. Langmuir 20 (19), 8172-8182. PAN, W.; DURNING, C.J.; TURRO, N.J. (1996). Kinetics of alkanethiol adsorption on gold. Langmuir 12, 4469-4473.
105
PEREIRA, A.C.; SANTOS, A.D.; KUBOTA, L.T. (2002). Tendências em modificação de eletrodos amperométricos para aplicações eletroanalíticas. Quim. Nova 25 (6A), 1012-1021. PETERLINZ, K.A.; GEORGIADIS, R. (1996). In situ kinetics of self-assembly by surface plasmon resonance spectroscopy. Langmuir 12 (20), 4731-4740. PINKERNELL, U.; EFFKEMANN, S.; KARST, U. (1997). Simultaneous HPLC determination of peroxyacetic acid and hydrogen peroxide. Anal. Chem. 69 (17), 3623-3627. POIRIER, G.E. (1997). Characterization of organosulfur molecular monolayers on Au(111) using scanning tunneling microscopy. Chem. Rev. 97 (4), 1117-1127. PORTER, M.D.; BRIGHT, T.B.; ALLARA, D.L.; CHIDSEY, C.E.D. (1987). Spontaneously organized molecular assemblies .4. Structural characterization of normal-alkyl thiol monolayers on gold by optical ellipsometry, infrared-spectroscopy, and electrochemistry. J. Am. Chem. Soc. 109 (12), 3559-3568. QIN, W.; ZHANG, Z.J.; LI, B.X.; LIU, S.N. (1998). Chemiluminescence flow-sensing system for hydrogen peroxide with immobilized reagents. Anal. Chim. Acta 372 (3), 357-363. REN, C.B.; SONG, Y.H.; LI, Z.; ZHU, G.Y. (2005). Hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase immobilized on a silver nanoparticles/cysteamine/gold electrode. Anal. Bioanal. Chem. 381 (6), 1179-1185. ROGERS, K.R. (2000). Principles of affinity-based biosensors. Mol. Biotech. 14 (2), 109-129. RUSGAZ, T.; CSOREGI, E.; EMNÉUS, J.; GORTON, L.; MARKO- VARGA, G. (1996). Peroxidase-modified electrodes: fundamentals and apllications. Anal. Chim. Acta 330, 123-138. SAKURAGAWA, A.; TANIAI, T.; OKUTANI, T. (1998). Fluorometric determination of microamounts of hydrogen peroxide with an immobilized enzyme prepared by coupling horseradish peroxidase to chitosan beads. Anal. Chim. Acta 374 (2-3), 191-200. SAMBLES, J.R.; BRADBERY, G.W.; YANG, F.Z. (1991). Optical-excitation of surface-plasmons - an introduction. Contemp. Phys. 32 (3), 173-183. SANTOS, A.S.; DURAN, N.; KUBOTA, L.T. (2005). Biosensor for H2O2 response based on horseradish peroxidase: Effect of different mediators adsorbed on silica gel modified with niobium oxide. Electroanalysis 17 (12), 1103-1111.
106
SANTOS, A.S.; PEREIRA, A.C.; SOTOMAYOR, M.D.P.T.; TARLEY, C.R.T.; DURÁN, N.; KUBOTA, L.T. (2006). Determination of phenolic compounds based on coimmobilization of methylene blue and HRP on multi-wall carbon nanotube. Electroanalysis, submetido. SCHRECK, S.; DORNENBURG, H.; KNORR, D. (1996). Evaluation of hydrogen peroxide production in tomato (Lycopersicon esculentum) suspension cultures as a stress reaction to high pressure treatment. Food Technol. 10 (2), 163-171. SCHREIBER, F. (2000). Structure and growth of self-assembling monolayers. Prog. Surf. Sci. 65, 151-256. SELLERS, H.; ULMAN, A.; SHNIDMAN, Y.; EILERS, J.E. (1993). Structure and binding of alkanethiolates on gold and silver surfaces: implications for self-assembled monolayers. J.Am.Chem. Soc. 115, 9389-9401. SHIMAZU, K.; YAGI, I.; SATO, Y.; UOSAKI, K. (1992). In situ and dynamic monitoring of the self-assembling and redox processes of a ferrocenylundecanethiol monolayer by electrochemical quartz crystal microbalance. Langmuir 8 (5), 1385-1387. SMITH, R.K.; LEWIS, P.A.; WEISS, P.S. (2004). Patterning self-assembled monolayers. Prog. Surf. Sci. 75, 1-68. SONG, Y.; WANG, L.; REN, C.; ZHU, G.; LI, Z. (2006). A novel hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase immobilized in DNA films on a gold electrode. Sens. Actuators B 114, 1001-1006. SUBRAMANIAN, R.; LAKSHMINARAYANAN, V. (2000). A study of kinetics of adsorption of alkanethiols on gold using electrochemical impedance spectroscopy. Electrochim. Acta 45, 4501-4509. SULLIVAN, T.P.; HUCK, W.T.S. (2003). Reactions on monolayers: organic synthesis in two dimensions. Eur. J. Org. Chem., 17-29.
