tese de doutorado · 2006. 5. 10. · tese apresentada à faculdade de medicina da universidade de...

Denis Pajecki

Estudo da redução de nitrato e da produção de

compostos N-nitrosos na luz esofágica, mediadas por

bactérias, em pacientes portadores de megaesôfago

não avançado

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências

Área de concentração: Cirurgia do Aparelho

Digestivo

Orientador: Prof. Dr. Bruno Zilberstein

Co-orientador: Prof. Dr. Ivan Cecconello

São Paulo

2005

Para Adriana, Daniel e Alan

Para Sima e Paulo

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Bruno Zilberstein, meu mestre, orientador e amigo, pela

confiança e incentivo que me motivaram, nos últimos quinze anos, a chegar

até aqui.

Ao Prof. Dr. Ivan Cecconello, chefe do Serviço de Cirurgia do

Esôfago, co-orientador desta tese, incentivador de primeira hora desta

pesquisa.

Ao Prof. Dr. Joaquim Gama-Rodrigues, Professor Titular da Disciplina

de Cirurgia do Aparelho Digestivo, pelo incentivo e oportunidade de

crescimento pessoal e profissional que dá a todos os pós-graduandos da

disciplina.

Ao Prof. Dr. Wilson Jacob Filho, que mais uma vez abriu espaço no

Hospital-Dia do Hospital das Clínicas para realização das coletas.

Ao Prof. Dr. Francisco Laurindo, chefe do Laboratório de Biologia

Vascular do InCor, por ter me ajudado na requisição de recursos para a

pesquisa e por ter aberto as portas do laboratório para sua execução.

À Sra. Laura Brandise, química do Laboratório de Biologia Vascular,

que me ajudou na dosagem de nitrito e nitrato.

Ao Prof. Dr. Manoel Armando dos Santos, do Laboratório de

Microbactérias do Instituto de Ciências Biomédicas da USP, amigo e

parceiro científico, responsável pelo estudo microbiológico.

Ao acadêmico do 5º ano, Samuel Terra Gallafrio, que me ajudou na

coleta e transporte de materiais e na montagem da aula.

Ao Prof. Dr. Henrique Walter Pinotti, com quem aprendi a gostar da

esofagologia, e que acompanhou, sempre com interesse, em nossos

encontros casuais, o desenvolvimento desta pesquisa.

À Sra. Mercedes Araújo, minha secretária, que segurou todos os

rojões enquanto eu me dediquei a esta tese.

Às secretárias da pós-graduação da disciplina de Cirurgia do Aparelho

Digestivo, Vilma de Jesus Liberio, Fabiana Renata Soares Bispo e Myrtes

Freire de Lima, por serem sempre prestativas e por me orientarem pelos

caminhos burocráticos da pós-graduação.

À FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo, pelo financiamento desta pesquisa.

SUMÁRIO

Resumo

Summary

1 Introdução........................................................................................

01

2 Objetivo............................................................................................

13

3 Casuística e método........................................................................

15

3.1. Casuística....................................................................................

16

3.1.1 Critérios de inclusão..................................................................

17

3.1.2 Critérios de exclusão.................................................................

18

3.2 Método..........................................................................................

19

3.2.1 Preparo do paciente...................................................................

20

3.2.2 Material......................................................................................

20

3.2.3 Coleta de saliva.........................................................................

21

3.2.4 Coleta de amostra esofágica.....................................................

22

3.2.5 Estudo endoscópico do esôfago................................................

24

3.2.6 Transporte e armazenamento das amostras.............................

24

3.2.7 Dosagem de nitrito e nitrato...................................................... 25

3.2.8 Pesquisa de nitrosaminas..........................................................

27

3.2.9 Estudo microbiológico................................................................

30

3.2.10 Método estatístico....................................................................

31

4 Resultados.......................................................................................

32

4.1 Nitrato na saliva............................................................................

33

4.2 Nitrito na saliva.............................................................................

34

4.3 Nitrato no esôfago.........................................................................

36

4.4 Nitrito no esôfago..........................................................................

37

4.5 Nível de redução da concentração de nitrato e nitrito entre a

saliva e o esôfago, no GC e GM............................................................

38

4.6 Pesquisa de nitrosaminas.............................................................

40

4.7 Estudo microbiológico de bactérias redutoras de nitrato..............

41

5 Discussão.........................................................................................

43

5.1 Bactérias redutoras no esôfago....................................................

44

5.2 Nitrato na saliva............................................................................

46

5.3 Nitrito na saliva..............................................................................

50

5.4 Nitrato no esôfago.........................................................................

53

5.5 Nitrito no esôfago..........................................................................

55

5.6 Compostos N-nitrosos no esôfago................................................

57

5.7 Perspectivas..................................................................................

61

5.7.1 Estudo da formação de NO e estresse oxidativo no

megaesôfago..........................................................................................

61

5.7.2 Estudo da suscetibilidade às nitrosaminas................................

63

6 Conclusões......................................................................................

64

7 Referências bibliográficas................................................................

65

Apêndice

Resumo

Pajecki D. Estudo da redução de nitrato e da produção de compostos N-nitrosos na luz esofágica, mediadas por bactérias, em pacientes portadores de megaesôfago não avançado [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2005. 87p.

Pacientes com megaesôfago chagásico têm risco aumentado de desenvolvimento de carcinoma espinocelular do esôfago. O mecanismo fisiopatológico de desenvolvimento dessa neoplasia está relacionado com a ocorrência de processo inflamatório crônico da mucosa, devido à irritação causada pelo conteúdo esofágico estagnado em contato contínuo com ela. No líquido de estase ocorre supercrescimento de bactérias aeróbias e anaeróbias provenientes da cavidade oral e deglutidas com a saliva, havendo entre elas algumas espécies com capacidade redutora de nitrato. O nitrato reduzido se transforma em nitrito que, ao reagir com as aminas provenientes da dieta, forma nitrosaminas, que são substâncias algumas delas com reconhecida ação carcinogênica esofágica. Nesse sentido, o objetivo deste estudo foi analisar o aumento da concentração de nitrito e a presença de compostos N-nitrosos (nitrosaminas) na luz esofágica de pacientes portadores de megaesôfago não avançado, em comparação com indivíduos sem afecção esofágica, correlacionando os achados com a presença ou não de bactérias redutoras de nitrato. Foram estudados quinze pacientes portadores de megaesôfago não avançado de etiologia chagásica, denominados de Grupo Megaesôfago (GM), e quinze pacientes sem afecção esofágica, denominados de Grupo Controle (GC). Foram feitas coletas de saliva para dosagem de nitrito e nitrato e coleta de líquido de estase esofágica para dosagem de nitrito e nitrato, pesquisa de nitrosaminas e estudo microbiológico para identificação de bactérias redutoras de nitrato. Os dois grupos foram equivalentes quanto à concentração de nitrato e nitrito na saliva. Foram equivalentes quanto à concentração de nitrato no esôfago, mas houve diferença significante na concentração de nitrito, que foi maior no GM. A concentração de bactérias redutoras de nitrato foi significativamente maior no GM. Foram identificadas nitrosaminas em três pacientes do GM e em nenhum do GC, sem diferença significante. Conclui-se que no GM existe aumento da concentração de bactérias redutoras de nitrato, causando aumento da concentração de nitrito e, eventualmente, a formação de nitrosaminas.

Descritores: nitrato reductases/análise, compostos nitrosos/análise, acalasia esofágica/microbiologia, doença de Chagas/etiologia

Summary

Pajecki D. Nitrate, nitrite, volatile nitrosamines and reductive bacteria in Chagasic megaesophagus [thesis]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2005. 87p.

Patients with Chagasic megaesophagus have an elevated risk of developing spin-cell carcinoma of the esophagus. The phisiopathologic mechanism of this cancer development is related to the chronic inflammation of the esophageal mucousa due to the retention of swallowed food and saliva. In this environment, the overgrowth of aerobic and anaerobic bacteria from the mouth, swallowed with saliva, is observed, and some of them have the capacity of reducing nitrate. The reduced nitrate is turned into nitrite and the late reacts with amines to form nitrosamines, which are substances with proven role in esophageal carcinogenesis. Thus, the aim of this study was to evaluate the concentration of nitrite, the presence of volatile nitrosamines and the concentration of reductive bacteria in the esophageal lumen of patients with non advanced Chagasic megaesophagus and in a group of patients without any esophageal disease. Fifteen patients with non-advanced megaesophagus (MG) and fifteen patients without any esophageal disease (CG) were studied. Saliva samples were taken for nitrate and nitrite quantitative determination and esophageal stasis liquid samples were taken for nitrate and nitrite quantitative determination, volatile nitrosamines qualitative determination and reductive bacteria quantitative determination. MG and CG were equivalent in nitrate and nitrite saliva concentration. They were also equivalent in nitrate esophageal concentration but significant difference was found in nitrite and reductive bacteria concentration, both higher in MG. Volatile nitrosamines were identified in three MG patients and in none of the CG patients but this was not significant. We conclude that in MG there is a higher concentration of reductive bacteria that is responsible for the rising in nitrite concentration at the esophageal lumen and, eventually, for the formation of volatile nitrosamines.

Key words: nitrate reductases/analysis, nitroso compounds/analysis, esophageal achalasia/microbiology, Chagas desease/etiology

1

Introdução

1 Introdução - 2

No megaesôfago existe acentuada diminuição dos plexos nervosos

intramurais de sua musculatura lisa, com as conseqüentes alterações

motoras caracterizadas por falta de peristaltismo e acalasia do esfíncter

inferior do esôfago (Koberle, 1957). Essas alterações levam, em última

análise, à dilatação progressiva da víscera e à estase alimentar e salivar de

longa duração.

Entre as suas complicações mais temidas está a neoplasia do

esôfago (carcinoma espinocelular), relatada pela primeira vez em 1872 por

Fagge em exame de autópsia. Entretanto, foi apenas a partir da segunda

metade do século XX que a literatura enfatizou a importância do

megaesôfago, seja de etiologia chagásica ou idiopática, como afecção

predisponente ao câncer do esôfago (Câmara Lopes, 1961; Belsey, 1966;

Lotart-Jacob et al.,1969; Pierce et al., 1970; Pinotti et al., 1980; Sonnenberg

et al., 1993; Sandler et al.,1995). Estudos mais antigos (Rake, 1931)

revelavam altas prevalências (de 20 a 25%), mas em trabalhos mais

recentes, considerando casuísticas mais numerosas, observam-se índices

entre 2,0 e 8,6% (Belsey, 1966; Lotart-Jacob et al., 1969; Bolívar-

Herendeen, 1970; Norton et al., 1980; Pinotti et al., 1980; Streitz et al.,

1995). Em casuística do Serviço de Cirurgia do Esôfago do Hospital das

1 Introdução - 3

Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP)

verificou-se a prevalência de 2,8% (Pinotti et al., 1994).

Em relação à incidência risco de pacientes com megaesôfago, sem

neoplasia, desenvolverem carcinoma num período determinado de tempo ,

constata-se que para cada 100.000 pacientes/ano a variação é de zero a

344 e que, portanto, o risco relativo desses doentes apresentarem

carcinoma é de zero a 33 vezes maior que o da população em geral

(Wychulis et al., 1971; Chuong et al., 1984; Peracchia et al., 1991, Aggestrup

et al., 1992; Meijssen et al., 1992, Streitz et al., 1995). Muitos autores

relatam, ainda, a ocorrência de carcinoma mesmo após a terapêutica

conservadora em geral, dilatação pneumática ou hidrostática da cárdia, ou

cirurgia, esofagocardiomiectomia e fundoplicatura , apesar do alívio da

disfagia que proporciona (Belsey, 1966; Lotart-Jacob et al., 1969, Wychulis

et al., 1971; Pinotti et al., 1980; Peracchia et al., 1991, Pinotti et al., 1994).

O mecanismo fisiopatológico de desenvolvimento dessa neoplasia

está relacionado com a ocorrência de processo inflamatório crônico do

epitélio, devido à irritação causada pelo conteúdo esofágico estagnado, em

contato contínuo com a mucosa, criando condições favoráveis para a

gênese do câncer (Câmara Lopes, 1961; Pinotti et al., 1980; Pinotti et al.,

1994). Segundo outros autores, o supercrescimento bacteriano nesse meio

teria também papel importante na promoção do processo inflamatório e na

fisiopatologia da afecção (Loviscek et al., 1998). O câncer se instala com

maior freqüência em esôfagos ectasiados com longa história de disfagia, em

média de 15 a 20 anos (Norton et al., 1980; Aggestrup et al., 1992, Streitz et

1 Introdução - 4

al., 1995), fato que corrobora a relação entre sua ocorrência e o processo

inflamatório crônico decorrente de estase.

A esofagite é considerada por muitos autores como lesão precursora

do câncer do esôfago (Munõz et al., 1987; Jacob et al., 1993) e, no

megaesôfago, o processo inflamatório é difuso por toda a superfície mucosa

esofágica, caracterizado por hiperplasia da camada basal, infiltrado

linfocitário em lâmina própria e pela presença de centros germinativos

proeminentes (Zucoloto; Rezende, 1990). A ocorrência de esofagite é mais

freqüente nas formas mais avançadas da doença, nos grupos III e IV de

Rezende (1960), quando comparadas com os grupos I e II, não sendo

influenciada pelo fato de ter sido o paciente tratado conservadoramente ou

não (Goldblum et al., 1994, Yamamuro et. Al., 1998). A presença de

esofagite é, portanto, própria da afecção.

A esofagite está associada à replicação celular aumentada, facilitando

a expressão de qualquer influência mutagênica que possa desempenhar

papel na carcinogênese (Chang-Claude et al., 1990). Quando as alterações

histológicas já descritas para esofagite se somam à atipia nuclear,

caracterizada por aumento do tamanho do núcleo, núcleo hipercromático e

aumento da atividade mitótica, estabelece-se a lesão chamada de displasia

ou neoplasia intra-epitelial (Watanabe et al., 1990). A neoplasia intra-epitelial

pode ser classificada como grau I, II ou III, de acordo com a espessura do

epitélio em que essas alterações são observadas, recebendo o nome de

carcinoma in situ quando todo o epitélio está acometido, preservando a

camada basal (Mandard et al., 1984). Uma vez que a esofagite é difusa em

1 Introdução - 5

toda a luz do órgão, essas alterações podem ocorrer em qualquer ponto da

superfície mucosa. Nesse sentido, a busca ativa por neoplasias ainda em

estágio precoce tornou-se obrigatória na avaliação desses pacientes, sendo

realizada por meio da cromoscopia com lugol (Carter-Brewer,1975; Sano et

al., 1978; Makuuchi et al., 1991). Em casuística do Serviço de Cirurgia do

Esôfago do Hospital das Clínicas da FMUSP, 17% dos pacientes tinham

áreas não coradas ou hipocoradas e desses, 10% tinham neoplasia intra-

epitelial (Yamamuro et al., 1999). Por sua vez, a análise histopatológica

detalhada da superfície mucosa em produtos de esofagectomia subtotal por

megaesôfago revelou, mesmo em áreas coradas com lugol, casos de

carcinoma in situ e neoplasia intra-epitelial de graus I, II e III, mostrando,

assim, que a mucosa no megaesôfago pode ser considerada como tendo

propensão para malignidade (Yamamuro et al., 1998).

A carcinogênese esofágica é um processo de múltiplas fases nas

quais ocorrem alterações genéticas específicas. Uma dessas alterações é a

hiperexpressão e mutação do gene p53, localizado no cromossomo 17p13.1

(Miller et al., 1986; Hollstein et al., 1991; Levine et al., 1991; Greenblatt et al.,

1994). Alterações do p53 foram demonstradas em até 80% dos tumores

esofágicos e parecem ocorrer precocemente no processo de carcinogênese,

estando envolvidas na seqüência displasia carcinoma do carcinoma

espinocelular (Casson et al., 1991; Tamura et al., 1992; Lerbah et al., 2004).

Seguindo essa linha e procurando um marcador que pudesse predizer com

precisão o risco individual de desenvolvimento do câncer, Safatle-Ribeiro et

al. (2000) mostraram, em fragmentos de mucosa esofágica obtidos por

1 Introdução - 6

biópsia endoscópica de pacientes portadores de megaesôfago chagásico

avançado, o aumento da expressão de p53 em 43,7%. Houve correlação

estatística positiva entre a intensidade da inflamação e a alteração genética.

A presença de mutação do gene p53, por sua vez, foi observada em 1 a

cada 16 pacientes (6,2%), em prevalência semelhante à observada para o

câncer no megaesôfago. Por outro lado, mutações do gene p53, em

particular as do tipo transição, podem ser causadas diretamente por agentes

alquilantes com ação carcinogênica como os compostos N-nitrosos, de

reconhecido papel na carcinogênese esofágica (Lijinski et al.,1968; Dallinga

et al., 1998; Putz et al., 2002; Araya et al., 2003; Ribeiro-Pinto et al., 2003;

Drablos et al., 2004). Os compostos N-nitrosos definem-se quimicamente por

apresentarem o grupo funcional N-N=O em comum, podendo ser divididos

em dois grupos: as nitrosaminas e as nitrosamidas. As nitrosaminas são

substâncias estáveis, encontradas com freqüência na natureza,

principalmente nos alimentos. Por outro lado, as nitrosamidas são

compostos extremamente instáveis, dependentes principalmente do pH.

Sofrem redução em pH acima de 2 e praticamente não existem em pH acima

de 7. Isso explica a dificuldade para encontrá-las na natureza em condições

normais (Hotchkiss et al., 1987).

A relação entre dieta rica em nitrosaminas e pobre em agentes

antioxidantes (betacaroteno, vitamina C e vitamina E) e o carcinoma

espinocelular (CEC) do esôfago já foi demonstrada em diversos estudos

epidemiológicos em populações de risco (De Jong et al., 1974; Cheng et al.,

1982; Li et al., 1989; Wang et al., 1992; Stemmermann et al., 1994; Cheng,

1 Introdução - 7

1994). Os pacientes portadores de megaesôfago, principalmente na forma

avançada, freqüentemente desenvolvem desnutrição e carência desses

elementos considerados protetores, o que também pode contribuir para o

desenvolvimento da neoplasia (Correa, 1982; Safatle-Ribeiro et al., 2000).

As nitrosaminas também podem ter origem endógena, resultante da

reação in vivo de agentes nitrosantes e aminas ingeridas, chamada

nitrosação (Vermeer et al., 1998; Dallinga et al., 1998; Moriya et al., 2002;

Susuki et al., 2003; Lin et al., 2003). Esses agentes são os sais de nitrito e

nitrato, tanto sódico como potássico, usados por séculos como conservantes

para carnes, aves e peixes. Na realidade, os nitratos são adicionados, como

fonte de nitrito que é a substância ativa, aos produtos a serem conservados.

Essa transformação é mediada por ação bacteriana (Binked,1975). O nitrato

pode servir como fonte de nitrito por longos períodos de tempo. Essa

substância teria como funções básicas: manter viva a cor vermelha,

resultando em aspecto de carne fresca, evitar a formação de ranço e inibir o

crescimento do Clostridium botulinum (Cassens, 1995; Andrade, 2004).

Outras fontes de nitrato habitualmente ingeridas são a água, hortaliças, trigo

(pães) e cerveja (Lakritz et al., 1982; Preussmann; Eisinbrand, 1984; Van

Maanen et al., 1996).

A carcinogênese esofágica induzida por nitrosaminas já foi

demonstrada em diversos estudos experimentais, principalmente em ratos,

que ingeriam soluções contendo concentrações definidas de determinadas

nitrosaminas (Clapp; Graig, 1967; Reuber, 1975, 1977; Rubio et al., 1982;

Kruel, 1992; Sallet et al., 2002). Kuroka et al. (1998) demonstraram,

1 Introdução - 8

entretanto, que ratos portadores de acalasia eram mais sensíveis à indução

tumoral por N-Amyl-N-methylnitrosamina quando comparados com ratos

sem acalasia, provavelmente pelo maior tempo de exposição da mucosa

esofágica à droga.

A partir dessas considerações, surge uma pergunta: haveria alguma

relação entre a predisposição ao câncer no megaesôfago e a ação de

compostos N-nitrosos em contato prolongado com a mucosa, devido à

estase? Embora essa hipótese já tenha sido levantada anteriormente por

outros autores, nunca foi comprovada. No entanto, um fato chamou a

atenção: realizando estudo descritivo da microbiota esofágica em pacientes

portadores de megaesôfago (Pajecki et al, 2002), percebeu-se alta

concentração de microrganismos que tinham como característica comum a

capacidade de redução de nitrato (Tabelas 1 e 2).

1 Introdução - 9

Tabela 1

Microbiota no megaesôfago: prevalência (%) e concentração (UFC/ml) de microrganismos (n=15) (Pajecki et al., 2002)

Microrganismos Prevalência Concentração

Streptococcus sp 93,3% 101 a 105

Staphylococcus sp 46,6% 101 a 105

Corynebacterium sp 53,3% 101 a 104

Enterococcus sp 33,3% 102 a 105

Klebsiella sp 6,6% 101

Veillonella sp 73,3% 101 a 105

Peptococcus sp 40,0% 101 a 104

Peptostreptococcus sp 33,3% 101 a 102

Lactobacillus sp 26,6% 101 a 104

Bacillus sp 6,6% 102

Clostridium sp 6,6% 101

Bacteroides sp 6,6% 102

Propionibacterium sp 20,0% 101 a 103

Candida sp 13,3% 103 a 104

Tabela 2 Prevalência (%) e concentração (UFC/ml) de bactérias redutoras de nitrato no megaesôfago (n=15) (Pajecki et al., 2002)

Microrganismos Prevalência Concentração

Staphylococcus sp 46,6% 101 a 105

Corynebacterium sp 53,3% 101 a 104

Veillonella sp 73,3% 101 a 105

Peptococcus sp 40,0% 101 a 104

Há muito tempo já se supunha que essas bactérias poderiam estar

envolvidas na formação endógena de compostos N-nitrosos e associadas à

1 Introdução - 10

carcinogênese em diferentes sistemas (Hill, 1980). A ação redutora de

nitratos por bactérias foi posteriormente demonstrada por Calmels et al.

