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Análises de DNA

O DNA e sua história

DNA nos remete a Hereditariedade -Hipócrates (460-377 a.C.): “pangênese” -Aristóteles (384-322 a.C.): transmissão das características pelo sêmen

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Friedrich Miescher (1869) Primeiras evidências da presença de DNA no núcleo das células identificou uma substância rica em fósforo que não se enquadrava como nenhuma das substâncias protéicas conhecidas até aquele momento. A esta substância ele deu o nome de nucleina.

Richard Altman (1889) Obteve amostras de nucleina livres de proteína e cunhou uma denominação mais apropriada para a substância: ácido nucléico.

O genoma e sua história

Primeiras extrações de DNA Final 1800s e início 1900s -35 kg de pâncreas bovino dissolvido em 200 litros de ácido sulfúrico -Timo, também utilizado (…legado “timina”)

Estrutura do DNA

Watson & Crick 1953, Nature 171: 737-738

Rosalind Franklin: cristalografia de raio-X de moléculas de DNA

A dupla Hélice

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Modelo da estrutura do DNA elaborado por Watson e Crick

Crick's first sketch of the deoxyribonucleic acid double-helix

Watson & Crick's 1953 Nature paper Recent view of double-helix DNA structure

Cristalografia e Difração de raio X

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DNA

processo de cristalografia por raio-X padrão resultante de difração – estrutura tridimensional do DNA

Cristalografia e Difração de raio X

Genômica integrativa

Laboratório

Eletroforese em Gel

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Genômica integrativa

Laboratório

Princípios da eletroforese Gel (malha): agarose, poliacrilamida... Fonte de energia – campo elétrico

Resultados

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Enzimas de Restrição e Tecnologia do DNA recombinante

Enzimas de Restrição

-Nomenclatura; –Reconhecem seqüências palindrômicas; -Finais coesivos e finais retos; -Freqüência de cortes;

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Restrição enzimática

Arber, Smith e Nathans Prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina em 1978

Construindo moléculas recombinantes

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Produção de moléculas recombinantes

Complementariedade entre os finais gerados pela enzima de restrição e produção de moléculas recombinantes

Construindo moléculas recombinantes

Restrição Enzimática

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Restrição Enzimática

Construindo moléculas recombinantes

Molécula de DNA recombinante

Complementariedade entre os finais gerados pela enzima de restrição

Construindo moléculas recombinantes

1970s – Engenharia Genética

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DNA recombinante Bactéria

Fazendo clones do DNA recombinante

Fazer uma molécula de DNA recombinante, para que?

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Polymerase Chain Reaction (PCR)

Síntese de DNA in vitro

DNA total

30 ciclos de PCR

PCR

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Polymerase Chain Reaction (PCR)

Desnaturação

Anelamento dos Primers

Duplicação do DNA

PRINCÍPIO DA PCR

-Diagnósticos moleculares -Identificação e isolamento de genes -Marcadores moleculares -Expressão gênica (RT-PCR e PCR em tempo real)

APLICAÇÕES

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Ex: Teste de paternidade e identificação de indivíduos

M F SP M F SP M F SP

APLICAÇÕES da PCR

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GENÉTICA FORENSE

Ex: identificação de criminosos

caso de estupro

Ex: Polimorfismo da enzima conversora da Angiotensina I ! Angiotensina II ! Cardiopatias

Alelo I

Alelo D

Indivíduos

APLICAÇÕES da PCR

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Hibridização de ácidos nucléicos

Hibridização de ácidos nucléicos

Sonda Alvo

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Genômica integrativa

Laboratório

Hibridização de ácidos nucléicos

Método para identificação e localização de ácidos nucléicos em materiais fixados

Cromossomos

Fibra de cromatina

Células Núcleo

Tecidos

DNA imobilizado

Hibridização de ácidos nucléicos

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Hybridization of interphasic nuclei

Chromosome 18 (blue), X (green) e Y (red)

Chromosome 13 (red) e 21 (green)

Chromosome hybridization

Normal Chromosome 13

(blue) e 21 (green)

Down Chromosome 13 (blue) e 21 (red)

Chromosome hybridization

Hybridization of interphasic nuclei

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Whole chromosome probes

Human karyotype

Chromosome hybridization

Male normal cell

Tumor female cell

Whole chromosome probes

Chromosome hybridization

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Partial chromosome probes

Chromosome hybridization

Human karyotype

Tissue section hybridization – RNA hybridization

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Curso de Férias

Análise genômica: presente e futuro

09 a 12 de julho de 2012

Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP