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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
José Caetano da Silva Filho Resolução da Estrutura Cristalográfica da Lectina de Sementes da Canavalia maritima (ConM) em Complexo com o Ácido Indole-3-
Acético: Caracterização de Dois Novos Sítios de Ligação e Predição de sua Relevância Fisiológica
JOÃO PESSOA
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
José Caetano da Silva Filho Resolução da Estrutura Cristalográfica da Lectina de Sementes da Canavalia maritima (ConM) em Complexo com o Ácido Indole-3-
Acético: Caracterização de Dois Novos Sítios de Ligação e Predição de Sua Relevância Fisológica
Trabalho Acadêmico de Conclusão de Curso orientado pelo Prof. Dr. Plínio Delatorre e desenvolvido como um dos requisitos para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas pela Universidade Federal da Paraíba.
JOÃO PESSOA
2011
José Caetano da Silva Filho
Resolução da Estrutura Cristalográfica da Lectina de Sementes da Canavalia maritima (ConM) em Complexo com o Ácido Indole-3-Acético:
Caracterização de Dois Novos Sítios de Ligação e Predição de Sua Relevância Fisiológica
Este trabalho foi julgado adequado e aprovado para a obtenção do título de Bacharel
em Ciências Biológicas pela Universidade Federal da Paraíba
João Pessoa, _____ de __________________ de 2011
________________________________ Profa. Dra. Eliete Lima de Paula Zárate
Coordenadora do Curso de Ciências Biológicas
BANCA EXAMINADORA:
________________________________ Prof. Dr. Plínio Delatorre
Universidade Federal da Paraíba Orientador
________________________________ Profa. Dra. Tatiane Santi-Gadelha Universidade Federal da Paraíba
Banca
________________________________ Msc. Raphael Batista da Nóbrega Universidade Federal do Ceará
Banca
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal da Paraíba, pela oportunidade de desenvolver estágios de
iniciação científica, permitindo, assim, a aplicação dos conhecimentos adquiridos em
sala de aula;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq), pelo apoio financeiro;
Ao professor Dr. Plínio Delatorre, pela orientação durante esses quase três anos e
pelo apoio e ensinamentos em mim investidos;
A todos os professores do curso de Ciências Biológicas, mas de maneira especial ao
Dr. Carlos Alberto de Almeida Gadelha, pela ajuda no desenvolvimento desse
trabalho, e à Drª. Tatiane Santi-Gadelha, tanto pela ajuda quanto por ter aceitado
participar da banca examinadora;
Ao doutorando Msc. Raphael Batista da Nóbrega, pelos momentos de descontração,
troca de conhecimentos e por ter aceitado participar da banca examinadora;
Aos meus pais, José Caetano e Maria Salomé, por todas as dificuldades enfrentadas
desde que vim morar em João Pessoa e por todo o apoio oferecido para que esse
momento se concretizasse;
À minha esposa, Adlane Florentino, pelo carinho, atenção, compreensão e apoio;
A todos os colegas e amigos da turma 2008.1 do curso de Bacharelado em Ciências
Biológicas da UFPB, por todos os momentos vivenciados, inclusive os extraclasse,
durante todo o curso.
SUMÁRIO
Resumo ................................................................................................................................. 5
Abstract ................................................................................................................................ 6
1. Introdução ........................................................................................................................ 7
2. Fundamentação Teórica .................................................................................................. 9
2.1 Lectinas Vegetais ......................................................................................................... 9
2.1.1 Lectinas de Leguminosas ....................................................................................... 9
2.1.1.1 ConM, uma lectina extraída da Canavalia maritima........................................ 12
2.1.2 Estrutura das Lectinas ......................................................................................... 13
2.1.3 Domínio de Reconhecimento a Carboidrato ......................................................... 17
2.1.4 Sítios Hidrofóbicos ............................................................................................... 20
2.2. Hormônios Vegetais .................................................................................................. 22
2.2.1 Auxinas ................................................................................................................ 23
2.2.2 Ácido Indole 3-Acético (AIA) ................................................................................ 25
3. Objetivos ......................................................................................................................... 30
4. Materiais e Métodos ....................................................................................................... 31
4.1 Coleta de Dados de Difração de Raios X .................................................................... 31
4.2 Resolução da Estrutura Cristalográfica ....................................................................... 32
5. Resultados e Discussão ................................................................................................ 34
5.1 Difração de Raios X .................................................................................................... 34
5.2 Estrutura Geral ........................................................................................................... 34
5.3 Sítio de Ligação ao Ácido Indole-3-Acético (AIA) ........................................................ 36
5.4 Relevância Fisiológica ................................................................................................ 40
5.5 Ligação do Grupamento Indolil ................................................................................... 43
5.6 O que Indica a Presença do Grupamento Indolil? ....................................................... 47
6. Conclusões ..................................................................................................................... 50
7. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 51
5
RESUMO
Lectinas representam uma classe de proteínas caracterizadas por sua capacidade
de se ligar específica e reversivelmente a mono- e/ou oligossacarídeos. Todas as
formas de vida existentes expressam essas proteínas, embora aquelas de origem
vegetal, especialmente as extraídas de sementes das leguminosas Diocleinae,
sejam mais estudadas, uma vez que, em detrimento da conservação de suas
estruturas primária, terciária e quaternária, tais proteínas apresentam diferenças
quanto às atividades biológicas desenvolvidas. Nesse sentido, a maioria das funções
atribuídas às lectinas leva em consideração sua capacidade de decifrar os
glicocódigos da superfície celular. Entretanto, é cada vez maior o número de
evidências demonstrando que tais proteínas tem afinidades maiores por compostos
hidrofóbicos, como a adenina e o ácido indole-3-acético (AIA). Assim sendo, o
presente trabalho demonstra, pela primeira vez, a resolução da estrutura
cristalográfica da ConM, uma lectina isolada de sementes da leguminosa Canavalia
maritima, em complexo com o AIA, o qual encontra-se coordenado na cavidade
formada pela associação entre os dímeros canônicos, hipotetizando-se que a lectina
seria uma nova forma de armazenamento desse fitormônio, tornando-o disponível
através da ruptura de seu arranjo quaternário mediante a acidificação do meio
extracelular. Além disso, reportamos a presença do grupamento indolil, a estrutura
base do AIA, sendo coordenado no domínio de reconhecimento a carboidrato da
CML, indicando que essa região é um novo sítio de ligação para compostos
hidrofóbicos.
Palavras-chave: lectina; ConM; AIA; indolil; sítio hidrofóbico.
6
ABSTRACT
Lectins are a group of proteins characterized by its ability in interacts specifically and
reversibly with mono- and oligosaccharides. Such macromolecules are expressed in
all forms of life, although those from plants, specifically those extracted from
Diocleinae leguminous seeds, is more studied, once they present different biological
activities, despite their primary, tertiary and quaternary structures conservation. The
majority of biological activities reported to them take into account its capability in
decipher the glycocodes on cell surface. However, several studies have reported the
ability of these proteins in interact with more affinity with hydrophobic compounds,
such as adenine and indole 3-acetic acid (IAA). Thus, in the present work, we report,
for the first time, the crystal structure of ConM, a lectin isolated from leguminous
Canavalia maritima seeds, in complex with IAA, which encounters coordinated in the
cavity formed by association between the canonic dimers, being hypothesized that
the lectin could be a novel storage form of this phytohormone, availabling it through
brake down of its tetrameric arrangement due the acidification of extracellular media.
Furthermore, we report the presence of indole group, the basic structure of IAA,
being coordinated by amino acid residues in the carbohydrate-recognition domain,
indicating that this area could be a novel hydrophobic binding site.
Keywords: lectin; ConM; IAA; indole; hydrophobic site.
7
1. INTRODUÇÃO
Segundo Lis & Sharon (1998), lectinas são proteínas de origem não imune
que possuem pelo menos um sítio não-catalítico de ligação reversível a mono- e
oligossacarídeos específicos. Apesar dessa ser a definição mais aceita para essas
proteínas e das mesmas terem a recebido na segunda metade do século passado,
elas vem sendo estudadas desde o final do século XIX, quando Stillmark, em 1888,
isolou a primeira dessas proteínas, a qual foi denominada de ricina devido à planta
da qual foi extraída, Ricinus communis. Devido sua propriedade de aglutinar
eritrócitos (Fig. 1), essa proteína, bem como todas aquelas de origem vegetal que
apresentavam a mesma característica, foi denominada de fitohemaglutinina.
Entretanto, sabe-se hoje que a ricina apresenta uma atividade hemaglutinante
relativamente baixa, sendo caracterizada pela sua alta toxicidade devido à sua
capacidade de inibir a síntese proteica (PEUMANS et al., 2001).
Figura 1 – Esquematização da ação aglutinante das lectinas, mostrando que proteínas com mais de um domínio de ligação podem interagir com os carboidratos na superfície de duas células adjacentes. (Adaptado de KENNEDY et al., 1995).
A partir de seus estudos com o sistema sanguíneo ABO, Boyd & Shapleigh
(1954), corroborando diversos trabalhos que demonstraram que aglutininas oriundas
de diferentes leguminosas reagiam de modo específico com células sanguíneas
(revisado por SHARON & LIS, 2004), passaram a utilizar o termo lectina (do latim
legere – selecionar, escolher) para nomear essas proteínas que ligavam-se com
especificidade aos glicoconjugados da superfície dos eritrócitos que caracterizavam
cada um destes no sistema ABO.
8
As lectinas constituem um grupo de proteínas presente em todas as formas
de vida, desde vírus até os mamíferos (KENNEDY et al., 1995). Como seria de se
esperar, cada tipo de organismo apresenta lectinas com a propriedade comum de
reconhecer carboidratos, embora suas sequências de resíduos de aminoácidos bem
como suas estruturas terciárias e quaternárias sejam bastante particulares, criando
um espectro de arranjos biológicos altamente diverso.