SUN, L.; CROOK, R.M. (1991). Imaging of defects contained within n-alkylthiol monolayers by combination of underpotential deposition and scanning tunneling microscopy: kinetics of self-assembly. J. Electrochem. Soc. 138, L23-L25.
TANG, J.L.; WANG, B.Q.; WU, Z.Y.; HAN, X.J.; DONG, S.J.; WANG, E.K. (2003). Lipid membrane immobilized horseradish peroxidase biosensor for amperometric determination of hydrogen peroxide. Biosens. Bioelectron. 18 (7), 867-872. THE UNITED SATES PHARMACOPEIA. 24. (2000). Ed. Rockville, United States Pharmacopoeial Convention, 301-301.
107
THÉVENOT, D.R.; TOTH, K.; DURST, R.A.; WILSON, S.G. (2001). Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification. Biosens. Bioelectron. 16 (1-2), 121-131. ULMAN, A. (1996). Formation and structure of self-assembled monolayers. Chem. Rev. 96, 1553-1554. VIEIRA, I.D.; FATIBELLO-FILHO, O. (1998). Flow injection spectrophotometric determination of hydrogen peroxide using a crude extract of zucchini (Cucurbita pepo) as a source of peroxidase. Analyst 123 (9), 1809-1812. WANG, J.; LIN, Y.H.; CHEN, L. (1993). Organic-phase biosensors for monitoring phenol and hydrogen-peroxide in pharmaceutical antibacterial products. Analyst 118 (3), 277-280. WANG, J.; ZENG, B.; FANG, C.; ZHOU, X. (2000). Electrochemical characteristic of 2-mercaptobenzothiazole self-assembled monolayer on gold. Anal. Sci. 16, 457-461. WEISSHAAR, D.E.; LAMP, B.D.; PORTER, M.D. (1992). Thermodynamically controlled electrochemical formation of thiolate monolayers at gold - characterization and comparison to self-assembled analogs. J. Am. Chem. Soc. 114 (14), 5860-5862. WESTBROEK, P.; VANHAUTE, B.; TEMMERMAN, E. (1996). Monitoring of high hydrogen peroxide concentrations by voltammetry. Fres. J. Anal. Chem. 354 (4), 405-409. WIDRIG, C.A.; CHUNG, C.; PORTER, M.C. (1991). The electrochemical desorption of n-alkanethiol monolayers from polycrystalline Au e Ag electrodes. J. Electroanal. Chem. 310, 335-339. WHITESIDES, G.M.; LAIBINIS, P.E. (1990). Wet chemical approaches to the characterization of organic-surfaces - self-assembled monolayers, wetting, and the physical organic-chemistry of the solid liquid interface. Langmuir 6 (1), 87-96. YAMADA, R.; SAKAI, H.; UOSAKI, K. (1999). Solvent effect on the structure of the self-assembled monolayer of alkanethiol. Chem. Lett. (7), 667-668. YAMADA, R.; WANO, H.; UOSAKI, K. (2000). Effect of temperature on structure of the self-assembled monolayer of decanethiol on Au(111) surface. Langmuir 16, 5523-5525. YAO, H.; LI, N.; XU, S.; XU, J.Z.; ZHU, J.J.; CHEN, H.Y. (2005). Electrochemical study of a new methylene blue/silicon oxide nanocomposition mediator and its application for stable biosensor of hydrogen peroxide. Biosens. Bioelectron. 21 (2), 372-377.
108
YANG, Z.; GONZALEZ-CORTES, A.; JOURQUIN, G.; VIRÉ, J.C.; KAUFFMANN, J.M. (1995). Analytical application of self-assembled monolayers on gold electrodes: critical importance of surface pretreatment. . Biosens. Bioelectron. 10, 789-795. YANG, W.R.; GOODING,J.J.; HIBBERT, D.B. (2001). Characterisation of gold electrodes modified with self-assembled monolayers of L-cysteine for the adsorptive stripping analysis of copper. J. Electroanal. Chem. 516 (1-2), 10-16. YANG, G.; LIU, G.Y. (2003). New insights for self-assembled monolayers of organothiols on Au(111) revealed by scanning tunneling microscopy. J. Phys. Chem. B 107 (34), 8746-8759. YANG, G.H.; AMRO, N.A.; STARKEWOLFE, Z.B.; LIU, G.Y. (2004). Molecular-level approach to inhibit degradations of alkanethiol self-assembled monolayers in aqueous media. Langmuir 20 (10), 3995-4003. ZHANG, Y.; TERRILL, R.H.; BOHN, P.W. (1999). Ultraviolet photochemistry and ex situ ozonolysis of alkanethiol self-assembled monolayers on gold. Chem. Mater. 11 (8), 2191, 2198. ZHANG, J.Z.; LI, B.; WANG, Z.X.; CHENG, G.J.; DONG, S.J. (1999). Functionalized inorganic-organic composite material derivated by sol-gel for construction of mediated amperometric hydrogen peroxide biosensor. Anal. Chim. Acta 388 (1-2), 71-78. ZHANG, S.; WRIGHT, G.; YANG, Y. (2000). Materials and techniques for electrochemical biosensor design and construction. Biosens. Bioelectron. 15 (5-6), 273-282.