(1988), que identificaram a enzima nitrato redutase bacteriana. Essas

bactérias, que fazem parte da microbiota normal, estão presentes na boca

de todos os indivíduos (Tabela 3), reduzindo o nitrato (ingerido, absorvido no

trato gastrintestinal proximal e depois secretado na saliva) na fração de

aproximadamente 25% (Tenovuo, 1986; Bjorne et al., 2004).

Tabela 3

Microbiota da cavidade oral em indivíduos saudáveis: prevalência (%) de microrganismos e bactérias redutoras de nitrato (Souza JAU, 2001)

Microrganismo Saliva Língua Subgengival Supragengival

Actinomyces sp 40 30 30 20

Candida sp 20 30 10 0

Corynebacterium sp 70 40 20 20

Escherichia coli sp 10 20 20 0

Fusobacterium sp 60 0 40 0

Lactobacillus sp 90 50 30 0

Neisseria sp 0 40 0 0

Peptostreptococcus sp 70 50 50 20

Propionibacterium sp 20 30 60 30

Staphylococcus sp 50 30 10 10

Streptococcus sp ( ) 100 90 90 80

Streptococcus sp ( ) 20 10 0 10

Veillonella sp 100 60 80 70

1 Introdução - 11

Por sua vez, a microbiota bucal em indivíduos com má higiene oral e

mau estado de conservação dos dentes sofre alterações. Nessas situações

ocorre aumento da flora bacteriana redutora de nitrato, favorecendo a

formação de nitrito na saliva e facilitando a nitrosação de aminas da dieta

(Shapiro et al., 1991; Tricker et al., 1992; Van Maanen et al., 1998). Essas

condições estão também relacionadas com a incidência aumentada do CEC

esofágico, cavidade oral e orofaringe (Nagy et al., 1998, Ribeiro Jr et al.,

1996). No esôfago normal essas bactérias não são encontradas, ou o são

em concentrações muito baixas (Gagliardi et al., 1998). No entanto, em

situações de estase esofágica (acalasia, estenose, neoplasia), ocorre

proliferação dessa flora, identificada em aspirados da luz ou em fragmentos

de biópsia (Lau et al., 1981; Finlay et al., 1982; Pajecki et al., 2002).

No mesmo sentido, alterações da microbiota que levam à redução de

uma quantidade maior de nitratos a nitritos favorecem a formação de

compostos N-nitrosos, o que já foi demonstrado em estudos clínicos e

experimentais em situações de acloridria, nas quais as bactérias da boca,

deglutidas, não são destruídas pelo ácido clorídrico do estômago, como era

de se esperar numa situação normal, e lá proliferam (Stockbrugger et al.,

1982; Marchesini, 1990; Camels et al., 1991; Andreollo, 1994; Verdu et al.,

1994; Guadagni et al., 1996; Camels et al., 1996). Fein et al. (2000) apontam

também esse problema em modelo experimental de adenocarcinoma

esofágico por refluxo biliar, no qual há alteração da microbiota ao nível da

transição esofagogástrica, induzida pela presença de bile. Osias et al. (2004)

observaram número aumentado de colônias de bactérias redutoras em

1 Introdução - 12

biópsias de mucosa de esôfago de Barrett e traçaram possível associação

entre sua presença e a ocorrência de metaplasia e displasia nesse epitélio.

Com base no exposto, formulou-se a seguinte hipótese: no

megaesôfago, a estase luminal causa supercrescimento bacteriano,

aumento da reação de redução de nitrato, aumento da concentração de

nitrito na luz, facilitando a formação de compostos N-nitrosos. Dessa forma,

a reação de nitrosação ocorreria no líquido de estase presente na luz

esofágica. Nessa reação, a velocidade de formação de nitrosaminas é

dependente da concentração de nitritos e aminas (Sclaan, 1983).

2

Objetivo

2 Objetivo -14

O objetivo deste estudo foi analisar a formação de nitrito e a produção

de compostos N-nitrosos (nitrosaminas) na luz esofágica de pacientes

portadores de megaesôfago não avançado, em comparação com indivíduos

sem afecção esofágica, correlacionando os achados com a presença ou não

de bactérias redutoras de nitrato.

3

Casuística e método

3 Casuística e método - 16

3.1 Casuística

Foram estudados prospectivamente 42 pacientes no período de

agosto de 2003 a setembro de 2004. Esses pacientes eram provenientes do

ambulatório do Serviço de Cirurgia do Esôfago do Hospital das Clínicas, da

Disciplina de Cirurgia do Aparelho Digestivo do Departamento de

Gastroenterologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo,

e de outros ambulatórios do mesmo hospital. Todos os pacientes que

participaram da pesquisa assinaram o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido (Apêndice A), após explicação minuciosa e clara do

procedimento de coleta e seus riscos. Esse termo foi aprovado, sob o

número 776/02, junto com o protocolo de pesquisa em si, pela Comissão de

Ética para Análise de Projetos de Pesquisa CAPPesq da Diretoria Clínica

do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São

Paulo (Apêndice B).

A idade variou de 19 a 74 anos com média de 47,8 anos. Vinte e

quatro pacientes (57,1%) eram do sexo masculino e dezoito (42,9%), do

sexo feminino. Os pacientes foram divididos em dois grupos: um grupo de 22

pacientes portadores de megaesôfago (Apêndice C), chamado Grupo


Megaesôfago (GM), e um grupo de 20 pacientes sem megaesôfago

(Apêndice D), chamado Grupo Controle (GC). Os pacientes do GM foram

numerados de 1 a 22, seguidos os números da letra m (de 1m a 22m). Os

pacientes do GC foram numerados de 1 a 20, seguidos os números da letra

c (de 1c a 20c).

3.1.1 Critérios de inclusão

Os pacientes do Grupo Megaesôfago (GM) foram diagnosticados e

incluídos segundo os seguintes critérios:

história clínica com presença de disfagia e regurgitação;

sorologia positiva para doença de Chagas por pelo menos dois

métodos (hemaglutinação indireta, enzima imunoensaio ou

imunofluorescência indireta);

estudo radiológico contrastado do esôfago, estômago e duodeno

com presença de dilatação do órgão, estase, afilamento gradual

e regular da transição esofagogástrica e/ou ausência de bolha de

ar no fundo gástrico. Baseados nesses critérios, foram

selecionados apenas pacientes que se incluíam na classificação

de Rezende (1960) como grau II (de pequeno a moderado

aumento de diâmetro, apreciável retenção do meio de contraste,

ondas terciárias) ou grau III (grande aumento de diâmetro,


atividade motora reduzida, grande retenção do meio de

contraste);

estudo manométrico das pressões intra-esofágicas com presença

de acalasia, aperistalse, ondas iterativas e espontâneas,

complexos de baixa amplitude e de longa duração.

Os pacientes do Grupo Controle (GC) foram incluídos segundo os

seguintes critérios:

pacientes com queixas dispéticas que tinham sido encaminhados

por seus médicos para realização de endoscopia digestiva alta.

3.1.2 Critérios de exclusão

Foram adotados como critérios de exclusão para os dois grupos a

presença de morbidades associadas que poderiam ser causa eventual de

mudanças da microbiota normal da boca e orofaringe ou que tivessem outro

fator de risco de desenvolvimento de CEC esofágico:

diabéticos;

etilistas crônicos;

tabagistas;

portadores de neoplasias associadas;

pacientes que haviam recebido antibióticos nos últimos três

meses.


Foram adotados como critérios de exclusão apenas para o Grupo

Megaesôfago:

megaesôfago grau IV pela classificação de Rezende (1960) ou

avançado, segundo critério manométrico, devido à grande

quantidade de resíduos sólidos na luz esofágica, dificultando a

coleta e aumentando o risco do procedimento;

pacientes com operação prévia para tratamento do megaesôfago;

pacientes em uso de sonda nasoenteral para alimentação.

Foram adotados como critérios de exclusão para o Grupo Controle:

presença de sintomas de refluxo gastroesofágico ou outra

esofagopatia;

portadores de alterações endoscópicas esofagogástricas.

3.2 Método

O método de estudo consistiu na dosagem das concentrações de

nitrato e nitrito na saliva e no esôfago dos pacientes do GM e do GC e na

pesquisa da presença de compostos N-nitrosos e de bactérias redutoras de

nitrato na luz esofágica nos dois grupos.


3.2.1 Preparo do paciente

A coleta de amostras foi realizada no Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, nas dependências do

Hospital-Dia.

Os pacientes eram externos (não internados) e foram preparados da

seguinte forma:

jejum de 12 horas;

anestesia tópica da orofaringe com lidocaína spray a 10%;

sedação com diazepan, 3 a 5 mg, e/ou cloridrato de petidina, 30

a 50 mg, por via endovenosa, nos pacientes do GC.

A seqüência de procedimentos para obtenção de amostras foi a

seguinte: coleta de saliva, coleta de amostra de líquido de estase esofágico

ou de lavado esofágico.

3.2.2 Material

O seguinte material foi utilizado para coleta de amostras:

campo estéril;

placa de Petri pequena;

sonda de entubação orotraqueal de 7,5 mm;


sonda de Levine no 14;

seringa descartável de 20 ml;

par de luvas estéril;

tubo de ensaio contendo 9 ml de solução pré-reduzida de tampão

fosfatado;

tubos de Ependorf contendo 0,1 ml de solução de NaOH 1M;

tubo de ensaio contendo 0,5 ml de solução de tampão borato;

garrafa térmica contendo nitrogênio líquido para transporte de

amostras;

geladeira de isopor pequena com gelo para transporte de

amostras.

3.2.3 Coleta de saliva

Foram coletados, em placa de Petri, 4 ml de saliva estimulada pela

realização de movimentos bucais envolvendo os músculos mastigatórios

(Figura 1). Em seguida, a saliva foi aspirada com seringa e duas alíquotas,

de 2 ml cada uma, foram colocadas em dois tubos de Ependorf contendo 0,1

ml de solução de NaOH 1M, para dosagem de nitrito e nitrato. Os tubos de

Ependorf foram imediatamente colocados na garrafa térmica contendo

nitrogênio líquido, a fim de manter a estabilidade da amostra.


Figura 1 Coleta de saliva

3.2.4 Coleta de amostra esofágica

Após anestesia tópica da orofaringe com lidocaína spray, os pacientes

eram colocados em decúbito lateral esquerdo. Os pacientes do Grupo

Controle, que seriam depois submetidos a exame endoscópico, recebiam

também sedação endovenosa, conforme descrito anteriormente. A coleta era

realizada antes do exame endoscópico a fim de evitar possível fator de

contaminação. A sonda de entubação, a sonda de Levine e a seringa eram

inicialmente abertas sobre o campo estéril. A seguir, a sonda de Levine no

14 era passada por dentro da cânula de entubação orotraqueal (Figura 2). O

conjunto era então passado pela boca até o 1/3 médio do esôfago com a

sonda de Levine escondida dentro da cânula de entubação, de maneira a


não haver contaminação da orofaringe com microrganismos. A sonda era

então empurrada até atingir a luz esofágica, quando era aspirado o líquido

de estase com seringa de 20 ml conectada em sua extremidade (Gagliardi et

al., 1998; Pajecki et al., 2002). Foi coletado o volume mínimo de 7 ml. Nos

pacientes do GC foi feito lavado com 10 ml de solução salina, que era em

seguida aspirado (mínimo de 7 ml). Essa diluição foi levada em

consideração no cálculo das concentrações pesquisadas.

