tese - fabio andrade

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Instituto de Química - Araraquara

Estudo químico de chás brasileiros

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade

Orientador: Wagner Vilegas

ARARAQUARA - 2002

Tese apresentada ao Instituto de Química –UNESP – Araraquara, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química.

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado i

Comissão examinadora

Prof.Dr. Wagner Vilegas (Orientador)

Professor adjunto do Instituto de Química / UNESP / Araraquara

ProfªDrª Vanderlan da Silva Bolzani

Professor adjunto do Instituto de Química / UNESP / Araraquara

ProfªDrª Alba Regina Monteiro Souza Brito

Professor Titular do Instituto de Biologia / UNICAMP / Campinas

ProfªDrª Mitsue Haraguchi

Professor Doutor do Instituto Biológico de São Paulo

ProfªDrª Joana D’Arc Felicio de Souza

Professor Doutor do Instituto Biológico de São Paulo

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado ii

Curriculum vitae Dados pessoais

Nome: Fábio Donisete Pezzuto de Andrade

Filiação: Antônio Fernandes de Andrade e Vilma Pezzuto de Andrade

Data de Nascimento: 26 / 11 / 1973

Estado Civil: Solteiro

Naturalidade: Araraquara - SP

Nacionalidade: Brasileira

Carteira de Trabalho: 092320 Série 00122 - SP

Carteira de Identidade: 25.572.600-4

Órgão Emissor: SSP-SP Data de Emissão: 07/02/1990

Titulo de Eleitor: 1905932601-16 Zona: 013

CIC: 196.338.418-01

Certificado de Reservista: 131747 Série B

Registro no CRQ-IV: 04140182

Passaporte: CJ 680556

Tipo Sanguineo: O positivo

Endereço: R. Dr. Cristiano I. Vieira, 615, Parque das Laranjeiras

CEP: 14.801-556

Cidade: Araraquara - SP

Telefone: (016) 236-4214

Correio eletrônico: [email protected]

Formação

Primeiro grau:

Instituição: E.E.P.G. “Pedro José Neto”

Local: Araraquara - SP

Início: 1981 Conclusão: 1988

Segundo grau:

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado iii

Instituição: E.E.P.S.G. “Bento de Abreu”


Curso: Colegial Normal

Início: 1989 Conclusão: 1991

Terceiro grau:

Instituição: Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Instituto de Química - Câmpus de Araraquara


Curso: Bacharelado em Química Início: 1993 Conclusão: 1996

Pós-graduação Mestrado




Orientação: Prof. Dr. Wagner Vilegas

Área: Química Orgânica

Sub área: Química de Produtos Naturais

Projeto: “Investigação química de plantas da família Eriocaulacea”

Financiamento: FAPESP

Início: agosto de 1997 Conclusão: junho de 1999

Doutorado




Orientação: Prof. Dr. Wagner Vilegas

Área: Química Orgânica

Sub área: Química de Produtos Naturais

Projeto: “Investigação química de chás brasileiros”

Financiamento: FAPESP

Início: agosto de 1999....Conclusão: 24 de junho de 2002.

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado iv

Publicaçãoes

ANDRADE, F.D.P.; VILEGAS, W.. Constituintes de Sorocea bomplandii Bailon. Revista de

Ciências Farmacêuticas, v.19, p. 129-139, 1998.

ANDRADE, F.D.P.; SANTOS, L.C.; DOKKEDAL, A.L.; VILEGAS, W.. Acyl glicosylated

flavonols from Paepalanthus species. Phytochemistry, v. 51, p. 411-415, 1999.

TAVARES, D.C.; VARANDA, E.A.; ANDRADE, F.D.P.; VILEGAS, W.; TAKAHASHI, C.S..

Evaluation of the genotoxic potential of the isocoumarin Paepalanine in in vivo and in vitro

mammalian systems. Journal of Ethnopharmacology, v. 68, p. 115-120, 1999.

SANTOS, L.C.; ANDRADE, F.D.P.; VASCONCELOS, COELHO, R.G.; DOKKEDAL, A.L.;

GARCIA, A.C.L.; SANO, P.T.; VILEGAS, W.. Simultaneous separation of flavonoids and

naphtopyrones from Brasilian everlating plants by droplet coutercurrent chromatography. Revista

Brasileira de Plantas Medicinais, v. 2, n. 1, p. 43-47, 1999.

SANTOS, L.C.; DATCHLER, M.; ANDRADE, F.D.P.; ALBERT, K.; VILEGAS, W.. Application

of HPLC-NMR coupling using C30 phase in the separation and identification of flavonoids of

taxonomic relevance. Fresenius Journal Analytical, v. 368, n. 5, p. 540-542, 2000.

ANDRADE, F.D.P.; PIACENTE, S.; PIZZA, C.; VILEGAS, W.. Studies on the constituents of

Brasilian folk infusion. Isolation and structure elucidation.of new triterpene saponins from Ilex

amara leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, p. 255-261, 2002.

ANDRADE, F.D.P.; SANTOS, L.C.; DATCHLER, M.; ALBERT, K.; VILEGAS, W.. Use of on-

line HPLC-NMR for rapid invetigation of flavonids form Sorocea bomplandii. Journal of

Chomatography A, v. 953, p 287-291, 2002.

ANDRADE, F.D.P.; PIACENTE, S.; PIZZA, C.; VILEGAS, W. A new arbutin derivative from Ilex

theezans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002 (submetido).

COSTA, E.S.; HIRUMA-LIMA, C.A.; LIMA, E.O.; SUCUPIRA, G.C.; BERTOLIN, A.O.; LOLIS,

S.F.; ANDRADE, F.D.P.; VILEGAS, W.; SOUZA-BRITO, A.R.M.. Antimicrobial activity of

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado v

ethanolic extracts from higher plants of the Cerrado, Brazil. Flavonoid glycosides from Alchornea

castaneifolia . Phytomedicine, 2002 (submetido).

TOMA, W.; GRACIOSO, J.S.; ANDRADE, F.D.P.; PAULA, A.C.B.; ALMEIDA, A.B.A.;

HIRUMA-LIMA, C.A.; VILEGAS, W.; SOUZA BRITO, A.R.M. (2002). Phytochemical analysis

and evaluation of the analgesic and antiedematogenic activities of four extracts of different polarities

obtained from bark of Quassia amara L. (Simaroubaceae). J. Pharmaceutical Pharmacology, 2002

(submetido).

TOMA, W.; GRACIOSO, J.S.; ANDRADE, F.D.P.; HIRUMA-LIMA, C.A.; VILEGAS, W.;

SOUZA BRITO, A.R.M.. Antiulcerogenic activity of four extracts obtained from bark of Quassia

amara L. (Simaroubaceae). Biological Pharmaceutical Bulletin., 2002 (no prelo).

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado vi

A paciência é a medida metódica e eficaz que ensina a

produzir no momento exato a tarefa correta.

Joana de Ângelis

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado vii

Agradecimentos

A DEUS pela vida e pela oportunidade de sempre evoluir.

Aos meus pais por todo amor, carinho e ensinamentos que um doutoramento jamais ensinaria.

A FAPESP pela bolsa concedida.

A todos, que direta ou indiretamente, nos auxiliaram na realização deste trabalho.

Aos prof. Klaus Albert e Dr. Markus Datchler (Tübingen - Alemanha) e a Dra. Lourdes Campaner

dos Santos pelas análise por HPLC-RMN.

Aos professores da Faculdade de Farmácia de Salerno, principalmente aos profs. Cosimo Pizza e

Sonia Piacente, pela grande contribuição para esse trabalho.

Ao prof. Dr. Wagner Vilegas pela orientação

Finalmente, ao amigo Wagner por tantos outros ensinamentos, aqueles, sabe?! que estão além dos

muros da academia.

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado viii

Índice Comissão examinadora ...........................................................................................................................i Curriculum vitae .................................................................................................................................... ii Agradecimentos ...................................................................................................................................vii Índice...................................................................................................................................................viii Abreviaturas ...........................................................................................................................................1 Resumo...................................................................................................................................................3 Abstract..................................................................................................................................................4 Objetivos ................................................................................................................................................ 5 Considerações preliminares ...................................................................................................................6 Introdução ..............................................................................................................................................7

Plantas medicinais e os chás .............................................................................................................. 7 Atividade antiúlceras gástricas ...........................................................................................................9

Plantas ............................................................................................................................................ 9 Testes para avaliação de atividade antiúlcera .................................................................................. 10 O tratamento de úlceras (Silva, 1998) .............................................................................................. 10

Materiais e métodos .............................................................................................................................12 Reagentes ......................................................................................................................................... 12

Solventes PA:............................................................................................................................... 12 Equipamentos............................................................................................................................... 12 Extrações ...................................................................................................................................... 14 Procedimentos cromatográficos. .................................................................................................. 15 Material Vegetal........................................................................................................................... 16

Capítulo 1: Quassia amara (Simaroubaceae) ......................................................................................18 1.1. Experimental / Resultados / Discussões ................................................................................... 19

1.1.1. Ensaios biológicos ............................................................................................................. 19 Preparação dos extratos utilizados nos ensaios biológicos ...................................................... 19 Testes de analgesia................................................................................................................... 20 Resultados dos ensaios ............................................................................................................. 20

1.1.2. Análise fitoquímica de Quassia amara .............................................................................. 24 Fracionamento do extrato hexânico. ........................................................................................ 24 Qa1........................................................................................................................................... 24 Qa2........................................................................................................................................... 25 Qa3........................................................................................................................................... 25 Qa4........................................................................................................................................... 26

Análise do extrato hexânico por HPLC-ES-MS .......................................................................... 26 Capítulo 2: Alchornea castaneifolia (Euphorbiaceae).........................................................................30

2.1. Experimental / Resultados / Discussões ................................................................................... 31 2.1.1Ensaios biológicos ............................................................................................................... 31

Preparação dos extratos para os ensaios biológicos:................................................................ 31 Avaliação do extrato etanólico de A. castaneifolia .................................................................. 31

2.1.2. Estudo fitoquímico:............................................................................................................ 34 Ac1........................................................................................................................................... 35 Ac2........................................................................................................................................... 35 Ac3........................................................................................................................................... 36 Ac4........................................................................................................................................... 37

Capítulo 3: Curatella americana L. (Dilleniaceae) .............................................................................40 3.1. Experimental / Resultados / Discussões ................................................................................... 41

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado ix

3.1.1. Ensaios biológicos ............................................................................................................. 41 Preparação dos extratos para os ensaios biológicos ................................................................. 41 Avaliação do extrato etanólico de C. americana ..................................................................... 42

3.1.2. Estudo fitoquímico:............................................................................................................ 45 Extrato clorofórmico.................................................................................................................... 45

Ca1........................................................................................................................................... 46 Ca2........................................................................................................................................... 46

Extrato etanólico.......................................................................................................................... 47 Extrato aquoso (decocto) ............................................................................................................. 47

Ca3........................................................................................................................................... 47 Ca4........................................................................................................................................... 48 Ca5........................................................................................................................................... 48

3.1.4. Ensaios químicos para detecção de taninos no extrato etanólico de C. americana ........... 50 Capítulo 4: Hancornea speciosa Gomez (Apocynaceae) .................................................................... 52

4.1. Experimental / Resultados / Discussões ................................................................................... 53 4.1.1. Ensaios biológicos ............................................................................................................. 53 4.1.2. Estudo fitoquímico:............................................................................................................ 55

Preparação do decocto de H. speciosa ..................................................................................... 55 Fracionamento por HSCCC..................................................................................................... 55

Capítulo 5: Sorocea bomplandii Baill. (Moraceae) .............................................................................56 5.1. Experimental / Resultados / Discussões ................................................................................... 57

Capítulo 6: Ilex (Aquifoleaceae)..........................................................................................................65 6.1. Ilex amara (Vell.) Loes............................................................................................................. 65 6.2. Ilex theezans Mart. .................................................................................................................... 66 6.3. Experimental / Resultados/ Discussões .................................................................................... 67

6.3.1. Fracionamentos de I. amara e I. theezans .......................................................................... 67 6.3.2. Determinação estrutural..................................................................................................... 71

Espectros de RMN de saponinas triterpênicas ......................................................................... 71 Ilex amara ................................................................................................................................................................................. 72

Ia1............................................................................................................................................. 72 Ia2............................................................................................................................................. 80 Ia3............................................................................................................................................. 83 Ia4............................................................................................................................................. 84 Ia5............................................................................................................................................. 85 Ia6............................................................................................................................................. 86 Ia7............................................................................................................................................. 86 Ia8............................................................................................................................................. 87 Ia9............................................................................................................................................. 87 Ia10........................................................................................................................................... 88 Ia11........................................................................................................................................... 88 Ia12........................................................................................................................................... 89

Ilex theezans .................................................................................................................................91 It1 ............................................................................................................................................. 91 It2 ............................................................................................................................................. 91 It3 ............................................................................................................................................. 91 It4 ............................................................................................................................................. 92 It5 ............................................................................................................................................. 92

Capítulo 7: Considerações finais .........................................................................................................94 Conclusões .........................................................................................................................................103 Referências bibliográficas..................................................................................................................104 Anexos ...............................................................................................................................................111

Fabio Donisete Pezzuto de Andrade –Tese de Doutorado 1

Abreviaturas δ Deslocamento químico em ppm

AcOEt Acetato de etila

ara Arabinose

BAW Sistema de solvente butanol: ácido acético: água

BPI Base Peak Ion

CC Cromatografia em coluna

CCC Countercurrent chromatography. - Cromatografia em contracorrente.

COSY Correlation spectroscopy – Espectroscopia de correlações

D Dubleto

d.i. Diâmetro interno

DAD Diodo Array Detector - Detector de foto diodo

DAINE Droga antiinflamatória não esteroidal

DCM Diclorometano

dd Duplo dubleto

DMSO d6 Dimetilsulfóxido deuterado

EtOH Etanol

FI Fase inferior

Fr. Fração

FS Fase superior

gal Galactose

GC Gas chromatography - Cromatografia gasosa

GPC Gel Permeation Chromatography – Cromatografia por permeação em gel

glcA Ácido glicurônico

glu Glicose

HEX Hexano

HMBC Heteronuclear multiple-bond connectivity - Coerência heteronuclear com ligações

múltiplas

HMQC Heteronuclear multiplequantum coherence – Coerência heteronuclear múltiplo

quântica

HPLC High Performance Liquid Chromatography - Cromatografia líquida de alta eficiência


HOHAHA Homonuclear Hartmann-Hahn espectrometria

HSCCC High Speed Countercurrent Chromatography.- Cromatografia em contracorrente de

alta velocidade.

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento

M Multipleto

m/z Relação massa/carga

MeOH Metanol

MS Mass Spectrometry - Espectrometria de massas

NI Ïon negativo

NP/PEG Natural Product/Polietilenoglicol

PI Ïon positivo

ppm Partes por milhão

rha Rhamnose

RI Índice de refração

RMN Ressonância magnética nuclear

RMN 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

RMN 13C Ressonância magnética nuclear de carbono 13

RP Reversed phase – fase reversa

s Singleto

t Tripleto

TIC Total Íon Current – corrente total de íons

TLC Thin Layer Chromatography - Cromatografia em camada delgada comparativa

TMS Tetrametilsilano

TOCSY Totally Correlated Spectroscopy – Espectroscopia totalmente correlacionada

Tol Tolueno

tR Tempo de retenção

UV Ultravioleta


Resumo Neste trabalho apresentamos o estudo químico de plantas que são popularmente

utilizadas na forma de infusão. Como parte de nosso projeto, estudamos espécies usadas no

tratamento de úlceras gástricas: Quassia amara (Simaroubaceae), Alchornea castaneifolia

(Euphorbiaceae), Curatella americana (Dilleniaceae) e Hancornea speciosa (Apocynaceae). Os

extratos foram avaliados farmacológicamente em diferente modelos indutores de úlcera para avaliar

suas atividades. Os extratos ativos foram fracionados por técnicas cromatograficas e as substâncias

identificadas por métodos espectrométricos. Em Quassia amara foram identificados principalmente

esteróides e quassinóides; em C. americana foram identificados taninos, catequinas, terpenos e

ácidos fenólicos; em A. castaneifolia foram encontrados flavonóides glicosilados e em H. speciosa

foram identificados a catequina e o ácido clorogênico. Os extratos contendo essas substâncias

apresentam atividade antiúlcera comprovada dando suporte para o uso das plantas pela popula ção.

Apresentamos também o estudo fitoquímico de Ilex amara e Ilex theezans, duas plantas da família

Aquifoliaceae, que são comumente encontradas como adulterantes de Ilex paraguariensis , o popular

mate. Pela análise de I. theezans identificamos triterpenos, saponinas e um derivado sulfatado da

arbutina, enquanto que em I. amara identificamos um flavonóide, 11 saponinas, sendo duas inéditas.

As técnicas hifenadas de HPLC-RMN e HPLC-MS foram usadas para determinar a composição

flavonoídica da infusão de Sorocea bomplandii (Moraceae), um adulterante da espinheira-santa

(Maytenus ilicifolia – Celastraceae). Essa abordagem permitiu identificar os flavonóides presentes

como constituintes minoritários na infusão e permitiram diferenciar entre a verdadeira e a falsa

espinheira santa.


Abstract In this work we have investigated plants used in folk medicine in the form of infusion.

As a part of our project, we studied species used for the treatment of gastric ulcers: Quassia amara

(Simaroubaceae), Alchornea castaneifolia (Euphorbiaceae), Curatella americana (Dilleniaceae) and

Hancornea speciosa (Apocynaceae). The extracts were submitted to pharmacological evaluation in

different models to evaluate their antiulcer activities. The active extracts were fractionated by

chromatographic techniques and the substances were identified by spectrometric methods. Quassia

amara afforded mainly steroids and quassinoids; C. americana gave tannins, catequins, terpenes and

phenolic acids; A. castaneifolia afforded glycosilated flavonoids and H. speciosa gave chlorogenic

acid and catechin. These substances supported the antiulcer properties found in the investigated

extracts. Other species commonly found in Brazil as infusions are Ilex amara and Ilex theezans

(Aquifoleaceae), both considered as aduterant of Ilex paraguariensis, the traditional mate. The

analyses of Ilex theezans afforded triterpenes, saponins and a new sulphated arbutin derivative,

whereas Ilex amara gave one flavonoids and eleven triterpene saponins, two of them are new

derivatives. Saponins of I. amara were used to establish chemical differenciation between true and

false mates by HPLC-DAD analysis. The HPLC- NMR and HPLC-MS techniques were used to

determine the flavonoidic composition of aqueous extract of Sorocea bomplandii (Moraceae), an

adulterant of espinheira-santa (Maytenus ilicifolia – Celastraceae). This approach allowed to identify

the flavonoids present in minor amounts in the infusion and allowed to differenciate between true

and false espinheiras-santas.


Objetivos

Foram objetivos deste trabalho:

- Determinar a composição química de Alchornea casteneifolia (Euphorbiaceae), Curatella

americana (Dilleniaceae) e Hancornea speciosa (Apocynaceae), plantas popularmente utilizadas no

tratamento de úlceras gástricas;

- Determinar a composição química de Quassia amara (Simaroubaceae), planta popularmente

utilizada como analgésico;

- Verificar a eficiência das técnicas hifenadas HPLC-RMN e HPLC-MS na análise do extrato aquoso

de Sorocea bomplandii (Moraceae), um conhecido adulterante da espinheira-santa;

- Determinar a composição química de Ilex amara e Ilex theezans (Aquifoliaceae), plantas

encontradas como adulterantes do mate (Ilex paraguariensis).


Considerações preliminares

Neste projeto investigamos uma série de plantas de várias famílias e gêneros. Tendo

em vista este fato, optamos por apresentar o estudo de cada espécie individualmente, incluindo em

cada capítulo introdução, desenvolvimento e discussão. Além disso, como para cada espécie foram

feitos vários tipos de extratos, preferimos discutir os resultados provenientes de cada um dos extratos

separadamente, ao invés de apresentar toda a parte de isolamento e somente depois a identificação

espectrométrica de cada substância. Acreditamos que, dessa forma, pode-se ter uma visão mais clara

sobre o andamento do trabalho.

Os ensaios biológicos de atividade antiúlceras de Alchornea castaneifolia, Curatella.

americana, Hancornea speciosa foram realizados pela prof.ª Dr.ª .Clélia A. Hiruma Lima (IBB-

UNESP-Botucatu) e os ensaios de atividade antiinflamatória e analgesia com Quassia amara foram

realizados por Walber Toma em seu trabalho de mestrado apresentado ao IB/Unicamp.

As análises realizadas por HPLC-RMN foram realizados com a colaboração do grupo

de pesquisa do prof. Klaus Albert (Universidade de Tübingen - Alemanha) e da Dra. Lourdes

Campaner dos Santos em seu estágio durante o doutoramento.

As análises das espécies de Ilex foram realizadas junto ao grupo do Prof. Cosimo

Pizza e Sonia Piacente, da Universitá degli Studi di Salerno – Itália.


Introdução

Plantas medicinais e os chás

Encontrar a cura para as velhas e novas enfermidades tem sido o objetivo de homens e

mulheres, cientistas, mercadores e curandeiros, que perambulam hoje pelas matas brasileiras. No

filme Medicine Man (1992), Sean Connery interpreta um desses personagens. No inferno ou paraíso

verde da floresta amazônica, o pesquisador procura uma substância capaz de curar o câncer. Ficção à

parte, a história mostra o quanto plantas e animais podem contribuir para manter ou restabelecer a

saúde humana (Falceta Jr, 2002)

O tratamento de várias doenças vem sendo feito com plantas há mais de 3000 anos

a.C. Milhares de receitas empregando plantas medicinais eram usadas e, de lá para cá, quase não

houve mudanças. As receitas atravessaram os séculos tendo apenas pequenas variações em suas

formulações, ora com acréscimo de algumas ervas, outras vezes com a retirada de alguma das drogas

vegetais mas, ainda assim, sempre presentes na vida da humanidade (Zatta, 1996).

Os problemas econômicos são bem conhecidos: fármacos industrializados possuem

preços proibitivos para a população em geral (Gottlieb & Kaplan, 1993). A preparação de um

fármaco aprovado pelo FDA americano em torno de 500 milhões de dólares para ser desenvolvida

(Clay, 2000). Segundo a OMS, 80% da humanidade não tem acesso à medicina convencional, seja

pelos preços, seja pela distância que residem dos centros urbanos. A utilização de plantas medicinais

é uma prática generalizada na medicina popular brasileira, a qual é baseada no acúmulo secular de

conhecimentos empíricos sobre a ação dos vegetais, por diversos grupos étnicos (Gottlieb & Kaplan,

1993).

Hoje, o uso de plantas medicinais não se restringe apenas às zonas rurais ou regiões

desprovidas de assistência médica e farmacêutica. Elas são usadas intensamente no meio urbano

como forma alternativa ou complementar aos medicamentos da medicina industrializada (Simões,

1996).

Mesmo sem dispor do marketing das grandes indústrias farmacêuticas, o uso de

fitoterápicos tem aumento de 20% ao ano (Gullo et al., 1998). Nos países ricos, entre eles os Estados

Unidos, o uso de fitoterápicos vem aumentando consideravelmente a cada ano, de 2,5% em 1990

para 12,1% em 1997, equivalendo a um gasto de aproximadamente 5 bilhões de dólares (Clay, 2000).


Atualmente, a população das cidades acaba adquirindo os fitoterápicos no comércio,

na maioria das vezes de fornecedores não adequados. Em virtude dessa falta de conhecimento,

muitas vezes a população pode ser enganada pelos comerciantes, tanto voluntária quanto

involuntariamente (Di Stasi, 1996).

Toda sociedade acumula um acervo de informações sobre o ambiente que a cerca, que

vai lhe possibilitar interagir com ele para prover suas necessidades de sobrevivência. Nessa coleção

de dados, inscreve-se o conhecimento relativo ao mundo vegetal com o qual estas sociedades estão

em contato. É uma troca constante de informações sobre “qual chazinho faz bem para quê” ou “qual

garrafada cura o quê”. Essa coletânea aumenta com a mistura de culturas; um país como o Brasil, por

exemplo, tem um acervo de uso popular imenso, com influências trazidas pelos negros da África,

pelos europeus desbravadores, que giravam o mundo em busca de especiarias e pelos índios, nativos

dessa terra, que possuíam sua farmacopéia particular guardada com o pajé de sua tribo (Di Stasi,

1996).

A análise das tradições populares no uso de plantas medicinais faz parte do conjunto

de objetivos de estudo da etnobotânica. A etnobotânica pode ser definida como a disciplina que se

ocupa do estudo do conhecimento e das conceituações desenvolvidas por qualquer sociedade a

respeito do mundo vegetal; este estudo engloba tanto a maneira como um grupo social classifica as

plantas, como os usos que dá a elas. O interesse de conferir se as atividades anunciadas pela cultura

popular são reais estimula a intedisciplinaridade, associando ao trabalho etnobotânico, o

farmacológico e o químico (Di Stasi, 1996).

O potencial das plantas como fonte de novas drogas é ainda pouco explorado. Estima-

se existir entre 250.00-500.000 espécies de plantas em todo o mundo, das quais uma porcentagem

muito pequena foi submetida a estudo fitoquímico. As plantas contêm centenas ou milhares de

metabólitos. Assim, a investigação fitoquímica de uma dada planta pode revelar apenas uma pequena

porcentagem de seus constituintes (Hamburger & Hostettman, 1991).

Especialmente nos países em desenvolvimento, a população encontra nas plantas uma

importante oportunidade de solução para seus problemas de saúde. Isso leva a um grande risco de

envenenamento devido ao uso inapropriado ou excessivo dessas plantas. Um exemplo desse fato foi

o uso para afecções do fígado de Symphytum officinale (Boraginaceae), conhecido popularmente

como confrei. Estudos fitoquímicos revelaram que essa espécie é rica em alcalóides pirrolizidínicos,

que causam obstruções nas veias do fígado (IPCS News, 1995)

Diariamente, várias publicações leigas são impressas sobre os mais diversos tipos de

usos de chás medicinais. Algumas apresentam até mesmo receitas de elixires milagrosos capazes de

curar tudo. Os produtos, muitas vezes, usam um rótulo de produto 100% natural sem contra-

indicações o que, para a população, é extremamente atraente. No entanto, poucos estudos químicos e


biológicos são feitos com chás na forma como os mesmos são consumidos pela população e também

não se tem um controle de qualidade confiável das plantas medicinais que estão no mercado. Esse

conjunto de fatos pode levar a conseqüências desastrosas.

Recentemente na Bélgica, um grupo de mulheres que estava ingerindo um chá

emagrecedor de origem chinesa apresentou insuficiência renal e, nos casos mais graves, câncer das

vias urinárias e até mesmo morte. A planta com efeito emagrecedor é Stephania tetranda, que foi

trocada por Aristolochia fang-chi. A confusão deveu-se ao fato de que, em chinês, o nome vulgar das

duas plantas é o mesmo, pinyin, e não se conhece metodologia para diferenciar as duas plantas. A

intoxicação ocorre porque os ácidos aristolóquios (altamente cancerígenos) interagem com o DNA

das células renais. Na Bélgica, foram 110 vítimas do equivoco e existem relatos de que o problema

também tenha ocorrido na França, Japão, Espanha e Reino Unido (Laport, 2000).

Se problemas desse tipo ocorrem nos países europeus, onde a legislação é mais

contundente com relação ao conhecimento das propriedades das plantas medicinais e ao controle de

qualidade de fitoterápicos, o desconhecimento dos chás brasileiros pode estar causando problemas

tão graves quanto os que ocorreram na Bélgica ou, na melhor das hipóteses, estamos desperdiçando

novos medicamentos devido a esse desconhecimento.

Popularmente conhecem-se muitas plantas utilizadas no combate às úlceras gástricas.

No entanto, as cientificamente mais estudadas são espécies do gênero Maytenus, conhecidas como

espinheiras-santas (Carlini, 1988; Sannomiya et al., 1998).

Para melhor situar esse trabalho, que em grande parte avalia plantas utilizadas no

tratamento popular de úlceras gástricas, apresentamos um breve apanhado sobre as úlceras: processo

de formação e combate, plantas antiúlceras e modelos biológicos utilizados nos ensaios in vivo.

Atividade antiúlceras gástricas

Plantas

No Brasil, muitas plantas são usadas na forma de chás no combate a úlceras e outras

anomalias gástricas; no entanto, não existem estudos científicos comprobatórios. Dentre elas estão:

cidrão (Aloysia priphyllla), fedegoso (Cassia allata ), coentro (Coriandrun sativum), cominho

(Cumunum cymimum), funcho (Foeniculum vulgare), erva cidreira (Melissa officinalis), melão de

São Caetano (Momordica charantia), damiana (Turnera diffusa) (Souza Brito, 1989).


Testes para avaliação de atividade antiúlcera

Para se estudar a atividade anti-úlceras é necessário encontrar modelos de indução de

úlceras em animais de laboratório que simulem as principais causas de úlceras gástricas que atingem

os seres humanos. Posteriormente, deve-se analisar o tratamento das lesões gástricas causadas com

os extratos ou substâncias isoladas de plantas por via oral, intraduodenal ou intraperitoneal.

Hiruma-Lima (1998) apresenta uma revisão de modelos indutores de úlceras mais

empregados em animais:

a) Solução ácido clorídrico/etanol: produz úlcera devido à ação necrosante na mucosa gástrica.

b) Ligadura do piloro: induz lesões gástricas por estímulo e acúmulo de ácido no lúmen do estômago.

c) Uso de DAINE: causam lesões hemorrágicas na mucosa gástrica decorrentes da inibição da síntese

de prostaglandinas, diminuindo os mecanismos de citoproteção da mucosa gástrica. Um exemplo de

DAINE usado na indução de úlceras é a indometacina.

d) Agentes parassimpatomiméticos: sensibilizam a mucosa gástrica através do estímulo da secreção

ácida e de pepsina, facilitando a irritação gástrica causada pelas DAINE. Um desses agentes é o

betanecol.

e) Estresse: as alterações no fluxo sanguíneo da mucosa gástrica e o estímulo para a secreção ácida,

têm sido apontados como os principais fatores do aparecimento de lesões gástricas.

Os animais utilizados para os testes de indução de úlceras são camundongos Swiss

(25-35 g), ratos Wistar (150-250 g) todos aclimatados e preparados previamente para os testes.

Os testes biológicos orientaram a análise fitoquímica das plantas, indicando os

extratos mais ativos a serem fracionados. Dependendo da polaridade do extrato, chás ou óleos

essenciais, foram selecionados as técnicas cromatográficas mais adequadas para as separações.

O tratamento de úlceras (Silva, 1998)

A úlcera é o resultado da ruptura do equilíbrio entre forças defensivas/reparadoras e

daquelas agressivas da mucosa gastroduodenal, bem como desgaste da mucosa (Lewis et al., 1991).

No processo ulceroso é mais fácil controlar os sintomas e a cicatrização da úlcera

péptica simples (em torno de três semanas) do que impedir a recidiva ou a formação de nova úlcera.

O tratamento se dá em duas fases; a mais imediata é a eliminação da dor e a cicatrização das feridas.

A segunda fase do tratamento é a manutenção da integridadedas mucosas gástricas evitando


recidivas. Essa segunda fase pode até ser mais difícil que o tratamento sintomático, uma vez que a

úlcera é uma doença sócio-psicossomática, estando relacionada à personalidade do doente; assim, um

medicamento pode aliviar os problemas, mas a cura pode depender de uma mudança radical dos

hábitos do doente. Em alguns casos de tratamento recomenda-se até o uso de psicofármacos para um

tratamento mais eficaz.

O tratamento clínico da úlcera baseia-se em auxiliar as forças reparadoras da mucosa

gástrica ou duodenal e atenuar as forças agressivas mediante neutralização ou bloqueio da secreção

clorídro-péptica, proteção da mucosa gástrica (efeito emoliente) e moderação da atividade motora

gastroduodenal, além de tranqüilizar o paciente.

De modo geral, são utilizados cinco alvos farmacológicos para o tratamento das

úlceras gástricas. (1) neutralização do ácido gástrico; (2) bloqueadores da secreção gástrica; (3)

citoprotetores e reparadores da mucosa, (4) moduladores do esvaziamento gastroduodenal e; (5)

psicofármacos.

Os alcalinizantes ou neutralizantes mais usados são Mg(OH)2, CaCO3 e Al(OH)3, mas

esse tratamento não é o mais adequado, porque pH alto estimula a produção de gastrina que estimula

as células parietais a produzirem mais HCl; este fenômeno é chamado de rebote ácido.

A célula parietal, produtora de HCl, pode receber estímulos da histamina, da gastrina e

da acetilcolina; assim, os bloqueadores da secreção gástrica objetivam anular a ação dessas

substâncias.É possível bloquear a secreção gástrica utilizando-se anticolinérgicos, bloqueadores dos

receptores H2 da célula parietal e inibidores da bomba protônica. Os anticolinérgicos influenciam a

motilidade estomacal retardando o esvaziamento gástrico e bloqueiam a secreção estimulada pela

histamina; a atropina é uma substância anticolinérgica muito utilizada. Os bloqueadores dos

receptores de H2 da célula parietal bloqueiam os receptores histaminérgicos tipo 2, provocando a

diminuição da produção de HCl mediada pela histamina. Um exemplo desse tipo de droga é a

cimetidina, utilizada em nossos testes como controle positivo.

Os inibidores da bomba protônica inibem a ação da H+/K+ ATPase, responsável pelo

fluxo de H+ e influxo de K+.


Materiais e métodos

Reagentes

Solventes PA:

Hexano, acetato de etila, tolueno, butanol, ácido acético, etanol, diclorometano, clorofórmio,

metanol. Marca Synthlab.

Solventes grau HPLC: Metanol, acetonitrila, clorofórmio Merck e Mallinkrodt. Água purificada em

sistema Milli Q.

Solventes deuterados: Clorofórmio, DMSO-D6, água deuterada, metanol-D4, marcas Merck, Aldrich,

Sigma, Acros.

Reveladores para TLC: Anilsaldeído/H2SO4, sulfato cérico/H2SO4, NP/PEG, cloreto férrico 5% em

metanol, idoplatinato e Dragendorff.

TLC: Silicagel em suporte de alumínio e/ou vidro Merck e Aldrich.

Equipamentos

RMN:

Espectrômetro Bruker DRX-600 - 600MHz.

Espectrômetro Varian Inova 500 e Inova 300, de 500 e 300 MHz, respectivamente.

Espectrômetro Bruker AC 200 - 200MHz.

Experimentos 1D e 2D: COSY 1H-1H, TOCSY-1D, HSQC e HMBC

HPLC-ES-MS:


HPLC: Shimadzu LC-10AD, Shimadzu DAD-Detector SPD-M10AVP, Software Shimadzu Class

LC10

Espectrômetro Fisons VG Platform de quadrupolo simples. Ionização Electrospray, 70 ou 100 V,

modo positivo ou negativo.

HPLC Semipreparativo: Waters modelo 590, com injetor Rheodyne volume do loop: 100 µL e

detector de índice de refração Waters modelo 401, atenuação 8x. Coluna: Water µBondapak C18 PN

84176 Fluxo: 2,0 mL/min Solventes: MeOH:H2O (65:35) multiplas injeções de 80 µL Registrador:

The Recorder Company

HPLC-DAD-prep

Sistema Binário Varian Pro Star Bombas: modelo 210. PDA Detector Varian Pro Star modelo 330.

Coluna Phenomenex 25 cm x 10 mm 5 µm RP18. Fluxo: 2,0 mL/min Solventes: MeOH:H2O, modo

gradiente.

HPLC-DAD analítico:Sistema Binário Varian Pro Star Bombas: modelo 210. PDA Detector Varian

Pro Star modelo 330. Coluna Microsorb 25 cm x 4,6 mm 100 Å RP18.

HPLC-RMN

HPLC-NMR- Bruker AMX 600 equipado com uma probe inversa para acoplamento com LC com

volume de 120 µL. BPSU (Bruker Peak Sampling Unit) necessário para experimentos stopped-flow.

Software Chromstar Software (Bruker, Rheinstetten, Germany). Coluna Bischoff ProntoSil C30-

Material com 25-40 µm

MS-MS

Espectrômetro Bruker Esquire-LC Ion Trap LC/MS(n)-System G1980AA (Bruker Daltonik, Bremen)

- ES e APCI Interface HPLC-MS-Coupling : HP 1100

DCCC

Cromatógrafo Tokyo Rikakikai CO., equipado com 300 colunas de vidro 2,0 d.i. x 400 mm. Fluxo

10 mL/45 min.

HSCCC


High Speed Countercurrent Chromatography P.C. Inc. equipado com coluna de teflon de 130 m X de

1,6 mm d.i. volume 285 mL. Sample Injector P.C. Inc. com loop de 16 mL Bomba FMI Q2

Sistema para GPC

Bomba peristáltica Pharmacia mod P1 18-1110-91; coluna de 1m x 3 cm preenchida com Sephadex

LH-20; coletor de frações Pharmacia mod. RediFrac com capacidade para 95 frações; fluxo de 0,5

mL/min.

Extrações

Decocção

Decocção foi utilizada para preparação de extratos aquosos de cascas. Toda decocção foi preparada a

10% (m/v). O material vegetal moído foi colocado em água em ebulição por 15 minutos sendo

deixado em repouso até que o extrato atingisse a temperatura ambiente. A solução foi filtrada em

papel e concentrada em evaporador à pressão reduzida ou liofilizada.

Infusão

Infusão foi utilizada para preparação de extratos aquosos de folhas. As infusões foram preparadas a

10% (m/v). Às folhas moídas foi adicionada água fervente. O recipiente foi fechado e deixado em

repouso até a temperatura ambiente. Em seguida, o extrato foi filtrado em filtro de papel e

concentrado em liofilizador e/ou destilador à pressão reduzida.

Maceração

Maceração foi utilizada para preparação de extratos de solventes orgânicos de cascas e de folhas. O

material vegetal depois de moído foi colocado em recipiente com tampa. Ao material foi adicionado

solvente até que estivesse completamente imerso. A maceração foi mantida por uma semana com

agitações freqüentes. O extrato foi filtrado em filtro de papel e evaporado por destilação à pressão

reduzida.


Procedimentos cromatográficos.

CC

As colunas de sílica foram montadas para a separação de 500 mg a 1,0 g de extratos em colunas de 2

cm d.i.. A quantidade de sílica empregada sempre perfazendo 30 vezes a quantidade de amostra. A

aplicações foram realizadas pela impregnação do extrato em uma pequena quantidade de sílica

posteriormente aplicada no topo da coluna. As eluições foram realizadas no modo gradiente

escolhendo-se entre dois sistemas de solventes avaliados para cada caso por TLC: tol/AcOEt ou

Hex/AcOEt. As frações foram coletadas pela observação das manchas eluídas e/ou por frações de 10

mL.

Coluna de Amberlite XAD-2

Os extratos aquosos depois de filtrados foram eluídos por coluna de Amberlite XAD-2 de 2,0 cm d.i.

x 40 cm, na fase de adsorção foi realizada em um fluxo baixo. A dessorção foi feita em duas fases: a

primeira com metanol/água (1:1) seguida pela passagem de metanol 100% pela coluna. Os extratos

dessorvidos foram secados e fracionados para a análise de suas composições químicas.

GPC

Em média foram utilizados 2 g de extrato para a realização de cromatografia de filtração em gel. O

extrato foi dissolvido em 8 mL de metanol, centrifugado e aplicado em coluna preenchida com

Sephadex LH20 (1 m x 2,5 cm) eluída com metanol (0,5 mL/min), coletando-se automaticamente

frações de 6 mL cada.

DCCC

Na cromatografia em contra-corrente por gotejamento a amostra é preparada a partir da dissolução de

2 g de extrato em 10 mL de fase móvel e 10 mL de fase estacionária. As colunas do sistema

inicialmente são preenchidas com a fase estacionária. Em seguida, o reservatório de injeção é

preenchido com a solução-amostra e então é iniciada a eluição com a fase móvel. A cromatografia

pode ser desenvolvida no modo ascende ou descendente dependendo da densidade dos solventes

escolhidos para o preparo das fases. A coleta é feita em coletor automático programado para coletas

de 6 min.


HSCCC

A amostra é preparada dissolvendo-se 2,0 g de extrato em 16 mL de fase móvel. Inicialmente o

sistema é preenchido com a fase móvel. Em seguida, com uma seringa de 20 mL o reservatório de

amostra é preenchido com a solução da amostra. Inicia-se o bombeamento da fase móvel a 2 mL/min

com a rotação em 850 rpm até que o sistema esteja em equilíbrio. Alcançado o equilíbrio a amostra é

injetada. As frações são coletadas em coletor automático programado para coletas de 3 min.

HPLC semi-preparativo

As eluições foram realizadas no modo isocrático. As amostras foram preparadas dissolvendo-se as

frações em metanol numa concentração de 100 mg/mL. Essa solução foi centrifugada duas vezes

antes de ser injetada. A detecção foi por índice de refração ou UV, dependendo da natureza química

das frações previamente analizadas por TLC.

Material Vegetal

Plantas antiúlceras: As espécies foram coletadas pela prof.ª Clelia A. Hiruma Lima em Palmas (TO).

A identificação foi realizada pela prof.ª Solange de Fátima Lólis. Exsicatas foram depositadas no

Herbário da Fundação Universidade do Tocantins com os seguintes números de voucher: Alchornea

castaneifolia Willd A. Juss (Euphorbiaceae) - TO4321; Curatella americana L. (Dilleniaceae) -

TO1637; Hancornea speciosa Gom. (Apocynaceae) – TO4064.

Quassia amara L. (Simaroubaceae) foi coletada pela equipe de botânicos do Instituto Enda-Caribe

em Santo Domingo, República dominicana; voucher BP 165 F 97323.

Espécies de Ilex (Aquifoliaceae): As especies foram coletadas em Bertioga - SP, e identificadas pela

prof.ª Lucia Rossi, do Instituto de Botânica de São Paulo.

I. theezans Mart. ex Reissek, praia do Itaguaré, uma exsicata foi depositada no herbário do IB/USP

com voucher SPF 430.

Ilex amara (Vell.) Loes. Praia de Guaratuba, Fazenda Três Irmãos, estrada da captação, uma exsicata

foi depositada no herbário do IB/USP com voucher SPF434.

Sorocea bomplandii – as folhas foram coletadas em Jaguariava, PR, e identificadas pelo prof.

Armando C. Cervi, da Universidade Federal do Paraná. Voucher UPCB 20263.


Preparação do material vegetal: depois de coletas, as plantas foram secadas em estufa a 60 °C. Em

seguida, foram moídas em moinho de facas. As plantas moídas foram pesadas, embaladas,

etiquetadas e armazenadas em local seco.


Capítulo 1: Quassia amara

(Simaroubaceae) Quassia amara, da família Simaroubaceae, é uma pequena árvore de 2-6 m, natural da

região norte do Brasil e toda região amazônica (Fig.1.1). Na floresta amazônica Q. amara é muito

usada como “quina” (Cinchona spp.), contra malária e febre. Ela cresce em regiões onde a “quina”

não cresce e contém algumas das substâncias ativas da quina. Q. amara também é usada como

inseticida, como tônico e contra febres e hepatite (Rutter, 1990). Os indígenas amazônicos se banham

com suas folhas para curar sarampo (Brabch et al., 1983) e usam como desinfetante bucal após a

extração de dentes. A medicina popular utiliza cascas de Q. amara como tônico e aperitivo. É

recomendada contra diarréia, disenteria, dispepsia, blenorragia, gases intestinais, dores de estômago,

anemia, desordens no fígado e do trato gastrintestinal (Duke et al., 1994).

A composição química de Q. amara é bastante conhecida, incluindo algumas

substâncias amargas conhecidas como quassinóides (Ohmoto et al., 1989; Diadanamwa et al., 1993;

Grieco et al., 1994), alcalóides β-carbolínicos (Ajaiyeoaba et al., 1994), alcalóides indólicos,

triterpenos e esteróides, cantin-6-onas (Njar et al.,1993; Ouyang et al., 1994). Os quassinóides e

alcalóides cantinônicos são os principais constituintes bioativos (Njar et al., 1995).

Fig.1.1.: Quassia amara L. (Simaroubaceae)


Nosso trabalho foi realizado em conjunto com alunos de pós-graduação em Biologia

Molecular e Funcional do Departamento de Fisiologia do IB/Unicamp, fazendo-se o isolamento e

identificação das substâncias e uma série de testes biológicos - DL50, toxicidade aguda in vivo e in

vitro, atividade antiulcerogênica, atividades narcóticas, mecanismos de ação das atividades

biológicas - a partir dos extratos, frações e substâncias isoladas.

Apesar de nosso projeto estar voltado principalmente para extratos polares de plantas

medicinais e, dentre esses extratos, principalmente os aquosos, infusão ou decocção, os resultados da

atividade analgésica apresentados pelos extratos apolares foram mais expressivos do que aqueles

polares, o que nos estimulou a estudar fitoquímicamente os primeiros. Investigamos a composição

química dos extratos hexânico e diclorometânico das cascas de Q. amara e realizamos a análise dos

extratos brutos por HPLC-ES-MS.

1.1. Experimental / Resultados / Discussões

1.1.1. Ensaios biológicos

Preparação dos extratos utilizados nos ensaios biológicos

Quinhentos gramas de pó de cascas de Q. amara foram inicialmente macerados com 3

L de hexano por uma semana. A solução hexânica foi filtrada em gaze e em papel e evaporada em

rota-evaporador (30oC). Procedimento idêntico foi usadopara fornecer, respectivamente, extratos

diclorometânico, etanólico e hidroalcoólico. Os extratos foram enviados para o grupo de pesquisa da

prof. Dra. Alba R. M. Souza Brito (IB/Unicamp) para avaliações biológicas, visando um

direcionamento para o estudo dos extratos. Foram realizados testes de analgesia utilizando-se

analgésicos-padrão como controle positivo e extratos administrados na dose de 100 e 250 mg/kg em

um volume final de 10 mL/kg, pelas vias oral e intraperitonial. Os testes realizados foram o de placa

quente, antagonismo aos receptores opióides e edema de pata induzido por carragenina. Nos teste

foram usados camundongos Swiss machos (25-35 g) previamente preparados para os testes.

Para entendermos melhor esses testes, vamos fazer uma breve explanação sobre eles.


Testes de analgesia

Teste de Placa Quente e antagonismo aos receptores opióides

Este teste é utilizado para determinar a latência pelo método de Eddy e Leiback

(1953). Nesse teste é cronometrado o tempo decorrente entre o primeiro contato do animal com a

placa quente até o momento em que o mesmo lambe as patas dianteira ou dá saltos repentinos,

indicando o estímulo de dor. O teste para análise da participação do sistema opióide é realizado com

a mesma metodologia do teste de latência; no entanto, os animais são tratados 15 min antes da

aplicação das drogas (extratos e controles) com naloxana (5 mg/kg, intraperitonial)

Edema de pata induzido por carragenina

O experimento é realizado conforme descrito por Henriques et al. (1987). Os animais

são pré-tratados com os extratos nas doses 100 e 250 mg/kg por via oral. Depois de 30 min provoca-

se um edema em uma das patas posteriores do animal com a injeção de 250 µg de carragenina (1%

em suspensão salina 0,9% estéril), para se ter um controle do aumento do peso da pata provocado

pelo edema, a pata contralateral recebe volume similar de solução salina 0,9% estéril. Três horas

após a administração de carrigenina os animais são sacrificados, as patas amputadas e pesadas. O

edema da pata é determinado pela diferença de peso entre a pata que recebeu salina e aquela que

recebeu carragenina.

Resultados dos ensaios

Nas tabelas (Tabela 1.1, 1.2 e 1.3) a seguir estão os resultados observados nos testes

de placa quente para latências e antagonismo aos receptores opióides. Os resultados da atividade

analgésica dos extratos, quando administrados por via oral nas doses de 100 e 250 mg/kg, no teste de

placa quente não foram significativos. Isto também ocorreu quando estes extratos foram

administrados a camundongos submetidos ao edema de pata por carragenina, visando avaliar uma

possível atividade antiinflamatória da planta.


Tabela 1.1: Evolução temporal da latência (s), no teste de placa quente, em camundongos pré-

tratados com morfina subcutânea (10 m/kg), etanol 70%, etanol (EtOH), diclometano (DCM),

hexano (HEX) das cascas de Q. amara L. por via oral na dose de 100 mg/kg.

Observação Latência (s)

(min) Controle Morfina EtOH 70% EtOH DCM HEX

0 4,5±0,5 3,9±0.2 4,0±0,3 4,0±0,5 3,3±0,3 4,7±0,5

30 5,2±0,5 13,9±2,7** 4,1±0,6 3,4±0,4 4.2±0,6 7,4±1,2

60 3,5±0,3 12,7±2,6** 5,1±0,6 4,4±0,4 6,6±0,8 2,8±1,1

90 4,8±0,6 10,0±1,4** 5,5±0,6 4,0±0,3 5,2±2,4 6,4±0,3

120 5,5±0,6 8,6±1,3* 6,3±0,6 5,0±0,3 6,8±2,5 7,2±0,4

240 6,3±1,1 7,0±0,6 7,5±0,8 6,3±0,5 9,7±1,0 7,5±1,5

Diferenças estatísticas estabelecidas em comparação com o tempo 0 de observação para cada grupo

de 5-6 animais. ANOVA F(5,29) 30 min = 10,861; 60 min = 8,146; 90 min = 7,409; 120 min = 2,708

p<0,05; Teste de Dunnet, *p<0,05; **p<0,001.

Tabela1.2: Evolução temporal da latência (s), no teste de placa quente, em camundongos pré

tratados com morfina subcutânea (10 m/kg) e etanol 70%, etanol (EtOH), diclometano (DCM),

hexano (HEX) das cascas de Q. amara L. por via oral na dose de 250 mg/kg.



0 3,3±0,2 3,3±0.2 3,0±0,2 3,0±0,1 3,4±0,1 3,2±0,1

30 4,5±0,4 11,9±1,3 5,2±0,3 5,0±0,5 5,0±0,5 5,2±0,7

60 5,7±0,3 10,8±1,0 5,1±0,6 6,1±0,5 5,0±0,9 5,3±1,0

90 5,6±0,6 13,1±1,7 5,4±0,5 5,0±043 6,3±1,1 6,2±1,2

120 5,8±0,4 9,4±1,0 6,4±0,6 6,6±0,5 5,9±1,0 7,3±1,4

240 5,8±0,4 5,4±0,4 4,9±0,4 5,1±0,2 5,3±0,5 5,5±0,4


de 7-8 animais. ANOVA F(5,40) 30 min = 13,975; 60 min = 7,961; 90 min = 8,986; 120 min = 1,958




tratados com morfina subcutânea (10 m/kg) e etanol 70%, etanol (EtOH), diclometano (DCM),

hexano (HEX) das cascas de Q. amara L. por via intraperitonial na dose de 100mg/kg.



0 2,5±0,1 2,7±0.1 3,1±0,3 3,0±0,2 3,1±0,1 3,2±0,2

30 3,2±0,2 8,5±1,8** 4,4±0,3 3,9±0,3 5,0±0,8 4,1±0,3

60 3,8±0,2 12,6±0,9** 6,0±0,5 5,0±0,4 6,3±1,1 6,4±0,8

90 4,5±0,3 10,8±1,1* 6,1±0,4 5,7±0,5 7,4±0,7* 8,4±0,8**

120 5,7±0,4 10,4±1,5** 6,1±0,4 6,2±0,5 6,7±0,9 7,3±0,6

240 3,7±0,2 4,6±0,5 4,5±0,5 4,4±0,4 5,6±1,0 5,1±0,5


de 8 animais. ANOVA F(5,42) 30 min = 5,429; 60 min = 18,115; 90 min = 10,154; 120 min = 4,055


Tabela1.4:Evolução temporal da latência (s), no teste de placa quente, em camundongos pré tratados

com morfina subcutânea (10 m/kg) e etanol 70%, etanol (EtOH), diclometano (DCM), hexano

(HEX) das cascas de Q. amara L. por via intraperitonial na dose de 250mg/kg.



0 3,3±0,1 3,4±0.2 3,2±0,3 3,2±0,2 3,2±0,1 3,1±0,1

30 3,8±0,2 4,8±0,4* 3,6±0,2 3,7±0,3 3,6±0,1 3,7±0,1

60 4,0±0,3 7,4±0,9** 4,7±0,4 4,6±0,4 5,5±0,3 4,7±0,3

90 4,6±0,3 9,4±1,0** 5,9±0,4 4,5±0,3 7,0±0,5 7,7±1,2*

120 4,7±0,5 11,0±1,0** 4,7±0,3 4,5±0,3 6,8±0,3 7,3±1,0*

240 5,0±0,3 5,5±0,8 5,3±0,4 5,0±0,5 1,5±0,5 8,8±2,0*


de 8 animais. ANOVA F(5,42) 30 min = 3,314; 60 min = 6,120; 90 min = 7,785; 120 min = 13,079




tratados com com naloxana (5 m/kg)após tratamento com morfina subcutânea (10 m/kg) e ao

extratos hexânico (HEX) e diclometânico (DCM), das cascas de Q. amara L. por via

intraperitonial nas doses de 100 mg/kg e 250 mg/kg.


(min) Controle Morfina HEX 100 DCM 100 HEX 250 DCM 250

0 3,0±0,2 3,2±0.1 3,6±0,3 3,1±0,1 3,3±0,1 3,6±0,3

30 4,4±0,3 4,8±0,3 4,3±0,2 4,5±0,5 4,5±0,4 3,7±0,2

60 4,6±0,2 6,4±0,8 4,7±0,3 5,2±0,6 5,1±0,3 4,9±0,4

90 4,5±0,3 10,8±1,5 6,1±0,4 5,7±0,5 7,4±0,7 8,4±0,8

120 4,4±0,4 5,7±1,0 5,2±0,5 4,6±0,5 3,8±0,3 5,0±0,4

240 5,7±0,8 5,1±1,0 5,8±0,6 4,4±0,4 5,9±0,3 5,2±0,4


de 8 animais. ANOVA F(5,42) 0 min = 1,714; 30 min = 1,370; 60 min = 1,712; 90 min = 0,763; 120

min = 1,544; 240 = 0,264 p<0,05; Teste de Dunnet, *p<0,05; **p<0,001.

Quando os extratos foram administrados por via intraperitoneal, no teste de placa

quente, foram observados resultados significativos quando comparados ao grupo controle. O extrato

hexânico apresentou atividade em ambas as doses testadas - 100 e 250 mg/kg - sendo esta atividade

dose-dependente. Pelos tempos de observação notou-se que o efeito, na dose 250 mg/kg, permanece

por mais tempo. O extrato diclorometânico apresentou atividade apenas na dose 100mg/kg, tendo

efeito pelo mesmo período do extrato hexânico.

Os animais tratados com naloxana 15 min antes da administração dos extratos tiveram

os efeitos observados acima inibidos; assim, é possível de que as substâncias presentes nos extratos

apresentem afinidade por receptores opióides.

Os extratos etanólico e etanólico 70%, mesmo sendo administrados por via

intraperitoneal, não apresentaram atividade analgésica.


1.1.2. Análise fitoquímica de Quassia amara

Os extratos foram preparados por maceração em hexano, diclorometano etanol e

etanol 70%, a partir de 3 kg de cascas secas e moídas. O extrato selecionado para fracionamento

devido sua atividade biológica foi o hexânico, que na preparação rendeu 3 g (0,1%).

Fracionamento do extrato hexânico.

Quinhentos miligramas do extrato hexânico foram fracionados por CC eluídas com

misturas de hexano/acetato de etila. Foram coletadas 60 frações que foram analisadas por TLC

(Silica; hexano/acetato de etila 8:2). As frações semelhantes e que se apresentaram mais puras foram

analisadas por RMN H e por ES-MS.

Qa1

O espectro de RMN 1H mostrou picos na região entre δ 0,68 e δ 2,29, com o pico mais

intenso em δ 1,25. Esse perfil é compatível com a presença de derivados de ácidos graxos de cadeia

longa misturados a terpenos. O quarteto próximo a δ 4,10 é característico de H presente em carbono

oxigenado, como por exemplo o hidrogênio da posição 3 dos triterpenos e esteróides. Os sinais na

região de δ 5,0 - 5,36 são referentes a hidrogênios de ligações duplas, o que também é comum em

derivados de ácidos graxos, triterpenos e esteróides. Um conjunto de sinais é visível na região entre δ

7,46 e δ 7,82, caracterizando a presença de substâncias aromáticas. Tendo em vista a presença de

alcalóides cantinônicos e indólicos em Q. amara (Njar et al, 1993; Barbetti et al, 1990; Barbetti et

al, 1993), é possível que essas substâncias sejam as responsáveis por esse conjunto de sinais.

Foram registrados os espectros de ES-MS nos modos positivo e negativo. O sinal em

m/z 413 no espectro registrado no modo positivo é compatível com a presença do estigmasterol e/ou

da sitostenona (Fig. 1.2), como será explicitado abaixo. Não observamos sinais com m/z 250 ou 259,

referentes aos alcalóides cantinônicos já isolados de Q. amara (Njar et al, 1993). Contudo, isso pode

ser devido ao fato de não se ter empregado ionização com a potência necessária para haver ionização.

Por outro lado, observa-se um sinal intenso de m/z 353 no espectro do modo negativo, que pode ser


referente a uma série de alcalóides indólicos, dentre os quais a yohimbina e derivados hidroxilados

da coronaridina, de relativamente ampla ocorrência.

Qa2

O espectro de RMN 1H mostrou sinais entre δ 0,66 e δ 2,27, característicos de

triterpenos ou esteróides. Os sinais próximos a δ 3,7 são referentes ao H-3 desses metabólitos. Os

sinais na região entre δ 5,0 e δ 5,31 são referentes aos hidrogênios de ligações duplas, comuns em

triterpenos e esteróides. Esses sinais são semelhantes àqueles do sitosterol e do estigmasterol (Fig.

1.2), sendo que o sinal em δ 5,31 refere-se ao H-6, enquanto que o multipleto em redor de δ 5,0

refere-se aos H-22 e H-23 do estigmasterol.

O espectro ES-MS registrado no modo positivo, mostrou um pico com m/z 413, que

pode ser referente ao íon [M+H]+ Perda de uma metila a partir da molécula não-protonada leva ao

fragmento [M-CH3]+ com m/z 397.

Esses conjuntos de sinais dos espectros mencionados acima são compatíveis tanto

com o estigmasterol, quanto com a sitostenona, a qual já foi isolada de Q. amara (Lavie & Kaye,

1963).

Qa3

O espectro de RMN 1H mostrou um sinal intenso em δ 1,18, característico de grupos

CH2 de derivados de ácidos graxos acompanhado por picos de menor intensidade entre δ 0,72 e δ

2,27. Sinais menos intensos na região de δ3,5 - 4,2 são coerentes com o H-3 de triterpenos e

esteróides, cuja posição 3 é hidroxilada. Os sinais em redor de δ 5,0 - 5,3 são referentes a

hidrogênios olefínicos, semelhantes aos discutidos anteriormente. Assim, é possível que essa fração

seja composta por mistura de derivados de ácidos graxos e de terpenos/esteróides.

O espectro ES-MS no modo positivo também apresentou pico em m/z 411, referente

ao pico [M-H]- de esteróide semelhante ao estigmasterol ou à sitostenona. Analogamente, o pico em

m/z 397 é referente à perda de uma das metilas, gerando o fragmento [M-CH3]-. O pico em m/z 413

pode ser referente ao pico [M-H]- de um esteróide semelhante ao sitosterol (Fig. 1.2). Fragmentação

do tipo retro-Diels-Alder e subsequente perda de uma metila do sitosterol levaria ao íon [M-C7H12O-

CH3]- de m/z 287.


Qa4

O espectro de RMN 1H mostrou perfil semelhante àqueles de derivados de ácidos

graxos: um sinal intenso em δ 1,23, sinais distribuídos entre δ 0,66 e δ 2,32 e um sinal aparentando

um tripleto em δ 5,34. Não há vestígios de substâncias aromáticas. Pode-se perceber a presença de

outras substâncias - provavelmente de natureza terpênica - ao longo de toda a região entre δ 0,66 e δ

5,5. Particularmente na região entre δ 0,66 e δ 1,09 há evidência de sinais referentes a metilas.

Embora não haja a integração, as intensidades desses sinais são coerentes com aquelas referentes aos

H-3 e aos hidrogênios situados em ligações duplas, muito menos intensos.

Os espectros ES-MS nos modos positivo e negativo sugeriram um fragmento comum

de m/z 468: o espectro no modo positivo mostra [M+H]+ com m/z 469; no espectro no modo

negativo, esse pico tem m/z 467. A perda de uma metila a partir da molécula não-protonada levou ao

íon [M-CH3] com m/z 453, tanto no modo positivo, quanto no negativo. Esses resultados

correlacionam-se com aqueles esperados para moléculas derivadas do acetato de α-amirina, de β-

amirina (Fig. 1.2) ou moléculas afins. Contudo, foi possível a visualização de fragmentos com m/z

maiores do que 468 nos dois espectros. Particularmente informativo foi o espectro no modo negativo,

que sugeriu a presença de outras hidroxilas ligadas ao núcleo fundamental, levando a perdas de

moléculas de água: perda de duas moléculas de água a partir do íon de m/z 521 leva ao fragmento de

m/z 485, enquanto a perda de uma terceira molécula de água leva ao íon de m/z 467.

Análise do extrato hexânico por HPLC-ES-MS

Cinqüenta miligramas do extrato foram dissolvidos em acetonitrila. A solução foi

filtrada em filtro Millex de 0,45 µm e 20 µL foram injetados diretamente no sistema, operando a

+70V. A eluição foi feita com mistura de Acetonitrila/água 30:70, com fluxo de 1 mL/min, em

coluna C18 de 25 cm x 4,6 mm x 5µm.

A Fig. 1.3 mostra o TIC, o BPI e os cromatogramas extraídos de alguns íons

significativos.


Quassia Hex lcms ESI + 70 V

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00Time0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

LULU08 Sm (Mn, 2x3) Scan ES+ 413435

9.45

4.654.052.271.430.48 3.35

5.915.45 7.216.477.98 13.3412.0810.54 14.18

LULU08 Sm (Mn, 2x3) Scan ES+ 389-391

6159.73

6.050.80 5.352.791.57 3.81 4.75 7.846.58 8.58 10.54 13.9012.1911.59 12.78

LULU08 Sm (Mn, 2x3) Scan ES+ 391-389

2.87e39.31

5.94 11.17

LULU08 Sm (Mn, 2x3) Scan ES+ TIC

3.25e52.410.06 9.666.054.72 12.82

Fig. 1.3: HPLC-ES-MS do extrato hexânico de Q. amara com TIC, BPI, e cromatogramas

extraídos dos íons de m/z 391-389,


100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000Da/e0

100

%

LULU08 276 (9.697) Cm (274:288-137:183) Scan ES+ 3.42e3223

19117714582

237389297 329 411 443 473

827572537

Quassina


100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000Da/e0

100

%

LULU08 264 (9.276) Cm (252:266-347:419) Scan ES+ 1.64e3391

207

56165

12158

373329221 313

269392

441445 561475 984798657616 689 786693 946839925894 1000

Neoquassina

Fig. 1.4: Espectros de massas da quassina e da neoquassina.


O cromatograma extraído do íon de m/z 391-389 detectou a neoquassina (PM = 391),

enquanto que o cromatograma extraído do íon de m/z 389-391 detectou a quassina (PM = 389). Essas

duas substâncias são encontradas em Q. amara (Nestler et al, 1980), mas não foram identificadas nas

frações anteriormente mencionadas, referentes ao estudo químico do extrato hexânico. Os

cromatogramas mostram que ambas estão presentes no extrato hexânico, que apresentou atividade.

Os espectros da neoquassina e o da quassina estão apresentados na Fig. 1.4.

Ao mesmo tempo, o cromatograma extraído do íon de m/z 413, referente a esteróides

do tipo estigmasterol, mostrou um pico com tempo de retenção semelhante àquele da quassina e

neoquassina. Dessa forma, é possível que os espectros de RMN 1H - e mesmo os de ES-MS feitos

com as frações - estejam encobrindo a presença desses dois quassinóides.


CH3

CH3

OH

CH3 CH3

CH3

CH3

H

H

H

H

sitosterol

CH3

CH3

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

H

H

H

estigmasterol

acetato de β-amirina

CH3

CH3CH3

CH3CH3

AcO

CH3

CH3CH3

H

H

H

quassina

O

OO

O

O

OCH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H H

H

H

O

OO

OH

O

OCH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H H

H

H

neoquassina

CH3

CH3CH3

CH3CH3

AcO

CH3

CH3

CH3

H

H

H

acetato de α-amirina

Fig. 1.2.: Substâncias identificadas em Quassia amara.

sitostenona

CH3

CH3

O

CH3 CH3

CH3

CH3

H

HH

H


Capítulo 2: Alchornea castaneifolia

(Euphorbiaceae) A. castaneifolia Willd. A. Juss. (Euphorbiaceae) é conhecida popularmente como

sarã, sarão, gurupiá. Encontra-se distribuída do AM a BA e MT, leste do Brasil, GO. Apresenta-se na

forma de arbusto ou arvoreta 1-6 m de altura (Fig. 2.1) sendo relatado indivíduos de 10 m na

Argentina. É unissexuada, florescendo em março e agosto e frutificando em julho e novembro.

Ocorre abundantemente em beira de rios, solos arenosos e argilosos. É importante colonizadora de

areia e fixadora de barranco de rio; é importante na formação de mata ciliar na margem que recebe

deposição, sendo assim indicada para recuperação de margem de rio (Pott & Pott, 1994).

Na medicina popular, A. castaneifolia é utilizada na forma de infusão de meia xícara

de folhas ou decocto de 1 colher de sopa de cascas 1-3 ao dia, ou ainda, 2-3 mL duas vezes ao dia da

tintura 4:1. A planta é empregada no tratamento de reumatismo, artrite, resfriados e dores musculares

pelos indígenas da Amazônia (Duke et al., 1994), no aumento a fertilidade feminina (De Feo,1992) e

como analgésico para as dores de articulações em forma de cataplasma (Schultes et al., 1990). Um

levantamento etnofarmacológicas realizado no Tocantins indicou que uso de A. castaneifolia para

afecções gástricas (Hiruma-Lima, 2000, comunicação pessoal). Por esse motivo foram realizados

ensaios antiúlceras com esta planta para se averiguar sua atividade.

Fig. 2.1: Alchornea casteneifolia Willd. A. Juss.

(Euphorbiaceae).

Foto: Prof.ª Clélia A. Hiruma-Lima


Apesar da infinidade dos usos fitoterápicos de A. castaneifolia encontrados em

levantamento bibliográfico, não se encontrou estudos químicos dessa planta. Trabalhos realizados

com Alchornea cordifolia revelaram a presença de alcorneina, alcorneinona, ácido antranilico, ácido

gentísico, isoalcorneina, yoimbina e outros alcalóides (Ogungbamila, et al., 1990). Tona et al.

(1998), em uma triagem de plantas medicinais do Congo, detectaram flavonóides, taninos, esteróides

e terpenos, saponinas e alcalóides em Alchornea cordifolia. Setzer et al. (2000) reportam a presença

dos triterpenóides taraxerona, friedelina, epifriedelinol, taraxerol, seco-3,4-friedelina e seco-3,4-

taraxerona no extrato clorofórmico de Alchornea latifolia. Os dois últimos triterpenoides, que

apresentam o anel A aberto, mostraram atividade citotóxica in vitro contra células humanas

cancerosas e potente inibição da topoisomerase II.


2.1.1Ensaios biológicos

Preparação dos extratos para os ensaios biológicos:

Duzentos gramas de casca e de folhas de A. castaneifolia foram moídos em moinho de

facas e macerados com 2 L de etanol. A solução alcoólica foi filtrada em gaze e papel e

posteriormente secada à pressão reduzida em rota-evaporador à temperatura de 45oC rendendo 2 g

(1,0%) de extrato de cascas e 3 g (1,5%) de extrato de folhas.

Avaliação do extrato etanólico de A. castaneifolia

Os extratos etanólicos das cascas e folhas de A. castaneifolia foram testados em ratos

machos Wistar de massa corporal entre 150 e 200 g para avaliar suas atividades antiúlceras gástrica

(Tabela 2.1 e 2.2). Os extratos testados nas doses de 1000 mg/kg, por via oral, apresentaram

significativa inibição das lesões gástricas nos modelos de HCl/etanol e indometacina/betanecol.

Além disso, pôde-se constatar que a inibição na formação de úlceras é um pouco maior para o extrato

de folhas do que para o extrato de cascas. A partir disso, foi feito um ensaio com 3 níveis de doses do

extrato etanólico das folhas (Tabela 2.3). Nesse modelo, observou-se que a dose de 500 mg/kg pela

via oral apresentou significativa proteção.


Tabela 2.1: Efeitos do lanzoprazol e do extrato etanólico de cascas e folhas de A. castaneifolia em

úlceras induzidas por HCl/etanol em camundongos. Os resultados são expressos como média ±

desvio padrão.

Tratamentos

(p.o.)

Dose

(mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlcera

(mm)

Inibição

%

Controle - 11 3,77 ± 0,32 67,5 ± 3,25 -

Lanzoprazol 30 11 5,91 ± 0,38* 21,5 ± 4,02* 68,1

Folhas

Cascas

1000

1000

6

6

3,75 ± 0,44

2,17 ± 0,49*

8,17 ± 5,44*

9,50 ± 5,27*

87,9

85,9

ANOVA F(3,30) = 43,1 (P< 0,001) para o índice de úlceras e = 17,5 (P< 0,001) para pH. Teste de

Dunnett: * P<0,001.

Tabela. 2.2: Efeitos da cimetidina e do extrato etanólico de cascas e folhas de A. castaneifolia em

úlceras induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Os resultados são expressos como

média ± desvio padrão.

Tratamentos

(p.o.)

Dose

(mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlcera

(mm)

Inibição

%

Controle - 11 2,45 ± 0,23 38,3 ± 2,13 -

Cimetidina 100 11 3,55 ± 0,05* 14,5 ± 2,02** 62,1

Folhas

Cascas

1000

1000

6

5

2,33 ± 0,32

3,20 ± 0,35

14,5 ± 2,89**

15,4 ± 3,17**

62,1

59,8


Dunnett: * P<0,05, ** P<0,001.


Tabela. 2.3: Efeitos do lanzoprazol e do extrato etanólico de folhas de A. castaneifolia sobre o

modelo de indução de úlceras gástricas por HCl/etanol em camundongos. Os resultados são

expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos

(p.o.)

Dose

(mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlceras

(mm)

Inibição

%

Controle - 11 3,77 ± 0,37 67,5 ± 4,02 -

Lanzoprazol 30 11 5,91 ± 0,38* 21,5 ± 4,01* 68,1

Extrato 1000

500

250

6

6

6

3,75 ± 0,11

4,33 ± 0,39

5,67 ± 0,03*

8,17 ± 2,80*

24,7 ± 5,44*

60,0 ± 5,44

87,9

63,4

11,1

ANOVA F:(4,35) = 30,8 (P< 0,05) para os índice de úlceras e = 6,04 (P< 0,05) para pH. Teste de

Dunnett: * P<0,01.

Pelos resultados apresentados nas tabelas 2.1, 2.2 e 2.3, notamos que os extratos de A.

castaneifolia inibem a formação de úlceras. É necessário ressaltar que a dose necessária para se

atingir tais resultados foram altas (1000 mg/kg) quando comparadas com o controle positivo de

lanzoprazol (30 mg/kg), para as úlceras induzidas por HCl/etanol, e contra 100 mg/kg de cimetidina

para aquelas induzidas por indometacina/betanecol.

Esses resultados são bastante promissores e indicaram a necessidade de se estudar

fitoquimicamente o extrato etanólico de A. castaneifolia, tendo em vista a possibilidade de o

princípio ativo puro (ou um conjunto de determinados princípios ativos) apresentar uma atividade

bem mais acentuada.


2.1.2. Estudo fitoquímico:

No esquema (Fig. 2.2) abaixo está apresentado de forma resumida os processos de

extração e fracionamento dos constituintes químicos de A. castaneifolia.

A.castaneifolia Folhas - 400 g

5,0 g (1,25%)

2,0 g

25 frações *

Ac2 (15 mg), Ac3 (8 mg) e Ac4 (5 mg)

3 L EtOH

Alíquota

Sephadex LH20 MeOH

HPLC semi - preparativo

* juntadas depois de análise por TLC

Fig. 2. 2 : Esquema resumido do procedimento experimental da análise fitoquímica de A. castaneifolia .

A.castaneifolia Cascas - 400 g

7,0 g (1,75%)

2,0 g

40 frações *

Ac1 (20 mg)

3 L EtOH

Alíquota

Sepha dex LH20 MeOH

HSCCC


Ac1

O espectro de RMN 1H apresenta sinais na região de H aromáticos entre δ 6,5 e δ 8,0.

Análise acurada dessa região do espectro permite a identificação de dois anéis aromáticos. Um deles

possui um sistema A2X2 em δ 6,7 (J = 8Hz) e δ 7,7 (J = 8 Hz), caracterizando um anel substituído. O

outro exibe um sistema ABX em δ �7,48 (J = 2 Hz), δ 7,40 (J = 8 e 2 Hz) e δ 6,72 (J = 8 Hz),

mostrando um anel trissubstituído. O espectro COSY H-H com supressão de sinais confirma essas

proposições e mostra um sinal adicional em δ 3,77.

O espectro ES-MS (70V,NI) mostra o íon pseudo-molecular [M-H]- com m/z 215,

compatível com a fórmula molecular C13H12O3. O pico com m/z 93 corresponde ao anel A. O pico de

m/z 108 pode ser devido ao anel B, referente ao p-metilfenol formado pela fragmentação no sistema

benzílico do Anel B.

A partir desses resultados, sugerimos para Ac1 a estrutura apresentada na Fig 2.3.

Ac2

A revelação das placas cromatográficas com NP/PEG forneceu indícios de que a

substância Ac2 poderia ser um flavonóide.

O espectro de massas de Ac2 apresenta pico pseudo-molecular [M+H]+ = 464. Perda

de 162 u leva ao pico base [M-hex]+ = 303 = [A + H]+. Essa perda é referente a uma hexose, podendo

ser glicose ou galactose.

O espectro RMN 1H (Fig 2.4) apresenta sinais na região de absorção dos sinais de

hidrogênios aromáticos. Em δ 7,65 observa-se um duplo dubleto (J = 8,5 e 2,0 Hz), em δ 7,52 um

dubleto de J = 2 Hz, em δ 6,80 um dubleto de J = 8,5 Hz. Esses sinais podem ser atribuídos

respectivamente aos hidrogênios H-6’, H-2’e H-5’, característicos em um sistema ABX de

substituição em anéis aromáticos. Ainda na região de hidrogênios aromáticos, observamos dois

dubletos de J = 2 Hz em δ 6,39 e outro em 6,19, atribuídos a H-8 e H-6 do flavonóide. Em δ 5,35 é

observado o dubleto (J = 8,0 Hz), atribuído ao hidrogênio anomérico da molécula.

Os deslocamentos químicos dos carbonos observados no espectro HMBC permitiram

determinar que a unidade de açúcar está ligada no posição 3 do flavonóide. Os deslocamentos

químicos obtidos a partir dos espectros de RMN 1H e de HMQC indicaram que a hexose é a

galactose (Harborne, 1993, Agrawal, 1989).


O conjunto dos dados do espectro de massas e de RMN permitiram identificar o

flavonóide Ac2 como a quercetina -3-O-β-D-galactopiranosideo (Fig 2.3).

Ac3

Ac3 também apresenta mancha amarela quando revelada com NP/PEG, característico

de flavonóides.

No espectro ES/MS observa-se o pico pseudo-molecular m/z 435 [M+H]+ a perda do

açúcar é de 132 u, o que equivale a perda de uma unidade de arabinose, gerando o pico da quercetina

m/z 303 [A + H]+ .

O espectro de RMN 1H de Ac3 (Fig 2.5) apresenta sinais semelhantes aos de Ac2 na

região dos aromáticos, confirmando que a aglicona é a quercetina. Observa-se o hidrogênio

anomérico em δ 5,25 (d, J = 5 Hz). A constante de acoplamento indica que o açúcar apresenta

configuração α. Assim, identificamos Ac3 como a quercetina-3-O-α-L-arabinopiranosídeo (Fig 2.3)

(Harborne, 1993).

Fig. 2.4: Espectro RMN 1H de Ac2 (ppm, 500 MHz, DMSO-d6, TMS)


Ac4

Ac4 também apresentou revelação para flavonóide quando pulverizado com NP/PEG.

Na região de absorção de hidrogênios aromáticos no espectro de RMN 1H de Ac4 (Fig

2.6) observam-se apenas 3 sinais: dois dubletos de J = 2 Hz em δ 6,30 e 6,19, respectivamente

atribuídos a H-8 e H-6 do anel A do flavonóide. O sinal em δ 7,18 (s, 2H), possivelmente pertencente

Fig. 2.5: Espectro RMN 1H de Ac3 (ppm, 200 MHz, DMSO-d6, TMS)


a um anel aromático com padrão de substituição A2, indicou que o anel B é simétrico e substituído

nas posições 3’, 4’ e 5’. Assim, esse sinal foi atribuído a H-2’/H-6’ do anel B de uma unidade de

miricetina. Comparando-se os espectros de RMN 1H de Ac2 e Ac3, observa-se que os sinais dos

hidrogênios dos açúcares são iguais. No ES/MS observamos o pico do íon pseudo-molecular m/z 451

[M+H]+, a perda do açúcar produz o pico m/z 319 [M-ara+H]+= [A+H]+da aglicona. Assim, podemos

identificar Ac4 como miricetina-3-α-L-arabinopiranosídeo (Fig 2.3) (Harborne, 1993).

Fig. 2.6: Espectro RMN 1H – supressão do sinal da água de Ac4 (ppm, 200 MHz, DMSO-d6, TMS)


Ac1

93 107

109

O H O H

O H

Ac3

O

O H

O H

O O H

O H

O ara

Ac4

O

OH

OH

OH

Oara

OOH

HO

Fig. 2.3.: Substâncias identificadas em Alchornea castaneifolia.

Ac2

O

OH

OH

OOH

OH

Ogal

1

45

8 9

10

1’

3’


Capítulo 3: Curatella americana L.

(Dilleniaceae) Curatella americana L. é uma espécie da família Dilleniaceae. Apresenta-se como

árvore ou arbusto tortuoso de 1 a 12 m em cerradão (Fig. 3.1). É conhecida popularmente como

lixeira, cajueiro-bravo, cajueiro-do-mato, cambarba, caimbé, marajoara, pentieira, sabeiba e sobro

(Lorenzi, 1992),

C. americana ocorre freqüentemente em cerrados com solos arenosos. Cresce na

Amazônia e é de ampla dispersão neotropical em savanas, cerrados, matas secas, semidecíduas e

tabuleiros (Pott & Pott, 1994). Apesar da plântula frágil e crescimento inicial lento, é invasora de

pastagem (Lorenzi, 1992).

C. americana floresce nos meses de agosto e setembro, e frutifica em outubro e

novembro. Sua casca grossa a protege contra fogo. As folhas são ásperas por apresentarem cristais de

ácido silícico.

São conhecidas várias utilidades de C. americana. É usada como planta forrageira de

emergência para vacas, pois não é tóxica, com composição de 8% de proteínas, 0,35% Ca, 0,16% P,

0,23% Mg, 11 ppm Cu e 17 ppm Zn. O arilo branco de seu fruto é comestível com sabor suave e

Fig. 3.1: Curatella americana L. (Dilleniaceae)

Fonte: http://sites.uol.com.br/eadmelo/cerrd/lista.htm

(01/06/2002)


adocicado (vermelho por dentro). É um alimento muito procurado pelas aves, que são suas

dispersoras. C. americana também tem importância na apicultura e apresenta valor ornamental. Sua

madeira é usada para pilão; é pesada, compacta com fibras revessas, muito durável ao tempo; serve

para marcenaria, carpintaria, tornearia, canga, sela, escultura, lenha e carvão. A folha é usada como

lixa para utensílios de chifre, panela, madeira, unhas etc.

