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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

ESCOLA DE FARMÁCIA - CIPHARMA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

SÍNTESE E ATIVIDADES

FARMACOLÓGICAS DE DERIVADOS DA

6-NITRO-2H-1,4-BENZOTIAZIN-3-ONA

JULIANA LUÍSA TEIXEIRA DE ANDRADE

OURO PRETO – MG – BRASIL

2008

JULIANA LUÍSA TEIXEIRA DE ANDRADE

SÍNTESE E ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE

DERIVADOS DA 6-NITRO-2H-1,4-BENZOTIAZIN-3-ONA

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

da Escola de Farmácia da Universidade

Federal de Ouro Preto, como requisito parcial

à obtenção do título de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Área de Concentração: Química Farmacêutica

Orientadora: Profª. Drª. Vera Lúcia de Miranda Guarda

Co-orientadora: Profª. Drª. Andrea Grabe Guimarães

Ouro Preto

Escola de Farmácia - UFOP

2008

Catalogação: [email protected]

A554s Andrade, Juliana Luísa Teixeira de.

Síntese e atividades farmacológicas de derivados da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona [manuscrito] / Juliana Luísa Teixeira de Andrade – 2008.

xvii, 108 f.: il. color., grafs., tabs. Orientadora: Profa. Dra. Vera Lúcia de Miranda Guarda. Co-orientadora: Profa. Dra. Andrea Grabe Guimarães. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Química Farmacêutica

1. Benzotiazina - Teses. 2. Toxicidade aguda - Teses. 3. Atividade antinociceptiva - Teses. 4. Atividade antifúngica - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título. CDU: 615.07

ii Juliana Luisa T. de Andrade

iii Juliana Luisa T. de Andrade

Trabalho realizado nos laboratórios de Química

Farmacêutica, de Farmacologia Experimental e de

Microbiologia da Escola de Farmácia da

Universidade Federal de Ouro Preto, Minas Gerais.

Os ensaios de toxicidade aguda foram realizados

em parceria com a Profª. Drª. Neila Márcia Silva

Barcellos e os de atividade antifúngica in vitro com

a Profª. Drª. Maria Elisabete Barros.

Dedicatória

iv Juliana Luisa T. de Andrade

Este trabalho é dedicado à minha filha Júlia,

cujo sorriso possui “atividade farmacológica”

que cientista nenhum consegue decifrar.

Graças a ela aprendi que o amor materno é

realmente infinito e incondicional.

Agradecimentos

v Juliana Luisa T. de Andrade

AGRADECIMENTOS

É imprescindível referir que a realização deste trabalho se deve a todos

aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização do mesmo,

incentivando e colaborando com amizade. Sei que palavras não quantificam a

minha gratidão, mas ainda assim gostaria de demonstrar o meu imenso

agradecimento:

À Deus, por tudo.

Aos meus pais, Tony e Ivy, exemplos de resiliência e amor. Aos meus

irmãos Klaus e Danilo, pela presença sempre constante além do apoio, incentivo

e amizade verdadeira.

Ao Renato, por encorajar-me a persistir nos ideais. Nele encontrei todo o

amor e apoio necessário, renovando minha energia e confiança.

À Dadá, pela certeza de que minha filha estava sendo imensamente

amada e bem cuidada.

Às queridas amigas Elenice e Júnia, por compreenderem a minha ausência

e serem sempre um exemplo de força e dedicação.

À Tália, “Tia Ângela” e Ariadne, pela grande amizade, apoio, inúmeras

ajudas, além do enorme carinho, hospitalidade e aconchego familiar.

À Nathália Duarte, pela dedicação imensurável. Muitas são as razões para

agradecer, mas todas se resumem na certeza de que este trabalho não seria o

mesmo sem ela.

À minha orientadora, Profª. Drª. Vera Guarda, minha gratidão e admiração.

Convidar-me foi um sinal de confiança e jamais esquecerei que foi graças a ela

que cheguei até aqui. Obrigada pela oportunidade, apoio e incentivo.

Agradecimentos

vi Juliana Luisa T. de Andrade

À minha co-orientadora, Profª. Drª. Andrea Grabe, pelos ensinamentos,

sugestões e dedicação, principalmente durante a finalização deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Sidney Augusto, querido Bibo, pelos conselhos e incentivos

para a conclusão desta pesquisa.

Ao Prof. Dr. Tanus Nagem, mais que ensinos teóricos, pela amizade,

confiança e apoio em todos os momentos que a ele recorri.

Às Profªs. Drª. Neila Barcellos e Drª. Maria Elisabete Barros, pela

colaboração, auxílio e ensinamentos, sempre com imensa presteza e dedicação.

Ao Fernando Armini pela ajuda, possibilitando a finalização deste trabalho

em tempo hábil.

Ao Sr. José Maria, técnico do laboratório de Química Farmacêutica, por

todo o apoio, disposição e presteza.

Aos funcionários do Biotério, especialmente Wilson e Cristina, por auxiliar-

me nos procedimentos necessários e pelos cuidados com os animais.

À Luciana Guzzo, pela ajuda e valiosas informações.

À Eliane Stetler, pelo carinho e delicadeza em revisar esta dissertação.

Aos professores e colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas – CiPharma, pelo engrandecimento deste curso. De forma

especial, à Profª. Drª. Dênia Antunes e ao Prof. Dr. Jorge Humberto.

À Universidade Federal de Ouro Preto pela oportunidade, ensinamentos e

concessão da bolsa de Desenvolvimento Científico.

vii Juliana Luisa T. de Andrade

“O homem se torna muitas vezes o que ele próprio

acredita que é. Se eu insisto em repetir para mim

mesmo que não sou capaz de realizar alguma coisa, é

possível que realmente seja incapaz de fazê-lo. Ao

contrário, se tenho convicção de que posso fazê-la,

certamente adquirirei capacidade de realizá-la, mesmo

que não a tenha no começo.”

Gandhi

Resumo

Juliana Luísa T. de Andrade vii

RESUMO

A necessidade de potencializar determinadas atividades farmacológicas e

reduzir efeitos indesejáveis torna necessária a busca por novos fármacos.

Utilizando técnicas de modificação molecular, cinco derivados da 2H-1,4-

benzotiazin-3-ona foram sintetizados. Suas estruturas foram comprovadas por

métodos espectroscópicos de infravermelho, RMN1H, RMN13C e espectrometria

de massas. Estes compostos foram submetidos aos testes de toxicidade aguda,

analgesia - pelo método da placa quente e das contorções abdominais induzidas

pelo ácido acético - e atividade antifúngica. Foram observadas estereotipias e

sinais qualitativos indicativos de toxicidade nos animais. Os resultados da Dose

Letal Mediana revelaram que as modificações moleculares induziram uma maior

toxicidade, principalmente nos compostos que sofreram a redução do grupo nitro

a grupo amino. O derivado benzoilado induziu maior redução nas contorções

abdominais e aumento no tempo de latência sobre a placa quente. Nos

experimentos antifúngicos apenas o composto de partida induziu atividade.

Palavras-chave: 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, toxicidade aguda, atividade

antinociceptiva, atividade antifúngica.

Abstract

Juliana Luísa T. de Andrade viii

ABSTRACT

The necessity to maximize some pharmacological activities and to reduce

unwanted effects makes necessary the search for new therapeutic agents. By

means of molecular modifications, five derivatives of 2H-1,4-benzothiazin-3-one

had been synthesized. Their structures had been confirmed by infrared and mass

spectrometry, RMN1H and RMN13C. These composites had been submitted to the

tests of acute toxicity, analgesy – using the hot plate method and the acetic acid

induced abdominal contortions method - and antifungal activity. Stereotypes and

qualitative signals that indicate of toxicity in the animals had been observed.

Medium Lethal Dose results had disclosed that the molecular modifications had

induced to a bigger toxicity, mainly in the composites that had suffered to the

reduction from the nitro group to the amino group. The benzoyl derivative induced

greater reduction in the abdominal contortions and increase in the time latency on

the hot plate. Only the departure composite induced activity in the antifungal

experiments.

Keywords: 6-nitro-2H-1,4-benzothiazin-3-one, acute toxicity, antinociceptive

activity, antifungal activity.

Lista de Figuras

Juliana Luísa T. de Andrade ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Núcleo benzotiazínico e suas formas isoméricas 2H e 4H .............................................5

Figura 2: Estrutura molecular do antipsicótico Protipendil (Tiofenilpiridilamina)...............................6

Figura 3: Similaridade estrutural entre 1,4-benzotiazinas e fenotiazinas observadas ao longo do

eixo nitrogênio-enxofre.......................................................................................................................6

Figura 4: Morfologia de algumas das espécies de Candida: a) Candida albicans; t) Candida

tropicalis; k) Candida krusei e p) Candida parapsilosis....................................................................19

Figura 5: Morfologia da Candida albicans: A) Representação esquemática; B e C) Aspecto

microscópicos, visualizando os clamidosporos e as pseudohifas....................................................20

Figura 6: Morfologia da Candida krusei: A) Representação esquemática; B e C) Aspecto

microscópicos, visualizando os clamidosporos e as pseudohifas. ..................................................20

Figura 7: Morfologia da Candida parapsilosis: A) Representação esquemática; B e C) Aspecto

microscópicos, visualizando os clamidosporos e as pseudohifas. ..................................................20

Figura 8: Morfologia da Candida tropicalis: A) Representação esquemática; B e C) Aspecto

microscópicos, visualizando os clamidosporos e as pseudohifas. ................................................. 20

Figura 9: Representação esquemática da síntese dos derivados ................................................ 33

Figura 10: Fórmula estrutural e tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-1 .................................38

Figura 11: Fórmula estrutural e tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-1R ............................. 38

Figura 12: Fórmula estrutural e tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-2 ................................ 38

Figura 13: Fórmula estrutural e tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-2R ............................. 38

Figura 14: Fórmula estrutural e tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-3..................................38

Figura 15: Espectro de absorção no Infravermelho da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona..............42

Figura 16: Espectro de absorção no Infravermelho da 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ..........43

Figura 17: Espectro de absorção no Infravermelho da 6 – nitro – 4 – metil - 2H - 1,4 - benzotiazin-

3-ona .............................................................................................................................................. 44

Figura 18: Espectro de absorção no Infravermelho da 6 – amino – 4 – metil -2H-1,4-benzotiazin-3-

ona....................................................................................................................................................45

Figura 19: Deslocamentos registrados no espectro de RMN 1H para o BTZ-1...............................46

Figura 20: Espectro de RMN 1H para a 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona...................................47

Lista de Figuras

Juliana Luísa T. de Andrade x

Figura 21: Espectro de RMN 1H para a 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.........................48

Figura 22: Espectro de RMN 1H para a 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ..................... 49

Figura 23: Espectro de RMN1H para a 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ............51

Figura 24: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-

3-ona ...............................................................................................................................................53

Figura 25: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-amino-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona ............................................................................................................................54

Figura 26: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-nitro-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona............................................................................................................................ 55

Figura 27: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-amino-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona ........................................................................................................................... 56

Figura 28: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-benzoilamino-4-metil-

2H-1,4-benzotiazin-3-ona ................................................................................................................58

Figura 29: Aparato utilizado no teste do campo aberto - Open-Field test ..................................... 64

Figura 30: Determinação da DL50 para o composto BTZ-1............................................................ 70

Figura 31: Determinação da DL50 para o composto BTZ-1R ........................................................ 70

Figura 32: Determinação da DL50 para o composto BTZ-2............................................................ 70

Figura 33: Determinação da DL50 para o composto BTZ-2R ........................................................ 71

Figura 34: Determinação da DL50 para o composto BTZ-3 ........................................................... 71

Figura 35: Ensaio de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6% ........................ 77

Figura 36: Aparatos utilizados no Método da Placa Quente. ........................................................ 78

Figura 37: Roteiro do método da placa quente na avaliação da atividade antinociceptiva............ 79

Figura 38: Número total de contorções (em 30 minutos) induzidas pelo ácido acético 0,6% em

camundongos tratados com os fármacos padrões e os derivados sintetizados............................. 83

Figura 39: Resultado da determinação da CIM para o 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ............ 91

Figura 40: Resultado da determinação da CIM para o 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona;

(A)-Fluconazol e (B) - Terbinafina .................................................................................................. 91

Figura 41: Resultado da determinação da CIM para 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona;

(A)- Fluconazol e (B) – Terbinafina ................................................................................................ 91

Figura 42: Resultado da determinação da CIM para o 4-metil-6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona (A)-

Lista de Figuras

Juliana Luísa T. de Andrade xi

Fluconazol e (B) – Terbinafina ....................................................................................................... 92

Figura 43: Resultado da determinação da CIM para o 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-

3-ona; (A)- Fluconazol e (B) - Terbinafina....................................................................................... 92

Lista de Tabelas

Juliana Luísa T. de Andrade xii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Características físico-químicas da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona. ................ 28

Tabela 2: Características físico-químicas da 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona............... 29

Tabela 3: Características físico-químicas da 6-nitro-4-metil-2H-1,4benzotiazin-3-ona ...... 30

Tabela 4: Características físico-químicas da 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona .. 31

Tabela 5: Características físico-químicas da 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4 -

benzotiazin-3-ona. ............................................................................................................... 32

Tabela 6: Caracterização do composto 2-amino-4-nitrobenzenotiol pela espectrometria

no IV e RMN 1H, segundo Guarda (1998) ...........................................................................

35

Tabela 7: Propriedades físico-químicas dos derivado sintetizados..................................... 40

Tabela 8: Características de infravermelho para o BTZ-1 (ν cm-1, KBr 1%) ....................... 41

Tabela 9: Características de infravermelho para o BTZ-1R (ν cm-1, KBr 1%).................... 42

Tabela 10: Características de infravermelho para o BTZ-2 (ν cm-1, KBr 1%)...................... 43

Tabela 11: Característica de infravermelho para o BTZ-2R (ν cm-1, KBr 1%).................... 44

Tabela 12: Características de infravermelho para o BTZ-3 (ν cm-1, KBr 1%)...................... 45

Tabela 13: Deslocamentos químicos de H registrados para a 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-

3-ona ...................................................................................................................................

47

Tabela 14: Deslocamentos químicos de H registrados para a 6-amino-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona ................................................................................................................

48

Tabela 15: Deslocamentos químicos de H registrados para a 6-nitro-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona ................................................................................................................

49

Tabela 16: Deslocamentos químicos de H registrados para o composto 6-amino-4-metil-

2H-1,4-benzotiazin-3-ona ....................................................................................................

50

Tabela 17: Deslocamentos químicos de H registrados para o composto 6-benzoilamino-

4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ........................................................................................

51

Tabela 18: Características de RMN 13C da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ................. 53

Tabela 19: Características de RMN13C para a 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.......... 54

Tabela 20: Deslocamentos químicos de Carbono - 13 registrados para o composto 6 -

Lista de Tabelas

Juliana Luísa T. de Andrade xiii

nitro - 4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ............................................................................. 55

Tabela 21: Deslocamentos químicos de Carbono - 13 registrados para o composto 6-

amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona..............................................................................

57

Tabela 22: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para o composto 6-

benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona .................................................................

59

Tabela 23: Número de animais mortos após a administração dos diferentes compostos

sintetizados (nº de mortos / nº de animais testados) .......................................................... 68

Tabela 24: Determinação dos valores da DL50 para os derivados benzotiazínicos

testados ...............................................................................................................................

69

Tabela 25: Sinais qualitativos indicativos de toxicidade, observados em um período de 6

horas após administração por via i.p. dos derivados benzotiazínicos sintetizados.............

72

Tabela 26: Efeitos dos derivados benzotiazínicos sobre a motilidade dos camundongos,

analisada pelo número de quadrados percorridos em 01 min no ensaio do campo aberto

76

Tabela 27: Representação percentual da redução da motilidade dos animais, avaliadas

pelo número de quadrados invadidos no campo-aberto .....................................................

77

Tabela 28: Número total de contorções em 30 minutos induzidas pelo ácido acético

0,6% em camundongos. ......................................................................................................

83

Tabela 29: Efeito dos derivados benzotiazínicos no tempo de latência sobre uma placa

aquecida a 50ºC. .................................................................................................................

84

Tabela 30: Registros da ATCC para os fungos leveduriformes utilizados neste estudo .... 85

Tabela 31: Concentração inibitória mínima (µg/ml) para os derivados da 6-nitro-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona....................................................................................................

90

Sumário

Juliana Luísa T. de Andrade xiv

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS.................................................................................................................................. V

RESUMO .................................................................................................................................................... VII

ABSTRACT ...............................................................................................................................................VIII

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................................. IX

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................... XII

SUMÁRIO.................................................................................................................................................. XIV

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 1

2. OBJETIVOS........................................................................................................................................ 4

2.1. OBJETIVO GERAL: ..................................................................................................................... 4

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:........................................................................................................ 4

3. REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................................................... 5

3.1. SÍNTESE E REATIVIDADE DOS DERIVADOS BENZOTIAZÍNICOS.............................. 5

3.1.1. Síntese a partir do 2-aminotiofenol ............................................................................................................ 6 i. Reação com 1,2-dihaloetano....................................................................................................................... 7 ii. Reação com ácidos e ésteres α-halogenados.............................................................................................. 7 iii. Reação com ácidos e ésteres α,β-insaturados............................................................................................. 8

3.1.2. Síntese a partir do ácido 2-nitro- ou 2-amino-feniltioglicólico ................................................................. 8 i. A partir do 2-nitrotiofenol .......................................................................................................................... 8 ii. A partir da 2-cloroanilina............................................................................................................................ 9 iii. A partir do 2,4-dinitroclorobenzeno........................................................................................................... 9

3.1.3. Por extensão do ciclo ................................................................................................................................ 10 3.1.4. Síntese a partir de dissulfetos de bis(o-nitrofenil).................................................................................... 10

3.2. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE.......................................................................................... 11

3.3. ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DOS DERIVADOS BENZOTIAZÍNICOS............. 13

3.4. ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA ...................................................................................... 17

3.5. AS CÉLULAS FÚNGICAS..................................................................................................... 18

3.6. OS FÁRMACOS ANTIFÚNGICOS ....................................................................................... 21

3.7. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA............................. 22

Sumário

Juliana Luísa T. de Andrade xv

4. SÍNTESE DOS DERIVADOS DA 6-NITRO-2H-1,4- BENZOTIAZIN-3-ONA....................... 25

4.1. METODOLOGIA .................................................................................................................... 25

4.1.1. MATERIAIS .......................................................................................................................................... 25 4.1.1.1 Equipamentos .................................................................................................................................. 25 4.1.1.2 Solventes e Reativos........................................................................................................................ 26

4.1.2. MÉTODOS ..............................................................................................................................................27 4.1.2.1 Síntese do composto 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ................................................................ 27 i. Síntese do 2-amino-4-nitrofenolato de sódio ........................................................................................... 27 ii. Síntese da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona........................................................................................... 28 4.1.2.2 Redução do grupo nitro: síntese da 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ....................................... 29 4.1.2.3 N-metilação: síntese da 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona............................................... 30 4.1.2.4 Redução do grupo nitro: síntese da 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona .......................... 31 4.1.2.5 Benzoilação da amina: síntese do 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona. ............... 32

4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 33

4.2.1. Via Sintética ............................................................................................................................................33 4.2.2. Obtenção do composto de partida: 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.................................................... 34 4.2.3. A metilação do nitrogênio da posição 4 ................................................................................................... 36 4.2.4. A redução do grupo nitro.......................................................................................................................... 36 4.2.5. Acilação da amina primária. ..................................................................................................................... 37

4.3. ESTRUTURAS E PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS................................................... 38

4.4. CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE IV..................................................... 41

4.4.1. 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ............................................................................................................ 41 4.4.2. 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona .......................................................................................................... 42 4.4.3. 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ............................................................................................... 43 4.4.4. 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona............................................................................................. 44 4.4.5. 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona ................................................................................. 45

4.5. CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE RMN 1H. ......................................... 46


4.6. CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE RMN 13 C......................................... 52


4.7. CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS......................................... 60

5. AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS IN VIVO ....................................... 65

5.1. METODOLOGIA GERAL...................................................................................................... 65

Sumário

Juliana Luísa T. de Andrade xvi

5.1.1. Animais ......... ........................................................................................................................................... 65 5.1.2. Preparação e administração das soluções................................................................................................. 65

5.2. TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE LOCOMOTORA ESPONTÂNEA ...................... 65

5.2.1. METODOLOGIA..................................................................................................................................... 65 5.2.1.1 Determinação da DL50..................................................................................................................... 65 5.2.1.2 Identificação de estereotipias e sinais de toxicidade ...................................................................... 66 5.2.1.3 Método do Campo-Aberto - Open-Field......................................................................................... 66 5.2.1.4 Análise Estatística ........................................................................................................................... 67

5.2.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................................. 67 5.2.2.1 Toxicidade Aguda ........................................................................................................................... 67 5.2.2.2 Atividade Locomotora Espontânea................................................................................................. 76

5.3. ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA ...................................................................................... 80

5.3.1. METODOLOGIA..................................................................................................................................... 80 5.3.1.1 Método das Contorções induzidas pelo Ácido Acético - Writhing Test ........................................ 80 5.3.1.2 Método da Placa Quente - Hot Plate Test....................................................................................... 81 5.3.1.3 Análise Estatística ........................................................................................................................... 82

5.3.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................................. 82

6. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO .................................................... 88

6.1. METODOLOGIA .................................................................................................................... 88

6.1.1. Materiais ..................................................................................................................................................88 6.1.2. Métodos............ ........................................................................................................................................ 88

6.1.2.1 Preparo da cultura de fungos........................................................................................................... 88 6.1.2.2 Preparo do meio RPMI 1640 ......................................................................................................... 89 6.1.2.3 Padrões antifúngicos ....................................................................................................................... 89 6.1.2.4 Soluções dos derivados benzotiazínicos ......................................................................................... 89 6.1.2.5 Padronização dos inóculos. ............................................................................................................. 90 6.1.2.6 Determinação da concentração inibitória mínima. ......................................................................... 90 6.1.2.7 Leitura dos resultados...................................................................................................................... 90

6.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 91

7. CONCLUSÕES ................................................................................................................................. 96

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 98

Introdução

Juliana Luísa T. de Andrade 1

1. INTRODUÇÃO

A modificação molecular de um protótipo de fármaco pela introdução ou

substituição de grupos e adição de moléculas a partir de uma estrutura primária,

ainda constitui o meio principal na obtenção por novos princípios ativos. Estas

variações estruturais conferem às moléculas novas propriedades físico-químicas

e farmacocinéticas, tornando-as capazes de induzir respostas farmacológicas

almejadas, com biodisponibilidade adequada ao seu emprego terapêutico

(BARREIRO et. al., 2001; RATTI e TRIST, 2001;).

A síntese de fármacos é importante principalmente por permitir a

construção de novas moléculas, em seus diversos níveis de complexidade. Sua

aplicação na obtenção por novos protótipos representa uma grande parcela dos

medicamentos disponíveis para uso clínico e movimenta elevadas cifras no

mercado mundial (BARREIRO, 2002). Até 1991, entre os 866 fármacos usados na

terapêutica, 680 (79%) eram de origem sintética. Os 186 restantes (21%)

correspondiam àqueles de origem natural ou semi-sintética (VILELA et. al., 2007).

Observando a estrutura dos fármacos empregados na terapêutica,

constata-se que 62% deles são heterocíclicos e nitrogenados. Adicionalmente,

cerca de 30% dos fármacos de estrutura heterocíclica apresentam átomos de

enxofre e 18% apresentam átomos de oxigênio (VILELA et. al., 2007). Estes

valores ilustram a importância da química dos heterociclos, em que se incluem os

compostos derivados da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, que têm sido foco de

muitos estudos devido à grande variedade de atividades farmacológicas relatadas

(GUPTA e OJHA, 1988).

Em estudos mais recentes, estes derivados se destacam pela significativa

atividade antifúngica (SCHIAFFELLA et. al., 2006; FRINGUELLI et. al., 2002;

Introdução


FRINGUELLI et. al., 1998) , antiproliferativa (URAKAWA et. al., (a) 2000 e (b)

2002) e imunoestimulante (PITZURRA et. al., 1999; DEL CORONA et. al., 1992),

eficiente atividade tranqüilizante (LAUBACH, 1962), importante atividade

antitumoral (BRZOZOWSKI et. al., 2006; GUPTA et. al., 1993) atribuída à

atividade citotóxica contra células neoplásicas (MARCHETTI et. al., 2002; INOUE

et. al., 1998), eficácia anti-HIV (BRZOZOWSKI et. al., 2003), potente inibição da

aldose-redutase - atividade hipoglicemiante (AOTSUKA et. al., 1994; TAWADA

et. al., 1990), efeitos anti-reumáticos, atividade antialérgica (TAKIZAWA et. al.,

2001), atividade vasorelaxante (TULLIO et. al., 2005; CECCHETTI et. al., 2003),

efeitos antiarrítmicos (YOSHIKAWA et. al., 2003; HARA e NAKAYA, 1995) e

antihipertensivos (CECCHETTI et. al., 2000). Uma potente atividade inibidora da

15-lipoxigenase também foi relatada, sendo atribuída a importância no uso para o

tratamento de Doenças Pulmonares Obstrutivas Crônicas (BAKAVOLI et. al.,

2007; SCHEWE, 2002). Estes derivados também induzem a efeitos neurotóxicos

ou neuroprotetores (MARCHETTI et. al., 2002; SHEN e DRYHURST, 1996) e um

possível efeito em doenças neurodegenerativas como Parkinson e Alzheimer está

sendo investigado (OKUYAMA et. al., 2000; LI e DRYHURST, 1997; KOBAYASHI

et. al., 1997).

A molécula do composto de partida deste trabalho, a 6-nitro-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona apresenta vários sítios ativos:

Introdução


N

S

H

OO2N

1

2

3

45

6

7

89

10

• Na posição 1, um átomo de enxofre;

• Na posição 2, um grupo metileno ativado pela presença da carbonila em C-3;

• Na posição 3, um grupo C = O que pode ser reduzido;

• Na posição 4, um grupo NH que pode ser alquilado;

• Na posição 6, um grupo nitro que pode ser reduzido a uma amina primária.

Esta pode então ser substituída por grupos alquilas, lineares ou cíclicos.

O presente trabalho teve como objetivo a síntese de cinco derivados

benzotiazínicos obtidos a partir de modificações estruturais no composto de

partida, 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, explorando as posições N-4 e C-6, a

saber: introdução do grupo metila em N-4; redução do grupo nitro a amino

seguida da benzoilação no C-6. Todos os compostos sintetizados tiveram suas

estruturas demonstradas através dos métodos espectroscópicos de

infravermelho, RMN1H e RMN13C. Após caracterização estrutural, estes

compostos foram submetidos aos ensaios de determinação de toxicidade aguda e

atividade antinociceptiva pelos métodos da placa quente e das contorções

abdominais induzidas pelo ácido acético. A atividade antifúngica in vitro também

foi avaliada.

Objetivos


2. OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL:

Sintetizar e caracterizar os derivados da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-

ona e avaliar suas atividades farmacológicas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1. Sintetizar os compostos 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona e seus

derivados 4-metil-6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, 6-amino-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona e 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona e 6-

benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

2. Caracterizar as propriedades físico-químicas e demonstrar as suas

estruturas pelos métodos espectroscópicos de infravermelho,

massas e ressonância magnética nuclear de H e do carbono 13.

3. Avaliar a toxicidade geral dos compostos sintetizados pela

determinação da Dose Letal Mediana (DL50) e atividade locomotora

espontânea.

4. Realizar estudos farmacológicos para a avaliação dos efeitos

antinociceptivos.

5. Avaliar os efeitos antifúngicos in vitro dos derivados sintetizados

sobre cepas de diferentes espécies de Candida ssp.

Revisão da Literatura


3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1. SÍNTESE E REATIVIDADE DOS DERIVADOS BENZOTIAZÍNICOS

Dentre os compostos heterocíclicos, os benzotiazínicos apresentam um

amplo espectro de atividade biológica. O núcleo benzotiazínico (Fig.1a) está

presente em diversas moléculas biologicamente ativas, como no antipsicótico

Protipendil (Fig. 2), comercializado principalmente na Alemanha (Dominal®) e no

Reino Unido (Largophren®, Timoval®, Timovan® e Tolnate®).

As 1,4-benzotiazinas exibem um tipo de tautomerismo, pois existem nas

formas isoméricas 2H e 4H, sendo o isômero 2H a forma predominante (Fig. 1b).

Segundo Gupta e Ojha (1988), estes isômeros nunca foram isolados, mas

observados como espécies transientes em solução, determinados por estudos de

RMN 1H. A nomenclatura e o sistema de numeração para a 2H-1,4-benzotiazina

e 4H-1,4-benzotiazina foram adotadas na edição de 1984 do Ring System

Handbook (CHEMICAL ABSTRACTS PUBLICATION).

N

S1

2

3

45

6

7

8

N

S1

2

3

45

6

7

8

H1 a 1 b

Figura 1: Núcleo benzotiazínico e suas formas isoméricas 2H (1a) e 4H (1b).



N

SN

N

Figura 2: Estrutura molecular do antipsicótico Protipendil (Tiofenilpiridilamina)

A 1,4 Benzotiazina (3a) é um análogo da fenotiazina (3b), resultante da

troca do grupo o-fenileno por um grupo etilidênico (-CH =CH-) e possui algumas

propriedades similares devido a características estruturais comuns.

N

S

H

N

S

H3a 3b

Figura 3: Similaridade estrutural entre 1,4-benzotiazinas (3a) e fenotiazinas (3b) observadas ao longo do eixo nitrogênio-enxofre.

Vários métodos de obtenção das 2H-1,4-benzotiazinas e de seus derivados

são descritos na literatura, sendo eles:

3.1.1. Síntese a partir do 2-aminotiofenol

As reações sintetizadas a partir do 2-aminotiofenol conduzem aos

compostos 1,4-benzotiazínicos em apenas uma etapa.



i. Reação com 1,2-dihaloetano

SH

NH2 N

S

H

R X - CH2 - CH2 - X+ R

X = Cl, BrR = H, substituintes

A condensação do 2-aminotiofenol com 1,2-dihaloetano em meio

metanólico e em presença de metóxido de sódio conduz à formação da 2,3-diidro-

1,4-benzotiazina (FLORIO et. al., 1982). WATANABE (1990) utilizou esse método

em presença de iodetos e carbonatos de metais alcalinos obtendo o mesmo

resultado.

ii. Reação com ácidos e ésteres α-halogenados

SH

NH2 N

S

H

+

a) X = Br, R = Phb) X = Cl, R = H

R

O

X R

COOH N

S

H

RLiAlH4

A condensação do 2-aminotiofenol com ácido α-bromofenilacético em

meio etanólico origina a 1,4-benzotiazin-3-ona substituída na posição 2 (FUNKE

et. al., 1961). O composto pode ser reduzido com hidreto de lítio e alumínio

conduzindo às 1,4-benzotiazinas correspondentes. Krapcho e Turk (1973)

realizaram esta reação em presença de ácido monocloroacético, obtendo 75% de

rendimento para o composto 1,4-benzotiazin-3-ona.



iii. Reação com ácidos e ésteres α,β-insaturados

SH

NH2

+N

S

H

CH2COORCH - COOR

CH - COOR O

A reação do 2-aminotiofenol com ácidos e ésteres α,β-insaturados leva à

formação das 1,4-benzotiazin-3-ona, substituídas na posição 2 (KIRCHNER e

ALEXANDER, 1959; BOURDAIS, 1967).

3.1.2. Síntese a partir do ácido 2-nitro- ou 2-amino-feniltioglicólico

i. A partir do 2-nitrotiofenol

SH

NH2 NH2

SCH2COOR

+

N

S

H

O

Cl - CH2 - COOR

R = H, C2H5

Redução

A condensação do 2-nitrotiofenol com ácidos ou ésteres α-halogenados

leva à formação do ácido 2-nitrofeniltioglicólico (FRIEDLAENDER e CHWALA,

1907). A redução desse ácido com zinco em ácido acético ou estanho em ácido

clorídrico leva ao aminoácido correspondente que perde facilmente uma molécula

de água e cicliza-se em 2H-1,4-benzotiazin-3-ona (CLAASZ, 1912; MACKIE e

RAEBURN, 1952).



ii. A partir da 2-cloroanilina

Cl

NH2 NH2

SCH2COOH

+

N

S

H

O

HS - CH2 - COOH Sn + HCl

A ação do ácido tioglicólico sobre a 2-cloroanilina, em metanol sob refluxo

e em presença de base, conduz ao ácido 2-aminofeniltioglicólico (IMPERIAL

CHEMICAL INDUSTRIES LTDA., 1935). Esse ácido, quando tratado com ácido

clorídrico concentrado, se desidrata conduzindo a 2H-1,4-benzotiazin-3-ona

(MACKIE e RAEBURN, 1952).

iii. A partir do 2,4-dinitroclorobenzeno

Cl

NO2 NO2

SCH2COOH+

N

S

H

OHS - CH2 - COOH SnCl2 + HCl

O2N O2N H2N

O ácido tioglicólico em solução com etanol e água, juntamente com o 2,4-

dinitroclorobenzeno, são colocados sob refluxo por 6 horas em presença de

bicarbonato de sódio (CECCHETTI et. al., 1989). A ação do cloreto de estanho

em meio contendo ácido clorídrico concentrado conduz ao ácido 2,4-

dinitrofeniltioglicólico, originando a 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona (OKUJIMA

et. al., 1990).



3.1.3. Por extensão do ciclo

S

N NH2

SH

N

S

H

OO2N O2NNH2 - NH2, H2O ClCH2COOH

O2N CH

Diversos autores sintetizaram as benzotiazinas pela extensão do ciclo a

partir de benzotiazóis substituídos. Pela ação da base, hidrato de hidrazina, o anel

tiazólico se abre e forma o 2-aminotiofenol que, em presença do ácido

monocloroacético, forma facilmente um anel tiazínico (MARTANI et. al., 1968).

3.1.4. Síntese a partir de dissulfetos de bis(o-nitrofenil)

N

Y

O

R2

R1

H

R1 NO2

Y

SmI2/THF

R1 N(SmI2)2

YSmI2

R2CH(X)Z

R1 = H, Cl; Y = S, Se; R2 = H, alquil, aril; Z = CO2H, COMe, CO2Et, CN

Dissulfetos e disselenetos de bis(o-nitrofenil) se reduzem facilmente com o

iodeto de samário(II), produzindo intermediários ativos, que reagem com

derivados α-halocarboxílicos e originam os compostos 2H-1,4-benzotiazin-3(4H)-

ona e 2H-1,4-benzoselenazin-3(4H)-ona, respectivamente. Os rendimentos

obtidos por esta reação são de moderados a altos. O iodeto de samário (SmI2) é

um excelente reagente para promover reações de ciclização (ZHONG e ZHANG,

2001).



3.2. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE

A avaliação das possíveis propriedades tóxicas de quaisquer substâncias

as quais o homem está exposto é de suma importância. No caso de substâncias

de origem sintética, esta avaliação torna-se ainda mais necessária, pois o termo

sintético normalmente é associado à efeitos adversos (PURCHASE et al, 1998;

BLAAUBOER, 2003; COECKE et al, 2005; PRIETO et al, 2006).

O controle sobre a qualidade, segurança e eficácia dos medicamentos

aumentou nas últimas décadas, impulsionado por trágicos episódios ocorridos no

último século decorrentes dos efeitos indesejáveis atribuídos ao uso dos

medicamentos. Episódios como o de 1937, que levou à morte dezenas de

pessoas que utilizaram o Elixir de Sulfanilamida nos EUA, e o nascimento de

crianças com focomelia no final da década de 50, pelo uso da Talidomida durante

a gravidez, chamaram a atenção das autoridades regulatórias para a necessidade

de se avaliar a segurança e a eficácia dos medicamentos liberados para o

consumo humano (GOLDIM, 2007; GAVA, 2005; LIMA et. al., 2001)

O processo de registro de medicamentos é uma das ações de vigilância

sanitária cuja responsabilidade compete aos órgãos de Estado e, no Brasil, esta

atividade compete à ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL,

1999). O registro de medicamentos novos na ANVISA é atualmente

regulamentado pela Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) da ANVISA nº 136,

de 29 de maio de 2003. No Regulamento Técnico estabelecido por meio desta

RDC, definido como “Regulamento Técnico para Medicamentos Novos ou

Inovadores com Princípios Ativos Sintéticos ou Semi-Sintéticos”, são

apresentadas as exigências relacionadas à segurança dos compostos, como

estudos de toxicidade aguda.



A Lei de Alimentos, Medicamentos e Cosméticos dos Estados Unidos,

aprovada em 1938, norteia as atividades de regulação da FDA - Food and Drug

Administration (FDA, 1938), tendo sido aprovadas algumas emendas importantes

a esta lei como a Emenda Kafauver-Harris, em 1962. Dentre as exigências

estabelecidas pela referida Lei está a garantia de segurança dos medicamentos

antes da comercialização. Os padrões de referência para a realização de ensaios

clínicos foram estabelecidos pela FDA em 1970, sendo definidas exigências

metodológicas como a necessidade de grupo controle e elaboração do protocolo

de pesquisa permitindo proceder à análise quantitativa usando métodos

estatísticos adequados (OLIVEIRA, 2001). A intervenção que se deseja avaliar é

realizada em apenas um dos grupos (experimental) – o outro grupo (controle) é

usado como padrão para a comparação dos resultados.

Segundo as legislações vigentes, um dos primeiros testes realizados para

a avaliação do potencial tóxico de qualquer substância é o teste de toxicidade

aguda. Através deste, a dose letal mediana (DL50) e outros efeitos tóxicos podem

ser avaliados por diferentes vias em uma ou mais espécies, sendo os ratos e os

camundongos usados com maior freqüência. (KRYSIAK e RYDZYNSKI, 1997;

GUBBELS-VAN HAL et. al., 2005; STAMMATI et. al., 2005).

A avaliação da DL50 foi introduzida por TREVAN em 1927, para avaliação

de substâncias que seriam utilizadas em seres humanos - como a digitallis e a

insulina (VALADARES, 2006). A DL50 é um parâmetro importante na toxicologia e

é definida como a quantidade de uma substância química que, quando

administrada em uma única dose, produz a morte de 50% dos animais no período

de observação (PIMENTEL et al, 2006).



3.3. ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DOS DERIVADOS BENZOTIAZÍNICOS

Durante os últimos 25 anos observou-se um aumento progressivo de

doenças invasivas e infecções sistêmicas causadas por fungos, sendo estas uma

causa importante de letalidades, principalmente em pacientes imunodeprimidos

(IMWIDTHAYA e POUNGVARIN, 2000; STEENBERGEN e CASADEVALL, 2000).

Fatores iatrogênicos têm sido responsabilizados por este aumento na incidência

de casos, tais como os tratamentos com fármacos imunossupressores em

transplantados e doentes com câncer, a nutrição parental, o aumento do número

de indivíduos com AIDS e o uso indiscriminado de antibióticos (ALVARADO et.

al., 2002). A terapia atual utilizada contra essas infecções é afetada pela

toxicidade relacionada aos medicamentos, interações medicamentosas,

farmacocinética comprometida e ao desenvolvimento de resistências

(MAERTENS e BOOGAERTS, 2000).

Estudos sobre relação estrutura-atividade para fármacos, realizados por

Schiaffella e colaboradores (1999), demonstram que os derivados mais ativos

para o tratamento de infecções causadas por fungos são aqueles que apresentam

no núcleo benzotiazínico um grupo metila em N-4, uma cadeia lateral em C-6, C-7

ou C-8, e um grupo carbonila, enxofre como tioéter ou sulfóxido no C-3. A

presença do substituinte azólico 1H-imidazol-1-il na cadeia lateral também

influencia positivamente na atividade antifúngica (FRINGUELLI et. al., 2005).

Compostos benzotiazínicos também demonstraram atividade contra a

artrite reumatóide, uma doença crônica e progressiva associada com inflamação

sistêmica. Essa doença afeta diretamente a função física e mobilidade, resultando

em um elevado índice de morbidade a curto e longo prazo. O fármaco de escolha



para o tratamento é o metotrexato (GUBNER et. al., 1951), porém, este se

acumula no interior das células como poliglutamato, ocasionando uma diminuição

dos níveis de folatos, fator crucial para a ocorrência dos efeitos adversos. Para

reduzir estes efeitos, Matsuoka e cols (1997), sintetizaram um novo derivado: N-

{[4-[(2,4-diaminopteridin-6-il)metil]-3,4-dihidro-2H-1,4-benzotiazin-7-il]-Carbonil}-L-

ácido homoglutâmico (MX-68). Este derivado foi criado focalizando a atividade

antireumática, portanto, foi projetado para resistir à ação da folilpoliglutamato

sintetase. A troca do resíduo glutamato do metotrexato por um homoglutamato e

substituição do ácido aminobenzóico por um anel 1,4-benzotiazínico levou o

composto a ser ativo (FRINGUELLI et. al., 2005).

A histamina é conhecida por mediar respostas alérgicas e inflamatórias

através dos receptores histamínicos e desempenhar um importante papel na

asma e dermatite atópicas e rinite alérgica. Conseqüentemente, muitos

antagonistas dos receptores histamínicos foram desenvolvidos, no entanto, a

ação inibitória desses compostos sobre os receptores da muscarina, serotonina e

até mesmo dos diferentes tipos de receptores da histamina, são propensos a

causar efeitos adversos no sistema nervoso central (SNC). O derivado 7-{3-[4-(2-

Quinolinilmetil)-1-piperazinil ] propoxi } - 2,3- dihidro - 4H -1,4-benzotiazin-3-ona

foi sintetizado (TIMMERMAN et. al., 1999) e mostrou ser um potente e seletivo

antagonista do receptor histamínico, sem atividades anti-serotoninas ou

anticolinérgicas. Após a administração sistêmica em cobaias, o derivado resultou

em efeitos anti-histaminérgicos, sugerindo ser útil no tratamento de doenças

alérgicas como dermatite atópica e eczema. Os efeitos observados nas alterações

histopatológicas resultaram em inibição da reação asmática, como hiperplasia do

epitélio das vias aéreas, edema e infiltração perivascular por eosinófilos,



confirmando a utilidade em tratamento de pacientes asmáticos (FRINGUELLI et.

al., 2005).

Tawada e cols (1990) sintetizaram derivados tiolactâmicos das 1,4-

benzotiazinas, possuindo grupos benzílicos em C-2. Esses compostos

demonstraram potente atividade inibidora da enzima aldose redutase in vitro,

porém não apresentaram atividades in vivo no princípio, sendo posteriormente

notadas em compostos com substituintes ramificados em C-2 - como o grupo

isopropílico (FRINGUELLI et. al., 2005). Em hiperglicemia, a enzima aldose

redutase catalisa a conversão do excesso de glicose em sorbitol. O acúmulo

intracelular de sorbitol causa o desenvolvimento de complicações do diabetes,

tais como neuropatia, retinopatia, nefropatia e catarata (KADOR et. al.,1985).

Cecchetti e cols (1987) propuseram a troca da cadeia lateral na molécula

de oxipropanolamina por um derivado da 1,4-benzotiazina para a obtenção de

uma molécula que apresente propriedades β-bloqueadoras e diuréticas

(GIFFORD e BORAZANIAN, 1989). Fringuelli e colaboradores (2005) introduziram

a cadeia lateral 2-(4-cloro-3-sulfamoilbenzamido)-etil na molécula de

oxipropanolamina modificada, mantendo a atividade β-bloqueadora (grupo 2-

amidoetil) e acrescentando a atividade diurética pela molécula de o-

clorobenzenosulfonamida. Estas modificações resultaram em uma eficácia no

tratamento da hipertensão, que necessita de fármacos β-bloqueadores e

diuréticos para um tratamento satisfatório.

Um estudo com o núcleo 1,4-benzotiazínico foi realizado por Cecchetti e

cols em 2003. Eles adicionaram um grupo retirador de elétrons na posição C-6 e

um anel lactâmico, amidas acíclicas, ciclopentenona, cadeias acilas - todos

ligados a uma função oxo - em diferentes distâncias do núcleo 1,4-benzotiazínico,



como substituintes na posição N-4. Todos os compostos foram testados com o

objetivo de avaliar a atividade vasodilatadora in vitro, comparando-se à

levocromacalina, um enantiômero biologicamente ativo da cromacalina. A

principal observação feita nesses estudos é que os compostos mais potentes são

aqueles que possuem núcleo 1,4-benzotiazínico (FRINGUELLI et. al., 2005).

Com o objetivo de reduzir os efeitos adversos cardíacos, tais como falência

cardíaca, bradicardia e assistolia, Fujita e cols (1990) mudaram o núcleo

benzodiazepínico por um núcleo benzotiazínico nos medicamentos existentes no

mercado utilizados para o tratamento de doenças como angina, hipertensão,

doença cardíaca isquêmica e algumas arritmias (GIBSON et. al.,1986). Os

compostos testados apresentaram potente atividade antagonista de canais de

cálcio in vitro. Os íons cálcio são importantes componentes celulares, envolvidos

na regulação de diversas funções das células e os níveis citosólicos de cálcio são

controlados por diversos mecanismos. Em particular, os canais de cálcio

voltagem-dependentes são importantes para regular o influxo de cálcio, fazendo

com que os bloqueadores dos canais de cálcio sejam utilizados no tratamento

para as doenças acima citadas.

Além das atividades mencionadas, os compostos derivados das

1,4-benzotiazinas apresentam atividade antitumoral in vivo, atribuída à sua

atividade citotóxica direta contra as células neoplásicas. Inoue e cols (1998)

demonstraram que a diidro-1,4-benzotiazina-6,7-diona é o último metabólito tóxico

produzido pela oxidação do 4-S-cisteaminoilfenol pela tirosinase. Em 2003,

Fringuelli e cols analisaram o mecanismo de ação dos derivados 1,4-

benzotiazínicos e observaram que esses compostos induzem a apoptose dos

timócitos através de um complexo sistema de transdução de sinal.



3.4. ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA

Uma vez associada a diferentes condições patológicas, a dor representa o

sintoma que mais causa sofrimentos aos pacientes, sendo também a principal

razão pela procura do auxílio médico.

Pela dificuldade de um conceito definido e pelas muitas variações da dor, a

IASP (International Association to Study of Pain) propôs o conceito sendo “uma

experiência sensorial e emocional desagradável, relacionada com lesão tecidual

real ou potencial, ou descrita em termos deste tipo de dano” (GAZDA, 2004;

MERSKEY et al, 1979).

A dor, portanto, é composta por componentes dinamicamente articulados

que, pela conceituação oficial, foram reconhecidos e devem sempre obedecer ao

processo do movimento multifatorial e multidimensional, não devendo se acentuar

a um único fator ou dimensão (PAUMGARTTEN, 2002).

Loeser e Black (1975) operacionalizaram a definição de dor em

componentes: nocicepção, dor propriamente dita, sofrimento e comportamento

doloroso. Segundo os autores, “nocicepção refere-se ao mecanismo pelo qual o

dano tecidual, mecânico, térmico ou químico, excitando um nervo, inicia o

processo que conduz a informação nociceptiva ao sistema nervoso central. Dor é

a percepção do sinal no sistema nervoso”.

Diferentes abordagens terapêuticas têm sido usadas objetivando abrandar

a dor, sendo a farmacoterapia uma das mais comuns. Entre as diferentes classes

farmacológicas ou grupos terapêuticos usados no alívio da dor estão os

antiinflamatórios não-esteróides (AINEs), os analgésicos opióides, os agonistas

α2-adrenérgicos, os antiepiléticos, os antidepressivos e, mais recentemente, as

vitaminas do complexo B (BERTOLLO, 2006).



O cérebro modula a dor mediante vias eferentes inibitórias, de modo que a

sensação dolorosa é a resultante dos processos antagônicos. Toda a atividade

relaciona-se à presença de neurotransmissores e neuromoduladores, tanto nas

vias aferentes (substância P, GABA, colecistocinina, somatostatina, encefalinas)

quanto nas eferentes (acetilcolina, dopamina e encefalinas). Para dores leves e

moderadas de natureza tegumentar e localização diversificada, associadas ou

não a processo inflamatório periférico, são preferencialmente indicados os

analgésicos não-opióides e, para as intensas, os opióides (WANNMACHER e

FERREIRA, 1992).

3.5. AS CÉLULAS FÚNGICAS

Apenas uma minoria entre as 100.000 espécies de fungos existentes é

patogênica ao homem. Um fungo é um eucariota definido pela ausência de

organização tecidual e de clorofila. A célula fúngica é limitada por uma parede

rígida de natureza celulósica ou quitinosa. As formas celulares esferoidais ou

ovais são típicas dos fungos leveduriformes (leveduras) e possuem o diâmetro de

5 a 25 µm. As células tubulares ou filamentosas são características das hifas, que

constituem os fungos filamentosos (bolores), podendo possuir o comprimento de

5 a 50 µm por um diâmetro de 2 a 5 µm. (MANUAL PRÁTICO DE

MICROBIOLOGIA, 2006).

Candidíase (ou Candidose) é uma infecção primária ou secundária que

envolve as espécies do gênero Candida, sendo consideradas patogênicas para o

homem as seguintes espécies Candida albicans, C. tropicalis, C. krusei e C.

Parapsilosis, dentre outras (CROCCO et al., 2004). As manifestações clínicas da



doença são as mais variadas, podendo ser subaguda, aguda ou crônica. O

envolvimento pode ser localizado na boca, garganta, couro cabeludo, vagina,

dedos, unhas, brônquios, pulmões, trato gastrointestinal ou generalizado, como

na septicemia, endocardite e meningite (TEIXEIRA e MEZZARI, 2005).

Figura 4: Morfologia de algumas das espécies de Candida: a) Candida albicans; t) Candida tropicalis; k) Candida krusei e p) Candida parapsilosis.

Candida albicans é o patógeno mais comum nas candidíases cutâneas e

da orofaringe, porém as espécies não-albicans têm aumentado em número e em

importância nas candidíases vaginal e sistêmica (REX et al, 2000). A variabilidade

comportamental das diferentes espécies de Candida criou a necessidade de

desenvolvimento de métodos rápidos e fáceis para sua identificação, assim como

no desenvolvimento de novos agentes antifúngicos. Muitas das espécies não

albicans mais comumente isoladas são menos susceptíveis aos derivados

azólicos, dificultando o tratamento dessas infecções.

a t k p



Figura 5: Morfologia da Candida albicans: A) Representação esquemática; B e C) Aspecto microscópicos, visualizando os clamidosporos e as pseudohifas.

Figura 6: Morfologia da Candida krusei: A) Representação esquemática; B e C) Aspecto microscópicos, visualizando os clamidosporos e as pseudohifas.

Figura 7: Morfologia da Candida parapsilosis: A) Representação esquemática; B e C) Aspecto microscópicos, visualizando os clamidosporos e as pseudohifas.

Figura 8: Morfologia da Candida tropicalis: A) Representação esquemática; B e C) Aspecto microscópicos, visualizando os clamidosporos e as pseudohifas.

BA C

BA C

BA C

BA C

D



3.6. OS FÁRMACOS ANTIFÚNGICOS

Os fármacos antifúngicos disponíveis ainda são em número limitado, sendo

que as principais famílias de antifúngicos compreendem os poliênicos, azólicos,

tiocarbamatos, alilaminas, derivados morfolínicos, 5-fluorcitosina e griseofulvina.

Os agentes antifúngicos, na sua maioria, produzem efeitos tóxicos devido aos

fungos compartilharem o caráter eucariota com a célula do hospedeiro humano,

com conseqüentes similaridades bioquímicas e fisiológicas que limitam ação

terapêutica (CATALÁN e MONTEJO, 2006; ODDS, 2003). Os iodetos foram as

primeiras substâncias utilizadas na terapia antifúngica, tanto nos homens quanto

nos animais, especialmente no tratamento da esporotricose, representando uma

alternativa eficaz e de baixo custo. Porém, os preparados contendo iodo tiveram

seu uso limitado devido aos freqüentes efeitos tóxicos, especialmente na espécie

felina (COSKUN et al., 2004).

O fluconazol, antifúngico do grupo dos triazóis, surgiu como uma

alternativa terapêutica eficaz, com reduzidos efeitos colaterais em relação aos

outros antifúngicos (PIERAD et al., 2000). As vantagens relacionadas ao fármaco

levaram ao intenso uso para o tratamento da aspergilose, histoplasmose e

blastomicose, ampliando, posteriormente, o seu espectro de ação frente a

diversas espécies de fungos patogênicos (SCHUBACH et al., 2004; ROCHETTE

et al., 2003). Atualmente o fluconazol é bastante utilizado, porém, devido ao uso

indiscriminado, freqüentes relatos de fungos resistentes têm sido observados,

ocasionando, em conseqüência, falhas terapêuticas e remissão de enfermidades

micóticas (CATALÁN e MONTEJO, 2006; KAUFFMAN et al., 2000).

A terbinafina, antifúngico do grupo das alilaminas, tem amplo espectro de

ação in vitro e in vivo frente a fungos responsáveis por micoses superficiais e



sistêmicas. O fármaco apresenta natureza lipofílica e queratofílica, levando ao seu

acúmulo no tecido adiposo e queratinoso. Devido a essas características é

considerado o antifúngico de eleição para o tratamento das dermatofitoses e

onicomicoses (DARKES et al., 2003; JESSUP et al., 2000; HAY, 1999; PEREZ,

1999; RYDER, 1999).

O fluconazol e a terbinafina possuem entre si particularidades relacionadas

ao mecanismo de ação e toxicidade que devem ser consideradas. Ambos agem

inibindo enzimas envolvidas com a síntese do ergosterol, porém a terbinafina atua

mais precocemente na cadeia da biossíntese tendo um efeito primário fungicida,

enquanto o fluconazol provoca a inibição de enzimas dependentes do citocromo

P-450, com efeito, primariamente fungistático (MEINERZ et. al., 2007).

3.7. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

Uma variedade de métodos é empregada para avaliar, in vitro, compostos

com potencial antimicrobiano. Os principais métodos encontrados na literatura,

tanto para detecção da atividade de bactérias quanto para fungos e leveduras,

são classificados por três tipos de ensaios: bioautográficos, de difusão e de

diluição (RIOS et al, 1988).

Os ensaios bioautográficos são aqueles que utilizam placas de

cromatografia em camada delgada (CCD) para a análise. Os compostos são

separados por CCD e colocados em placas de ágar previamente inoculadas com

o microrganismo teste. A incidência de zonas de inibição do crescimento indica a

presença de substâncias antimicrobianas (BRANDÃO, 2004; RIOS et al., 1988).



Os ensaios de difusão fundamentam-se no transporte da substância-teste

para um meio de cultura sólido e inoculado com o microrganismo desejado.

Diferentes tipos de reservatórios podem ser empregados incluindo discos de

papel, cilindros de porcelana ou de aço inoxidável e orifícios feitos no meio de

cultura. Nestes reservatórios são formados halos, e o que não acusar o

crescimento do microrganismo é denominado halo de inibição (VANDENBERGHE

e VLIETINCK, 1991).

Os ensaios de diluição são aqueles nos quais os extratos ou substâncias a

serem testadas são adicionados a um meio de cultura líquido, previamente

inoculado com o microrganismo teste. Após incubação, o crescimento do

microrganismo é determinado pela leitura visual direta ou pela leitura em

espectrofotômetro, com λ apropriado (VANDENBERGHE e VLIETINCK, 1991).

O método de diluição em meio líquido é o que apresenta metodologia mais

complicada, entretanto é o mais sensível. Esse método é recomendado na

determinação da concentração inibitória mínima - CIM (RIOS et al., 1988). A CMI

é a menor concentração do agente antimicrobiano capaz de inibir completamente

o crescimento do microrganismo em tubos ou placas de microdiluição (NCCLS,

2003).

De acordo com a literatura, existem métodos nos quais a substância a ser

testada é incorporada ao meio de cultura nas concentrações desejadas. Os

fungos são inoculados no centro de cada placa de Petri, no meio solidificado, em

discos de micelas com 0,5 cm e são feitos controles negativos contendo somente

a substância teste e o meio na ausência de microrganismos. As placas são

incubadas à temperatura de 22 ºC ± 1 ºC durante sete dias. A efetividade é



avaliada pelo diâmetro de crescimento das colônias de fungos. A porcentagem de

inibição é calculada pela equação:

Sendo I = inibição, C = medida do diâmetro de crescimento do fungo no meio

controle e T = medida do diâmetro de crescimento do fungo no meio contendo a

substância (TUBEROSO et al., 2005).

Outro método descrito para avaliação da atividade antifúngica é a

determinação da concentração fungicida mínima - CFM e diluição em caldo RPMI-

1640 em placas de microtítulo para determinação da CMI (NCCLS, 2003).

Na determinação da CFM utiliza-se a técnica de filtração de membrana. O

inóculo é adicionado à substância, e essa mistura é mantida à temperatura

ambiente por um determinado tempo. Após este contato, a mistura é transferida

para um aparelho de filtração esterilizado, lavado por duas vezes com solução

neutralizante (água destilada e Tween). As membranas são transferidas para

placas contendo ágar e, após incubação, as colônias são contadas. A CFM

corresponde à menor concentração da substância capaz de inibir a multiplicação

de fungos (MATSUMOTO, 2006).

I = 100 (C - T) C-1

Síntese dos derivados da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona


4. SÍNTESE DOS DERIVADOS DA 6-NITRO-2H-1,4- BENZOTIAZIN-3-ONA

4.1. METODOLOGIA

4.1.1. MATERIAIS

4.1.1.1 Equipamentos

A pureza dos compostos foi controlada por cromatografia em camada

delgada (CCD), utilizando placas de vidro com 0,25 mm de espessura, revestida

com o adsorvente sílica GF254. As placas foram reveladas em luz ultravioleta

(254 nm) em um gabinete próprio para revelação e/ou em cuba saturada com

vapor de iodo.

Os espectros de infravermelho foram obtidos em espectrofotômetro de

absorção no infravermelho (FT-IR) Nicolet, modelo Impact 410, acoplado a um

microcomputador Pentium 233 MHz, HD = 2,4 Gb, RAM = 32 Mb com software

compatível, instalado no Departamento de Química da Universidade Federal de

Ouro Preto.

Os espectros de ressonância magnética nuclear foram registrados por

espectrômetros Bruker DPX 200 AVANCE, 200 MHz, do Laboratório de

Ressonância Magnética Nuclear de Alta Resolução da Universidade Federal de

Minas Gerais - UFMG, em Belo Horizonte, Minas Gerais.

A faixa correspondente à temperatura de fusão dos derivados foi

determinada em tubos capilares no aparelho Buchi 510.

Nas reações de síntese, foram utilizados solventes e reagentes com alto

grau de pureza, em vidrarias apropriadas.



4.1.1.2 Solventes e Reativos

Foram utilizados os seguintes solventes e reagentes:

- 2-cloro-5-nitro-anilina - Aldrich

- Acetato de etila: Merck

- Ácido acético glacial: Merck

- Ácido clorídrico: Merck

- Ácido monocloroacético: Merck

- Água destilada

- Álcool etílico (Etanol): Merck

- Cloreto de benzoíla: Merck

- Cloreto de estanho dihidratado: Merck

- Clorofórmio: Merck

- Dimetilsulfóxido (DMSO): Synth

- Enxofre: Nuclear

- Éter etílico: Merck

- Hidróxido de potássio: Merck

- Hidróxido de sódio: Nuclear

- Iodeto de metila: Merck

- Sílica gel GF254: Merck

- Sulfeto de sódio monohidratado: Isofar

- Tolueno: Merck



4.1.2. MÉTODOS

4.1.2.1 Síntese do composto 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

A obtenção do composto de partida, 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona foi

realizada em três etapas: Inicialmente obteve-se o 2-amino-4-tiofenolato e, após

reação com ácido monocloroacético em meio básico, formou o ácido

feniltioglicólico, que em meio ácido perdeu água e ciclizou-se em 6-nitro-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona.

Cl

NH2O2N

SNa

NH2O2N

Na2S

S1) ClCH2COOH/OH-

2) H+ N

S

OO2NH

i. Síntese do 2-amino-4-nitrotiofenolato de sódio

(FRIES et al, 1927)

Cl

NH2O2N

SNa

NH2O2N

Na2S.9H2O + S

Em um balão de 50 mL, solubilizou-se 10 mmol (1,72 g) de 2-cloro-5-nitro-

anilina em 20 mL de etanol e aqueceu-se até refluxo. Uma mistura de 10 mmol

(2,4 g) de sulfeto de sódio nonohidratado (Na2S.9H2O) e 15 mmol (0,48 g) de

enxofre puro se liqüefez quando aquecida e foram adicionadas, gota a gota. A

mistura reacional foi mantida em refluxo por 45 minutos. Após esfriar, o composto

2-amino-4-tiofenolato de sódio apresentou-se como um precipitado vermelho.



ii. Síntese da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

(GRANDOLINI et al, 1986)

SNa

NH2O2N

1) ClCH2COOH/OH-

2) H+N

S

OO2NH

Em um balão de 50 mL adicionou-se, em pequenas quantidades, uma

solução eqüimolar de ácido monocloroacético (0,95 g;10 mmol) e hidróxido de

sódio (0,4 g; 10 mmol) em 40 mL de água destilada. A mistura foi mantida em

reação por 30 min, sob agitação. Ao resfriar, tratou-se a solução com 1 mL de

ácido clorídrico concentrado. Após 15 minutos à temperatura de 60°C, filtrou-se a

mistura à quente.

O composto foi purificado por recristalização em etanol a 95%.

