stÊnio karol lima de oliveira viabilidade e
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STÊNIO KAROL LIMA DE OLIVEIRA
VIABILIDADE E ARMAZENAMENTO DE GRÃOS DE PÓLEN DE
CULTIVARES DE MELOEIRO (Cucumis melo L.).
Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural do Semi-Árido, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Agronomia: Fitotecnia.
ORIENTADOR:
Prof. Dr. Jeferson Luiz Dallabona Dombroski
MOSSORÓ-RN 2009
ii
O48v Oliveira, Stênio Karol Lima de Viabilidade e armazenamento de grãos de pólen de cultivares
de meloeiro (Cucumis melo L.) / Stênio Karol Lima de Oliveira. -- Mossoró, 2009.
66f.: il.
Dissertação (Mestrado em Fitotecnia, Área de concentração Cultura de tecidos) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido. Pró-Reitoria de Pós-Graduação Orientador: Profª. D. Sc. Jeferson Luiz Dallabona Dombroski. 1.Cucumis melo L. 2.Grãos de pólen. 3.Germinação. 4.Armazenamento.. I.Título.
CDD: 635.611 Bibliotecária: Keina Cristina Santos Sousa e Silva
CRB15 120
Ficha catalográfica preparada pelo setor de classificação e catalogação da Biblioteca “Orlando Teixeira” da UFERSA
iii
AVALIAÇÃO IN VITRO DA GERMINAÇÃO, VIABILIDADE E CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO DE GRÃOS DE PÓLEN DE CULTIVARES DE
MELÃO (Cucumis melo L.).
Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural do Semi-Árido, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Agronomia: Fitotecnia.
Aprovada em: 25/02/2009
___________________________________
Prof., Dr., Jeferson Luiz Dallabona Dombroski Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA)
(Orientador)
___________________________________
Prof., Dr., Glauber Henrique de Sousa Nunes Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA)
(Co-orientador)
__________________________________ Prof., Dr., José Torres Filho
Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA) (Conselheiro)
Mossoró-RN 2009
iv
Aos meus pais, Margarete Maria de Oliveira
Lima e Antônio Lima Filho, pelo amor, carinho,
compreensão, apoio, simplicidade, e a quem
devo tudo o que sou.
Dedico
Aos meus irmãos, Sara Kadydja Lima de
Oliveira, João Paulo Lima de Oliveira e
Micael de Sousa Praxedes por sempre
acreditarem e se orgulharem de mim.
Ofereço
v
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a Deus, meu Senhor e Salvador, pela força necessária que
me dá para seguir em frente, transpondo todas as barreiras em minha vida;
À Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), pela oportunidade
concedida para a realização deste curso de Pós-Graduação;
À CAPES pela concessão da bolsa de pesquisa;
Ao professor orientador, Dr. Jeferson Luiz Dallabona Dombroski pela
orientação, oportunidades, ensinamentos, paciência, profissionalismo, competência e
apoio.
Ao professor Glauber Henrique de Sousa Nunes pelas sugestões, apoio e
amizade.
Ao meu companheiro de trabalho, Micael de Sousa Praxedes, pela parceria,
determinação, apoio e fiel ajuda na condução deste trabalho.
Aos professores: Francisco Bezerra Neto, Leilson Costa Grangeiro, Maria
Zuleide de Negreiros, Glauber Henrique de Sousa Nunes, Jeferson Luiz Dallabona
Dombroski e Cristiane Elizabeth Costa de Macêdo pelos conhecimentos transmitidos
ao longo do curso e que foram de auxílio na minha formação profissional.
Aos meus tios: Margarida, Mario, Magnólia, Marta, Fatinha e Aldetônio pelo
carinho, orgulho e por sempre me apoiarem.
As minhas avós: Maria do Socorro e Maria Aldenora, pelo amor, atenção e
cuidado.
Ao meu grande amigo Juviano Junior pela ajuda na coleta dos dados e
contagem dos grãos de pólen, pelo carinho e pela amizade sincera.
vi
Aos amigos em especial: Carlos Junior, Jully, Ligya, Irmã Antônia, Maria,
Diana Ligia, Tutuga, Érica e Igor pelos momentos de alegria, compreensão e amizade.
Aos amigos do curso de Pós-Graduação: Pascalle, Romenique, Maria
Aparecida, Gleider, Robson e Bráulio pelo convívio agradável, estudos e pela amizade
ao longo do curso.
Ao professor Salvador Barros Torres pela doação das sementes utilizadas no
trabalho.
À Professora Selma Rogéria pela cessão dos corantes usados no projeto;
À minha amiga Damiana Cleuma de Medeiros pelo apoio, carinho e amizade
sincera;
Aos colegas do laboratório de cultura de tecidos (BIOFÁBRICA): Poliana,
Luciana, Rômulo, Rivanildo e Augusto pelo apoio e amizade;
A amiga Tenessee pela ajuda e grande amizade;
Aos funcionários da horta do Departamento de Ciências Vegetais da UFERSA:
Seu Antônio, Zé Carlos e Alderi pela ajuda, conversas e amizade.
E a todos que, de uma forma ou de outra contribuíram para a realização deste
trabalho.
Muito Obrigado!
vii
BIOGRAFIA
STÊNIO KAROL LIMA DE OLIVEIRA, filho de Margarete Maria de
Oliveira Lima e Antônio Lima Filho, nascido no dia 21 de Maio de 1983 em Mossoró
– Rio Grande do Norte.
Realizou os estudos de ensino fundamental, inicialmente, na Escola Estadual
Cônego Estevão Dantas, concluindo-o, posteriormente, no Centro de Educação
Integrada Professor Eliseu Viana, onde também cursou o ensino médio, concluindo-o
em 2000.
Em Fevereiro de 2001, ingressou no curso de Engenharia Agronômica da
antiga Escola Superior de Agricultura de Mossoró-ESAM, atualmente Universidade
Federal Rural do Semi-Árido-UFERSA, finalizando-o no final de 2005. Enquanto
Aluno de graduação foi bolsista de Iniciação Científica do CNPq com o projeto:
Cultivo de alface com proteção de agrotêxtil na região de Mossoró – RN.
Em março de 2007, iniciou o curso de Mestrado em Agronomia: Fitotecnia no
Programa de Pós-Graduação da Universidade Federal Rural do Semi-árido-UFERSA,
como bolsista da CAPES.
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RESUMO
OLIVEIRA, Stênio Karol Lima de. Viabilidade e armazenamento de grãos de pólen de cultivares de meloeiro (Cucumis melo L). 2009. 66f. Dissertação (Mestrado em Agronomia: Fitotecnia) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2009.
O Nordeste brasileiro é responsável por aproximadamente 95% da produção nacional de melão, destacando-se os estados do Rio Grande do Norte e do Ceará, com cerca de 55% e 28% da produção brasileira. A busca por maior produtividade e características de qualidade e armazenabilidade estimulam a pesquisa de variedades melhoradas. Um dos fatores que dificulta o trabalho de melhoramento do melão são as baixas taxas de pegamento das polinizações, da ordem de 40% a 50%, sendo necessário conhecimento sobre a biologia floral, e em especial sobre a receptividade do estigma e a viabilidade do grão de pólen, de forma a otimizar e facilitar o procedimento da fecundação manual pelos melhoristas. Este trabalho teve como objetivo estudar a viabilidade e as condições de armazenamento de grãos de pólen de cultivares de meloeiro (Cucumis
melo L.). As flores foram coletadas e levadas ao laboratório, onde as anteras foram retiradas e maceradas com solução de sacarose e colocadas para germinar em meio de cultura composto de 1% de ágar, 10% de sacarose, 800 mg L-1 de nitrato de cálcio (Ca(NO3)2 4H2O) e 200 mg L-1 de ácido bórico (H3BO3), avaliou-se a germinação in
vitro até 8 h, sendo estabelecidos quatro horários de coleta do pólen . Foi feito também um teste de armazenamento sob três condições de temperatura: temperatura ambiente, geladeira e em freezer. Após 2 horas da semeadura os grãos de pólen apresentam germinação máxima. Também foi verificado que o melhor horário para a coleta das flores é no momento da antese. Dentro dos ambientes utilizados para o armazenamento, observou-se que houve uma queda da germinação com o passar do tempo, até 96 horas, e que os grãos colocados em geladeira apresentaram melhor germinação.
Palavras-chaves: Cucumis melo L., grãos de pólen, germinação, armazenamento.