No levantamento bibliográfico realizado nos sistemas eletrônicos Web of Science,

Current Contents e Probe não foi encontrado nenhum trabalho químico sobre C. americana. Uma

triagem das plantas do Mato Grosso do Sul indicou a presença de triterpenóides e esteróides nas

folhas e de corantes e taninos (usados no curtimento) nas cascas do tronco (Honda et al., 1990).

A medicina popular usa o decocto de cascas de C. americana para lavar feridas e

úlceras, inclusive de gado. É tida como medicinal contra artrite, diabetes e pressão alta. As flores são

usadas contra tosse, bronquites e resfriados. No fruto, a parte vermelha apresenta um corante e suas

cerdas são irritantes, causando alergia. (Lorenzi, 1992). Informações etnofarmacológicas indicam

que o macerado de C. americana em água por uma noite é intensamente usado para afecções

gástricas na região de Tocantins (Hiruma-Lima, 2000, comunicação pessoal). Por esse motivo foram

realizados ensaios antiúlceras com esta planta para se averiguar sua atividade.



Os extratos de C. americana foram testados em relação às suas atividades antiúlceras

gástricas nos modelos de HCl/etanol, indometacina/betanecol de acordo com os procedimentos

descritos na literatura (Souza Brito & Nunes, 1997).

Preparação dos extratos para os ensaios biológicos

Duzentos e cinqüenta gramas de cascas secas de C. americana foram maceradas com

2L etanol rendendo 2,5 g de extrato seco.


Avaliação do extrato etanólico de C. americana

Os resultados dos ensaios realizados estão apresentados nas Tabelas 3.1, 3.2 e 3.3

com C. americana.

Tabela 3.1: Efeitos do lanzoprazol e de diferentes doses de extrato etanólico de casca de C.

americana em úlceras induzidas por HCl/etanol em camundongos. Os resultados são expressos como


Tratamentos

(p.o.)

Dose

(mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlcera

(mm)

Inibição

%

Controle - 10 3,65 ± 1,20 77,3 ± 9,64 -

Lanzoprazol 30 10 6,0 ± 1,05** 21,8 ± 10,65 72

Extrato 1000

500

250

100

7

7

5

5

3,08 ± 1,48

4,60± 1,34

3,86 ± 1,35

4,20 ± 1,10

9,86 ± 3,63**

23,0 ± 11,0 **

54,8 ± 21,3*

78,3 ± 8,37

87

70

29

-1,3

ANOVA sF(5,38) = 5,85 (P< 0,05) para pH e = 53,7 (P< 0,05) para o índice de úlceras. Teste de

Dunnett:* P< 0,05, ** P<0,001.


Tabela 3.2: Efeitos da cimetidina e de diferentes doses de extrato etanólico de cascas de C.

americana sobre o modelo de indução de úlceras gástricas por indometacina/betanecol em

camundongos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos

(p.o.)

Dose

(mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlceras

(mm)

Inibição

%

Controle - 11 2,45 ± 0,69 38,3 ± 8,40 -

Cimetidina 100 11 3,54 ± 0,82* 14,5 ± 3,30** 62

Exrato 1000

500

250

100

5

6

5

5

3,40 ± 0,89*

3,17 ± 0,98

2,80 ± 0,84

2,67 ± 0,71

18,2 ± 8,07**

22,2 ± 7,14**

34,0 ± 8,06

36,9 ± 6,89

52

42

11

4

ANOVA F(5,37) = 2,82 (P< 0,05) para pH e = 19,9 (P< 0,05) para os índices de úlceras. Teste de

Dunnett: * P< 0,05, ** P<0,001.

Tabela 3.3: Efeitos do lanzoprazol e do extrato etanólico de cascas de C. americana em úlceras

gástricas induzidas por etanol em ratos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos

(p.o.)

Dose

(mg kg-1)

n Índice de úlcera

(mm)

Inibição

%

Controle - 5 113,4 ± 9,64 -

Lanzoprazol 30 5 68,6 ± 10,7* 39,5

Extrato 1000 5 6,0 ± 4,94* 94,7

ANOVA F(2,12) = 119 (P< 0,001) para o índice de úlceras. Teste de Dunnett:* P< 0,05.


Os resultados obtidos possibilitaram concluir que o extrato etanólico da casca

apresentou atividade gastroprotetora em ratos e camundongos frente aos modelos de úlceras gástricas

induzidos por agentes irritantes, HCl, etanol e indometacina e secretagogos como o betanecol. Pôde-

se concluir também que as úlceras gástricas foram significativamente reduzidas somente a partir das

doses de 500 mg/kg, pela via oral.

Através desses dois modelos experimentais, pôde-se concluir também que o extrato

etanólico de C. americana foi tão efetivo em promover proteção gástrica quanto as drogas-padrão

lanzoprazol e cimetidina. Porém, apesar da atividade gastroprotetora, não foram observadas

alterações significativas na acidez gástrica dos animais tratados com o extrato, com exceção no

modelo de indometacina/betanecol em que foi observado elevação dos valores de pH na dose

máxima (1000 mg/kg, por via oral).

Analisando a dose de 1000 mg/kg, nota-se que no modelo de indução de úlceras por

HCl/etanol o resultado de inibição da ulcerogênese em camundongos é bem maior do que o controle

positivo. Apesar de a dose do controle ser 33 vezes menor do que a dose de C. americana, deve-se

levar em consideração que foi avaliado um extrato bruto, o qual é composto por grande quantidade

de substâncias que podem estar competindo por determinados sítios ativos biológicos constituindo

um complexo sistema de agonistas e antagonistas, o que não ocorre com uma substância pura. Ainda,

considerando a dose de 1000 mg/kg, verificamos que a atividade permanece alta mesmo mudando o

agente indutor de úlcera - HCl/etanol, indometacina/betanecol ou etanol. Além disso, quando se

realizam os testes com ratos, animais de massa corporal maior (150-200 g), a dose de 1000 mg/kg de

extrato continua ativa e, como podemos ver na Tabela 3.3, bem mais ativa que o lanzoprazol

(controle positivo) é mais ativa do que nos testes realizado em camundongos (25-35 g).

Considerando-se os bons resultados fornecido pelos ensaios biológicos, preparamos

inicialmente os extratos da maneira fitoquímica tradicional a fim de encontrar a substância ou

conjunto de substâncias responsáveis pelas atividades. O chá de C. americana também foi preparado

tendo em vista que ele é usado pela população.



No esquema a seguir (Fig. 3.2) está resumidamente apresentado os procedimentos de

extração e fracionamento dos constituintes químicos de C. americana.

Extrato clorofórmico

O extrato clorofórmico foi fracionado por CC. Foram fracionados 2 g do extrato

utilizando-se o sistema de solventes tolueno:acetato de etila no modo gradiente, iniciando-se com

100% de tolueno e finalizando-se com 100% de acetato de etila.

O fracionamento rendeu 50 frações. As frações foram analisadas por TLC de sílica-gel

utilizando como eluente o sistema de solventes tolueno:acetato de etila (8:2). As frações 5 e 11

(denominadas Ca1 e Ca2 respectivamente), que se apresentaram boas condições para análise por

RMN e MS.

Fig. 3.2: Esquema experimental da análise fitoquímica dos extratos de C. americana.

2,0 g

Ca3, Ca4 e Ca5

Decocto 10%

Alíquota

LH20 MeOH

8,0 g

C. americana Cascas - 300 g

2,0 g

Catequina e derivados

3 L EtOH

Alíquota

DCCC HCCl3/MeOH/H2O 43:37:20 (descendente)

10,0 g



3,0 g

1,5 g

Ca1 e Ca2

Alíquota

3 L HCCl3

CC Sílica

tol:AcOEt (grad)


Ca1

O espectro de RMN 1H mostra sinais intensos entre δ 0,7 e δ 2,2, típicos de

triterpenóides (Vilegas, 1989). Observou-se também um tripleto em δ 4,49 (H-3) e um multipleto em

δ 5,23 (H-12), correspondentes a hidrogênios carbinólicos e olefínicos respectivamente.

O espectro de RMN de 13C apresentou mais de 30 sinais. Contudo, a região dos

carbonos insaturados mostra sinais em δ 125,6 e δ 137,9, característicos de derivados com o

esqueleto ursano (Olea & Roque, 1990). Os sinais em δ 122,4 e δ 143,5 são típicos de triterpenos

com esqueleto oleanano. O sinal em δ 183,9 é referente a um grupamento carboxílico, enquanto que

os sinais em δ 171,0 e δ 21,1 são referentes à carbonila e ao grupo CH3 do acetato. Por esse motivo,

comparamos os deslocamentos químicos de Ca1 com os acetatos do ácido ursólico e oleanólico.

Assim podemos identificar na mistura, ácido ursólico, ácido oleanólico (Fig. 3.3) e os acetatos desses

ácidos (Mahato & Kundu, 1994).

Ca2

O espectro de RMN 1H mostra grande quantidade de sinais entre δ 0,5 e δ 2,5, com

perfil bem característico de triterpenóide (Vilegas, 1989). O sinal δ 8,2, corresponde ao hidrogênio

de aldeído.

O espectro de RMN 13C apresenta uma quantidade de sinais compatíveis com a

estrutura de um triterpeno. Na região dos carbonos insaturados visualizamos sinais em ð 110,1 (C-

29) e δ 140,6 (C-20). Pelo DEPT, sabe-se que esses sinais são respectivamente um CH2 e um

carbono quaternário. Esses dados caracterizam derivados com o esqueleto lupano (Olea & Roque,

1990). O sinal do CHO pode ser visto em δ 206,7 e C-3, um carbono oxigenado, em δ 78,0. A

comparação com dados da literatura, indicam que Ca2 é o betulinaldeído (Fig. 3.3) (Mahato &

Kundu, 1994).


Extrato etanólico

O extrato etanólico foi fracionado por DCCC utilizando o sistema de solventes

clorofórmio/metanol/água (43:37:20, descendente). O resultado desse fracionamento foi a detecção

de derivados catequínicos.

Extrato aquoso (decocto)

O fracionamento do decocto foi realizado por GPC em coluna de Sephadex LH20.

Ca3

O espectro de RMN 1H apresentou um perfil característico de triterpenóides, com

vários sinais intensos absorvendo entre δ 0,5 e δ 2,5 (Vilegas, 1989). Os hidrogênios olefinicos

absorvem entre δ 4,5 e 4,6. Em δ 8.2 observa-se o sinal de hdrogênio de aldeídico, em δ 9,8 o sinal

de um H de ácido carboxílico e em δ 1,99 o sinal de CH3 de acetato. A fração está contaminada com

substâncias aromáticas, que mostram sinais de baixa intensidade entre δ 6 - 8, provavelmente

catequinas.

O espectro de RMN 13C mostrou dezenas de sinais. No entanto, comparação com os

resultados anteriormente descritos para Ca1 e Ca2 permitiram identificar o betulinaldeído e o acetato

do ácido betulínico. O espectro de massas no modo negativo comprova a presença dessas duas

substâncias, exibindo o pico de m/z 429, correspondente ao íon [M-H]- do betulinaldeído, e o pico de

m/z 445, correspondente ao íon [M-H]- do ácido betulínico.

O espectro ES-MS permite constatar a presença de um pico de baixa intensidade, de

m/z 481, atribuído ao íon [M-H]- do acetato do betulinaldeído (Fig. 3.3).


Ca4

O espectro de RMN 1H mostrou que a substância é a catequina. Observam-se os sinais

de H-2’, H-5’ e H-6’ na região entre δ 6,60 e 6,70. A baixa resolução espectral não permite visualizar

todas as constantes de acoplamento. O sinal de H-2 absorve em δ 4,45 (d, J = 7,6 Hz). O sinal do H-3

absorve vizinho àquele da água, em δ 3,8. Os sinais de H-4ax e H-4eq absorvem como multipletos em

δ 2,63 e δ 2,30. O espectro COSY H-H comprova o acoplamento entre H-4ax e H-4eq, entre H-4ax e

H-3 e entre H-3 e H-2. A catequina pode ser diferenciada da epicatequina, tendo em vista que esta

última apresenta sinal de H-2’em δ 6,90 (Harborne, 1993).

Os deslocamentos químicos de RMN 13C de Ca4 e a comparação com dados da

literatura (Agrawal, 1989) permitiram confirmar a identidade da catequina (Fig. 3.3).

Ca5

A análise do extrato por TLC com padrões de taninos mostrou a presença de ácido

clorogênico (Fig. 3.3) no extrato etanólico de C. americana. A presença do ácido clorogênico foi

confirmada por análises em HPLC, comparando-se os tempos de retenção da amostra e padrão e

também com coinjeção de padrão e amostra, verificando um aumento na intensidade do pico da

amostra.

Testes químicos para taninos (Harborne, 1973, Santos et. al., 1999) indicaram a

presença predominante dessa classe de substância no extrato de C. americana.


Ca1.

R = H − ác. oleanólico

R = Ac – acetato do ác. oleanólico

CH3

CH3CH3

CH3CH3

RO

COOH

CH3CH3

H

H

H

Ca1.

R = H − ác. ursólico

R = Ac – acetato do ác. ursólico

CH3

CH3CH3

CH3CH3

RO

COOH

CH3

CH3

H

H

H

Ca2. R1 = COH R2 = H − betulinaldeído

Ca3. R1 = COOH R2 = Ac − acetato do ác. betulínico

CH2

CH3

CH3CH3

CH3 CH3

R2O

R1

CH3

HH

H

H

Ca4

O

OH

OH

OH

OH

OH

Ca5

O

O

O

OH OH

OH

OH OH OH

Fig. 3.3.: Substâncias identificadas em Curatella americana.


3.1.4. Ensaios químicos para detecção de taninos no extrato etanólico de C.

americana

As frações resultantes da reversão do fluxo no fracionamento por DCCC

apresentaram-se extremamente polares quando analisadas por TLC em BAW (6:1:2) e

clorofórmio/metanol/água (43:37:20, FI). Tendo-se em vista a coloração extremamente vermelho-

sangue, o isolamento das catequinas e também de derivados de ácido gálico nesse extrato, é bastante

provável que esse extrato seja uma fonte de taninos. Reforça essa hipótese o fato de que muitas

vezes a atividade anti-úlceras gástricas tem sido relacionada à presença desses metabólitos (Lewis &

Hanson, 1991), o que faz com que a análise desse material seja de grande importância para a

completa caracterização dos possíveis princípios ativos.

As análises por RMN 1H e RMN 13C desse material não forneceram bons resultados.

Os sinais mostram-se sempre alargados, tanto na região aromática quanto na região alifática.

Análises por ES-MS nos modos positivo e negativo também não forneceram bons resultados,

mostrando uma infinidade de sinais de difícil interpretação. A acetilação de uma fração da amostra

com anidrido acético e piridina levaram a espectros igualmente de baixa resolução e difícil

interpretação. Por esses motivos, realizamos ensaios químicos e cromatográficos a fim de detectar a

presença de taninos.

Realizamos os ensaios descritos por Harborne (1973) e por Santos et al. (1999) a fim

de determinar os tipos de taninos presentes em C. americana.

Duzentos e cinqüenta miligramas de extrato etanólico de C. americana foi colocada

em erlenmeyer de 250 mL em ácido clorídrico 2 M para promover a hidrólise da amostra. Após 60

min, verificamos uma solução vermelho-vinho e um precipitado. A coloração vermelha da solução já

é um indício que os taninos majoritários na planta são os condensados. Com o aquecimento em

presença de ácido, os taninos condensados produzem antocianidinas de coloração vermelha intensa.

Posteriormente, testamos o hidrolisado com solução de FeCl3 10%. Para comparação

utilizamos padrões de ácido gálico e de catequina-padrão. O resultado da reação com FeCl3 10% com

ácido gálico foi uma solução de azul muito intenso. A catequina apresentou coloração amarelada-

ocre. O resultado observado para o hidrolisado de C. americana foi amarelado, muito parecido com o

resultado obtido para a catequina. Assim, podemos concluir que a composição majoritária dos

taninos da planta são os taninos condensados, formados por unidades flavan-3-ol e flavan-3,4-diol.

No entanto, a TLC em BAW do hidrolisado comparado com os padrões de ácido gálico e de

catequina indicou que no hidrolisado também estão presentes os derivados de ácido gálico e,


conseqüentemente, podemos concluir que no extrato de C. americana também existem os taninos

hidrolisáveis.


Capítulo 4: Hancornea speciosa

Gomez (Apocynaceae) Popularmente conhecida por mangaba, mangabeira e mangava, Hancornea speciosa

Gomez (Apocynaceae) (Fig. 4.1) é encontrada no nordeste, no litoral brasileiro, desde o Amapá até

São Paulo, Centro-Oeste e na Amazônia, mas não na floresta. É uma árvore hermafrodita medindo de

3 a 10 m de altura. Apresenta o tronco áspero com ramos lisos e avermelhados e abundante látex

branco. Folhas opostas, simples, pecioladas; limbo com cerca de 5 a 6 x 2 cm, elíptico ou oblongo;

ápice abruptamente acuminado ou obtuso; base obtusa ou arredondada; nervura mediana impressa na

face ventral e elevada na face dorsal.

Devido ao seu valor nutricional, tem sido cultivada na caatinga. As sementes têm de

ser lavadas antes de plantar, devido à presença de inibidores de germinação. A frutificação ocorre em

6 anos, ou em 2 com enxertia. Encontra-se H. speciosa no nordeste, no litoral de Amapá a São Paulo,

Centro-Oeste e Amazônia (não na floresta) e outros paises da América do Sul (Lorenzi, 1992)

O fruto de H. speciosa é muito utilizado devido ao seu teor nutritivo, apresentando

mais vitamina C do que o limão. Esse fruto verde é indigesto e purgante, podendo ser tóxico. Pode-se

produzir sorvetes, suco, licor , vinho, xarope, álcool e vinagre de mangaba (Pott & Pott, 1994).

Fig. 4.1: Hancornea speciosa L. (Apocynacea)

Fonte: http://sites.uol.com.br/eadmelo/cerrd/lista.htm

(01/06/2002).


Na medicina popular, H. speciosa é usada de várias formas: como decocto da raiz,

junto com o quiabinho (Manihot tripartita), para tratar a hipertensão (Almeida et al. 1998); como

infusão das folhas para cólica menstrual e contra gripe; a casca é indicada para doenças internas e o

látex para o pulmão e abscessos internos. Outros usos medicinais são descritos contra câimbras,

fígado, diabetes e para emagrecer (Pott & Pott, 1994). Levantamento etnobotânico no Tocantins

indicou que a população local utiliza as cascas dessa planta fervidas em água para o tratamento de

males do estômago (Hiruma-Lima, 2000, comunicação pessoal).

Triagem fitoquímica indicou a presença de flavonóides e taninos na casca e, nas

folhas, esteróides, triterpenos e taninos (Honda et al., 1990).



Preparação dos extratos para os ensaios biológicos:

Duzentos gramas das cascas de H. speciosa foram moídas em moinho de facas e

maceradas com 2 L de etanol rendendo 2.5 g de extrato.

Avaliação do extrato etanólico de H. speciosa contra úlcera gástrica

O extrato etanólico das cascas de H. speciosa foi testado frente aos modelos de

indução gástrica por indometacina/betanecol e HCl/etanol em camundongos e foi observado que o

extrato apresentou atividade gastroprotetora na dose de 1000 mg/kg, por via oral nos dois modelos

(Tabela 4.1 e 4.2). Também não foram observadas alterações quanto à acidez gástrica frente a

administração dos dois extratos. Através da administração de 3 níveis de doses diferentes podemos

concluir que a dose de 500 mg/kg, foi aquela que apresentou resultados mais significativos com

menor massa de ambos extratos.


Tabela 4.1: Efeitos da cimetidina e do extrato etanólico de cascas de H. speciosa sobre o modelo de

indução de úlceras gástricas por indometacina/betanecol em camundongos. Os resultados são

expressos como média ± desvio padrão.

Tratamentos

(p.o.)

Dose

(mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlceras

(mm)

Inibição

%

Controle - 11 2,45 ± 0,21 38,3 ± 2,53 -

Cimetidina 100 11 3,55 ± 0,25* 14,45 ± 0,99* 62,1

Extrato 1000 5 3,20 ± 0,49 17,8 ± 2,80* 53,5

ANOVA F(2,24) = 42,2 (P< 0,05) para os índices de úlceras e = 4,95 (P< 0,05) para pH. Teste de

Dunnett: * P<0,001.

Tabela 4.2: Efeitos do lanzoprazol e de diferentes doses de extrato etanólico de cascas de H.

speciosa em úlceras induzidas por HCl/etanol em camundongos. Os resultados são expressos como


Tratamentos

(p.o.)

Dose

(mg kg-1)

n pH

(unidade)

Índice de úlcera

(mm)

Inibição

%

Controle - 11 3,77 ± 0,37 42,7 ± 3,25 -

Lanzoprazol 30 11 6,36 ± 0,20* 10,9 ± 2,31* 74,5

Extrato 1000

500

250

5

6

5

4,20 ± 0,58

4,67 ± 0,49

4,40 ± 0,68

13,6 ± 5,14*

20,3 ± 4,42*

43,6 ± 3,19

68,1

52,4

-2,11


Dunnett: * P<0,001

Embora a atividade gastroprotetora de H speciosa seja semelhante à do lanzoprazol

apenas na concentração de 1000 mg/kg, deve-se lembrar que foram ensaiados apenas extratos brutos.

É possível, portanto, que o extrato possua princípios ativos que sejam tão ativos quanto (ou até

mesmo mais ativos) do que o próprio lanzoprazol. Inicialmente preparamos o decocto H. speciosa,

porque é o modo usado popularmente; no entanto, frente aos resultados positivos, também

preparamos o extrato etanólico para o estudo fitoquímico, com a possibilidade de comparar sua

composição química com a do chá.



Preparação do decocto de H. speciosa

Preparamos o decocto de 400 g de cascas de H. speciosa e obtivemos 6g de extrato

seco.

Fracionamento por HSCCC

O perfil químico dessa planta, analisada por HPLC-DAD, apresentou composição

semelhante à de Curatella americana, com substâncias extremamente polares. Devido a essa grande

polaridade resolvemos empregar a HSCCC no fracionamento do decocto de H. speciosa, evitando

perdas por adsorções permanentes. Utilizamos o sistema clorofórmio/metanol/n-propanol/água

(5:6:1:4), sendo a fase inferior (mais rica em clorofórmio) empregada como fase móvel.

Foram coletadas 125 frações e após análise preliminar por TLC (sílicagel;

clorofórmio/metanol/n-propanol/água - 5:6:1:4 - inferior) as frações iguais foram reunidas.

Os testes químicos apresentaram resultado positivo para taninos e outras substâncias

fenólicas que constituem os taninos, como catequina e ácido clorogênico. Esse conhecimento prévio

da composição majoritária do decocto de H. speciosa, nos direcionou para utilização de padrões

dessas substâncias na análise das frações reunidas. A comparação dos Rf e da coloração na revelação

indicaram que as duas substâncias majoritárias da decocção de H. speciosa são realmente a catequina

e o ácido clorogênico.

Para confirmar a presença das duas substâncias apontadas como majoritárias nesse

extrato, foram feitas analises de algumas frações por HPLC em conjunto com a adição de padrões, a

fim de comparar os tempos de retenção. O aumento na intensidade dos picos correspondentes à

catequina e ao ácido clorogênico corroborou presença dessas duas substâncias no decocto de H.

speciosa.


Capítulo 5: Sorocea bomplandii Baill.

(Moraceae) Sorocea bomplandii Baill. pertence à família Moraceae. São árvores pequenas ou

arbustos, com ramos eretos, troncos com casca lisa, folhas rijas e serrilhadas nas bordas, que crescem

em lugares sombreados (Fig. 5.1). Popularmente são conhecidas como bainha-de-espada, canxim-

mirim, cega-olho, cincho, erva cancrosa, maria-mole, sorocó e sorococó (Carauta 1996).

As folhas de S. bomplandii têm aspecto muito semelhante às da “espinheira-santa”

(Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium), cujo chá das folhas tem comprovada atividade

antiúlcera gástrica (Carlini, 1988). Por isso, as folhas de S. bomplandii podem facilmente ser

confundidas com as da verdadeira “espinheira-santa” e algumas vezes têm-se constatado o uso do

chá de S. bomplandii ao invés do chá de Maytenus spp. Avaliação toxicológica indicou que S.

bomplandii não apresenta toxicidade aguda aos animais testados (Bianchi 1993). Contudo, o

desconhecimento de sua composição química representa um sério risco à sua utilização como planta

medicinal.

Fig. 5.1: Sorocea bomplandii Baill. (Moraceae)

(Lorenzi, 1992)


Estudos fitoquímicos anteriores com o extrato metanólico das raízes de S. bomplandii

e S. ilicifolia conduziram ao isolamento e identificação de polifenóis prenilados com estruturas

complexas, resultantes da formação de adutos de Diels-Alder entre chalconas e compostos prenilados

(Ferrari et al., 1986; Hano et al.1995a; Hano et al. 1995b; Messana et al. 1994; Messana et al. 1991).

Dos extratos hexânico e diclorometânico foram isolados triterpenos pentacíclicos derivados do

oleanano, ursano e lupano (Andrade & Vilegas, 1998).


Preparamos a infusão 10% com 90 g de folhas de Sorocea bomplandii. Esse extrato

aquoso foi fracionado em coluna de Amberlite XAD2. A dessorção foi iniciada com 200 mL de

metanol/água, seguida por 200 mL de metanol. Depois de secado, 10 mg do extrato metanólico

dessorvido foi dissolvido em 1 mL de de metanol e preparado para análise cromatográfica.

As condições cromatográficas para a separação dos flavonóides glicosilados de S.

bomplandii usando fase C30, assim como as condições para usar HPLC-MS e HPLC-RMN foram

semelhantes àquelas utilizadas na separação de extratos de Maytenus (Sannomiya et al., 1998).

A separação foi otimizada sendo que a eluição foi feita com metanol/H2O (40:60) por

20 min, seguida por um gradiente de 40 min até se chegar à proporção de metanol/água 80:20. O

fluxo foi reduzido para 0,7 mL/min a fim de diminuir a pressão sobre a coluna.

A Fig. 5.3 mostra a separação dos flavonóides de S. bomplandii. Todos os

componentes tiveram separação de linha-base e quase não se observa alargamento irregular dos

picos. Devido à alta seletividade da fase C30, até mesmo os componentes minoritários puderam ser

separados. Os triglicosídeos mostram um baixo tempo de retenção devido às suas altas polaridades

quando comparadas com os diglicosídeos. De modo semelhante aos extratos de Maytenus (Vilegas et

al. 1999), os respectivos derivados da quercetina eluem primeiro por serem mais hidroxilados do que

os do kaempferol.

Apesar da grande quantidade de material injetado, não se perceberam efeitos de

saturação da coluna. Devido à alta capacidade dessa coluna, as substâncias eluídas puderam ser

injetadas diretamente nos sistemas de MS e de RMN sem a necessidade de pré-concentração.


Os flavonóides puderam ser identificados a partir de experimentos de HPLC-ES-MS.

A Fig. 5.3 mostra o cromatograma de HPLC-UV (370 nm) e também os espectros de massas no

modo negativo dos picos detectados. Na região entre 40 e 60 min observam-se os diglicosídeos. A

literatura mostra que os açúcares mais comuns encontrados em plantas - especialmente os ligados a

flavonóides - são glicose e rhamnose (Harborne, 1993). Por esse motivo, explanaremos os resultados

a seguir baseados apenas nesses dois açúcares, ficando claro no entanto que os experimentos

realizados não permitem diferenciar unidades de hexoses, pentoses, etc. A seguir será empregada

uma nomenclatura simplificada para denominar as substâncias detectadas.

0 10 20 30 40 50 0

100

200

300

400

500

mAu

min

Fig. 5.3: Cromatograma da fração flavonoídica do extrato de folhas de S. bomplandii (370nm).


A aglicona dos derivados do kaempferol (K) apresentam [K-H]- com m/z 285 e os da

quercetina [Q-H]- com m/z 301. O pico com tR 39,2 min apresenta [M-H]- com m/z 609 e [Q-H]- com

m/z 301, podendo ser caracterizado como um derivado da quercetina ligada a duas unidades de

açúcares, um dos quais glu e outro rha. O pico que elui com tR 44,9 min apresenta massa [M-H]- com

m/z 593, e [K-H]- com m/z 285, sendo portanto um diglicosídeo do kaempferol contendo glu e rha.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 [min]

m/z 593

m/z 755

m/z 609

m/z 739

m/z 771

Fig.5.3: Análise de S. bomplandii por HPLC-ES-MS. Cromatograma UV (370 nm) e

cromatogramas extraidos dos íons m/z 771, m/z 755, m/z 739, m/z 609 e m/z 593.


Analogamente, os triglicosídeos com tR 10,2 min, 20,3 e 22,9 puderam ser identificados

respectivamente como 771 (Q-glu-glu-rha), 755 (K-glu-glu-rha), 739 (K-glu-rha-rha).

É interessante observar que nos cromatogramas extraídos dos íons m/z 609 e m/z 593,

referentes aos triglicosídeos, que eluem entre 10 e 25 min, podem ser vistos sinais intensos na região

entre 35 e 45 min. Estes últimos sinais são derivados das fragmentações dos triglicosídeos formando

diglicosídeos.

O cromatograma extraído do íon de m/z 755 mostra 2 picos, de onde se deduz que 2

diferentes derivados de kaempferol com 2 unidades de glicose e 1 rhamnose estão presentes em S.

bomplandii. Provavelmente os açúcares estão ligados entre si ou à aglicona de formas diferentes.

Pudemos também registrar os espectros MS-MS de alguns dos picos a fim de obter

uma determinação estrutural mais detalhada. Na Fig. 5.4 mostramos um resumo dos 3 picos

principais.


0

20

40

60

80

100

Abund.

100 200 300 400 500 600 700 m/z

755,0MS (Peak bei 20,3 min)

100 200 300 400 500 600 700 m/z0

20

40

60

80

100

Abund.

575,0

755,0

285,0

MS/MS von

0

20

40

60

80

100

Abund.

100 200 300 400 500 600 700 m/z

609,0MS (Peak bei 39,2 min)

0

20

40

60

80

100

Abund.

301,0

100 200 300 400 500 600 700 m/z

MS/MS von Q-Glc-Rha

593,0

100 200 300 400 500 600 700 m/z0

20

40

60

80

100

Abund.

285,0

100 200 300 400 500 600 700 m/z0

20

40

60

80

100

Abund.

MS (Peak bei 44,9 min) MS/MS von K-Glc-Rha

K-Glc-Glc-Rha K-Glc-Glc-Rha

Q-Glc-Rha

K-Glc-Rha

Fig. 5.4: Espectros de massas dos 3 constituintes princípais de S. bomplandii, com tR 20,3 min,

39,2 min e 44,9 min.


Os espectros de MS-MS no modo negativo dos picos com m/z 771 e m/z 593, mostram

a aglicona do kaempferol [K-H]- m/z 285, enquanto que o espectro MS-MS do pico com m/z 609

mostra a aglicona correspondente à quercetina [Q-H]- m/z 301.

O pico de tR 20,3 min indica um derivado diglicosilado do kaempferol em que

simultaneamente perdeu uma molécula de água, gerando o pico o íon MS2 com m/z 575 [M-H]- -

[glu-rha-H2O]-.

Com o emprego do HPLC-MS acoplados foi possível identificar rápida e facilmente

os derivados de kaempferol e de quercetina. Paralelamente à análise cromatográfica, os espectros de

MS e MS2 possibilitaram uma análise detalhada do pico.

Obviamente, o acoplamento HPLC-ES-MS não permite que se estabeleça a estrutura

completa do flavonóide, como por exemplo a identificação dos açúcares ligados a ele. Por esse

motivo, é necessário empregar técnicas de HPLC-RMN.

O acoplamento HPLC-RMN é uma das mais modernas técnicas de separação de

detecção on-line e fornece novas perspectivas ao trabalho fitoquímico, possibilitando a separação e

identificação simultânea. As principais vantagens desse acoplamento são a rapidez da análise

partindo-se do extrato bruto e a baixa quantidade de material vegetal envolvida na análise (Albert,

1995).

Todas análises por HPLC-RMN foram realizadas em espectrômetro Bruker AMX

600. Foi usada uma POBRE inversa com volume de detecção de 120 µL.

A Fig. 5.5 mostra as regiões alifática e aromática do espectro RMN 1H (stopped-flow)

dos componentes principais de S. bomplandii. Os derivados da quercetina e do kaempferol podem ser

facilmente diferenciados através do exame da região aromática dos espectros. O kaempferol mostra 2

dubletos (δ 8,00 e 6,94 J = 8 Hz) de um anel aromático p-substituído e a quercetina apresenta três

grupos de sinais um dubleto de 2 Hz em δ 7,69, um dubleto de 8 Hz em 6,90 e um duplo dubleto de 8

e 2 Hz em δ 7,55 O número de açúcares ligados à cada flavonóide pode ser facilmente determinado

pelo número de prótons anoméricos na região entre δ 5,2 e 4,4. Apesar do sinal da mistura de

solventes metanol/D2O entre δ 3,3 e δ 4,7, todos os sinais dos prótons anoméricos foram detectados.


(ppm) 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0

2' 6' 5'

8 6

Glc

Rha

3' 5'

6 8

Glc Rha 2' 6'

2' 6' 3' 5'

6 8

Glc

Rha Glc

a) Quercetina-diglicosilada (tR 44,9 min)

b) Käempferol-diglicosilado (t+R 39,2 min)

c) Käempferol-triglicosilado(tR 20,3 min)

a)

b)

c)

Fig. 5.5: Espectro de RMN 1H (600 MHz, δ, TMF) dos componentes principais de

S. bomplandii.


O pico com tR = 44,9 min (Fig. 5.5a) mostra dois prótons anoméricos: em δ 5,01 (d,

7,5 Hz) e em δ 4,47 (d, 1,5 Hz). A constante de aclopamento de J = 7,5 Hz mostra a configuração β

da unidade de glicose, enquanto que a constante de acoplamento J = 1,5 Hz identifica a outra unidade

de açúcar sendo α-rhamnose. Estes sinais também são encontrados no derivado de quercetina, que

elui da coluna C30 com tR 39,2 min (Fig. 5.5b). No pico que elui com tR 20,3 min (Fig. 5.5c)

encontram-se 3 unidades de açúcar: δ 5,17(d, 7,5 Hz), δ 4,78 (d, 7,5 Hz) e δ 4,47 (d, 1,5 Hz). Esses

dados são compatíveis com aqueles de HPLC-MS indicando a presença de diglicosídeos e

triglicosídeos no chá de S. bomplandii.

Através da combinação HPLC-MS e HPLC-RMN foi possível uma rápida

determinação estrutural dos componentes do extrato de S. bomplandii. Nesta planta foram

encontrados componentes diferentes daqueles determinados em Maytenus aquifolium. Dessa forma, é

possível que os extratos de S. bomplandii não possuam os mesmos efeitos terapêuticos das

espinheiras-santa.

Ao contrário de Maytenus aquifolium, na qual se encontram grandes quantidades de

tetraglicosídeos (Sannomyia, 1998), em S. bomplandii não foi detectado nenhum tetraglicosídeo.

Esse resultado permite que se tenha parâmetros químicos para um controle de qualidade mais eficaz

das espinheiras-santas.


Capítulo 6: Ilex (Aquifoleaceae)

6.1. Ilex amara (Vell.) Loes.

Ilex amara (Vell.) Loes. é uma das muitas espécies do gênero Ilex utilizada como

adulterante de Ilex paraguariensis. Inclusive, popularmente, também é conhecida como mate ou

erva-mate, nomes populares de I. paraguariensis. Outro nome popular de I. amara é caúna.

I. amara apresenta-se como arbustos ramosos ou árvores, podendo atingir até 20 m.

Os ramos jovens não apresentam pelos ou são pouco pubérulos. As suas folhas são glabras e

coriáceas com as faces abaxiais com glândulas punctiformes escuras; podem se apresentar em vários

formatos elípticos, obovais ou estreitamente obovais, ápice acuminado, agudo a arredondado,

margem revoluta, serreada ou crenado-serreada, com as serras terminando em apículo enegrescido, e

pode apresentar ainda a base aguda. O pecíolo varia de 4-10 mm, com poucos ou sem pelos, algumas

vezes com tricomas brancos (Groppo Jr, 2001) (Fig. 6.1).

As inflorescências masculinas costumam ser em aglomerados de dicásios 3-floros (2-

10 por axila), juntamente com tirsos curtos, no máximo com 2 cm comprimento, podendo ser

Fig. 6.1: Exsicata de Ilex amara depositada no

Jardim Botânico de Nova Iorque

Fonte: www.nybg.org (01/06/2002)


proliferantes ou não, e dicásios 3–floros solitários. As inflorescências femininas são em fascículos de

2-7 flores por axila, juntamente com racemos curtos (até 1,5 cm de comprimento); as flores

solitárias, muito raramente apresentam tirsos proliferantes. I. amara floresce de outubro a dezembro,

e os frutos amadurecem entre maio e junho (Groppo Jr, 2001).

Ilex amara está distribuída desde a Bahia, Mato Grosso e Minas Gerais até o Rio

Grande do Sul e oeste do Paraguai. É encontrada em restingas, campos, matas ciliares, topos de

morros, bordas ou interiores de matas, nesse caso desenvolvendo-se sob forma de árvore alta

(Groppo Jr, 2001).

Ilex amara é freqüentemente referida como I. dumosa Reissek. Além disso, materiais

de folhas menores (até 3,5 cm de comprimento), subsésseis e obovais são muitas vezes identificados

como I. chamaedryfolia Reissek. A delimitação desses táxons não é clara, sendo necessários estudos

mais aprofundados (Groppo Jr, 2001).

Ilex dumosa e Ilex amara são espécies taxonomicamente problemáticas. Pelas

características morfológicas, provavelmente tratam-se de nomes diferentes para a mesma espécie. I.

dumosa está sendo considerada como um sinônimo I. amara. Mas a sinonímia ainda não foi

formalmente oficializada. Assim, botanicamente é mais correto utilizar o nome I. amara em vez de I.

dumosa, pois seu basiônimo é mais antigo e com isso é um indicativo prioritário (Groppo Jr, 2001.).

6.2. Ilex theezans Mart.

Ilex theezans Mart. ex Reissek é encontrada como árvore com altura variando entre

12-18 m; raramente como arvoreta ou arbusto. Apresenta tronco liso e ramos novos glabros. Suas

folhas são coriáceas, glabras, de ápice arredondado quase sempre com um apículo muito curto

margeado por dois dentes, de 5-10 cm de comprimento por 2-5 cm de largura. I. theezans é uma

planta perenifólia e heliófita.

Apresenta extensiva dispersão por quase todo o sul do país, principalmente nas matas

de pinhais e capões. Ocorre também na mata pluvial da encosta Atlântica, bem como na planície

litorânea, onde por vezes se torna muito abundante na vegetação arbustiva da restinga (Lorenzi,

1992).

As folhas de I. theezans são usadas misturadas no mate para aumentar o amargor, ou

são premeditadamente, utilizada para a adulteração do mate.


6.3. Experimental / Resultados/ Discussões

6.3.1. Fracionamentos de I. amara e I. theezans

Para todas as partes analisadas, preparamos a infusão 10%, que foi secada e,

posteriormente alíquotas de 2 g de cada extrato foram fracionadas por GPC. Na tabela 6.1 estão

apresentadas as quantidades de plantas utilizadas, as quantidades de extratos obtidos e também o

resultado do fracionamento por GPC.