Tabela 1: Características físico-químicas da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Fórmula molecular

C8H6N2O3S

Massa Molecular

210,21

Faixa de Fusão (°C):

- Experimento

241-244

N

S

OO2N

H

BTZ-1

- Literatura

243-244 (MACKIE & RAEBURN, 1952)



4.1.2.2 Redução do grupo nitro: síntese da 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-

ona

(OKUJIMA et al, 1990)

N

S

OO2NH

N

S

OH2NH

SnCl2

HCl

Foram solubilizados, em um balão de 50 mL, 16 mmol (3,72 g) de cloreto

de estanho dihidratado (SnCl2.2H2O) em 4 mL de ácido clorídrico concentrado. A

mistura foi mantida em banho de gelo por 10 minutos. Foram adicionados

3,5 mmol (0,736 g) de 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona em pequenas partes,

conservando constante a agitação por 15 minutos. Gradativamente, aumentou-se

a temperatura ao refluxo (T≈90°C), sendo mantida por duas horas. Após

resfriamento, a mistura foi filtrada. O precipitado obtido foi suspenso em água e

alcalinizado a pH=10 pelo tratamento com NaOH 20%, que liberou a amina.

O composto foi purificado por recristalização em H2O.

Tabela 2: Características físico-químicas da 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Fórmula molecular C8H8N2OS

Massa Molecular 180,23

Faixa de Fusão do cloridrato:

- Experimental (°C): 228-230

N

S

OH2N

H

BTZ-1R - Literatura (°C): 225-228 (SOUZA et al., 2006)



4.1.2.3 N-metilação: síntese da 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

(NGADI et al, 1990)

N

S

OO2NH

N

S

OO2NCH3

CH3I+KOH

Uma solução contendo 5 mmol (1,05 g) de 6-nitro-2H-1,4-benzotiazinona

em DMSO/EtOH (10/12,5 mL) foi mantida sob agitação à temperatura ambiente

por 10 min em presença de 10mmol (0,56 g) de hidróxido de potássio. Gota a

gota, adicionaram-se 10 mmol de iodeto de metila, mantendo a reação sob forte

agitação a 50°C, por aproximadamente 17 h. Após resfriamento, o composto

precipitou-se quando adicionado a gelo triturado. O derivado metilado foi

separado por filtração.

O composto foi purificado por recristalização em etanol a 95%.

Tabela 3: Características físico-químicas da 6-nitro-4-metil-2H-,4benzotiazin-3-ona.

6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

Fórmula molecular C9H8N2O3S


Faixa de Fusão:


N

S

OO2N

CH3

BTZ-2 - Literatura (°C): 183 - 185 (GUARDA, 1998)



4.1.2.4 Redução do grupo nitro: síntese da 6-amino-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona

(CECCHETTI et al, 1984)

N

S

OO2NH

N

S

OH2NCH3

SnCl2

HCl

Em um balão de 50 mL, foram solubilizados 16 mmol (3,72 g) de cloreto de

estanho dihidratado (SnCl2.2H2O) em 4 mL de HCl concentrado. Após

resfriamento, foram adicionados 3,5 mmol (0,785 g) de 6-nitro-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona em pequenas porções, mantida a mistura sob agitação

constante em banho de gelo por 15 min. Gradativamente, aumentou-se a

temperatura até refluxo (T≈90°C), mantendo-a por duas horas e, após

resfriamento, filtrou-se, o precipitado formado. O composto foi isolado sob a forma

de cloridrato. A amina foi liberada pela suspensão em H2O e tratamento com

NaOH 20% até pH=10. O precipitado foi lavado com água até neutralização do pH

da água de lavagem.

O composto foi purificado por recristalização em H2O.

Tabela 4: Características Físico-Químicas da 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Fórmula molecular C9H10N2OS


Faixa de Fusão do cloridrato:

- Experimental (°C): 226- 227

N

S

OH2NCH3

BTZ-2R - Literatura (°C): 228-230 (GUARDA, 1998)



4.1.2.5 Benzoilação da amina: síntese do 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona.

(VOGEL, 1989)

N

S

OH2NCH3

N

S

OHNCH3C

+

O

ClNaOH

OC6H5

Uma suspensão de 5 mmol (0,971 g) de 6-amino-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona em 10 mL de hidróxido de sódio a 5% p/v, foi tratada com 10

mL de cloreto de benzoila. A mistura foi agitada por 15 minutos à temperatura

ambiente e, em seguida, foram adicionados 5 mL de água. O composto acilado

precipitou-se e foi separado por filtração e lavado com água.

Purificou-se o composto por recristalização em etanol 95%.

Tabela 5: Características físico-químicas da 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Fórmula molecular C16H14N2O2S


Faixa de Fusão:


N

S

OHNCH3C

OC6H5

BTZ-3 - Literatura (°C): 185 – 186 (GUARDA, 1998)



4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.2.1. Via Sintética

O esquema geral de síntese dos derivados 2H-1,4-benzotiazínicos está

apresentado abaixo:

Cl

NH2O2N

SNa

NH2O2N

Na2S

S1) ClCH2COOH/OH-

2) H+

N

S

OO2NH

N

S

OH2NH

SnCl2H+

CH3OH-

N

S

OO2NCH3

N

S

OH2NCH3

SnCl2H+

OH-

C6H5COClN

S

O

CH3

HN

COPh

BTZ 1BTZ 1R

BTZ 2BTZ 2RBTZ 3

(a) (b)

(c)(d)

(e)(f)(g)

Figura 9: Representação esquemática da síntese dos derivados: (a) 2-cloro-5-nitroanilina; (b)2-amino-4-nitrotiofenolato de sódio; (c) 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona; (d) 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona; (e) 4-metil- 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona; (f) 4-amino-6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona; (g) 4-benzoilamino-6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.



4.2.2. Obtenção do composto de partida: 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-

ona

A via sintética para esta reação compreendeu três etapas. Inicialmente

obteve-se o 2-amino-4-nitrotiofenol (ou 2-amino-4-nitrobenzenotiol), pela reação

entre a 2-cloro-5-nitroanilina e o sulfeto de sódio misturado com enxofre. Na

segunda etapa, o 2-amino-4-nitrobenzenotiol em presença do ácido

monocloroacético levou à formação do ácido feniltioglicólico. Este, em meio ácido,

perdeu uma molécula de água e ciclizou-se originando o composto 6-nitro-2H-

1,4-benzotiazin-3-ona, representado neste trabalho por BTZ-1.

Na primeira etapa da reação, a substituição do átomo de halogênio (cloro)

no anel aromático se dificulta quando a molécula não se fecha com a função

ativadora. Em contrapartida, esta substituição é favorecida pela presença de um

grupo nitro em orto ou pára. O grupo nitro exerce um forte efeito desativante do

anel. Assim, o cloro presente em 2-cloro-5-nitroanilina pôde ser substituído por

um grupo SH, apesar da presença do grupo amina exercer um efeito doador de

elétrons (GUARDA, 1998).

O2N

NH2

Cl

O sal de sódio 2-amino-4-nitrobenzenotiol apresentou-se na forma de

cristais com coloração avermelhada. A função tiol pôde ser liberada pela

acidificação do meio.



SH

NH2O2N

1

2

34

5

6

A caracterização do composto 2-amino-4-nitrobenzenotiol não foi realizada,

visto que se realizou a reação sem a separação do mesmo. Mas, a caracterização

através de espectrometria no infravermelho e pela espectrometria de ressonância

magnética nuclear de H foi relatada por Guarda, 1998, durante a obtenção da 6-

nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

Tabela 6: Caracterização do composto 2-amino-4-nitrobenzenotiol pela espectrometria no IV e RMN 1H, segundo Guarda (1998).

2-amino-4-nitrobenzenotiol

IV (KBR 1%)

RMN 1H (∆ PPM / DMSO-D6)

NH2 6.20 (S)

ν NH2 3400 E 3310 CM-1 H1 3.40 (S)

ν NO2 1500, 1340 E 740 CM-1 H3 7.56 (D)

ν SH 2540 CM-1 H5 7.26 (DD)

H6 7.34 (D)

A etapa seguinte desta reação utilizou o tiol na forma de um sal de sódio,

que reagiu com ácido monocloroacético em meio alcalino levando à formação do

ácido feniltioglicólico. Este aminoácido, por aquecimento à 50ºC no etanol

adicionado de algumas gotas de ácido clorídrico concentrado, perdeu uma

molécula de água e se ciclizou em 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, o BTZ-1.



4.2.3. A metilação do nitrogênio da posição 4

A síntese para esta reação ocorreu em aproximadamente 17 horas. O

composto de partida, 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, juntamente com KOH,

reagiu com iodeto de metila (iodometano) em uma mistura de EtOH e DMSO. O

iodeto de metila foi utilizado por ser um excelente reagente para metilação.

A base KOH utilizada atuou na remoção do próton ácido formando o ânion,

que serviu como um nucleófilo na substituição SN2 e permitiu a posterior

alquilação com iodeto de metila. O composto alquilado, 6-nitro-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona, foi representado neste trabalho por BTZ-2.

N

S

OO2NH

N

S

OO2NCH3

N

S

OO2NK

N

S

OO2NK

+ KOHEtOH / DMSO

H2C IH

4.2.4. A redução do grupo nitro

A redução do grupo nitro é o ponto de partida para a obtenção de novos

compostos. Nesse trabalho os compostos 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

(BTZ-1) e 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona (BTZ-2) foram convertidos a



amina segundo a reação de redução que utiliza o cloreto de estanho em meio

ácido:

N

S

OO2NH

N

S

OH2NR

SnCl2

HCl

R = H, CH3

4.2.5. Acilação da amina primária.

O composto 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona foi

sintetizado através da reação de Schotten-Baumann, uma reação de benzoilação

de aminas aromáticas. Quando benzoilado, o par de elétrons do nitrogênio fica

deslocado entre os dois grupos aromáticos, tornando o hidrogênio mais ácido e

permitindo dessa forma a sua substituição por grupos alquilas, por exemplo. O

composto benzoilado foi representado neste trabalho por BTZ-3.

N

S

OH2NCH3

C

Cl

O

N

S

OH2NCH3C

Cl

O

N

S

OH2NCH3C O

N

S

OHNCH3C O

Cl-

H+



4.3. ESTRUTURAS E PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS

Os derivados benzotiazínicos sintetizados, cujas fórmulas estruturais foram

representadas nas figuras 10 a 14, foram previamente identificados devido às

características físicas e químicas, como estado físico, coloração, faixa de

fusão (ºC) e fator de retenção para CCD, confirmando suas purezas.

N

S

OO2N

H Figura 10: (a) Fórmula estrutural e (b) tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-1

N

S

OH2NH

Figura 11: (a) Fórmula estrutural e (b) tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-1R

N

S

OO2N

CH3 Figura 12: (a) Fórmula estrutural e (b) tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-2

N

S

OH2N

CH3 Figura 13: (a) Fórmula estrutural e (b) tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-2R

N

S

O

CH3

HN

COPh Figura 14: (a) Fórmula estrutural e (b) tridimensional (modelo de bolas) do BTZ-3



Observando a tabela 7, verifica-se a influência do grupo nitro na coloração

dos compostos obtidos que, devido à redução, passaram de amarelo a branco.

Observa-se também uma influência da redução do grupo nitro na faixa de fusão e

no fator de retenção cromatográfico.

Os rendimentos acima de 60% indicam um bom resultado para as reações.



4.4. CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE IV

Evidenciaram-se, através da espectrometria no infravermelho, as bandas

de absorção características dos grupos funcionais presentes nos compostos

sintetizados.

4.4.1. 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

A análise das vibrações de deformação das carbonilas mostrou uma banda

de absorção na região compreendida entre 1720 e 1690 cm-1. Observou-se uma

freqüência de absorção entre 3180 e 3200 cm-1 referente à deformação axial N-H.

Entre 1347 e 1510 cm-1, observou-se a absorção da vibração característica do

grupo nitro. Os valores encontrados estão de acordo com os dados da literatura

(tabela 8).

Tabela 8: Características de infravermelho para o BTZ-1 (ν cm-1, KBr 1%)

6-nitro-2h-1,4-benzotiazin-3-ona

EXPERIMENTAL

LITERATURA*

ν 4-NH 3200 - 3180 3320

ν 3-CO 1720 - 1690 1680

ν 6-NO2 1510 E 1347 1510, 1340, 740 * GUARDA, 1998.



Figura 15: Espectro de absorção no Infravermelho da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

4.4.2. 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

A análise das vibrações de deformação das carbonilas mostrou uma banda

de absorção na região compreendida entre 1720 e 1680 cm-1. Observou-se uma

freqüência de absorção entre 3180 e 3200 cm-1 referente à deformação axial do

N-H. As bandas características de NH2 aparecem em torno de 3400 a 3380 cm-1.

Ao compararmos com o BTZ-1, observa-se o desaparecimento das bandas

características do grupo nitro. Os dados da literatura confirmam as características

obtidas (SOUZA et al.; 2006).

Tabela 9: Características de infravermelho para o BTZ-1R (ν cm-1, KBr 1%).

6-amino-2h-1,4-benzotiazin-3-ona.

EXPERIMENTAL LITERATURA*

ν 4-NH 3330 - 3250 3349 -3201

ν 3 - CO 1720 -1680 1678,1623

ν 6 –NH2 3430 - 3380 3442

* SOUZA et al, 2006.



Figura 16: Espectro de absorção no Infravermelho da 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

4.4.3. 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Verificou-se a alquilação do BTZ-1 pelo desaparecimento das bandas

características para a ligação N-H e pela presença da banda de absorção

característica do grupo metila.

Tabela 60: Características de infravermelho para o BTZ-2 (ν cm-1, KBr 1%).

6-nitro-4-metil-2h-1,4-benzotiazin-3-ona.


ν 3-CO 1690 1690

ν 6 -NO2 1510, 1340, 745 1510, 1340, 745

ν 4-N-CH3 2940 2940




Figura 17: Espectro de absorção no Infravermelho da 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

4.4.4. 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Nas características do infravermelho para a 6-amino-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona, evidencia-se a redução do grupo nitro pelo desaparecimento

de suas bandas características e o surgimento do grupo amino primário através

das bandas entre de 3350-3450 cm-1.

Tabela 11: Característica de infravermelho para o BTZ-2R (ν cm-1, KBr 1%).

6-amino-4-metil-2h-1,4-benzotiazin-3-ona.


ν CH3 2900 2900

ν 3-CO 1655 1655

ν 6 -NH2 3430, 3340 3430, 3380 * SOUZA et al, 2006.



Figura 18: Espectro de absorção no Infravermelho da 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

4.4.5. 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Ao analisar o espectro de infravermelho da 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona observa-se o desaparecimento das bandas características de

aminas primárias e o aparecimento de bandas características da carbonila da

função acila e da função NH.

Tabela 12: Características de infravermelho para o BTZ-3 (ν cm-1, KBr 1%).

6-benzoilamino-4-metil-2h-1,4-benzotiazin-3-ona.


ν NH 3280 3300

ν CO ACILA 1690 1675

ν CO LACTAMA 1640 1645

ν CH3 2840 2800




4.5. CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE RMN 1H.

Pela espectrometria de ressonância magnética nuclear protônica,

verificaram-se os deslocamentos característicos referentes aos prótons presentes

nas estruturas dos derivados da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, identificando as

moléculas pela comparação com os dados publicados na literatura.

O espectro foi realizado em CDCl3 (BTZ-1) e DMSO-d6 (BTZ-1R, BTZ-2,

BTZ-2R e BTZ-3). Os deslocamentos químicos foram expressos em ppm.


Os dados observados estão apresentados na tabela 13. Pela comparação

destes dados com os relatados na literatura, espectrofotômetro Varian HA-100 por

Martani e cols (1968), a estrutura do composto BTZ-1 pôde ser identificada.

Observa-se a influência do grupo nitro no deslocamento dos H das

posições 5, 7 e 8.

N

S

OO2N

H

3.72

8.0

7.837.41

8.47N

S

OO2N

H

1

2

3

45

978

106

012345678PPM

Figura 19: Deslocamentos registrados no espectro de RMN 1H para o BTZ-1



Tabela 13: Deslocamentos químicos de H registrados para a 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

Prótons δ (ppm) experimental δ (ppm) literatura

H2 3,72 (s) 3,57

H4 8,0 (s) 10,88

H5 8,47 (d) J = 2,3 Hz 7,74

H7 7,83 (dd) J = 9,2 Hz e J = 2,3 Hz 7,78

H8 7,41 (d) J = 9,2 Hz 7,56

* MARTANI et al., 1968


Para a 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona observa-se que os prótons 5, 7 e

8 apresentam seus deslocamentos em campos mais altos, devido a ausência da

influência do grupo nitro. Evidencia-se o aparecimento dos sinais para os prótons

da amina primária (Tabela 14). A diferença entre os valores experimentais e da

literatura para os hidrogênios ligados ao nitrogênio foi observada, mas os

deslocamentos são coerentes.

N

S

ONH2

H

6.91

6.10

6,74

8.0

3,71

4.0N

S

ONH2

H

1

2

3

45

97

8

106

012345678PPM

Figura 20: Espectro de RMN 1H para a 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona



Tabela 14: Deslocamentos químicos protônicos registrados para a 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona (δ ppm /DMSO-d6).

Prótons Experimental Literatura*

H2 3,71 (s) 3,30 (s)

H4 8,00 (s) 10,22(s)

H5 6,74 (d) J = 1,5Hz 6,23 (d)

NH2 4,00 (s) 5,14 (s)

H7 6,10 (dd) J = 9,3 e 2,7 Hz 6,21 (dd)

H8 6,91 (d) J = 8,4 Hz 6,90 (d)

*SOUZA et al. , 2006


Para o 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona observa-se que os prótons

das posições 5, 7 e 8 sofreram a influência do grupo nitro e os seus

deslocamentos se localizaram em campos mais baixos, próximos de 8,0 ppm. Os

prótons do grupo metila em posição 4 foi evidenciado.

N

S

OO2N

CH3

N

S

OO2N

CH3

12

3

45

97

8

106

7.49

8.07

7.93

2.78

3.71

012345678PPM

Figura 21: Espectro de RMN 1H para a 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona



Tabela 15: Deslocamentos químicos protônicos registrados para a 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona (δ ppm /DMSO-d6).

Prótons

Experimental

Literatura*

H2 3,71 (s) 3,66 (s)

CH3 2,78 (s) 3,43 (s)

H5 7,93 (d) J = 2,4Hz 7,98 (d)

H7 8,07 (dd) J = 8,6 e 2,2 Hz 7,90 (dd)

H8 7,49 (d) J = 8,4 Hz 7,70 (d)

*SOUZA et al., 2006.


Para o composto 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona evidencia-se

novamente a influência exercida pela ausência do grupo nitro nos prótons das

posições 5, 7 e 8, que apareceram em campos mais baixos, em torno de 6,5 ppm.

Adiciona-se a estes sinais de deslocamento o aparecimentos dos prótons de

grupo amino primário e do grupo metila da posição 4.

N

S

ONH2

CH3

N

S

ONH2

CH3

12

3

45

97

8

106

6.986,28

6,46

3,24

3,35

5.24

01234567PPM

Figura 22: Espectro de RMN 1H para a 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona



Tabela 16: Deslocamentos químicos protônico registrados para o composto 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona (δ ppm /DMSO-d6).

Prótons Experimental Literatura*

H2 3,35 (s) 3,31 (s)

CH3 3,24 (s) 3,25 (s)

H5 6,46 (d) J = 2,2 Hz 6,46 (d)

H7 6,28 (dd) J = 8,2 Hz e 2,1 Hz 6,28 (dd)

H8 6,98 (d) J = 8,2 Hz 6,98 (d)

NH2 5,24 (s) 5,24 (s)

* SOUZA et al. 2006


Para o 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, os deslocamentos

protônicos observados terão maior significância ao nível do próton da posição 6,

onde evidencia-se o aparecimento do próton da amina secundária (NH), em torno

de 10,0 ppm.

Uma influência semelhante a do grupo nitro é exercida pela carbonila acila:

observa-se que os prótons das posições de 5, 6 e 7 se apresentam em campos

mais baixos, em torno de 8,0 ppm.

Os prótons do segundo anel aromático são equivalentes nas posições orto

e meta, e também sofrem a influência da carbonila.



N

S

O

CH3

12

3

45

97

8

106

N

S

O

CH3

HNHN

3.71

7.44

7.21

7.52

7.51

7.38

7.44

7.95

8.0

2.781'

2'

3'

4'

5'

6'

O O

7.95

012345678PPM

Figura 23: Espectro de RMN 1H para a 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Tabela 17: Deslocamentos químicos protônico registrados para o composto 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

PRÓTONS

EXPERIMENTAL

LITERATURA*

H2 3,71 (s) 3,50 (s)

CH3 2,78 (s) 3,32 (s)

H5 7,38 (d) J = 2,2 Hz 7,76 (d)

H7 7,52 (m) 7,76 (m)

H8 7,21 (d) J = 8,4 Hz 7,36 (d)

6-NH 8,0 (s) 10,33 (s)

H2’ E H6’ 7,95 (dd) 7,96 (m)

H3’ E H5’ 7,44 (m) 7,76 (m)

H4’ 7,51 (m) 7,76 (m)

* SOUZA et al. , 2006



4.6. CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE RMN 13 C

Analisando o espectro de ressonância magnética nuclear do carbono 13,

verificam-se os deslocamentos característicos presentes na estrutura dos

derivados da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, identificando a estrutura da

molécula pela comparação com os dados publicados na literatura. Os espectros

foram realizados em CDCl3 (BTZ-1) e DMSO-d6 (BTZ-1R, BTZ-2, BTZ-2R e

BTZ-3). Os deslocamentos químicos foram expressos em ppm.


Na análise dos deslocamentos químicos para a 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-

3-ona verifica-se a presença do carbono CH2 da posição 2, único do gênero

dentro da estrutura bem como a presença de quatro carbonos quaternários nas

posições 3, 6, 9 e 10. Para o carbono 3 verifica-se a influência do grupo carbonila

e, em menor intensidade, a influência do grupo nitro sobre o carbono 6. (Figura

24, Tabela 18).



N

S

OO2N

H

41.4116.9

127.9

117.1N

S

OO2N

H

1

2

3

45

978

106 145.0 143.3

131.4

168.2

020406080100120140160180PPM

Figura 24: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Tabela 18: Características de RMN 13C da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona (δ ppm /DMSO-d6)

Carbonos

Experimental

Literatura*

C2 41,4 28,1

C3 168,2 164,6

C5 117.1 111,0

C6 145.0 145,9

C7 116.9 117,2

C8 127.9 128,5

C9 131.4 127,9

C10 143.3 137,8

*GUARDA, 1998.




Na análise dos deslocamentos químicos para a 6-amino-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona observa-se que os carbonos das posições 5 e 9 estão

posicionados em campos mais altos do que aqueles dos derivados nitro

correspondente. (Figura 25, Tabela 19).

N

S

ONH2

H

1

2

3

45

978

106

N

S

ONH2

H

128.3

117.2

108.2

41.4

168.2143.8

117.9

145.9

020406080100120140160180PPM

Figura 25: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Tabela 19: Características de RMN13C para a 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona (δ ppm/DMSOd6)

Carbonos

Experimental

Literatura*

C2

41,4

29,6

C3 168,2 165,7

C5 108,2 109,4

C6 145,9 148,2

C7 117,2 102,5

C8 128,3 127,7

C9 117,9 103,4

C10 143,8 139,1

* SOUZA et al., 2006




Ao analisar os deslocamentos químicos para o 6-nitro-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona observa-se o aparecimento do deslocamento do carbono do

grupo metila em torno de 30 ppm. (Figura 26, Tabela 20).

N

S

OO2N

CH3

N

S

OO2N

CH3

12

3

45

97

8

106

127.9116.9

115.7

29.8

38.9

166.7136.7

145.0

131.4

020406080100120140160180PPM

Figura 26: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

Tabela 20: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para o composto 6-nitro-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

Carbonos

Experimental

Literatura*

C2 38.9

29,3

C3 166.7 164,6

CH3 29.8 31,5

C5 115.7 112,2

C6 145.0 146,3

C7 116.9 117,5

C8 127.9 128,5

C9 131.4 131,9

C10 136.7 140,4

* GUARDA, 1998




Na análise dos deslocamentos químicos para a 6-amino-4metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona observa-se que os carbonos das posições 5 e 9 estão

posicionados em campos mais altos do que aqueles dos derivados nitro

correspondente (Figura 27, Tabela 21).

N

S

OH2N

CH3

N

S

OH2N

CH3

12

3

45

97

8

106

127.8112.1

108.2

29.8

38.9

166.7136.6

145.0

115.3

020406080100120140160180PPM

Figura 27: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-amino-4-metil-2H-1,4-

benzotiazin-3-ona



Tabela 21: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para o composto 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

Carbonos

Experimental

Literatura*

C2 38.9 31,2

C3 166.7 165,6

CH3 29.8 31,3

C5 108.2 103,6

C6 145.0 148,5

C7 112.1 109,2

C8 127.8 128,3

C9 115.3 106,7

C10 136.6 140,8

*GUARDA, 1998


A análise dos espectros mostra o aparecimento dos sinais de

deslocamento característicos do núcleo aromático próximo a 130 ppm e de outro

sinal próximo a 165 ppm para o carbono quaternário do grupo carbonila. (Figura

28, Tabela 22).



N

S

O

CH3

12

3

45

97

8

106

N

S

O

CH3

HNHN

38.9

127.2

1'

2'

3'

4'

5'

6'

O O

166.7

120.9117.4

132.5

127.5

164.8 127.5

128.9

29.8

132.2

113.5

134.2 128.9

136.0

020406080100120140160180PPM

Figura 28: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para a 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona



Tabela 22: Deslocamentos químicos de Carbono-13 registrados para o composto 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona (δ ppm / DMSO d6).

Carbonos Experimental Literatura*

C2 38,9 30,4

C3 166,7 165,3

CH3 29,8 31,4

C5 113,5 109,8

C6 132,5 138,5

C7 117,4 114,9

C8 127,2 127,8

C9 120,9 116,6

C10 136,0 140,1

COPH 164,8 165,5

C1’ 134,2 134,6

C2’E C6’ 127,5 127,5

C3’ E C5’ 128,9 128,3

C4’ 132,2 131,5

*Sousa et al., 2006.



4.7. CARACTERIZAÇÃO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Considerando que não há divergência entre os resultados

experimentais e os relatados na literatura para as espectroscopias realizadas, as

fragmentações obtidas no espectro de massas enriquecem a caracterização das

estruturas dos compostos obtidos. Segundo estudos realizados por Guarda

(1998), os compostos sintetizados apresentam os principais fragmentos (m/z):

- 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

- m/z 180 (M* 100 %) - pico base / pico do íon molecular.

- m/z 151 (18,1%) – corresponde à perda de um radical formila (-CHO•), pelo íon

molecular;

- m/z 135 (25,5%) – perda de -CHO seguida de -NH2



N

S

NH2

H

O

-CHO

N

S+

NH2

H

N

S+

NHH

-NH

-HCN

N

S

+

H

+

S

NH2N

S+

H

S

++

SH

-C2H2NH -HCN

-CS-C4H4

C3H3+

HC S+

m/z 180

m/z 151

m/z 135m/z 124 m/z 124

m/z 83m/z 97

m/z 39m/z 45



- 4-metil-6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona

- m/z 224 (M* 100%): Pico do íon molecular.

- m/z 181 (65,1%): corresponde à perda do -CH3CO.

- m/z 149 (33,8%): corresponde à perda do enxofre a partir do fragmento m/z 181.

- m/z 95 (45%): corresponde à clivagem do íon em m/z 149 liberando -CH2N e

-CN.

N

S

ONO2

CH3

N

S

NO2

+CH2

N

S+

NO2

H

-CHO

-CH3CO

CH2

NNO2 H

-S -NO2

+ N

S

H

-CH2

N

S

H

+

-CH2N-HCN -CN

C6H3NO2 C6H4S +

+

SH

-S

-HC CH

+

-S

C6H4

-CN

C5H3O2

BTZ 2 m/z 224

m/z 195

m/z 181

m/z 149 m/z 135 m/z 121

m/z 95

m/z 121

m/z 76

m/z 108 m/z 109

m/z 77

m/z 51



- 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

- m/z 194 (M* 100%): Pico do íon molecular

- m/z 165 (17,7%): corresponde à perda de um -H• seguido de um grupo -CO ou

de um radical formila, -CHO•, ambos a partir do íon molecular.

- m/z 149 (28,35%): perda de –NH2, a partir do fragmento m/z 165

- m/z 133 (11%): Perda de - CH4 a partir do fragmento m/z 149.

N

S

NH2

CH3

O N

S

NH2

-CH2

O

-CO-CHO

N

S+

NH2

CH3

N

S+

NH2

H

N

S

CH3

-CH2 -NH2

+-CH4

N

S

+

-CH2

-H

BTZ 2R m/z 194 m/z 193

m/z 165

m/z 151 m/z 149 m/z 133

m/z 135



- 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

- m/z 298 (M* 37,8%): Pico do íon molecular.

- m/z 105 (100%): Fragmento proveniente da ruptura da benzoíla.

- m/z 77 (53,9%): Corresponde à fragmentação do benzeno substituído (benzoíla),

que perdeu uma molécula de monóxido de carbono e originou o fragmento

m/z 77. Quando há picos em m/z 105, originando m/z 77, é característica a

presença de uma carbonila ligada ao anel.

CH3

O

CO

CH3 CO HC CH

m/z 105 m/z 77 m/z 51

Avaliação das atividades farmacológicas in vivo


5. AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS IN VIVO

5.1. METODOLOGIA GERAL

5.1.1. Animais

Foram utilizados camundongos Swiss albinos, fêmeas, pesando de

25 a 35 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Ouro

Preto. Os animais foram mantidos em condições padronizadas e alimentados com

ração (LABCIL Peletizado - Socil®) e água ad libitum, sendo privados de ração

durante as 12 horas precedentes aos experimentos.

Os protocolos utilizados foram submetidos ao Comitê de Ética em

Experimentos Animais da Universidade Federal de Ouro Preto.

5.1.2. Preparação e administração das soluções

Os derivados sintetizados foram solubilizados em água, DMSO (Synth,

Brasil) e Tween 80 (Synth, Brasil), na proporção 8:1:1. As soluções foram

preparadas imediatamente antes de serem administradas por via intraperitonial

(i.p.) para a utilização nos métodos descritos no presente capítulo.

5.2. TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE LOCOMOTORA ESPONTÂNEA

5.2.1. METODOLOGIA

5.2.1.1 Determinação da DL50

A DL50 foi determinada para cada um dos cinco compostos estudados, de

acordo com TURNER (1972). Para cada composto foi determinada, em um grupo



de 10 animais, a menor dose que resultava em 100% de letalidade, além de

outras quatro doses que resultavam em diferentes percentuais de mortalidade

(BRITO, 1994). Em cada experimento, os camundongos receberam a dose

correspondente do derivado sintético ou igual volume do veículo controle (n = 2).

O número de óbitos foi verificado durante o período de 24 horas após a

administração das soluções.

5.2.1.2 Identificação de estereotipias e sinais de toxicidade

Foi observada a ocorrência de estereotipias e sinais qualitativos indicativos

de toxicidade nos animais, tais como: grooming, rearing, perda do reflexo de

postura, sudorese e o aparecimento de hemorragias. A observação dos efeitos

tóxicos foi realizada com os animais em livre movimentação durante o período de

seis horas.

5.2.1.3 Método do Campo-Aberto - Open-Field

O método utilizado foi proposto por Turner (1972). Foi realizado utilizando-se

uma caixa de madeira (campo-aberto) de 3600 cm2, dividido em 16 quadrados

iguais (Figura 29). Cada animal foi colocado no quadrante do vértice inferior

esquerdo e foi observado por um período de 60 segundos (BERTOLLO, 2006).

Foi contado o número de quadrados invadidos nos tempos 0, 1, 3 e 24 horas após

a administração de cada composto ou solução controle. Foi considerado um

quadrado invadido quando o animal colocava ao menos duas patas dentro da

mesma área.



Figura 29: Aparato utilizado no teste do campo aberto - Open-Field test, de acordo com Turner (1972). O campo aberto consiste em uma caixa quadrada de 3.600 cm2, demarcada por 16 quadrados de 22 cm2, com paredes laterais de 19,5 cm de altura.

5.2.1.4 Análise Estatística

Os dados obtidos no método do campo aberto foram expressos como

média ± erro padrão da média (e.p.m). Os resultados apresentados foram

submetidos à análise de variância (one-way ANOVA), seguido pelo teste t de

Student, adotando um intervalo de confiança de 95%.

5.2.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.2.2.1 Toxicidade Aguda

Para avaliação da toxicidade aguda, foram utilizadas diferentes doses dos

derivados sintetizados. No método de probitos são necessárias de pelo menos

cinco doses que resultem em valores percentuais distintos de mortalidade (LEITE

e AMORIM, 2006).

A tabela 23 apresenta os dados da mortalidade induzida pelas diferentes

doses dos produtos sintéticos estudados. O efeito tóxico avaliado pela

mortalidade foi expresso como DL50, calculado pelo método de probitos. Para os

grupos com 0 e 100% de mortalidade foi utilizado as seguintes fórmulas:

• Grupo com 0% de mortalidade = 100 (0.25/n)

• Grupo com 100% de mortalidade = 100 [(n - 0.25)/n)



onde n simboliza o número de animais em cada grupo (VEERAPPAN et al, 2007).

Após a correção percentual das mortalidades 0 e 100%, os valores obtidos

foram transformados em probitos (Tabela 24) e plotados em função do logaritmo

das doses. A DL50 foi então determinada pelo método gráfico.

No método gráfico, a DL50 foi determinada pelo valor antilogarítimico da

dose equivalente ao probito 5 na reta de regressão linear (VEERAPPAN et al,

2007; ALONSO et al, 2000). Os resultados obtidos estão apresentados nas

figuras 30 a 34.

A determinação da DL50 revelou que, comparados ao composto de partida

(6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona : BTZ-1), a alquilação do nitrogênio por um

grupo metil no BTZ-2 aumentou a toxicidade de 1548,82 para 1023,29. Este

aumento também foi observado nos compostos BTZ-1R (de 1548,82 para 489,78)

e BTZ-2R (de 1548,82 para 407,38), devido à modificação estrutural causada

pela substituição do grupo nitro (-NO2) pelo amino (-NH2) em C-6. De acordo com

a toxicidade observada nos dois compostos contendo o grupo amino, é possível

dizer que este grupo elevou a toxicidade dos compostos.

Ainda pelos dados da Tabela 24, foi observado que o composto BTZ-3

apresentou baixa toxicidade quando comparado aos outros derivados, devido a

presença do grupo metila na posição 4 e do grupo nitro na posição 6. Estes

resultados sugerem que o grupo metila nesta posição atribui à molécula uma

menor toxicidade, porém, mesmo com esta metila, a presença do grupo amino

em C-6 eleva a toxicidade dos compostos. Este fato pode ser explicado pelo

grupo amino ter um caráter ácido que atua negativamente na farmacocinética

destes compostos (BTZ-1R e BTZ-2R) no organismo dos animais.



Além da determinação da DL50, várias estereotipias indicativas de

toxicidade foram observadas após a administração das diferentes doses dos

derivados benzotiazínicos. Estes efeitos apareceram poucos minutos após o

tratamento e incluíram salivação, sudorese, perda do reflexo de postura,

tremores, convulsão, emissão sonora relacionada à dor (grunhidos), alteração no

tônus da calda e sangramento ocular. No trabalho desenvolvido por OBICI e cols,.

(2008), os efeitos tóxicos das substâncias iniciaram poucos instantes após

administração por via i.p., sendo reversíveis em 24 horas para doses baixas ou

moderadas dos extratos testados. As estereotipias e sinais de toxicidade

observados neste trabalho desapareceram após poucas horas (entre 3 e 5 horas

para salivação, sudorese, tremor e alteração do tônus da cauda) ou perduraram

até a morte dos animais tratados por doses elevadas dos compostos. Os animais

que perderam o reflexo de postura recuperaram a locomoção em até 6 horas

após administração dos compostos. Acima deste tempo, foi observada a morte

em todos os camundongos que não recuperaram a locomoção.

A tabela 26 apresenta os derivados relacionados às dosagens em que

foram observadas as estereotipias. Tais observações demonstram a toxicidade

dos compostos mesmo em doses que não apresentaram efeito letal, o que

justifica a avaliação de toxicidade também por estes parâmetros, conforme

estudos realizados por Matosiuk e cols (2002) para compostos sintéticos

benzotiazínicos.

Durante os últimos anos, tanto por razões éticas quanto econômicas, os

toxicologistas têm se empenhado em reduzir o número de animais utilizados em

experimentos in vivo, sugerindo o uso de métodos in vitro sempre que possível.



A determinação da DL50 vem sendo questionada pelo elevado número de

animais sacrificados para prover um valor estatisticamente válido. O método de

determinação da DL50 depende de muitas variáveis, citando como exemplos a

espécie animal, o sexo, a idade, a dieta, as condições do ambiente (temperatura,

umidade, luminosidade e barulhos) e os procedimentos laboratoriais. Tais

variáveis tornam os resultados difíceis de serem reproduzidos, exceto sob rígidas

condições experimentais (GAZDA, 2004).

Os três testes alternativos em animais empregados hoje - Dose Fixa,

Toxicidade Aguda de Classe e o Teste Up and Down - trouxeram significativa

melhoria para o bem-estar animal. Valadares (2006), relata que embora a

eliminação total do uso de animais ainda não seja possível, a citotoxicidade basal

in vitro tem sido empregada como adjuvante dos testes em animal para a seleção

das doses iniciais, que permite reduzir o número de animais em experimentos de

toxicidade aguda sistêmica.

Paumgartten e cols (2002) sugerem a substituição da DL50 por outras

metodologias como dose letal aproximada (DLA), que mesmo envolvendo

número reduzido de animais, fornece informações úteis sobre as propriedades

tóxicas dos compostos. Tais informações podem predizer doses adequadas para

experimentos de doses repetidas, que fornecem uma estimativa sobre os efeitos

tóxicos produzidos após sucessivas doses da(s) substância(s)-teste e pode(m)

revelar indícios sobre efeitos cumulativos.



Tabela 23: Número de animais mortos após a administração dos diferentes compostos sintetizados (nº de mortos / nº de animais testados).

DOSE Mortalidade observada

(mg/kg) BTZ-1 BTZ-1R BTZ-2 BTZ-2R BTZ-3

100 ND 0/10 ND 0/10 0/10 300 ND 1/10 0/10 1/10 1/10 500 ND 3/10 ND 5/10 1/10 750 ND 6/10 ND 8/10 ND

1000 0/10 10/10 2/10 10/10 1/10 1250 2/10 ND ND ND ND 1500 5/10 ND 5/10 ND 1/10 1750 ND ND 8/10 ND ND 2000 7/10 ND 10/10 ND 5/10 2500 10/10 ND ND ND 7/10 3000 ND ND ND ND 10/10

* ND = Não Demonstrado



Tabela 24: Determinação dos valores da DL50 para os derivados benzotiazínicos testados.

Dose (mg/kg)

Log dose

Mortalidade (%)

Mortalidade corrigida (%)

Probitos DL50 (mg/kg) método gráfico

1000 3,0000 00 02,50 3,45 1250 3,0969 20 20,00 4,16 1500 3,1761 50 50,00 5,00 2000 3,3010 70 70,00 5,52 BT

Z –

1

2500 3,3979 100 97,50 6,55

1548,82

100 2,0000 00 02,50 3,45 300 2,4771 10 10,00 3,72 500 2,6990 30 30,00 4,48 750 2,8751 60 60,00 5,25 BT

Z - 1

R

1000 3,0000 100 97,50 6,55

489,78

300 2,4771 00 02,50 3,45 1000 3,0000 20 20,00 4,16 1500 3,1761 50 50,00 5,00 1750 3,2430 80 80,00 5,84 BT

Z –

2

2000 3,3010 100 97,50 6,55

1023,29

100 2,0000 00 02,50 3,45 300 2,4771 10 10,00 3,72 500 2,6990 50 50,00 5,00 750 2,8751 80 80,00 5,84 BT

Z - 2

R

1000 3,0000 100 97,50 6,55

407,38

300 2,4771 00 02,50 3,45 1000 3,0000 10 10,00 3,72 2000 3,3010 50 50,00 5,00 2500 3,3979 70 70,00 5,52 BT

Z –

3

3000 3,4771 100 97,50 6,55

1445,44



BTZ 1

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

2.9 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5

Log DosePr

obito

s

DL50 = log 3,19 = 1548,82 mg/kg

Figura 30: Determinação da DL50 para o composto BTZ-1.

BTZ 1R

2.53

3.54

4.55

5.56

6.57

1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2

Log Dose

Prob

itos

DL50 = log 2,69 = 489,78 mg/kg

Figura 31: Determinação da DL50 para o composto BTZ-1R.

BTZ 2

2.53

3.54

4.55

5.56

6.57

2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4

Log Dose

Prob

itos

DL50 = log 3,01 = 1023,29 mg/kg




BTZ 2R

2.53

3.54

4.55

5.56

6.57

1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2

Log Dose

Prob

itos

DL50 = log 2,61 = 407,38 mg/kg

Figura 33: Determinação da DL50 para o composto BTZ-2R.

BTZ 3

2.53

3.54

4.55

5.56

6.57

2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6

Log Dose

Prob

itos

DL50 = log 3,16 = 1445,44 mg/kg




Tabela 25: Sinais qualitativos indicativos de toxicidade, observados em um período de 6 horas após administração por via i.p. dos derivados benzotiazínicos sintetizados.

DO

SE

(mg/

kg)

SA

LIV

AÇ

ÃO

SU

DO

RE

SE

RE

FLE

XO

DE

P

OS

TUR

A

TRE

MO

R

CO

NV

ULS

ÃO

GR

UN

HID

OS

TÔN

US

DA

C

AU

DA

SAN

GR

AMEN

TO

1000 X X X 1250 X X X 1500 X X X X 2000 X X X

BTZ

– 1

2500 X

100 X 300 X X 500 X X X X X 750 X X X

BTZ

- 1R

1000 X X X

300 X 1000 X 1500 X X X X 1750 X X

BTZ

– 2

2000 X X

100 300 X 500 X X 750 X X

BTZ

- 2R

1000 X X

300 X 1000 X X 2000 X X 2500 X X X

BTZ

– 3

3000 X X X



5.2.2.2 Atividade Locomotora Espontânea

O método do campoaberto é utilizado por muitos autores para avaliar o

animal quanto ao comportamento emocional (GRAY, 1979), analisando as

atividades locomotoras espontâneas e capacidade exploratória do animal ao

ambiente (LIND et. al., 2005; WALSH e CUMMINS, 1976). A locomoção no

campo aberto pode ser interpretada de várias formas, mas principalmente como

curiosidade ou como tentativa de escape (ARCHER, 1973).

Na análise do comportamento dos animais foram detectadas alterações

principalmente na motilidade, que foi avaliada pela distância percorrida (número

de quadrados invadidos) na exploração do ambiente. Os efeitos observados na

atividade locomotora espontânea dos animais após administrações dos derivados

sintetizados estão resumidos na tabela 25.

A redução da motilidade foi observada para todas as doses dos compostos

BTZ-1, BTZ-1R e BTZ-2. O composto BTZ-2R reduziu a motilidade apenas em

doses superiores a 100 mg/kg. Após a administração das doses 300 e

1000 mg/kg do composto BTZ-3 foi observado aumento da motilidade, que foi

reduzida após dosagens maiores.

Em experimentos realizados por Matosiuk e cols. (2002), o derivado

benzotiazínico estudado aumentou a motilidade dos animais, indicando o efeito

deste composto sobre o sistema nervoso central (SNC).

A redução na atividade locomotora também pode ser observada em animais

tratados com fármacos padrão. Em 2005, Farkas e cols estudaram a atividade do

diazepam, um fármaco benzodiazepínico agonista de receptores GABAA, e

revelaram uma redução na locomoção dos animais. Segundo Choleris e cols



(2001), esta redução da motilidade ocorre até alcançar a estabilidade, devido a

adaptação dos animais ao ambiente em testes repetidos.

O número de vezes que o animal levanta (rearing) foi avaliado,

qualitativamente, de modo a refletir a capacidade exploratória dos camundongos.

Redução no número de rearings foi observada para todos os compostos

avaliados, mas principalmente nos animais tratados com os compostos BTZ-1,

BTZ-2 e BTZ-3. Diminuição do número de rearings e de quadrados percorridos

revelou comportamento sedativo, que também é aceito como um parâmetro para

avaliação das condições de ansiedade dos animais (RODRIGUEZ et. al., 1984).

Segundo Ozturk e cols (1996), a diminuição da locomoção espontânea é

indicativa de excitabilidade reduzida com origem no SNC levando à sedação.

O número de groomings também foi avaliado de forma qualitativa. Grooming

é um termo descrito para o comportamento do animal ao levar as duas patas

dianteiras ao focinho. Este ato tem sido relatado como índice de elevada atividade

tóxica (PRESCOTT, 1970; IVINSKIS, 1968). Para o composto BTZ-2R houve

aumento no número de groomings nas doses de 300, 500 e 750 mg/kg, indicando

irritação alergênica causada por fatores tóxicos do composto testado (WALSH e

CUMMINS, 1976).