Devido à sua ampla distribuição, bem como aos seus aspectos estruturais e
de especificidade a sacarídeos, as lectinas podem ser classificadas de diversas
formas. Neste contexto, Vasconcelos e Oliveira (2004) revisaram essa temática,
destacando que as lectinas podem ser agrupadas levando-se em consideração três
parâmetros: (1) estrutura tridimensional; (2) relação estrutural e evolutiva e (3)
afinidade a monossacarídeos.
Sendo sua principal característica a capacidade de se ligar com
especificidade a carboidratos, as lectinas podem ser utilizadas, por exemplo, como
ferramentas para a detecção, o isolamento e a caracterização de glicoconjugados,
sendo essenciais para o entendimento de mudanças nas superfícies celulares em
processos fisiológicos e patológicos, bem como nos estudos imunológicos e
oncológicos (ETZLER, 1985; SHARON & LIS, 2004; KOMATH et al., 2006).
Entretanto, é cada vez maior o número de evidências que indicam que as
lectinas podem interagir com outros tipos de moléculas, como aminoácidos não-
proteicos (DELATORRE et al., 2007) e compostos hidrofóbicos (ROBERTS &
GOLDSTEIN, 1982; KONONOPOULOS, 2006). Tais observações podem servir
como um indicativo de um amplo espectro de funções e aplicações que,
futuramente, podem determinar a renomeação de lectinas, fato este que pode ser
influenciado pelo presente trabalho.
9
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 LECTINAS VEGETAIS
Lectinas estão presentes em virtualmente todos os representantes do reino
Plantae, desde as mais basais até aquelas caracterizadas pelo desenvolvimento de
flores (ETZLER, 1985).
Suas especificidades a carboidratos, bem como suas estruturas, tem sido
estudadas para uma grande variedade de espécies vegetais, onde se percebe que
lectinas de um determinado grupo taxonômico apresentam características únicas
que as distingue de outras categorias, conforme observado na Tab. 1.
2.1.1 Lectinas de leguminosas
As sementes dos legumes são particularmente ricas em lectinas, embora
estas proteínas possam também ser encontradas em outros órgãos e tecidos. A
família botânica a qual pertence os legumes, Fabaceae (Leguminosae), é muito
estuda com relação a essa classe de proteínas, uma vez que diversos estudos
indicam grande homologia sequencial e estrutural das lectinas, especialmente se as
mesmas são encontradas em espécies de uma mesma tribo ou subtribo (ETZLER,
1985).
É interessante destacar que o estudo de lectinas extraídas de leguminosas
sempre leva em consideração suas homologias com a Concanavalina A (ConA),
extraída de sementes da Canavalia ensiformis e que é a lectina desse grupo
taxonômico mais bem estudada com relação à sua estrutura e suas atividades
biológicas (LIS & SHARON, 1998). A partir de estudos comparativos, constatou-se
grande conservação de sequência e estrutura nos domínios de reconhecimento a
carboidrato e nos sítios hidrofóbicos. Devido a essa grande homologia, as demais
lectinas dessa família são denominadas de ConA-like.
10
Tabela 1 – Características das lectinas de diversos grupos taxonômicos vegetais. (Adaptado de
ETZLER, 1985).
A ConA e todas as demais lectinas ConA-like são extraídas de plantas
pertecentes à família Fabaceae, subfamília Papilinoidae e tribo Phaseolae, a qual
agrupa oito subtribos (Cajaninae, Clitoriae, Diocleinae, Erythrinae, Glycininae,
Kennediinae, Ophrestiinae e Phaseolinae). Destas, há especial interesse nos
estudos direcionados às lectinas da subtribo Diocleinae, principalmente com relação
aos gêneros Canavalia e Dioclea, uma vez que as mesmas apresentam grande
homologia em suas sequências e estruturas. Além disso, devido a essa
11
característica, que reflete a baixa modificação genética sofrida durante a evolução,
as lectinas podem ser utilizadas como marcadores moleculares em estudos e
investigações quimiotaxonômicas e filogenéticas (MOREIRA et al., 1993; MOREIRA
et al., 1995).
Nas leguminosas, as lectinas são, de maneira geral, sintetizadas em uma
forma imatura, com posterior processamento pós-traducional para a formação de
uma proteína madura, onde há a remoção de um peptídeo sinal na região N-terminal
(LORIS et al., 1998). As etapas desse processamento envolvem clivagem
proteolítica do peptídeo sinal (HIGGINS et al., 1983), trimming do C-terminal
(ETZLER, 1994; MANDAL et al.; 1994; YOUNG et al., 1995), remoção de
carboidratos ligados covalentemente (MIN et al., 1992; SHELDON & BOWLES,
1992), e ligação enzimática das extremidades C- e N-terminais originais
(CARRIGNTON et al., 1985; BOWLES et al., 1986). É interessante destacar que,
apesar das moléculas precursoras serem similares nas diferentes lectinas de
leguminosas, há variações nos processos pós-traducionais que fazem com que
essas proteínas sejam reunidas em três grupos distintos (REEKE & BECKER, 1986;
LORIS et al., 1998): o primeiro contem a ConA, que é um homotetrâmero com 237
resíduos em cada cadeia; no segundo encontra-se a favina, uma proteína dimérica
composta por uma cadeia α e uma β que juntas se assemelham a um monômero da
ConA; e no terceiro grupo encontra-se proteínas de cadeia única, como aquelas
derivadas da Dolichos biflorus. Todos os três grupos apresentam um processo
denominado de permutação circular, onde as extremidades N- e C-terminais da
molécula precursora, que estão espacialmente próximas uma da outra, após a
liberação do peptídeo sinal, são unidas covalentemente para formar,
temporariamente, uma proteína circular. Posteriormente, há a clivagem enzimática
dessa molécula em uma região distinta, criando-se assim novas extremidades
(GOODSELL, 2010) (Fig. 2). Entretanto, outras etapas diferem de uma lectina para
outra. Por exemplo, enquanto na favina há, após a remoção do peptídeo sinal, a
adição covalente de uma molécula glicídica ao resíduo Asn168 e a clivagem
enzimática da cadeia remanescente para a formação das subunidades α e β
(HEMPERLY et al., 1982), na ConA, após a remoção do peptídeo sinal, a cadeia
remanescente é clivada em diversas subunidades menores que, pelo processo de
permutação circular, dão origem à proteína madura (BOWLES et al., 1986).
12
Figura 2 – Maturação da ConA através do processo de permutação circular. A molécula precursora (PDB ID 3CNA) possui uma extremidade C-terminal, a qual se encontra próximo ao N-terminal, e um loop extras, ambas as estruturas representadas pelo pontilhado azul claro. No processamento, a cauda C-terminal extra é clivada enzimaticamente e a nova extremidade é unida ao N-terminal para formar uma proteína circular. Posteriormente, o loop extra também é clivado para dá origem às novas extremidades da, agora, proteína madura. (Adaptado de GOODSELL, 2010).
2.1.1.1 ConM, uma lectina extraída da Canavalia maritima
A ConM é uma lectina extraída de sementes da Canavalia maritima, uma
leguminosa presente em regiões tropicais e que é conhecida popularmente como
“feijão-de-praia”. Sua lectina foi purificada inicialmente por Perez et al. (1991), os
quais a caracterizaram como sendo uma proteína com 25 kDa e 237 resíduos de
aminoácidos por monômero, assim como as demais lectinas Diocleinae. Gadelha et
al. a cristalizaram (2005a) e resolveram sua estrutura tridimensional nativa (2005b),
destacando sua capacidade de induzir a produção de óxido nítrico. Além disso, este
trabalho demonstrou que a ConM apresenta 98% de similaridade em sua estrutura
primária quando comparada com a ConA, onde apenas cinco resíduos diferem de
uma proteína para outra (D58G, A70G, M129S, E192D e P202S – as primeiras
letras referem-se à ConA e as segundas à ConM). Delatorre et al. (2006) resolveram
a estrutura tridimensional da ConM complexada com maltose e trealose, observando
que a afinidade dessa lectina por dissacarídeos, previamente reportada por Ramos
et al. (1996), era ocasionada pela interação entre a Tyr12 e o segundo anel dessas
moléculas.
13
2.1.2 Estrutura das lectinas
Lectinas provenientes de vegetais e microrganismos são as proteínas dessa
classe mais conhecidas e estudadas. Lectinas de origem animal, classificadas como
tipo C, galectinas (ou tipo S) e tipo P, vem sendo estudadas desde a década de 80 e
suas estruturas cristalográficas vem sendo resolvidas a relativamente pouco tempo.
Estudos indicam que lectinas do grupo das galectinas apresentam uma estrutura
tridimensional muito semelhante àquela de lectinas de leguminosas (DODD &
DRICKAMER, 2001).
De acordo com suas características estruturais, as lectinas são proteínas
ligadoras de carboidrato que se enquadram no grupo II dessa classe, não possuindo
em seu sítio de reconhecimento a sacarídeos atividades enzimáticas ou de
anticorpos (RINI, 1995), fato este utilizado para sua própria definição, como
destacado anteriormente.
As lectinas de leguminosas são excelentes fontes de estudos para se
entender as relações estrutura-função que caracterizam uma proteína, uma vez que
apesar da enorme homologia existente entre suas sequências e suas estruturas
terciárias e quaternárias, as mesmas apresentam distintas especificidades por
mono- e oligossacarídeos (MANOJ & SUGUNA, 2001). Seus monômeros
apresentam um peso médio de 25kDa, possuindo dois sítios de ligação altamente
conservados para os íons divalentes Ca2+ e Mn2+, os quais são essenciais para a
estabilização da proteína e coordenação das moléculas de carboidrato (BECKER et
al., 1975; BREWER et al., 1983). Cada íon está coordenado por seis interações de
hidrogênio (Fig. 3), sendo quatro provenientes da proteína e duas de moléculas de
água. A essencial presença dos íons, particularmente do cálcio, para a ligação das
lectinas a carboidratos pode ser explicada pela capacidade dos resíduos que
compõem o domínio de reconhecimento a carboidrato serem, também, os
responsáveis pela coordenação desse íon (LORIS et al., 1998), conforme observado
na Fig. 3. É interessante ressaltar que existem exceções para essa necessidade de
sítios de ligação para íons divalentes. Por exemplo, as lectinas αAI (amylase
inhibitor) e arcelin (OSBORN et al., 1988; MIRKOV et al., 1994), derivadas da
leguminosa Phaseolus vulgaris, não possuem o loop correspondente aos resíduos
14
Pro13-Pro23 de outras lectinas de leguminosas, o qual está envolvido na
coordenação dos íons. Neste caso, a estabilização das proteínas parece ser
efetuada através de interações entre os aneis da Tyr85 e da Phe127, bem como por
duas interações de hidrogênio entre as cadeias principais dos resíduos
Ala84/Thr205 e Gly207/Ala84 (BOMPARD-GILLES et al., 1996; HAMELRYCK et al.,
1996).