Figura 2 Sonda de Levine acoplada na seringa para coleta de amostra esofágica


O material coletado foi dividido em diferentes tubos da seguinte

maneira:

2 ml em dois tubos de Ependorf contendo 0,1 ml de solução de

NaOH 1M, para dosagem de nitrito e nitrato;

2 ml em tubo de ensaio contendo 0,5 ml de solução de tampão

borato para dosagem de nitrosaminas;

1 ml em solução de transporte contendo 9 ml de tampão

fosfatado, para estudo microbiológico.

3.2.5 Estudo endoscópico do esôfago

Os pacientes do GC foram submetidos, imediatamente após a coleta

de amostras, à endoscopia digestiva alta, para avaliação da presença de

eventuais afecções esofagogástricas que excluiriam pacientes do estudo.

3.2.6 Transporte e armazenamento das amostras

Os tubos de Ependorf foram transportados, em garrafa térmica

contendo nitrogênio líquido, até o Laboratório de Biologia Vascular do

Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da FMUSP, onde foram


colocados em congelador regulado para temperatura de 80o C negativos.

Esse material só foi descongelado no dia em que se realizaram as dosagens

de nitrito e nitrato.

O tubo de ensaio, contendo tampão borato e amostra, foi levado ao

mesmo laboratório em geladeira de isopor com gelo (4o C). No mesmo dia

esse material foi preparado por processo de extração, com solução de

diclorometano, sendo então transportado, em geladeira de isopor com gelo,

até a Central Analítica do Instituto de Química da USP, onde foi realizada a

pesquisa de nitrosaminas.

O tubo de ensaio com solução de tampão fosfatado e amostra foi

levado, em geladeira de isopor com gelo, imediatamente após a coleta, ao

Laboratório de Microbactérias do Instituto de Ciências Biomédicas II da USP,

onde foi realizado o estudo microbiológico.

3.2.7 Dosagem de nitrito e nitrato

Para dosagem de nitrito e nitrato foi utilizado um detector de óxido

nítrico de alta sensibilidade, NOA (Nitric Oxide Analyzer), modelo 280, marca

Sievers® (Figura 3), cujo funcionamento se baseia na reação de

quimioluminescência em fase gasosa entre o óxido nítrico e o ozônio. Tanto

para as dosagens de nitrato (NO3) como para nitrito (NO2) foram realizadas


curvas-padrão, partindo de uma solução "mãe", com concentração de 100

mM.

Figura 3

Detector de óxido nítrico de alta sensibilidade, NOA (Nitric Oxide Analyzer), modelo 280, marca Sievers®

Para gerar a curva-padrão, foram feitas, em duplicata, diluições

seriadas de NaNO2 e NaNO3 em água deionizada, variando as

concentrações de 0,5 M (micromolar) a 20,0 M. Foram injetados 20 l

(microlitros) de concentrações crescentes de padrão já conhecidas, em

duplicata. Depois que as amostras padronizadas foram injetadas, obteve-se

uma curva-padrão para nitrito e outra para nitrato. A curva-padrão era feita

no dia das dosagens e foi utilizada para calcular as concentrações das


amostras subseqüentes. As amostras foram estocadas a 80° C negativos e

foram descongeladas em temperatura ambiente, centrifugadas a 3000 rpm

por 15 minutos, a 4º C. O volume de 20 l (microlitros) do sobrenadante foi,

então, injetado no aparelho para obtenção dos picos de concentração. O

cálculo das amostras foi realizado por meio de um software do equipamento

que determina a área sob a curva e a transforma em concentração em M

(micromolar). Todo esse processo foi realizado no Laboratório de Biologia

Vascular do InCor HCFMUSP.

3.2.8

Pesquisa de nitrosaminas

A pesquisa de nitrosaminas foi realizada pelo método de

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (equipamento

Shimatzu® modelo QP 5050 A), na Central Analítica do Instituto de Química

da Universidade de São Paulo (Figura 4). Esse equipamento contém quatro

bibliotecas eletrônicas de espectros de massa para comparação de

espectros de compostos químicos desconhecidos. Para identificação das

nitrosaminas foi adicionado a essa biblioteca um padrão já utilizado

anteriormente por outros autores (Dallinga et al., 1998; Van Maanen et al.,

1998), contendo cinco nitrosaminas: N-nitrosodimetilamina,

N-nitrosoetilmetilamina, N-nitrosodietilamina, N-nitrosomorpholina,

N-nitrosopiperidina (Sigma- Aldich ®).


Figura 4 Equipamento de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (Shimatzu® modelo QP 5050 A)

A comparação da biblioteca eletrônica e do espectro de cada pico do

padrão (Figura 5) ao espectro de massa de cada pico do cromatograma

(Figura 6) adquirido de cada amostra permitiu concluir se havia ou não,

individualmente, uma das nitrosaminas em cada uma das amostras.


Figura 5 Curva-padrão de 5 nitrosaminas. 1) N-nitrosodimetilamina; 2) N-nitrosoetilmetilamina; 2) N-nitrosodietilamina; 4) N-nitrosopiperidina; 5) N-nitrosomorpholina

Figura 6

Curva de identificação de nitrosaminas: 1) N-nitrosomorpholina; 2) Ácido Linoleico; 3) Lidocaína


3.2.9 Estudo microbiológico

O material separado para estudo microbiológico foi encaminhado ao

Laboratório de Microbactérias do Instituto de Ciências Biomédicas II da

Universidade de São Paulo, onde foi manipulado. Esse material foi diluído

em razões decimais que variaram de 10-2 a 10-10. A partir das diluições, o

volume de 0,01 ml foi semeado em duplicata em placas de Petri contendo

ágar BHI (Brain Heart Infusion) enriquecido com sangue desfibrinado (ágar

sangue-As) a 5% e em ágar Sabouroud (Aso). As placas de As foram

incubadas em aerobiose e anaerobiose (sistema GASPACK) a 37º C,

durante 48 horas e até 11 dias, respectivamente. As placas de Aso foram

incubadas a 37º C pelo período de até 4 dias. Após leitura e constatação de

crescimento bacteriano ou fúngico, colônias representativas foram repicadas

para caldo indol-nitrato, para pesquisa da formação de nitrito (Bailey e Scott,

1980). A pesquisa de redução de nitrato foi realizada após incubação no

mesmo ambiente da colônia original. Para efeito de comparação, foram

consideradas apenas as colônias redutoras de nitrato presentes no GM ou

no GC.


3.2.10 Método estatístico

Para estudarmos possíveis diferenças entre os grupos Megaesôfago

e Controle, tanto na saliva quanto no esôfago, para nitrato e nitrito, usamos o

teste não paramétrico para duas amostras independentes (indivíduos

diferentes) de Mann-Whitney.

Para estudarmos, dentro do mesmo grupo, tanto para nitrato quanto

para nitrito, possíveis diferenças entre saliva e esôfago, usamos o teste não

paramétrico para duas amostras não independentes (mesmo indivíduo) de

Wilcoxon.

Para estudarmos possíveis associações entre os grupos e presença

ou ausência de nitrosaminas ou bactérias redutoras de nitrato, usamos o

teste qui-quadrado ( 2) para tabelas de associação. Quando presente a

restrição de Cochran (freqüência esperada < 5 em 20%), o teste do 2 foi

substituído pelo teste exato de Fisher.

O nível de rejeição para a hipótese de nulidade foi fixado sempre em

valor 0,05 (p 5%).

4 Resultados

4 Resultados - 33

Dos pacientes inicialmente incluídos no estudo, cinco do GC foram

excluídos, pois apresentavam alterações endoscópicas: três com hérnia

hiatal e esofagite e dois com esofagite. Os sete primeiros pacientes do GM

foram excluídos, pois as amostras de nitrito e nitrato foram colocadas no

mesmo tubo, causando perda da amostra de nitrito quando foi feito o

descongelamento e recongelamento da solução. A casuística final, portanto,

foi de 15 pacientes no GC e 15 pacientes no GM.

4.1

Nitrato na saliva

As concentrações de nitrato na saliva no GC e no GM estão

apresentadas na Tabela 4. Não houve diferença estatística (p=0,44) na

comparação entre as concentrações dos dois grupos, tornando os grupos

equivalentes no aspecto de quantidade de nitrato ingerido (Figura 7).

4 Resultados - 34

Tabela 4 Concentração de nitrato [NO3] na saliva (µM/ml)

(GM) [NO3] (GC) [NO3]

8m 62,03 1c 111,52

9m 85,23 2c 85,05

10m 219,75 3c 201,00

11m 484,00 5c 36,19

12m 175,26 6c 221,17

13m 72,14 7c 171,63

14m 86,22 8c 267,16

15m 149,64 11c 43,00

16m 34,90 12c 41,21

17m 55,63 13c 84,80

18m 78,06 15c 90,13

19m 121,23 16c 115,30

20m 143,00 18c 57,10

21m 241,00 19c 225,63

22m 487,00 20c 32,20

4.2 Nitrito na saliva

As concentrações de nitrito na saliva no GC e no GM estão

apresentadas na Tabela 5. Não houve diferença estatística (p=0,29) na

comparação entre as concentrações dos dois grupos, demonstrando sua

equivalência na capacidade de redução de nitrato na boca (Figura 7).

4 Resultados - 35

Tabela 5 Concentração de nitrito [NO2] na saliva (µM/ml)

(GM) [NO2] (GC) [NO2]

8m 29,91 1c 42,08

9m 71,35 2c 59,40

10m 54,50 3c 102,00

11m 343,22 5c 17,29

12m 83,51 6c 206,72

13m 78,72 7c 89,92

14m 31,27 8c 245,78

15m 49,30 11c 15,40

16m 11,48 12c 25,29

17m 51,99 13c 9,90

18m 45,92 15c 35,20

19m 50,10 16c 40,40

20m 85,86 18c 28,30

21m 93,50 19c 193,61

22m 228,00 20c 12,70

4 Resultados - 36

Figura 7 Comparação das médias de [NO3] e [NO2] salivar entre o GM e o GC

4.3 Nitrato no esôfago

As concentrações de nitrato no esôfago no GM e no GC estão

apresentadas na Tabela 6. Na comparação entre as concentrações dos dois

grupos, não houve diferença estatística (Figura 8).

