terapia gênica - princípios gerais modificação genética das células para produzir efeito...

Terapia gênica - Terapia gênica - Princípios geraisPrincípios geraisTerapia gênica - Terapia gênica - Princípios geraisPrincípios gerais

Modificação genética das células para Modificação genética das células para

produzir efeito terapêuticoproduzir efeito terapêutico

• Ex vivo:Ex vivo: modificação genética feita em células modificação genética feita em células em cultura que são administradas ao pacienteem cultura que são administradas ao paciente

• In vivo:In vivo: modificação feita diretamente no modificação feita diretamente no pacientepaciente

Modificação genética das células para Modificação genética das células para

produzir efeito terapêuticoproduzir efeito terapêutico

• Ex vivo:Ex vivo: modificação genética feita em células modificação genética feita em células em cultura que são administradas ao pacienteem cultura que são administradas ao paciente

• In vivo:In vivo: modificação feita diretamente no modificação feita diretamente no pacientepaciente

Necessidade de Necessidade de

– se conhecer o gene terapêutico (clonagem se conhecer o gene terapêutico (clonagem

do gene)do gene)

– método para liberar o gene na célula alvo método para liberar o gene na célula alvo

Métodos mais promissores:Métodos mais promissores: transferência transferência

gênica através de adenovirus associado e gênica através de adenovirus associado e

lentiviriuslentivirius

Necessidade de Necessidade de

– se conhecer o gene terapêutico (clonagem se conhecer o gene terapêutico (clonagem

do gene)do gene)

– método para liberar o gene na célula alvo método para liberar o gene na célula alvo

Métodos mais promissores:Métodos mais promissores: transferência transferência

gênica através de adenovirus associado e gênica através de adenovirus associado e

lentiviriuslentivirius

Terapia gênica - Terapia gênica - Princípios geraisPrincípios geraisTerapia gênica - Terapia gênica - Princípios geraisPrincípios gerais

Células alvo para introdução de genesCélulas alvo para introdução de genesCélulas alvo para introdução de genesCélulas alvo para introdução de genes

Células humanasCélulas humanas: :

hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos, hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos,

mioblastos, etcmioblastos, etc

Células xenogênicasCélulas xenogênicas: murinas, porcinas, : murinas, porcinas,

bovinas, outros primatas, etc bovinas, outros primatas, etc

– Desvantagens: transmissão de retrovírus e Desvantagens: transmissão de retrovírus e

xenoosis (algumas desconhecidas)xenoosis (algumas desconhecidas)

Células humanasCélulas humanas: :

hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos, hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos,

mioblastos, etcmioblastos, etc

Células xenogênicasCélulas xenogênicas: murinas, porcinas, : murinas, porcinas,

bovinas, outros primatas, etc bovinas, outros primatas, etc

– Desvantagens: transmissão de retrovírus e Desvantagens: transmissão de retrovírus e

xenoosis (algumas desconhecidas)xenoosis (algumas desconhecidas)

Métodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvo

ViraisVirais

– RetrovírusRetrovírus

– LentivírusLentivírus

– AdenovírusAdenovírus

– Adenovírus associadoAdenovírus associado

– Herpes simplesHerpes simples

ViraisVirais

– RetrovírusRetrovírus

– LentivírusLentivírus

– AdenovírusAdenovírus

– Adenovírus associadoAdenovírus associado

– Herpes simplesHerpes simples

LTRLTR gaggag polpol envenv

Retrovirus (wild-type) DNARetrovirus (wild-type) DNA

LTRLTR

LTRLTR Target DNATarget DNA LTRLTR

RetrovirusRetrovirusvector DNAvector DNA

GenomeGenome

PackagingPackagingcell linecell line

PackagingPackagingcell linecell line

GenomeGenomeProduct ofProduct ofexpressionexpression

cassettecassette

ProviralProviralRNARNA

ProviralProviralDNADNA

RTRT

IntegrationIntegration

Target cellTarget cell

ReceptorReceptorPackagedPackagedretrovirusretrovirus

vectorvector

Transferência GênicaTransferência GênicaTransferência GênicaTransferência Gênica

Lentivirus (HIV-1)Lentivirus (HIV-1)Lentivirus (HIV-1)Lentivirus (HIV-1)