Os extratos obtidos foram analisados por TLC de sílicagel eluídas em três diferentes

sistemas de solventes: clorofórmio/metanol/água 70:30:3 e 80:18:2 e BAW 60:25:15. A revelação

das placas de sílica foi feita com sulfato cérico/H2SO4 sob aquecimento. Neste revelador as amostras

apresentaram cores púrpura-arroxeadas, típicas de revelação de saponinas (Safir et al. 1998). Dessa

análise, os extratos de folhas de Ilex amara (IaF), caules de I. amara (IaC) e folhas de I. theezans

(ItF) revelaram maior quantidade de saponinas, sendo assim escolhidos para serem fracionados.

Fig. 6.2: Exsicata de Ilex theezans depositada no

Jardim Botânico de Nova Iorque

Fonte: www.nybg.org (01/06/2002)


Tabela 6.1: Quantidade de cada planta utilizada para a preparação do infuso, quantidades de extratos

obtidos, quantidade de frações obtidas no fracionamento por GPC e de frações obtidas após renião

acompanhadas por TLC.

Extrato Massa de

planta

(g)

Massa de

extrato

(g)

Rendimento

%

Quantidade de

frações da coluna de

Sephadex

Quantidade de

frações reunidas

após TLC

IaF 400 4,0 1,0 75 30

IaC 250 2,5 1,0 90 25

ItF 500 8,0 1,6 120 20

Após análise inicial por TLC as frações coletadas da separação por GPC foram

reunidas e purificadas por HPLC semi-preparativo de fase reversa C18, utilizando-se como eluente o

sistema de solventes metanol/água em proporções variadas de acordo com a polaridade exibida em

TLC.

Dos fracionamentos dos 3 extratos foram obtidos 11 saponinas, 3 triterpenos, 1

flavonóide e um derivado sulfatado da arbutina (tabela 6.2).


Extrato Fração da GPC que foi purificada

(mg)

Tempo de eluição total

prep-HPLC(min)

Quantidade de frações obtidas por

prep-HPLC

Frações analisadas por RMN

(mg)

TR (min)

Substâncias isoladas

4 (240 mg) 51 26 22 (15 mg)

31,5 Ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-(1-3)-α-L-2-O-acetilarabinopiranosil-olean-12-en-28-óico 28-O-β-D-

glucopiranosil éster (Ia2 ) 24

(15 mg) 33,0 Ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-(1-3)-α-L-2-O-

acetilarabinopiranosil-urs-12-en-28-oico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Ia1 )

5 (160 mg) 55 30

27-30 (10 mg)

49,5 Ácido 3β-[α-l-rhamninopiranosil-(1-2)]-[β-D-glucopiranosil-(1-3)]-α-L-arabinopiranosil-olean-12-en-28-

óico (Ia3 ) 7

(12 mg) 9,0 Ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1-2)-α-L-

galactopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Ia10)

25-27 (8 mg)

25,5 Ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-(1-3)-α-L-arabinopiranosil-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-

glucopiranosil éster (Ia5 )

6 (130 mg) 75,5 48

47 (10 mg)

57,0 Ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-(1-2)-α-L-arabinopiranosil-urs-12-en-28-óico (Ia9 )

+ derivado do ácido oleanólico 14-15

(12 mg) 7,5 Ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1-2)-α-L-

galactopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Ia10)

7 (140 mg) 36 44

25 (10 mg)

14,5 3α -O-β-D-glucopiranosil-(1-2)-α-L-galactopiranosil-urs-12-en-28-óico (Ia8 )

+ derivado do ácido 19α -hidroxi-ursólico

IaF

10 (70 mg) 30 30 18 (7 mg)

14,5 Ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1-2)-α-L-galactopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico (Ia4 )

Tabela 6.2: Saponinas identificadas e sua procedência.


Extrato Fração da GPC que foi purificada

(mg)

Tempo de eluição total

prep-HPLC(min)

Quantidade de frações obtidas por

prep-HPLC

Frações analisadas por RMN

(mg)

TR (min)

Substâncias isoladas

5 (150 mg) 33

14 11 (7 mg)

19,5 Ácido 3β-O-β-D-glicuronopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Ia6)

6 (100 mg) 45 45 32 (10 mg)

22,5 Ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1-2)]-[β-D-glucopiranosil-(1-3)]-α-L-arabinopiranosil-olean-12-en-28-

óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Ia7 ) + derivado do ácido ursólico

12-14 (12 mg)

6,5 Ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1-2)-α-L-galactopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-

glucopiranosil éster (Ia10)

IaC

7 (110 mg) 30 31

26-27 (10 mg)

16,5 Ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1-2)]-[β-D-glucopiranosil-(1-3)]-α-L-arabinopiranosil-19α-hidroxi-

urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Ia11) 9

(15 mg) 6,0 Ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-olean-12-en-23-hidroxi-28-

óico (It1 ) 28-29

(10 mg) 12,0 Ácido 3β,19α,23-triidroxiurs-12-en-28-óico (It2)

36-37 (9 mg)

15,0 Ácido 3α,19α-diidroxiurs-12-en-28-óico (It3 )

ItF

11 (150 mg) 45 55

50-52 (10 mg)

24,0 Ácido 3β,19α-diidroxiurs-12-en-28-óico (It4 )

Tabela 6.2 cont.: Saponinas identificadas e sua procedência.


6.3.2. Determinação estrutural

Espectros de RMN de saponinas triterpênicas

As saponinas que encontramos nas espécies de Ilex estudadas provém de agliconas

triterpênicas derivadas dos ácidos oleanólico, ursólico e 19α-hidroxiursólico, estando de acordo com

outras saponinas encontradas nos gênero Ilex até então descritas na literatura (Schenkel et al. 1995).

Assim, é possível apresentar algumas características principais dos espectros de RMN 1H para cada

tipo de esqueleto.

Na região entre δ 1,4 e 0,7, observam-se os sinais das metilas. Para as substâncias de

esqueleto oleanano, observam-se 7 singletos. Os derivados de esqueleto ursano apresentam 5

singletos e 2 dubletos, estes últimos atribuídos às Me-29 e Me-30. As substâncias derivadas do

esqueleto 19α-hidroxiursano, mostram 6 sinais singletos correspondendo a metila e um dubleto

referente a Me-30.

No espectro RMN 1H, podemos observar sinais da aglicona na região entre δ 1,1 e 3,4

importantes para a elucidação estrutural. Quando a aglicona é um derivado de esqueleto oleanano,

observa-se o sinal de H-18 em ~ δ 2,8, como um duplo dubleto com J = 4 e 12 Hz (muitas vezes

observado como um dubleto largo), pois existe um acoplamento axial-axial e um acoplamento axial-

equatorial entre os hidrogênios H-18, H-19a e H-19b (Rastrelli et al. 1996). Um sinal com essa feição

espectral evidentemente indica que a posição 19 está livre de substituintes.

Quando o esqueleto é ursano, o sinal de H-18 é observado como um dubleto entre δ

2,1-2,5. Estando H-18 na configuração α (axial), o sinal será um dubleto de J = 12 Hz; Caso H-18

esteja em β (equatorial), o dubleto será de J = 5 Hz (Sylverstein et al., 1991). Para os esqueletos

19α-hidroxiursanos, H-18 absorve em aproximadamente δ 2,6 como um singleto (Romussi et al.

1994).

Os deslocamentos químicos de H-3 podem indicar se a configuração na posição 3 é α

ou β. Quando a hidroxila está na posição equatorial, H-3 absorve em δ 3,2 como um duplo dubleto

de J = 5 e 11 Hz. No caso da hidroxila em axial, o sinal de H-3 absorve em ~ δ 3,4, também como

um duplo dubleto, mas de J = 2,0 e 2,0 Hz (Rastrelli et al. 1996). Algumas vezes o sinal de H-3 fica

sobreposto aos sinais dos açúcares, sendo difícil a distinção de sua multiplicidade e medida das

constantes de acoplamento.


Nos espectros dos derivados com os esqueletos oleanano e ursano isolados, pode-se

observar o sinal de H-12 olefínico em ~ δ 5.3 (Taketa et al. 2000).

Entre δ 3,0 e 4,2 absorvem os sinais do hidrogênios hidroximetínicos e

hidroximetilênicos dos açúcares (Agrawal, 1992).

Os sinais dos hidrogênios anoméricos de unidades de açúcar ligados à posição 3 da

aglicona aparecem entre δ 4,0 e 4,7, enquanto que os sinais dos hidrogênios anoméricos dos açúcares

ligados à posição 28-COOH da aglicona absorvem entre δ 5,2 e 5,5 (Rastrelli et al. 1996). Os

hidrogênios anoméricos com dubletos de constante de acoplamento variando entre 1-4 Hz podem ser

atribuídos a hidrogênios α anoméricos, enquanto aqueles com constante de acoplamento entre 6-8 Hz

a hidrogênios anoméricos de configuração β (Agrawal, 1992).

Esses aspectos gerais observados nos espectros RMN 1H direcionaram a determinação

estrutural de cada umas das substâncias encontradas nos extratos estudados, conforme relatamos a

seguir.

Como a variação nos espectros é muito pequena, para exemplificar o procedimento de

identificação estrutural,vamos apresentar apenas os espectros de Ia1.

Ilex amara

Ia1

Pelo espectro de RMN 1H (Fig. 6.3) verificamos que se trata de uma saponina

derivada do esqueleto ursano. Observamos H-18 em δ 2.26 (d, J = 9,5 Hz). Os sinais dos hidrogênios

das metilas 29 e 30 absorvem em δ 0,92 (d, J = 6,6 Hz) e δ 1,00 (d, J = 10,0 Hz). Em δ 2,09 observa-

se um singleto intenso, indicativo de uma metila de um grupo acetílico. O sinal de H-3 aparece como

um duplo dubleto (J = 4,8 e 12 Hz) em δ 3,15, indicando configuração β da hidroxila.

Para a determinação dos açúcares, os hidrogênios anoméricos (δ 4,40, 4,45 e 5,38)

foram irradiados em experimentos TOCSY-1D. No espectro obtido após a irradiação do hidrogênio

anomérico em δ 4,40 (Fig.6.4a) observamos todos os sinais de uma unidade de glicose, podendo-se

ver, inclusive, os sinais dos H-6a e H-6b. A constante de acoplamento J = 7,8 Hz do H-1(glu) indica

configuração β do carbono anomérico.


Irradiando-se o hidrogênio anomérico em δ 4,45 (Fig. 6.4b), observa-se um aparente

multipleto em δ 5,19 (H-2(ara)), um duplo dubleto em δ 3,83 (J = 10,2 e 3,6; H-3(ara)) e um singleto

largo em δ 4,08 (H-4(ara)). A irradiação do sinal em δ 5,19 (Fig. 6.4c) mostra o mesmo conjunto de

sinais observados anteriormente, caracterizando o mesmo sistema de spins. Irradiação do sinal em δ

4,08 (Fig. 6.4d) mostra, além dos sinais observados anteriormente, os sinais em δ 3,88 (d, J = 12,0

Hz) e δ 3,61 (d, J = 13,2 Hz) referentes a Ha-5(ara) e Hb-5(ara), respectivamente. Esses dados

observados são compatíveis com uma unidade de arabinose acetilada na posição 2. A configuração α

da arabinose pôde ser deduzida a partir da constante de acoplamento J = 7,8 Hz de H-1(ara)

(Agrawal, 1992).

Irradiação do hidrogênio anomérico em δ 5,37 (Fig. 6.4e) mostra os sinais de uma

segunda unidade de β-D-glicose, desta vez esterificando a carboxila C-28.

O espectro COSY 1H-1H (Fig. 6.5) apresentou correlações que possibilitaram a

confirmação das identidades dos açúcares. Além disso, análise do espectro confirmou que o sinal em

δ 5,19 corresponde ao hidrogênio H-2 da unidade de arabinose, que deve estar acetilada, tendo em

vista seu deslocamento para região diamagnética quando comparada com uma unidade normal de

arabinose (Agrawal, 1992).

O espectros HMQC (Fig. 6.6) e espectro HMBC (Fig. 6.7) e suas ampliações

forneceram os deslocamentos químicos de RMN 1H e RMN 13C. Pelo espectro HMBC observou-se

importantes correlações para determinação das posições de ligação dos açúcares entre si e na

aglicona. Observaram-se as correlações C-1(ara)-H-3 (δ 104,2-3,15), C-3(ara)-H-1(glu) (δ 81,2-

4,40), C-3-H-1(ara) (90,5-4,45) e C-28-H-1’(glu) (176,9-5,36), determinando-se assim que uma das

unidades de glicose estava ligada à posição 28, que a unidade de arabinose estava ligada à aglicona e

que a segunda unidade de glicose encontrava-se ligada à posição 3 da unidade de arabinose.

Pelo espectro HMBC não foi possível determinar o ponto de ligação do grupo

acetílico observado no espectro RMN 1H. No entanto, conforme mencionado anteriormente,

observou-se no conjunto de espectros de RMN 1H, no TOCSY-1D e no COSY 1H-1H que o sinal de

H-2(ara) estava muito desprotegido com relação ao seu deslocamento químico usual - em torno de δ

3,90 (Agrawal, 1992), o que seria apenas explicado com a substituição do OH-2 pelo grupo acetílico.

O espectro ES-MS (100 V, modo negativo) indicou o pico do aduto com acetonitrila

de m/z 994 [M-H+MeCN]- (20) e o pico do íon pseudo molecular de m/z 953 [M-H]- (2). Perda de

uma unidade de glicose gerou o pico m/z 791 [M-H-glu]- (55) e, na seqüência, a perda de um grupo

acetato m/z 749 [M-H-glu-OAc]- (100). Perda de outra unidade de glicose gerou o fragmento de m/z

587 [M-H-2glu-Ac]- (15). A perda de uma unidade de arabinose deveria produzir o íon de m/z 455


[M-H-2glu-Ac-ara]- = [A-H]-, mas este não foi observado no modo negativo. No modo positivo (100

V) pôde-se observar no espectro os sinais do aduto com sódio de m/z 977 [M+Na]+ (30), a perda de

uma unidade de glicose a partir do aduto com sódio, m/z 815 [M+Na-glu]+ (70) e a posterior perda

do grupo acetato, m/z 773 [M+Na-glu-Ac]+ (10). O sinal em m/z 439 indica a massa da aglicona

desidratada, [A+H-H2O]+ (50).

A análise do conjunto de dados (Tabelas 6.3-6.4) e os dados dos espectos de massas

permitiram identificar a substância com fórmula molecular C49H78O18 - ácido 3β-O-β-D-

glucopiranosil-(1→3)-α-L-2-O-acetilarabinopiranosil-urs-12-en-28-oico 28-O-β-D-glucopiranosil

éster (Fig. 6.8). O levantamento bibliográfico indicou que esta substância foi encontrada em I.

paraguariensis (Schenkel, 1995), no entanto, não encontramos a publicação que apresenta os dados

espectrométricos.


Fig. 6.3: Espectro RMN 1H de Ia1 (ppm, 600 MHz, CD3OD, TMS)


Fig. 6.4: Espectro TOCSY-1D de Ia1 (ppm, 600 MHz, CD3OD, TMS) (A) Irradiado em δ 4.40; (B) irradiado em δ 4,45; (C) irradiado em δ 5,19; (D) irradiado em δ 4,08; (E) irradiado em δ 5,38 .

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)


Fig. 6.5: Espectro COSY 1H- 1H Ia1 (ppm, 600 MHz, CD3OD, TMS)


Fig. 6.6: Espectro HMQC de Ia1 (ppm, 600 MHz, CD3OD, TMS)


Fig. 6.7: Espectro HMBC de Ia1 (ppm, 600 MHz, CD3OD, TMS)


Ia2

Esta molécula difere de Ia1 apenas na aglicona. Ia2 é um derivado do ácido

oleanólico: no espectro de RMN 1H pôde-se notar a presença de H-18 em δ 2,9 (dd, J = 12,0 e 5,4

Hz) e 7 singletos de metilas na região diamagnética. Os demais sinais têm pequena variação nos

deslocamentos químicos com relação àqueles de Ia1. Através dos dados apresentados na Tabela 6.3,

observamos que as mudanças dos deslocamentos químicos de RMN de 13C estão principalmente no

anel E, devido à mudança da posição das metilas 29 e 30 (Mahato et al.1994).

Pelos dados apresentados (Tabela 6.3-6.4), Ia2 foi determinado como sendo o ácido

3β-O-β-D-glucopiranosil-(1→3)-α-L-2-O-acetilarabinopiranosil-olean-12-en-28-óico 28-O-β-D-

glucopiranosil éster. Os dados de ES/MS de Ia1 confirmaram a estrutura proposta. Observa-se o

aduto com acetonitrila em m/z 994 [M-H+MeCN]- (33), o pico pseudo molelular em m/z 953 [M-H]-

(5), e as demais quebras indicando as perdas dos açúcares, m/z 791 [M-H-glu]- (51) perda de uma

glicose, m/z 749 [M-H-glu-Ac]- (100) a perda do grupo acetato, resultando da perda de outra unidade

de açúcar o pico m/z 587 [M-H-2glu-Ac]- (29). No modo negativo não foi possível observar a perda

da arabinose gerando o pico m/z 455 [M-H-2glu-Ac-ara]- = [A-H]- da aglicona. No modo positivo

(100 V) observamos os seguintes sinais: m/z 977 [M+Na]+ (25), m/z 815 [M+Na-glu]+ (60), m/z 773

[M+Na-glu-Ac]+ (13), m/z 439 [A+H-H2O]+ (45) confirmando as fragmentações observadas no

modo negativo.


Tabela 6.3: Deslocamentos químicos de RMN 13C das substâncias Ia1 - Ia4 (CD3OD, 600 MHz, δ).

Ia1 Ia2 Ia3 Ia4 1 39,5 39,7 39,6 39,2 2 26,6 26,8 26,7 26,5

3 90,5 90,0 89,9 88,8 4 40,0 40,2 40,0 40,0 5 56,8 56,9 56,7 56,9 6 18,7 19,3 18,9 18,9 7 32,2 32,6 32,1 32,0 8 39,3 40,7 39,0 39,4 9 48,8 48,0 48,9 48,9 10 38,8 37,8 38,5 37,2 11 24,0 24,5 24,2 23,9 12 127,5 123,8 122,5 128,1 13 138,6 144,7 144,5 139,9 14 42,1 42,8 42,0 42,2 15 28,0 28,9 28,1 29,6 16 24,0 24,2 24,6 26,2 17 48,1 47,1 47,1 48,4 18 54,0 42,6 42,4 53,4 19 39,1 47,2 47,3 72,7 20 39,5 31,5 31,2 41,8 21 30,1 34,9 34,7 26,7 22 37,2 33,2 32,8 36,9 23 27,9 28,0 27,9 27,8 24 16,0 15,6 16,3 15,9 25 14,9 16,4 14,3 14,5 26 17,1 17,1 17,0 17,0 27 23,6 25,2 23,5 23,8 28 176,9 178,1 182,0 182,0 29 17,1 33,3 33,3 29,9 30 20,9 23,8 21,0 16,7


Tabela 6.4: Deslocamentos químicos de 13C e 1H dos açúcares das substâncias Ia1 - Ia4 (CD3OD, 600 MHz, δ). Multiplicidades e constante de acoplamento (Hz) entre parênteses.

Ia1 Ia 2 Ia3 Ia4 13C 1H 13C 1H 13C 1H 13C 1H

3-ara 1 104,9 4,45 d (7,8) 104,9 4,45 d (7,9) 104,5 4,52 d (7,6) 2 72,5 5,20 dd (7,8; 8,4) 72,5 5,20 dd (7,9; 8,4) 74,9 3,90 dd (7,6; 8,4) 3 52,1 3,84 dd (3,6; 8,4) 81,2 3,85 dd (3,6; 8,4) 72,6 3,85 dd (3,6; 8,4) 4 69,7 4,08 m 69,7 4,08 m 68,5 4,04 m 5 66,5 3,62 dd (12,0; 3,0)

3,90 dd (12,0; 2,4) 66,5 3,62 dd (12,0; 3,0)

3,90 dd (12,0; 2,4) 64,5 3,52 dd (12,5; 3,0)

3,81 dd (12,5; 2,0)

CH3CO 21,3 2,09 s 21,0 2,07 s CH3CO 171,0 171,1

glu (3→1) glu (3→1) glu (2→1) rha 1 106,0 4,41 d (7,8) 106,0 4,41 d (7,8) 101,5 5,23 s 2 74,5 3,22 dd (9,6; 7,8) 74,5 3,22 dd (9,6; 7,8) 71,7 3,92 dd (1,5; 3,5) 3 77,9 3,42 t (9,6) 77,9 3,42 t (9,6) 71,3 3,73 dd (3,5; 10,0) 4 71,7 3,38 t (9,6) 71,7 3,38 t (9,6) 73,4 3,41 t (9,5) 5 77,9 3,34 m 77,9 3,34 m 72,0 3,92 m 6 61,8 3,67 dd (11,5; 6,0)

3,80 dd (11,5; 2,0) 61,8 3,67 dd (11,5; 6,0)

3,80 dd (11,5; 2,0) 12,4 1,25 d (6,0)

(3→1) glu 3-gal 1 104,8 4,52 d (7,8) 106,0 4,43 d (7,6) 2 75,0 3,31dd (9,6; 7,8) 81,6 3,72 dd (7,6; 9,0) 3 78,0 3,40 t (9,6) 74,7 3,69 dd (4,0; 9,6) 4 71,4 3,35 t (9,6) 69,8 3,87 dd (2,5; 4,0)

5 78,0 3,32 m 75,7 3,50 m 6 62,0 3,87 dd (11,5; 6,0)

3,71 dd (11,5; 2,0) 62,2 3,75 dd (12,0; 4,5)

3,79 dd (12,0; 2,5) 28-glu 28-glu (2→1) ara

1 95,5 5,37 d (8,0) 95,5 5,41 d (8,0) 106,8 4,50 d (7,8) 2 73,6 3,34 dd (9,5; 8,0) 73,6 3,34 dd (9,5; 8,0) 73,4 3,68 t (8,0) 3 78,3 3,38 t (9,5) 78,2 3,36 t (9,5) 73,8 3,58 dd (3,6; 9,0) 4 71,9 3,32 t (9,5) 71,9 3,32 t (9,5) 69,1 3,80 m 5 78,2 3,35 m 77,5 3,29 m 66,8 3,55 dd (8,0; 2,0)

3,90 dd (8,0; 3,0) 6 61,8 3,67 dd (12,6; 5,9)

3,80 dd (12,6; 2,0) 61,8 3,71 dd (12,6; 5,9)

3,85 dd (12,6; 2,0)


Ia3

O espectro de RMN 1H é bastante complexo apresentando sinais importantes

sobrepostos. No entanto, é possível reconhecer que se trata de um derivado triterpênico de esqueleto

oleanano. Observou-se os sinais de H-18 em δ 2,93 como um aparente dubleto largo (J = 14,7 Hz),

além de 7 singletos de grupos metilas.

Na região dos prótons anoméricos, observou-se um conjunto de sinais centrados em δ

4,5, correspondentes a 2 unidades de açúcares. Devido à sobreposição de sinais não é possível

realizar o experimento TOCSY-1D a partir dos hidrogênios anoméricos. Contudo, observação atenta

do espectro revela um sinal alargado em δ 4.04, semelhante ao H-4 da arabinose (sinal também

observado em Ia1 e Ia2). Irradiação sobre o sinal em δ 4.04 mostrou sinais em δ 4,53 (H-1), δ 4,04

(H-4), δ 3,89 (H-2, H-3, Ha-5) e δ 3,51 (Hb-5). Os sinais de H-2, H-3 e Ha-5 da arabinose que

apareceram sobrepostos no experimento TOCSY-1D puderam ser claramente observados no espectro

HSQC.

Em δ 5,23 observou-se um sinal intenso, cuja irradiação mostrou um único sinal

adicional que absorve como um singleto largo em δ 3,92, coerente com H-2 de uma unidade de

rhamnose. A irradiação sobre o dubleto em δ 1,25 (H-6(rha)) conduziu à observação dos hidrogênios

H-5(rha) e H-2(rha) (δ 3.89, sobrepostos), H-4(rha) (δ 3,40) e H-3(rha) (δ 3,73). A análise do

espectro HMQC indica que o sinal δ 5,23 também tem correlção com C-12 (δ 122,5), indicando a

coalescência dos sinais de H-12, olefínico, com os sinais de H-1(rha).

No espectro HMQC foi possível observar os valores dos deslocamentos químicos de

RMN 13C que permitiram confirmar a identificação tanto da aglicona quanto dos açúcares.

Correlações significativas puderam ser observadas para os sinais em δ 101,5-5,23 (C-1(rha)-H-

1(rha)), δ 104,5-4,52 (C-1(ara)-H-1(ara)) e δ 104,8-4,53 (C-1(glu)-H-1(glu)).

Pelo espectro HMBC constatou-se que a unidade de arabinose está ligada ao C-3

através da correlação δ 89,9-4,53 (C-3-H-1(ara)). Embora o espectro HMBC não apresente

correlações que permitam estabelecer todas as ligações interglicosídicas, comparação com os dados

da literatura nos levou a concluir que a substância é o ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1→2)]-[β-

D-glucopiranosil-(1→3)]-α-L-arabinopiranosil-olean-12-en-28-óico (Fig. 6.8). Os dados de ES/MS

reforçam a atribuição a Ia3. No modo negativo (100 V): observa-se o pico do aduto com acetonitrila

com m/z 936 [M-H+MeCN]- (22), o pico m/z 895 [M-H]- (3) indica o íon pseudo-molecular, com a

perda de uma glicose tem-se o sinal m/z 733 [M-H-glu]- (45), com aperda da rhamnose foi observado


o pico m/z 587 [M-H-glu-rha]- (30).Não foi possível observar a perda da arabinose que produziria o

pico da aglicona m/z 455 [M-H-glu-rha-ara]- = [A-H]-. No modo positivo (100 V), verificamos o

aduto com sódio m/z 919 [M+Na]+ (27).

Ia4

No espectro RMN 1H foi possível observar que a substância analisada é um derivado

triterpênico de esqueleto 19α-hidroxiursano, principalmente pelo sinal do H-18 em δ 2,59(s). Nesse

espectro também se observa a presença de dois hidrogênios anoméricos em δ 4,50 (d, 6,6 Hz) e em δ

4,43 (d, 7,2 Hz), atribuídos respectivamente a uma unidade de arabinose e outra de galactose,

identificados pelos experimentos TOCSY-1D.

Irradiação do hidrogênio anomérico em δ 4,50 mostrou 3 grupos de sinais de mesmo

sistema de spins atribuídos a uma unidade de arabinose: H-2(ara) (δ 3,68, t, J = 8 Hz), H-3(ara) (δ

3,58, dd, J = 9,0 Hz e 3,6 Hz) e H-4(ara) (δ 3,80, m). Irradiação do sinal em δ 3,80 (H-4(ara))

mostrou os sinais de H-1(ara) (δ 4.50, d, J = 6,6), Ha-5(ara) (δ 3.90, dd, J = 8,0 e 3,0 Hz), H-2(ara)

(δ 3,68, dd, J = 7,6 e 8,4), H-3(ara) (δ 3,58, dd, J = 9,0 e 3,6 Hz) e em δ 3,55 (Hb-5(ara), dd, J = 8,0

e 2,0 Hz).

O experimento TOCSY-1D partindo do sinal em δ 4,42 mostrou outros 3 grupos de

sinais: um tripleto aparente em δ 3,72 (J = 7,6, H-2(gal)), um duplo dubleto em δ 3,67 (J = 9,6 e 3,0

Hz, H-3(gal)) e um singleto largo em δ 3,87 atribuído a H-4(gal). A identificação do açúcar como

sendo galactose proveio da análise do conjunto dos experimentos TOCSY-1D e HMQC.

O espectro HMQC permitiu obter os valores de deslocamentos químicos de RMN 1H

e RMN 13C, além de confirmar as identidades dos açúcares feitas através dos experimentos TOCSY-

1D (Tabelas 6.3 e 6.4)

O experimento HMBC exibiu as correlações entre os sinais C-1(gal)-H-3 (δ 105,9-

3,15) e C-3-H-1(gal) (δ 90,5-4,43), mostrando que a unidade de galactose está ligada à posição 3 da

aglicona. Por sua vez, a correlação entre os sinais C-2(gal)-H-1(ara) (δ 81,8-4,50) mostra que a

unidade de arabinose está ligada à posição 2 da galactose. Os dados de ES/MS ajudaram na

elucidação estrutura. No modo negativo (100 V) observamos o sinal do aduto com acetonitrila m/z

806 [M-H+MeCN]- (19) e o pseudo molecular m/z 765 [M-H]- (3); a perda de uma arabinose produz

o pico m/z 633 [M-H-ara]- (40) e a perda da galactose fornece o pico m/z 471 [M-H-ara-gal]- = [A-


H]- (2). No modo negativo (100 V) observamos o pico do aduto com sódio m/z 789 [M+Na]+ (23);

com a perda da arabinose temos o sinal m/z 657 [M+Na-ara]+ (68). No modo positivo também foi

possível observar o pico da aglicona desidratada m/z 455 [A+H-H2O]+ (40).

A análise dos dados obtidos e a comparação com dados da literatura possibilitaram

que Ia4 fosse identificado como o ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1→2)-α-L-galactopiranosil-

19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico (Fig. 6.8).

Ia5

No espectro RMN 1H observou-se sinais que indicam que Ia5 é uma saponina

derivada de triterpeno com esqueleto ursano, pois observa-se o dubleto de H-18 em δ 2,25 (J = 5,0

Hz). Três hidrogênios anoméricos foram observados em δ 5,37 (H-1(glu), d, J = 7,8 Hz), 4,58 (H-1

(glu), d, J = 7,8 Hz) e 4,32 (H-1(ara), d, J = 7,2 Hz). Os açúcares foram identificados por

experimentos TOCSY-1D semelhantes aos descritos anteriormente.

O espectro HMQC permitiu obter os valores de deslocamentos químicos de RMN 1H

e de 13C, além de confirmar as identidades dos açúcares feitas através dos experimentos TOCSY-1D.

O espectro ES/MS forneceu dados que auxiliaram na determinação estrutural. No

modo negativo (100 V) observamos um aduto com acetonitrila,o pico pseudo molecular e as perdas

sucessivas de duas unidades de glicose e uma de arabinose: m/z 952 [M-H+MeCN]- (21), m/z 911

[M-H]- (5), m/z 749 [M-H-glu]- (51), m/z 587 [M-H-2glu]- (29), m/z 455 [M-H-2glu-ara]- = [A-H]-

(5). No modo positivo (100 V) verificamos o aduto de sódio e as perdas sucessivas dos açúcares: m/z

935 [M+Na]+ (25), m/z 773 [M+Na-glu]+ (60), m/z 611 [M+Na-2glu]+ (13), m/z 479 [M+Na-2glu-

ara]+ = [A+Na]+ (10), m/z 457 [A+H]+ (3) e a aglicona desidratada, [A+H-H2O]+ (35) com pico m/z

439.

Por comparação com dados da literatura (Miyase et al.,1996) concluiu-se que Ia5 é o

ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-(1-3)-α-L-arabinopiranosil-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-

glucopiranosil éster (Fig. 6.8).


Ia6

Pelo espectro RMN 1H observou-se que a substância Ia6 é derivada de triterpeno com

esqueleto 19α-hidroxiursano, como se pode deduzir pela presença do singleto largo em δ 2,54.

Observam-se dois sinais de hidrogênios anoméricos, um em δ 4,36 (d, J = 7,8 Hz) e outro em δ 5,35

(d, J = 8,4 Hz).

O experimento TOCSY-1D irradiando o sinal em δ 5,35 forneceu o perfil de uma

unidade de glicose, com um conjunto de sinais entre 3,32 e 3,43 e os sinais de H-6a(glu) e H-6b(glu),

visíveis em δ 3,81 e δ 3,71.

Através da irradiação do hidrogênio anomérico em δ 4,35 observaram-se os duplo

dubletos de H-2(glcA) (δ 3,41), H-3(glcA) (δ 3,60), H-4(glcA) (δ 3,25) e H-5(glcA) (δ 3,46).

Portanto, deduz-se que o açúcar é o ácido glucurônico, tendo em vista que o H-5 acopla unicamente

com H-4 e que não se observam os sinais de H-6a e H-6b.

Pela análise dos dados espectroscópicos, Ia6 foi identificada como o ácido 3β-O-β-D-

glucuronopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Fig. 6.8) (Lavaud

et al., 1996).

Ia7

O espectro RMN 1H é semelhante ao de Ia3. A observação dos sinais das metilas e do

H-18 mostram que é um triterpeno derivado de esqueleto oleanano. Os sinais dos prótons anoméricos

também aparecem em regiões semelhantes àqueles de Ia3. A principal diferença é que em δ 5,40

observa-se o dubleto (J = 7,8 Hz) de um hidrogênio anomérico adicional. Experimento TOCSY-1D

mostrou que esta é uma unidade de glicose.

Comparação com os dados obtidos anteriormente e com aqueles da literatura

possibilitou que identificássemos Ia7 como o ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1-2)]-[β-D-

glucopiranosil-(1-3)]-α-L-arabinopiranosil-olean-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Fig.

6.8).

Pode-se notar também sinais menos intensos referentes a H-18 em δ 2,35 - referente

ao respectivo derivado ursânico - e o próton anomérico em δ 5,28. Dessa forma, pode-se concluir que

nessa fração existe também o ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1-2)]-[β-D-glucopiranosil-(1-3)]-α-

L-arabinopiranosil-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster.


Ia8

O perfil dos espectros de RMN 1H indica que existe uma mistura de substâncias com

agliconas derivadas de ursano e de 19α-hidroxiursano.

O sinal de H- em δ 3,27, observado como um dubleto de J = 9 Hz, indica que H-3

ocupa a posição equatorial, portanto, a configuração α.

O espectro apresenta dois hidrogênios anoméricos, em δ 4,69 (d, 7,8 Hz) e δ 4,42 (d,

7,8 Hz). Irradiação do hidrogênio anomérico em δ 4,69 mostrou grupos de sinais de mesmo sistema

de spins atribuídos a uma unidade de glicose: H-1(glu) (δ 4,69, d , J = 6,0 ), H-2(glu) a H-5(glu) (δ

3,20 - 3-40), H-6a(glu) (δ 3,85, m) e H-6b(glu) (δ 3,63, m). Irradiação do sinal em δ 4,42 (H-1(gal))

mostrou os sinais de H-2(gal) (δ 3,90, dd, J = 8,0 e 10,0), H-3(gal) (δ 3.68, dd, J =3,5 e 10,0 Hz), H-

4(gal) (δ 3,84, d, J = 3,5 Hz). A identificação dos acúcares proveio da análise do conjunto dos

experimentos TOCSY-1D e HMQC.

A partir dos espectros HOHAHA e COSY 1H-1H foi possível atribuir os sinais dos

hidrogênios dos dois açúcares. O espectro HOHAHA mostra que outros 6 sinais correlacionam com

o anomérico em δ 4,43, estando de acordo com o sistema de spins de uma unidade de glicose. Para o

hidrogênio anomérico em δ 4,68 observam-se outros três sinais correlacionados num mesmo sistema

de spin, referentes a uma unidade de galactose.

Pelos dados apresentados, deduzimos que Ia8 é uma mistura dos ácidos 3α-O-β-D-

glucopiranosil-(1-2)-α-L-galactopiranosil-urs-12-en-28-óico e ácidos 3α-O-β-D-glucopiranosil-(1-

2)-α-L-galactopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico (Fig. 6.8)

Ia9

Pelo espectro RMN 1H, observou-se que Ia9 é uma mistura de saponinas derivadas de

triterpenos com esqueletos ursano e oleanano, tendo-se em vista os sinais em δ 2,90 dd (H-18-

oleanano) e em δ 2,30 d (H-18-ursano).

Observam-se dois sinais de hidrogênios anoméricos em δ 4,55 (d, J = 7,2 Hz) e δ 4.31

(d, J = 7,2 Hz). O espectro TOCSY-1D com irradiação de δ 4,55, resultou nos sinais característicos

de uma unidade de glicose podendo-se observar com facilidade os sinais de H-6a(glu) (δ 3,85) e H-

6b(glu) (δ 3,69).


Pela irradiação do sinal em δ 4,31, indicou os sinais de uma unidade de arabinose: H-

2(ara) (δ 3,73, dd, J = 8,5 e 8,5 Hz), H-3(ara) (δ 3,65, dd, J = 9,0 e 3,6 Hz) e H-4(ara) (δ 4,04,

singleto aparente). A irradiação do sinal em δ 4,04 permitiu a visualização de Ha-5(ara) e Hb-5(ara).

Comparando-se os dados obtidos com os espectros analisados anteriormente e com os

da literatura as substâncias presentes em Ia9 foram identificadas como sendo o ácido 3β-O-β-D-

glucopiranosil-(1→2)-α-L-arabinopiranosil-urs-12-en-28-óico e o ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-

(1→2)-α-L-arabinopiranosil-olean-12-en-28-óico (Fig. 6.8).

Ia10

Pelo perfil do espectro de RMN 1H observou-se que a substância é um derivado de

esqueleto ursano 19-α-hidroxilado. Os hidrogênios anoméricos apresentam absorção em δ 4,43 (d,

7,8 Hz), 4,51 (d, 6,6 Hz) e 5,35 (d, 7,8 Hz). Comparando-se esse espectro como aquele de Ia4,

deduzimos que é o mesmo conjunto de açúcares que está ligado na posição 3 da aglicona, ou seja

ara(1→2)gal. No entanto, Ia10 apresenta açúcar também em C-28, conforme indica o dubleto (J = 7

Hz) em δ 5,33. Pela comparação dos espectros e por comparação com dados da literatura concluímos

que Ia10 é o ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1-2)-α-L-galactopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-

óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Fig. 6.8)

Ia11

Pelo RMN 1H pôde-se determinar que o esqueleto da substância é um ursano 19α-

hidroxilado. O padrão de substituição na posição 3 é idêntico àquele de Ia3 e Ia7. No entanto, em δ

5,35 (d, J = 7,8 Hz) observa-se o sinal do hidrogênio anomérico de uma glicose esterificada em C-

28. Assim, comparando os espectros das três substâncias e os dados da literatura foi possível

determinar a estrutura de Ia11 como sendo o ácido 3β-O-[α-L-rhamnopiranosil-(1-2)]-[β-D-

glucopiranosil-(1-3)]-α-L-arabinopiranosil-19α-hidroxi-urs-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil

éster (Fig. 6.8).


Ia12

O espectro RMN 1H de Ia12 apresentou sinais na região entre δ 6,0 e 8,1,

sinais característicos de anéis aromáticos. Observam-se sinais entre δ 3,0 e 4,0 atribuídos a

hidrogênios de unidades de açúcar. Entre δ 4,5 e 5,0 é possível identificar os sinais de dois

hidrogênios anoméricos. O perfil do espectro é típico de um flavonóide diglicosilado com o padrão

de substituição A2B2 no anel B, indicando que pode ser um derivado do kaempferol. O anel A

apresenta padrão de substituição AB, provavelmente hidroxilado nas posições 5 e 7. Em 6,9

verificamos o dubleto de J = 8,4 Hz atribuído aos hidrogênios H-3'/H-5'do anel B do flavonóide. Em

δ 8,1 observa-se o dubleto de J = 8,4 Hz, dos hidrogênios H-2'/H-6'. Os hidrogênios H-6 e H-8, têm

sinal absorvendo respectivamente em δ 6,1 e 6.22 como dubletos de J = 2.0 Hz. O hidrogênio

anomérico observado em δ 4,5 como um singleto aparente, foi atribuído à rhamnose e, outro sinal de

hidrogênio anomérico,em δ 5,0 (d, J = 7,2 Hz), a uma unidade de glicose. No espectro ainda é

possível observar o dubleto (J = 6.0 Hz) em δ 1,22 do H-6 da rhamnose. Esses dados foram

comparados com dados da literatura (Sharaf et al. 1997), sendo possível a identificação do

kaempferol-3-O-rutinosídeo (Fig. 6.8).


CH3

CH3CH3

CH3CH3

R1

R2

CH3

CH3

H

H

H

1

3

28

19

Ia1 R1: O-ara(2OAc)-3-glu R2: COOglu

Ia5 R1: O-ara-3-glu R2: COOglu

Ia8 R1: O-gal-2-glu R2: COOH

Ia9 R1: O-ara-2-glu R2: COOH

CH3

CH3CH3

CH3CH3

R1

R2

CH3CH3

H

H

H

Ia2 R1: O-ara(2OAc)-3-glu R2: COOglu

Ia3 R1: O-ara-2-rha | 3 glu R2: COOH

Ia7 R1: O-ara-2-rha | 3 glu R2: COOglu

CH3

CH3CH3

CH3CH3

OH

COOH

CH3

CH3OH

H

H

H

Ia4 R1: O-gal-2-ara R2: COOH

Ia6 R1: O-glcA R2: COOglu

Ia10 R1: O-gal-2-ara R2: COOglu

Ia11 R1: O- ara-2-rha | 3 glu R2: COOglu

O

OH

O

HO

OHO

rhaglc6

Ia12

Fig. 6.8.: Substâncias identificadas em Ilex amara.


Ilex theezans

It1

O perfil do espectro RMN 1H apresentou sinais característicos dos derivados de

triterpenos de esqueleto oleanano. Todavia apresenta apenas 6 singletos referentes a sinais de Me. No

entanto, em δ 4,13 (d, J = 10,8 Hz) e δ 3,87 (d, J = 11,4) absorvem os sinais de Ha-23 e Hb-23,

indicando que a Me-23 está hidroxilada (Taketa et al., 2000). O espectro TOCSY-1D do H

anomérico observado em δ 4,38 (d, J = 7,8 Hz) indicou todos os sinais de uma unidade de glicose.

Assim, It1 foi identificada como o ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-olean-12-en-23-hidroxi-28-óico

(Fig. 6.9).

It2

O espectro de RMN 1H condiz com aquele de um derivado de ursano 19α-hidroxilado.

Similarmente a It1, observam-se apenas 6 sinais de grupos metílicos, além de sinais em δ 4.28 (d, J

= 12 Hz) e δ 4,01 (d, J = 12 Hz), referentes a Ha-23 e Hb-23, indicando que a Me-23 está hidroxilada.

Não se observam sinais de hidrogênios anoméricos. Através dos espectros HMQC e HMBC foi

possível atribuir os valores dos deslocamentos químicos de carbono e de hidrogênio. Comparação

com dados da literatura (Mahato & Kundu, 1994) permitiram identificar It2 como o ácido

3β,19α,23-triidroxiurs-12-en-28-óico (Fig. 6.9).

It3

O espectro de RMN 1H mostra que a substância é um derivado do ácido 19α-hidroxi-

ursólico. Pelo sinal de H-3, observado como singleto largo em δ 4,00, deduz-se que H-3 ocupe a

posição equatorial, ou seja, possui configuração α. Através do espectro COSY 1H-1H foi possível

atribuir os sinais dos hidrogênios de It3 e comparar com dados da literatura (Mahato & Kundu,

1994), tendo sido identificada como o ácido 3α,19α-diidroxiurs-12-en-28-óico (Fig. 6.9).


It4

O espectro de RMN 1H mostrou que esta substância é muito semelhante a It3, porém

observa-se o sinal de H-3 como duplo dubleto em δ 3,15 (J = 8,4 e 4,2 Hz ). Esses valores indicam

que H-3 ocupa posição axial, e portanto possui configuração β. Através do espectro COSY 1H-1H foi

possível atribuir os sinais dos hidrogênios de It4. Comparação com dados da literatura (Mahato &

Kundu, 1994) permitiram identificar essa substância como o ácido 3β,19α-diidroxiurs-12-en-28-óico

(Fig. 6.9).

It5

A substância It5 foi isolada diretamente da coluna de Sephadex LH20. Quando

analisada por TLC e revelada sob luz UV apresentava mancha azul.

O espectro RMN 1H dessa substância apresenta sinais na região de aromáticos, δ 7,02

(d, J = 8,4 Hz) e δ 6,71 (d, J = 9,0 Hz), característico de um sistema AB. Observam-se hidrogênios

referentes a unidades de açúcar entre δ 3,4 e 4,3. Um hidrogênio anomérico absorve em 4,88 (d, J =

7,2 Hz), sob o sinal do metanol, e que é melhor observado no espectro TOCSY-1D com a irradiação

do H em δ 4,29. O espectro TOCSY-1D indicou que o açúcar ligado ao aromático apresenta os sinais

característicos de glicose, no entanto com deslocamentos químicos em campo muito mais baixo que

o normal. Os valores observados são característicos para açúcares substituídos por grupos sulfatos.

Assim, o sinal em δ 4,29 indica que a posição 2 deve estar sulfatada (Safir et al., 1998). Os espectros

COSY 1H-1H e HMQC forneceram os dados para as atribuições dos hidrogênios e carbonos da

molécula. Dessa forma, It5 foi identificada como sendo o p-β-D-2-O-sulfonilglucopiranosil fenol

(arbutina sulfatada na posição 2 do açúcar), inédita (Fig. 6.9)

O espectro de massas no modo negativo mostrou o íon quasi-molecular [M-H]- em

m/z 351 (100). Observou-se uma fragmentação produzindo o sinal em m/z 259 [M-93-H]- (20)

atribuído à perda de um fenil (C6H5O). Observou-se também um forte fragmento devido a perda de

ácido sulfúrico em at m/z 98 (90).


Fig. 6.9.: Substâncias identificadas em Ilex theezans.

It1

CH3

CH3CH3

CH3

gluO

COOH

CH3CH3

H

OH

H

H

It2

CH3

CH3CH3

CH3

OH

COOH

CH3

H

OH

H

H

OH

CH3

It4

CH3

CH3CH3

CH3CH3

OH

COOH

CH3

H

H

H

OH

CH3

CH3

CH3CH3

CH3CH3

OH

COOH

CH3

H

H

H

OH

CH3

It3

It5

OH

O

O

OSO3H

OH

OH

OH


Capítulo 7: Considerações finais O objetivo principal deste projeto de pesquisas foi o estudo químico e biológico de

alguns chás brasileiros que apresentam atividade biológica.

Iniciamos o estudo fitoquímico de uma série de plantas que estão sendo estudadas

pelo grupo da prof.ª Dr.ª Alba R. M. Souza Brito do IB/Unicamp e da prof.ª Dr.ª Clélia ª Hiruma-

Lima do IB/UNESP-Botucatu, que frente a testes de atividade antiúlcera apresentaram resultados

muito promissores quando comparados com os de drogas antiúlceras conhecidas. Assim, iniciamos o

fracionamento dos extratos ativos com o objetivo de se detectar quais são os princípios ativos

responsáveis pela atividade antiúlcera e conferir, posteriormente, se a atividade aumenta com os

componentes puros ou se pode estar havendo algum efeito sinérgico nos extratos.

As plantas incluídas no estudo de plantas com atividade antiúlcera foram: Alchornea

castaneifolia Willd A. Juss (Euphorbiaceae), Curatella americana L. (Dilleniaceae), Hancornea

speciosa Gom. (Apocynaceae) e Quassia amara L. (Simaroubaceae), que apresentou também

atividade antiinflamatória.

O FDA classifica as cascas de Quassia amara como narcótico e antipirético, duas

características que sugeriam a existência de alguma atividade analgésica e antiinflamatória de seus

componentes químicos (Germonsén-Robineau, 1998). Os extratos apolares, principalmente o

hexânico, realmente apresentaram boa atividade analgésica. Os resultados dos testes de analgesia

indicaram que a atividade do extrato hexânico é dose-dependente.

Duke (1992) relatou que a quassina já foi usada no tratamento do alcoolismo,

apresentando propriedades farmacológicas semelhantes ao dissulfiram, um dos principais

medicamentos para o tratamento de alcoolismo crônico. O dissulfiram diminui os níveis de

substância P, um dos neurotransmissores responsáveis pela transmissão da sensação de dor (Hang et.

al., 1997). Desse modo, o conhecimento da similaridade dos efeitos entre o dissulfiram e a quassina

facilita a proposição de um modelo de ação para a atividade analgésica de Quassia amara.

Nossos resultados contradizem o uso popular de Q. amara, que é consumida como

infusão para o tratamento de dores, pois o mesmo não é tão ativo como analgésico. Em geral,

verificamos que os extratos mais polares apresentam baixa atividade analgésica (Toma et. al., 2002a

- anexo).

Apesar de não apresentarmos os resultados dos testes antiúlcera, também foram

realizados ensaios para avaliar esta atividade nos extratos hexânico, diclorometânico, etanólico e

etanólico 70%. Destes extratos, apenas o extrato etanólico 70% não apresentou atividade


significativa. A atividade antiúlcera pode ser atribuída também à quassina e seus derivados e o

mecanismo de ação provavelmente está relacionado com a produção de prostaglandinas e de muco

(Toma et. al., 2002b-anexo).

No Tocantins, região onde foram coletadas C. americana e H. speciosa, a população

utiliza o chá das cascas dessas plantas para afecções gástricas. Em uma fase inicial de nosso trabalho

preparamos os chás com 1g em 10 mL de água, proporção semelhante àquela usada pela população

para verificar se exibia alguma semelhança na composição química entre a infusão e o extrato

etanólico, uma vez que os ensaios antiúlcera de indometacina/betanecol realizados com os extratos

etanólicos de ambas plantas, demonstraram atividade muito similar.

Também na fase inicial fizemos análises por HPLC-DAD dos chás de C. americana e

H. speciosa, apresentando-se semelhantes, com picos com tR entre 6 e 21 min. Os espectros no UV

dos picos dos 2 cromatogramas indicam substâncias semelhantes, com tempos de retenção próximos

e com espectros UV semelhantes. Além disso, eles concordam também com o tR = 9,3 min e o

espectro UV do padrão catequina-padrão.

De C. americana foi possível identificar a catequina (Ca4), e detectar alguns de seus

derivados galato. Existem estudos biológicos comprovandos que a catequina e seus derivados,

inclusive seus polímeros (os taninos condensados) apresentam atividades antiúlceras. Uma das

principais atuações das catequinas nos sistemas vivos é a inibição enzimática. Elas inibem a ação da

histidina descarboxilase, inibindo assim, a formação de histamina que é o sinal bioquímico para a

produção do ácido clorídrico gástrico (Lewis et. al. 1991). Outra interação importante sobre o

sistema enzimático é a inibição das cliclooxigenases, no processo de contração dos músculos lisos,

em alguns processos antiinflamatórios, alérgicos e também gastrintestinais, pois essas enzimas

catalizam a conversão de alguns ácidos graxos para a síntese de prostaglandinas, que são as

substâncias responsáveis pela manutenção da integridade da mucosa gástrica (Harborne, 1993;.

Lewis et. al. 1991). A medicina popular da Indonésia utiliza o chá das folhas de Artocarpus integra,

ricas em catequinas, para o tratamento de úlceras e outra afecções gastrintestinais (Lewis et. al,

1991).

Foram detectadas outras atividades biológicas dos derivados de catequina. Eles

apresentam atividade comprovada contra 11 tipos de vírus e notou-se que os mais ativos eram 3-

hidroxilados. A (+)-catequina foi, dentre os derivados testados, a substância que apresentou a maior

atividade contra os vírus da hepatite e apresentou também uma importante atividade hepato-protetora

(Harborne, 1993).

Em C. americana também foram identificados os triterpenóides de esqueletos lupano,

oleanano e ursano. Foi possível a identificação do ácido ursólico, ácido oleanólico e seus acetatos em


Ca1 e de betulinaldeido em Ca2. Ca3 contém uma mistura de betulinaldeído e ácido betulínico. Os

triterpenos têm atividade bem conhecida nos mecanismos de proteção contra úlceras gástricas. Eles

são excelentes estimulantes da síntese de muco, inibindo uma enzima redutase de prostaglandinas e

permitem a manutenção de um alto nível de prostaglandina na mucosa gástrica. Outro mecanismo

atribuído à ação dos triterpenos na proteção contra a úlcera é a inibição da secreção de pepsina

(Lewis et al., 1991).

Alchornea castaneifolia apresentou resultados significativos nos ensaios biológicos

antiúlcera, sendo que as folhas apresentaram resultados mais expressivos do que as cascas. Para Ac1

sugerimos uma estrutura bastante simples, parecida como um derivado de fluoroglucinol. Derivados

de fluoroglucinóis podem apresentar dois anéis aromáticos ligados entre si por um grupo CH2.

Contudo, biossinteticamente a estrutura de Ac1 não apresenta correlação com aqueles de derivados

de fluoroglucinóis, tendo em vista os padrões de oxigenação observados nos anéis de Ac1.

H. speciosa é uma das plantas utilizadas no tratamento de úlceras gástricas pela

população do cerrado de Tocantins. Segundo Lewis et al. (1991) os efeitos antiulcerogênicos e

antissecretor da catequina são atribuídos à ação inibitória da histidina descarboxilase. Contudo, o

efeito inibitório comprovado da catequina à H+/K+-ATPase pode estar contribuindo na atividade,

uma vez que esta enzima é essencial ao processo de secreção ácida no estômago.

Por testes químicos e pelos resultados da revelação com cloreto férrico da parte mais

polar do extrato de H. speciosa, pudemos considerar positiva a presença de taninos, que possuem

comprovada atividade antiúlcera (Lewis et al., 1991).

Avaliando-se os resultados obtidos e os dados da literatura, temos observado que

existe uma relação entre a atividade antiúlcera e atividade antioxidante das substâncias. Flavonóides

somam duas atividades de muito interesse para o ser humano: apresentam boa atividade

antiinflamatória e são protetores da mucosa gástrica contra vários agentes ulcerogênicos.

Normalmente, antiinflamatórios são agressores do estômago (DiCarlo et al.,1999). Notamos que

grande parte das substâncias que encontramos como antiúlcera, catequinas, flavonóides, taninos,

fenólicos em geral, são conhecidos pelas atividades antioxidantes, inclusive sendo possível estimar

algumas atividades antiúlcera a partir de ensaios antioxidante. Os farmacologistas do grupo de

pesquisa da prof. Souza-Brito tentam encontrar um mecanismo que justifique a proximidade dos

resultados positivos para os dois tipos de atividade biológica.

No caso das espécies de Ilex, em levantamento bibliográfico foi encontrada a

existência de muitos problemas no reconhecimento de Ilex paraguarienses com relação aos seus


adulterantes, suspeitando-se inclusive, que algumas espécies como I. argentina sejam o indivíduo

feminino de I. paraguarienses.

Se as confusões ocorrem em uma espécie tão utilizada e tão importante

comercialmente como I. paraguarienses, as demais espécies também devem apresentar grandes

problemas de identificação. Assim, o nosso trabalho, além de ter o objetivo de revelar os

componentes químicos de chás medicinais brasileiros, também pôde fornecer dados importantes para

uma melhor identificação de espécies de Ilex.

Pelo levantamento bibliográfico sobre espécies de Ilex, encontramos relatado que I.

dumosa (possível sinônimo de I. amara) apresenta em sua constituição 4 saponinas majoritárias

derivadas do oleanano (Schenkel et al., 1995): o ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1-2)-β-D-

galactopiranosil-olean-12-en-28-óico (Ia4), o ácido 3β-O-β-D-glucopiranosil-(1-2)-β-D-

galactopiranosil-olean-12-en-28-óico (Ia8 é o ursano), o ácido 3β-O-α-L-arabinopiranosil-(1-2)-β-

D-galactopiranosil-olean-12-en-28-óico 28 -O-β-D-glucopiranosil éster (Ia10) e o ácido 3β-O-β-D-

glucopiranosil-(1-2)-β-D-galactopiranosil-olean-12-en-28-óico 28-O-β-D-glucopiranosil éster (Ia5).

Algumas dessas substâncias foram encontramos em I. amara, podendo reforçar a hipótese de

sinônimos. Por outro lado, encontramos outras saponinas além dessas 4 e não apenas de esqueleto

oleanólico, como também de esqueleto ursólico e ursólico-19α-hidroxilados, indicando que o estudo

químico dessas plantas pode ser ainda mais aprofundado, fornecendo resultados importantes.

A saponina encontrada por Schenkel et al. (1995) em I. theezans, 28-O-β-D-

glucopiranosideo do ácido rotúndico, não condiz com a que encontramos, substância It1. A diferença

entre elas é que o açúcar de nossa molécula está ligado na posição 3. Mas, de um modo geral, com

relação a I. amara, I. theezans é pobre em saponinas, sendo sua composição majoritária de

triterpenos, principalmente ácido rotúndico.

As principais atividades biológicas de saponinas estão relacionadas com suas

propriedades tensoativas, complexantes, hemolíticas e tóxicas. (Mahato et al., 1988)

A atividade hemolítica de saponinas e a atividade citotóxica dependem do número de

monosacarídeos ligados à hidroxila em C-3. Quanto maior a cadeia sacarídica, maior será a

citotoxicidade apresentada pela saponina. A relação entre estrutura, atividade hemolítica e efeito

tensoativo de 5 derivados do ácido oleanólico foram estudadas, indicando que saponinas

monodesmosídicas apresentam atividades hemolíticas mais acentuadas que as bisdesmosídicas.

Assim, pôde-se concluir que a atividade hemolítica de monodesmosídeos diminui com o aumento do

comprimento e o aumento das ramificações da cadeia sacarídica. A ação tensoativa é maior em

bisdesmosídeos e aumenta com o comprimento da cadeia. Desse modo, concluímos que a


característica estrutural que potencializa a atividade hemolítica diminui a ação tensoativa e vice-

versa (Mahato et al., 1988).

Os resultados da atividade hemolítica realizada em nosso trabalho concordam com a

tendência apresentada por Mahato et al. (1988) sendo que as dissacarídicas na posição 3

apresentaram atividade mais intensa, enquanto que as trissacarídicas menos intensa. Notamos que as

duas saponinas com açúcar acetilado não apresentam atividade. Segundo a tendência que

apresentamos, as saponinas mais polares não apresentam atividade hemolítica. Assim, podemos

justificar o motivo pelo qual as saponinas extraídas com metanol apresentam atividade hemolítica,

enquanto que as extraídas por infusão, obviamente com cadeias sacarídicas mais longas e

ramificadas, não.

As saponinas, de um modo geral, são altamente tóxicas quando aplicadas

intravenosamente. No entanto, quando administrada oralmente os efeitos tóxicos são bem mais

baixos (Mahato et al., 1991), felizmente, a toxicidade diminui por via oral, uma vez que consumimos

muitos alimentos ricos em saponinas, como o mate, uma das principais bebidas dos moradores do sul

do Brasil e Argentina.

A toxicicidade mais baixa para as saponinas ministradas oralmente permite que o uso

de plantas medicinais seja uma boa alternativa para a ingestão dessas substâncias. Como exemplo,

observou-se redução na taxa de colesterol e triglicerideos no soro sanguíneo de ratos alimentados

com alfafa (Medicago sativa), que apresenta diversas saponinas derivadas do ácido zânico, que difere

do esqueleto oleanano por uma hidroxila na posição 22 (Mahato et al., 1991; Kalac et al.,1996).

Outra atividade muito importante de saponinas, muito utilizada, principalmente por

países com problemas de saneamento, é a molusquicida. No combate da esquistossomose, tenta-se

encontrar substâncias que combatam o caramujo aquático, hospedeiro do esquistossoma. Saponinas

derivadas do ácido oleanólico, monodesmosídicas, mostraram atividade molusquicida (Treyvaud et

al., 2000). Saponinas bisdesmosídicas não apresentam atividade no extermínio dos caramujos

(Mahato et al., 1991; Treyvaud et al., 2000). Dessa forma, é possível pressupor que algumas

saponinas encontradas em espécies do gênero Ilex possuam tal atividade. Dentre as saponinas

apresentadas aquelas triglicosiladas na posição 3, derivadas do ácido oleanólico: Ia3 e Ia7.

As saponinas são constituintes presentes em grande quantidade nos chás a que

estamos habituados a consumir. As saponinas do chá preto e verde (Camellia sinensis) apresentam

efeito inibitório no esvaziamento gástrico e um efeito acelerador do trânsito gastrintestinal em ratos.

(Murakami et al., 2000). Murakami et al. (1999) também observou que as saponinas do chá preto

proporcionavam a proteção das mucosas gástricas para lesões induzidas por etanol. Assim, podemos

inferir que algumas saponinas podem apresentar atividade antiúlceras. O alcaçuz (Glycyrrhiza


glabra) tem atividade antiúlcera comprovada sendo sua composição 12% saponinas (Borrelli et

al.,2000).

Em nosso estudo de I. amara também encontramos o flavonóide kaempferol -3-O-

rutinosídeo. Na literatura encontramos apenas trabalhos apresentando triagens visando a presença de

flavonóides em Ilex. Nesses trabalhos foram avaliadas as presenças de kaempferol, quercetina,

kaempferol-3-O-arabinopiranosídeo, quercetina-3-O-arabinopiranosídeo, quercetina-3-O-

glicopiranosídeo, quercetina-3-O-[glicopiranosil(1-2)]-arabinosídeo, rutina, proantocianidina,

isorhamnetina, apigenina e luteolina (Ricco et al. 1995; Matínez et al.1997). Na literatura não

encontramos referências de Ia12 em Ilex. Além disso, tem-se que derivados do kaempferol são

menos freqüentes em espécies da América Central. Segundo Ricco et al. (1995), I. dumosa, possível

sinônimo de I. amara, não apresenta derivado de kaempferol em sua composição, por outro lado, no

trabalho de Matinez et al.(1997), foram analisados espécimes de I. dumosa de diferentes regiões da

América do Sul e Central, sendo detectada a presença da aglicona kaempferol em algumas delas. Isto

indica que a produção dos derivados de kaempferol pode estar condicionada ao ambiente onde se

encontra a planta. Com essa variação da composição de I. dumosa sendo dependente do local em que

floresce, é difícil estabelecer uma regra para marcação taxonômica, para corroborar na sinomização

I. dumosa e I. amara, a partir de sua composição flavonoídica.

Em nossa análise de I. theezans encontramos outra substância fenólica, que também

não apresenta referência na literatura sobre sua presença em Ilex. É um derivado da arbutina, a

hidroquinona glicosilada sulfatada na posição 2 da glicose (It5).

Terapeuticamente, a arbutina é utilizada como diurético e antiséptico, sendo a

principal responsável pela atividade encontrada em uva-ursina (Arctostaphylos uva-ursi), uma planta

usada como infusão no tratamento de cálculos renais (Briukhanov et al. 1998; Malinowska, 1995).

It5 foi detectada nos chás de I. amara e de I. theezans. Assim podemos considerar que

é a arbubina pode ser uma das substâncias responsáveis pelo efeito diurético encontrada em várias

espécies de Ilex. Em análise por HPLC-DAD, I. paraguariensis, não apresentou It5; no entanto,

comparando-se o tR do padrão de arbutina com o cromatograma do chá de I. paraguariensis,

podemos indicar a presença desta.

Por trabalharmos com extratos muito polares, foi necessário o uso de técnica de

fracionamento que minimizasse os problemas causados pela adsorção permanente pela fase

estacionária. Buscamos técnicas mais apropriadas para a elaboração dos fracionamentos e

identificações. Dentre as técnicas cromatográficas, pode-se apontar as cromatografias em contra

corrente (CCC) como sendo as mais adequadas para os fracionamentos dos chás. O motivo principal


para o emprego de tais técnicas é que as mesmas não envolvem a utilização de fase estacionária

sólida, não existindo assim o risco de perda de substâncias por adsorção permanentes. Além disso,

dentre as CCC, selecionamos a HSCCC como a mais adequada para o desenvolvimento dos

refracionamentos de algumas frações que se apresentavam misturas complexas de substâncias e

quantidade não muito grande de amostra.

Utilizando HSCCC pudemos considerar que a técnica é bastante eficiente e rápida.

Conseguimos separar grupos de substância que em TLC apresentavam praticamente o mesmo Rf.

Além disso, podemos recuperar toda a amostra injetada, sem correr o risco de adsorções

permanentes. O extrato de Hancornea speciosa é um exemplo disso: a maior parte do extrato, devido

à sua alta polaridade, não e luiu, podendo no final do experimento ser recuperado. A rapidez do

fracionamento também é um ponto favorável para o uso dessa técnica, sendo possível realizar em um

dia o mesmo fracionamento que levaria 3 dias ininterruptos de GPC ou semanas de DCCC.

O fracionamento de H. speciosa resultou em frações com algumas substâncias

majoritárias. A análise por TLC dessas frações comparadas com padrões de ácido clorogênico e

catequina mostraram que essas duas substâncias são majoritárias em H. speciosa.

Contudo, em alguns casos o problema não reside apenas no processo de

fracionamento, mas na concentração dos metabólitos secundários nos chás medicinais. Um exemplo

é o chá de Sorocea bomplandii (Moraceae), no qual foi detectada a presença de flavonóides por TLC,

mas em concentrações muito pequenas, inviabilizando qualquer tipo de estudo fitoquímico

tradicional. S. bomplandii é um adulterante das espinheiras-santas e já foi encontrada sendo

comercializada como espinheira-santa em mercados populares. Apesar de não apresentar toxicidade

(Bianchi et al., 1993), o uso de S. bomplandii pode agravar o estado do paciente ulceroso, uma vez

que essa espécie não apresenta os mesmos efeitos terapêuticos das espinheiras-santas. Dessa forma,

percebe-se que é importante a determinação dos constituintes dessa espécie.

Dentre as técnicas atualmente disponíveis para a separação e identificação on-line de

compostos de plantas, estão a HPLC-RMN e HPLC-MS. Assim, realizamos a análise do chá de S.

bomplandii utilizando as técnicas hifenadas HPLC-MS-[MS] e HPLC-RMN, tentando encontrar

parâmetros químicos de comparação entre essa espécie e as espinheiras-santas, cujo chá tem

atividade antiúlcera

As análises do chá de S. bomplandii foram eficientemente realizadas através do uso de

HPLC-RMN e de HPLC-MS-MS, comprovando as vantagens dessas técnicas no caso de metabólitos

secundários em concentrações muito baixas. Partindo de apenas 10 mg de amostra pudemos

identificar os componentes principais do chá de S. bomplandii. As análises indicaram a presença de

derivados glicosilados de flavonóides, cujas agliconas foram facilmente identificadas pelo espectro

de RMN 1H devido aos sinais característicos de absorção do anel B, que apresenta um sistema do


tipo A2X2 para os derivados do kaempferol e ABX para os derivados da quercetina. Nesses espectros

também é fácil notar o número de unidades glicosídicas pela presença dos sinais dos prótons

anoméricos dos açúcares, que apresentam sinais entre δ 4,5 e δ 5,5.

Os espectros de massas, por sua vez, também permitiram uma análise confiável dos

derivados dos flavonóides de S. bomplandii. Os derivados do kaemperol apresentaram um sinal

correspondente à aglicona m/z 285 na ionização negativa ou m/z 287 na ionização positiva, e os

derivados da quercetina com um oxigênio a mais em sua composição m/z 301 (negativa) e m/z 303

(positiva). Além das agliconas, é fácil identificar a quebra das unidades de açúcares, com perdas de

162 u para as hexoses e de148 u para as pentoses.

Evidentemente, como qualquer técnica de análise, a HPLC-RMN e HPLC-MS-[MS]

também apresentam limitações: nenhuma delas permitiu estabelecer inequivocamente a identidade

dos açúcares ligados às agliconas. Para isso seria necessário realizar outros experimentos, como os

de RMN 13C, COSY H/H e similares.

Como ponto altamente positivo, essa metodologia nos possibilita obter informações

para realizar um controle de qualidade mais eficiente para as verdadeiras espinheiras-santas –

espécies de Maytenus aquifolium e Maytenus ilicifolia, que apresentam em sua composição

flavonóides glicosilados, mas com quatro unidades de açúcares ligadas á aglicona (Sannomiya,

1998), ausentes em S. bomplandii. Tais substâncias são úteis como marcadores químicos na

comparação entre as plantas mencionadas.

Por esses motivos, a aplicação de técnicas hifenadas torna-se muito importante para o

estudo de chás medicinais. Como se pode constatar pelos resultados obtidos com o chá de S.

bomplandii, essas técnicas permitem a análise de quantidades muito pequenas de amostra e de

matrizes muito complexas. Ademais, por se tratar de técnicas cromatográficas acopladas on-line a

espectrômetros, esses últimos atuam como detectores universais e também fornecem informações

relevantes para a determinação estrutural. As técnicas hifenadas, HPLC-[MS]n e HPLC-RMN, são

rápidas e consomem pouco solvente.

O estudo dos chás medicinais e de extratos polares deixou clara tanto a importância

quanto a dificuldade em se trabalhar com esse tipo de material: a partir do conhecimento da

composição química do material avaliado biologicamente é possível tecer considerações sobre o

porquê da atividade apresentada e prever a realização de outros ensaios, que podem aprofundar os

conhecimentos dos mecanismos de ação da droga. Por outro lado, surgem outras dificuldades. Do

ponto de vista de isolamento - que necessita de técnicas cromatográficas baseadas em princípios que

não a adsorção - é necessário dispor de materiais e equipamentos apropriados, como GPC, DCCC e


HSCCC, que ainda não são de domínio comum no campo da fitoquímica. Do ponto de vista de

determinação estrutural, as moléculas polares apresentam peculiaridades estruturais, como os

glicosídeos. O fato de conter vários tipos e unidades de açúcares, torna a região do espectro de RMN 1H entre δ 3 e δ 4 muito difícil de se analisar, sendo necessária a utilização de técnicas de alta

resolução, como TOCSY, HMQC e HMBC, além de espectrometria de massas.

Finalmente, a abordagem interdisciplinar (etnobotânica-farmacologia-fitoquímica-

química analítica) possibilitou uma visão mais ampla e real da temática das plantas medicinais, de

suas potencialidades, tanto para a ampliação do saber acadêmico quanto para a validação dos

conhecimentos tradiconais.


Conclusões

Plantas antiúlcera: as substâncias encontradas em Alchornea castaneifolia, Curatella

americana e Hancornia speciosa são mencionadas na literatura como tendo atividades relacionadas à

gastroproteção, dando suporte aos ensaios farmacológicos apresentados nesta tese.

Quassia amara: possui quassinóides e triterpenos, que têm atividades analgésicas e

antiinflamatórias conhecidas.

Sorocea bomplandii: as técnicas hifenadas HPLC-RMN e HPLC-MS são ótimas

ferramentas para a análise de quantidades pequenas de extrato e para obter informações estruturais

das substâncias minoritárias presentes.

Ilex spp.: foram encontradas saponinas diferentes daquelas citadas na literatura para o

mate. As saponinas podem ser usadas para a diferenciação entre as espécies, contribuindo para o

controle de qualidade do mate.


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(submetido).

TONA, L.; KAMBU, K.; NGIMBI, N.; CIMANGA, K.; VLIETINCK, A.J.. J. Ethnopharm. , v. 61,

p. 57-65, 1998.

TREYVAUD, V.; MARSTON, A.; DYATMICO, W.; HOSTETTMANN, K.. Phytochemistry, v. 55,

n. 6, p. 603-609, 2000.

VILEGAS, W.. RMN Aplicada à Química de Produtos Naturais. 1989. 74f. Tese (Doutorado em

Química Orgânica) - Instituto de Química, USP, São Paulo.

WAGNER, H.M.; BLADT, S.; ZGAINSKI, E.M.. Plant Drug Analysis. Berlin: Springer, 1984.

303p.

ZATTA I.M.. A farmácia da natureza. Pelotas: Diocese de Pelotas, 1996.


Anexos

ANDRADE, F.D.P., PIACENTE, S., PIZZA, C., VILEGAS, W. Studies on the constituents of

Brasilian folk infusion. Isolation and structure elucidation.of new triterpene saponins from Ilex

amara leaves. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 50, pp. 255-261, 2002.

ANDRADE, F.D.P., SANTOS, L.C., DATCHLER, M., ALBERT, K., VILEGAS, W. Use of on-line

HPLC-NMR for rapid invetigation of flavonids form Sorocea bomplandii. Journal of

Chomatography A, v. 953, pp 287-291, 2002.

ANDRADE, F.D.P., PIACENTE, S., PIZZA, C., VILEGAS, W. A new arbutin derivative from Ilex

theezans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002 (submetido).

COSTA, E.S., HIRUMA-LIMA, C.A., LIMA, E.O., SUCUPIRA, G.C., BERTOLIN, A.O., LOLIS,

S.F., ANDRADE, F.D.P., VILEGAS, W., SOUZA-BRITO, A.R.M. Antimicrobial activity of

ethanolic extracts from higher plants of the Cerrado, Brazil avonoids glycosides from Alchornea

castaneifolia . Phytomedicine, 2002 (submetido).


HIRUMA-LIMA, C.A.; VILEGAS, W.; SOUZA BRITO, A.R.M. (2002). Phytochemical analysis

and evaluation of the analgesic and antiedematogenic activities of four extracts of different polarities

obtained from bark of Quassia amara L. (Simaroubaceae). J. Pharm. Pharmacol.., 2002

(submetido).

TOMA, W.; GRACIOSO, J.S.; ANDRADE, F.D.P.; HIRUMA-LIMA, C.A.; VILEGAS, W. and

SOUZA BRITO, A.R.M.. Antiulcerogenic activity of four extracts obtained from bark of Quassia

amara L. (Simaroubaceae). Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2002 (no prelo).

Studies on the Constituents of a Brazilian Folk Infusion.Isolation and Structure Elucidation of New Triterpene Saponins

from Ilex amara Leaves

FABIO DONISETE PEZZUTO DE ANDRADE,† SONIA PIACENTE,‡ COSIMO PIZZA,‡ AND

WAGNER VILEGAS* ,†

Universidade Estadual Paulista, Instituto de Quı´mica de Araraquara, C. Postal 355,14801-970 Araraquara, SP, Brazil, and Universita` degli Studi di Salerno, Dipartimento di Scienze

Farmaceutiche, Via Ponte don Melillo, 84084 Fisciano (SA), Italy

The isolation of three new triterpene saponins 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f3)-R-L-2-O-acetylara-binopyranosylolean-12-en-28-oic acid 28-O-â-D-glucopyranosyl ester (2), 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f2)-R-L-O-arabinopyranosylurs-12-en-28-oic acid (3), and 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f2)-â-D-O-galactopyranosylurs-12-en-28-oic acid (4) together with five known saponins and one flavonoidglycoside from the aqueous infusion of Ilex amara (Vellozo) Loes. leaves is reported. All structureswere elucidated by spectroscopic methods, including the concerted application of one-dimensional(1H, TOCSY, 13C, and 13C DEPT NMR) and two-dimensional NMR techniques (DQF-COSY, HSQC,and HMBC).

KEYWORDS: Ilex amara (Vellozo) Loes.; Aquifoliaceae; mate; infusion; triterpene saponins; 1D and 2D

NMR

INTRODUCTION

Ilex amara (Vellozo) Loes. (Aquifoliaceae) is a Brazilianplant species the leaves of which are widely used in the formof an aqueous infusion. Because the leaves have a morphologysimilar to that ofIlex paraguariensisand the infusion has asimilar taste and flavor,I. amara is also popularly known as“mate”. In fact, some adulterations have been found in the localmarket. Many reports indicate that saponins are the majorconstituents ofIlex species (1-5). The occurrence of flavonoids(6, 7), xanthines (8, 9), aldehydes (10), hemiterpene glycosides(11), triterpenes and alkanes (12), anthocyanins (13), pentylesters, hexyl esters, and other lipophilic compounds (14) hasalso been reported. Several biological activities were related tothe compounds isolated fromIlex species, including hypocho-lesterolemic (15) and antioxidant (16-21) activities and inhibi-tion of acyl CoA cholesteryl acyl transferase (ACAT) (22).Some authors have also reported an association between theconsumption of mate (I. paraguariensis) or tea (Camelliasinensis) with esophageal and renal cancer (23, 24). In acontinuation of our studies of Brazilian food and/or medicinalplants (25, 26) we have investigated the chemical compositionof the aqueous infusion of the leaves ofI. amara. The chemicalinformation obtained could be important not only for under-standing folk utilization but also for the future validation of

compounds as markers for the assessment of Brazilian mateinfusion (1).

MATERIALS AND METHODS

Biological Material. The leaves ofI. amara (Vellozo) Loes. werecollected in July 2000 at Fazenda Treˆs Irmaos, Guaratuba Beach,Bertioga, Sa˜o Paulo, Brazil. Samples were identified by Dr. MiltonGroppo from the Instituto de Biocieˆncias da Universidade de Sa˜o Paulo.A voucher sample is deposited at the Herbario of the Universidade deSao Paulo, USP - col. M. Groppo Jr. 434, fr. (SPF). The leaves ofI.paraguariensiswere obtained in the local market and identified by Dr.Milton Groppo Jr.

Apparatus. The ES-MS spectra were obtained with a FisonsPlatform spectrometer (Altrinchan, U.K.) in both the positive (90 V)and negative (100 V) modes. The sample was dissolved in MeOH andinjected directly.

A Bruker DRX-600 spectrometer (Silberstreifen, Germany), operat-ing at 599.19 MHz for1H and at 150.858 for13C, using the UXNMRsoftware package was used for NMR experiments in CD3OD. Distor-tionless enhancement by polarization transfer (DEPT) experiments wereperformed using a transfer pulse of 135° to obtain positive signals forCH and CH3 and negative ones for CH2. Polarization transfer delayswere adjusted to an average CH coupling of 135 Hz.1H-1H doublequantum filtered (DQF) COSY) (27, 28), 1H-13C HSQC, and HMBC(29) experiments were obtained using the conventional pulse sequencesas described in the literature, and 1D TOCSY spectra (30) were acquiredusing a waveform generator-based GAUSS shaped pulse, a mixing timeranging from 80 to 100 ms, and an MLEV-17 spin-lock field of 10kHz preceded by a 2 mstrim pulse.

Preparative HPLC separations were performed on a Waters 590 seriessystem (Milford, MA) equipped with a Waters R401 refractive index

* Corresponding author [telephone (+55) (16) 2016668; fax (+55) (16)2227932; e-mail [email protected]].

† Universidade Estadual Paulista.‡ Universitadegli Studi di Salerno.

J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 255−261 255

10.1021/jf010863r CCC: $22.00 © 2002 American Chemical SocietyPublished on Web 12/19/2001

detector and with a Watersµ-Bondapak C-18 column (30 cm× 7.8mm i.d.) and a U6K injector. Analytical HPLC analyses were performedon a Varian ProStar 330 chromatograph (Sugar Land, TX) managedby an Varian workstation equipped with a Varian ProStar 220 diodearray detector (DAD) operating from 200 to 600 nm and a Rheodyneinjector with a 20µL loop. The column used was a Varian C18 250×4.6 mm i.d., at 30°C. Isocratic elution was performed using MeOH/H2O, 75:25, as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. Monitoringwavelength was 205 nm. The infusion was filtered on a 0.45µm Millexfilter and directly injected. Standard solutions of compounds1-8 weredissolved in the mobile phase and injected into the HPLC for qualitativepurposes.

GC separations were run using a Hewlett-Packard 5890 gaschromatograph (Palo Alto, CA) equipped with a mass selective detectorMSD 5970 MS and an HP-5 fused-silica column (25 m× 0.2 mm i.d.,0.33 µm film).

Combustion analyses were performed on an EA 1110 CHNS-O CEInstruments (Rodano, Italy).

Preparation of Infusions for Qualitative HPLC Analysis. Onegram of the air-dried leaves ofI. amara and I. paraguariensiswereseparately milled and put into 50 mL Erlenmeyer flasks. Ten millilitersof boiled water was added to each sample. The infusion was centrifuged,and the supernatant was filtered through a 0.45µm Millex filter. Twentymicroliters of the filtered solution was directly injected into theanalytical HPLC system.

Extraction and Isolation of I. amara Constituents. Leaves ofI.amara were air-dried and milled. The powdered plant (200 g) wasboiled for 8-9 min with water (2 L). The mixture was allowed to cool,filtered through filter paper, and evaporated to dryness, affording 3 gof crude extract of each plant. An aliquot (2.0 g) of the extract wasdissolved in 10 mL of MeOH and fractionated by column chromatog-raphy on a Sephadex LH-20 (1 m× 3 cm i.d.) with a flow rate of 0.5mL/min. Seventy-five fractions of 8 mL were collected. After TLCanalysis (silica gel;n-BuOH/AcOH/H2O, 65:15:25; CHCl3/MeOH/H2O,70:30:3), fractions with similarRf values were combined and furtherpurified by HPLC (µ-Bondpak column, 30 cm× 7.8 mm i.d., flowrate) 2.0 mL/min). Fractions containing saponins were purified usingMeOH/H2O, 75:25, as eluent to yield compounds1 (18 mg, tR ) 33min), 2 (14 mg,tR ) 30 min),3 (12 mg,tR ) 57 min),4 (22 mg,tR )24 min),5 (33 mg,tR ) 27 min),6 (19 mg,tR ) 51 min),7 (17 mg,tR ) 9 min), and8 (35 mg,tR ) 26 min), and the flavonoid was purifiedusing MeOH/H2O as eluent to afford compound9 (10 mg, tR ) 24min).

TLC Analyses for Hemolytic Activity. Approximately 15µg ofthe crude extract of the infusion ofI. amara and of the isolatedcompounds1-8 was spotted on TLC silica gel plates (Aldrich, 10×20 cm) and developed with CH3Cl/MeOH/n-PrOH/H2O, 5:6:5:1:4(upper phase). The plates were dried and sprayed with blood reagent(31).

Acid Hydrolysis of Compounds 1)8.A solution of each compound(3 mg) in 6% HCl (3.5 mL) was refluxed for 2 h. The reaction mixturewas diluted with H2O and then extracted with EtOAc. The resultingproducts were identified by TLC comparison of theirRf values andalso by their1H NMR spectra.

Methanolysis of Compounds 1)8. Each compound (1.0 mg) washeated in a vial for 24 h at 80°C in MeOH/2% HCl (2 mL). AfterMeOH and HCl evaporation in an N2 stream, Ag2CO3 and MeOH wereadded until CO2 production stopped. The mixture was centrifuged andthe centrifugate was dried over P2O5. The resulting monosaccharideswere treated with Trisil-Z (Pierce) and analyzed by GC-MS. Retentiontimes were identical to those of authentic TMS sugars.

Compound1: C49H78O18; ES-MS,m/z (rel int.) (negative mode) 994(20), 953 (2), 791 (55), 749 (100), 587 (15), 455 (absent); (positivemode) 977 (30), 815 (70), 773 (10), 439 (50);1H and13C NMR data,see Tables 1 and 2. Combustion analysis: C, 61.53%; H, 8.33%; O,30.14% (calcd: C, 61.61%; H, 8.23%; O, 30.16%).

Compound2: C49H78O18; ES-MS,m/z (rel int.) (negative mode) 994(33), 953 [M- H]- (5), 791 (51), 749 (100), 587 (29), 455 (absent);(positive mode) 977 (25), 815 (60), 773 (13), 439 (45);1H and 13CNMR data, see Tables 1 and 2. Combustion analysis: C, 61.49%; H,8.33%; O, 30.18% (calcd: C, 61.60%; H, 8.24%; O, 30.16%).

Compound3: C41H66O12; ES-MS, m/z (rel int.) (100 V, negativemode) 790 (22), 749 (3), 587 (45), 455 (absent); (100 V, positive mode)773 (27), 611 (63), 439 (45);1H and13C NMR data, see Tables 1 and2. Combustion analysis: C, 65.69%; H, 8.73%; O, 30.58% (calcd: C,65.56%; H, 8.86%; O, 25.57%).

Compound4: C42H68O13; ES-MS,m/z (rel int.) (negative mode) 820(19), 779 (3), 617 (40), 455 (2); (positive mode) 803 (23), 641 (68),439 (40); 1H and 13C NMR data, see Tables 1 and 2. Combustionanalysis: C, 64.66%; H, 8.42%; O, 26.92% (calcd: C, 64.68%; H,8.78%; O, 26.64%).

Compound5: ES-MS,m/z (rel int.) (negative mode) 952 (21), 911(5), 749 (51), 587 (29), 455 (5); (positive mode) 935 (25), 773 (60),611 (13), 479 (10), 457 (3), 439 (35);1H NMR (CD3OD) δ 0.87 (s,Me), 0.92 (d,J ) 8 Hz, Me), 0.93 (d,J ) 10 Hz, Me), 0.94, 0.98,1.08, 1.14 (s, 4× Me), 2.87 (dd,J ) 13 and 5 Hz, H-18), 5.27 (m,H-12), 4.31 (d,J ) 7 Hz, H-1 glucose), 4.58 (d,J ) 7 Hz, H-1arabinose), 5.37 (d,J ) 7 Hz, H-1 glucose linked at C-28).

Compound6: ES-MS,m/z (rel int.) (negative mode) 936 (17), 895(3), 733 (55), 749 (33), 587 (57), 455 (2); (100 V, positive mode) 919(32), 757 (56), 611 (11), 479 (8), 457 (2), 439 (35);1H NMR (CD3-OD) δ 0.88, 0.89, 0.91, 0.97, 0.97, 1.05, 1.18 (s, 7× Me), 2.93 (dd,J ) 13 and 5 Hz, H-18), 5.24 (m, H-12 and H-1 rhamnose), 1.25 (d,J ) 6 Hz, Me-6-Rha), 4.53 (2H, m, H-1 glucose and H-1 arabinose).

Compound7: ES-MS,m/z (rel int.) (negative mode) 968 (19), 927(5), 765 (51), 603 (29), 471 (2); (positive mode) 951 (25), 789 (60),627 (13), 495 (9), 473 (3), 455 (38);1H NMR (CD3OD) δ 0.80, 0.87,0.95, 0.96, 1.04, 1.22, 1.35 (s, 7× Me), 2.54 (s, H-18), 5.32 (m, H-12),4.43 (d,J ) 8 Hz, H-1 arabinose), 4.51 (d,J ) 7 Hz, H-1 galactose),5.35 (d,J ) 7 Hz, H-1 glucose linked at C-28).

Compound8: ES-MS,m/z (rel int.) (negative mode) 806 (21), 765(5), 603 (53), 471 (3); (positive mode) 789 (25), 627 (60), 495 (11),473 (4), 455 (40);1H NMR (CD3OD) δ 0.86, 0.88, 0.95, 0.97, 1.00,1.22, 1.34 (s, 7× Me), 2.59 (s, H-18), 5.30 (m, H-12), 4.43 (d,J )7.2 Hz, H-1 galactose), 4.51 (d,J ) 6.5 Hz, H-1 arabinose).

Compound9: ES-MS,m/z (rel int.) (negative mode) 593 (55), 447(25), 285 (88); (positive mode) 617 (45), 595 (60), 449 (23), 287 (90);1H NMR (CD3OD) δ 6.07 (d,J ) 2.0 Hz, H-6), 6.22 (d,J ) 2.0 Hz,H-8), 6.89 (d,J ) 8.4 Hz, H3′/5′), 8.09 (d,J ) 8.4 Hz, H2′/ H6′), 4.55(br s, H-1 rhamnose), 5.00 (d,J ) 7.2 Hz, H-1 glucose), 1.22 (d,J )6.0 Hz, H-6 rhamnose).

Table 1. 13C NMR Assignments (δ) of the Aglycon Moiety ofCompounds 1−4 in CD3OD

position 1 2 3 4

1 39.5 39.7 39.6 39.22 26.6 26.8 26.7 26.53 90.5 90.0 90.3 90.14 40.0 40.2 40.0 40.05 56.8 56.9 56.7 56.96 18.7 19.3 18.9 18.97 32.2 32.6 32.1 32.08 39.3 40.7 39.0 39.49 48.8 48.0 48.9 48.9

10 38.8 37.8 38.5 38.911 24.0 24.5 24.2 23.912 127.5 123.8 127.5 127.213 138.6 144.7 138.7 138.314 42.1 42.8 42.0 42.215 28.0 28.9 28.1 28.216 24.0 24.2 24.6 24.717 48.1 47.1 48.1 48.418 54.0 42.6 53.4 53.419 39.1 47.2 39.3 39.420 39.5 31.5 39.2 39.121 30.1 34.9 30.7 30.922 37.2 33.2 36.8 36.923 27.9 28.0 27.9 27.824 16.0 15.6 16.3 15.925 14.9 16.4 15.0 14.526 17.1 17.1 17.0 17.027 23.6 25.2 23.5 23.828 176.9 178.1 182.0 182.029 17.1 33.3 16.8 16.830 20.9 23.8 21.0 20.7

256 J. Agric. Food Chem., Vol. 50, No. 2, 2002 Andrade et al.

RESULTS AND DISCUSSION

The saponins from the leaves ofI. amara were readilyextracted by the addition of hot water. The infusion wasfractionated by chromatograph to separate its chemical con-stituents, and fractions were further purified by reversed-phaseHPLC to yield pure triterpene saponins (1-8) and flavonoid(9) as the major constituents of this infusion (Figure 1). Thestructures of the compounds were determined by one- and two-dimensional NMR experiments as well as by mass spectrometry.

Acid hydrolysis of1, 3, and4 released ursolic acid, whereas2 released oleanolic acid. These aglycons were identified bytheir 1H and13C NMR spectra and also by TLC with authenticstandards. The gas chromatographic analysis of the methanolysisproducts showed the presence of glucose and arabinose, in theratios 2 Glc/1 Ara for both1 and2, 1 Glc/1 Ara for3, and 1Glc/1 Gal for4.

The ES-MS (negative mode) mass spectrum of1 gave theadduct [M- H + MeCN]- atm/z994 and the pseudomolecularion [M - H]- at m/z 953. Fragment ions occurred atm/z 791[(M - H) - 162]-, at m/z749 [(M - H) - 162 - 42]-, andat m/z 587 [(M - H) - 162 - 42 - 162]-, which wereattributed to independent losses of one terminal hexose, oneacetyl group, and a second terminal hexose moiety, respectively.In the ES-MS in the positive ion mode we observed the adductwith sodium [M + Na]+ at m/z 977. The fragment atm/z 815[M + Na - 162]+ corresponds to the loss of one terminalhexose. Sequential loss of an acetyl unit would yield thefragment [M+ Na - 162- 42]+ at m/z 773. The fragment atm/z 439 [M - 162 - 42 - 162 - 132 - 18]+ ) [A + H -18]+ corresponds to the losses of two hexoses, an acetyl group,

one pentose, and one water molecule, leading to the dehydratedprotonated aglycon fragment.

The structure of1 was fully elucidated by 1D and 2D NMRexperiments at 600 MHz. The1H NMR spectrum of1 (Tables1 and 2) displayed signals for methyl groups atδ 0.77, 0.86,0.92 (d,J ) 6.6 Hz), 0.96 (6H), 1.00 (d,J ) 6.6 Hz), and 1.14.A signal due to H-3 was evident atδ 3.14 (dd,J ) 11.0; 4.0Hz), and the olefinic proton appeared atδ 5.27 (br s, H-12).These values were compatible with the ursolic acid aglycon (32).

The 13C NMR shifts of the aglycon part of1 (Table 1) alsocorresponded well with the shifts for ursolic acid, the mostsignificant differences being those corresponding to C-3 andC-28 (33). These shifts were analogous to those reported whenboth 3-OH and 28-COOH groups are glycosylated in a triterpenesaponin (34). Three anomeric protons were easily identified inthe spectra of1. They resonated atδ 5.37 (d,J ) 8.0 Hz), 4.45(d, J ) 7.8 Hz), and 4.41 (d,J ) 7.8 Hz) and correlated tocarbons atδ 95.5, 104.9, and 106.0, respectively. From theassigned aglycon and sugar values (Tables 1 and 2), it apparedthat1 was a bisdesmosidic saponin. The structure of saccharidechain was assigned by a combination of 1D TOCSY, 2D DFQ-COSY, HSQC, and HMBC experiments. The isolated anomericsignals resonating in uncrowded regions of the spectrum,betweenδ 5.37 and 4.41, were the starting points for the 1DTOCSY experiments. Because of the selectivity of multistepcoherence transfer, the 1D TOCSY subspectra of the singlemonosaccharide units could be extracted from the overlappingregion of the spectrum (betweenδ 3.0 and 4.0). Each subspec-trum could be attributed to one set of coupled protons such as

Table 2. 1H and 13C NMR Assignments (δ) of the Sugar Moiety of Compounds 1−4 in CD3OD

1 2 3 413C 1H 13C 1H 13C 1H 13C 1H

3-Ara1 104.9 4.45 d (7.8) 104.9 4.45 d (7.9) 105.5 4.31 d (7.6)2 72.5 5.20 dd (7.8; 8.4) 72.5 5.20 dd (7.9; 8.4) 78.0 3.73 dd (7.6, 8.4)3 81.2 3.84 dd (3.6; 8.4) 81.2 3.65 dd (3.6; 8.4) 72.6 3.65 dd (3.6, 8.4)4 69.7 4.08 m 69.7 4.08 m 68.5 4.04 m5 66.5 3.62 dd (12.0; 3.0) 66.5 3.62 dd (12.0; 3.0) 65.3 3.60 dd (12.5, 3.0)

3.90 dd (12.0; 2.4) 3.90 dd (12.0; 2.4) 3.81 dd (12.5, 2.0)CH3CO 21.3 2.09 s 21.0 2.07 sCH3CO 171.0 171.1Glc (3f1) Glc (3f1) Glc (2f1) Glc (2f1) Glc

1 106.0 4.41 d (7.8) 106.0 4.41 d (7.8) 104.3 4.59 d (7.8) 104.0 4.69 d (7.8)2 74.5 3.22 dd (9.6; 7.8) 74.5 3.22 dd (9.6; 7.8) 75.4 3.21 dd (7.8, 9.0) 75.5 3.25 dd (7.8, 9.0)3 77.9 3.42 t (9.6) 77.9 3.42 t (9.6) 77.9 3.42 t (9.0) 77.8 3.40 t (9.0)4 71.7 3.38 t (9.6) 71.7 3.38 t (9.6) 71.1 3.37 t (9.0) 71.0 3.37 t (9.0)5 77.9 3.34 m 77.9 3.34 m 77.2 3.27 m 77.2 3.29 m6 61.8 3.67 dd (11.5; 6.0) 61.8 3.67 dd (11.5; 6.0) 62.3 3.70 dd (4.5, 11.5) 62.0 3.70 dd (4.5, 11.5)

3.80 dd (11.5; 2.0) 3.80 dd (11.5; 2.0) 3.85 dd (2.5, 11.5) 3.85 dd (2.5, 11.5)3-Gal

1 103.5 4.42 d (7.6)2 78.2 3.89 dd (7.6, 9.0)3 75.2 3.70 dd (4.0, 9.6)4 71.4 3.85 dd (2.5, 4.0)5 76.2 3.54 m6 62.2 3.75 dd (12.0, 4.5)

3.79 dd (12.0, 2.5)28-Glc

1 95.5 5.37 d (8.0) 95.5 5.41 d (8.0)2 73.6 3.34 dd (9.5; 8.0) 73.6 3.34 dd (9.5; 8.0)3 78.3 3.38 t (9.5) 78.2 3.36 t (9.5)4 71.9 3.32 t (9.5) 71.9 3.32 t (9.5)5 78.2 3.35 m 77.5 3.29 m6 61.8 3.67 dd (12.6; 5.9) 61.8 3.71 dd (12.6; 5.9)

3.80 dd (12.6; 2.0) 3.85 dd (12.6; 2.0)

a Chemical shift values are in parts per million, and J values in hertz are presented in parentheses. All signals were assigned by 1D-TOCSY, DQF-COSY, HSQC, andHMBC studies. Ara ) R-L-arabinopyranosyl. Gal ) â-D-galactopyranosyl. Glc ) â-D-glucopyranosyl.

Triterpene Saponins from the Infusion of Ilex amara Leaves J. Agric. Food Chem., Vol. 50, No. 2, 2002 257

H-C(1) to H-C(4) for arabinose or H-C(1) to H-C(6) forglucose.

1D TOCSY subspectra obtained by irradiation of the signalsat δ 5.37 and atδ 4.41 showed two sets of coupled resonancesin a sugar, ascribable from H-1 to H-6 of two glucose units.The 1D TOCSY subspectrum obtained by irradiating the signalatδ 4.45 showed connectivities to three methine groups (δ 5.20,4.08, and 3.84). The coherence transfer to H-5 was not obtainedbecause of the smallJH4-H5 value of this arabinose unit. Thedouble doublet atδ 5.20 (J ) 5.0 and 8.4 Hz) clearly indicatedthat this was an acetylated sugar. The DFQ-COSY spectrumshowed the connectivity between the anomeric signal atδ 4.45and the signal atδ 5.20, thus establishing that the acetyl groupwas located at position 2 of the arabinose moiety. The sequentialassignments of all these sugar protons as shown in Table 2derived from their distinctive DQF-COSY patterns. The assign-ments of all proton resonances for the sugar moieties, im-mediately permitted assignment of the resonances of the linkedcarbon atoms by HSQC (Table 2).

Information about the sequence of the saccharide chain wasdeduced from an HMBC experiment. Key correlation peakswere observed between the anomeric proton of the glucose (δ5.37) and C-28 of the ursolic acid aglycon (δ 176.9), theanomeric proton signal of the arabinose (δ 4.45) and C-3 ofthe aglycon (δ 90.5), and the anomeric proton of glycose (δ4.41) and C-3 of the arabinose (δ 81.2). Further correlation wasalso observed between H-3 (δ 3.14) and C-1′ of the arabinose

unit (δ 104.9). Theâ-configuration at the anomeric positionfor the glucopyranosyl units (J1-2 ) 7.8 Hz) was easily deducedfrom their relatively large3J1-2 coupling constants (7-8 Hz).The large coupling also allowed theR-configuration for thearabinopyranosyl unit (J1-2 ) 7.8 Hz) to be established (35).

These data suggested that the structure of1 is 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f3)-R-L-2-O-acetylarabinopyranosylurs-12-en-28-oic acid 28-O-â-D-glucopyranosyl ester. This compoundwas reported fromI. paraguariensis(1), but no spectroscopicdata were found in the literature.

The ES-MS (negative mode) mass spectrum of2 gave theadduct [M- H + MeCN]- at m/z 994 and the quasimolecularion [M - H]- at m/z 953. Fragment ions occurred atm/z 791[(M - H) - 162]-, m/z 749 [(M - H) - 162- 42]-, andm/z587 [(M - H) - 162 - 42 - 162]- and were interpreted asindependent losses of one terminal hexose, one acetyl group,and a second terminal hexose moiety, respectively. The ES-MS in the positive ion mode presented a fragmentation patternsimilar to that of compound1 with ions atm/z 977 [M + Na]+,m/z 815 [M + Na - 162]+, m/z 773 [M + Na - 162 - 42]+,andm/z 439 [A + H - 18]+.

Compound2 showed1H and 13C NMR spectra similar tothose of compound1. The main differences related to theaglycon. The1H NMR spectrum of2 displayed signals formethyl groups atδ 0.76, 0.82, 0.94, 0.96, 0.97, 0.98, and 1.18.The H-3 absorbs atδ 3.15 (d,J ) 11.5 and 4.5), and the olefinicproton appears atδ 5.27 (br, H-12). These values were in goodagreement with oleanolic acid as aglycon (33). The 13C NMRshifts of the aglycon part of2 (Table 1) also corresponded wellwith the shifts for oleanolic acid. The most significant differ-ences were the downfield shift caused by glycosylation at C-3and the upfield shift caused by substitution at C-28 (36, 34).

The sugar region of compound2 was almost superimposableon that of compound1 (Table 2). The only difference was thechemical shift of the anomeric proton of the glucose moietybonded to C-28, which absorbed atδ 5.41 (d,J ) 8.0 Hz).From these considerations the structure of the new saponin (2)was established as 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f3)-R-L-2-O-acetylarabinopyranosylolean-12-en-28-oic acid 28-O-â-D-glu-copyranosyl ester.

The ES-MS (negative mode) mass spectrum of3 gave theadduct [M - H + MeCN]- at m/z 790, the pseudomolecularion [M - H]- at m/z 749, and an ion atm/z 587 [(M - H) -162]-, the latter one due to the loss of one terminal hexose. Inthe ES-MS in the positive ion mode we observed the adductwith sodium [M + Na]+ at m/z 773. The fragment atm/z 611[M + Na - 162]+ corresponded to the loss of the terminalhexose. The fragment atm/z 439 [M - 162 - 132 - 18]+ )[A + H - 18]+ corresponded to the loss of one hexose, onepentose, and one water molecule, leading to the dehydratedprotonated aglycon fragment.

Compound3 showed1H and 13C NMR spectra similar tothose of compound1 (Tables 1 and 2). The main differencesrelated to the saccharide moiety, as previously revealed byhydrolysis results. The 1D TOCSY subspectrum, obtained byirradiation of the signal atδ 4.59 (d,J ) 7.8 Hz), showed aspin system corresponding to a glucose unit withâ-configura-tion, whereas the 1D TOCSY subspectrum obtained by irradiat-ing the signal atδ 4.31 (d,J ) 7.6 Hz) showed connectivitiesto three methine groups (δ 4.04, 3.73, and 3.65), correspondingto the arabinose moiety with anR-configuration. The assign-ments of all protons and carbons of3 were established from1D and 2D NMR experiments (1D TOCSY, DFQ-COSY,DEPT, HSQC, and HMBC) as shown in Tables 1 and 2.

Figure 1. Saponins isolated from I. amara leaves: (1) 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f3)-R-L-2-O-acetylarabinopyranosylurs-12-en-28-oic acid28-O-â-D-glucopyranosyl ester; (2) 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f3)-R-L-2-O-acetylarabinopyranosylolean-12-en-28-oic acid 28-O-â-D-glucopyra-nosyl ester; (3) 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f2)-R-L-arabinopyranosylurs-12-en-28-oic acid; (4) 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f2)-â-D-galactopyranosyl-urs-12-en-28-oic acid; (5) 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f3)-R-L-arabinopy-ranosylurs-12-en-28-oic acid 28-O-â-D-glucopyranosyl ester; (6) 3â-O-[â-D-glucopyranosyl-(1f3)]-[R-L-rhamnopyranosyl(1f2]-R-L-arabinopy-ranosylolean-12-en-28-oic acid; (7) 3â-O-â-D-galactopyranosyl-(1f2)-R-L-arabinopyranosyl-19-hydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-â-D-glucopyranosylester; (8) 3â-O-â-D-galactopyranosyl-(1f2)-R-L-arabinopyranosyl-19-hy-droxyurs-12-en-28-oic acid.


The position of the saccharide on the aglycon and thesequence of the saccharide chain were deduced from an HMBCexperiment. Correlation peaks were observed between theanomeric proton of the arabinose (δ 4.31) and C-3 of the aglycon(δ 90.3) and between the anomeric proton of the glucose (δ4.59) and C-2 of the arabinose (δ 78.0). Further correlation wasalso observed between H-2 (δ 3.73) of the arabinose and C-1of the glucose unit (δ 104.3). These data suggested that thestructure of3 is the new 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f2)-R-L-O-arabinopyranosylurs-12-en-28-oic acid.

The ES (negative mode) mass spectrum of4 gave the adduct[M - H + MeCN]- at m/z 820 and the pseudomolecular ion[M - H]- at m/z 779. Fragment ions occurred atm/z 617 [(M- H) - 162]- and m/z 455 [(M - H) - 162 - 162]-,corresponding to sequential losses of two hexose moieties. Inthe ES-MS spectrum in the positive ion mode we observed theadduct with sodium [M+ Na]+ at m/z 803. The fragment atm/z 641 [M + Na - 162]+ corresponded to the loss of theterminal hexose. The fragment atm/z 439 [M - 162- 162-18]+ ) [A + H - 18]+ corresponded to the loss of two hexoseunits and one water molecule, leading to the dehydratedprotonated aglycon fragment.

With regard to the aglycon moiety, compound4 showed1Hand13C NMR spectra superimposable on those of compound3(Table 1). The main differences related to the saccharide chain,and this observation was also supported by hydrolysis experi-ments. 1D TOCSY experiments were performed to identify thesugars linked to the ursolic acid aglycon. The subspectraobtained by irradiating the signal atδ 4.42 (d,J ) 7.6 Hz)showed connectivities to three methine groups (δ 3.89, 3.83,and 3.68), corresponding to a galactose unit withâ-configura-tion, and the 1D TOCSY subspectra obtained by irradiation atδ 4.69 (d,J ) 7.8 Hz) displayed a typical spin system H-1 toH-6 of the glucose moiety withâ-configuration.

The sequence of the sugar chain, the position of attachmenton the aglycon, and the complete assignments of each protonand carbon of4 were deduced from DFQ-COSY, DEPT, HSQC,and HMBC experiments (Tables 1 and 2). In the HMBC

spectrum, correlation peaks were observed between the anomericproton of the galactose (δ 4.42) and C-3 of the aglycon (δ 90.1)and between the anomeric proton of the glucose (δ 4.69) andC-2 of the galactose (δ 78.2). Therefore, the structure of4 wasconcluded to be the new 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f2)-â-D-O-galactopyranosylurs-12-en-28-oic acid.

Compounds5-9 displayed spectroscopic data identical tothose reported in the literature: 3â-O-â-D-glucopyranosyl-(1f3)-R-L-arabinopyranosylurs-12-en-28-oic acid 28-O-â-D-glucopyranosyl ester (5) was previously isolated fromAraliadecaisneana(36); 3â-O-[â-D-glucopyranosyl-(1f3)]-[R-L-rhamnopyranosyl(1f2)]-R-L-arabinopyranosylolean-12-en-28-oic acid (6) was isolated fromI. paraguariensis(37); 3â-O-â-D-galactopyranosyl-(1f2)-R-L-arabinopyranosyl-19-hydroxyurs-12-en-28-oic acid 28-O-â-D-glucopyranosyl ester (7) and 3â-O-â-D-galactopyranosyl-(1f2)-R-L-arabinopyranosyl-19-hydroxyurs-12-en-28-oic acid (8) were isolated fromI. cornuta(38); and the flavonoid 3-O-R-L-rhamnopyranosyl(1f6)-glucopyranosylkaempferol (9) was isolated fromCapparisartilogenia (39). All of these structures were confirmed by 1Dand 2D NMR experiments and also by ES-MS analyses.

The main objective of this study was to investigate thechemical compounds fromI. amarabecause it is a species usedin a traditional beverage also called mate. The major compoundsof the I. amara leaves are saponins. This class of secondarymetabolites is among those which provide foods with biologicalactivities and even with antinutritional and toxic properties (40).

The structural diversity of saponins depends not only on thetriterpene skeleton but also on the variety of sugars attached tothe aglycon nucleus. The saponins isolated fromI. amara arebased on ursane, oleanane, and 19-hydroxyursane triterpenes.Although similar saponins were isolated fromI. paraguariensis,to the best of our knowledge, saponins with 19-hydroxyursaneor 19-hydroxyoleanane skeletons were not found in the aqueousinfusion of the leaves ofI. paraguariensis.

To check this hypothesis, we performed a comparative HPLCanalysis of the infusions ofI. amara and I. paraguariensis(Figure 2). The chromatographic profiles of the aqueous

Figure 2. Comparative HPLC analysis of the infusions of I. amara and I. paraguariensis.


infusions ofI. amaraandI. paraguariensiscould be establishedby comparing the retention times and UV spectra of the peakswith those of the isolated compounds. Figure 2 shows that the19-hydroxy saponin (8) is present in significant amounts inrelation to the other detected compounds only in the infusionof I. amarabut is almost absent in the infusion ofI. paraguar-iensis. Therefore, the presence of the 19-hydroxy saponin (8)can be used to establish a chemical differentiation between theaqueous infusions ofI. paraguariensisand I. amara.

Concerning the hemolytic activity, TLC analysis sprayed withblood reagent (31) indicated a positive response with 15µg forcompounds1-8 isolated from I. amara. Recently, muchattention has been paid to the antioxidant activity of the phenoliccompounds in the infusion of mate (I. paraguariensis) (20).However, because saponins are amphiphilic compounds withhemolytic properties, they can be toxic. This toxicity wasdemonstrated by Takechi (41), who reported the high hemolyticactivity of di- and triglycosides of methyl ursolate. Moreover,Oda (42) suggested that saponins with an acyl residue tendedto show increased hemolytic activity. Although there have beenno reports that the intake of the aqueous infusion ofI. amaraisharmful, our results demonstrate a need for more informationabout the biological activities of this tealike beverage.

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Received for review July 6, 2001. Revised manuscript received October12, 2001. Accepted October 16, 2001. We are grateful to FAPESP(Fundacao de Amparo a Pesquisa do Estado de Sa˜o Paulo) forsponsoring part of this work and for a fellowship for F.D.P.A. and toCNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico)for a grant to W.V.

JF010863R


953 (2002) 287–291Journal of Chromatography A,www.elsevier.com/ locate /chroma

Short communication

Use of on-line liquid chromatography–nuclear magnetic resonancespectroscopy for the rapid investigation of flavonoids from Sorocea

bomplandiia a b bFabio D.P. Andrade , Lourdes C. Santos , Markus Datchler , Klaus Albert ,

a ,*Wagner Vilegasa ´Instituto de Quımica de Araraquara, Universidade Estadual Paulista, CP 355, 14801-970, Araraquara, SP, Brazil

b ¨ ¨Institute of Organic Chemistry, University of Tubingen, Auf der Morgenstelle 18, D-72076 Tubingen, Germany

Received 23 May 2001; received in revised form 5 February 2002; accepted 5 February 2002

Abstract

This paper reports the identification of di- and triglycosylated flavonoids from Sorocea bomplandii (Moraceae) by liquidchromatography coupled on-line to nuclear magnetic resonance (LC–NMR). These glycosylated flavonoids may be used as ataxonomic marker in future work. 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

Keywords: Sorocea bomplandii; Nuclear magnetic resonance spectroscopy; Flavonoids

1. Introduction medicine with proven biological activity againstgastritis and ulcers [9]. Sorocea bomplandii Baillon

Hyphenated techniques are increasingly utilized in (Moraceae) has morphological characteristics verythe field of natural products chemistry to analyze similar to those of Maytenus species and has alreadycrude plant extracts [1]. The major advantages over been found in commerce as an adulteration [10]. Thethe traditional off-line techniques are the rapidity of toxicological evaluation indicated that S. bomplandiithe analyses and the small amounts of material does not show acute toxicity in rats [11]. However,required. Column liquid chromatography coupled to the lack of the knowledge of its chemical com-nuclear magnetic resonance (LC–NMR) is a recent position represent a risk for its use as a medicinaltechnique. It has already been used to study small plant.amounts of many compounds including complex Previous reports indicated that methanol extractsplant extracts [2–8]. of the roots of S. bomplandii and S. ilicifolia

In Brazil, the infusion of the leaves of Maytenus afforded Diels–Alder adducts between chalcones andaquifolium and M. ilicifolia (Celastraceae, known as prenylated compounds [12–16]. The hexane and‘espinheira-santa’—holly spines) are used in folk methylene chloride extracts of the leaves of S.

bomplandii led to the isolation of pentacyclic tri-terpenes derived from oleanane, ursane and lupane*Corresponding author. Tel.: 155-16-201-6668; fax: 155-16-skeleta [17]. Vilegas et al. [10] reported the detection222-7932.

E-mail address: [email protected] (W. Vilegas). of di- and triglycosylated flavonoids in the leaves of

0021-9673/02/$ – see front matter 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.PI I : S0021-9673( 02 )00132-2

953 (2002) 287–291288 F.D.P. Andrade et al. / J. Chromatogr. A

S. bomplandii by high-performance thin-layer chro- filter. Ten microliters of this solution were directlymatography (HPTLC) as a way to distinguish be- injected into the LC–NMR system.tween Sorocea and Maytenus plants, based on thefact that leaves from Maytenus species produces

2.2. Apparatus and chemicalsmainly quercetin and kaempferol tetraglycosides[18]. However, the structure of the flavonoids from

For LC separations, methanol (LiChrosolv gra-Sorocea leaves were only suggested based on theirdient grade, Merck, Darmstadt, Germany) and D OR and on the monitoring of the plates with natural 2F

99.9% (Deutero, Herresbach, Germany) were used.products–polyethylene glycol (NP–PEG) reagentAnalyses were performed under ambient condi-[19].

tions using a Merck Lichrograph L-6200A gradientPrevious attempts to investigate the flavonoidspump and a Merck Lichrograph L-4000/4200 UV/using the traditional phytochemical approach (isola-VIS absorbance detector. Separations were carriedtion by chromatographic techniques followed byout on a 25034.6 mm stainless steel column (Bis-identification by spectrometric techniques) was notchoff, Leonberg, Germany) with a particle size of 3successful due to the tiny amounts of these com-

˚pounds in the leaves [17]. mm and a pore diameter of 200 A. Eluents wereLC–mass spectrometry (MS) is a useful technique A5MeOH and B5D O. Separation was performed2

for the investigation of flavonoid glycosides in plant first with isocratic elution with MeOH–D O 40:602

extracts [3]. However, differences between flavone for 20 min and then with linear gradient from 40% toand flavonol skeleta and also the substitution pattern 80% A within 40 min. The flow-rate was maintainedof rings A, B and C are more easily established by at 0.7 ml /min and elution was monitored by ab-LC–NMR experiments. sorbance detection at 370 nm.

The aforementioned facts led us to investigate the All on-line LC–NMR experiments were conductedglycosylated flavonoids present in the leaves of S. on a Bruker AMX 600 spectrometer (1H resonancebomplandii using LC–NMR coupling. frequency 600.13 MHz, Bruker, Rheinstetten, Ger-

many) equipped with an LC inverse probe with adetection volume of 120 ml. The NMR spectra arereferenced to the solvent signal of methanol at d 3.3

2. Experimental and d 4.7. The chromatographic equipment and theBPSU (Bruker Peak Sampling Unit) necessary forstopped-flow experiments were controlled by Chrom-

12.1. Plant material and sample preparation star Software (Bruker). For recording the H-NMRspectra solvent suppression was necessary. This was

Authentic samples of the leaves of S. bomplandii done by employing shaped pulses (rectangle pulse´(Moraceae) were collected in Jaguariava, Parana, with a length of 100 ms) of 1.6 s prior to the start of

Brazil in January 1992 and identified by Armando C. the acquisition for low power presaturation of theCervi Voucher n8 UPCB 20263 (Herbarium of the two methanol signals (d 3.3 and d 4.7). For the

1´Universidade Federal do Parana). H-NMR stopped-flow measurements 2 K transientsThe leaves of S. bomplandii (88 g) were dried at were accumulated, which requires a total acquisition

40 8C, powdered and boiled with 1 l water for 10 time of about 1 h. A time domain of 16 k and amin. The infusion was cooled overnight and filtered. sweep width of 9600 Hz was used for acquisition.It was fractionated over an Amberlite XAD-2 col- Processing was performed with 1D WINNMR soft-umn (2533.5 cm I.D., flow-rate 1 ml /min) eluted ware (Bruker). For all spectra, zero filling up to 32 Kfirst with 1 l water and then with 200 ml methanol. data points and an exponential multiplication of theThe methanolic fraction was evaporated to dryness FID with a line broadening of 0.3 Hz was performedunder vacuum. Ten milligrams of the methanolic before Fourier transformation.fraction were dissolved in 1 ml of methanol in an The LC–ES-MS analysis was performed in aultrasonic bath for 15 min and filtered in a 0.45 mm Fisons VG Platform operating at 70 V, positive mode.

953 (2002) 287–291 289F.D.P. Andrade et al. / J. Chromatogr. A

Chromatographic conditions were similar to thosepreviously described.

3. Results and discussion

Fig. 1 shows the LC chromatogram of the com-pounds present in the leaves of S. bomplandii using aC column. After optimization, we have obtained30

base-line separation for the three main peaks (R 5t31.0, 47.5 and 51.0 min) and good separation for theremaining peaks between 10 and 60 min. Separationof the compounds was performed within 60 min,with a simple linear gradient procedure using metha-nol–deuterium oxide, resulting in a very fast screen-ing of the extract from S. bomplandii. The highselectivity of the C -phase led to a good separation30

of the S. bomplandii flavonoids.1Fig. 2 shows the H-NMR spectra of the three

major peaks. Minor peaks were not considered in1Fig. 2. Stopped-flow H-NMR spectra of (a) peak at 47.5 min, (b)this analyses because chromatographic resolution

peak at 51.0 min and (c) peak at 31.0 min.was not good enough, leading to a mixture ofcompounds in the same peak. Kaempferol andquercetin derivatives can be easily identified and 6.9 (J58 Hz, H59). Therefore, the spectra shown in

1differentiated by their H-NMR spectra [20]. Kaemp- Fig. 2 allows to identify one quercetin derivative inferol derivatives presents two A X doublets near d the peak that elutes with R 547.5 and two different2 2 t

8.0 and d 6.9, with J58 Hz, assigned to the p- kaempferol derivatives in the peaks with R 531.0t

substituted aromatic B ring of the flavonoid aglycon and 51.0 min.[20]. On the other hand, quercetin derivatives present The number of sugar linked in each flavonoidthree groups of characteristic ABX aromatic signals: aglycone could be determined observing thea doublet at d 7.6 (J52 Hz, H29), a double-doublet anomeric region of the spectra (between d 4.0 andat d 7.5 (J58 Hz and 2 Hz, H69) and a doublet at d 5.5) [20]. Despite some interference of solvent signal

between d 3.3 and d 4.7, the anomeric signals of thethree flavonoids were clearly detected. A doublet(3H, J56.0 Hz) at d 1.00 refers to the CH group of3

rhamnose moieties.1The H-NMR spectrum of the kaempferol deriva-

tive with R 551.0 min (Fig. 2a) presents the signalt

of two anomeric protons at d 5.0 (d, J57.5 Hz) andd 4.5 (d, J51.5 Hz). These chemical shifts andcoupling constants signals are consistent with oneglucose moiety with b configuration directly bondedto the 3-OH of the aglycone and one rhamnosemoiety with a configuration bonded to the 69-OH ofthe glucose unity [20]. Therefore, the substance withR 544.9 min may be identified as being kaempferol-t

3-O-b-D-rhamnopyranosyl(1→6)glucopyranoside.Fig. 1. LC chromatogram with detection at 370 nm of the1

flavonoid fraction of the leaves from S bomplandii. The H-NMR spectrum of the quercetin derivative

953 (2002) 287–291290 F.D.P. Andrade et al. / J. Chromatogr. A

with R 547.5 min (Fig. 2b) shows an anomeric glycosides from S. bomplandii that confirm thet

region almost superimposable to that of the quercetin identity of the analyzed compounds.These frag-derivative. Thus, it could be identified as being mentation patterns agree well with the data obtainedquercetin-3-O-b-D-rham- from the LC–NMR experiments and provide furthernopyranosyl(1→6)glucopyranoside. This is also support for the structures proposed.compatible with its lower R when compared to thet

kaempferol derivative, as quercetin has one morephenolic hydroxyl group than the kaempferol agly- 4. Conclusionscone.