Figura 3 – Coordenação dos íons Ca2+ e Mn2+. Nota-se que a coordenação daquele envolve resíduos de aminoácidos (Tyr12 e Arg228) que participam também da coordenação de moléculas glicídicas no CRD, explicando, assim, a necessidade da presença desse íon para a ligação a carboidratos. (Adaptado de LORIS et al., 1998).
Cada monômero possui uma arquitetura tridimensional denominada de jelly-
rool (SRINIVAS et al., 2001), onde um “sanduiche” é formado por uma parte frontal
contendo sete folhas-β antiparalelas (Fig. 5B) que se sobrepõe a uma porção
posterior com seis folhas-β antiparalelas (Fig. 5C), de modo que estas duas regiões
estão conectadas de um lado por cinco folhas-β, além da existência de diversos
loops (Fig. 5A). Entretanto, as formas biologicamente ativas das lectinas dessa
subtribo se encontram di- ou tetramerizadas, fato este influenciado pelo pH do meio
(SENEAR & TELLER, 1981; OLIVEIRA et al., 2008; NAGANO et al., 2008).
É interessante ressaltar que a maioria das lectinas de leguminosas apresenta
um arranjo dimérico conhecido como dímero canônico (Fig. 5D), onde um monômero
interage com outro lado a lado de modo a formar uma arquitetura contínua, através
15
da associação das porções posteriores de cada monômero, de 12 folhas-β
antiparalelas (EDELMAN et al., 1972; HARDMAN & AINSWORTH, 1972; EINSPAHR
et al., 1986) e onde cada um forma uma angulação em relação ao outro. Já a
estrutura tetramérica, descrita primeiramente para a ConA (EDELMAN et al., 1972;
HARDMAN & AINSWORTH, 1972; REEKE et al., 1975), é formada pela associação
entre as partes posteriores de dois dímeros canônicos (Fig. 5E), as quais, sendo
côncavas, formam uma cavidade preenchida com água que na ConA possui um
volume de cerca 5000 Å3. Entretanto, de acordo com a arquitetura dimérica de cada
lectina, que pode ser canônica ou não (PRABU et al., 1998), esta associação pode
se dá de diferentes formas, de modo que variações são detectadas nos arranjos
quaternários (BOUCKAERT et al., 1999; VIJAYAN & CHANDRA, 1999; MANOJ &
SUGUNA, 2001) (Fig. 4), refletindo-se, assim, nas diferenças de atividades
biológicas, como abordado por Sanz-Aparício et al. (1997) para a lectina da
Canavalia brasiliensis (ConBr) .
Figura 4 – Variações das estruturas quaternárias encontradas em lectinas de leguminosas. (Adaptado de VIJAYAN & CHANDRA, 1999).
16
Figura 5 – Características gerais das estruturas terciária e quaternária das lectinas Diocleinae
baseada na ConM. (A) Representação do arranjo monomérico conhecido como beta sandwich
(SRINIVAS et al., 2001), destacando-se a sobreposição das sete folhas-β frontais (azul) em relação
às seis posteriores (laranja). (B) e (C) Disposição das sete folhas-β frontais (azul) e das seis
posteriores (verde), respectivamente. (D) Dímero canônico, destacando o arranjo contínuo de 12
folhas-β formado pelas porções posteriores de cada monômero (verde e magenta). (E) Arranjo
tetramérico formado a partir da associação entre dois dímeros canônicos, sendo um destes
constituído pelas cadeias polipeptídicas A (cinza) e B (magenta) e o outro pelas cadeias C (verde) e
D (vermelho). * Cavidade central gerada pela disposição dos dímeros canônicos no tetrâmero (ver
texto).
*
A
(E)
B C
D
(A) (B)
(C) (D)
17
Em adição aos sítios de ligação a carboidrato e àqueles destinados à coordenação do Ca2+ e do Mn2+, é cada vez maior o número de trabalhos que evidenciam a existência de sítios hidrofóbicos nas estruturas de lectinas de leguminosas. A caracterização do CRD será abordada na próxima seção e os sítios hidrofóbicos na seguinte.
2.1.3 Domínio de Reconhecimento a Carboidrato
Como já mencionado, lectinas apresentam uma ampla variedade de
especificidade para mono- e oligossacarídeos, podendo ser classificadas em cinco
grupos de acordo com sua afinidade por monossacarídeos (MANOJ & SUGUNA,
2001; VASCONCELOS & OLIVEIRA, 2004): manose/glicose (Man/Glc), galactose/N-
acetilgalactosamina (Gal/GalNAc), N-acetilglicosamina (GlcNAc), fucose e ácido N-
acetilneuramínico.
Esse espectro de possibilidades de interação com carboidratos pode ser
entendido a partir da análise do Domínio de Reconhecimento a Carboidrato (CRD)
(DRICKAMER, 1988), o qual, de maneira geral, possui uma arquitetura muito similar
nas lectinas de leguminosas (Fig. 8), sendo formado por quatro loops presentes na
superfície da região frontal de cada monômero (YOUNG & OOMEN, 1992; SHARMA
& SUROLIA, 1997). Nesse sentido, ressalta-se que lectinas extraídas de plantas
filogeneticamente relacionadas e que possuem a mesma afinidade por
monossacarídeos, como é o caso daquelas pertencentes à subtribo Diocleinae,
apresentam seus CRDs sequencialmente conservados (MANOJ & SUGUNA, 2001)
(Fig. 6), embora a especificidade por carboidratos mais complexos seja diferente
(LIS & SHARON, 1998). A partir disso, constata-se que essa variação se reflete nas
atividades biológicas desempenhadas por essas proteínas, onde, por exemplo,
verifica-se que ConA, ConM e ConBr se diferenciam, dentre outras coisas, quanto
aos efeitos pró- e antiinflamatórios (ALENCAR et al., 1999; ASSREUY et al., 1999;
BENTO et al., 1993), liberação de histamina (GOMES et al., 1994; FERREIRA et al.,
1996), produção de óxido nítrico (ANDRADE et al., 1999), mitogenicidade (BARRAL-
NETO et al., 1992) e produção de citocinas (CAVADA et al., 2001).
18
Mas como uma região que apresenta extrema conservação em sua sequência
de resíduos de aminoácidos pode apresentar especificidades tão distintas? Uma
resposta para tal questionamento foi dada pelo trabalho de Gadelha e colaboradores
(2005b) ao demonstrar que os CRDs da ConM e da ConA apresentam uma
conformação ligeiramente diferente devido a uma mutação que altera o resíduo 202,
o qual naquela é uma Serina e nesta é uma Prolina, mostrando que essa
modificação deixa o domínio da ConM cerca de 0.70 Å mais aberto que o da ConA ,
permitindo, assim, que carboidratos mais complexos possam interagir com maior
facilidade com aquela proteína.
As moléculas de carboidratos nas lectinas da subtribo Diocleinae são
coordenadas, de maneira geral, pelos resíduos Tyr12, Asn14, Leu99, Tyr100,
Asp208 e Arg228 (LORIS et al., 1998) (Fig. 7) por meio de interações de hidrogênio
e de forças de Van der Waals (PEUMANS & VAN DAMME, 1995). Um sétimo
resíduo pode participar dessa coordenação: o Asp16 via seu átomo de oxigênio O4
que pode interagir com o núcleo do trimanosídeo Manα1-3[Manα1-6]Man, como
demonstrado pela resolução da estrutura cristalográfica da ConA complexada com
esse trissacarídeo (LORIS et al., 1996; NAISMITH & FIELD, 1996).
19
Figura 6 – Alinhamento das sequências de resíduos de aminoácidos de algumas lectinas extraídas
de espécies pertencentes à subtribo Diocleinae, destacando a grande homologia existente entre
estas proteínas. As setas indicam os resíduos que compõem os CRDs (ver texto) e as pontas de
flecha aqueles que constituem a cavidade hidrofóbica (ver seção 2.1.4). ConA (C. ensiformis); ConBr
(C. brasiliensis); ConM (C. maritima); Dguia (Dioclea guianensis); Cra (Cratylia mollis); * Resíduos
conservados; : modificações de conservação; . modificações semi-conservadas. (Adaptado de
GADELHA et al., 2005b).
É interessante destacar que lectinas de leguminosas pertencentes a subtribos
e até tribos diferentes, mesmo possuindo resíduos distintos, apresentam
equivalência nos seus CRDs quando suas estruturas são sobrespostas (LORIS et
al., 1998), como ilustrado na Fig. 8 para a ConM e a DBL, a lectina extraída de
sementes da Dolichos biflorus.
Figura 7 - Domínio de Reconhecimento a Caboidrato (CRD) da ConM, destacando-se os resíduos de aminoácidos (cinza) que estabilizam a maltose (azul) (PDB ID 2CYF – Adaptado de DELATORRE et al., 2006).
20
Figura 8 – Sobreposição do CRD da ConM (verde – PDB ID 2CYF) e do sítio de ligação a monossacarídeos da DBL [(cinza) PDB ID 1BJQ – HAMELRYCK et al., 1999], mostrando a conservação na arquitetura dessa região em lectinas extraídas de espécies de subtribos diferentes. Além disso, nota-se que alguns dos resíduos da DBL correspondem em posição aos da ConM (D85/D208, G103/R228, L127/Y12, N129/N14 e S215/L99).