0

30

60

90

120

150

180

210

NO3 (X) NO2 (X)

Grupo Controle

Grupo Megaesôfagop=0,44

p=0,29

NO3 NO2

Média

M/m

l

0

30

60

90

120

150

180

210

NO3 (X) NO2 (X)

Grupo Controle


p=0,29

NO3 NO2

Média

M/m

l

4 Resultados - 37

Tabela 6 Concentração de nitrato [NO3] no esôfago (µM/ml)

(GM) [NO3] (GC) [NO3]

8m 55,12 1c 25,19

9m 125,34 2c 43,00

10m 228,53 3c 102,00

11m 188,00 5c 29,02

12m 131,10 6c 27,91

13m 27,12 7c 71,61

14m 11,23 8c 65,96

15m 121,5 11c 3,20

16m 5,50 12c 28,51

17m 33,76 13c 2,83

18m 2,25 15c 13,50

19m 64,33 16c 18,40

20m 2,65 18c 22,45

21m 314,00 19c 5,93

22m 53,90 20c 3,23

4 Resultados - 38

4.4 Nitrito no esôfago

As concentrações de nitrito no esôfago no GM e no GC estão

anotadas na Tabela 7. Na comparação entre as concentrações dos dois

grupos, houve diferença estatística (p=0,03), com concentrações maiores no

Grupo Megaesôfago (Figura 8).

Tabela 7 Concentração de nitrito [NO2] no esôfago (µM/ml)

(GM) [NO2] (GC) [NO2]

8m 52,94 1c 9,92

9m 87,96 2c 11,72

10m 90,40 3c 27,00

11m 115,06 5c 1,60

12m 37,12 6c 13,07

13m 48,05 7c 9,39

14m 11,54 8c 10,22

15m 37,10 11c 1,05

16m 1,23 12c 1,23

17m 14,12 13c 1,25

18m 0,81 15c 0,05

19m 53,03 16c 3,20

20m 1,05 18c 8,16

21m 74,00 19c 2,89

22m 17,10 20c 0,05

4 Resultados - 39

Figura 8 Comparação das médias de [NO3] e [NO2] esofágico entre o GM e o GC

4.5

Nível de redução da concentração de nitrato e nitrito entre a

saliva e o esôfago, no GC e no GM

A diferença da concentração de nitrato e nitrito no conteúdo da saliva

e do esôfago, nos dois grupos, foi estatisticamente significante (Figura 9),

com a concentração de nitrato e nitrito esofágico menor que a concentração

salivar. Ao comparar-se a diminuição ocorrida da concentração de nitrito no

esôfago do GC (-92%) com a diminuição sofrida pela concentração do nitrito

no esôfago do GM (-49%), observou-se que esta foi menor no GM.

NO3 NO2

Média

0

20

40

60

80

100

120

NO3(x) NO2(x)

Grupo Controle


p=0,003

M/m

l

NO3 NO2

Média

0

20

40

60

80

100

120

NO3(x) NO2(x)

Grupo Controle


p=0,003

M/m

l

4 Resultados - 40

Foram calculadas as relações entre a concentração de nitrato e nitrito

no esôfago no GM e no GC e entre a concentração de nitrito na saliva e no

esôfago no GM e no GC:

A relação entre as concentrações de nitrato e nitrito no esôfago

do GM foi de 2,12.

[NO3 esofágico]/ [NO2 esofágico] = 2,12

A relação entre as concentrações de nitrato e nitrito no esôfago

do GC foi de 4,59.

[NO3 esofágico]/ [NO2 esofágico] = 4,59

A relação entre as concentrações de nitrito na saliva e no

esôfago do GM foi de 2,04.

[NO2 salivar]/ [NO2 esofágico] = 2,04

A relação entre as concentrações de nitrito na saliva e no

esôfago do GC foi de 11,2.

[NO2 salivar]/ [NO2 esofágico] = 11,2

Essas relações mostram que a proporção de NO2 esofágico em

relação ao NO3 esofágico e ao NO2 salivar é maior no Grupo Megaesôfago

quando comparado ao Grupo Controle. Esses dados demonstram haver, no

GM, uma tendência de desvio da reação NO3 (nitrato) NO2(nitrito) para a

direita, com maior formação de NO2.

4 Resultados - 41

Figura 9 Comparação de [NO3salivar] e [NO3 esofágico] no GC e GM e [NO2salivar] e [NO2esofágico] no GC e GM.

4.6 Pesquisa de nitrosaminas

Nitrosaminas foram encontradas em 3 dos 15 casos do GM e em

nenhum dos 15 casos do GC. As nitrosaminas encontradas foram a

N- nitrosomorpholina em dois casos e a N-nitrosodimetilamina em um caso.

A análise estatística, entretanto, não apontou diferença significativa (Tabela

8).

020406080

100120140160180200

GC GM GC GM

Saliva

EsôfagoM

/ml

NO3 NO2

Média

p=0,001

p=0,017

p=0,001 p=0,027

=(-92%)

=(-49%)

020406080

100120140160180200

GC GM GC GM

Saliva

EsôfagoM

/ml

NO3 NO2

Média

p=0,001

p=0,017

p=0,001 p=0,027

=(-92%)

=(-49%)

4 Resultados - 42

Tabela 8 Nitrosaminas no esôfago

Nitrosaminas GM GC Total

Sim 3 0 3

Não 12 15 27

Total 15 15 30

p = 0,113 (Fischer)

4.7 Estudo microbiológico de bactérias redutoras de nitrato

As bactérias redutoras de nitrato encontradas no GM e no GC estão

descritas nas Tabelas 9 e 10, respectivamente. O estudo microbiológico

revelou a presença de bactérias redutoras freqüentes e em altas

concentrações no GM, com diferença estatística quando em comparação

com o GC (Tabela 11).

Tabela 9 Prevalência (%) e concentração (UFC/ml) de bactérias redutoras de nitrato em GM (n=15)

Prevalência Concentração

Lactobacillus sp 66% 101 a 107

Peptococcus sp 40% 101 a 105

Veillonella sp 80% 101 a 107

Enterococcus sp 40% 102 a 107

Fusobacterium sp 6,6% 103

4 Resultados - 43

Tabela 10 Prevalência (%) e concentração (UFC/ml) de bactérias redutoras de nitrato no GC (n=15)

Prevalência Concentração

Lactobacillus sp 13% 101 a 102

Paptococcus sp 6,6% 101

Tabela 11 Comparação entre a prevalência de bactérias redutoras de nitrato no GM e no GC

Bact. redut. GM GC Total

Sim 15 2 17

Não 0 13 13

Total 15 15 30

p < 0,0001 (Fischer)

5

Discussão

5 Discussão - 45

5.1 Bactérias redutoras no esôfago

Já foi demonstrado em estudo anterior (Pajecki et al., 2002) que no

megaesôfago não avançado há microbiota abundante, constituída

principalmente de aeróbios gram-positivos e anaeróbios. Nessa condição, a

microbiota encontrada, embora em quantidade inferior, é bastante

semelhante à da saliva (Ubriaco, 2002), da qual provém e se multiplica em

decorrência da estase.

Entre as bactérias encontradas, já havia sido destacada a presença

de espécies redutoras de nitrato (Pajecki et al., 2003). Esse fato chamou a

atenção, pois há muito tempo vem sendo estudada a associação entre o

supercrescimento de bactérias redutoras e carcinogênese, através da

formação de compostos N-nitrosos. No estômago, esse fenômeno foi

descrito por diversos autores em estudos clínicos e experimentais,

contemplando situações de acloridria (Stockbrugger et al., 1982; Marchesini,

1990; Camels et al., 1991; Andreollo, 1994; Verdu et al., 1994; Guadagni et

al., 1996). Mais recentemente, representantes dessa flora foram

identificados em produtos de biópsia de mucosa esofágica com Barrett, em

indivíduos recebendo tratamento de supressão ácida e associados a maior

incidência de displasia (Osias et al., 2004).

5 Discussão - 46

Na mesma linha, a associação entre o supercrescimento de bactérias

redutoras na saliva e a gênese do câncer da cavidade oral foi demonstrada

por Nagy et al. (1998). Antes dele, Shapiro et al. (1991) demonstraram que

indivíduos com maior capacidade de redução de nitrato na saliva (avaliados

pelo estudo da flora redutora) excretavam maior concentração de compostos

N-nitrosos na urina. Chang et al. (1992), por sua vez, sugeriram mas não

comprovaram que as modificações da microbiota bucal em indivíduos com

mau estado de conservação dos dentes poderiam estar relacionadas com a

carcinogênese esofágica.

Sendo o megaesôfago uma condição na qual existe estase salivar e

risco elevado de desenvolvimento de carcinoma espinocelular do esôfago, e

estando os compostos N-nitrosos também associados à gênese dessa

neoplasia, imaginou-se se esse seria o mecanismo pelo qual ocorre a

indução de tumores na mucosa esofágica, em pacientes com acalasia e

esôfago dilatado.

A linha de investigação traçada procurou, em primeiro lugar, confirmar

a presença de bactérias redutoras no esôfago em quantidades

significativamente maiores do que em indivíduos normais. Para isso, além

dos métodos de cultura e identificação de colônias, já utilizados

anteriormente (Pajecki et al., 2002), foram aplicados testes específicos que

identificassem a atividade redutora. Os achados foram coerentes com as

expectativas, tendo sido encontradas espécies em quantidades muito

superiores no Grupo Megaesôfago, quando comparadas ao Grupo Controle.

5 Discussão - 47

Em seguida, procurou-se verificar a participação desta flora redutora

na modificação da fisiologia dos compostos nitrogenados na luz esofágica,

induzindo a formação de nitrito em concentrações maiores do que as

esperadas numa situação normal, levando, eventualmente, como

conseqüência à formação de nitrosaminas.

Para tanto, dosou-se a concentração de nitrato e nitrito na saliva e no

esôfago de pacientes com megaesôfago e pacientes sem afecção esofágica

e pesquisou-se a presença de nitrosaminas na luz esofágica de pacientes

com megaesôfago. Esse modelo de estudo foi aplicado anteriormente, no

mesmo tipo de avaliação, em pacientes com diversas afecções gástricas

(Stockbrugger et al., 1982; Verdu et al., 1994; Guadagni et al., 1996; Dallinga

et al., 1998; Vanmaaen et al., 1998; Vermeer et al., 1998,Vermeer et al.,

2001).

5.2 Nitrato na saliva

Os seres humanos estão expostos ao nitrato, principalmente por meio

da ingestão de alimentos e, em menor escala, pelo consumo de água. Os

vegetais são a principal fonte de exposição de nitrato, fornecendo pelo

menos 85% da quantidade ingerida diariamente em localidades onde a

concentração de nitrato na água é baixa (1-5 mg/l).

5 Discussão - 48

A contribuição do consumo de água potável na quantidade de nitrato

ingerido depende das fontes de suprimento de água. A Organização Mundial

de Saúde (OMS) determina que a concentração máxima admissível de

nitrato na água potável seja de 44,3 mg/dl (Van Maanen et al., 1996). Esse

valor é considerado apropriado para prevenir o desenvolvimento de

metahemoglobinemia, a principal doença associada à exposição excessiva

de nitrato. Embora esse valor seja respeitado pela maioria das empresas de

distribuição de água em países europeus, em localidades daquele continente

abastecidas principalmente por água de poço, por exemplo, a concentração

de nitrato pode atingir valores de até 300 mg/dl. Fontes de suprimento de

água com alta concentração de nitrato foram identificadas em diferentes

áreas na Colômbia, Itália e China; nessas localidades, o tipo de suprimento

de água esteve associado com risco maior de desenvolvimento de câncer

gástrico (Van Maanen et al., 1996 apud Cuello et al., 1976, Xu et al., 1992).

Esses dados são importantes pois, ao analisarmos a concentração de

nitrato na saliva, precisamos ter alguma idéia sobre a fonte de consumo de

nitrato da população estudada e, ao compararmos a concentração entre

duas populações, precisamos ter certeza de que seu consumo seja

semelhante. Na região metropolitana de São Paulo, onde vivem todos os

pacientes que participaram do presente estudo, a concentração de nitrato na

água, segundo a Sabesp (Portaria MS-518/2004), é de, no máximo, 10

mg/dl. Desprende-se daí, portanto, que se trata de população uniforme

quanto ao consumo de nitrato e que sua ingestão pela água é considerada

normal pelos padrões da OMS.

5 Discussão - 49

O nitrato pode também ser utilizado como conservante de alimentos,

sendo empregado em carnes industrializadas e alimentos preservados em

conservas (Binkerd, 1975; Cheng, 1982; Cassens, 1995). Embora diferentes

indivíduos do Grupo Megaesôfago ou do Grupo Controle pudessem

eventualmente ingerir quantidade maior desses alimentos, não se levou esse

dado em consideração, pois a análise em separado de pacientes com

distintos hábitos alimentares requereria aumento expressivo da amostragem.

O nitrato (NO3) ingerido é quase totalmente absorvido (98%) no

estômago e intestino proximal (Van Maanen et al., 1996). O nitrato é

transportado ativamente do sangue para a saliva, onde atinge concentrações

muito maiores do que as sangüíneas. Entre 25 e 30% do nitrato circulante é

captado ativamente pelos ductos salivares. O pico da concentração de

nitrato salivar ocorre entre uma e duas horas após a ingestão de um suco de

vegetais ou entre duas e três horas após a ingestão de vegetais frescos

(Tenovuo, 1986).

A concentração de nitrato na saliva depende, portanto, da quantidade

de nitrato ingerida e do tempo após a ingestão em que é feita a dosagem.

Mesmo assim, diferenças interindividuais significativas podem ser

observadas, mesmo em estudos em que a quantidade ingerida é bem

controlada. Vermeer et al. (1998) encontraram concentração média de 202 ±

80 µmol/l em pacientes que receberam 170 mg de nitrato de potássio por

dia, diluído na água de beber. Shapiro et al. (1991) encontraram

concentrações de 54,6 ± 6,9 µmol/l em indivíduos em jejum e 458 ± 47,3

µmol/l nos mesmos indivíduos, após receberem 5,24 mmol de nitrato.

5 Discussão - 50

Spiegelhalder et al. (1976) encontraram concentrações de 74 ± 50 µmol/l de

nitrato duas horas após a ingestão de café da manhã típico americano

(continental breakfast) e postularam que para cada 100 mg de nitrato

ingerido haveria um aumento de 110 µmol/l em sua concentração salivar.

No presente estudo, a coleta de amostras foi feita com os pacientes

em jejum de aproximadamente 12 horas, condição necessária para se

proceder à coleta de material do esôfago de maneira segura. Nessa

situação, provavelmente a concentração de nitrato na saliva encontrava-se

em seu ponto mais baixo de variação diária. Apesar disso, o que se

objetivou foi apenas, de alguma forma, deixar os grupos Megaesôfago e

Controle equivalentes, sob o aspecto concentração salivar de nitrato, para

que esse parâmetro não interferisse nas análises subseqüentes.

Na casuística apresentada, a concentração média de nitrato salivar no

GC foi de 118,8 µmol/l (de 41,2 a 267,1) e no GM de 166,3 µmol/l (de 34,9 a

219,7), ambas compatíveis com dados obtidos em outros estudos (Hart;

Walters,1983; Tenouvo, 1986; Palmieri et al., 2003; Bjorne et al., 2004). Não

houve diferença significante entre os dois grupos, mostrando que eram

equivalentes nesse parâmetro.

5 Discussão - 51

5.3 Nitrito na saliva

A formação de nitrito na saliva humana ocorre pela fermentação

bacteriana (redução) do nitrato. Aproximadamente de 20% a 25% do nitrato

salivar é convertido em nitrito (Hart; Walters, 1983; Tenuovo, 1986; Shapiro

et al., 1991; Nagy et al., 1998; Iijima et al., 2003). A redução bacteriana de

nitrato a nitrito é fortemente dependente do pH do meio e ocorre na cavidade

oral onde o pH é neutro ou ligeiramente alcalino. Em situações de

diminuição da secreção ácida gástrica, essa reação pode ocorrer também no

estômago. O nitrato não reduzido pode ser reabsorvido no estômago,

duodeno ou jejuno proximal, e novamente secretado na saliva, onde pode

sofrer redução para nitrito. Esse ciclo é responsável por 80% da exposição

do organismo ao nitrito.

O nitrito também pode ser diretamente ingerido. É utilizado,

juntamente com o nitrato, como conservante alimentar, adicionado às carnes

industrializadas (salsicha, lingüiça, mortadela, salame, carne enlatada,

fiambre, hambúrguer e presunto), para conferir-lhes a cor rosada e sabor

característico e evitar o crescimento de microrganismos, principalmente o

Clostridium botulinum (Andrade, 2004). O nitrito em pH ácido pode reagir

com aminas e amidas secundárias, presentes nos alimentos, e formar

nitrosaminas e nitrosamidas, compostos reconhecidamente cancerígenos

(Scanlan, 1983; Hotchkiss et al., 1987).

5 Discussão - 52

Nesse sentido, devido à sua potencial toxicidade, a ingestão de nitrito

deve ser controlada e, segundo a OMS, o limite de ingestão diária

recomendado é de 0,06 mg/kg de peso corpóreo. A legislação brasileira

determina que a concentração máxima de nitrito permitida em alimentos seja

de 150 ppm (partes por milhão). Produtos industrializados, supervisionados

pelo Ministério da Agricultura, têm esse parâmetro respeitado, mas o mesmo

não se pode dizer de produtos artesanais ou de pequenas fábricas que

escapam ao controle da fiscalização.

Alguns autores utilizam dieta padronizada, rica em nitrato e nitrito,

para estudar a fisiologia desses dois compostos no trato digestivo alto

(Lakritz, 1982; Van Maanen, 1998; Vermeer, 1998; Iijima, 2003). No presente

estudo, o objetivo final era analisar o comportamento dessas substâncias em

pacientes com megaesôfago, que recebiam sua dieta habitual, sem

modificações. Analisou-se, portanto, apenas a influência do fator

megaesôfago e não a de uma dieta padronizada administrada a esses

pacientes. Por esse motivo não se recomendou nenhuma dieta especial na

véspera da coleta das amostras.

Diferenças consideráveis, entre indivíduos, na concentração salivar de

nitrito decorrem também de diferenças na capacidade de redução salivar.

Como já foi discutido, há diferenças entre indivíduos de concentração de

bactérias redutoras de nitrato na saliva, responsáveis pela transformação de

nitrato em nitrito. Indivíduos com má higiene bucal ou mau estado de

conservação dos dentes têm concentrações de nitrito salivar maiores,

5 Discussão - 53

quando comparados a indivíduos com boa higiene e bom estado de

dentição.

No mesmo indivíduo, dependendo da ocasião, a concentração de

nitrito salivar também pode variar. Shapiro et al. (1991) mostraram que o

tratamento com anti-séptico bucal contendo 0,12% de gluconato de

chlorexidine reduziu de 17% para 4% o total de nitrato convertido à nitrito em

16 voluntários. Van Maanen et al. (1996) relatam redução para 0,9% após

utilização da mesma solução a 0,20%, mas não encontraram grande

diferença após utilização de soluções de triclosan, amiloglicosidase e glicose

oxidase.

Para que a higiene bucal de cada indivíduo não atrapalhasse o

resultado da dosagem de nitrito, os pacientes foram orientados a não

escovar os dentes, lavar a boca com anti-séptico ou utilizar goma de mascar

no dia da coleta. Não foi possível, entretanto, separar os indivíduos pelo seu

estado de dentição, o que exigiria um aumento significativo da amostragem.

No presente estudo, a concentração média de nitrito salivar foi 74,9

µmol/l (9,9 a 245) no Grupo Controle e 87,2 µmol/l (11,48 a 343,22) no

Grupo Megaesôfago.

Não se observou diferença significante da concentração de nitrito

salivar entre os grupos Megaesôfago e Controle. Entretanto, em ambos os

grupos, a concentração relativa de nitrito comparada à de nitrato é um pouco

maior do que a relatada em outros estudos em que se utilizou metodologia

semelhante (Hart, 1983; Shapiro, 1991; Van Maanen, 1996b). A

concentração média elevada de nitrito, nos dois grupos, deve-se somente a

5 Discussão - 54

alguns poucos indivíduos que apresentaram concentrações muito elevadas

(até 245 µmol/l no GC e 343,22 µmol/l no GM).

Uma possível explicação para esse fenômeno pode estar no péssimo

estado de conservação dos dentes e na deficiente higiene bucal de alguns

indivíduos, nos dois grupos, resultando em supercrescimento de bactérias

redutoras e, conseqüentemente, maior atividade redutora da saliva. Essa

condição é uma característica de alguns indivíduos da população estudada,

de baixo nível socioeconômico.

De qualquer modo, pode-se dizer que os dois grupos eram

equivalentes nos parâmetros nitrato e nitrito salivar, e que eventuais

diferenças, posteriormente medidas no esôfago, seriam conseqüência de

eventos anteriormente ocorridos nessa víscera.

5.4 Nitrato no esôfago

Para coleta de amostras do esôfago, escolhemos o método de aspirar

o conteúdo esofágico, que já havia sido utilizado anteriormente para estudo

microbiológico (Pajecki et al., 2002). Processo semelhante também já foi

amplamente empregado para a pesquisa de nitrato, nitrito e compostos

N-nitrosos no suco gástrico, mas foi utilizado no esôfago pela primeira vez.

5 Discussão - 55

Para correta análise das amostras, um passo importante é a

conservação do material coletado, que deve ser colocado em solução de

NaOH 1M e congelado (Dallinga et al., 1998) . Quando, em estudo piloto,

não se utilizou a solução de conservação, obtiveram-se valores muito

diferentes, em geral mais baixos.

Outros autores utilizaram métodos diferentes para estudo dos

compostos nitrogenados no esôfago. Susuki et al. (2003) utilizaram probes

de microdiálise para determinação da concentração de nitrito e encontraram,

no esôfago distal, valores discretamente mais baixos que os da saliva. O

equipamento, porém, utilizava sistema de fluxo contínuo de solução de

nitrato e tinha como objetivo determinar o ponto onde o nitrito se

transformava mais em óxido nítrico (NO).

Casselbrant et al. (2002) utilizaram equipamento de tonometria para

medir concentrações de óxido nítrico (NO) e Iijima et al. (2002)

desenvolveram um sensor específico para o mesmo fim.