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ABSTRACT
OLIVEIRA, Stênio Karol Lima de. Viability and storage of pollen grains of cultivars of melon (Cucumis melo L.). 2009. 66f. Dissertation (Master in Agriculture: Fitotecnia) - Rural Federal University of the Semi-Arid (UFERSA), Mossoró-RN, 2009. The Northeast is responsible for approximately 95% of national production of melons, especially the states of Rio Grande do Norte and Ceará, with around 55% and 28% of Brazilian production. The search for higher productivities and characterristics of quality and storage capability stimulate the research on improved varieties. One of the factors that troubles the varieties improvement work are the low pollination rates , in order of 40 to 50%, making it necessary to understand the floral biology, in special the stigma receptivity and the pollen viability, in order to optimize and facilitate the process of fertilization by manual breeders. This work had to study the viability and the storage of pollen grains of cultivars of melon (Cucumis melo L.). The flowers were harvested and brought to the laboratory, where the anthers were removed and macerated with a solution of sucrose and set to germinate in a culture media composed of 1% agar, 10% sucrose, 800 mg L-1 calcium nitrate (Ca (NO3)2 4H2O), 200 mg L-1 acid Boric (H3BO3), evaluate the in vitro germination by 8 h, and down four times to collect the pollen. It was also done a test under three storage conditions of temperature: room temperature, refrigerator and freezer. After 2 hours of seeding, the pollen grains have maximum germination. It was found that the best time to collect the flowers are at anthesis. Within the environments used for storage, it was observed that there was a decrease in germination with time, up to 96 hours, and the grains placed in the refrigerator showed better germination. Keywords: Cucumis melo L., pollen grains, germination, storage.
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resumo da análise de Deviance para o meio de extração de grãos de pólen
e meio de cultura, UFERSA, Mossoró,
2009..........................................................................................................................
36
Tabela 2. Comparação de médias do horário de coleta para as cultivares Mandacaru, Vereda
e Goldex. UFERSA, Mossoró,
2009..........................................................................................................................
46
Tabela 3. Análise de Deviance de 3 cultivares de melão em função do local e do
tempo de armazenamento, UFERSA, Mossoró, 2009.…….......................
48
Tabela 4. Comparação de média do armazenamento em geladeira em função do tempo para
as cultivares Mandacaru, Vereda e Goldex. UFERSA, Mossoró,
2009…………………………………........................................................................
53
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Sequência das etapas de extração dos grãos de pólen: Placa com as flores e a pinça
(A), retirada das sépalas e pétalas (B), retirada da antera (C), pinça com a antera (D),
colocação da antera em tubo de micro-centrifuga (E), pipetagem da solução de sacarose (F),
maceração da antera (G), aplicação da suspensão dos grãos em meio de cultura (H).
UFERSA, Mossoró,
2008........................................................................................................................
30
Figura 2. Campo fotográfico com grãos de pólen marcados por computador, com auxílio do
programa paint para windows, pintados de vermelho (grãos germinados) e de amarelo (não
germinados). UFERSA, Mossoró,
2008........................................................................................................................
31
Figura 3. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Vereda em função do meio de
extração (água ou solução de sacarose a 400 g.L-1) e do meio de cultivo (sólido ou líquido).
UFERSA, Mossoró, 2009........................................................
37
Figura 4. Pólen de melão (Cucumis melo L.). A - extraídos com sacarose e B - extraídos
com água, após incubação sobre meio de cultura. Observar a presença de material celular
extravasado após a extração com água, na figura B. UFERSA, Mossoró,
2009............................................................................................................
38
Figura 5. Pólen de melão (Cucumis melo L). A - sem coloração, B - coloridos com Iodo a
5% e C - coloridos com azul de metileno. UFERSA, Mossoró,
xii
2008............................................................................................................................. 40
Figura 6. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Mandacaru em função do tempo de
leitura. UFERSA, Mossoró, 2009.………................................................
41
Figura 7. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Mandacaru em função do tempo de
avaliação: A - Com 1 horas após a inoculação, B – 2 horas, C- 3 horas, D – 4 horas, E – 5
horas, F – 6 horas, G – 7 horas e H – 8 horas. UFERSA, Mossoró,
2008.............................................................................................................................
42
Figura 8. Estágios do botão floral de plantas de melão da cultivar Mandacaru desde a sua
emissão até a sua abertura, medido com auxílio de um escalímetro. A - 1° dia, B - 2° dia, C -
3° dia, D - 4° dia, E - 5° dia, F - 6° dia e G - 7° dia. UFERSA, Mossoró, 2008..
44
Figura 9. Porcentagem de germinação em diferentes horários de coleta. Com 24 horas antes
da antese (05 Pré), com 12 horas antes da antese (17 Pré), no momento da antese (05 Pós) e
com 12 horas depois da antese (17 Pós). UFERSA, Mossoró, 2009................
47
Figura 10. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Mandacaru, em função do local e
tempo de armazenamento. UFERSA, Mossoró, 2009…
49
Figura 11. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Vereda, em função do local e
tempo de armazenamento. UFERSA, Mossoró, 2009...................
49
Figura 12. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Goldex, em função do local e
tempo de armazenamento. UFERSA, Mossoró, 2009……………..............
50
xiii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................
15
2 REFERENCIAL TEÓRICO ......................................................................... 17
2.1 Características da cultura …………....................................................... 17
2.2 Aspectos da genética, expressão sexual e fenologia do meloeiro..... 19
2.3 Grãos de Pólen............................................................................................ 21
2.4 Viabilidade................................................................................................... 22
2.5 Germinação in vitro ………………………………………...................... 23
2.6 Armazenamento………………................................................................. 24
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 27
3.1 Local…………………………….................................................................. 27
3.2 Caracterização do material vegetal………………………………....... 27
3.3 Condução das plantas matrizes ……………………………………..... 28
3.4 Coleta das flores e extração do pólen ………………………………... 29
3.5 Avaliação da germinação in vitro.......................................................... 31
1° Ensaio: Meio para extração dos grãos de pólen.................................. 32
2° Ensaio: Teste de meios de cultura........................................................... 32
3° Ensaio: Uso de corantes……………………………………………….... 33
4° Ensaio: Tempo de leitura……………………………............................. 33
5° Ensaio: Identificação da fenologia do desenvolvimento floral......... 33
6° Ensaio: Horário de coleta……………………………............................. 34
7º Ensaio: Armazenamento………………………………............................ 34
xiv
3.6 Análise estatística............................................................................... 35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO………………………........................... 36
4.1 Meio para extração dos grãos de pólen e tipos de meios de cultura.......................................................................................................
36
4.2 Uso de corantes…………………....................................................... 39
4.3 Tempo de leitura…............................................................................. 40
4.4 Identificação da fenologia do desenvolvimento floral…................. 43
4.5 Horário de coleta................................................................................ 45
4.6 Armazenamento…………………………......................................... 47
5 CONCLUSÕES……………………..................................................... 54
6 REFERÊNCIAS ...................................……….................................... 55
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1 INTRODUÇÃO
O Nordeste brasileiro é responsável por aproximadamente 95% da produção
nacional de melão, destacando-se os estados do Rio Grande do Norte e do Ceará, com
cerca de 55% e 28% da produção brasileira, respectivamente (FNP, 2006). As
principais áreas produtoras nesses estados localizam-se na região semi-árida e se
concentram nos agropólos Mossoró/Assu e Baixo Jaguaribe (Negreiros et al., 2005).
A necessidade de elevar e diversificar a oferta de melão nos mercados
consumidores tem estimulado as pesquisas com a espécie em diferentes áreas de
conhecimento, no sentido de promover a melhoria de cultivo visando ao aumento da
produtividade (Nunes et al., 2004; Araújo et al., 2003), à conservação da qualidade
pós-colheita das frutas (Arruda et al., 2004; Mendonça et al., 2004a), a adubação e
irrigação na produção e qualidade dos frutos, conforme, cita Costa (1987) e Ferreira et
al. (1982). Entre elas também se destaca o melhoramento genético convencional
visando o aumento de produtividade, e a resistência a doenças.
O melhoramento genético convencional depende basicamente do cruzamento
de indivíduos com características fenotípicas úteis e na seleção dos descendentes
produzidos para fixar as características de interesse (RAMALHO et al. 1993). O
primeiro passo desse processo é o controle da fecundação dos óvulos, evitando que
grãos de pólen indesejáveis toquem o estigma, e procedendo à fecundação manual,
aplicando grãos de pólen de indivíduos selecionados diretamente no estigma dos
indivíduos alvo (DAFNI, 1992). Esse procedimento exige o conhecimento da
biologia reprodutiva, tanto do grão de pólen quanto do conjunto estigma-ovário-óvulo.
Um dos fatores que dificulta o trabalho com melão são as baixas taxas de
pegamento das polinizações, da ordem de 40 a 50%, sendo interessante verificar se isso
ocorre por perda de viabilidade do pólen. Nesse aspecto, é importante que os lotes de
16
pólen possam ser testados quanto à sua viabilidade por meio de testes rápidos, antes de
executar a polinização. Atualmente não são feitos testes de viabilidade do pólen, e só
se saberá se o pólen é viável se ocorrer o pegamento dos frutos, o que implica em
perda de tempo e de trabalho.
Uma alternativa que vem sendo usada para várias espécies é a utilização de
ensaios de germinação in vitro, em que grãos de pólen são colocados para germinar
sobre um meio de cultura específico e a germinação avaliada sob microscópio após
algumas horas.
Assim, no caso da biologia do pólen, é interessante que algumas questões
sejam respondidas, de forma a otimizar e facilitar o procedimento da fecundação
manual. As principais questões são: É possível verificar a viabilidade e o vigor (VV)
do grão de pólen in vitro? Como o horário de coleta e o estádio de maturação do pólen
afetam a VV? O pólen pode ser armazenado? em quais condições?
Também é interessante a possibilidade que o pólen possa ser armazenado,
ainda que por poucos dias, de forma a facilitar a tarefa de polinização, pela
possibilidade da coleta do pólen ser feita em dias diferentes da polinização, e se for
possível o armazenamento por períodos maiores. Isso facilitaria o intercâmbio de
germoplasma em programas de melhoramento, a coleta de pólen em locais distantes do
local de polinização e mesmo a polinização em períodos diferentes aos da coleta do
pólen.
Para responder a essas questões, foram elaborados uma série de ensaios, que
compõem a presente dissertação.
Diante dessas considerações, o objetivo do presente trabalho foi determinar
se fatores como: horário de coleta, condições e tempo de armazenamento afetam a
viabilidade de grãos de pólen de 3 cultivares de melão (Cucumis melo L.).
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2 REFERÊNCIAL TEÓRICO
2.1 Características da cultura
A espécie Cucumis melo L. pertence à família Cucurbitaceae, que é um dos
grupos de plantas mais diversificados geneticamente no reino vegetal e compreende
cerca de 120 gêneros e mais de 800 espécies (RUBATZKY & YAMAGUCHI, 1997).
As cucurbitáceas são plantas com comportamento predominantemente rastejante,
sendo encontradas em regiões tropicais e subtropicais de todo o globo.
O meloeiro é uma planta perene na natureza, sendo explorada como planta
anual. Possui um sistema radicular superficial e praticamente sem raízes adventícias,
tendo baixa capacidade de regeneração quando danificado, com caule herbáceo de
crescimento rasteiro ou prostrado provido de nós com gemas, sendo que dessas gemas
desenvolvem-se gavinhas, folhas, novos caules ou ramificações (FONTES &
PUIATTI, 2005). O fruto é classificado como uma baga, com forma, tamanho e
coloração variáveis, contendo de 200 a 600 sementes na cavidade central (PEDROSA,
1997) e a parte comestível é derivada do pericarpo (PRATT, 1971).
Como em outras espécies, a variabilidade genética no melão é muito grande e
os pesquisadores têm tentado classificá-lo em diversas variedades botânicas. A
diversificação ocorre nos aspectos relacionados à sensibilidade ao frio, capacidade de
conservação, aparência do fruto externa e interna, bem como a forma – esférica,
elíptica e ovóide; tamanho do fruto e estrutura da casca – lisa e reticulada. A coloração
da polpa pode variar desde alaranjado até o branco. As diferentes cultivares de melão
apresentam comportamento de maturação variados, diferindo em características como
cor externa, cor de polpa, firmeza, conteúdo de sólidos solúveis, flavor, aroma e
mecanismos de produção de etileno (GONÇALVES et al.; 1996).
18
Apesar dessa diversidade, segundo Menezes et al., (2000), apenas dois
grupos têm maior importância econômica: Cucumis melo var. inodorus Naud. e
Cucumis melo var. cantaloupensis Naud. O primeiro deles compreende cultivares
adaptadas a climas secos e quentes, cujos frutos possuem casca lisa ou com estrias, de
maturação tardia e boa capacidade de conservação pós-colheita. Os frutos são
esféricos, amarelos ou verdes, com polpa esbranquiçada. O segundo grupo inclui os
melões anteriorrmente classificados como das variedades C. melo reticulatus e C. melo
cantaloupensis. São melões muito aromáticos, mais doces que os inodorus, porém de
baixa conservação pós-colheita. Os frutos são de tamanho médio, com superfície
reticulada, verrugosa ou escamosa, podendo apresentar gomos (costelas), e têm polpa
de coloração alaranjada ou salmão, às vezes, verde.
O melão é uma cultura bastante antiga, e acredita-se que tenha se originado
na África Tropical, difundindo-se dessa região para a Índia e Ásia (WHITAKER;
DAVIS, 1962; SEYMOUR & McGLASSON, 1993; Mallick e Massui; 1986). No
Brasil a cultura é conhecida desde o século XVI quando foram trazidos provavelmente,
pelos escravos. Os imigrantes europeus fizeram outra introdução durante o século XIX
devido à expansão da cultura nas regiões Sul e Sudeste, chegando por volta dos anos
60 ao Nordeste (AGRIANUAL, 2004).
O meloeiro requer clima quente e umidade relativa baixa para o seu
desenvolvimento, pois do contrario tem baixa produção e frutos de qualidade inferior.
Exige temperaturas variando de 28°C a 32°C para a germinação das sementes, e 25°C
a 35°C para o desenvolvimento vegetativo (PEDROSA, 1997). A temperatura também
tem papel fundamental no processo de florescimento. Nesse sentido, temperaturas
elevadas, acima de 35°C, estimulam a formação de flores masculinas, que também
sofrem influência de outros fatores ambientais como: água, luz e nutrientes,
principalmente o nitrogênio (PEDROSA, 1997). Os insetos polinizadores desenvolvem
sua atividade mais intensamente em temperaturas de 21°C a 39°C, sendo considerada
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ideal, a faixa de 28°C a 30°C (PEDROSA, 1997). As temperaturas excessivamente
altas (acima de 33°C a 40°C) prejudica a polinização das flores, provocando a queda
dessas e de frutos novos (FONTES & PUIATTI, 2005).
Quando comparado a outras culturas, o melão cultivado no Nordeste tem o
ciclo muito curto. O intervalo entre o plantio e a colheita é, em média, de 60 a 65 dias,
enquanto que na Espanha, um dos principais concorrentes do Brasil, o ciclo dura entre
120 e 140 dias (FILGUEIRAS et al.; 2000).
2.2 Aspectos da genética, expressão sexual e fenologia do meloeiro
A espécie Cucumis melo L. é diplóide (2n=2x = 24 cromossomos) e
compreende duas subespécies de acordo com a pilosidade do ovário: C. melo ssp melo,
com ovário piloso, e C. melo ssp agrestis, com ovário ceroso. O meloeiro está
distribuído em todo o mundo e é a espécie que possui a maior variabilidade fenotípica
no gênero Cucumis. A maior parte da variação é observada em seus frutos. O meloeiro
tem frutos com forma que varia de esféricos a extremamente alongados, com peso de
poucas gramas a vários quilogramas, sabor da polpa de amargo a doce, e diferentes
colorações de polpa e casca (STEPANSKY et al., 1999).
Esses tipos de Variedades podem ser cruzados entre si e na verdade existe
uma continuidade entre eles. As diferentes características fenotípicas dos tipos de
melão podem ser combinadas e exploradas nos programas de melhoramento dessa
cultura, propiciando a produção de genótipos superiores. A divisão em tipos auxilia no
processo de classificação e comercialização. Estudos com marcadores moleculares têm
sido realizados com germoplasma de vários países e continentes buscando a melhor
caracterização da grande variabilidade morfológica dessa espécie (STAUB et al.,
2000).
20
Com relação à expressão do sexo, o meloeiro, assim como a maioria das
cucurbitáceas, pode ter plantas monóicas, andromonóicas, ginomonóicas, ginóicas e
hermafroditas (WHITAKER; DAVIS, 1962). As plantas monóicas têm flores
masculinas e femininas na mesma planta, mas separadas. As plantas andromonóicas
têm flores masculinas e hermafroditas na mesma planta, mas separadas. As plantas
ginomonóicas têm flores femininas e hermafroditas na mesma planta, mas separadas.