2.1.4 Sítios hidrofóbicos
As funções biológicas e fisiológicas propostas para as lectinas vegetais,
especialmente para aquelas extraídas de leguminosas, tais como ativação de
linfócitos e indução de apoptose (NOWELL, 1960; WANG et al., 1975; BARBOSA et
al., 2001), processos de defesa contra herbivoria (JANZEN et al., 1976; PEUMANS
& VAN DAMME, 1995; FITCHES et al., 2001; MURDOCK & SHADE, 2002),
nodulação de raízes (BREWIN & KARDAILSKY, 1997; HIRSCH, 1999) e inibição de
infecção por diversos patógenos, como fungos e vírus (BROEKAERT et al., 1989;
PEUMANS & VAN DAMME, 1995), são consideradas como estando relacionadas a
sua capacidade de decifrar os glicocódigos presentes na superfície das células com
as quais interagem, uma vez que suas propriedades são completo ou parcialmente
inibidas por açúcares específicos. Entretanto, diversos estudos vêm indicando que
lectinas de leguminosas e de outros grupos taxonômicos, bem como de organismos
não-vegetais (STOITSOVA et al., 2003), podem interagir com outras moléculas,
21
como aminoácidos não-proteicos (DELATORRE et al., 2007) e compostos
hidrofóbicos (ROBERTS & GOLDSTEIN, 1982; ROBERTS & GOLDSTEIN, 1983;
HARDMAN & AINSWORTH, 1973; EDELMAN & WANG, 1978). Neste caso,
trabalhos tem sido desenvolvidos com as substâncias fluorescentes ANS (ácido 1,8-
analinonaftalenossulfônico) e TNS (ácido 2,6-toluidinilnaftalenossulfônico) (YANG
et al., 1974; ROBERTS & GOLDSTEIN, 1982), adenina (ROBERTS et al., 1986;
GEGG et al., 1992; GEGG & ETZLER, 1994), derivados hidrofóbicos de açúcares
(DE BOECK et al., 1984; KENELLOPOULOS, 1996) e com o ácido indole-3-acético
(AIA) (EDELMAN & WANG, 1978). É interessante destacar que boa parte desses
estudos indica que a afinidade de lectinas por compostos hidrofóbicos chegar a ser
maior que aquela para os próprios carboidratos (revisado por LIS & SHARON,
1986), mostrando, assim, que tais sítios podem ter uma importante relevância para
as atividades biológicas e fisiológicas desempenhadas por estas proteínas
Alguns estudos vêm propondo a existência de dois sítios hidrofóbicos
independentes nas lectinas. Por exemplo, Yang et al. (1974) identificaram um sítio
de ligação de alta afinidade na ConA para um ligante fluorescente. Edelman & Wang
(1978) reportaram que o triptofano e o AIA ligam-se com baixa afinidade à ConA,
propondo que existe um desses sítios em cada uma das quatro subunidades da
lectina. Além disso, Roberts & Goldstein (1982) propuseram a existência de um
único sítio de alta afinidade para o TNS em lectinas extraídas da leguminosa
Phaseolus lunatus e quatro sítios de baixa afinidade para o mesmo composto, um
em cada monômero.
Assim, a partir desses estudos, especula-se que existiria um sítio de alta
afinidade para compostos hidrofóbicos por tetrâmero e um de baixa afinidade por
monômero. O sito de alta afinidade ou cavidade hidrofóbica na ConA, baseado em
alguns estudos (EDELMAN et al., 1972; BECKER et al., 1975), estaria delimitado
pelos seguintes resíduos de aminoácidos: Y54, L81, L85, V89, V91, F111, S113,
V179, I181, F191, F212 e I214. Nesse sentido, é razoável imaginar que tal região
pode, de fato, estar relacionada a alguma função fisiológica e/ou biológica
desempenhada pelas lectinas, uma vez que tais resíduos são extremamente
conservados nos diferentes gêneros que compõem a subtribo Diocleinae (Fig. 6).
22
2.2 HORMÔNIOS VEGETAIS
Assim como os animais, as plantas utilizam diversos sinais químicos
extracelulares para a comunicação entre células, conhecidos como hormônios, que
atuam sobre o desenvolvimento e o crescimento do organismo. É interessante
destacar que muitos destes têm similaridades estruturais com aqueles encontrados
em animais, como mostrado na Fig. 9, embora, funcionalmente, aqueles pareçam ter
um espectro bem mais amplo (CHOW & McCOURT, 2006; LUMBA et al., 2010).
Entretanto, até o advento das modernas metodologias da biologia molecular, pouco
se sabia a respeito dos fitormônios devido à dificuldade de purificação de seus
receptores, de modo que a maioria dos estudos se baseava em comparações com
os análogos animais (CHOW & McCOURT, 2006).
Historicamente, os hormônios vegetais são classificados em cinco grupos de
moléculas orgânicas: auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico.
Entretanto, estudos mais recentes indicam a existência de diversos outros
compostos que se enquadram como fitormônios: jasmonatos, brassinosteroides,
óxido nítrico, ácido salicílico e estrigolactonas (LUMBA et al., 2010). De todos estes,
especial interesse é direcionado para auxinas e citocininas, uma vez que os mesmos
parecem ser requeridos de forma constitutiva, já que não se encontrou na natureza
nem em laboratórios, até o presente momento, nenhum organismo mutante que
apresentasse deficiência para estes dois hormônios e fosse viável (TAIZ & ZEIGER,
2004; p. 450).
Como o presente trabalho está focado para o ácido indole-3-acético, que é
uma auxina, as próximas seções serão direcionadas para uma descrição geral sobre
este fitormônio.
23
Figura 9 – Semelhanças estruturais entre alguns hormônios vegetais (esquerda) e animais (direita). Os nomes no centro representam as moléculas precursoras. (Adaptado de CHOW & McCOURT, 2006).
2.2.1 Auxinas
Auxina é um termo genérico utilizado para nomear todas aquelas substâncias,
naturais ou sintéticas, cuja função na planta seja semelhante àquela do Ácido
Indole-Acético (AIA) (SIMON & PETRÁŠEK, 2011), o qual foi o primeiro composto
dessa classe a ser identificado como sendo o responsável pelo crescimento
diferencial de coleóptilos em resposta à luz. Além disso, auxinas estão envolvidas
em processos de foto- e gravitropismos, na inibição do crescimento de raízes
primárias e na estimulação do desenvolvimento de raízes laterais (SIMON &
PETRÁŠEK, 2011; CASIMIRO et al., 2001; DELKER et al., 2008).
24
De maneira geral, apenas quatro auxinas são produzidas naturalmente pelas
plantas: além do AIA, há a presença do Ácido Indole-Butírico (IBA), do Ácido
FenilAcético (PAA) e do Ácido 4-CloroIndole-Acético (4-Cl-IAA) (KOEPFLI et al.,
1938; PORTER & THIMANN, 1965; WIGHTMAN & LIGHTLY, 1982). Todos esses
compostos apresentam uma estrutura bastante similar (Fig. 10), onde um grupo
substituinte está ligado covalentemente ao átomo de carbono C7 do anel indole
(condensação de um anel aromático de seis átomos de C com um anel pirrólico de
cinco átomos, sendo quatro carbonos e um nitrogênio).
Figura 10 – Estrutura química das quatro auxinas endógenas, destacando a similaridade proporcionada pela presença do grupo indole. (Adaptado de SIMON & PETRÁŠEK, 2011).
Embora estes quatro compostos sejam considerados auxinas endógenas,
apenas o AIA é mais bem compreendido com relação ao seu armazenamento,
transporte, percepção, mecanismo de ação e papel fisiológico (SIMON &
PETRÁŠEK, 2011). Nesse sentido, poucos trabalhos têm focado no papel das
outras auxinas (KOEPFLI et al., 1938; PORTER & THIMANN, 1965). Estudos
indicam que o IBA é uma forma de armazenamento mais estável do AIA (LUDWIG-
MÜLLER & HILGENBERG, 1995), sendo convertido enzimaticamente neste
composto por β-oxidação nos peroxissomos (EPSTEIN & LUDWIG-MÜLLER, 1993;
ZOLMAN et al., 2008). Tal conversão favorece o alongamento de pelos radiculares e
das células dos cotilédones (STRADER et al., 2010), de modo que ainda não se tem
evidência de um papel independente do AIA para o IBA. Já o 4-Cl-AIA, que possui
uma via biossintética não relacionada ao AIA, está presente em consideráveis
quantidades em sementes em desenvolvimento de leguminosas (SIMON &
PETRÁŠEK, 2011), estando envolvido na estimulação do crescimento do pericarpo
(REINECKE et al., 1995). Por sua vez, o PAA, que é o único derivado fenólico, tem
25
efeitos mais fracos sobre o alongamento caulinar de leguminosas (SMALL &
MORRIS, 1990), apresentando, entretanto, efeitos bactericidas (SLININGER et al.,
2004; SOMERS et al., 2005).
2.2.2 Ácido Indole-3-Acético (AIA)
Como mencionado anteriormente, o AIA foi a primeira auxina a ser
identificada e isolada. Além dos processos biológicos citados na seção anterior, este
fitormônio atua sobre a divisão, alargamento e diferenciação celular (COMMONER &
MAZIA, 1942; VANNESTE & FRIML, 2009), desenvolvimento do pólen (NI DI-AN et
al., 2002), formação foliar (HE et al., 2000) e embriogênese (AN et al., 2001;
FISCHER-IGLESIAS et al., 2001).
Todas essas funções desempenhadas pelo AIA levam em consideração sua
capacidade de interagir com o receptor nuclear TIR1/AFB da família de proteínas F-
box nas células-alvo. Esse receptor faz parte de um grande complexo proteico
chamado SCF. Em baixos níveis de AIA, a TIR1 se encontra fracamente ligada aos
repressores transcricionais Aux/IAA, os quais estão inibindo a atividade de fatores
transcricionais responsivos ao AIA (ARFs). Quando os níveis desse fitormônio
aumentam e há sua ligação ao TIR1, este estabiliza sua interação com os
repressores Aux/AIA, que passam a ser poliubiquitinizados por proteínas ligases
presentes no complexo para posterior degradação. Após esta etapa, ARFs se
tornam livres para promover a expressão de genes induzidos pelo AIA (revisado por
CALDERON-VILLALOBOS et al., 2010).