1The H-NMR spectrum of the kaempferol deriva- On-line LC–NMR allowed the fast identificationtive with R 531.0 min (Fig. 2c), shows threet of three flavonol glycosides in the leaves of S.anomeric proton signals. Two of them present bomplandii using only small amount of extracts andchemical shifts at d 5.2 (d, J57.5 Hz) and at d 4.8 little organic or deuterated solvents. Clean-up of the(d, J57.5 Hz). Their constant couplings suggests two extract was kept to a single filtration through aglucose unities with b configuration. The third porous membrane. The flavonol glycosides could beanomeric proton at d 4.5 (d, J51.5 Hz) indicates a characterized as being quercetin and kaempferolrhamnose moiety with a configuration. These chemi- glycosides containing two or three sugars bound tocal shifts do not allow to unequivocally identify the the flavonoidic aglycones.interglycosidic linkages. However, this compound These results are important not only for a futuremay be identified as a kaempferol triglycoside. quality control of the Brazilian ‘espinheiras-santas’

Triglycoside flavonoids have a lower retention but also for providing an alternative tool to studytime than diglycosides because of their higher polari- minor constituents in polar phytomedicines usingty. Under the conditions employed, triglycosides only small amounts of crude extracts.eluted after 25–35 min while diglycosides elutedafter 45–55 min. Quercetin derivatives eluted ca. 3.5min earlier than the respective kaempferol derivative, Acknowledgementsprobably because the extra 39-OH makes thesecompounds more polar. The authors acknowledge the support by FAPESP

Additional evidence for the identification of the for fellowships for FDPA and LCS and for fundingflavonoids were obtained from LC–ESI-MS experi- to WV and to CNPq for a grant to WV. The supportments in the positive mode at 70 V. Table 1 presents of the Deustche Forschungsgemeinschaft, der Fondsthe most important fragmentations of the flavonoid der Chemischen Industrie and Bischoff Ana-

lysentechnik GmbH (Leonberg, Germany) is grate-Table 1 fully acknowledged.Main MS fragmentations of the flavonoids from S. bomplandiileaves

R (min) Fragmentations m /z (u)t References131.0 [M1H] 757

1[M-rha1H] 611[1] S.C. Bobzin, S. Yang, T.P. Kasten, J. Chromatogr. B 7481[M-rha-glc1H] 449

(2000) 259.1[M-rha-2glc1H] 287[2] J.-L. Wolfender, K. Hostettmann, Spectrosc. Eur. 8 (1996) 7.[3] J.-L. Wolfender, K. Ndojoko, K. Hostettmann, Phytochem.147.5 [M1H] 611

Anal. 12 (2001) 2.1[M-rha1H] 465[4] A. Lommen, M. Godejohann, D.P. Venema, P.C.H. Hollman,1[M-rha-glc1H] 303

M. Spraul, Anal. Chem. 72 (2000) 1793.[5] S.H. Hansen, A.G. Jensen, C. Cornett, I. Bjornsdottir, S.151.0 [M1H] 595

Taylor, B. Wright, I.D. Wilson, Anal. Chem. 71 (1999) 5235.1[M-rha1H] 449[6] M. Sandvoss, A. Weltring, A. Preiss, K. Levsen, G. Wuench,1[M-rha-glc1H] 287

J. Chromatogr. A 917 (2001) 75.

953 (2002) 287–291 291F.D.P. Andrade et al. / J. Chromatogr. A

[7] M. Sandvoss, L.H. Pham, K. Levsen, A. Preiss, C. Mugge, [14] Y. Hano, J. Yamanaka, T. Nomura, Y. Momose, HeterocyclesG. Wuench, Eur. J. Org. Chem. 7 (2001) 1253. 41 (1995) 1035.

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1

A sulphate arbutin derivative from Ilex theezans leaves Fabio D. P. Andradea, Sonia Piacenteb, Cosimo Pizzab and Wagner Vilegasa*

aUniversidade Estadual Paulista, Instituto de Química de Araraquara, C. Postal 355, 14801-970, Araraquara, SP, Brazil.

bUniversità degli Studi di Salerno, Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Via Ponte don Melillo, 84084, Fisciano (SA), Italy. Corresponding author. Tel.: +55-16-2016668; fax: +55-16-2227932. E-mail address: [email protected] (W. Vilegas)

2

Abstract A sulphate arbutin derivative was isolated from the leaves of Ilex theezans, an adulterant of mate (I. paraguariensis), along with a known triterpene saponin and three known triterpenes. Isolation was performed by GPC followed by purification by RP-HPLC. Structures were determined by spectrometric methods, mainly by and 1D and 2D NMR experiments as well as electrospray mass spectrometry. Keywords: Ilex theezans, Aquifoliaceae, mate, arbutin sulphate, saponin, triterpenes. 1. Introduction Ilex theezans Mart. ex. Reissek. (Aquifoliaceae) is one of the Brazilian plant species whose leaves are widely used in the form of aqueous infusion. This occurs because the leaves have morphology similar to the Ilex paraguariensis and the infusion of I. theezans has similar taste and flavour. In fact, some adulterations have been found in the local commerce. Saponins have been reported as the major constituents of Ilex species (Schenkel et al., 1995; Schenkel et al, 1997; Taketa et al, 2000). It was also reported the occurrence of flavonoids (Martinez et al, 1997; Ricco et al, 1995), xanthines (Reginatto et al, 1999; Saldaña et al, 2000), aldehydes (Dong-Xu et al, 1996), hemiterpene glycosides (Fuchino et al, 1997), triterpenes and alkanes (Vangenderen et al, 1990), anthocyanin (Ishikura, 1975), pentyl-esters, hexyl-esters and other lipophylic compounds (Vangenderen et al, 1988). In continuation to our studies of Brazilian alimentary and/or medicinal plants (Sannomyia et al, 1998; Vilegas et al, 1999 and Andrade et al, 2002) we investigated the chemical composition of the aqueous infusion of the leaves of I. theezans. In this work we found a triterpene saponin and three triterpenes, along with a new sulphate arbutin derivative. 2. Results and discussion The arbutin sulphate, isolated from the chromatografic separation of the aqueous extract of leaves of I. theezans as an amorphous white powder, had UV bands at 220 and 282 nm and IR bands at 3376 cm-1 (OH), 2926 (CH), 1226 (S=O) and 1072 (C-O-S). The ES-MS spectrum in the negative mode showed the quasi-molecular ion [M-H]- at m/z 351 (100). From this fragment loss of the phenyl moiety (C6H5O) led to the ion at m/z 259 [M-93-H]- (20). A strong fragment due to the sulphuric acid appeared at m/z 98 (90).

In the 1H NMR spectrum two orto-coupled aromatic protons at δ 7.02 (2H, d, J = 8.4 Hz) and δ 6.61 (2H, d, J = 8.4 Hz) are characteristic of an aromatic AB system. The anomeric signal occurs at δ 4.88 (1H, d, J = 7.2 Hz). The others hydrogen sugar signals are shifted downfield when compared to those of the arbutin glucose signals (Perry et al.,1996). The main difference arises at the H-2’ of 1 (δ 4.30, 1H, dd J = 6.6 and 1.8 Hz) when compared to arbutin (H-2’ δ 3.43), suggesting that the sulphate moiety is bounded to the position 2’ of the glucose unit. The TOCSY 1D and COSY 1H-1H spectra confirmed the sequence of the sugar hydrogens (Table 1). Irradiation of the hydrogen signal at δ 4.28 shows all the sequence of the hydrogens belonging to the glucose moiety.

3

The carbon chemical shifts were given by the HMQC and HMBC spectra (Table 1). Compound 1 presented a strong downfield shift of C-2’ (δ 82.0) when compared to that of the non substituted arbutin (C-2’ δ 74.9) (Perry et al. 1996), thus confirming the position of the sulphate group at position 2’ of the glucose moiety. The HMBC spectrum showed correlation between the proton signal at δ 4.87 (H-1’) and the carbon signal at δ 151.0 (C-1) and between the proton signals at δ 6.71 (H-3, H-5) and δ 7.02 (H-2, H-6) and the carbon signal at 152.0 (C-4). Therefore, compound 1 was characterized as the new arbutin 2’-sulphonyl (Fig. 1). To the best of our knowledge, this is the first time that an arbutin sulphate was isolated from plants of the genus Ilex. The triterpene saponin 3-O-β-D-glucopyranosyl-19-α-23-dihydroxyursolic acid 2 (Taketa et al., 2000), the α- and β- isomers of pomolic acid 3 and 4 (Mahato and Kundu, 1994), and rotundic acid 5 (Mahato and Kundu, 1994) were identified by their spectral data compared to those reported in the literature.

TLC analyses were performed to compare the infusions of I. paraguariensis and I. theezans. It demonstrates the absence of compound 1 in the infusion of I. paraguariensis, thus establishing an easy method to differentiate between these two species. Further work is in progress to use compound 1 as a marker for the validation of beverages made with I. theezans leaves by HPLC.

3. Experimental 3.1 General experimental procedures The ES-MS spectra were performed in a Fisons Platform spectrometer in the negative (70 V) mode. The sample was dissolved in MeOH and injected directly. A Bruker DRX-600 spectrometer, operating at 599.19 MHz for 1H and 150.858 for 13C, using the UXNMR software package was used for NMR experiments in CD3OD with TMS as internal standard. The DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) experiments were performed using transfer pulse of 135° to obtain positive signals for CH and CH3 and negative ones for CH2. Polarization transfer delays were adjusted to an average CH coupling of 135 Hz. 1H-1H DQF-COSY (Double Quantum Filtered COSY), 1H-13C HSQC experiments were obtained using the conventional pulse sequences as described in the literature, and 1D TOCSY were acquired using waveform generator-based GAUSS shaped pulse, mixing time ranging from 80 to 100 ms and a MLEV-17 spin-lock field of 10 kHz preceded by a 2 ms trim pulse. Infrared spectra were recorded with a FT-IR Nicolet Imact 400 spectrometer using KBr discs. UV spectra were recorded using a Perkin Elmer Lambda 14 UV-VIS spectrometer in methanol. Elemental analyses were made with a Carlo Erba EA 1110 apparatus. Purification of the isolated compounds was performed with a Varian ProStar 330 chromatograph managed by an Varian workstation equipped with a diode array detector (DAD) Varian ProStar 220 operating between 200 and 600 nm coupled in serie to a refractive index detector Varian 350 RI and a Rheodyne injector with a 100 µL loop. The column used was a Phenomenex 25 cm X 1 cm X 5 µm, at 30oC. Isocratic elution were performed using MeOH:H2O 75:25 as mobile phase at a flow rate of 2.0 mL/min. Absorption wavelength was selected at 210 nm. The fractions were filtered on a Millex filter of 0.45 µm and injected directly. TLC analyses were performed on silica gel plates SiF254 0.25 mm thickness (Merck) eluted with n-BuOH-HOAc-H2O (65:15:25). The plates

4

were sprayed with ceric sulphate reagent, heated for 5 min at 110oC affording purple spots for triterpenes and saponins and blue for arbutin sulphate. The Rf of the arbutin sulphate 1 was 0.33. 3.2. Plant material The leaves of Ilex theezans Mart. ex. Reissek (Aquifoliaceae) were collected at July, 2000 at Fazenda Três Irmãos, Guaratuba Beach, Bertioga, State São Paulo, Brazil. Samples were identified by Dr. Milton Groppo from the Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. A voucher sample is deposited at the Herbario of the Universidade de São Paulo - USP - col. M. Groppo Jr. SPF 430. The leaves of I. paraguariensis were obtained in the local commerce and identified by Dr. Milton Groppo Jr. 3.3. Extraction and isolation Leaves of Ilex theezans were air dried and milled. The powdered plant (200 g) was boiled for 8-9 min with water (2 L). The mixture was allowed to cool, filtered over filter paper and evaporated until dryness affording 3 g of crude extract of each plant. An aliquot (2.0g) of was dissolved in 10 mL MeOH and fractionated on a Sephadex LH-20 CC (1 m x 3 cm i.d) with flow rate of 0.5 mL/min. 120 fractions of 8 mL were collected. The arbutin sulphate 1 was eluted in the fractions 89-92 (180 mg). Fractions 53-57 (150 mg) were further purified by HPLC affording respectively the triterpene saponin 3-O-β-D-glucopiranosyl-19-α-23-dihydroxyursolic acid 2 (20 mg), the α-pomolic acid 3 (12 mg), β-pomolic acid 4 (10 mg) and rotundic acid 5 (10 mg). 3.4. Arbutin 2’-sulphonyl (1) Amorphous powder. UV (MeOH) λmax: see text. IR (KBr disc) νmax: see text. 1H and 13C NMR: see Table 1. Elemental analysis: C 40.98%, H 4.61%, S 9.18%, calculated for C 40.91%, H 4.58%, S 9.10%. 3.5. Preparation of the infusions for qualitative TLC analysis.

The air-dried leaves of I. amara and I. paraguariensis (1 g each) were separately milled and put into 50 ml Erlenmeyer. 10 ml of boiled water was added to each sample and left for 15 min. The infusions were centrifuged and the supernatant were filtered over a 0.45 µm Millex filter. The filtered solutions (ca. 1 µL) were spotted onto the TLC plates. After elution in BAW, plates were revealed with ceric sulphate reagent and heated at 110oC for 5 min. Acknowledgements The authors are grateful to FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo) that has sponsored part of this work and for a fellowship for F.D.P.A. and to CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) for a grant to W.V.

5

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6

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Fig. 1. Arbutin 2’-sulphonyl (1). Table 1 1H and 13C NMR spectral data (CD3OD, 600 MHz) for compound 1a

Position δ 13C δ 1H 1 151.0

2,6 121.5 7.02 (d, 8.5 Hz) 3,5 117.5 6.71 (d, 8.5 Hz) 4 152.0

Glucose 1’ 100.8 4.87(d, 7.2 Hz) 2’ 82.0 4.30 (dd 8.5, 8.5 Hz) , 3’ 77.6 3.74 (dd, 8.5, 8.5 Hz) 4’ 75.2 3.50 (dd, 8.5, 8.5 Hz) 5’ 77.8 3.43 (m) 6’ 62.5 3.40 (dd, 12.0, 5.0) 3.91 (d, 12.0)

a J in Hz; assignments confirmed by HSQC and HMBC experiments.

O

O S O 3 H

O H

O H O H H

O

O H

1’

2’

6’

1

4

A sulphate arbutin derivative from Ilex theezans leaves Fabio D. P. Andradea, Sonia Piacenteb, Cosimo Pizzab and Wagner Vilegasa*

aUniversidade Estadual Paulista, Instituto de Química de Araraquara, C. Postal 355, 14801-970, Araraquara, SP, Brazil.

bUniversità degli Studi di Salerno, Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Via Ponte don Melillo, 84084,

Fisciano (SA), Italy. A sulphate arbutin derivative was isolated from the leaves of Ilex theezans, an adulterant of mate (I. paraguariensis).

O

O S O 3 H

O H

O H O H H

O

O H

1

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ETHANOLIC EXTRACTS FROM HIGHER PLANTS OF THE CERRADO, BRAZIL

E.S. Costa1, C.A. Hiruma-Lima2*, E.O. Lima3, G.C. Sucupira3, A.O. Bertolin1, S.F. Lolis1, F.D.P. Andrade 4, Vilegas, W. 4, and A.R.M. Souza-Brito5

1 Instituto de Biologia e Saúde Pública, Campus de Porto Nacional, Fundação Universidade do Tocantins, Porto Nacional, Tocantins, Brazil. 2 Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Rubião Junior, Botucatu, São Paulo, Brazil. 3 Laboratório de Micologia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, CCS, Universidade Federal da Paraíba, Campus Universitário I, João Pessoa, Paraíba, Brazil. 4 Laboratório de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, São Paulo, Brazil. 5 Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil. Address correspondence to: Dra. Clélia A. Hiruma-Lima, Departamento de Fisiologia, cp. 510, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista-UNESP, Rubião Junior, s/n, Botucatu, SP, Brazil, Fax +55/14 6821 3744, CEP 18618-000, e-mail address: [email protected] ABSTRACT In order to determine the potential of Cerrado plants as sources of antimicrobial activities, ethanolic extracts of 5 plants, were evaluated. The ethanolic extracts from Virola surinamensis (sap), Qualea grandiflora (bark), Alchornea castaneifolia (leaves), Hancornia speciosa (bark) and Curatella americana (bark), plants of the Brazilian Cerrado traditionally used in folk medicine, were tested for their in vitro antimicrobial activity. Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S. epidermides, Trichosporon spp., Rhodotorula rubra, Candida guilliermondii, C. tropicalis, C. albicans, Cephalosporum spp., Aspergillus flavus, A. parasituns, Penicillium spp., Microsporum canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum and T. mentagrophytes were used as the test organisms. Among the investigated species, Qualea grandiflora, and Hancornia speciosa showed antifungal activity and Virola surinamensis, Qualea grandiflora, and Hancornia speciosa showed effective antimicrobial activities. Keywords: Antimicrobial activity, Qualea grandiflora, Hancornia speciosa, Virola surinamensis, Qualea grandiflora, Hancornia speciosa, Brazilian Cerrado, traditional medicine

2

INTRODUCTION Brazilian flora is widely recognized as being one of the major natural medicinal plant resources of the whole world. Because of its large geographical territory, several geographical territories have their typical flora with endemic species. Because of its biodiversity, the Amazonian Forest and the Atlantic Forest are among the most investigated regions of Brazil. However, many other localities have their local folk medicines, and population make intense use of plant remedies to heal their diseases, with a wide acceptability. This is the case of Tocantins State, in the North of Brazil. At this region, the mainly vegetation is Cerrado, Brazilian name of the neotropical savanna, is composed of herbaceous-subshrubby ans shrubby-arboreal floras highly diverse and regionally differentiated (Ferri, 1973). Despite it is located near the Amazonic region, plants from Tocantins State have been neglected regarding their chemical and biological properties. Most of the inhabitants of Tocantins use traditional medicinal plants in the treatment of infectious disease. Only few examples deals with the investigation of species from this region (Almeida et al., 1998). Hence, it is necessary to establish the scientific basis for the therapeutic actions of traditional plant medicines as these may serve as the source for the development of more effective drugs. This paper presents the investigation of antibacterial and antifungal activities of five typical species of the flora from Brazilian Cerrado that grow in Tocantins State, Brazil, traditionally used in folk medicine: Virola surinamensis (Myristicaceae), Qualea grandiflora (Vochysiaceae), Alchornea castaneifolia (Euphorbiaceae), Hancornia speciosa (Apocynaceae) and Curatella americana (Dilleniaceae). MATERIALS AND METHODS Plant material. Plants (Table 1) were collected from January to December 2000, in Porto Nacional, Tocantins State, Brazil. The species were selected on the basis of information supplied by traditional healers from many villages near Porto Nacional, Tocantins, Brazil. All the taxonomic identity of the plants was identified by Profa. Solange F. Lolis from Universidade do Tocantins (HTINS), Brazil. Classified reference vouchers were deposited at the herbarium from HTINS Fundação Universidade do Tocantins, Porto Nacional, Tocantins, Brazil. Assay for antimicrobial activity. Antimicrobial activity was determined by a technique previously described by Mc Ginnis, 1980 and Bauer et al., 1966. The microorganisms used included Trichosporum spp.(LM99), Rhodotorula rubra (ICB 36) , Candida guilliermondi (LM 30), C. tropicalis (LM 13), C. albicans (LM 528) , Cephalosporum spp. (LM 00), Aspergillus flavus (FCF 26), A. parasituns (NRRL 29999), Penicillium spp. (FCF 281), Microsporum canis (LM 72), M. gypseum (LM 1), Trichophyton rubrum (LM 118), T. mentagrophytes (LM 16), Escherichia coli (B 4), Pseudomonas aeruginosa (B 8), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) and S. epidermidis (ATCC 12228), cultivated on Sabourand dextrose agar (DIFCO). All the strains of microorganisms were obtained from the Mycology Department at the Paraíba Federal University, João Pessoa, PB, Brazil. The assays were accomplished by diffusion method in solid media. Suspensions of the culture in 0.85% physiological saline sterile solution standartized with number 0.5 of the Mc Farland Scale (106 UFC) and with 90% T (530 nm) were made. From these suspensions, 1 ml was transferred to the sterile Petri plates and soon after 21 ml of the fused solid media were added at 45-50 °C, carefully homogenized. After solidification, the compound solutions in dimethylsulfoxide (Sigma Chemical Co., U.S.A.) were introduced into preformed cavities. The plates were incubated at 37°C for 24 h. After this period, it was possible to observe inhibition zone. The antimicrobial activity was evaluated by measuring the diameter of inhibition zone. Cultured bacteria and fungi with halos equal to or greater than 7 mm were considered susceptible to tested extract. The experiment was carried out in triplicate and the mean of the diameter of the inhibition zones was calculated. The controls were the solvents used for each extract and they showed no inhibitions in preliminary studies. Preparation of extracts and samples for biological testing.

3

Dried and powdered plants were exhaustively extracted in a percolator with 96 % EtOH for 3 days. The extracts were filtered and solvents were removed under reduced pressure using a rotary evaporator to obtain the dried extract. A 10 % (w/v) test solution of each extract was prepared in dimethylsulfoxide. Choranphenicol (30 µg/mL) was used as positive control for bacteria, ketoconazol (50 µg/mL) for fungi and dimethylsulfoxide was used as negative control. The chemicals used in the preparation of the other solutions were all analytical grade. Preparation of extracts and samples for chromatographic testing. The identification of the chemical groups present on each plant was performed according Wagner et al., 1986. The chromatographic analyses were carried out on Fluka F254 silica gel 5 x 30 cm glass plates, layer thikness 0.25 mm (Art. 60763) eluted in three different solvent systems: n-butanol/acetic acid/water (BAW) 65:15:35, chloroform/methanol/ammonia 8:2:0.5 and chloroform/methanol/n-propanol/water 5:6:1:4 (lower layer). Dried and powdered plants (1 g each) were transferred to testing tubes and extracted by heating on a water bath for 1 h. Solutions were centrifuged for 10 min and the extracts were filtered to clean testing tubes. Approximately 100 µl of each solution was spotted onto the TLC plate. For alkaloids, drugs were previously moistened with 2 ml ammonia solution and mixed with 5 ml methanol; detection was performed after spraying the plates with Dragendorff's reagent or iodoplatinate. For anthraquinones, flavonoids, phenolic compounds, triterpenes, steroids and saponins, drugs were extracted with 5 ml methanol. For tannins and saponins, drugs were extracted with 5 ml water. Anthraquinones were detected using 10% potassium hydroxide solution in methanol. Flavonoids were detected by their intense fluorescent colours in visible or in UV light when revealed with natural products/polyethylene glycol (NP/PEG) reagent. General phenolic compounds were detected after exposing the plates to ammonia vapors and immediately observing the fluorescent spots under UV light. Saponins, triterpenes and steroids were detected either with anisaldehyde-sulphuric acid reagent or ceric sulphate-sulphuric acid solution, producing a range of colours after heating for 5 min at 100 oC. Tannins were detected with 5% ferric chloride solution in methanol and with 1% gelatin solution. Standard solutions of rutin, isoquercitrin, chlorogenic acid and catechin were prepared in methanol. RESULTS AND DISCUSSION Even through pharmacological industries have produced a number of new antibiotics in the last decades, bacteria have acquire resistance to these drugs and new infections can occur in hospitals resulting in high mortality (Tortura et al., 2001). The antimicrobial properties of plants have been investigated by a number of researchers world wide. The use of plants extracts with know antimicrobial properties, can be a great significance in therapeutic treatments (Dorman & Deans, 2000). In the present study, extracts of 5 plants were tested for antimicrobial activity against 17 microbial pathogens. Among them are included Staphylococcus aureus, a pyrogenic bacterium known to play a significant role in invasive skin diseases and the fugal pathogen Candida albicans, which causes serious opportunistic infection in patients infected with HIV virus (Totura et al. 2001). Of the plants studied, all of them showed antibacterial activity against at least one microorganism in the maximal concentration employed (5000 µg/ml) (table 3). Antibacterial screening reveals that out of the five examined extracts, three of them exhibited significant inhibitory effects. Qualea grandiflora, Virola surinamensis and Hancornia speciosa were the most promising plants. Different concentrations of these three plants were tested against Staphylococcus aureus, S. epidermides and Pseudomonas aeruginosa (Figure 1). We observed that the effective concentration inhibitory minimal was 625 µg/ml for Hancornia speciosa, 1250 µg/ml for Qualea grandiflora and variable for Virola surinamensis. From these results, it is evident that the Gram-positive microorganisms, i.e. Staphylococcus aureus and S. epidermides, are more sensitive to the plant extracts than the Gram-negative ones (E. coli and Pseudomonas aeruginosa). These findings are in agreement with other reports with other research (Mitscher et al. 1972; McCutheon et al. 1992). The antifungal activity was also evaluated from the species investigated, H. speciosa and Q. grandiflora presented significant activity against Trichosporum spp. and R. rubra, comparable to those of ketoconazol (Table 4). In comparison to extracts of Q. grandiflora and V. surinamensis, the ethanolic extracts of H. speciosa presented also moderate antifungal activity against C. guilliermondii,

4

Cephalosporium spp and A. flavus. The activity of the H. speciosa, Q. grandiflora and V. surinamensis provides preliminary scientific validation for the traditional medicinal use of this plants. Among the traditional use of this plants are as an antiseptic for application to infected wound and taken internally for inflammation (table 1) indicates that the use of traditional medicine as supported by the antimicrobial effect observed. In conclusion, the presented results indicated that ethanolic extracts of plants from the Tocantins State are active in either of the two assay systems used i.e., antifungal and antibacterial activities particularly against Gram-positive bacteria. The most promising plants are Qualea grandiflora and Hancornia speciosa. The phytoconstituents responsible for the antifungal and antibacterial activities not yet identified but we can supposed some hypothesis based on our phytochemical screening. Previous phytochemical screening in addition to ours chemical results on these plants has shown that contains tannins, flavonoids, steroids and triterpenoids. Previous investigations on plants utilized in folk medicine demonstrate that the antibacterial activity may attributable to tannins and flavonoids (Scalbert, 1991). Tannins are also known to exhibit significant antifungi properties (Simões et al., 1999). The ethanolic extracts were submitted to a chemical screening by thin-layer chromatography (TLC) (Table 2) and indicated the presence of great concentration of tannins, mainly in H. speciosa, V. surinamensis while Qualea species are known to contain flavonoids (Lopes et al., 1979; Correa et al., 1981). Works are currently being carried out on the isolation and quantification of the phytoconstituents in an effort to correlate antifungi and antibacterial activities with a particular chemical constituent in each of these plants.

5Table 1. Previously identified constituents and folk indication of medicinal plants from the Brazilian Cerrado flora.

Family, genus species, authority and popular name

Registration Part of plant used

Folk indication Chemical constituents

Euphorbiaceae Alchornea castaneifolia (Wild.) A. Juss.- “sarã”

TO4527 Whole plant Inflammation and ulcer -

Dilleniaceae Curatella americana Linn. –“lixeira”

TO1637 Stem bark Skin diseases and ulcers Flavonoids, phenolics, saponins, (El-Azizi et al., 1980) steroids, terpenoids and tannins (Correa, 1978; Pott & Pott, 1994)

Apocynaceae Hancornia speciosa Gomez – “mangaba”

TO4064 Stem bark Skin diseases

Flavonoids, tannins, steroids and triterpenoids (Honda et al., 1990)

Vochysiaceae Qualea grandiflora Mart.-“pau-terra”

TO4158 Stem bark Skin diseases and inflammatory processes

C-methyl phenolics and flavones (Correa et al., 1981; Lopes et al., 1979).

Myristicaceae Virola surinamensis (Rol.) Warb. – “mucuíba”

TO2781 Stem bark Inflammation and several types of cancer

Steroids, lignans, flavonoids and polyketide (Valderrama, 2000; Lopes et al., 1996; Barata et al., 1978)

Table 2. Phytochemical analyses of the ethanolic extracts from Medicinal Plants of Tocantins State, Brazil.

Plant species Alkaloids Anthraquinones Flavonoids Saponins, Triterpenes

Steroids

Tannins Phenolic compounds

Catechin Rutin Isoquercitrin Chlorogenic acid

Alchornea castaneifolia

- - ++ + + + + - + -

Curatella americana - - - + + + + - - -

Hancornia speciosa - - - + +++ + + - - ++

Qualea grandiflora - - - + + + + - - -

Virola surinamensis - - - - ++ + + - - -

+ : presence; - : absence.

6Table 3: Antibacterial activity of the ethanolic extract from A. castaneifolia, C. americana, H. speciosa, Q. grandiflora and V. surinamensis (5000 µg/mL).

Inhibition zone diameter (mm) Bacteria

Growth control of test strains

A. castaneifolia

C. americana H. speciosa Q. grandiflora V. surinamensis Choranphenicol (30 µg/ml)

E. coli (Gram -)

+ - - - - - 10

P. aeruginosa (Gram-)

+ - - 18 12 12 22

S. aureus (Gram+)

+ - 8 14 14 10 23

S. epidermidis (Gram +)

+ 12 - 15 17 10 16

Antimicrobial activity was determined from plate-hole diffusion assays. Numbers indicate the diameters of the zones of growth inhibition around the holes. A negative symbol indicates no inhibition. A zone of inhibition ≤ 7mm was considered positive. Table 4: Inhibition of growth of fungi by ethanolic extract from A. castaneifolia, C. americana, H. speciosa, Q. grandiflora and V. surinamensis (5000 µg/mL).

Inhibition zone diameter (mm) Fungi Growth control of test strains

A. castaneifolia C. americana H. speciosa Q. grandiflora V.surinamensis Ketoconazol (50 µg/mL)

A. flavus + - - 8 10 8 18 A. parasiticus + - - - - - 18 C. albicans + - - - - - 20 C. guilliermondii + - - 10 - - 18 C. tropicalis + - - - - - 20 Cephalosporium spp. + - - 7 - - 17 M. canis + - - - - - 22 M. gypseum + - - - - - 20 Penicillium spp. + - - - - - 20 R. rubra + - - 15 11 - 15 T. mentagrophytes + - - - - - 20 T. rubrum + - - - - - 18 Trichosporum spp. + - - 14 10 - 17 Antimicrobial activity was determined from plate-hole diffusion assays. Numbers indicate the diameters of the zones of growth inhibition around the holes. A negative symbol indicates no inhibition. A zone of inhibition ≤ 7mm was considered positive.

7 Figure 1: Inhibition of growth of bacteria by ethanolic extract from S.speciosa, Q. grandiflora and V. surinamensis.

5 0 0 0 2 5 0 0 1 2 5 0 6 2 5 5 0 0 0 2 5 0 0 1 2 5 0 6 2 5 5 0 0 0 2 5 0 0 1 2 5 0 6 2 5 3 00

5

10

15

20

25

ChoranphenicolV. surinamensisQ. grandifloraH. speciosa

inib

itio

n zo

ne d

iam

eter

(m

m)

Concentration of Ethanolic Extract (ug/ml)

P. aeruginosa

S. aureus

S. epidermidis

8

Figure 2: Inhibition of growth of fungi by ethanolic extract from S.speciosa and Q. grandiflora.

5000 2500 1250 625 5000 2500 1250 625 500

5

10

15

20

KetoconazolQ. grandifloraH. speciosa

inib

ition

zon

e di

amet

er (m

m)

Concentration of Ethanolic Extract (ug/ml)

A. flavus

C. guillermondii

R. rubra

Trichosporum spp.

9

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511

Phytochemical analysis and evaluation of the analgesic and antiedematogenic activities of four extracts of different polarities obtained from bark of Quassia amara L.

(Simaroubaceae) Toma, W.1, , Gracioso, J.S. 1, de Andrade, F.D.P. 2, Paula, A.C.B. 1, Almeida, A.B.A.1,

Hiruma-Lima, C.A.3, Vilegas, W.2 and Souza Brito, A.R.M. 1

1 Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas,SP, Brasil 2 Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP, Brasil. 3 Instituto de Biologia e Saúde Pública, Fundação Universidade do Tocantins, Porto Nacional, TO, Brasil. *Address for correspondence Fax (023)19.3289.3124 – E-mail [email protected] Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Caixa Postal 6109 – CEP 13.083-970 – Campinas, SP, Brazil.

Abstract Quassia amara L. is a small tree of Simaroubaceae family and is found in the

northern regions of Brazil. The folk medicine utilized widely the bark of Quassia amara for the treatment of several diseases among this the fever conditions. Moreover, the Food and Drug Administration (FDA) classified this plant as narcotic drug. Previous phytochemical analyses demonstrated the presence of numerous compounds, among these the indole alkaloids, triterpenes, steroids, and many bitter compounds known as quassinoids. In this study we evaluated the possible analgesic and anti-inflammatory activities of four extracts of different polarities from the bark of Quassia amara. When the extracts were administered by oral route, it was not observed significant results in the paw edema and hot plate test (p>0.05). However, when administered in the hot plate test by intraperitoneal route in three doses (100, 250 and 500 mg/kg), the hexane (HEX) extract showed an increase in the pain threshold (p<0.05). We performed the hot plate test with the pre-treatment with naloxone, a specific opioid antagonist to evaluate the possible involvement of this activity with the opioid or opioidergic system. The data showed that the analgesic effect of the hexane extract was reverted by previously administration of naloxone (p<0.05). These data showed that the active(s) antinociceptive principle(s) of Quassia amara are present mainly in the hexane extract and has a significant antinociceptive effect when assessed in these pain models. The mechanism underlying the analgesic effect seems to be related to interaction with the opioid or opioidergic system.

2

Introduction The use of plants as medicines is an ancient tradition, far older than the

contemporary sciences of medicine, pharmacology and chemistry. The World Health Organization has estimated that over 75% of the world’s population still relies on plant-derived medicines, usually obtained from traditional healers, for there basic health-care needs (Farnsworth, et al., 1985). The study of plants that traditionally had been used as pain killers is still a fruitful and logical research strategy in the search for new analgesic drugs (Elisabetsky et al., 1995)

The Simaroubaceae is a large botanical family with a pantropical distribution; only a few representatives occur in temperate regions (Polonsky & Yvette, 1971). Quassia amara L., popularly known in Latin American as “Amargo”, “Hombre Grande”, “Simaruba”, “Pau Quassia”, “Murubá”, “Murupá” and “Quina de Caiena”, is a small tree 2-6 m in height which occur in northern Brazil, Venezuela, Surinam, Colombia, Argentina, Panamá and Guiana. In Brazil, this species is cultivated from the border with Guiana to the state of Maranhão and its wood is reputed in traditional medicine as having antimicrobial, antianemic, cytotoxic and antimalarial activities (Rutter, 1990), as well as being useful for the treatment of digestive disorders (Corrêa, 1984). Duke (1992) showed that Quassia amara is classiffied by Food and Drug Administration (FDA) as a narcotic drug; it is included in the Generally Regarded as Safe (GRAS) item. Previous phytochemical analysis has identified numerous compounds from Quassia amara, including indole alkaloids, triterpenes, steroids and many bitter compounds known as quassinoids (Germonsén-Robineau, 1998).

Considering the use of this plant in Brazilian folk medicine and the numerous chemical substances identified from Quassia amara bark, we have evaluated the antinociceptive and anti-inflammatory effects of four bark extracts of different polarities using the hot-plate analgesic test and paw edema in mice. The possible mechanisms involved in the antinociceptive effect of this plant were investigated.

Material and methods Drugs and chemicals

Acetic acid (HOAc), hexane, methylene chloride, methanol, Diazald (Merck), Anisaldehyde (Merck), morphine hydrochloride, naloxone hydrochloride and indomethacin (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo) were used in this work. Fatty acid methyl esters (FAMES) were purchased from SIGMA. Quassine, chaparrinone, β-sitosterol, estigmasterol and campesterol were obtained from a collection of our laboratory. The solvents used for HPLC were of analytical grade from Mallinckrodt Baker S.A., Brazil.

Acetic acid, morphine and naloxone were dissolved in 0.9% NaCl solution just before use. Indomethacin was prepared in sodium bicarbonate (5%). The extracts were dissolved in 12% Tween 80. The reagents used were of analytical grade.

Equipments Nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were registered with an AC-200 Bruker equipment operating at 200 MHz for 1H. Samples were dissolved with CDCl3. TMS was used as internal standard.

High performance liquid cromatography coupled to electrospray mass spectrometry (HPLC-ES-MS) analyses were performed with a Shimadzu chromatograph equiped with an Rheo 400 (Flux Instruments) pump and coupled to a Fisons Platform Electrospray Spectrometer. Samples were dissolved in methanol and injected through a Rheodyne injector

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with a loop of 20 µL. Chromatographic conditions used were: column Phenomenex RP18, 25 cm x 4.6 mm i.d x 5 µm, methanol/water 1 mL/min. ES-MS were registered using scan mode, in the range between 50 to 1000 Da. Ionization was set at positive mode (+70V) and interface temperature was 70oC. Nitrogen gas was used both as a drying gas and for nebulization.

High performance liquid chromatography coupled to a diode array detector (HPLC-DAD) analyses were carried out using a Varian, ProStar HPLC system equipped with a Phenomenex RP-18 column (250 x 4.6 mm I.D., 5 µm) and a Rheodyne injector with a loop of 20 µL. Samples were dissolved with HPLC-grade methanol and filtered on a Millex filter of 0.45 µm. The mobile phase used was water-methanol (15:85) at a flow-rate of 1.0 mL/min, and the effluent was monitored using a ProStar 330 photodiodo-array ultra-violet (PAD-UV) detector monitoring at 330 nm.

Gas chromatography using flame ionization detector (GC-FID) analyses were performed in a CP 3380 Varian gas chromatograph equipped with a capillary fused silica LM-5 column (5% phenyl methylpolysiloxane, 15 m x 0.2 mm x film thickness 0.5 µm) and with a flame ionization detector (FID). H2 was used as carrier gas at flow rate 30 mL/min and the split ratio was 1:30. The injection temperature was 250 oC. Column temperature was programmed 150oC, linear increase 5oC/min until 280oC, held for 10 min. The detector temperature was 280oC. Samples were dissolved with HPLC-grade hexane and filtered through a Millex filter of 0.45 µm. The filtered solution (1 µL) was injected with a 10 µL Hamilton syringe and analysed by GC-FID with authentic standards.

Animals All experiments were performed on male Swiss mice (30 ± 5 g) obtained from the

Animal House (ANILAB) in Paulínia-SP. The animals were fed a certified Nuvilab CR-a (Nuvital) diet with free access to tap water and were housed on a 12 h light/dark cycle at a humidity of 50% and a temperature of 24 ± 1°C. All experiments were done in the morning. The experimental protocols were approved by the Animal Use and Care Committee at Unicamp and were conducted in accordance with the recommendations of the Canadian Council on Animal Care and with the ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals (Zimmerman, 1983).

Preparation of extracts The bark of Quassia amara L. was collected and identified by botanists from the

Enda Caribe Institute, Santo Domingo, Dominican Republic in May 1999, under registration number BP 165 F 97323. The dried bark (1 Kg) was powdered in a mill and extracted by maceration for one week with organic solvents of increasing polarity (hexane (HEX), methylene chloride (DCM), ethanol (EtOH) and 70% ethanol (70EtOH). After each extraction, the solutions were filtered over filter paper and the solvents were evaporated in a rotavapor at reduced pressure in order to separate the raw extract from the solvent.

Phytochemical analysis The extracts of Quassia amara bark were analyzed using thin-layer chromatography

TLC plates (0.1 mm thick, silica gel G Merck, Art. 7731) eluted with toluene-acetone-acetic acid (70:30:0.5, v/v/v) or n-butanol-acetic acid-water (BAW, 65:15:25, v/v/v) according to their polarities. The spots were identified under short wave UV light and plates were further sprayed with iodoplatinate, anisaldehyde-sulfuric acid reagents (Wagner et al, 1984) or revealed with resublimed iodine vapour.

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Crude HEX and DCM extracts were also analysed by HPLC-ES-MS. 20 mg of each extract were dissolved with methanol and filtered on a Millex filter of 0.45 µm. 20 µL of each extract were injected into the HPLC-ES-MS system (RP18, Phenomenex, 25 cm x 4.6 mm x 5 µm, 1 mL/min, ES positive mode +70V).

The HEX extract (200 mg) was fractionated on a silica gel CC (Merck, Art. XXXX, 10 cm x 2 cm i.d) eluted with 100 mL hexane (Fr.1, 35 mg), 100 mL hexane/EtOAc 9:1 (Fr.2, 10 mg), 100 mL hexane/EtOAc 7:3 (Fr. 3, 35 mg), 100 mL hexane/EtOAc 1:1 (Fr. 4, 12 mg), 100 mL EtOAc (Fr. 5, 20 mg) and 100 mL methanol (Fr.6, 65 mg). Solvents were evaporated under vacuum. Fractions were analysed by TLC. Only Fr. 1 (Rf 0.96), Fr. 3 (Rf. 0.44) and Fr. 6 (Rf 0.07) showed pronounced spots after being revealed. They were further analysed by 1H NMR, GC-FID and HPLC-DAD as mentioned before.

