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Tecnologia do DNA Recombinante

BIOTECNOLOGIA – CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Prof. Esp. Roberto Venerando Fundação Educacional Miguel Mofarrej. – FIO

[email protected]

FIO – Faculdades Integradas de Ourinhos.

Tecnologia do DNA recombinante.

Engenharia Genética

VENERANDO,R .2009

INTRODUÇÃO

• Década de 70 ⇔ surgimento da Engenharia Genética ouTecnologia do DNA recombinante ou BiotecnologiaModerna.

• Engenharia Genética• Engenharia Genética

– Conjunto de técnicas que tornam possível a criação denovas combinações gênicas, inexistentes na natureza,mediante recombinação ou alteração de seqüências deDNA.

TECNOLOGIA DO DNAr

• Caracteriza-se pela aplicação de técnicas paramanipulação de ácidos nucléicos.

– Consiste em isolar e transferir genes responsáveis pelaprodução de certas substâncias para outros seres vivosque não produziam estas substâncias.que não produziam estas substâncias.

– Permite manipular diretamente os genes dedeterminados organismos com objetivos práticos.

– Permite combinar na mesma molécula de DNA genesprovenientes de fontes diferentes, mas nãonecessariamente de espécies diferentes, dando origema uma molécula de DNA recombinante (rDNA).

TECNOLOGIA DO DNAr

• No entanto, necessita que:

– DNA recombinante seja duplicado.

– DNA recombinante deve ser transcrito e– DNA recombinante deve ser transcrito etraduzido.

– Produtos da tradução por vezes, ainda,deverão sofrer passos adicionais deprocessamento pós-traducional na célulahospedeira.

TECNOLOGIA DO DNAr

• Objetivos

– Produção de grandes quantidades de um geneespecífico.específico.

– Produção de grandes quantidades de umaproteína específica.

TECNOLOGIA DO DNAr

• Aplicação prática

– Clonagem de fragmentos de DNA em plasmídios debactérias.

– Seqüênciamento de DNA.

– Amplificação de uma seq. especifica de DNA pela técnica– Amplificação de uma seq. especifica de DNA pela técnicada reação em cadeia da polimerase (PCR).

– Construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs.

– Vetores de expressão (procariotos e eucariotos).

– Plantas transgênicas.

– Animais transgênicos.

TECNOLOGIA DO DNAr

• Requer:

– Um método para clivar e voltar a ligar in vitro diferentesmoléculas de DNA originando moléculas de DNArecombinante.

– Um elemento transportador de genes, o vetor genético, que,– Um elemento transportador de genes, o vetor genético, que,ao ser multiplicado por uma célula hospedeira, possibilitaráque o gene estrangeiro que transporta também o seja.

– Um meio de introduzir o vetor numa célula viva, capaz demultiplicá-lo.

– Uma maneira de selecionar, dentre uma grande população decélulas, apenas aquelas que tiverem efetivamenteincorporado o rDNA.

TECNOLOGIA DO DNAr

• Metodologia de obtenção de DNAr

– Primeiro ⇔ fragmento do DNA de interesse (inserto)é obtido por enzima de restrição e ligado (DNA ligase)a uma outra molécula de DNA (vetor) para formar oDNA recombinante;DNA recombinante;

– Segundo ⇔ a molécula do DNA recombinante éintroduzida numa célula hospedeira compatível(transformação).

– Terceiro ⇔ célula hospedeira com o DNArecombinante (transformante).

– Quarto ⇔ divisão celular resultando em milhares decópias do DNA recombinante (clonagem).

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse

• Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição

– Encontradas nas bactérias e são utilizadas comosistema de defesa contra vírus (cortam o DNA viralque penetrar no citoplasma); não são encontradasem eucariotos.

– Três tipos: tipo I, II e III, onde a II apresenta– Três tipos: tipo I, II e III, onde a II apresentaimportância na Engenharia Genética.

– Reconhecem seqüências específicas de nucleotídeosna molécula de DNA e cortam ambas as fitas dahélice, em lugares determinados (sítios).

– O sítio de reconhecimento é normalmente umaseqüência palindrômica (ARARA)

• Enzimas de restrição ou endonucleases derestrição

– Tipos de clivagem

• Cega ou Abrupta: no eixo de simetria;

TECNOLOGIA DO DNArPrimeiro passo: obtenção do gene de interesse

• Cega ou Abrupta: no eixo de simetria;

• Coesiva: fora do eixo de simetria;

Fonte: http://www.images.google.com.br


• Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição

– Nomenclatura

• Primeira letra ⇔ representa o gênero

• Segunda e terceira letra ⇔ espécie.

• Algarismo romano (ou outra letra) ⇔ indica a• Algarismo romano (ou outra letra) ⇔ indica aordem da descoberta ou a linhagem da qual elafoi isolada.

• Exemplo: EcoRI – Escherichia coli que carrega umfator de transferência de resistência RI.


• Enzimas

de restrição ou

endonucleases

de restrição



• Depois da clivagem...

– A família de fragmentos gerados por digestãocom enzima de restrição é geralmentecom enzima de restrição é geralmentedetectada pela separação destes fragmentospor eletroforese em gel de agarose. Osfragmentos migram em função de seus pesosmoleculares sendo que os menores migrammais rapidamente.


• Moléculas de menormassa irão migrar maisrapidamente quemoléculas de maiormassa. Isso permite amassa. Isso permite aseparação de moléculasde DNA de diferentestamanhos !!!


Cortes com várias enzimas:



• Em alguns casos não é possível utilizarenzimas de restrição, logo:

– procede-se à fragmentação mecânica do DNA;

– síntese química do DNA;– síntese química do DNA;

– obtenção do DNA complementar (cDNA) ⇔obtido pela ação da transcriptase reversa apartir de um mRNA;

– biblioteca genômica, banco genômico ougenoteca ⇔ arquivo de DNA de interesseinserido num vetor para uso posterior.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene

Biblioteca genômica

Biblioteca de cDNA

Fonte: adaptado de www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006


• Em alguns casos não é possível utilizarenzimas de restrição, logo:

– Técnica de PCR (Reação da polimerase emcadeia)cadeia)

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genéticos

• Vetores genéticos

– Moléculas de DNA que transportarão o DNAheterólogo para o interior da célulaheterólogo para o interior da célulahospedeira.

– Molécula de DNA que aceita introdução deDNA estrangeiro em regiões não essenciaispara sua multiplicação dentro da célulahospedeira.



– Características básicas necessárias

• Ser uma pequena molécula de DNA.

• Possuir uma origem de replicação.• Possuir uma origem de replicação.

• Dois ou mais sítios únicos de clivagem para asenzimas de restrição – Múltiplos sítios de

Clonagem (MSC) – local onde o inserto éincorporado ao vetor de clonagem.

• Possuir um marcador que permita a seleção dohospedeiro transformado (Ex.: Antibiótico).

• Exemplos: plasmídio, bacteriófagos, cosmídios.



– Característicasbásicas necessárias

Fonte: docentes.esa.ipcb.pt/lab.biologia/disciplinas/bcm/recombinante .pdf


• Vetores genéticosPlasmídio

Fago

Fonte: www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_clonagem _genes _fragmentos _DNA_de_interesse .pdf

Cosmídio

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: ligação do gene no vetor

Digestão do vetor e do DNA pela enzima de restriçãoDigestão do vetor e do DNA pela enzima de restrição

Fragmentos de DNA, vetor e DNA ligase: DNAr

Fonte: adaptado de www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006

TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: hospedeiros do DNAr

� Hospedeiros do DNA recombinante

� Características ideais:� Capacidade de crescer em meios de cultura

baratos.baratos.� Estáveis em cultura.� Não patogênicos.

� Organismos utilizados:� Hospedeiros procarióticos ⇔ E. coli, B.

subtilis.� Hospedeiro eucariótico ⇔ S. cerevesiae,

células de mamíferos em cultura.

TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: hospedeiros do DNAr

� Transformação� Transformação� Transfecção� Microprojéteis� Eletroporação

Fonte: www.labimuno.org.br/aulas/producao%20proteinas%20recombinantes.ppt

TECNOLOGIA DO DNArSegundo passo: inserção dos vetores recombinantesem uma célula hospedeira

� Transformação ⇔ a célula hospedeira é tornadacompetente (cloreto de cálcio e choque térmico)para o vetor de clonagem ser introduzido;normalmente empregada para procariotos.

� Transfecção ⇔ quando o vetor de clonagem temcaracterísticas de vírus ou plasmídio, a célulahospedeira pode ser transfectada para inserir amolécula recombinante; normalmente empregadapara eucariotos.


� Microprojéteis ⇔ partículas cobertas com DNA sãoprojetadas contra uma célula e penetram em suamembrana.

Fonte: http://www.ufv.br/dbg/trab2002/TRANSG/TRG004.htm


� Eletroporação ⇔ a célulaé submetida a um campoelétrico que faz com quepequenos poros sejamabertos temporariamenteabertos temporariamenteem sua membrana poronde o DNA pode serinserido.

Fonte: www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006.ppt

TECNOLOGIA DO DNAr Terceiro e quarto passos

Células transformantes

Transformação

Transformante

Fonte: miguelcorreia25 .googlepages.com/fundamentos deengenhariagenética 2

TECNOLOGIA DO DNAr Terceiro e quarto passos

� Seleção das células recombinantes� Crescimento de bactérias em meio de cultura

contendo antibiótico

Fonte: www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_clonagem _genes _fragmentos _DNA_de_interesse .pdf

Referências bibliográficas

� BORZANI, W. et al. Biotecologia industrial. 1 ed. V. 1: Fundamentos. EdgardBlucher: São Paulo, 2001.

� VOET,D.; VOET, J. G. Bioquímica. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, 2006.

� SOUZA, S. R. Recombinação gênica. Apontamentos de aula, 2007.

� Sites:� Sites:– http://miguelcorreia25.googlepages.com/fundamentosdeengenhariag

en%C3%A9tica2– www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_clonagem_genes_fragmentos_DNA_de_interesse.pdf

– docentes.esa.ipcb.pt/lab.biologia/disciplinas/bcm/recombinante.pdf – ww.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006.ppt – http://www.ufv.br/dbg/trab2002/TRANSG/TRG004.htm

tecnologia do dna recombinante … · tecnologia do dnar • requer: – um método para clivar e...

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