Entretanto, diversos estudos indicam que outras funções associadas ao AIA
não poderiam estar relacionadas à sua ligação com receptores nucleares, uma vez
que este hormônio vegetal induz respostas celulares rápidas, tais como ativação de
H+-ATPases (HAGER et al., 1991; HAGER, 2003), aumento dos níveis citosólicos de
cálcio (SHISHOVA & LINDBERG, 2004), ativação de espécies reativas de oxigênio
(SCHOPFER & LISZKAY, 2006) através da atividade da fosfatidilinositol-3-quinase
(JOO et al., 2005) e inibição de endocitose (PACIOREK et al., 2005).
26
Além desses fatores, as diversas funções morfogenéticas desempenhadas
pelo AIA estão relacionadas com a formação de um gradiente de concentração, o
qual é dependente de seu transporte polar (distribuição intra- e intercelular) e do
balanço existente entre sua síntese, conjugação e degradação (SIMON &
PETRÁŠEK, 2011).
O transporte polar diz respeito à direcionalidade, primariamente observada
nos experimentos pioneiros do século XIX onde o AIA, ainda não identificado àquela
época, movia-se sempre do ápice para a base do coleóptelo (transporte basípeto).
Com o avanço das técnicas e das metodologias de estudos, verificou-se que essa
característica era proporcionada pela distribuição diferencial de carreadores de
efluxo e de influxo ao longo da membrana plasmática das células (Fig. 11)
(PETRÁŠEK & FRIML, 2009). Os primeiros, representados pelas proteínas PIN
(GÄLWEILER et al, 1998; KŘEČEK et al., 2009), são os determinantes primários
desse transporte polar, existindo evidências de que subgrupos desses carreadores
estejam presentes no retículo endoplasmático, mediando o fluxo de AIA entre essa
organela, que é um local para sua degradação (WOODWARD & BARTEL, 2005), e o
citosol. Por sua vez, os carreadores de influxo podem ser representados pela
AUX1/LAX (BENNETT et al., 1996) e pelos ortólogos vegetais para os
transportadores ABCB de proteínas resistentes a múltiplas drogas (NOH et al., 2001;
GEISLER & MURPHY, 2006). Além disso, o AIA pode adentrar passivamente à
célula através de sua forma protonada ou por meio de um mecanismo ativo quando
encontrado sob sua forma desprotonada (SIMON & PETRÁŠEK, 2011). Assim
sendo, todos esses processos que influenciam a unidirecionalidade do transporte do
AIA contribuem para suas atividades, como exemplificado pelo crescimento
diferencial de coleóptilos quando de uma estimulação luminosa.
27
Figura 11 – Esquematização da distribuição assimétrica dos carreadores de influxo (círculos laranjas)
e efluxo (círculos roxos) do AIA ao longo da membrana plasmática de células vegetais, a qual é
responsável pela unidirecionalidade do transporte desse fitormônio. As setas tracejadas representam
a entrada por difusão passiva de moléculas de AIA protonadas. (Adaptado de KRAMER & BENNETT,
2006).
O outro fator que está relacionado com a formação de um gradiente de
concentração do AIA é o balanço existente entre sua síntese, conjugação e
degradação. Diversos estudos indicam que o mecanismo metabólico de biossíntese
do AIA é dependente de triptofano (Trp) (GORDON, 1958). Nesse sentido, há
evidências de que esse processo ocorre por meio de quatro vias distintas (Fig. 12),
sendo que apenas três parecem ocorrer em plantas. Entretanto, o trabalho de Wright
et al. (1991) evidenciou a existência de uma rota biossintética independente do Trp,
onde milhos (Zea mays) mutantes para o gene codificador da triptofano sintase não
eram capazes de converter esse aminoácido no AIA, embora a concentração do
fitormônio fosse aproximadamente 50 vezes maior nesses mutantes. A conjugação
refere-se à ligação covalente do AIA com outros compostos, como açúcares,
aminoácidos e peptídeos (ANDREAE & GOOD, 1955; WOODWARD & BARTEL,
2005; SEIDEL et al., 2006; NORMANLY, 2010), sendo estas as formas inativas
desse hormônio vegetal. Acredita-se que o metabolismo dessas formas conjugadas
seja o principal regulador dos níveis de AIA livre, sendo sua formação, bem como
degradação, que ocorre enzimaticamente (RAMPEY et al., 2004), influenciadas por
28
fatores ambientais, como luz e gravidade. Pensa-se que a conjugação seja um meio
de armazenamento, transporte e proteção contra a oxidação, atuando sobre a
remoção e o catabolismo desse fitormônio (TAIZ & ZEIGER, 2004, p. 455; DELKER
et al., 2008). O último fator que influencia o gradiente de concentração do AIA é sua
degradação, que parece ocorrer através de oxidação enzimática por múltiplas rotas
(TAIZ & ZEIGER, 2004, pp. 455, 456).
Figura 12 – Rotas metabólicas responsáveis pela produção do ácido indole-3-acético a partir do
triptofano. A rota (A) é a única que não ocorre em plantas, estando as enzimas presentes apenas em
bactérias assinaladas com um asterisco. (Adaptado de TAIZ & ZEIGER, 2004; p. 454).
Nesse sentido, o presente trabalho mostra a resolução da estrutura
cristalográfica da lectina isolada de sementes da leguminosa Canavalia maritima
(ConM) complexada com o ácido indole-3-acético, descrevendo, por meio de
substituição molecular, um novo sítio de ligação nessa proteína, o qual está de
acordo com estudos prévios realizados com a ConA “soaked” com outros compostos
hidrofóbicos (HARDMAN & AINSWORTH, 1973). A partir disso, hipotetiza-se as
29
possíveis implicações fisiológicas relacionadas com esse trabalho, mostrando uma
nova forma de armazenamento e transporte para o AIA, bem como ampliando o
espectro de funções desempenhadas por essas proteínas, o qual, nesse caso,
parece não ser influenciado pela interação com mono- ou oligossacarídeos. Além
disso, demonstra-se a existência de um novo sítio hidrofóbico próximo ao CRD.
30
3. OBJETIVOS
Geral
• Resolver a estrutura cristalográfica da lectina extraída das sementes da
Canavalia maritima (ConM) em complexo com o ácido indole-3-acético (AIA).
Específicos
• Verificar como ocorre a coordenação do AIA na estrutura tridimensional da
ConM;
• Analisar as mudanças conformacionais ocorridas na estrutura tridimensional
da ConM mediante a ligação do AIA;
• Inferir a possível relevância fisiológica da interação da ConM com o AIA a
partir da análise de sua estrutura tridimensional complexada.
31
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 COLETA DE DADOS DA DIFRAÇÃO DE RAIOS X
Cocristais da lectina de Canavalia maritima (ConM) complexada com o ácido
indole-acético (AIA) foram submetidos a experimentos de Difração de Raios X na
estação experimental MXI do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS),
localizado em Campinas, São Paulo. Padrões de difração foram obtidos utilizando-
se um comprimento de onda λ de 1.433 Å, sendo obtido um conjunto com 120
imagens (1° de oscilação) semelhantes àquela mostrada na Fig. 13B através de um
detector CCD (MAR Research).
Nesse processo, elétrons são acelerados em uma estrutura circular a uma
velocidade relativística (próxima à velocidade da luz – 3 x 108 m/s) de tal maneira
que imãs eletromagnéticos posicionados em pontos estratégicos provocam seu
desvio tangencial como um espectro de luz contendo todos os comprimentos de
ondas. No caso das estações experimentais destinadas a difração de raios X, essa
luz passa por um aparelho que permite a passagem apenas dos raios com
comprimento de onda referente aos raios X (cerca de 1 Å). Essa radiação é utilizada
nesse tipo de procedimento devido a seu comprimento, uma vez que é a única
capaz de permitir a visualização de ligações entre carbonos, os quais se distanciam
um do outro em aproximadamente 1.5 Å (LATTMAN & LOLL, 2008; pp. 1-3).
Os raios X são então incididos sobre os cristais, os quais contêm um arranjo
ordenado e periódico da proteína em estudo. Nesse processo, os raios incidentes
são desviados pelos elétrons que orbitam cada átomo da proteína, sendo, então,
captados por um detector localizado a uma determinada distância do cristal, gerando
um padrão que representa a disposição dos elétrons em uma determinada posição
(Fig. 13A) (LATTMAN & LOLL, 2008; pp. 19, 20). Como nosso interesse é elucidar a
estrutura tridimensional da macromolécula, os cristais são rotacionados em
determinados ângulos para que seja possível obter um conjunto de dados com o
maior número possível de spots a fim de se ter um alto grau de completeza, o que
representa visualizar o maior número de resíduos de aminoácidos.
32
Por se tratar de uma técnica de microscopia, desejamos conhecer as
estruturas formadoras dos cristais. Entretanto, diferentemente de outras técnicas, a
difração de raios X não faz uso de lentes, mas sim de cálculos computacionais que
mimetizam seu uso (LATTMAN & LOLL, 2008; p. 3). Assim, os padrões gerados
passam por um processamento matemático que recria as coordenadas posicionais
de cada átomo a partir das informações contidas ali, permitindo, portanto, a
resolução da estrutura tridimensional da proteína.
Figura 13 – Padrão de difração. (A) Esquematização de como um padrão de difração é gerado a partir da incidência de Raios X sobre um cristal proteico, destacando-se a ordenação das moléculas (Adaptado de LATTMAN & LOLL, 2008; p. 20). (B) Padrão obtido a partir da incidência de Raios X sobre o cristal da ConM complexada com o AIA. Cada ponto escuro, denominado spot ou “reflexão”, representa a soma de todos os raios difratados pelos elétrons dos átomos em uma determinada posição.