também codificamtambém codificam

tat tat e e rev rev genes regulatórios da expressãogenes regulatórios da expressão

genes acessóriosgenes acessórios

VantagensVantagens

promovem transporte ativo do complexo através do promovem transporte ativo do complexo através do nucleoporo nucleoporo

infectam células que não estão em duplicaçãoinfectam células que não estão em duplicação

também codificamtambém codificam

tat tat e e rev rev genes regulatórios da expressãogenes regulatórios da expressão

genes acessóriosgenes acessórios

VantagensVantagens

promovem transporte ativo do complexo através do promovem transporte ativo do complexo através do nucleoporo nucleoporo

infectam células que não estão em duplicaçãoinfectam células que não estão em duplicação

AdenovirusAdenovirusAdenovirusAdenovirus

derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria

dos adultos já foi expostados adultos já foi exposta

eficientes para transferência gênicaeficientes para transferência gênica

não se integram no genoma (episomal)não se integram no genoma (episomal)

derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria

dos adultos já foi expostados adultos já foi exposta

eficientes para transferência gênicaeficientes para transferência gênica

não se integram no genoma (episomal)não se integram no genoma (episomal)

GenomeGenome

ComplementingComplementingcell linecell line

AdenovirusAdenovirusvectorvector

GenomeGenome

Product ofProduct ofexpressionexpression

cassettecassette

Target cellTarget cell

ReceptorReceptor

EndosomeEndosome

EpisomalEpisomalactionaction

Adenovirus (wild-type) DNAAdenovirus (wild-type) DNA

E1E1 E3E3


AdenovirusAdenovirusvector DNAvector DNA

ExpressionExpressioncassette cassette (Target DNA)(Target DNA)

E3E3

Adenovirus associado (AAV)Adenovirus associado (AAV)Adenovirus associado (AAV)Adenovirus associado (AAV)

Parvovírus humanos que requerem um adenovirus Parvovírus humanos que requerem um adenovirus

para mediar infecçãopara mediar infecção

Eficientes para transferência gênicaEficientes para transferência gênica

Não há doença conhecida associada com infecção Não há doença conhecida associada com infecção

pelo AAVpelo AAV

Podem integrar o genoma aleatoriamente Podem integrar o genoma aleatoriamente ouou

Podem ter localização episomalPodem ter localização episomal

Parvovírus humanos que requerem um adenovirus Parvovírus humanos que requerem um adenovirus

para mediar infecçãopara mediar infecção

Eficientes para transferência gênicaEficientes para transferência gênica

Não há doença conhecida associada com infecção Não há doença conhecida associada com infecção

pelo AAVpelo AAV

Podem integrar o genoma aleatoriamente Podem integrar o genoma aleatoriamente ouou

Podem ter localização episomalPodem ter localização episomal

Métodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvoMétodos para introdução do DNA alvo

Não-ViraisNão-Virais

– LIpofecçãoLIpofecção

– EletroporaçãoEletroporação

– Precipitação com Fosfato de cálcioPrecipitação com Fosfato de cálcio

– Bombardeio de partículasBombardeio de partículas

Não-ViraisNão-Virais

– LIpofecçãoLIpofecção

– EletroporaçãoEletroporação

– Precipitação com Fosfato de cálcioPrecipitação com Fosfato de cálcio

– Bombardeio de partículasBombardeio de partículas

Plasmid withPlasmid withexpressionexpression

cassettecassette(target DNA)(target DNA)

GenomeGenome

Product ofProduct ofexpressionexpression

cassettecassette

Target cellTarget cellEndosomeEndosome

EpisomalEpisomalactionaction

Fuse withFuse withplasma membraneplasma membrane


LipossomesLipossomes


Injeção direta de DNA em células alvoInjeção direta de DNA em células alvo

– Ex:Ex: Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX

Anemia - injeção IM do gene da eritropoetinaAnemia - injeção IM do gene da eritropoetina

Neoplasias - injeção no tumor : Neoplasias - injeção no tumor : Gene p53 Gene p53

Gene suicidaGene suicida

Anti-senseAnti-sense

Infusão ou implante de células geneticamente Infusão ou implante de células geneticamente modificadasmodificadas

Injeção direta de DNA em células alvoInjeção direta de DNA em células alvo

– Ex:Ex: Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX

Anemia - injeção IM do gene da eritropoetinaAnemia - injeção IM do gene da eritropoetina

Neoplasias - injeção no tumor : Neoplasias - injeção no tumor : Gene p53 Gene p53

Gene suicidaGene suicida

Anti-senseAnti-sense

Infusão ou implante de células geneticamente Infusão ou implante de células geneticamente modificadasmodificadas

Regulatory Review Required for Gene Regulatory Review Required for Gene Transfer TrialsTransfer Trials

Regulatory Review Required for Gene Regulatory Review Required for Gene Transfer TrialsTransfer Trials

U.S. U.S.

Comitê de Ética LocalComitê de Ética Local

Comitê Local de BiosegurançaComitê Local de Biosegurança

FDAFDA

Recombinant DNA Advisory Committee, NIHRecombinant DNA Advisory Committee, NIH

BrazilBrazil


CONEPCONEP

Comitê Nacional de Biosegurança Comitê Nacional de Biosegurança

U.S. U.S.


Comitê Local de BiosegurançaComitê Local de Biosegurança

FDAFDA

Recombinant DNA Advisory Committee, NIHRecombinant DNA Advisory Committee, NIH

BrazilBrazil


CONEPCONEP

Comitê Nacional de Biosegurança Comitê Nacional de Biosegurança

Terapia gênica para hemofilia Terapia gênica para hemofilia Terapia gênica para hemofilia Terapia gênica para hemofilia

VantagensVantagens

níveis > 2% efeito terapêuticoníveis > 2% efeito terapêutico

não é necessária regulação gênica refinadanão é necessária regulação gênica refinada

não é necessária expressão tecido específicanão é necessária expressão tecido específica

rFVIII ou rFIX comerciais já existemrFVIII ou rFIX comerciais já existem

avaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticosavaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticos

VantagensVantagens

níveis > 2% efeito terapêuticoníveis > 2% efeito terapêutico

não é necessária regulação gênica refinadanão é necessária regulação gênica refinada

não é necessária expressão tecido específicanão é necessária expressão tecido específica

rFVIII ou rFIX comerciais já existemrFVIII ou rFIX comerciais já existem

avaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticosavaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticos

Ensaios ClínicosEnsaios ClínicosEnsaios ClínicosEnsaios Clínicos

Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos

com plasmideo contendo F.VIIIcom plasmideo contendo F.VIII

Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos

com plasmideo contendo F.VIIIcom plasmideo contendo F.VIII

Transplante de fibroblastos autólogoTransplante de fibroblastos autólogoTransplante de fibroblastos autólogoTransplante de fibroblastos autólogo

Implantar células no omentumImplantar células no omentum

Ex vivo Ex vivo pouco risco de transmissão para células pouco risco de transmissão para células

germinativasgerminativas

Expansão clonal de uma célula Expansão clonal de uma célula risco mínimo de risco mínimo de

mutagenesismutagenesis

Procedimento trabalhosoProcedimento trabalhoso

Implantar células no omentumImplantar células no omentum

Ex vivo Ex vivo pouco risco de transmissão para células pouco risco de transmissão para células

germinativasgerminativas

Expansão clonal de uma célula Expansão clonal de uma célula risco mínimo de risco mínimo de

mutagenesismutagenesis

Procedimento trabalhosoProcedimento trabalhoso


In vivoIn vivo

Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIIIInfusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII

Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIIIInfusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII

injeção IM de AAV/hF.IXinjeção IM de AAV/hF.IX

infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IXinfusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX

In vivoIn vivo

Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIIIInfusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII

Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIIIInfusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII

injeção IM de AAV/hF.IXinjeção IM de AAV/hF.IX

infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IXinfusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX

HemofiliaHemofilia HemofiliaHemofilia

• Administração do vetor bem toleradaAdministração do vetor bem tolerada

• Não houve formação de anticorposNão houve formação de anticorpos

• Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria hepática retrovirus ou adenovirus em artéria hepática

• Risco de transmissão para células germinativas parece baixaRisco de transmissão para células germinativas parece baixa

• Administração do vetor bem toleradaAdministração do vetor bem tolerada

• Não houve formação de anticorposNão houve formação de anticorpos

• Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria hepática retrovirus ou adenovirus em artéria hepática

• Risco de transmissão para células germinativas parece baixaRisco de transmissão para células germinativas parece baixa

HemofiliaHemofiliaHemofiliaHemofilia

• Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação

biologicamente ativobiologicamente ativo

• F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento

transitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientestransitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientes

• Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou

em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até

4%)4%)

• Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento

de até 11% nos níveis de F.IX. de até 11% nos níveis de F.IX.

• Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação

biologicamente ativobiologicamente ativo

• F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento

transitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientestransitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientes

• Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou

em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até

4%)4%)

• Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento

de até 11% nos níveis de F.IX. de até 11% nos níveis de F.IX.


41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia gênicagênica

DesafiosDesafios

sustentar efeitosustentar efeito

inibir resposta imuneinibir resposta imune

aumentar expressão do transgeneaumentar expressão do transgene

41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia gênicagênica

DesafiosDesafios

sustentar efeitosustentar efeito

inibir resposta imuneinibir resposta imune

aumentar expressão do transgeneaumentar expressão do transgene

Gene da Eritropoetina para Gene da Eritropoetina para tratamento de anemiatratamento de anemia

Gene da Eritropoetina para Gene da Eritropoetina para tratamento de anemiatratamento de anemia

Vetor não viralVetor não viral

injeção IM em injeção IM em

camundongoscamundongos

estímulo elétricoestímulo elétrico

Vetor não viralVetor não viral

injeção IM em injeção IM em

camundongoscamundongos

estímulo elétricoestímulo elétrico

Hematócrito antes e após terapia gênica Hematócrito antes e após terapia gênica com gene da EPOcom gene da EPO

Hematócrito antes e após terapia gênica Hematócrito antes e após terapia gênica com gene da EPOcom gene da EPO

35

45

55

65

75

85

95

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Hem

ató

crit

o (

%)

EPOEPO

O Sistema Tet-Off para controle da O Sistema Tet-Off para controle da expressão gênicaexpressão gênica

O Sistema Tet-Off para controle da O Sistema Tet-Off para controle da expressão gênicaexpressão gênica

Doxociclina ou Doxociclina ou tetraciclinatetraciclina

Doxociclina ou Doxociclina ou tetraciclinatetraciclina

Ausência de transcrição

Ausência de transcrição

TRETRETRETRE

PCMVPCMV tetRtetRtetRtetR ADADADAD

transativadortransativador

TRETRETRETRE pCMVpCMVpCMVpCMV Gene alvoGene alvoGene alvoGene alvo

pCMVpCMVpCMVpCMV Gene alvoGene alvoGene alvoGene alvoPresença de transcrição

Presença de transcrição

Controle da expressão gênica pela Controle da expressão gênica pela administração de Doxociclinaadministração de Doxociclina

Controle da expressão gênica pela Controle da expressão gênica pela administração de Doxociclinaadministração de Doxociclina

35

45

55

65

75

85

95

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Semanas

Hem

ató

cri

to (

%)

DoxociclinaDoxociclina

Células Células

ProgenitorasProgenitoras

HematopoéticasHematopoéticas

Células Células

ProgenitorasProgenitoras

HematopoéticasHematopoéticasPlacenta

Medula ÓsseaSangue Periférico

+ fatores de crescimento

Seleção CD34+

Crescimento in vitro

Transferência gênica

Infusão de células genéticamente alteradas

Correção de hemoglobinopatiaCorreção de hemoglobinopatiaCorreção de hemoglobinopatiaCorreção de hemoglobinopatia

anemia falciforme e talassemia (camundongos) anemia falciforme e talassemia (camundongos)

Vetor: lentivirusVetor: lentivirus

Gene: beta-globinaGene: beta-globina

Transferência do gene para células CD 34+Transferência do gene para células CD 34+

Mieloablação e infusão das células modificadasMieloablação e infusão das células modificadas

anemia falciforme e talassemia (camundongos) anemia falciforme e talassemia (camundongos)

Vetor: lentivirusVetor: lentivirus

Gene: beta-globinaGene: beta-globina

Transferência do gene para células CD 34+Transferência do gene para células CD 34+

Mieloablação e infusão das células modificadasMieloablação e infusão das células modificadas

Correção de talassemiaCorreção de talassemiaCorreção de talassemiaCorreção de talassemia

Correção de doença falciformeCorreção de doença falciformeCorreção de doença falciformeCorreção de doença falciforme

*

* *

X-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OFX-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OFTHERAPEUTIC GENE TRANSFERTHERAPEUTIC GENE TRANSFER

X-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OFX-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OFTHERAPEUTIC GENE TRANSFERTHERAPEUTIC GENE TRANSFER

Lethal diseaseLethal disease

Caused by gc cytokineCaused by gc cytokine

receptor deficiencyreceptor deficiency

Curable by bone marrow Curable by bone marrow

transplantationtransplantation

Lethal diseaseLethal disease

Caused by gc cytokineCaused by gc cytokine

receptor deficiencyreceptor deficiency

Curable by bone marrow Curable by bone marrow

transplantationtransplantation

Cavazzana-Calvo et al.Cavazzana-Calvo et al. Gene Gene

therapy of human severe therapy of human severe

imunodeficiency disease. imunodeficiency disease.

Science :288:669, 2000Science :288:669, 2000

Cavazzana-Calvo et al.Cavazzana-Calvo et al. Gene Gene

therapy of human severe therapy of human severe

imunodeficiency disease. imunodeficiency disease.

Science :288:669, 2000Science :288:669, 2000

2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação da cadeia gama do receptor comum para citocinada cadeia gama do receptor comum para citocina

– colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+)colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+)

– introdução do gene alvo + retrovírusintrodução do gene alvo + retrovírus

– reinfusão das células modificadas na corrente circulatória reinfusão das células modificadas na corrente circulatória

Resultado Resultado

– expressão do receptor nas células do sangue periférico e expressão do receptor nas células do sangue periférico e nos linfócitosnos linfócitos

– os linfócitos passaram a funcionaros linfócitos passaram a funcionar

– redução das infecçõesredução das infecções

2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação da cadeia gama do receptor comum para citocinada cadeia gama do receptor comum para citocina

– colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+)colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+)

– introdução do gene alvo + retrovírusintrodução do gene alvo + retrovírus

– reinfusão das células modificadas na corrente circulatória reinfusão das células modificadas na corrente circulatória

Resultado Resultado

– expressão do receptor nas células do sangue periférico e expressão do receptor nas células do sangue periférico e nos linfócitosnos linfócitos

– os linfócitos passaram a funcionaros linfócitos passaram a funcionar

– redução das infecçõesredução das infecções

Terapia gênica para tratamento de Terapia gênica para tratamento de imunodeficiência grave imunodeficiência grave


Terapia gênica para tratamento de Terapia gênica para tratamento de deficiência de adenosina deaminase (ADA)deficiência de adenosina deaminase (ADA)

Terapia gênica para tratamento de Terapia gênica para tratamento de deficiência de adenosina deaminase (ADA)deficiência de adenosina deaminase (ADA)

Também causa imunodeficiência graveTambém causa imunodeficiência grave

3 crianças com diagnóstico pré-natal3 crianças com diagnóstico pré-natal

colhido sangue de cordão umbilical e separadas colhido sangue de cordão umbilical e separadas células precursoras (CD34+)células precursoras (CD34+)

introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ retrovírus retrovírus

transplante autólogotransplante autólogo

Resultado: melhora das infecçõesResultado: melhora das infecções

Também causa imunodeficiência graveTambém causa imunodeficiência grave

3 crianças com diagnóstico pré-natal3 crianças com diagnóstico pré-natal

colhido sangue de cordão umbilical e separadas colhido sangue de cordão umbilical e separadas células precursoras (CD34+)células precursoras (CD34+)

introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ retrovírus retrovírus

transplante autólogotransplante autólogo

Resultado: melhora das infecçõesResultado: melhora das infecções

LTRLTRLTRLTR LTRLTRLTRLTR

c DNA Adenosina deaminasec DNA Adenosina deaminasec DNA Adenosina deaminasec DNA Adenosina deaminase

Detecção de vetor ADA por PCR Detecção de vetor ADA por PCR semiquantitativosemiquantitativo

Detecção de vetor ADA por PCR Detecção de vetor ADA por PCR semiquantitativosemiquantitativo

Kohn et al, 1995, Nature MedicineKohn et al, 1995, Nature Medicine

Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancerto tumors of patients with lung cancer

Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancerto tumors of patients with lung cancer