As plantas ginóicas possuem apenas flores femininas, enquanto que plantas
hermafroditas possuem flores perfeitas - hermafroditas (ROBINSON et al., 1976). Para
o melhoramento genético, as plantas monóicas e andromonóicas são as mais utilizadas.
O controle genético da determinação do sexo em meloeiro envolve três
genes, andromonoicia (a), ginomonoicia (g) e masculinidade (M), que quando
combinados resultam em diferentes tipos sexuais. Entre os diferentes tipos, a monoicia
(A-GG) e andromonoicia (aaGG) são determinados pelo alelos recessivo e dominante
do loco a combinado com o alelo dominante da ginoicia (G-). O tipo hermafrodita é
homozigoto para os locos a e g, ou seja, o seu genótipo é aagg, enquanto genótipos mm
parecem estabilizar a ginoicia de plantas AAgg (KENINGSBUCH; COHEN, 1990).
O meloeiro apresenta flores estaminadas, pistiladas e/ou perfeitas, de pétalas
amarelas e combinadas de diferentes formas (WHITAKER; DAVIS, 1962). As flores
estaminadas aparecem primeiro, cerca de 7 a 10 dias e em grupos, desenvolvendo-se
nas gemas axilares do caule principal; enquanto que as flores pistililadas ou perfeitas
aparecem nas axilas dos caules secundários e terciários e de forma isolada. O número
de flores estaminadas, é em média, quatro vezes maior que o número de flores
perfeitas, e estas ainda apresentam uma menor variação em quantidade diária (KATO,
1997). Quando se inicia a floração, a abertura das flores se procede nas primeiras horas
da manhã (VALLESPIR, 1997), todavia, verifica-se que algumas plantas continuam a
antese durante todo o dia, até o final da tarde (PEDROSA, 1997). As flores masculinas
e femininas ou hermafroditas localizam-se separadamente na mesma planta, sendo que
21
o início da floração acontece de 18 a 25 dias após o plantio. Surgem, inicialmente,
apenas as flores masculinas e, após três a cinco dias, inicia-se o aparecimento
simultâneo das flores masculinas e femininas.
2.3 Grãos de Pólen
O grão de pólen, de uma forma geral, é definido como micrósporo maduro
produzido nas anteras ou ainda, como a célula reprodutiva masculina quem contém a
metade do número de cromossomos da espécie, capaz de fertilizar a oosfera, dando
origem ao zigoto. (BORÉM & VIEIRA, 2005). As anteras são expansões dilatadas do
estame, constituídas por duas tecas, cada uma com dois sacos polínicos ou
microsporângios, onde são produzidos os grãos de pólen (MARCOS FILHO, 2005).
O grão de pólen maduro encontra-se rodeado por uma fina camada de celulose,
a intina, e por fora desta há uma outra camada, a exina, composta principalmente de
esporopolina, substância que confere grande resistência ao grão de pólen (BELTRATI,
1994).
Na superfície do grão de pólen podem ocorrer áreas delimitadas em que a
exina encontra-se delgada ou então ausente. Através dessas aberturas emerge o tubo
polínico, no momento da germinação (BELTRATI, 1994).
Com relação ao grão de pólen do meloeiro, ele é extremamente denso e
higroscópico. Quando depositado no estigma da planta, germina em poucos instantes e
pode alcançar o ovário até 24 horas após a germinação (WHITAKER; DAVIS, 1962).
22
2.4 Viabilidade
O estudo da viabilidade do grão de pólen é de primordial importância em
trabalhos de melhoramento genético, podendo também ser utilizado para diagnosticar
fatores envolvidos na formação de flores e embriões. A relação entre o pólen e o
estigma depende da viabilidade dos grãos, da receptividade do estigma e das alterações
genéticas entre as partes (BUENO & CAVALCANTE, 2001).
Os estudos sobre a viabilidade do pólen possibilitam indicar ao melhorista a
capacidade do material disponível em produzir pólen viável e permitem mostrar a
existência de diferenças intervarietais ou interespecíficas entre os genótipos
empregados no programa de melhoramento. Por meio de dados de viabilidade de
pólen, também é possível obter correlações com anormalidades meióticas, auxiliar na
seleção de matrizes genéticas e fazer inferências sobre os melhores cruzamentos,
tornando-se uma ferramenta útil na condução de experimentos nas áreas agrícola e
biotecnológica (TECHIO, 2002).
A viabilidade dos grãos de pólen pode ser alterada com a variação de umidade
e temperatura do ambiente. Também varia de acordo com a espécie, a exemplo de
algumas gramíneas que podem apresentar viabilidade de minutos ou horas, enquanto
que grãos de pólen de outras espécies podem permanecer viáveis por vários anos se
armazenados adequadamente (BUENO & CAVALCANTE, 2001). Vieira et al. (2002)
verificaram que houve uma redução de 30% da viabilidade do grão de pólen de melão
armazenado por 36 dias a –18ºC.
A viabilidade do pólen pode ser determinada através de um grande número de
técnicas as mais utilizadas são a germinação in vitro e a coloração, muito empregada
no monitoramento de pólen armazenado (OLIVEIRA et al., 2001).
23
2.5 Germinação in vitro
A germinação in vitro é o método mais utilizado em testes de viabilidade do
pólen em programas de melhoramento genético (MARCELLÁN & CAMADRO,
1996). Existem diferenças entre espécies quanto às condições exigidas para a
germinação do pólen, envolvendo, principalmente, os constituintes do meio de cultura,
a temperatura e o tempo de incubação. Além disso, a viabilidade do pólen também é
influenciada pelo estádio de desenvolvimento da flor, quando da coleta do pólen, e
pelas condições de armazenamento (STANLEY & LINSKENS, 1974).
O teste de germinação visa à avaliação do máximo potencial de viabilidade que
um lote de pólen pode alcançar nas condições ideais de temperatura, umidade e
substrato, num período necessário para essa germinação.
O meio básico usado nestes testes é constituído de sacarose e de ácido bórico
(MIRANDA & CLEMENT, 1990). O pólen das angiospermas precisa de uma fonte de
carbono, de boro e, freqüentemente de outros nutrientes para promover a sua
germinação (GALLETTA, 1983).
A sacarose promove o equilíbrio osmótico entre o pólen e o meio de
germinação, e fornece energia para o desenvolvimento do tubo polínico, já o boro
estimula o crescimento do tubo polínico e diminui a probabilidade de estes se
romperem (STANLEY & LINSKENS, 1974).
Segundo Pfahler (1967), a adição de boro tem importância, e suas respostas
são variáveis conforme a espécie. Seu mecanismo de ação consiste em interagir com o
açúcar e formar um complexo ionizável açúcar-borato, o qual reage mais rapidamente
com as membranas celulares.
O cálcio adicionado ao meio de cultura para germinação de grãos de pólen
propicia características fisiológicas como tubo polínico e grão de pólen com menor
sensibilidade a variações do meio básico, menor permeabilidade do tubo polínico,
24
crescimento do mesmo com forma linear e aparência rígida (BHOJWANI &
BHATNAGAR, 1974). Há maior permeabilidade da membrana do tubo polínico na
ausência de cálcio, causando a liberação de metabólitos internos para o meio externo
(STANLEY & LINSKENS, 1974).
O método geral consiste em germinar uma pequena amostra em um meio de
cultura apropriado e observar em microscópio, após um determinado período, a
porcentagem de grãos que desenvolvem tubo polínico (GALLETTA, 1983).
Scorza e Sherman (1995) consideram que um bom pólen deve apresentar 50 a
80% de grãos germinados com tubos bem desenvolvidos. À medida que o pólen
envelhece, a porcentagem de germinação e o comprimento dos tubos polínicos
decrescem. Ainda que o pólen pareça fraco, a presença de alguns tubos polínicos
vigorosos indica que o mesmo ainda é suficientemente bom para assegurar, pelo
menos, uma moderada frutificação efetiva, apesar da baixa porcentagem de
germinação.
Para a verificação da germinação do grão de pólen em diversas culturas tem
sido utilizada a aplicação de corantes, tais como o lugol, carmin acético, azul de
anilina, azul de algodão, iodeto de potássio (HAUSER & MARRISON, 1964;
STANLEY & LINSKENS, 1974).
.2.6 Armazenamento
O armazenamento de grãos de pólen é importante para a preservação de
germoplasma, desenvolvimento de pesquisas com pólen, promoção de intercâmbio de
germoplasma e melhoria da eficiência dos programas de melhoramento (HANNA,
1994).
25
O sucesso da preservação do pólen depende principalmente de fatores como a
temperatura e umidade relativa do ambiente de armazenamento e do grau de umidade
do pólen (LINSKENS, 1964; DEAN, 1965; KHAN et al., 1971). Sendo esse último
fato muito importante, pois quando úmido, pode formar cristais de gelo durante o
armazenamento, inviabilizando os grãos de pólen por danificar seus tecidos. Por outro
lado, quando o grão de pólen está extremamente seco, pode haver uma perda na sua
capacidade de germinação
O teor de umidade do pólen é um dos fatores mais importantes envolvendo o
armazenamento e normalmente encontra-se negativamente relacionado à longevidade
(SOUSA, 1988). O baixo teor de umidade do pólen (8 a 10%), quando armazenado,
propicia boa longevidade, independente do método de armazenamento (SPRAGUE &
JOHNSON, 1977).
O emprego de baixas temperaturas também influencia no armazenamento e
normalmente encontra-se ligado à redução do metabolismo do pólen, o que propicia
maior longevidade. Pode se conseguir redução de temperatura por meio de
refrigeradores e freezers. Entretanto, isso também é possível de forma mais promissora
através da criopreservação utilizando nitrogênio líquido -196º C (na fase líquida), ou a
-150° C (na fase de vapor) (WITHERS, 1984; KARTHA, 1985). Nessa temperatura
ultra baixa, o metabolismo celular do grão de pólen, como a respiração e atividades
enzimáticas pode reduzir-se substancialmente (SNYDER E CLAUSEN, 1974;
MEDEIROS E CAVALLARI, 1992) ou até mesmo ser inativado (BENSON et al.,
1998; CARVALHO E VIDAL, 2003), permitindo, teoricamente, a manutenção de sua
viabilidade por um período indefinido. De modo geral, estruturas de tamanho reduzido
são mais apropriadas para o congelamento, uma vez que a desidratação e o
congelamento ocorrem de forma mais rápida e uniforme (CARVALHO E VIDAL,
2003).
26
A longevidade do pólen vem sendo estudada em muitas espécies de
importância agronômica, na tentativa de conhecer as melhores condiççoes de estoque
para preservar a viabilidade e habilidade de fertilização do pólen por um longo período
(CASALI et al., 1984; Lacerda et al., 1995).
27
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Local
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos (Biofábrica),
da Universidade Federal Rural do Semi-árido – UFERSA, em Mossoró.
O município de Mossoró, situado na micro-região salineira do Rio Grande do
Norte, tem 5º 11’ de latitude Sul, 37º 20’ de longitude a Oeste de Greenwich e 18 m de
altitude. O clima, segundo a classificação de Koppen é ‘BSWh’ (muito seco, com
estação de chuva no verão atrasando-se para o outono) (CARMO FILHO; OLIVEIRA,
1989).
3.2 Caracterização do material vegetal
O pólen utilizado foi extraído de flores retiradas de meloeiros cultivados na
Horta do Departamento de Ciências Vegetais da Universidade Federal Rural do Semi-
árido – UFERSA, em Mossoró. Foram utilizados os híbridos: Vereda, Goldex e
Mandacaru, todos do tipo amarelo, pertencentes à variedade Inodorus Naud. Os
híbridos apresentam expressão andromonóica e possuem as seguintes características:
*Híbrido Vereda (Agroflora/Sakata): Híbrido de alta produtividade apresenta plantas
com excelente vigor e ótima cobertura foliar. Resistente ao Oídio raça 1 e ao vírus do
mosaico do mamoeiro estirpe melancia (PRSV-W). Os frutos possuem ótimo sabor e
cavidade pequena e boa conservação pós-colheita, padrão de mercado para exportação.
Início da colheita 60 a 70 dias.
28
*Híbrido Goldex (Agristar/Topseed): Híbrido de alta produtividade e plantas vigorosas
com tolerância a Fusarium raças 0 e 2 e Oídio. Os frutos apresentam polpa branca com
pequena cavidade interna e casca levemente rugosa com cor amarelo-ouro e peso
médio de 1,4 Kg. Alto brix (12 a 13º), ideal para exportação. Início da colheita de 64 a
70 dias.
*Híbrido Mandacaru (Clause Tézier): Plantas vigorosas, resistentes ao míldio. Os
frutos apresentam formato arredondado, casca vincada, polpa firme com peso médio de
1,5 a 2,3 Kg, excelente pós-colheita e brix. Ciclo médio- início da colheita entre 60 e
65 dias após o plantio.
3.3 Condução das plantas matrizes
O preparo do solo foi realizado com uma aração treze dias antes do plantio.
Posteriormente, com a ajuda de enxadas foram feitos camalhões e colocadas as
mangueiras do sistema de irrigação. A semeadura foi realizada no período de Agosto,
em bandejas de poliestireno expandido com 128 células, preenchidas com substrato
comercial. O transplantio foi feito quatorze dias após a semeadura, no espaçamento de
2,0 m entre linhas e 0,5 m entre plantas, as quais continham 3 linhas com 21 plantas de
cada cultivar separadas. O manejo da adubação foi feito via fertirrigação. A cultura foi
irrigada por gotejamento. O volume de água esteve em torno de 3.000 m3/ha. As
demais práticas culturais foram realizadas conforme a recomendação de manejo para a
cultura no estado (NUNES et al., 2004).
29
3.4 Coleta das flores e extração do pólen
Para a realização do trabalho foi feita a marcação dos botões florais que se
encontravam na pré-antese de plantas que se apresentavam fenotipicamente saudáveis.
No dia seguinte as flores marcadas eram coletadas em torno de 6:30 h da manhã e
colocadas em placas de petri que foram fechados e levados para o laboratório de
Cultura de Tecidos da UFERSA para a realização dos ensaios. As flores eram
dissecadas, retirando-se as pétalas e as sépalas, e com auxílio de uma pinça as anteras
eram retiradas e, em seguida, colocadas em tubos de micro-centrífuga, onde se
procedia à sua maceração.
A extração do pólen era feita após a adição de 50 µL de água destilada ou
solução saturada de sacarose, utilizando-se uma ponteira de micropipeta e
pressionando-se as anteras delicadamente três ou quatro vezes. A suspensão com os
grãos de pólen era então vertida sobre o meio de cultura, na forma de quatro gotas de
suspensão colocadas nas extremidades de cada placa de Petri, onde, após um período
de tempo pré-determinado se procedia à avaliação da germinação, conforme descrito
na figura 1.
30
Figura 1. Sequência das etapas de extração do pólen: Placa com as flores e a pinça
(A), retirada das sépalas e pétalas (B), retirada da antera (C), pinça com a antera (D),
colocação da antera em tubo de micro-centrifuga (E), pipetagem da solução de
sacarose (F), maceração da antera (G), aplicação da suspensão do pólen em meio de
cultura (H). UFERSA, Mossoró-RN, 2008.
31
3.5 Avaliação da germinação in vitro
A avaliação da germinação in vitro foi estudada e otimizada como forma
rápida de determinação da viabilidade do pólen, foi feita a avaliação em microscópio
binocular com aumento de 100X. Foram avaliados o número de grãos de pólen por
campo visual e a porcentagem de grãos de pólen germinados. Em cada gota de
suspensão foram avaliados 4 campos de visão, equivalendo a 4 repetições. Os campos
foram fotografados com auxílio de máquina fotográfica digital compacta sob resolução
de 8 MPixels e a leitura da quantidade de grãos de pólen e de germinação foi feita por
contagem manual em computador, com auxílio de um programa de computador para
exibição de imagens e desenho (Paint ®). Para isso, os grãos germinados e os não-
germinados foram marcados com pontos de cores diferentes, os quais foram contados
para determinar o número total de grãos-de-pólen e a percentagem de grãos
germinados (Figura 2). Foram considerados germinados os grãos cujos tubos polínicos
tivessem ultrapassado o comprimento do diâmetro do próprio grão de pólen (SOUSA,
1988).
Figura 2. Campo fotográfico com grãos de pólen marcados por computador, com
auxílio do programa paint para windows, pintados de vermelho (grãos germinados) e
de amarelo (não germinados). UFERSA, Mossoró-RN, 2008
32
1° Ensaio: Meio para extração dos grãos de pólen
Foram testados dois meios de extração: água destilada e saturada de sacarore
(400 g.L-1). Em ambos os casos foram utilizados 50 µL do meio de extração, que foram
colocados em um tubo de micro centrífuga com duas anteras. Após a maceração, a
suspensão de grão de pólen foi levada ao microscópio estereoscópico, onde foi
examinada sob aumento de 25,2 vezes para monitorar a ocorrência de danos de
embebição, que eram observados como explosões dos grãos de pólen com perda de
conteúdo celular. Foram feitas 6 repetições para ambos os meios de extração, e
posteriormente colocados para germinar em placas de Petri, em que, após duas horas,
foi avaliado o número total de grãos de pólen e a percentagem de germinação.
2° Ensaio: Teste de meios de cultura
Foram testados 2 meios de cultura, sendo o meio 1, semi-sólido constituído por
10% de sacarose, 1% de agar, 800 mg L-1 de nitrato de cálcio (Ca(NO3)2 4 H2O), 200
mg L-1 de ácido bórico (H3BO3), e o meio 2, líquido, contendo 1g de sacarose, 100 ml
de água, 200 mg L-1 de ácido bórico (H3BO3) e 0,2g de agar. Os meios foram
colocados em placas de Petri (10 mL por placa), que em seguida foram autoclavadas.
Amostras de pólen foram colocadas em ambos os meios, sendo avaliada após duas
horas, em microscópio binocular com aumento de 100X quanto à facilidade de
manipulação e leitura de germinação, a quantidade de grãos de pólen por campo visual
e a percentagem de germinação.
33
3° Ensaio: Uso de Corantes
Foi feito um teste utilizando dois corantes para parede celular, Lugol a 5% e o
Azul de Metileno. As soluções foram preparadas com as seguintes concentrações: 2 g
de Iodeto de Potássio, 1g de Iodo e 300 ml de água de água destilada para o Lugol e o
preparo do azul de Metileno consistiu da adição de 1,5mL de azul de metileno a uma
solução contendo: 20 mL de Glicerina, 20 mL de Ácido láctico, 40 mL de Lactofenol,
20 mL de água destilada.
Amostras de grãos de pólen foram colocadas para germinar em meio semi-
sólido em placas de Petri e, após duas horas, as áreas contendo as suspensões de pólen
foram adicionadas de uma gota de solução de iodo em cada campo de visualização.
4° Ensaio: Tempo de Leitura
Amostras de pólen da cultivar Vereda, cultivadas em casa-de-vegetação, foram
colocadas para germinar e avaliadas quanto ao número total de grãos de pólen e
percentagem de germinação após 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 horas da inoculação.
5° Ensaio: Identificação da fenologia do desenvolvimento floral
Foi feito um acompanhamento do desenvolvimento das flores do meloeiro,
desde o surgimento do botão floral até a sua abertura. Foi feita a marcação das pontas
dos ramos de 10 plantas aleatórias de cada cultivar utilizada no trabalho, no local de
um botão floral. Diariamente, de manhã, sempre no mesmo horário, o comprimento
dos botões era medido com auxílio de um escalímetro e os botões fotografados.
34
6° Ensaio: Horário de Coleta
Para a realização do trabalho, os botões florais foram marcados em estádio
balão, eliminando-se aqueles que estavam abertos de acordo com a metodologia de
Pasqual et al. (1982). Foram marcados, de forma aleatória, 60 botões florais das
cultivares Vereda, Mandacaru e Goldex. Foram estabelecidos 4 horários de coleta:1°
7:00 horas da manhã, ainda em estádio balão, 2° 16:00 horas do mesmo dia,
identificados como estando na véspera da antese; 3° em torno de 5:15 horas, em plena
antese, e às 16:00 horas desse dia. Para cada horário estabelecido foram coletados 15
botões florais marcados de cada cultivar. Os botões florais foram transportados para o
laboratório em placas de Petri fechadas onde se procedeu à análise da germinação in
vitro.
7º Ensaio: Armazenamento
As anteras foram coletadas no momento da antese e armazenadas em tubos de
micro-centrífuga numerados, colocados dentro de Becker de plástico sob 3
temperaturas: -10ºC (freezer), 4ºC (refrigerador) e em temperatura ambiente. A análise
da germinação in vitro foi feita após 24, 48, 72 e 96 horas de armazenamento. Os
botões florais foram marcados no dia anterior, na véspera da antese e coletados no dia
seguinte, no momento da antese. Foram coletadas 65 flores de cada cultivar para a
realização deste ensaio.
35
3.6 Análise estatística
Os ensaios 2, 4, 6 e 7 foram submetidos à estatística paramétrica através da
análise de deviance a 1% de probabilidade pelo método de modelos lineares
generalizados e para comparação de médias o teste Z Kolmogorov-Smirnov a 5% de
probabilidade. As análises foram realizadas para verificar o comportamento dos meios
de extração, horários de coleta e o uso das diferentes técnicas de armazenamento em
função do tempo dentro de cada cultivar estudada, observando os seus efeitos na
viabilidade dos grãos de pólen de melão.
36
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Meio para extração dos grãos de pólen e tipos de meios de cultura
Verificou-se pelo teste do χ2, através da análise de deviance ao nível de
significância de 1% de probabilidade que houve diferença significativa entre o meio de
extração com sacarose ou com água quanto à viabilidade dos grãos de pólen, não sendo
observadas diferenças significativas quanto ao tipo de meio, sólido ou líquido e para
interação entre ambos os fatores (Tabela 1).
Tabela 1. Resumo da análise de Deviance para o meio de extração de grãos de pólen e
meio de cultura, UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
Fontes de Variação GL χ ²
Extração Meio de Cultura
Ext. x Meio
1 1 1
67,96** 0,16ns 2,57ns
Deviance 2,6272
** nível de significância de 1% de probabilidade, pelo teste do χ ².
A figura 3 mostra que não houve diferença quanto ao meio de extração, onde
os tratamentos que utilizaram sacarose como meio de extração a germinação foi maior
do que 65 % e nos tratamentos onde os grãos foram extraídos em água a porcentagem
de germinação foi inferior a 50 %.
37
Meio de Extração/Meio de Cultura
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
sacarose/ sólido sacarose/ líquido água/ sólido água/ líquido
Tipos de meio de extração e meio de cultura
Ger
min
ação
(%
)
Figura 3. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Vereda em função do meio de
extração (água ou solução de sacarose a 400 g.L-1) e do meio de cultivo (sólido ou
líquido). UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
A diferença entre a extração do pólen com água ou sacarose pode ser
observada na Figura 4, onde se observa a presença de material celular extravasado (4B)
quando da extração com água.
38
Figura 4. Pólen de (Cucumis melo L.). A - extraídos com sacarose e B - extraídos com
água, após incubação sobre meio de cultura. Observar a presença de material celular
extravasado após a extração com água, na figura B. UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
Observou que com a extração em água os grãos de pólen rompiam com perda
de conteúdo celular, impossibilitando sua germinação. É possível que isso tenha
ocorrido em função da enorme diferença de potencial hídrico entre o grão de pólen e a
água, e supõe-se que a adição de sacarose à saturação minimiza esse efeito. Na prática,
observou-se melhor manutenção da viabilidade quando da extração em solução
saturada de sacarose. Por isso foi estabelecido o meio de extração com sacarose, o qual
foi usado nos demais experimentos. Estes resultados concordam com os obtidos por
vários autores, que afirmam que a sacarose é um dos componentes necessários para a
germinação de pólen e também exerce a função de equilíbrio osmótico da solução,
além de fornecer energia necessária para o crescimento do tubo polínico (GALLETTA,
1983; MIRANDA & CLEMENT, 1990; STANLEY & LINSKENS, 1974). Várias
pesquisas têm sido conduzidas a fim de estabelecer e padronizar meios de cultura e
condições ambientais para avaliar a viabilidade do pólen em diversas espécies
(SALLES et al., 2006). O meio proposto por (BREWBAKER & KWACK, 1963) foi
desenvolvido para testar pólen de espécies com dificuldades de germinação in vitro,
nos meios convencionais, o qual tem sido empregado, com sucesso, para espécies
agrícolas, ornamentais e florestais, tais como Prunus serotina (FARMER & HALL,
39
1975), Discorea rotundata (AKORODA, 1984), espécies da família Bignoniaceae
(RATHORE & CHAUHAN, 1985), Narcissus sp. (BOWES, 1990), Zea mays, Pinus
sp. e Picea sp. (CONNOR & TOWILL, 1993).