No esôfago normal, a população bacteriana é pobre e constituída por

aeróbios gram-positivos e anaeróbios, em baixas concentrações,

provenientes da cavidade oral, junto com a saliva deglutida. A capacidade de

redução de nitrato nesse meio é, portanto, muito baixa. No megaesôfago,

por sua vez, há população bacteriana abundante, com várias espécies

redutoras de nitrato, fazendo do líquido de estase, teoricamente, um meio

propício para a ocorrência dessa reação (Pajecki et al. 2002).

5 Discussão - 56

Nos dois grupos, a concentração encontrada de nitrato foi mais baixa

do que a observada na saliva. No Grupo Controle, encontramos 118 µmol/l

na saliva e 30,8 µmol/l no esôfago (relação=3,85/1). No Grupo

Megaesôfago, encontramos 166,3 µmol/l na saliva e 90,9 µmol/l no esôfago

(relação=1,83/1).

Embora a diferença entre a concentração de nitrato no esôfago entre

o Grupo Controle e o Grupo Megaesôfago não tenha sido significante,

parece haver proporcionalmente mais nitrato no Grupo Megaesôfago.

Podemos supor também que, uma vez que no megaesôfago existe líquido

de estase e no esôfago normal não, a quantidade total de nitrato (pool)

presente no megaesôfago capaz de ser reduzida a nitrito seja muito maior

do que no esôfago normal.

5.5 Nitrito no esôfago

O nitrito gerado a partir da redução do nitrato salivar ou diretamente

ingerido de fontes alimentares tem importância biológica pois, reagindo com

aminas ou amidas provenientes dos alimentos, resulta na formação de

nitrosaminas e/ou nitrosamidas, chamadas genericamente de compostos

N-nitrosos. Essa reação é chamada de nitrosação e pode ocorrer nos

próprios alimentos, in vivo ou in vitro (Tricker et al., 1992). Algumas

5 Discussão - 57

nitrosaminas, por sua vez, têm reconhecida ação carcinogênica no esôfago

e estômago.

Nesse sentido, como já foi exposto, o ritmo de geração de nitrito tem

sido estudado como fator associado à gênese do câncer da cavidade oral,

bem como do estômago em situações de acloridria: gastrite crônica, uso

crônico de cimetidina, uso crônico de omeprazol, gastrectomia parcial.

Após a deglutição da saliva, a formação de nitrito ocorre

principalmente no esôfago distal e estômago proximal (cárdia), em pH ácido.

Nesse meio ocorre também sua redução para óxido nítrico (NO), que já foi

identificado como causador de mutagênese e associado a carcinogênese

esofágica (Ohshima, Bartsch, 1994)

Na mesma linha, o papel do nitrito e do óxido nítrico na gênese de

tumores da junção esofagogástrica (adenocarcinoma da cárdia e

adenocarcinoma associado ao esôfago de Barrett) tem sido estudado por

diversos autores (Casselbrant et al., 2002; Iijima et al., 2002; Iijima et al.,

2003; Chen et al., 2004).

Por sua vez, Dallinga et al. (1998) encontraram concentrações de

nitrito no suco gástrico tanto maiores quanto mais alto fosse o pH do meio

(situações de acloridria), demonstrando que essa reação ocorre também em

pH mais elevado, próximo ao da saliva, influenciada por ação bacteriana.

Entretanto, nunca foi demonstrada a ocorrência de redução de nitrato

e formação de nitrito na luz esofágica e a possível associação desse evento

com o aumento do risco de desenvolvimento de neoplasia esofágica. No

5 Discussão - 58

megaesôfago existe flora bacteriana redutora de nitrato abundante e estase;

um meio propício para essa reação.

No Grupo Controle, a concentração de nitrito na saliva foi de 74,9

µmol/l e no esôfago de 6,7 µmol/l (relação de 11,2/1). No Grupo

Megaesôfago, a concentração de nitrito na saliva foi de 87,2 µmol/l e no

esôfago de 42,7 µmol/l (relação de 2,04/1). A diferença da concentração de

nitrito no esôfago entre o GC e o GM foi significante, demonstrando haver no

esôfago dos pacientes com megaesôfago reação de redução de nitrato, não

verificada em indivíduos sem afecção esofágica.

Reforçando essa constatação, observa-se que a relação entre a

concentração de nitrato e nitrito ([nitrato]/[nitrito]) na saliva no Grupo

Megaesôfago foi semelhante à relação nitrato e nitrito no esôfago (1,9/1 x

2,1/1). Por outro lado, a relação entre a concentração de nitrato e nitrito

([nitrato]/[nitrito]) na saliva do Grupo Controle foi muito menor do que a

relação nitrato e nitrito no esôfago desse mesmo grupo (1,5/1 x 4,5/1).

5.6 Compostos N-nitrosos no esôfago

Seguindo a lógica do desenho de estudo traçado, o passo seguinte foi

a identificação de nitrosaminas no líquido de estase esofágico. Foram

tomados por modelo os inúmeros estudos sobre a formação de nitrosaminas

no suco gástrico, mas, em especial, os conduzidos pelo Departamento da

5 Discussão - 59

Análise de Riscos à Saúde e Toxicologia da Universidade de Maastrich

Holanda (Vermeer et. Al., 2001; Dallinga et al., 1998), que descreveram com

mais pormenores as técnicas de conservação de amostras e análise.

Variáveis fisiológicas como pH gástrico, velocidade de esvaziamento

do estômago, capacidade de concentrar o nitrato na saliva, capacidade de

redução de nitrato e taxa de fluxo salivar são descritas como influentes na

nitrosação gástrica.

A reação de nitrosação in vitro ocorre com mais intensidade em pH

ácido, próximo de 3,5 (Mirnvish et al., 1995; Moriya et al., 2002; Susuki et al.,

2003). Os estudos de nitrosação gástrica revelam, entretanto, formação

maior de nitrosaminas entre o pH 4,0 e 6,0 (Verdu et al., 1994; Vermeer et

al., 2001). Em pH acima de 7,0 ocorre diminuição significativa da

concentração de nitrosaminas, provavelmente pelo crescimento de

microorganismos capazes de degradá-las ou pelo efeito decompositor do

ácido sulfâmico em pHs mais altos (Rowland-Grasso, 1975). No

megaesôfago não operado e não submetido à dilatação forçada da cárdia,

raramente o pH luminal fica abaixo de 4,0, mesmo após as refeições (Felix

et al., 1996). O pH do meio é, portanto, favorável à nitrosação.

A capacidade redutora aumentada, decorrente das modificações da

microbiota, já demonstrada anteriormente neste estudo, e a retenção

esofágica decorrente da acalasia são os outros fatores que, assim como no

estômago, podem favorecer a reação de nitrosação.

Além disso, a capacidade redutora da saliva e a ingestão aumentada

de nitrato (com conseqüente aumento da concentração de nitrato salivar) e

5 Discussão - 60

de aminas precursoras são outros fatores importantes que poderiam

interferir positivamente para a formação de nitrosaminas, mas que não foram

avaliados no presente estudo. Também não foram avaliados os níveis de

vitamina E, C e betacaroteno no líquido de estase, que poderiam agir

inibindo a reação de nitrosação (Mirvish et al., 1995; Stoner, Gupta, 2001).

A pesquisa de nitrosaminas pode ser feita pela determinação de

Compostos N-nitrosos Totais (Lakritz et al., 1983; Massey et al., 1988) por

meio da dosagem de óxido nítrico produzido durante a reação de de-

nitrosação utilizando brometo de hidrogênio, ou pela identificação de

nitrosaminas específicas pelo método de cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massa. Essa identificação é baseada na comparação das

substâncias encontradas com padrões comerciais contendo 5 ou 8

nitrosaminas.

Foi escolhido o segundo método, conhecido como pesquisa de

nitrosaminas voláteis, por ser mais específico para as nitrosaminas de maior

interesse na carcinogênese esofágica e por estar mais de acordo com os

estudos publicados mais recentemente (Vermeer et al., 2001; Moriya et al.,

2002; Lin et al., 2002). Foi selecionado o padrão de 5 nitrosaminas,

por conter aquelas encontradas com maior freqüência nos estudos

de nitrosação gástrica (N-nitrosodimethylamina, N-nitrosometiletilamina,

N-nitrosodietilamina, N-nitrosopiperidina, N-nitrosomorpholina).

Outra maneira de pesquisar a formação de nitrosaminas é dosá-las na

urina ou no sangue. Esses métodos têm como vantagem a facilidade da

coleta, sendo bastante utilizados em estudos dinâmicos nos quais se quer

5 Discussão - 61

pesquisar a formação endógena de nitrosaminas após administração de

dieta específica (Tricker et al., 1992; Van Maanen et al., 1996; Lin et al.,

2002). Entretanto, são pouco específicos em determinar o sítio onde ocorreu

a nitrosação. Além disso, em indivíduos com infecção urinária ou mesmo

bacteriúria assintomática, ocorre redução urinária de nitrato, podendo haver

formação urinária de nitrosaminas.

Pode-se ainda pesquisar a capacidade de nitrosação gástrica num

indivíduo por meio do teste da nitrosoprolina. Esse teste consiste em

administrar nitrato e L-prolina junto com a dieta e, posteriormente, na

dosagem N-nitrosoprolina (não carcinogênica) na urina (Mirvisch et al., 1995,

Lin et al., 2003). Ele pode ser útil na avaliação do efeito de medidas de

intervenção, aplicadas a indivíduos predispostos, sobre a capacidade

redutora no suco gástrico (quimioprevenção). Da mesma forma, poderia ser

utilizado com o mesmo objetivo em pacientes com megaesôfago.

No presente estudo, foram encontradas nitrosaminas no líquido de

estase esofágico de três pacientes do Grupo Megaesôfago e em nenhum do

Grupo Controle. Embora não tenha sido encontrada diferença estatística

significante, a avaliação da seqüência de eventos (microbiota redutora

aumento da concentração de nitrito nitrosamina) sugere que, no

megaesôfago, existam todas as condições locais para a reação de

nitrosação.

Entre as possíveis hipóteses que podemos levantar para a não

identificação de nitrosaminas em mais casos estão: 1) a ocorrência de

nitrosaminas acompanha a incidência de câncer nessa população, em torno

5 Discussão - 62

de 3%; 2) tempo prolongado de jejum e degradação enzimática das

nitrosaminas; 3) não-inclusão de casos de megaesôfago avançado, em que

a estase é maior; 4) escolha do método de dosagem de nitrosaminas

voláteis individuais e não de compostos N-nitrosos totais (talvez mais

sensíveis); e 5) a transformação preferencial de nitrito em óxido nítrico.

5.7 Perspectivas

5.7.1 Estudo de suscetibilidade às nitrosaminas

O mecanismo carcinogênico das nitrosaminas está relacionado com

sua ação de metilação do DNA. Investigações recentes revelaram a

existência de polimorfismos genéticos que podem determinar o risco

individual de desenvolvimento do CEC esofágico induzido por nitrosaminas,

interferindo em sua ativação metabólica. Estudos da expressão de enzimas

relacionadas com essa ativação (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6/2 A7, CYP2E1

e CYP3A4) já foram realizados em modelos experimentais e em populações

acometidas por CEC esofágico em nosso meio (Godoy et al., 2002; Ribeiro

Pinto et al., 2003). Esses estudos, entretanto, não foram realizados em

pacientes com megaesôfago.