4.2 RESOLUÇÃO DA ESTRUTURA CRISTALOGRÁFICA DA CML COMPLEXADA
COM O IAA
As imagens foram processadas na Unidade de Proteômica Estrutural (UPE)
do Departamento de Biologia Molecular (DBM) da Universidade Federal da Paraíba
(UFPB) para se obter e analisar o modelo tridimensional da CML, verificando se
havia ou não presença de ligante.
33
O processamento se deu a partir do uso de softwares específicos e seguiu as
seguintes etapas:
1 – Integração das imagens: as 120 imagens foram integradas para formar uma
única através do software iMOSFLM (LESLIE, 1992), disponível no pacote de
programas CCP4 (Collaborative Computacional Project, Number 4, 1994);
2 – Escalonamento: a imagem foi transformada em uma matriz de linguagem binária
através do software SCALA (Collaborative Computacional Project, Number 4, 1994),
sendo analisados parâmetros como resolução, completeza e multiplicidade;
3 – Substituição molecular: os cálculos computacionais utilizados no processamento
recuperam apenas uma parte das informações contidas nos padrões de difração, a
qual representa a amplitude dos raios difratados. A fase destes é “perdida” [fato este
referido como “problema da fase” (LATTMAN & LOLL, 2008; pp. 3,5; McPHERSON,
2009, pp. 15, 16)], de modo que utilizamos procedimentos adicionais para recuperá-
la. Em nosso estudo, utilizou-se o método da substituição molecular através do
programa MolRep (VARGIN & TEPLYAKOV, 1997), utilizando-se como modelo para
a geração das coordenadas atômicas a molécula da ConM complexada com
maltose, depositada no Protein Data Bank sob o código 2CYF (DELATORRE et al.,
2006). Nesse caso, analisou-se os parâmetros wRfac e Score, que representam,
respectivamente, o quanto os dados obtidos pelo experimento de difração discordam
e concordam com o modelo utilizado.
O modelo tridimensional gerado a partir da substituição molecular foi
analisado e modelado através do programa COOT (EMSLEY & COWTAN, 2004),
onde se observou a presença ou não de densidade eletrônica para o ligante (AIA),
bem como se realizou a modelagem molecular para adequar o modelo à densidade
eletrônica obtida (mapas de densidade eletrônica Fo-Fc e 2Fo-Fc foram gerados a
2σ após refinamento posicional por restrições). A estrutura passou por diversos
ciclos de refinamentos de rotação e translação através do programa RefMac5
(MURSHUDOV et al., 2011), de modo que o modelo final foi refinado
anisotropicamente por restrição após a adição de moléculas de água às densidades
não explicadas do mapa Fo-Fc.
34
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 DIFRAÇÃO DE RAIOS X
A estrutura cristalográfica da ConM complexada com o ácido-3-indole acético,
depositada no banco de estruturas proteicas Protein Data Bank sob o código 3SNM,
foi resolvida com uma resolução de 2.15 Å, onde os cristais, pertencentes ao grupo
espacial ortorrômbico I222, apresentaram uma célula unitária com os seguintes
parâmetros (Å): a = 67.190, b = 70.740 e c = 97.750. A unidade assimétrica
apresentou apenas uma molécula (237 resíduos de aminoácidos), com um
coeficiente de Matthews (MATTHEWS, 1968) igual a 2.32 Å3 Da-1 e um conteúdo de
solvente aproximadamente igual a 47,1%. Dados escalonados encontram-se
descritos na Tab. 2. A substituição molecular indicou um coeficiente de correlação
(Scor) de 72,9 % e um wRfactor de 39,3 %.
5.2 ESTRUTURA GERAL
Como reportado pelo trabalho de Gadelha et al. (2005b), os primeiros a
caracterizarem sua estrutura tridimensional, a ConM possui 98% de similaridade em
sua sequência de resíduos de aminoácidos com a ConA, apresentando também
grande homologia em seu arranjo quaternário, seja este analisado do ponto de vista
mono-, di- ou tetramérico. Nesse sentido, o monômero da ConM, além da
conservação dos resíduos que formam os sítios hidrofóbico, de ligação aos íons
divalentes e do CRD, bem como dos que constituem as folhas-β, é caracterizado
pela presença de três pequenas α-hélices, as quais, aqui identificadas como αI, αII e
αIII, são formadas, respectivamente, pelos resíduos Asn14-Gly18, Asp80-Val84 e
Thr226-Leu230, estando a primeira e a terceira presentes na região próxima ao
CRD. Tais características conformacionais são preservadas quando da interação
entre a proteína e moléculas de carboidratos (DELATORRE et al., 2006).
35
Tabela 2 – Dados estatísticos da resolução da estrutura tridimensional da ConM complexada com o AIA.
Parâmetros Valores
Coleta dos dados
Número total de observações 83.787
Número total de observações únicas 12.629
Rmerge (%) 24,4
Limite de resolução (Å) 24,36-2,15
Completeza (%) 97,2
Multiplicidade 3,2
(I)/σ 2,8
Comprimento de onda (Å) 1,433
Grupo espacial I222
Parâmetros de cela (Å) a = 67,190
b = 70,740
c = 97,750
Refinamento
Limite de resolução (Å) 24,44-2,15
Rfactor (%) 20,6
Rfree (%) 22,5
Número de aminoácidos no arranjo biológico 237
Número de moléculas de água 60
RMS desvios dos valores ideais
Comprimento das ligações (Å) 0,026
Ângulos das ligações (graus) 2,654
Fatores de temperature
Média do B-fator para toda a proteína (Å2) 28,1
Gráfico de Ramachandran
Resíduos nas regiões mais favorecidas 90,75
Resíduos em regiões adicionalmente permitidas 9,25
36
A lectina extraída de sementes da leguminosa Canavalia maritima (ConM)
complexada com o AIA apresenta sua estrutura tridimensional de forma truncada, ou
seja, com uma pequena sequência de resíduos de aminoácidos, correspondente ao
loop formado entre o resíduo Ser117 e o Glu122, que não pôde ser modelada
através do programa COOT devido à baixa densidade eletrônica observada nessa
região, a qual, de forma geral, apresenta-se com grande instabilidade na maioria das
lectinas tipo ConA (BEZERRA et al., 2011). O mesmo resultado foi encontrado para
a ConM complexada com maltose e trealose (DELATORRE et al., 2006), embora em
sua estrutura nativa esse loop tenha sido modelado com êxito (GADELHA et al.,
2006). Além disso, outras regiões de loop, como aqueles compreendidos pelos
resíduos 149-151 e 160-163, apresentaram-se instáveis, produzindo densidades
eletrônicas fracas, como reportado pelos trabalhos anteriores.
Apesar dessas semelhanças, nosso estudo demonstrou que a ligação do AIA
produziu mudanças conformacionais consideráveis em algumas regiões da estrutura
tridimensional da ConM, como nas α-hélices αI e αIII (discutidas adiante), as quais
não foram formadas, e em algumas folhas-β (dados não mostrados).
5.3 SÍTIO DE LIGAÇÃO AO ÁCIDO INDOLE-3-ACÉTICO (AIA)
Um mapa Fo-Fc característico para o AIA foi observado próximo aos resíduos
Ser108 e Asn 131, sendo sua molécula, cujas coordenadas foram obtidas a partir da
plataforma eletrônica HICUP (www.xray.bmc.uu.se/hicup - KLEYWEGT, 2007),
adicionada para modelagem. Após seu posicionamento, adição das moléculas de
água, ciclos de refinamento e criação de um modelo tetramérico baseado em
cálculos de simetria através do programa PyMol (DELANO, 2004), verificou-se que o
AIA se encontra na interface dimérica do tetrâmero (Fig. 15), sendo coordenado por
oito ligações hidrofílicas (interações de hidrogênio) e cinco forças de Van der Waals
pelos resíduos Ser 108 e Asn131 do monômero A, pela Thr123 do monômero C,
pela molécula de AIA coordenada pelo monômero D e por três moléculas de água
(Fig. 14). As distâncias e os átomos que fazem a coordenação do AIA estão listadas
na Tab. 3. É importante ressaltar que baseado em sua localização, a estabilização
37
do AIA também pode ocorrer através de sua interação com outros resíduos que
fazem parte do loop 117-122, o qual, como já destacado na seção anterior, não pôde
ser modelado no presente trabalho.
Figura 14 – Sítio de ligação do ácido indole-3-acético. Como destacado no texto, a molécula de AIA (amarelo) presente na interface tetramérica é coordenada pelos resíduos Ser108 e Asn131 do monômero A (verde), Thr123 do monômero C (cian) e com a molécula de AIA coordenada pela cadeia D (magenta). Além disso, o AIA é estabilizado por três moléculas de água (esferas vermelhas).
38
Tabela 3 – Distâncias em ângstrons (Å) relativas entre os átomos que coordenam a molécula do AIA em seu sítio de ligação. O = oxigênio; OD = oxigênio delta; OG = oxigênio gama; N = nitrogênio; C = carbono; CB = carbono beta; HOH = molécula de água.
AIA Ser108/A Asn131/A HOH26 HOH31 HOH37 Thr123/C AIA/D
OG CB O OD1 CB C C5
O2 3.07 3.82 3.48 3.35
O3 2.84 4.09 2.23
N 3.82
C 3.98
C4 3.54
C5 3.98 3.88
C18 3.14
Como destacado anteriormente (ver seção 2.1.4), diversos estudos indicam
que lectinas de leguminosas podem interagir com ligantes hidrofóbicos com
especificidades maiores que aquelas apresentadas para a coordenação de
carboidratos. Nesse sentido, vários trabalhos propõem a existência de dois sítios de
ligação para esses compostos: um de maior afinidade e quatro com menor afinidade,
sendo, neste caso, um em cada monômero. O trabalho de Hardman & Ainsworth
(1973), através da substituição isomórfica múltipla, mostrou que alguns compostos
hidrofóbicos soaked com ConA apresentam picos relativamente fracos na região
onde encontra-se o resíduo Asn131, indicando que este seria o sítio de baixa
afinidade. Interessantemente, o resultado aqui apresentado está de acordo com
essa ideia, uma vez que demonstramos que o AIA é coordenado, dentre outros, pelo
resíduo Asn131 da ConM. Além disso, pela análise do modelo tetramérico,
observamos a existência de quatro moléculas de AIA sendo coordenadas na
cavidade formada pelos dímeros (Fig. 15), corroborando, assim, a presença de um
sítio em cada monômero. Deste modo, propomos que essa região representa os
sítios de baixa afinidade referidos por trabalhos anteriores. Como o sítio de alta
afinidade é extremamente hidrofóbico, como verificado pelos resíduos de
aminoácidos que o constituem (ver seção 2.1.4 e Fig. 7), acreditamos que moléculas
39
como AIA, que são hidrofóbicas em sua natureza, mas apresentam grupos químicos
que permitem a formação de interações hidrofílicas, não possam se ligar na
cavidade hidrofóbica, a qual se encontra a 29 Å do local onde o AIA está
coordenado na ConM (distância entre os átomos Cα da Tyr54 e da Asn131) , devido
a um impedimento estereoquímico gerado por esses grupamentos iônicos.