Pharmacological assays Hot-plate test The hot-plate test was used to measure the latency of response as described by Eddy

and Leimback (1953), with minor modifications. The temperature of the hot-plate (Ugo Basile, Models-DS 37) was maintained at 56 ± 1°C. The mice were placed in a 24 cm diameter glass cylinder on the heated surface and the time between placement and licking of the paws or jumping was recorded as the latency. Control mice were treated with vehicle (12% Tween 80, 10 ml/kg). Morphine was used as positive control (10 mg/kg, s.c.) and extracts 70% Ethanol, Ethanol, DCM and HEX extratcs were administered (100 and 250 mg/kg, p.o. and i.p.). All substances were administered 30 min before the start of the experiment. Mice were selected 24 h before the experiment on the basis of their reactivity in the test. All mice were observed before and 30, 60, 90, 120 and 240 min after drug administration. A latency of 30 s was defined as complete analgesia.

Carrageenan-induced paw edema This test was done essentially as described by Henriques et al. (1987), using male

mice. Indomethacin (30 mg/kg, s.c., positive control) or 70% ethanol, Ethanol, DCM and HEX extracts (100 and 250 mg/kg, p.o. and i.p.) were administered 30 min before the injection of 250 µg of carrageenan (1%, w/v, in saline solution) into the subplantar region of the right hindpaw. The paw volume was measured 4 h after carrageenan injection and the increase in weight caused by the irritant was calculated by subtracting the weight of the untreated left paw from that of the treated right paw.

Analysis of the analgesic mechanism of action of Quassia amara L. The possible participation of the opioid system in the antinociceptive effect of DCM

and HEX extracts from Quassia amara was investigated (Trentin et al., 1997) using the hot-plate test in mice, with the minor modifications. Animals were pre-treated with naloxone (5 mg/kg, i.p.) 15 min before the i.p. administration of the DCM or HEX extract (100 and 250 mg/kg, i.p.) and the subcutaneous administration of morphine (10 mg/kg, i.p.). Control animals received a similar volume of 12% Tween 80 (10 ml/kg i.p.).

Statistical analysis The results are presented as the mean ± standard error of the mean (SEM) and were

compared using analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnet’s pairwise test. P values less than 0.05 were considered significant.

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Results and Discussion Since the chemical isolation of morphine by Seturner in 1806 (Reisine & Pasternak,

1996), many analgesic compounds have been described in the literature. However, no new central or peripherical analgesic drugs have been discovered.

The classification of Quassia amara bark as a narcotic drug and the use of this bark to treat fever, suggests that this species may contain any or some analgesic and anti-inflammatory compounds.

The oral administration (100 mg/kg, 250 and 500 mg/kg) of 70% ethanol, ethanol, DCM and HEX extracts of Quassia amara bark did not significantly alter the basal responses (data not showed). Similarly, extracts given orally did not affect the carrageenan induced paw edema (data not showed). However, when these extracts were administered intraperitoneally in the hot plate test, the HEX extract showed significant activities in the three doses utilized.

Table 1 shows that the intraperitoneal administration (100 mg/kg) of the HEX extract raised the pain threshold after 90 min. Morphine, used as a reference drug, produced a significant antinociceptive effect at 30, 60, 90 and 120 min of observation. The hot-plate test is considered to be selective for opioid-like compounds in several animal species (Janssen et al., 1963).

When the intraperitoneal dose was increased to 250 mg/kg, once more the ethanolic and DCM extracts had no significant effect. In contrast, the HEX extract raised the pain thresholds to 90, 120 and 240 min after treatment. As expected, morphine showed a significant increase in latency after 30, 60, 90 and 120 min (table 2).

Table 3 demonstrated the analgesic activities of HEX extract in the hot-plate test. The dose of 500 mg/kg by intraperitoneal route showed that this extract raised the pain threshold 60, 90, 120 and 240 min after treatment.

These results demonstrated that the analgesic activity of HEX extract is dependent-dose.

The hot-plate test model was also used to study the anti-analgesic action of naloxone (5 mg/kg) given intraperitoneally 15 min before morphine and HEX extract (100, 250 and 500 mg/kg). The results showed a significant reversion of the analgesic effects by morphine and the extracts in the three doses. Since naloxone, a classic morphine receptor antagonist (Gracioso et al., 1998), modified the analgesic effects induced by the HEX extract, the action of the latter probably results either from a central action on opioid receptors or on the release of endogenous opioid substances (Hiruma-Lima et al., 2000)

Chemical analyses of the extracts of Quassia amara barks were done using chromatographic and spectrometric techniques (see Experimental).

TLC analyses of the HEX and DCM extracts showed strong spots with Rf values of 0.96 and 0.44 and an additional weak spot with Rf 0.07. EtOH and 70EtOH extracts presented only a single spot with Rf 0.07 at the conditions used. These results suggest that the apolar substances present both in the HEX and in the DCM extracts correspond to the substances responsible for the analgesic activity. This hypothesis is reinforced since these apolar substances seem to be more concentrated in the HEX extract than in the DCM extract. Furthermore, ethanolic extracts, which have only more polar substances, showed no analgesic activity in any of the experiments. Alkaloids were detected only in trace amounts by the iodoplatinate reagent (Wagner et al, 1984). Therefore, we have examined the HEX and DCM extracts more deeply, in order to identify their chemical constituents.

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The HPLC-ES-MS analyses were performed for crude HEX and DCM extracts. Peaks were observed for both samples at Rt 6.16 min (Chaparrinone, [M+H]+ 379), 9.31 min (Neoquassin, [M+H]+ 389) and 9.73 min (Quassin, [M+H]+ 391). From these bitter principles, quassin was the most proeminent peak. More apolar substances did not elute from the column at the conditions employed in the HPLC-ES-MS analyses. Since HEX and DCM extracts have shown similar chromatographic pattern, we have fractionated the HEX extracts by silica gel CC for obtaining the apolar compounds.

TLC analyses of the eluted substances led to the recognition of three group of substances with Rf values close to those mentioned before. Fr. 1 (Rf 0.96) was analysed by GC-FID with authentic standards affording a mixture of β-sitosterol, estigmasterol and campesterol. Fr. 2 (Rf 0.44) was methylated with an etherial solution of diazomethane. Release of N2 was observed, confirming the efectiveness of the reaction. Moreover, TLC analyses showed a spot with a higher Rf value (0.80). The ether was evaporated and the methylated sample was analysed by GC-FID with authentic standards of FAMES. The major compounds were identified as the methyl esters of the corresponding palmitoleic acid (C16:1) and oleic acid (C18:1). Minor compounds were also detected as methyl esters of miristoleic acid (C14:1), cis-10-pentadecanoic acid (C15:1), C17:1, linoleic acid (C18:2), tricosanoic acid (C30:0) and C24:1. Fr. 6 (Rf 0.07) was analysed by HPLC-DAD using the conditions previously mentioned. Quassin was identified by comparison with authentic sample.

Since morphine is an alkaloid (Christup, 1997), it is reasonable to suppose that the indole alkaloids detected above may be responsible for the central analgesic effect of the bark extract. Moreover, Duke (1992), related that the bitter principle quassin was used to treatment of alcoholism, with pharmacological properties similar to the disulfiram. Marchand & coworkers showed that disulfiram reduces levels of P substance. This substance was a first neuropeptide discovered by Von Euler & Gaddun in 1931 (Hang et al., 1997).

It is well known that in the pain process occur the release of neuropeptides included P substance. Theses compounds acts in the dorsal horn promoting the transmission of pain. Since quassin showed pharmacological properties similar to the disulfiram, this bitter principle can help in the analgesic mechanism promoting the reduction of the P substance release in the dorsal horn (Hang et al., 1997).

Folk medicine uses a tea or infusion of Quassia amara to treat painful conditions. However, the negative results obtained with the extracts administered orally contradict popular belief. Morphine given orally is extensively absorbed in the stomach, has little effect by this route compared to parenteral administration, mainly because of first passage metabolism (Christup, 1997). It is possible that the extracts also undergo such metabolism when administered orally. Differences in pharmacokinetic parameters such as absorption and metabolism between humans and rodents must also be borne in mind (Alexandre-Moreira et al., 1999). In addition, infusions are used repeatedly over weeks or months, whereas the animal experiments above were performed with a single dose of the extracts. These considerations, taken alone or together, could explain the lack of effect when the extracts were administered orally.

In conclusion, we have demonstrated a central analgesic activity in nonpolar extract (HEX) of Quassia amara bark administered intraperitoneally. These results confirm the traditional uses of this plant and its classification as a narcotic drug by FDA. The

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mechanism involved in these effects apparently is related with opioids or the opioidergic system and substances responsible for this activity are probably steroids or alkaloids.

Acknowledgements We thank Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) for

fundings to W.V. and fellowships to W.T. and F.D.P.A. and to Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico Tecnológico (CNPq) for a gant to W.V. Table 1: Effects of the HEX extracts of Q. amara bark (100 mg/kg, i.p.) in mice submitted to the hot plate test.a.

Observation time (min) Latency (s) Control (i.p.) Morphine (s.c.) HEX

0 2.5 ± 0.1 2.7 ± 0.1 3.2 ± 0.2 30 3.2 ± 0.2 8.5 ± 1.8 ** 4.1 ± 0.3 60 3.8 ± 0.2 12.6 ± 0.9 ** 6.4 ± 0.8 90 4.5 ± 0.3 10.8 ± 1.1 ** 8.4 ± 0.8 **

120 5.7 ± 0.4 10.1 ± 1.5 ** 7.3 ± 0.6 240 3.7 ± 0.2 4.6 ± 0.5 5.1 ± 0.5

aEach value is the mean ± SEM for eight mice. ANOVA F(5,42) 30 min = 5.429; 60 min = 18.115; 90 min = 10.154; 120 min = 4.055 p<0.05; Dunnet`s test, *p<0.05, **p<0.001, compared to the respective control value. Table 2: Effects of the HEX extracts of Q. amara bark (250 mg/kg, i.p.) in mice submitted to the hot plate test.a.


0 3.3 ± 0.1 3.4 ± 0.2 3.1 ± 0.1 30 3.8 ± 0.3 4.8 ± 0.4 * 3.7 ± 0.2 60 4.0 ± 0.3 7.4 ± 0.9 ** 4.7 ± 0.3 90 4.6 ± 0.3 9.4 ± 1.0 ** 7.7 ± 1.2 *

120 4.7 ± 0.5 11.0 ± 1.0 ** 7.3 ± 1.0 * 240 5.0 ± 0.3 5.5 ± 0.8 8.8 ± 2.0 *

aEach value is the mean ± SEM for eight mice. ANOVA F(5,42) 30 min = 3.314; 60 min = 6.120; 90 min = 7.785; 120 min = 13.079 p<0.05; Dunnet`s test, *p<0.05, **p<0.001, compared to the respective control value.

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Table 3: Effects of the HEX extracts of Q. amara bark (500 mg/kg, i.p.) in mice submitted to the hot plate test.a.


0 6.4 ± 0.6 7.1 ± 0.6 6.8 ± 0.7 30 6.3 ± 0.7 9.5 ± 0.7 * 6.1 ± 0.8 60 6.7 ± 0.6 10.1 ± 0.6 ** 8.8 ± 0.6 * 90 6.9 ± 0.4 10.6 ± 0.4 ** 8.3 ± 0.5 *

120 6.5 ± 0.5 9.2 ± 0.5 ** 8.1 ± 0.5 * 240 6.7 ± 0.6 7.2 ± 0.6 8.7 ± 0.7 *

aEach value is the mean ± SEM for nine-ten mice. ANOVA F(2,26) 30 min = 6.85; 60 min = 7.96; 90 min = 19.04; 120 min = 8.61, 240 min = 2.61 p<0.05; Dunnet`s test, *p<0.05, **p<0.001, compared to the respective control value. Table 4: Effects of HEX extract (100, 250, 500 mg/kg, i.p.) of Q. amara bark in mice pre-treated with naloxone (5 mg/kg, i.p.) in the hot plate testª

Observation time

Latency (s)

(min) Control (i.p.) Morphine (s.c.) HEX 100 (i.p.) HEX 250 (i.p.) HEX 500 (i.p.) 0 3.2 ± 0.1 3.4 ± 0.1 3.6 ± 0.2 3.3 ± 0.2 3.3 ± 0.2

30 4.4 ± 0.2 4.8 ± 0.2 4.3 ± 0.3 4.5 ± 0.3 4.2 ± 0.3 60 4.6 ± 0.3 5.3 ± 0.3 4.7 ± 0.4 5.1 ± 0.4 5.1 ± 0.4 90 4.6. ± 0.3 4.9 ± 0.3 5.2 ± 0.4 4.4 ± 0.4 4.4 ± 0.4 120 4.3 ± 0.3 5.1 ± 0.3 5.2 ± 0.4 3.8 ± 0.4 4.0 ± 0.4 240 5.4 ± 0.4 5.4 ± 0.4 5.1 ± 0.6 5.9 ± 0.6 5.7 ± 0.6 aEach value is the mean ± SEM for eight-sixteen mice. ANOVA F(4,51) 0 min = 1.005; 30 min = 1.19; 60 min = 1.069; 90 min = 0.815; 120 min = 3.223; 240 min = 0.290 p<0.05; Dunnet`s test, compared to the respective control value. References Alexandre-Moreira, M.S.; Piuvezan, M.R.; Araújo, C.C.and Thomas, G. (1999). Studies on the anti-inflammatory and analgesic activity of Curatella americana L. J. Ethnopharmacol. 67, 171-177. Christrup, L.L. (1997). Morphine metabolites. Acta Anaesthesiol. Scand., 41: 116-122. Corrêa, M.P. (1984). Dicionário das Plantas Úteis do Brasil e das Exóticas Cultivadas. Ed. Imprensa Nacional. R.J.. Vol. V, p. 556. Duke, J. (1992). Handbook of Phytochemical Constituents of Gras Herbs and Other Economic Plants. Boca Raton, Florida: CRS Press, 654 pp. Eddy, N.B. and Leimback, D. (1953). Synthetic analgesics II. Dithienylbutenyl and dithienylbutylamines. J. Pharmacol. Exp. Ther., 107: 385-393. Elisabetsky, E.; Amodor, T.A.; Albuquerque, R.R.; Nunes, D.S.and Carvalho, A.C.T., (1995). Analgesic activity Psychotria colorata (Wild. ex R & S.) Muell. Arg. alkaloids. J. Ethnopharmacol., 48, 77-83.

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Regular Article

Antiulcerogenic activity of four extracts obtained from bark wood of Quassia

amara L. (Simaroubaceae)

Walber Toma1, Juliano de Souza Gracioso1, Fábio D. P. de Andrade 2, Clélia Akiko

Hiruma-Lima3 , Wagner Vilegas2 and Alba Regina Monteiro Souza Brito* 1

1 Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual

de Campinas (Unicamp), Campinas,SP, Brazil

2 Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual

Paulista, Araraquara, SP, Brazil.

3 Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, ,

Botucatu, SP, Brazil

*Address for correspondence

Fax ++55 19 3788 6185 – E-mail [email protected]

Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP), Caixa Postal 6109 – CEP 13.083-970

Campinas, SP, Brazil.

2

Abstract

Quassia amara L., is a neotropical forest shrub or small tree of the

Simaroubaceae family. The bark of this plant is widely used in Caribbean folk medicine

and in some northern states of Brazil for the treatment of gastric ulcers. This plant is a

source of numerous compounds including both β-carbonile and cantin-6 alkaloids as

well as, primarily, the bitter components known as quassinoids. We analyzed possible

antiulcerogenic activities of four extracts of different polarities (70% ethanol (EtOH),

100% EtOH, 100% dichloromethane (DCM), and 100% hexane (HEX)) obtained from

Quassia amara bark. All extracts, administered at doses of 5000 mg/kg by oral route

and 1000 mg/kg by intraperitoneal route, caused none of toxicity and death).

All extracts, administered orally at doses of 5000 mg/kg by and 1000 mg/kg

intraperitoneally, caused neither toxicity nor death. In the standard models of induced

gastric ulcer, all extracts showed significant activities (p<0.05) when administered

orally at a dose of 100 mg/kg, compared with the respective control. In the

indomethacin / bethanechol-induced gastric ulcer, 70% EtOH, 100% EtOH, DCM and

HEX extract inhibited the gastric ulcer (22.5, 23.4, 50.5 and 46.8%, respectively). 70%

EtOH, 100% EtOH, DCM, and HEX extracts reduced the gastric injury induced by

hypothermic restraint-stress in mice (70.7, 80, 60 and 82.7%, respectively). In the

pylorus ligature of the mouse stomach, the pre-treatment with a single intraduodenal

administration of 100 mg/kg of each extract, only 70% EtOH did not change

biochemical parameters of gastric juice. 100% EtOH, DCM and HEX extracts presented

decreased gastric juice content, increased pH values and decreased acid output. We also

determined the antiulcerogenic activity on the HCl-EtOH-induced gastric ulcer in mice

at four doses (25, 50, 75 and 100 mg/kg) administered by oral route, evaluated the

possible dose-dependent relation and calculated the ED50 values. Except for 70% EtOH

3

at a dose of 25 mg/kg, the others extracts showed significantly activity (p<0.05). The

free mucous amount in the gastric stomach content was also evaluated. All extracts

showed significant increases (p<0.05) of free mucous. This effect was abolished when

the animals were pre-treated with indomethacin. Prostaglandin synthesis was evaluated

by the administration of HEX extracts by oral route (100 mg/kg). In the animals pre-

treated orally with this extract, prostaglandin synthesis was increased significantly by

52.3% (p<0.05) and this effect was abolished with the previous administration of the

indomethacin. We concluded that Quassia amara is a probable source of a new drug for

the treatment of gastric ulcers and the mechanism with this activity is concerned with

cytoprotective factors such as mucous and prostaglandins but there is still the possibility

that antisecretory activity is involved with the antiulcerogenic effect.

Key words: Quassia amara; phytochemical analysis, antiulcerogenic activity

Introduction

Gastric ulcer is one of the most important diseases in the world. The gastric

mucosa is continuously exposed to potentially injurious agents such as acid, pepsin, bile

4

acids, food ingredients, bacterial products, and drugs 1). These agents have been

implicated in the pathogeneses of gastric ulcer such as an increase in gastric acid and

pepsin secretion, a decrease in gastric blood flow, suppression of endogenous

generation of prostaglandins, inhibition of mucosal growth and cell proliferation, and

alteration of gastric mobility 2).

The current therapy for this disease continues to have, as one of its major goals,

control of Helicobacter pylori as well as H+/K+-ATPase, acid secretion and a subsequent

reversal of mucosal damage and inflammation 3).

Many pharmaceutical products have been employed for the treatment of

gastroduodenal ulcer and peptic disease, and decreasing mortality and morbidity rates,

but they are not completely effective and produce many adverse effects. Moreover,

these pharmaceutical products are too expensive 4). Plant extracts are some of the most

attractive sources of new drugs and have been shown to produce promising results for

the treatment of gastric ulcer 5).

The Simaroubaceae is a large botanical family with a pantropical distribution;

only a few representatives occur in temperate regions. Quassia amara L., a

representative of this family, is a neotropical forest shrub or small tree reputed in

traditional medicine to be efficacious against stomach diseases, especially the gastric

ulcer. In Brazil, this specie is found in a region from the border with Guiana to the state

of Maranhão, and is popularly known in Latin American as “Amargo”, “Hombre

Grande”, “Simaruba”, “Pau Quassia”, “Murubá”, “Murupá” and “Quina de Caiena” 6).

This plant is a source of several compounds which include both β-carbonile and

cantin-6 alkaloids as well as, primarily, the bitter components known as quassinoids, a

group of substances belonging to the terpens class. Antimalarial, antifeedant and

antifertility pharmacological activities are atributted to these quassinoids 7).

5

In considering the use of this plant in Brazilian folk medicine and the several

chemical substances isolated and identified from Quassia amara bark, we have

performed the study of antiulcerogenic effects for four different extracts of this specie

using the standard rodent models of induced gastric ulcer.

Material and methods

Drugs and chemicals

Bethanechol, hydrochloric acid, cimetidine, Diazald, ethanol, hexane,

indomethacin, lansoprazole, methanol and dichloromethane (Sigma Chemical Co., St

Louis, Mo) were used in this study. Indomethacin was prepared in sodium bicarbonate

(5%) and extracts dissolved in 12% Tween 80. All substances were prepared

immediately before use. The reagents used were of analytical grade.

Animals

All experiments were performed on male Swiss mice (30 ± 5 g) obtained from

the Animal House (CEMIB-UNICAMP) in Campinas, SP. The animals were fed a

certified Nuvilab CR-a (Nuvital) diet with free access to tap water and were housed on

a 12h light/dark cycle at a humidity of 50% and a temperature of 24 ± 1°C. All

experiments were done in the morning. The experimental protocols were approved by

the Animal Use and Care Committee of Unicamp. All of the experiments were

conducted in accordance with the recommendations of the Canadian Council on Animal

Care 8).

6

Extract Preparation

The bark of Quassia amara L. was collected and identified by botanists from the

Enda Caribe Institute, Santo Domingo, Dominican Republic (Exsicata 2114, RD,

84374). The dried bark (5 kg) was powdered in a mill and extracted by maceration for

one week with the following organic solvents of increasing polarity: HEX, DCM,

100% EtOH and 70% EtOH. After each extraction, the solutions were filtered through

filter paper and the solvents were evaporated in a rotavapor at reduced pressure in order

to separate the raw extract from the solvent. Extractions afforded 8.0 g of HEX, 19.5 g

of DCM, 52.5 g of 100% EtOH and 93.5 g of 70% EtOH extracts.

Phytochemical analysis

The Quassia amara extracts were analyzed using thin-layer chromatography

(TLC) plates (0.1 mm thick, silica gel G Merck, Art. 7731) eluted with toluene-acetone-

acetic acid (70:30:0.5, v/v/v) or n-butanol acetic-acid water (BAW, 65:15:25, v/v/v)

according to their polarities. The spots were identified under short-wave UV light and

plates were sprayed further with iodoplatinate and anisaldehyde-sulfuric-acid reagents

or developed with resublimated iodine vapor.

These extracts were also analyzed by HPLC-ES-MS. Twenty mg of each extract

were dissolved with methanol and filtered through a 0.45 µm Millex filter. Twenty µL

of each extract were injected into the HPLC-ES-MS system (RP18, Phenomenex, 25 cm

x 4.6 mm x 5 µm, 1 mL/min, ES positive mode +70V).

Pharmacological assays

Nonsteroidal antiilflammatory drug (NSAID)-induced gastric ulcers in

cholinomimetic-treated mice

7

The experiment was performed by the method of Rainsford, 1978 9). In this

model, gastric ulcer was induced using indomethacin (30 mg/kg, s.c.) and bethanechol

(5 mg/kg, i.p.) administered to mice after a 24h fast. The extracts 70% EtOH, 100%

EtOH, DCM and HEX from Quassia amara (100 mg/kg), cimetidine (100 mg/kg) or

Tween were administered orally 30 min before the induction of gastric ulcer. The

animals were killed by cervical dislocation 4 h after the treatment with the ulcerogenic

agents; the stomachs were removed and inflated with 4 % formalin in buffered saline;

and the gastric damage was determined by the methodology of Szelenyi and Thiemer,

197810).

Hypothermic restrain-stress ulcer

The experiment was performed by the method of Levine (1971)11), with some

modifications. After 24 h of starvation, the animals received an oral administration of

70% EtOH, 100% EtOH, DCM and HEX extracts from Quassia amara (100 mg/kg),

cimetidine (100 mg/kg) or Tween (10 ml/kg). One hour after treatment, mice were

immobilized in a restraint cage at 4° C for 3 h to induce gastric ulcer. The animals were

killed and the stomachs removed and opened along the greater curvature to determine

the lesion index.

Determination of Gastric Secretion

The assay was performed by the method of Shay (1945)12) with a few

modifications. All groups of mice fasted for 24 h, with free access to water.

Immediately after pylorus ligature, 70% EtOH, 100% EtOH, DCM and HEX extracts

from Quassia amara (100 mg/kg), cimetidine (100 mg/kg) as positive control, or the

vehicle, Tween, were administered intraduodenally. The animals were killed 4 h later

8

by cervical dislocation; the abdomen was opened and another ligature was placed

around the esophagus, close to the diaphragm. The stomachs were removed and the

gastric content collected to determine the total amount of gastric-juice acid (ml) and pH

values. Distilled water (5 ml) was added and the resultant solution centrifuged at 3000

rpm for 10 min. Total acid in the gastric secretion was determined in the supernatant

volume by titration to pH 7.0 with 0.01 N NaOH.

HCl/ethanol-induced ulcer

The antiulcerogenic activity of the four extracts obtained from Quassia amara in

this model was assessed in mice, as described by Mizui and Doteuchi (1983) 13). Mice

were divided into 6 groups which fasted for 24 h prior to oral dosing with the vehicle,

12% Tween 80 (10 ml/kg), lansoprazole (30 mg/kg), 70% EtOH, 100% EtOH, DCM

and HEX (25, 50, 75 and 100 mg/kg). Fifty min after the treatments, all animals

received orally 0.2 ml of a 0.3 M HCl/60% EtOH solution. Animals were killed 1 h

after the administration of HC l/ EtOH solution; the stomachs were excised, inflated by

a injection of saline (2 ml) and opened along the greater curvature. Then the stomachs

were fixed in 5 % formalin for 30 min and the ulcerative lesion index (ULI) was

calculated. The ED50 values were also calculated by linear regression.

Determination of Mucous in Gastric Content

This assay was performed according to the methodology described previously by

Sun et al.,199114) with some modifications. Mice fasted for 24 h, under anesthesia, the

abdomen incised and the pylorus ligated. The 70% EtOH, 100% EtOH, DCM and HEX

extracts (100 mg/kg bodywet (kg)) of Quassia amara or vehicle were administered

intraduodenally after the pylorus ligature. The animals were killed by cervical

9

dislocation 4 h after the drug treatments. The stomach content was immersed in 10 ml

0.02% alcian blue in 0.16 M sucrose / 0.05 M sodium acetate, pH 5.8, and incubated for

24 h at 20° C. The alcian blue binding extract was centrifuged at 3000 rpm for 10 min.

The absorbance of supernatant was measured at 615 nm using a light spectrophotometer

U/2000 (Hitachi, Japan). The free mucous in the gastric content was calculated from the

amount of alcian blue binding (mg/wet tissue (g)).

Determination of Prostaglandin Synthesis

The assay was performed by the method of Curtis et al., 199515). Thirty minutes

after treatment with vehicle, vehicle plus indomethacin (20 mg/kg, s.c.), HEX (100

mg/kg), p.o.) and HEX plus indomethacin, the rats were killed by cervical dislocation

and the abdomen opened. The Sham group without treatment experienced the general

conditions of the experimental group. Samples of the corpus (full thickness) were

excised, weighed and suspended in 1 ml of 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4.

The tissue was minced finely with scissors, then incubated at 37° C for 20 min..

Prostaglandin in the buffer was measured using the enzyme immunoassay (RPN222-

Amersham).

Statistical analysis

The results are presented as the mean ± standard error of the mean (SEM) and

were compared with using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by

Dunnet’s pairwise test. P values less than 0.05 were significantly considered.

10

Results and Discussion

Traditionally, medicinal plants have been used in folk medicine throughout the

world to treat various diseases, especially for the gastric ulcer. There are several types

of experimental models for evaluating anti-ulcer drugs.

We evaluated the preventive effects of 70% EtOH, 100% EtOH, DCM and HEX

extracts obtained from Quassia amara bark in mice using the different standard

experimental models of induced gastric ulcer.

It is established that suppression of prostaglandin synthesis by NSAIDs such as

indomethacin results in increased susceptibility of mucosal injury and causes

gastroduodenal ulcerations16). The co-administration of cholinomimethic agents, such as

bethanechol, promotes a synergism with NSAIDs in the gastric lesion induced by

increased secretion of acid and pepsin in the stomach17).

The antiulcerogenic effect of these extracts in NSAID / Cholinomimetic-induced

lesion model (Table 1), mainly the DCM and HEX, demonstrated significantly reduced

damage of these gastric lesions (p<0.05) compared with the respective control and

suggested the probable involvement of these extracts with the cytoprotective mechanism

by increasing mucous and/or prostaglandin synthesis.

Gastric stress ulceration is a serious complication which may occur in patients

with burns, surgery or central-nervous-system trauma. Stress-induced ulcers are

probably mediated by histamine release with enhancement in acid secretion and a

reduction in mucous production. Moreover vagal over-activity has been suggested as

being the principal factor in stress-induced ulceration2).

In the gastric ulcer induced by hypothermic-restraint stress, again all the extracts

showed significantly activity (p<0.05) and the obtained inhibitions index for extracts

were more effective than those obtained for the positive control, cimetidine (70.7, 80,

11

60 and 82.7, respectively), considering the fact that both extracts and cimetidine were

used at same dose, 100 mg/kg p.o., (Table 1). Antisecretory mechanisms, such as

reduced histamine secretion and increased mucous synthesis are responsible for this

activity.

In the next step we showed the biochemical effects of Quassia amara extracts on

gastric-juice parameters obtained after submitting the mice to pylorus ligature using all

of the treatments, extracts and positive and negative control administered

intraduodenally (Table 2). We observed that 100% EtOH, DCM and HEX, as well as

the cimetidine positive control, significantly decreased the gastric acid secretion

(p<0.05), increased the pH values and promoted reduced acid output. The 70% EtOH

did not show significant results in the parameters evaluated.

Robert et al., 196718), showed that prostaglandins of E series (PGE2) inhibit

gastric acid secretion in dogs and rats. Subsequent studies confirmed this inhibitory

effect of PGE 2 and its analogs in both monkeys and man. In addition, PGI2, PGF2α, and

their analogs, were shown to have a similar acid-suppressant properties16). Probably, the

activities exhibited by these extracts are responsible for the synthesis of mucous,

phospholipd, bicarbonate and prostaglandins, consequently promoting inhibition of

gastric-acid secretion. Moreover, it is important to remember that the compound(s)

present in the extracts of Quassia amara by the intraduodenal administration were

absorbed and then arrived at the stomach to promote effects.

Considering the efficacy of these extracts led us to perform another HCl-EtOH-

induced gastric-ulcer experiment using four dose levels (25, 50, 75 and 100 mg/kg) for

each extract, all of them administered orally. In this experiment we tried to establish the

ED50 value for each extract and a possible dose-dependent relation of the obtained

effect. As shown in Table 3, only 70% EtOH at a dose of 25 mg/kg was not significant

12

in the inhibition of gastric ulcer. The 70% EtOH, 100% EtOH and HEX were dose-

dependent (p<0.05) and the ED50 values were respectively 7.0, 7.2 and 5.3 mg/kg.

The balance of defensive and aggressive factors is thought to be important in

maintaining gastric mucosal integrity19). The formation of gastric mucosal lesions by

necrotizing agents such as HCl and EtOH has been reported to involve depression of

these gastric defensive mechanisms20). HCl-EtOH-induced gastric ulcer also promotes

the stasis in gastric blood flow which contributes to development of the hemorrhagic

and necrotic aspects of tissue injury2).

It has been found that EtOH-induced ulcer is not inhibited by antisecretory

agents such as cimetidine, but is inhibited by agents that enhance mucosal defensive

factors such as prostaglandin21). These results show that Quassia amara extracts have an

antiulcerogenic effect related to cytoprotection activity.

In looking for a possible mechanism for the increase in mucosal protective

factors, we also investigated the free mucous production after administration of the 70%

EtOH, 100% EtOH, DCM and HEX extracts (100 mg/kg), p.o.), and prostaglandin

synthesis with HEX extract of Quassia amara.

We observed that all of the extracts significantly increased the “free” mucous in

the gastric juice (14.8, 14.3, 27.1 and 52.4%, respectively) (Table 4). When

indomethacin was subcutaneously administered 30 min before treatments with the

extracts or controls, the increase of this mucous was halted. As shown in Table 5, HEX

extract increased the synthesis of prostaglandin levels (52.3%). It was not significantly

different from the Sham group and negative control.

Several compounds such as β-carbonile alkaloids, indole alkaloids and steroids

are presented in the extracts obtained from Quassia amara22); moreover the bitter

principles quassinoids are the most interesting group of substances present in these

13

extracts. Our phytochemical analyses by TLC and HPLC-ES-MS confirmed the

presence of these quassinoids (mainly quassin and neoquassin ) in all of the extracts

(data not showed).

These quassinoids probably are responsible for the observed antiulcerogenic

activity. Raji and Bolarinwa, 199723) showed that orally administered quassin reduced

the plasma level of testosterone hormone and consequently promoted antifertility

actions in animals. Aston et al., 199124) showed that sexual hormones such as

testosterone, when exogenously administered, aggravated the gastroduodenal ulcer

induced by cysteamine in rats. In addition, Adeniyi 199125) observed that in

orcdoctemized rats, with testosterone synthesis inhibited, a reduction of gastric-acid

secretion occurred compared with that of normal rats. Montoneri & Drago, 199726), in

contrast, showed that the elevation of endogenous progesterone levels and the

administration of exogenous progesterone increased the layer of mucous in the stomach

and duodenum, and protected the cysteamine-induced ulcer.

Besides, there are many works relating exogenous testosterone with an

improvement in the ability to increase the number of receptors of endogenous

vasopressin, an important aggressive factor of gastrointestinal mucosa27,28), while

orcdectomy decreases these receptors as well as the vasopressin levels in the plasma29).

It is probable that quassinoids (quassin and neoquassin) are the compounds responsible

for antiulcerogenic activities exhibited in all of the performed experiments.

We conclude that 70% EtOH, 100% EtOH, DCM and HEX extracts obtained

from Quassia amara provide an excellent preventive effect for the gastric ulcer models.

The main compounds are the quassinoids – and the mechanism of this effect probably is

related to prostaglandins and mucous synthesis. However, the antisecretory mechanism

is still possibility in this activity. The fact that low doses obtain the best effects, with no

14

toxicity at a dose of 5000 mg/kg, is crucial, demonstrating the high efficacy and security

of these extracts.

Acknowledgements

We thanks Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

for a grant to W.T., A.R.M.S and W.V. (process n° 99/00290-0).

15

Table 1: Effects of Quassia amara extracts and cimetidine on Indomethacin/bethanecol

and hypothermic restrain stress induced gastric ulcer on mice.

Gastric lesion models Treatments

(p.o.)

Dose

(mg/kg)

N Ulcerative Index

(mm)

Inhibition

(%)

Indomethacin/Bethanechol Control - 8 11.1 ± 2.6 -

Cimetidine 100 8 4.8 ± 2.1 *** 56.8

70% EtOH 100 8 8.6 ± 2.3 * 22.5

100% EtOH 100 8 8.5 ± 1.5 * 23.4

DCM 100 8 5.5 ± 1.6 *** 50.5

HEX 100 6 5.9 ± 1.7 *** 46.8

Stress Control - 6 7.5 ± 1.2 -

Cimetidine 100 6 3.3 ± 1.6 *** 57.3

70% EtOH 100 6 2.2 ± 0.8 *** 70.7

100% EtOH 100 6 1.5 ± 0.8 ** 80.0

DCM 100 6 3.0 ± 1.1 *** 60.0

HEX 100 6 1.3 ± 0.5 ** 82.7

ANOVA: F(5,42) = 11.739 (p<0.05) for indomethacin/bethanecol and F(5,.30) = 27.097

(p<0.05) for hypothermic restrain stress model. Dunnett’s test : * p<0.05, **p<0.01,

***p<0.0001

16

Table 2: Effects of Quassia amara extracts and cimetidine administered

intraduodenally (i.d.) on the biochemical parameters of gastric juice obtained from

pylorus-ligature mice.

Treatments

(i.d.)

Dose

(mg/kg)

N PH

(Units)

Volume Gastric juice

(ml)

Total gastric acid

(µµEq/4h)

Control - 20 3.1 ± 1.0 469.5 ± 230.9 11.2 ± 3.9

Cimetidine 100 15 5.8 ± 1.1 *** 257.8 ± 150.9 ** 7.5 ± 5.4 **

70% EtOH 100 18 3.8 ± 1.4 454.6 ± 227.6 8.7 ± 3.4

100% EtOH 100 18 4.8 ± 1.4 *** 302.0 ± 134.0 * 7.0 ± 3.3 **

DCM 100 17 4.7 ± 1.7 ** 300.6 ± 225.6 * 7.8 ± 3.2 *

HEX 100 18 5.0 ± 1.5 *** 292.2 ± 175.2 * 6.5 ± 2.8 ***

ANOVA: F(5.100) = 9.036 (p<0.05) for pH; 3.895 (p<0.05) for gastric juice and 3.920

(p<0.05) for total acid. Dunnett s Test: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.0001

17

Table 3: Effects of Quassia amara extracts and lansoprazole on HCl/EtOH-induced

gastric ulcer in mice.

Treatments

(p.o.)

Dose

(mg/kg)

N Ulcerative Index

(mm)

Inhibition

(%)

R ED50

(mg/kg)

P

Control - 8 35.4 ± 5.2 - - - -

Lansoprazole 30 8 7.4 ± 1.1 *** 79.1 - - -

70% EtOH 25 8 33.3 ± 6.6 5.9

50 8 26.5 ± 4.4 *** 25.1 ** 0.98 7.0 ** 0.003

75 8 16.4 ± 2.9 *** 53.7

100 8 12.6 ± 2.1 *** 64.4

100% EtOH 25 8 22.8 ± 2.7 *** 35.6

50 8 16.8 ± 3.1 *** 52.5 * 0.92 7.2 * 0.03

75 8 15.0 ± 1.7 *** 57.6

100 8 12.1 ± 4.2 *** 65.8

DCM 25 8 16.1 ± 1.6 *** 54.5

50 8 16.0 ± 2.8 *** 54.8 0.50 - 0.4

75 8 5.6 ± 2.0 *** 83.8 - - -

100 8 5.6 ± 2.0 *** 83.8 - - -

HEX 25 8 13.5 ± 3.0 *** 61.9

50 8 13.6 ± 1.7 *** 61.6 * 0.92 5.3 * 0.03

75 8 6.0 ± 2.1 *** 83.1

100 8 2.5 ± 1.9 *** 92.9

ANOVA: F values: F(17,126) = 54.470 (p<0.05). Dunnett s Test: *p<0.05; **p<0.01;

***p<0.0001

18

Table 4: Effect of Quassia amara extracts and administered by intraduodenal route on

alcian blue binding to free gastric mucous from pylorus-ligated mice.

Treatments Dose

(mg/kg)

N Alcian blue

bound

[mg/wet tissue (g)]

Alcian blue

bound

(%)

Sham - 6 2.1 ± 0.1 -

Sham + indomethacin 10 ml/kg + 30 6 2.0 ± 0.1 * -4.8

Tween 10 ml/kg 6 2.1 ± 0.09 -

Tween + indomethacin 10 ml/kg + 30 6 2.0 ± 0.1 -4.8

70% EtOH 100 6 2.4 ± 0.07 * 14.8

70% EtOH + indomethacin 100 + 30 6 2.1 ± 0.1 -

100% EtOH 100 6 2.4 ± 0.08 * 14.3

100% EtOH + indomethacin 100 + 30 6 2.0 ± 0.06 -

DCM 100 6 2.7 ± 0.4 *** 27.1

DCM + indomethacin 100 + 30 6 1.9 ± 0.2 *** -9.5

HEX 100 6 3.2 ± 0.4 *** 52.4

HEX + indomethacin 100 + 30 6 2.0 ± 0.1 -

ANOVA following F values: F(11,60) = 20.748 (p<0.05) for alcian blue bound. Dunnett s

Test: *p<0.05; ***p<0.0001

19

Table 5: Effects of HEX extract from Quassia amara on prostaglandin synthesis by the

gastric mucosa of rats.

Treatments Dose

(mg/kg)

N Prostaglandin synthesis

(pg/mg)

Increase

(%)

Sham - 6 133.0 ± 16.4 -

Tween (p.o.) 10 ml/kg 6 140.3 ± 29.2 5.5

Tween (p.o.) + indomethacin (s.c.) 10 ml/kg + 30 6 45.3 ± 19.6 *** -65.9

HEX (p.o.) 100 6 202.5 ± 63 ** 52.3

HEX (p.o.) + indomethacin (s.c.) 100 + 30 6 33.3 ± 21.1 *** -75.0

ANOVA following F values: F(4,25) = 25.4 (p<0.05) . Dunnett s Test: *p<0.05;

**p<0.01; ***p<0.0001.

20

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tese - fabio andrade

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