Os principais componentes do meio de cultura para a germinação de pólen têm
sido as diferentes concentrações de açúcares e distintas concentrações de boro
(MIRANDA & CLEMENT, 1990). Em pólen de citrus, segundo Salles et al (2006) o
melhor resultado foi obtido na concentração de 100 gL-1 de sacarose, proporcionando
as maiores porcentagens de germinação de grãos de pólen para todas as cultivares
testadas (Valência, Pêra e Natal). Kobayashi et al. (1991) utilizaram concentração de
200 gL-1 de sacarose para obter maior germinação de grão de pólen de um híbrido de
Citrus sinensis x Poncirus trifoliata; Diferentes concentrações de glicose foram
testadas na germinação de grãos de pólen de algumas variedades cítricas e os melhores
resultados foram obtidos com 150 g L-1 de glicose, apresentando em média 59% de
germinação (Butt et al., 1993). Derin & Eti (2001) observaram que maiores taxas para
germinação de pólen de romã foram obtidas em meio de cultura contendo 10 gL-1 de
sacarose.
4.2 Uso de corantes
Conforme pode ser verificado na figura 5, observou-se que a aplicação de
ambos os corantes, Azul de Metileno e Iodo, facilitou a avaliação da germinação, mas
que a coloração com iodo proporciona a melhor visualização dos grãos. Com base
nessas observações, as demais avaliações foram feitas após coloração com iodo.
40
Figura 5. Pólen de (Cucumis melo L). A - sem coloração, B - coloridos com Iodo a 5%
e C - coloridos com azul de metileno. UFERSA, Mossoró-RN, 2008.
4.3 Tempo de leitura
Conforme pode ser observado na figura 6, após uma hora de leitura os grãos de
pólen já haviam atingido a germinação máxima, não havendo aumentos posteriores. A
pequena queda da taxa de germinação no período de quatro horas é devida ao fato de
se tratarem de amostras oriundas de flores diferentes. Nesse período os grãos de pólen
apresentavam tubos polínicos com cerca de quatro vezes o tamanho do grão de pólen
(ver figura 7).
41
Velocidade de Germinação
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo de Leitura (H)
Ger
min
ação
(%
)
Figura 6. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Mandacaru em função do
tempo de leitura. UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
Conforme pode ser observado na figura 7, em períodos posteriores a leitura da
germinação era dificultada por dois fatores, o enorme comprimento do tubo polínico,
que dificultava a identificação dos grãos germinados ou não, e a presença de sujidades,
provavelmente devidas ao crescimento de microrganismos. Por isso, foi estabelecido o
tempo de 2 horas para se proceder à avaliação da germinação in vitro. O tubo polínico,
nesse tempo, apresentava-se em média seis vezes maior que o grão de pólen. Esse
tempo de leitura foi usado nas demais avaliações.
42
Figura 7. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Mandacaru em função do
tempo de avaliação: A - Com 1 horas após a inoculação, B – 2 horas, C- 3 horas, D – 4
horas, E – 5 horas, F – 6 horas, G – 7 horas e H – 8 horas. UFERSA, Mossoró-RN,
2008.
43
Foi observado que alguns grãos de pólen apresentavam um intumescimento em
mais de uma das aberturas da exina. Entretanto, na maioria dos grãos de pólen apenas
um tubo polínico foi emitido por grão. Observou-se que após a germinação dos grãos
de pólen, o tubo polínico permanece por algumas horas ligados ao pólen, conforme foi
descrito por Johri et al. (1992). Esta característica pode permitir que estudos de
fertilização in vitro sejam realizados visando obtenção de híbridos elite.
Verificou-se também que em alguns casos o tubo polínico se encontrava solto
no meio de cultura. Segundo Akamine e Girolami (1959) e Salles et al. (2006), tubos
polínicos se rompem devido, entre outros fatores, à alta umidade e à variação da
pressão hidrostática do meio ocasionada pela diferença do potencial osmótico e pela
baixa resistência da parede celular.
Estas elevadas taxas de germinação (acima de 80%) dos grãos de pólen
alcançadas no laboratório podem não corresponder às taxas ocorrentes em condições
naturais, uma vez que as condições são diferentes daquelas in vitro.
4.4 Identificação da fenologia do desenvolvimento floral
Conforme pode ser verificado na figura 8. Os botões florais foram marcados
ainda bem pequenos, com tamanho de cerca de 3,5 milímetros. No segundo dia os
botões se encontravam com cerca de 4,5 mm. Entre o 3° e 4° dias começavam a se
desenvolver a sépalas, e as flores apresentavam tamanho entre 5 e 7 mm. Entre o 5° e
6° dias as pétalas surgiam, e se desenvolviam principalmente em torno do 6° dia,
chamado de período de pré-antese. Nessa época, o tamanho total da flor era de cerca de
13 mm. No 7° dia podia ser observada a antese, permitindo que o período de pré-
floração pudesse ser identificado com segurança, e que as flores pudessem ser
marcadas nesse estádio, de forma a identificar claramente o momento da antese,
44
considerada por vários autores como o momento de maior viabilidade do grão de
pólen.
Figura 8. Estágios do botão floral de plantas de melão da cultivar Mandacaru desde a
sua emissão até a sua abertura, medido com auxílio de um escalímetro. A - 1° dia, B -
45
2° dia, C - 3° dia, D - 4° dia, E - 5° dia, F - 6° dia e G - 7° dia. UFERSA, Mossoró-
RN, 2008.
4.5 Horário de coleta
Conforme pode ser visto na figura 9, percebeu-se que ocorreram diferenças
significativas quanto aos horários de coleta, sendo observado que com 24 horas antes
da antese, a germinação em todas as cultivares foi 0 (nula), Com 12 horas antes da
antese o grão de pólen já se encontrava em condições favoráveis à germinação in vitro,
com valores em trorno de 80 % para as cultivares Mandacaru e Goldex, e de 60% para
a cultivar Vereda. Os grãos atingiram os maiores valores de germinação no momento
da antese, acima de 90 % para todas as cultivares, em torno de 5:15 h da manhã. No
final da tarde, aproximadamente 12 horas após a antese, houve um decréscimo da
germinação. Observou-se neste horário uma diferença significativa entre as cultivares
estudadas. Enquanto que a Mandacaru após 12 horas da antese manteve uma
porcentagem de germinação em trorno de 80 %, as demais cairam drasticamente para
menos de 10 %.
A germinação do pólen não ocorre dentro da antera, mas este deve estar pronto
para germinar logo após a deiscência da mesma (LIN, 1984), desde que encontre
condições favoráveis. Em programas de melhoramento genético, é fundamental coletar
o pólen em estádio adequado de maturação, para que o mesmo mantenha a viabilidade
e capacidade de germinar quando for realizada a hibridação.
Foi observado no presente trabalho que a germinação dos grãos de pólen sofre
uma queda com o passar do dia, portanto a polinização nas primeiras horas do dia , em
torno de 5:30 h, deverá ser mais bem sucedida conforme mencionado por Free (1993).
Sendo também esse horário o mais indicado para a coleta de grãos de pólen para o
armazenamento. Pode ser estudada, no entanto, a possibilidade de coleta no final da
46
tarde, na véspera da antese, como forma de facilitar os trabalhos de fecundação
controlada.
A tabela 2 mostra o resumo da comparação de médias em função do horário de
coleta para as 3 cultivares, com uso da estatística não paramétrica pelo teste Z
Kolmogorov-Smirnov ao nível de 5% de significância. Verificando-se que não existe
diferença entre os horários de coleta no final da tarde, do dia anterior a antese e no
momento da antese para as 3 cultivares estudadas. Evidenciando com isso que o pólen
pode ser coletado até mesmo no dia anterior a antese, no final da tarde sem perda de
viabilidade.
Os demais horários não foram observados pois a porcentagem de germinação
tanto para o horário de 7:00 h da manhã, com a flor na pré antese e para o horário de
17:00 horas, com 12 horas após a antese foram nulos e baixos, respectivamente. Não
sendo interessante a sua coleta para utilização desses grãos de pólen para realização da
fecundação.
Tabela 2. Comparação de médias do horário de coleta para as cultivares Mandacaru,
Vereda e Goldex. UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
Horário de coleta Mandacaru Vereda Goldex
05 Pré 0,34 0 0
17 Pré 83,60 A 60,75 A 84,63 A
05 Pós 92,88 A 91,17 A 93,40 A
17 Pós 84,28 6,57 4,77
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo Teste Z
Kolmogorov-Smirnov ao nível de 5% de probabilidade.
47
0
20
40
60
80
100
120
05 Pré 17 Pré 05 Pós 17 Pós
Horários de Coleta
Ger
min
ação
(%
)
Mandacaru
Vereda
Goldex
Figura 9. Porcentagem de germinação em diferentes horários de coleta. Com
aproximadamente 24 horas antes da antese (05 Pré), com 12 horas antes da antese (17
Pré), no momento da antese (05 Pós) e com 12 horas depois da antese (17 Pós).
UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
4.6 Armazenamento
Pode-se verificar que houve efeito significativo pelo teste do χ ², tanto para os
fatores isolados com também na interação desses fatores (Tabela 3). Esses
resultados confirmam que a porcentagem de germinação é dependente de alguns
fatores, principalmente aqueles relacionados ao armazenamento.
48
Tabela 3. Análise de Deviance de 3 cultivares de melão em função do local e do tempo
de armazenamento, UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
FV DF χ ² Cult. Loc.
Cult. x Loc. Tem.
Cult. x Tem. Loc. x Tem.
Cult. x Loc. x Tem.
2 2 4 3 6 6
12
78,94** 1972,66** 175,88** 1092,32** 56,79** 275,05** 290,71**
Deviance 5,4010
** nível de significância de 1% de probabilidade, pelo teste do χ ².
Nas figuras 10, 11 e 12 são apresentados os valores de germinação de grãos de
pólen de melão para as cultivares Mandacaru, Vereda e Goldex de acordo com os
diferentes tratamentos de armazenamento nas referidas épocas de avaliações, sendo
comparadas com o pólen fresco. Observando que há uma redução da germinação in
vitro, com o aumento do tempo de conservação para as três cultivares, passando de
uma germinação de mais de 80 % com o pólen fresco para menos de 20 % de
germinação para todos ambientes utilizados ao longo do tempo de conservação.
49
0
20
40
60
80
100
0 24 48 72 96
Tempo de armazenamento (H)
Germ
inação
(%
)
ambiente
geladeira
freezer
Figura 10. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Mandacaru, em função do
local e tempo de armazenamento. UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
0
20
40
60
80
100
120
0 24 48 72 96
Tempo de armazenamento (H)
Germ
inação
(%
)
ambiente
geladeira
freezer
Figura 11. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Vereda, em função do local e
tempo de armazenamento. UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
50
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 24 48 72 96
Tempo de armazenamento (H)
Germ
inação
(%
)
ambiente
geladeira
freezer
Figura 12. Germinação de pólen de meloeiro da cultivar Goldex, em função do local e
tempo de armazenamento. UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
.Durante o armazenamento do grão de pólen, ocorrem alterações fisiológicas
que podem provocar a redução da viabilidade do mesmo.
Evidenciou-se que o armazenamento sob temperatura ambiente provocou a
perda rápida da viabilidade conforme pode ser visto nas figuras 10, 11 e 12. Esses
resultados são inferiores aos obtidos por vários autores (GOMEZ et al., 2000;
OLIVEIRA JÚNIOR et al., 1995; VAKNIN & EISIKOWITCH, 2000) que
constataram que a viabilidade de grãos de pólen armazenados em temperatura
ambiente pode ser mantida a curto prazo por no máximo 30 dias. Honda et al. (2002)
constatou que pólen de Delphinium armazenado a 25° C teve diminuição significativa
na taxa de germinação dentro de 10 dias. No caso do melão, observou-se forte perda da
viabilidade já após 24 horas de armazenamento, chegando a menos de 30 % de
germinação à medida em que se aumentava o tempo de conservação.
51
Verificou-se que o pólen de melão armazenado em refrigerador apresentou
maiores porcentagens de germinação em relação ao pólen armazenado à temperatura
ambiente, embora com um decréscimo de viabilidade em função do tempo de
armazenamento. Estes resultados concordam com vários autores (GOMEZ et al.,
2000) que manteve o pólen de amêndoa armazenado em refrigerador a 4° C por 8
semanas, e (SIREGAR & SWEET, 2000) estudando pólen de pinho também em
refrigerador a 4° C, constataram perda de viabilidade com o aumento do tempo de
conservação. Já Vaknin & Eisikowitch (2000) constataram que pólen de pistache
armazenados em refrigerador a 4° C teve sua viabilidade conservada até uma semana.
No caso do melão, sob refrigeração observou-se perda significativa da viabilidade
mesmo após 24 horas de armazenamento em geladeira, ainda que possa ser
considerado um período viável de armazenamento. Por outro lado, as taxas obtidas às
48 horas para a cultivar Mandacaru não são consideradas adequadas para utilização
desses grãos de pólen em programas de fecundação.
Os grãos de pólen de melão armazenados em freezer apresentaram
porcentagem de germinação inferior aos de geladeira, sendo que esses resultados não
estiveram de acordo com os outros trabalhos realizados, como o de Oliveira et al.
(2001) que observou maior longevidade quando do congelamento a (-10° C) do pólen
de açaizeiro por um período de 1, 3, 6 e 12 meses. O emprego de baixas temperaturas
normalmente encontra-se ligado à redução do metabolismo do pólen, o que propicia
maior longevidade segundo Salles et al (2007), que afirmam também que o pólen de
citrus armazenado em freezer (-10° C) permaneceu viável por um período maior de
tempo, mas ainda assim pôde-se verificar que houve uma redução com o tempo de
conservação. O teor de umidade do pólen é um dos fatores mais importantes
envolvendo o armazenamento e normalmente encontra-se negativamente relacionado à
longevidade (SOUSA, 1988). No caso de pólen de melão, observou-se que já no
período de 24 horas de armazenamento a perda da viabilidade foi significativa e
52
importante, quando foram observadas taxas de germinação em torno de 25% para todas
as cultivares, indicando que não é interessante congelar esses grãos para se trabalhar
posteriormente em programas de hibridação.
Pereira (2001) armazenou pólen de eucalipto em freezer (- 4°C) por 1, 2 e 3
meses, constatando decréscimo na viabilidade do pólen no decorrer do período de
armazenamento. Enquanto que, Vaknin & Eisikowitch (2000) observaram que pólen
de pistache congelado a (- 20°C) perdeu irreversivelmente sua viabilidade.
Com base nos resultados obtidos, considera-se que, em relação ao tempo de
armazenamento, os grãos de pólen de melão tendem a diminuir a viabilidade à medida
que se aumenta o tempo de armazenamento. Conforme pode ser visto na Figura 10,
observou-se dentro das interações que para a cultivar Mandacaru não houve diferença
ao longo do período de tempo nos ambientes; Nas Figuras 11 e 12, com relação as
cultivares Vereda e Goldex, observou-se que o ambiente geladeira foi melhor, podendo
ser armazenado em um intervalo de 48 até 72 horas. Podendo ser uma alternativa para
os melhoristas colocar os grãos de pólen de melão em refrigerador por até 72 horas
sem perda significativa de viabilidade e vigor.
A tabela 4 mostra os resultados da comparação das médias pelo teste Z
Kolmogorov-Smirnov ao nível de 5% de significância, para os dados de
armazenamento em geladeira em função do tempo de conservação para as 3 cultivares.
53
Tabela 4. Comparação de média do armazenamento em geladeira em função do tempo
para as cultivares Mandacaru, Vereda e Goldex. UFERSA, Mossoró-RN, 2009.
Tempo de Armaz. Mandacaru Vereda Goldex
0 84,74 A 87,44 A 64,22 A
24 63,35 B 53,31 B 44,16 B
48 23,39 C 54,04 B 49,06 B
72 25,99 C 42,69 B 43,49 B
96 11,04 D 21,24 C 18,74 C
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna não diferem entre si pelo Teste z
Kolmogorov-Smirnov ao nível de 5% de probabilidade.
Observa-se ainda, pela tabela 4 que não houve diferença de germinação para as
cultivares Vereda e Goldex, no intervalo de 24 a 72 horas de conservação, havendo
diferença somente quanto a cultivar Mandacaru, mostrando uma perda na viabilidade
do pólen já no período de 48 horas.
Esse fato evidencia heterogeneidade entre os cultivares. Por conseguinte, pode-
se ter maior tempo de conservação em função do genitor utilizado como doador de
pólen. No presente trabalho, os híbridos Vereda e Goldex poderiam ter seu pólen
conservador até 72 horas.
54
5 CONCLUSÕES
- A extração do pólen com sacarose possibilita uma melhor manutenção da viabilidade; - O uso do Iodo a 5%, facilita a visualização e avaliação da germinação in vitro de grãos de pólen de meloeiro; - A leitura da germinação pode ser feita em um período de duas horas após a inoculação; - A viabilidade máxima dos grãos de pólen é o momento da antese; - A viabilidade dos grãos de pólen de melão diminui com o aumento do tempo de armazenamento; - A melhor condição para armazenamento de grãos de pólen de melão é o ambiente de geladeira, para as cultivares Vereda e Goldex por um período máximo de 72 horas;
55
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