J.A. Roth, et alJ.A. Roth, et al

Nature Medicine, Volume 2, Number 9, September 1996Nature Medicine, Volume 2, Number 9, September 1996

Pretreatment (a and c) and Pretreatment (a and c) and

30 day posttreatment (b and 30 day posttreatment (b and

d) bronchoscopic imagesd) bronchoscopic images

Pretreatment (a and c) and Pretreatment (a and c) and

30 day posttreatment (b and 30 day posttreatment (b and

d) bronchoscopic imagesd) bronchoscopic images

Terapia Anti-senseTerapia Anti-senseTerapia Anti-senseTerapia Anti-sense

DNA alvoDNA alvoDNA alvoDNA alvo DNA anti-senseDNA anti-senseDNA anti-senseDNA anti-sense

TranscriçãoTranscriçãoTranscriçãoTranscrição

RNAm senseRNAm senseRNAm senseRNAm sense RNAm anti-senseRNAm anti-senseRNAm anti-senseRNAm anti-sense

Bloqueio da Tradução para proteínaBloqueio da Tradução para proteínaBloqueio da Tradução para proteínaBloqueio da Tradução para proteína

Terapia Anti-senseTerapia Anti-senseTerapia Anti-senseTerapia Anti-sense

Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb

et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996))

– Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam

bcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapiabcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapia

– 6 injeções parenterais do antisense 6 injeções parenterais do antisense

– Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4 Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4

pacientes com resposta parcialpacientes com resposta parcial

Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)

Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb

et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996))

– Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam

bcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapiabcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapia

– 6 injeções parenterais do antisense 6 injeções parenterais do antisense

– Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4 Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4

pacientes com resposta parcialpacientes com resposta parcial

Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)

Produção de vacinas de tumor Produção de vacinas de tumor autólogoautólogo

Produção de vacinas de tumor Produção de vacinas de tumor autólogoautólogo

Ressecção ecultivo de

células tumorais gene

Imunoestimulaçãodas células modificadas

Testar expressãogênica

Injetar células

sc

Gene SuicidaGene SuicidaGene SuicidaGene SuicidaEx: HSV - TKEx: HSV - TKEx: HSV - TKEx: HSV - TK

Herpes simplesHerpes simplesHerpes simplesHerpes simples Timidina QuinaseTimidina Quinase

GanciclovirGanciclovirGanciclovirGanciclovir

Fosforilação do GanciclovirFosforilação do GanciclovirFosforilação do GanciclovirFosforilação do Ganciclovir

Morte celularMorte celularMorte celularMorte celular

Células xenogênicas para terapia Células xenogênicas para terapia gênicagênica

Células xenogênicas para terapia Células xenogênicas para terapia gênicagênica

Exemplo:Exemplo: Linhagem murina produtora de vetor Linhagem murina produtora de vetor

contendo o gene suicida timidina quinase + regiões contendo o gene suicida timidina quinase + regiões

do vírus herpes simples para tratamento de Tumor do vírus herpes simples para tratamento de Tumor

cerebralcerebral

Objetivo:Objetivo: induzir a transformação de uma pró-droga induzir a transformação de uma pró-droga

em droga. O herpes simples tem afinidade pelo em droga. O herpes simples tem afinidade pelo

sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o

ganciclovir . O ganciclovir fosforilado destrói a ganciclovir . O ganciclovir fosforilado destrói a

celulacelula

Exemplo:Exemplo: Linhagem murina produtora de vetor Linhagem murina produtora de vetor

contendo o gene suicida timidina quinase + regiões contendo o gene suicida timidina quinase + regiões

do vírus herpes simples para tratamento de Tumor do vírus herpes simples para tratamento de Tumor

cerebralcerebral

Objetivo:Objetivo: induzir a transformação de uma pró-droga induzir a transformação de uma pró-droga

em droga. O herpes simples tem afinidade pelo em droga. O herpes simples tem afinidade pelo

sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o

ganciclovir . O ganciclovir fosforilado destrói a ganciclovir . O ganciclovir fosforilado destrói a

celulacelula

Transferência de células produtoras de Transferência de células produtoras de HSV-tk em Tumor Cerebral HSV-tk em Tumor Cerebral

Transferência de células produtoras de Transferência de células produtoras de HSV-tk em Tumor Cerebral HSV-tk em Tumor Cerebral

Ram et al, 1997 - Nature Medicine 3:1354Ram et al, 1997 - Nature Medicine 3:1354

Segurança em Terapia GênicaSegurança em Terapia GênicaSegurança em Terapia GênicaSegurança em Terapia Gênica

Vetor adenoviral expressando gene Ornitina Vetor adenoviral expressando gene Ornitina

Carboxilase (OTC)Carboxilase (OTC)

Infusão em artéria hepática em adultos com doença Infusão em artéria hepática em adultos com doença

leve ou heterozigotos leve ou heterozigotos

Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu

altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg)altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg)

Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãosDesenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos

Vetor adenoviral expressando gene Ornitina Vetor adenoviral expressando gene Ornitina

Carboxilase (OTC)Carboxilase (OTC)

Infusão em artéria hepática em adultos com doença Infusão em artéria hepática em adultos com doença

leve ou heterozigotos leve ou heterozigotos

Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu

altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg)altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg)

Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãosDesenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos

Em 2002Em 2002

11 pacientes em tratamento com boa resposta: 11 pacientes em tratamento com boa resposta:

melhora da imunodeficiênciamelhora da imunodeficiência

– 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide

aguda (2002 , 2003, 2004)aguda (2002 , 2003, 2004)

– Interrupção do protocoloInterrupção do protocolo

Pacientes com imunodeficiência teriam menos Pacientes com imunodeficiência teriam menos

chance de rejeitar células neoplásicas??chance de rejeitar células neoplásicas??

Em 2002Em 2002

11 pacientes em tratamento com boa resposta: 11 pacientes em tratamento com boa resposta:

melhora da imunodeficiênciamelhora da imunodeficiência

– 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide 4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide

aguda (2002 , 2003, 2004)aguda (2002 , 2003, 2004)

– Interrupção do protocoloInterrupção do protocolo

Pacientes com imunodeficiência teriam menos Pacientes com imunodeficiência teriam menos

chance de rejeitar células neoplásicas??chance de rejeitar células neoplásicas??



Toxicidade potencial da terapia gênicaToxicidade potencial da terapia gênicaToxicidade potencial da terapia gênicaToxicidade potencial da terapia gênica

Relacionada ao vetorRelacionada ao vetor

- resposta imuneresposta imune

- integraçãointegração

Relacionada ao TransgeneRelacionada ao Transgene

- response imuneresponse imune

- superexpressionsuperexpression

Transmissão para células germinativasTransmissão para células germinativas

Relacionada ao vetorRelacionada ao vetor

- resposta imuneresposta imune

- integraçãointegração

Relacionada ao TransgeneRelacionada ao Transgene

- response imuneresponse imune

- superexpressionsuperexpression

Transmissão para células germinativasTransmissão para células germinativas

Segurança em terapia gênicaSegurança em terapia gênicaSegurança em terapia gênicaSegurança em terapia gênica

Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar

em genes ativos (exons) em genes ativos (exons)

– Schroder et al (Cell, 2002) Schroder et al (Cell, 2002)

– Nakai et al (Nature Genetics, 2003) Nakai et al (Nature Genetics, 2003)

Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar

em genes ativos (exons) em genes ativos (exons)

– Schroder et al (Cell, 2002) Schroder et al (Cell, 2002)

– Nakai et al (Nature Genetics, 2003) Nakai et al (Nature Genetics, 2003)

ConclusãoConclusãoConclusãoConclusão

Terapia gênica é uma realidadeTerapia gênica é uma realidade Terapia gênica é uma realidadeTerapia gênica é uma realidade

AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos

• Margareth Castro OzelloMargareth Castro Ozello

• Valder R.ArrudaValder R.Arruda

• Marcelo Agostinho SalomãoMarcelo Agostinho Salomão

• Denise Silvia SouzaDenise Silvia Souza

• Dilmara Lopes VicentimDilmara Lopes Vicentim

• Margareth Castro OzelloMargareth Castro Ozello

• Valder R.ArrudaValder R.Arruda

• Marcelo Agostinho SalomãoMarcelo Agostinho Salomão

• Denise Silvia SouzaDenise Silvia Souza

• Dilmara Lopes VicentimDilmara Lopes Vicentim

terapia gênica - princípios gerais modificação genética das células para produzir efeito...

Documents