5 Discussão - 63

5.7.1 Estudo da formação de NO e do estresse oxidativo

no megaesôfago

A última hipótese apontada na discussão mudaria o rumo da linha de

pesquisa, em direção da investigação do papel do óxido nítrico e do estresse

oxidativo na carcinogênese.O óxido nítrico (NO) é uma molécula que atua

como mensageiro inter e intracelular em diversos sistemas (cardiovascular,

broncopulmonar, renal, nervoso e digestivo), participando de diversas

reações fisiológicas. Entretanto, conforme sua concentração ou grau de

depuração tecidual, pode ser potencialmente tóxico, estando envolvido na

patogênese de diversas afecções (Flora Filho, Zilberstein, 2000).

O NO pode ser gerado durante a reação de transformação do

aminoácido L-arginina em L-citulina ou pela redução de nitrito. Participam

dessa reação as izoenzimas da sintase do NO (NO sintase I, II e III). A

izoenzima II é conhecida por NO sintase induzível (INOS), que é estimulada

em situações de inflamação, permanecendo em atividade por horas com

mecanismo de sinergia de indução, inclusive do próprio NO produzido. O NO

gerado nessa situação pode reagir rapidamente com oxigênio para formar

N2O3, que pode alterar o DNA diretamente pela deaminação de bases

(estresse oxidativo) e, indiretamente, pela formação de compostos

N-nitrosos (Iijima et al., 2002).

5 Discussão - 64

A formação de óxido nítrico a partir de nitrito ocorre, normalmente, em

meio ácido (pH entre 1,5 e 3,5). Assim sendo, esse fenômeno vem sendo

estudado por autores que pesquisam os mecanismos de carcinogênese dos

tumores da transição esofagogástrica (adenocarcinoma da cárdia,

adenocarcinoma de Barrett). Verificaram que a formação de NO ocorre

preferencialmente na cárdia, ao primeiro contato com o ácido clorídrico, ou

no esôfago distal, em pacientes com refluxo gastroesofágico (Iijima et al,

2002; Casselbrant et al., 2002; Iijima et al., 2003a; Iijima et al., 2003b).

Entretanto, Palmieri et al. (2003) demonstraram que certas bactérias

do grupo Streptococcus sp, presentes na saliva, podem catalisar essa

reação em meio próximo do neutro, abrindo uma perspectiva de pesquisa

desse efeito também no megaesôfago.

6 Conclusões

6 Conclusões - 66

1. Nos pacientes com megaesôfago existe aumento da flora bacteriana

redutora de nitrato no esôfago, quando comparados a indivíduos sem

afecção esofágica.

2. Nos pacientes com megaesôfago existe aumento da quantidade relativa

e absoluta de nitrito no esôfago, quando comparados a indivíduos sem

afecção esofágica.

3. Dadas suas características microbiológicas, o líquido de estase esofágico

presente nos pacientes com megaesôfago é um meio favorável à reação

de formação de nitrosaminas.

7 Referências bibliográficas

7 Referências Bibliográficas - 68

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Apêndice

Apêndice

Apêndice A Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

HOSPITAL DAS CLÍNICAS

DA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CAIXA POSTAL, 8091

SÃO PAULO - BRASIL

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (Instruções para preenchimento no verso)

_____________________________________________________________

I - DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL

1. NOME DO PACIENTE ................................................................ ......................................................

DOCUMENTO DE IDENTIDADE Nº : ........................................ SEXO : .M ? F ? DATA NASCIMENTO: ......../......../...... ENDEREÇO .................................. ................................................... Nº ............................. APTO: .................. BAIRRO: .................................................................... CIDADE ........................................................................... CEP:..................................... TELEFONE: DDD (............) ......................................................................

2.RESPONSÁVEL LEGAL ........................................................................................................ NATUREZA (grau de parentesco, tutor, curador etc.) ............................................................

DOCUMENTO DE IDENTIDADE :....................................SEXO: M ? F ?

DATA NASCIMENTO.: ....../......./...... ENDEREÇO: ............................................................................ Nº ................... APTO: ......................... BAIRRO:................................................................... CIDADE: ............................................................... CEP: ....................................... TELEFONE: DDD (............)...................................................................

__________________________________________________________________________________

II - DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA

1. TÍTULO DO PROTOCOLO DE PESQUISA:

Estudo da redução de nitrato e da produção de compostos N-nitrosos, mediadas por bacterias, na luz esofágica de pacientes portadores de megaesôfago

2. PESQUISADOR: Denis Pajecki

CARGO/FUNÇÃO: Médico INSCRIÇÃO CONSELHO REGIONAL Nº 82306

UNIDADE DO HCFMUSP: Disciplina de Cirurgia do Aparelho Digestivo

Apêndice

3. AVALIAÇÃO DO RISCO DA PESQUISA:

SEM RISCO ? RISCO MÍNIMO ? RISCO MÉDIO

RISCO BAIXO ? RISCO MAIOR ?

(probabilidade de que o indivíduo sofra algum dano como consequência imediata ou tardia do estudo)

4.DURAÇÃO DA PESQUISA : 18 meses

__________________________________________________________________________________

III - REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU SEU REPRESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA CONSIGNANDO:

1. Justificativa e os objetivos da pesquisa: Os pacientes portadores de megaesôfago (esôfago dilatado) estão mais predispostos a desenvolver câncer do esôfago. Acreditamos que isto ocorra devido a presença de bactérias que ficam estagnadas no esôfago, juntamente com restos alimentares, as quais transformam substãncias normalmente presentes nos alimentos em outras substãncias que são cancerígenas. É necessário, entretanto, que esta hipótese seja comprovada para que métodos de prevenção do surgimento do câncer sejam desenvolvidos. Esteé, portanto, o objetivo deste estudo.

2. Procedimentos que serão utilizados e propósitos, incluindo a identificação dos procedimentos que são experimentais: Serão dosadas substãncias chamadas nitratos, nitritos e nitrosaminas da saliva e do líquido que fica estagnado no esõfago. A coleta da saliva será feita após realização de movimentos com a boca, solicitando-se ao paciente que elimine saliva sobre uma placa. A coleta do líquido esofágico será feita utilizando-se método seguro e já testado em 25 pacientes submetidos à um estudo prévio. Este consiste na passagem de uma sonda pela boca do paciente até o esôfago, de onde será aspirado o líquido. Este líquido servirá também para o estudo das bactérias nele presentes, procurando-se identificar aquelas capazes de participar na produção de substâncias cancerígenas.

3. Desconfortos e riscos esperados: Há um pequeno desconforto durante a passagem de sonda pela garganta. O procedimento será suspenso se o paciente tiver muito desconforto. Há o risco da sonda machucar a garganta mas este é muito pequeno e não foi observado em nenhum dos 25 pacientes que participaram do estudo previo. O risco de perfuração do esõfago é de 1 em 1.000.000 (um milhão), mas caso ocorra constitui-se em complicação grave com mortalidade de 80% dos casos não diagnosticados a tempo.

4. Benefícios que poderão ser obtidos: Estabelecer os passos de desenvolvimento do cãncer do esôfago em pacientes com megaesõfago, permitindo o desenvolvimento de métodos de prevenção.

5. Procedimentos alternativos que possam ser vantajosos para o indivíduo: Outros métodos possíveis de coleta de líquido esofágico apresentam o incoveniente de sofrer contaminação com bactérias da garganta e por este motivo não devem ser realizados.

Apêndice

IV - ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE GARANTIAS DO SUJEITO DA PESQUISA CONSIGNANDO:

1. Acesso, a qualquer tempo, às informações sobre procedimentos, riscos e benefícios relacionados à pesquisa, inclusive para dirimir eventuais dúvidas.

X SIM

2. Liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e de deixar de participar do estudo, sem que isto traga prejuízo à continuidade da assistência.

X SIM

3. Salvaguarda da confidencialidade, sigilo e privacidade.

X SIM

4. disponibilidade de assistência no HCFMUSP, por eventuais danos à saúde, decorrentes da pesquisa.

XSIM

5. viabilidade de indenização por eventuais danos à saúde decorrentes da pesquisa.

Não há viabilidade de indenização

__________________________________________________________________________________

V. INFORMAÇÕES DE NOMES, ENDEREÇOS E TELEFONES DOS RESPONSÁVEIS PELO ACOMPANHAMENTO DA PESQUISA, PARA CONTATO EM CASO DE

INTERCORRÊNCIAS CLÍNICAS E REAÇÕES ADVERSAS.

Denis Pajecki Rua Bahia 226 apto 22 Higienópolis São paulo-SP Tel: 38260674/91259406 __________________________________________________________________________________

VI. OBSERVAÇÕES COMPLEMENTARES:

_________________________________________________________________________________

VII - CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO

Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi explicado, consinto em participar do presente Protocolo de Pesquisa

São Paulo, de de 200 .

______________________________________ _____________________________________ assinatura do sujeito da pesquisa assinatura do pesquisador

ou responsável legal (carimbo ou nome Legível)

Apêndice

Apêndice B Aprovação do Projeto pela CAPPesq HC-FMUSP

Apêndice

Apêndice C Pacientes do Grupo Megaesôfago

No Paciente Registro-HC Sexo Idade Grau (Rezende,1960)

1m RAPC* 9863418C F 38 II

2m PAS* 13448321H M 48 II

3m GAG* 5299797E F 55 III

4m AFV* 2585901D M 68 III

5m OG* 5011746B M 65 II

6m LMA* 13557443J F 20 II

7m CPN* 3327942B M 74 III

8m JAC 13446492C M 64 III

9m JBA 3203828K M 73 III

10m MMSS 3246328C F 45 II

11m JRS 5185311G M 32 II

12m DJ 3203319K F 47 II

13m MVD 3166630B F 54 II

14m RBRG 13484314D F 19 III

15m BF 13442720A M 50 III

16m VMJ 3299434J F 49 II

17m JLF 13635650F M 41 III

18m ZMS 3020167A F 54 II

19m MBS 13448178E M 52 III

20m RAPC 9863418C F 38 II

21m PAS 13448321H M 48 II

22m GAG 5299797E F 55 III

*Pacientes excluídos da casuística final

Apêndice

Apêndice D Pacientes do Grupo Controle

No Paciente Registro-HC Sexo Idade

1c DP* 13436276B M 33

2c LBL* 13487699J M 30

3c ORMP 3388423G F 69

4c NLS 13298765I F 36

5c COM 3247654H F 46

6c IMS 3302876G F 52

7c AlS* 3320987A M 47

8c JMP 13429823C M 55

9c MLC 13452872J F 42

10c MLC* 3300435A M 61

11c CMT* 3377346A F 25

12c TAPE 13478253A F 38

13c PLS 17256325B M 43

14c FAC 3305673G M 65

15c EAS 2735296E M 30

16c SAT 3237015K M 54

17c AP 3126928J M 49

18c LAB 3259257K M 48

19c LPP 3201742C M 52

20c ARS 3229190F M 47

*Pacientes excluídos da casuística final

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tese de doutorado · 2006. 5. 10. · tese apresentada à faculdade de medicina da universidade de...

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