Embora os estudos realizados anteriormente tenham reportado a existência
de apenas um sítio de alta afinidade por tetrâmero, acreditamos que esse não seja o
fato real, uma vez que o mesmo está presente em todos os monômeros. Assim
sendo, trabalhos futuros devem ser realizados para verificar se a ligação de
compostos hidrofóbicos a esse sítio ocorre em apenas um dos monômeros e, nesse
caso, se sim, se há alguma relevância fisiológica, ou se a metodologia utilizada não
permitiu a coordenação dessas moléculas nos demais domínios.
Figura 15 – Modelo tetramérico da ConM complexada com o AIA (amarelo), mostrando a presença
de quatro moléculas da auxina na cavidade formada pela interação entre os dímeros canônicos,
corroborando, assim, diversos trabalhos que indicaram a presença de quatro sítios de baixa afinidade
para compostos hidrofóbicos nas lectinas vegetais (ver texto).
40
5.4 RELEVÂNCIA FISIOLÓGICA
Diante dos resultados aqui apresentados e de informações provenientes da
literatura científica, propomos um possível novo papel fisiológico para as lectinas
durante o processo de germinação.
Auxinas são hormônios vegetais cujas concentrações aumentam
drasticamente nas sementes quando do início do processo de germinação. Por
exemplo, Tillberg (1977) demonstrou que a concentração do AIA em sementes da
leguminosa Phaseolus vulgaris atinge um pico de aproximadamente 400% em
relação ao peso seco após 36 horas do início do processo, tendo, após esse
período, seus níveis diminuídos rapidamente, possivelmente devido sua capacidade
de inibir o desenvolvimento de certos tecidos, como proposto pela própria autora.
Assim, fica evidente que as auxinas são de extrema importância para o início da
germinação, mas que o subsequente estabelecimento de tecidos vegetais depende
de sua baixa disponibilidade na forma livre.
Anteriormente ao início da germinação, as auxinas encontram-se conjugadas
de forma covalente a aminoácidos, açúcares e peptídeos, de modo que sua
disponibilidade na forma livre, quando de condições favoráveis, torna-se possível a
partir da quebra enzimática desses complexos (ver seção 2.2.2.). A partir de sua
liberação, as auxinas, como AIA, promovem suas respostas fisiológicas de acordo
com seu transporte ou ligação a receptores intra- e extracelulares. No primeiro caso,
estudos indicam que o AIA pode se difundir passivamente pela membrana
plasmática ou pode ser translocado por um transportador dependendo de seu
estado de ionização. No interior da célula, a auxina pode induzir transcrição gênica a
partir do receptor nuclear F-boxTIR1 ou pode ser convertido em IBA no retículo
endoplasmático (SIMON & PETRÁŠEK, 2011). Por outro lado, como já destacado, o
AIA pode induzir respostas mais rápidas, o que pode ocorrer, dentre outras formas,
através de sua interação com o receptor ABP1, presente na superfície externa da
membrana celular (SAUER & KLEINE-VEHN, 2011). Nesse caso, a ligação do AIA
promove uma transdução de sinal (ainda não identificada) que culmina com a
41
ativação de H+-ATPases presentes na membrana, as quais liberam íons H+ no meio
externo à membrana plasmática, acidificando-o.
A partir desse momento, a lectina, que se encontra nesse ambiente em seu
estado tetramérico e complexado ao AIA, sofre uma mudança conformacional em
sua estrutura quaternária, deixando de ser um tetrâmero para se tornar dois
dímeros. Esse processo é referido como equilíbrio dímero-tetrâmero e diversos
estudos indicam que lectinas da subtribo Diocleinae se encontram em um estado
dimerizado em pH com valores relativamente ácidos e como tetrâmeros em pH
relativamente básico (OLIVEIRA et al., 2008; NAGANO et al., 2008). Embora
nenhum trabalho tenha demonstrado o intervalo de valores onde a ConM se
encontra di- ou tetramerizada, é de se imaginar que, devido à já reconhecida
homologia existente entre as lectinas Diocleinae, a nossa proteína de estudo
apresente comportamento similar, de modo que no pH extracelular de uma célula
vegetal, referido como estando em torno de 5,0 a 5,5 (SAUER & KLEINE-VEHN,
2011), a ConM se encontre como uma mistura desses arranjos quaternários. Nesse
sentido, é importante ressaltar que a maioria dos resíduos de aminoácidos que
participam da formação tetramérica da ConM, os quais são virtualmente os mesmos
reportados para outras lectinas Diocleinae (NAGANO et al., 2008), apresenta valores
de pI (potencial isoelétrico) relativamente ácidos (Tab. 4), indicando que a
diminuição do pH do meio provocada pela ligação do AIA livre à proteína ABP1
facilita sua protonação, de modo que a formação tetramérica é desfeita. Assim
sendo, nossa hipótese de trabalho é que as moléculas de ConM tetramerizadas
estejam fracamente associadas nesse arranjo quaternário devido ao pH do meio
extracelular e às propriedades da maioria dos resíduos de aminoácidos que
participam dessa formação, de modo que a ativação de ATPases de membrana pela
ABP1 favoreça a liberação de mais AIA mediante ruptura da estrutura tetramérica da
ConM.
Nossa hipótese também se baseia em alguns estudos que indicam que as
lectinas participam do processo de germinação, uma vez que suas concentrações
solúveis se tornam mais altas a partir do início dessa etapa do desenvolvimento
vegetal (OLIVEIRA et al., 1998), quando do princípio do desenvolvimento da plúmula
e da raiz, atingindo um determinado pico e posteriormente tendo seus níveis
42
reduzidos rapidamente (LAW & STRIJDOM, 1984; TOGUN et al., 2008),
possivelmente devido ao estabelecimento e maturação desses tecidos. Nesse
sentido, é razoável imaginar que esse aumento na concentração total de lectinas
nos primeiros momentos da germinação é resultado da ruptura de sua estrutura
quaternária, de modo que os dímeros formados a partir desse processo podem
contribuir para tal crescimento.
Esse pensamento é válido uma vez que Oliveira et al. (1998) demonstraram
que o conteúdo total de lectinas presentes nos cotilédones de sementes em
germinação da leguminosa Erythrina velutina forma aurantiaca aumenta desde o
início do processo até o 21° dia, indicando, ainda, que tal crescimento não era
proporcionado pela síntese “de novo” dessas proteínas. Assim, tais dados reforçam
nossa ideia inicial de que, provavelmente, a participação das lectinas na fisiologia
das sementes em germinação esteja ligada, também, à disponibilidade de auxinas
através da ruptura de seu arranjo tetramérico.
Portanto, hipotetizamos que a ConM possa servir como uma nova forma de
armazenamento e de controle da disponibilidade do AIA. Além disso, por esse
processo não ser realizado de forma covalente, não precisando assim de atividade
enzimática, propomos que a liberação do AIA a partir da mudança na estrutura
quaternária da ConM proporcionada pela acidez do meio possa ser um mecanismo
mais rápido para a disponibilidade desse hormônio, podendo, inclusive, ser o
processo primário.
Resíduo de aminoácido
pI Quantidade
Asn 5,41 4
Asp 2,77 4
Arg 10,76 4
His 7,59 4
Ser 5,68 10
Thr 5,87 4
Tabela 4 – Relação dos resíduos de aminoácidos que interagem entre si para a formação da estrutura tetramérica da ConM, destacando seus respectivos potenciais isoelétricos (pI) (LEHNINGER, 2002, p. 90) e a quantidade total de cada um destes.
43
5.5 LIGAÇÃO DO GRUPAMENTO INDOLIL
A resolução da estrutura da ConM complexada com o AIA nos mostrou a
presença do grupo indolil, formado pela condensação de um anel aromático com um
pirrólico e que é a estrutura base das auxinas, próximo ao CRD (Fig. 16). Esse
grupamento químico encontra-se coordenado por interações de hidrogênio e forças
de Van der Waals pelos resíduos Asn14, Asp16 e Arg228, estando estes últimos
envolvidos também na estabilização de moléculas glicídicas. A Tab. 5 lista os
átomos que participam da interação e suas respectivas distâncias relativas.
Figura 16 – Sítio de ligação do grupamento indolil, destacando os resíduos de aminoácidos que fazem sua coordenação. Como abordado no texto e na Fig. 8, estes são os mesmos resíduos que fazem parte do CRD nas lectinas Diocleinae.
44
Tabela 5 - Distâncias (Å) relativas entre os átomos que coordenam o grupamento indolil no sítio próximo ao CRD. Nota-se que a coordenação desse grupo químico é realizado principalmente por interações hidrofóbicas entre os átomos de carbono. C = carbono; CA = carbono alfa; CB = carbono beta; CD = carbono delta; CG = carbono gama; N = nitrogênio; NE = nitrogênio épsilon; NH = nitrogênio etá.
A presença do grupo indolil induziu uma mudança conformacional no resíduo
Asp16, de modo que a α-hélice da qual o mesmo fazia parte (αI) não pôde ser
formada. Como demonstrado na figura 17A, a cadeia lateral assume uma
conformação bem distinta daquela apresentada pelo mesmo resíduo nas estruturas
nativa (GADELHA et al., 2006) e complexada com açúcar (DELATORRE et al.,
2006), impossibilitando, assim, a interação entre seus átomos OD1 e N, os quais são
importantes para a formação da estrutura secundária. Além disso, essa alteração faz
com que o oxigênio do resíduo Thr15 fique a 4,12 Å do nitrogênio da ligação
peptídica da Gly18, desestabilizando a estrutura secundária. Como analisado por
Lehninger (2002, pp. 126-127), a interação de hidrogênio entre o oxigênio
eletronegativo da carbonila da ligação peptídica na extremidade N-terminal de uma
α-hélice, nesse caso representada pela Thr15, e o nitrogênio eletropositivo da
ligação peptídica no quarto resíduo que compõe uma volta nessa estrutura,
representado nesse caso pela Gly18, é de essencial importância para a formação de
uma α-hélice. Como a distância entre esses dois átomos na ConM impossibilita essa
interação, a α-hélice presente nessa região nas outras duas estruturas (nativa e
complexada com açúcar) é desfeita (Fig. 17A).
GRUPO INDOLE
Asn14 Asp16 Arg228
ND2 C CA CB CG CA CB NE NH1 CD
N1 3.57 3.42 2.63
C2 3.82
C5 3.94
C6 3.48 3.33 3.37 4.04 3.80
C7 4.00 3.70 3.11 3.79 4.01
C8 3.81 4.00 3.66
45
Por sua vez, a não formação da α-hélice αIII, que contém um resíduo de
arginina (R228) que estabiliza a molécula do indolil, parece não ser resultado, pelo
menos de maneira direta, da presença desse grupamento químico, já que nenhuma
mudança conformacional significativa é observada nos resíduos de aminoácidos que
compõe essa estrutura secundária. De fato, o que parece ocorrer, quando
comparamos essa região com aquela das estruturas nativa e complexada com
açúcar (Fig. 17B), é que a R228 não interage com moléculas de água, como o faz
nestas duas situações (a Tabela 6 compara as distâncias entre esses resíduos e as
moléculas de água correspondentes nas três estruturas). Assim, é razoável imaginar
que a presença dessas moléculas estabilizaria o resíduo, de modo que o mesmo
proporcionaria a formação da α-hélice. Como sua cadeia lateral é grande e bastante
flexível, promovendo diversas possibilidades de conformação, a não estabilização da
R228 em uma configuração adequada pela ausência de moléculas de água poderia
ser a responsável pela não formação da α-hélice.
(A)
46
Figura 17 – Mudanças conformacionais ocorridas na região de ligação do grupamento indolil e
comparação com as estruturas da ConM nativa (PDB ID 2CWM; amarelo) e complexada com maltose
(PDB ID 2CYF; cinza). (A) Sobreposição dos resíduos que fazem parte das α-hélices αI e αIII,
mostrando que na estrutura da ConM complexada com o AIA/índole (verde) essa estrutura
secundária não é formada. Nota-se a mudança conformacional ocorrida no resíduo Asp16 (verde), a
qual ocasionou a desestabilização da α-hélice αI (ver texto). (B) Destaque da Arg228 nas três
estruturas, mostrando que no caso da ConM nativa e daquela complexada com açúcar esse resíduo
de aminoácido se encontra estabilizado por duas moléculas de água (esferas amarelas e cinzas,
respectivamente), ao passo que na da ConM com AIA/indole, as moléculas correspondentes se
encontram distantes do resíduo (ver Tab. 6), impossibilitando, assim, sua estabilização e a
consequente formação da α-hélice αIII.
Tabela 6 – Distâncias (Å) entre os átomos da Arg228 nas estruturas da ConM nativa, complexada
com maltose e com o grupamento indole e duas moléculas de água, mostrando que nesta as
distâncias são relativamente longas, impossibilitando a estabilização do resíduo de aminoácido e, por
conseguinte, da α-hélice.
Molécula de água
Nativa Maltose Indole
NE NH2 NE NH1 NE NH2
I
II
3,1
2,9
2,9
3,2
5,0
3,9
I I
I
II
II
II
(B)
47
5.6 O QUE INDICA A PRESENÇA DO GRUPAMENTO INDOLIL?
A coordenação do indolil indica que compostos com arquitetura similar podem
interagir no mesmo sítio. Isso fica claro quando comparamos a coordenação do
grupo indolil com aquela da base nitrogenada adenina para a mesma lectina (PDB
ID 3S0S) (Fig. 18), indicando assim que essa região tem especificidade para
compostos hidrofóbicos, pelo menos com essa arquitetura básica. Além disso,
quando enfocamos a relevância fisiológica desse resultado, percebemos que esse
sítio próximo ao CRD pode servir para ligação de citocininas, que são hormônios
vegetais relacionados principalmente com a regulação da divisão celular e que são
derivados das bases púricas, como a adenina (SCHMÜLLING, 2004) (a Figura 19
ilustra a estrutura química de algumas citocininas).
Outros trabalhos demonstraram que lectinas tanto de leguminosas quanto de
outros grupos taxonômicos também podem interagir com a adenina (BOGOEVA et
al., 2004; BOGOEVA & RUSSEV, 2008; GEGG et al., 1992; GEGG & ETZLER,
1994; HAMELRYCK et al., 1999; KAVITHA et al., 2009; STOITSOVA et al., 2003).
Entretanto, nossos trabalhos indicam que, pelo menos na subtribo Diocleinae, essa
base nitrogenada pode se ligar em um sítio totalmente diferente daqueles reportados
anteriormente, onde sua coordenação é realizada na interface dimérica
(HAMELRYCK et al., 1999), semelhantemente à estabilização da molécula do Abu
pela CGL, uma lectina de sementes da C. gladiata (DELATORRE et al., 2007).
Nesse sentido, é interessante ressaltar que nosso resultado indica uma
característica inovadora para as lectinas, mostrando que resíduos que estabilizam
as moléculas de carboidratos no CRD também podem interagir com compostos
hidrofóbicos. Embora estudos indiquem a presença de um sítio para ligação de
compostos hidrofóbicos próximo ao CRD, como demonstrado por Kanellopoulos
(1996) para derivados não-polares de carboidratos, o resultado aqui apresentado
mostra a existência de outra região.
48
Figura 19 – Estruturas químicas de citocininas de ocorrência natural e sintética (thidiazuron). Destaca-se a arquitetura básica desses hormônios formada a partir do anel purínico da adenina. Além disso, nota-se que as citocininas podem ocorrer na forma conjugada de ribosídeos (ZR), ribotídeos (ZRMP) ou glucosídeos (ZOG). (Adaptado de SCHMÜLLING, 2004).
Figura 18 – Coordenação da molécula de adenina, destacando que os resíduos que o fazem são os mesmos que estabilizam a molécula do indolil. Além disso, vê-se que a adenina está posicionada de uma maneira muito similar ao indolil, com o anel de seis átomos mais próximo ao Asp16 e o de cinco átomos mais próximo da Arg228.
49
Os mesmos estudos que caracterizaram a interação de lectinas com
compostos hidrofóbicos, como a adenina, mostraram que essa ligação não interferia
com a capacidade de associação dessas proteínas com carboidratos, corroborando,
assim, o fato desses dois sítios não estarem relacionados, como mostrado por
Edelman & Wang (1978), que indicaram uma distância aproximadamente igual a
20Å entre o CRD e a cavidade hidrofóbica da ConA. Entretanto, poder-se-ia pensar
que o fato do grupamento indolil estar sendo coordenado por resíduos que fazem
parte do CRD bloquearia ou impediria a ligação de moléculas glicídicas. Mas isso
não é o que ocorre com a ConM. A sobreposição de nossa estrutura cristalográfica
com aquela da ConM complexada com maltose, ilustrada na Fig. 20, mostra
claramente que o modo como o grupamento indolil está sendo coordenado não
afetaria a interação da lectina com carboidratos. Entretanto, é necessário destacar
que a presença do indolil e da adenina nesse sítio pode ser indicativo de que
compostos mais complexos, como as citocininas, podem interagir na mesma região,
embora, por terem grupos substituintes mais extensos, estes hormônios vegetais
possam de alguma forma impedir a interação da proteína com moléculas de
carboidratos.
Figura 20 – Sobreposição dos CRDs da ConM complexada com maltose (cinza) e com o grupamento indole (verde), mostrando que a presença deste não impediria a ligação de moléculas de carboidrato. Entretanto, como destacado no texto, moléculas mais complexas, como as citocininas, podem se ligar na mesma região, o que provocaria a não interação das lectinas com carboidratos.
50
6. Conclusões
• A resolução da estrutura cristalográfica da ConM complexada com o AIA
mostrou que esse fitormônio se encontra coordenado, dentre outros, pelo
resíduo Asn131, assim como reportado por estudos anteriores para outros
compostos hidrofóbicos;
• Pela geração do modelo tetramérico do complexo foi visto que quatro
moléculas do fitormônio estão coordenadas na cavidade formada pela
associação entre os dímeros canônicos, cada uma destas por um monômero;
• Hipotetizamos que o sítio de ligação ao AIA em cada monômero representa o
sítio de baixa afinidade a moléculas hidrofóbicas reportadas por diversos
estudos para lectinas vegetais;
• Hipotetizamos, ainda, baseado nos resultados aqui apresentados, que
lectinas de leguminosas podem também ter a capacidade e função de uma
nova forma de armazenamento e de disponibilidade do AIA para a planta, a
qual ocorreria a partir da ruptura do tetrâmero mediante a acidificação do
meio extracelular, proporcionada pela ligação do fitormônio ao seu receptor
de membrana ABP1;
• A análise da estrutura tridimensional da ConM mostrou, ainda, a presença do
grupamento indolil, a estrutura base das auxinas, coordenado por três
resíduos de aminoácidos que fazem parte do CRD;
• A presença do indolil promoveu mudanças conformacionais nas α-hélices que
delimitam o CRD;
• A comparação entre a coordenação do indolil e a da adenina pelos mesmos
resíduos de aminoácidos indica que essa região é um novo sítio de ligação
para compostos hidrofóbicos.
51
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