Tabela 26: Efeitos dos derivados benzotiazínicos sobre a motilidade dos camundongos, analisada pelo número de quadrados percorridos em 01 minuto no ensaio do campo-aberto a

Dose (mg/kg i.p.) 0h 1h 3h 24h

Controle 28.5 ± 1.58 22.8 ± 1.82 25.3 ± 2.01 29.3 ± 2.84 1000 25.3 ± 2.81 1.6 ± 0.27* 1.5 ± 0.40* 25.9 ± 2.39 1250 22.6 ± 3.04 1.3 ± 0.26* 0.9 ± 0.18* 11.8 ± 2.47* 1500 27.9 ± 1.95 7.6 ± 1.49* 3.9 ± 0.80* 13.9 ± 4.75* 2000 25.6 ± 1.66 0.6 ± 0.16* 0.5 ± 0.17* 3.6 ± 2.11*

BTZ 1

2500 25.5 ± 3.50 0.5 ± 0.17* 0.3 ± 0.15* 0.0 ± 0.00*


Controle 34.5 ± 2.79 25.3 ± 3.27 26.4 ± 2.20 28.0 ± 1.67 100 22.7 ± 2.56* 21.1 ± 3.57 16.4 ± 3.75* 21.3 ± 3.04 300 27.4 ± 3.81 7.5 ± 1.44* 9.9 ± 1.83* 22.9 ± 3.50 500 27.1 ± 3.97 2.6 ± 0.85* 1.6 ± 0.43* 13.3 ± 4.15* 750 22.8 ± 2.32* 1.0 ± 0.00* 0.5 ± 0.17* 2.2 ± 0.98*

BTZ 1R

1000 21.5 ± 2.70* 0.7 ± 0.15* 0.2 ± 0.13* 0.0 ± 0.00*


Controle 28.2 ± 1.93 22.3 ± 2.11 22.8 ± 2.89 29.6 ± 1.65 300 30.6 ± 3.28 5.6 ± 1.79* 15.7 ± 3.12 31.9 ± 3.67 1000 26.6 ± 2.58 2.0 ± 0.52* 0.9 ± 0.10* 18.5 ± 3.51* 1500 34.0 ± 3.58 2.0 ± 0.47* 1.3 ± 0.37* 10.6 ± 3.68* 1750 24.8 ± 2.58 0.6 ± 0.16* 0.4 ± 0.16* 5.6 ± 3.75*

BTZ 2

2000 25.3 ± 2.58 0.3 ± 0.15* 0.2 ± 0.13* 0.0 ± 0.00*


Controle 31.2 ± 3.11 21.4 ± 3.04 25.5 ± 3.03 30.9 ± 1.79 100 23.2 ± 2.17* 12.9 ± 1.49* 16.1 ± 1.20* 23.4 ± 1.38* 300 23.8 ± 2.18 2.7 ± 0.94* 1.3 ± 0.21* 20.1 ± 2.57* 500 25.6 ± 2.52 1.4 ± 0.22* 0.9 ± 0.10* 7.3 ± 2.63* 750 27.9 ± 2.73* 1.0 ± 0.00* 0.5 ± 0.17* 2.7 ± 1.82*

BTZ 2R

1000 27.0 ± 2.50 0.7 ± 0.15* 0.5 ± 0.17* 0.0 ± 0.00*


Controle 28.2 ± 2.74 21.5 ± 3.05 21.9 ± 2.91 30.3 ± 1.97 300 28.4 ± 3.54 25.8 ± 3.36 27.2 ± 2.75 26.9 ± 2.20 1000 26.1 ± 2.71 27.1 ± 3.20 31.9 ± 2.62* 26.0 ± 3.71 2000 27.7 ± 2.45 1.0 ± 0.00* 0.7 ± 0.15* 8.5 ± 3.01* 2500 27.6 ± 0.93 1.0 ± 0.00* 0.7 ± 0.15* 4.0 ± 2.12*

BTZ 3

3000 27.7 ± 2.45 0.7 ± 0.15* 0.5 ± 0.17* 0.0 ± 0.00*

a Dados expressos pela média ± e.p.m. * p < 0.05 comparados com os animais do Grupo Controle (ANOVA seguido pelo teste t de Student).



Tabela 27: Representação percentual da redução da motilidade dos animais, avaliadas pelo número de quadrados invadidos no campo-aberto.

Dose 0h 1h 3h 24h (mg/kg) X ± e.p.m X ± e.p.m. X ± e.p.m X ± e.p.m

Controle 28,5 ± 1,58 22,8 ± 1,82 25,3 ± 2,01 29,3 ± 2,84 1000 25,3 ± 2,81 1,6 ± 0.27* 1,5 ± 0.40* 25,9 ± 2,39 1250 22,6 ± 3,04 1,3 ± 0.26* 0,9 ± 0.18* 11,8 ± 2.47* 1500 27,9 ± 1,95 7,6 ± 1.49* 3,9 ± 0.80* 13,9 ± 4.75* 2000 25,6 ± 1,66 0,6 ± 0.16* 0,5 ± 0.17* 3,6 ± 2.11*

BTZ

1

2500 25,5 ± 3,50 0,5 ± 0.17* 0,3 ± 0.15* 0 ± 0.00*

Controle 34,5 ± 2,79 25,3 ± 3,27 26,4 ± 2,20 28 ± 1,67 100 22,7 ± 2.56* 21,1 ± 3,57 16,4 ± 3.75* 21,3 ± 3,04 300 27,4 ± 3,81 7,5 ± 1.44* 9,9 ± 1.83* 22,9 ± 3,50 500 27,1 ± 3,97 2,6 ± 0.85* 1,6 ± 0.43* 13,3 ± 4.15* 750 22,8 ± 2.32* 1 ± 0.00* 0,5 ± 0.17* 2,2 ± 0.98* BT

Z 1R

1000 21,5 ± 2.70* 0,7 ± 0.15* 0,2 ± 0.13* 0 ± 0.00*

Controle 28,2 ± 1,93 22,3 ± 2,11 22,8 ± 2,89 29,6 ± 1,65 300 30,6 ± 3,28 5,6 ± 1.79* 15,7 ± 3,12 31,9 ± 3,67 1000 26,6 ± 2,58 2 ± 0.52* 0,9 ± 0.10* 18,5 ± 3.51* 1500 34 ± 3,58 2 ± 0.47* 1,3 ± 0.37* 10,6 ± 3.68* 1750 24,8 ± 2,58 0,6 ± 0.16* 0,4 ± 0.16* 5,6 ± 3.75*

BTZ

2

2000 25,3 ± 2,58 0,3 ± 0.15* 0,2 ± 0.13* 0 ± 0.00*

Controle 31,2 ± 3,11 21,4 ± 3,04 25,5 ± 3,03 30,9 ± 1,79 100 23,2 ± 2.17* 12,9 ± 1.49* 16,1 ± 1.20* 23,4 ± 1.38* 300 23,8 ± 2,18 2,7 ± 0.94* 1,3 ± 0.21* 20,1 ± 2.57* 500 25,6 ± 2,52 1,4 ± 0.22* 0,9 ± 0.10* 7,3 ± 2.63* 750 27,9 ± 2.73* 1 ± 0.00* 0,5 ± 0.17* 2,7 ± 1.82* BT

Z 2R

1000 27 ± 2,50 0,7 ± 0.15* 0,5 ± 0.17* 0 ± 0.00*

Controle 28,2 ± 2,74 21,5 ± 3,05 21,9 ± 2,91 30,3 ± 1,97 300 28,4 ± 3,54 25,8 ± 3,36 27,2 ± 2,75 26,9 ± 2,20 1000 26,1 ± 2,71 27,1 ± 3,20 31,9 ± 2.62* 26 ± 3,71 2000 27,7 ± 2,45 1 ± 0.00* 0,7 ± 0.15* 8,5 ± 3.01* 2500 27,6 ± 0,93 1 ± 0.00* 0,7 ± 0.15* 4 ± 2.12*

BTZ

3

3000 27,7 ± 2,45 0,7 ± 0.15* 0,5 ± 0.17* 0 ± 0.00*

* p < 0.05 comparados com os animais do Grupo Controle (ANOVA seguido pelo teste t de Student).



5.3. ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA

5.3.1. METODOLOGIA

5.3.1.1 Método das Contorções induzidas pelo Ácido Acético - Writhing Test

O método das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético foi

desenvolvido para ratos por Vander e Margolin (1956) e posteriormente,

modificado para camundongos por Koster e cols (1959). Neste método foi

avaliado o número de contrações da musculatura abdominal juntamente com a

extensão das patas posteriores, após administração de uma solução 0,6% de

ácido acético.

Os animais foram tratados (i.p.) com a solução controle ou com soluções

dos compostos sintetizados: BTZ-1 (100, 150 e 200 mg/kg), BTZ-2 (30, 50 e

80 mg/kg) e BTZ-3 (100, 150 e 200 mg/kg). Os fármacos morfina (Merk;

10 mg/kg), indometacina (Sigma-Aldrich, USA; 10 mg/kg; v.o.) e dipirona sódica

(Teuto, Brasil; 200 mg/kg) foram utilizados como padrões. Após cada tratamento

(figura 35), foi administrado a solução do ácido (0,1 mL/10g do animal). O número

de contorções foi contado durante 30 minutos. A redução significativa do número

de contorções, comparado ao grupo controle, foi considerada resposta

antinociceptiva.

A = Indometacina; B = Solução dos derivados; C = Solução controle D = Morfina; E = Dipirona Sódica; F = Solução 0,6% Ácido Acético

Figura 35: Ensaio de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6%

45 30 0 30

A B, C, D, E F Contagem das contorções Tratamento

T (minutos)



5.3.1.2 Método da Placa Quente - Hot Plate Test

A atividade antinociceptiva foi avaliada também pelo método placa quente

descrita por Eddy e Leimback (1953). Foi avaliado o tempo que o animal resiste

quando colocado sobre uma placa aquecida a 55°C ± 1,0°C. Sobre a placa foi

colocado um funil de vidro invertido, para contenção do animal (Fig. 36). A

resposta observada foi o ato do animal retirar as patas dianteiras, lambendo-as

em seguida. O tempo decorrido desde que o animal foi colocado sobre a placa

aquecida até o aparecimento da resposta (tempo de latência) foi mensurado

utilizando-se um cronômetro. Foi estabelecido o tempo de corte de 60 segundos

para a permanência máxima do animal na placa, com o objetivo de evitar danos

teciduais às patas dos animais e eventuais interferências nas leituras

subseqüentes. A latência foi medida nos tempos 0, 30, 60, 90 e 120 minutos após

administração dos compostos.

Os animais foram tratados (i.p.) com a solução controle ou com soluções

dos compostos sintetizados: BTZ-1 (100, 150 e 200 mg/kg), BTZ-2 (30, 50 e

80 mg/kg) e BTZ-3 (100, 150 e 200 mg/kg). A morfina (10 mg/kg; i.p.) e

indometacina (10 mg/kg; v.o.) foram utilizados como fármacos padrões.

Figura 36: Aparatos utilizados no Método da Placa Quente.



A = Indometacina; B = Morfina; C = Solução dos derivados; D = Solução controle;

Figura 37: Roteiro do método da placa quente na avaliação da atividade antinociceptiva.

5.3.1.3 Análise Estatística

Os resultados apresentados foram submetidos à análise de variância (one-

way ANOVA), seguido pelos testes de Dunnett ou de Bonferroni, adotando um

intervalo de confiança de 95%. As análises estatísticas foram realizadas

utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0.

5.3.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram avaliados apenas os derivados que não apresentaram nenhum sinal

de toxicidade até a dosagem de 300 mg/kg. Assim, apenas os compostos BTZ-1,

BTZ-2 e BTZ-3 foram avaliados quanto à atividade antinociceptiva.

A tabela 28 e figura 38 apresentam os resultados obtidos no método das

contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6%. Foi observada redução

significativa no número de contorções após a indometacina, morfina e dipirona,

conforme esperado. A Indometacina induziu á redução de aproximadamente

80,1% em relação ao grupo controle, enquanto a morfina e a dipirona reduziram

95,3% e 79,8%, respectivamente. Os compostos BTZ-1 (200 mg/kg) e BTZ-3 (150

e 200 mg/kg) foram capazes de reduzir o número de contorções abdominais, com

percentuais de redução de 21,7%, 24,5% e 48,1%, respectivamente. Estes

60 45 0 30 60 90 120

Tratamento

T (minutos)

A B C, D Leituras



resultados indicam atividade antinociceptiva, porém a redução do número de

contorções está aquém da redução observada para os fármacos padrões

utilizados. Por apresentar maior percentual de redução no número de contorções

(48,1%), atividade antinociceptiva moderada pode ser atribuída ao BTZ-3 na dose

de 200 mg/kg, porém esta redução ainda é insuficiente para seu uso na

terapêutica.

O método das contorções é considerado inespecífico, embora bastante

utilizado em triagens, pois permite a detecção de compostos com atividade

antinociceptiva periférica. O ácido acético induz a dor indiretamente, pois não

estimula os receptores nociceptivos peritoneais de forma direta, agindo liberando

substâncias endógenas que excitam as terminações nervosas, ou seja, produz

inflamação aguda na área peritoneal (GYIRES e KNOLL, 1975).

A tabela 29 apresenta os resultados obtidos no método da placa quente.

Foi observado aumento no tempo de latência para o composto BTZ-1 na dose

200 mg/kg, nos tempos 60, 90 e 120 minutos após a administração. A resistência

dos animais na placa quente também foi significativa para o BTZ-3 nas doses

100 mg/kg (90 minutos) 150 e 200 mg/kg (60, 90 e 120 minutos).

Os animais tratados com o BTZ-3, na dose 100 mg/kg, apresentaram

aumento discreto no tempo de latência (13,1 segundos) quando comparado aos

animais tratados com morfina (29,3 segundos). O composto BTZ-3, 200 mg/kg no

tempos 60, 90 e 120 minutos induziu ao aumento no tempo de latência de

maneira semelhante à indometacina. A indometacina é um analgésico não

esteroidal e demonstra atividade reduzida no método da placa quente, que é

considerado seletivo para compostos com atividade opióide (LE BARS et al.,



2001). A morfina, de acordo com o esperado, aumentou a resistência dos animais

ao calor.

Não houve diferença significativa entre os resultados observados para os

animais do grupo controle ao longo do tempo, o que demonstra a consistência do

método utilizado.

Embora existam muitos relatos das atividades de compostos

benzotiazínicos, este foi o primeiro estudo que avaliou comparativamente o efeito

antinociceptivo in vivo em dois modelos experimentais: método das contorções

induzidas pelo ácido acético e método da placa quente, descritos na literatura

como modelos para avaliação da atividade analgésica central e periférica,

respectivamente (VERMA et al, 2005).

No método da placa quente o calor induz à ação termoceptiva cutânea

(LE BARS et. al., 2001). O estímulo térmico do ensaio da placa quente é utilizado

para avaliar a atividade analgésica mediada por mecanismos centrais

(AL-GHAMDI, 2001). Fármacos opióides e outras drogas com atividade central,

tais como sedativas e hipnóticas, mostraram atividade no modelo da placa quente

(HIRUMA-LIMA et. al., 2000). Hendry e cols (1999) relataram que a integração do

estímulo ocorre devido à estimulação das fibras C de condução lenta, que

apresentam terminais não capsulados de receptores termais e mecânicos e fibras

do tipo Aδ de condução rápida, que induzem o reflexo de retirada da pata através

da ativação de termoreceptores. A latência do reflexo de retirada da pata ocorre

por integração medular (HENDRY et al., 1999).

Atividade antinociceptiva moderada pode ser atribuída ao BTZ-3 na dose

de 200 mg/kg, demonstrada pelo método das contorções abdominais induzidas

pelo ácido acético. No método da placa quente, o aumento no tempo de



permanência dos animais sobre a placa aquecida sugere um efeito analgésico

central (LORO et al,1999; RAMEZANI et al, 2001) para os compostos BTZ-1

(200 mg/kg) e BTZ-3 (150 e 200 mg/kg).

Schiaffella e cols (1999) realizaram estudos sobre relação estrutura-

atividade para compostos benzotiazínicos e demonstraram que os derivados mais

ativos farmacologicamente foram os que apresentaram um grupo metil em N-4,

uma cadeia lateral em C-6, C-7 ou C-8, e um grupo carbonila, enxofre ou

sulfóxido no C-3 do núcleo benzotiazínico. No presente estudo, os resultados

observados estão em acordo com o referido estudo, pois os compostos mais

ativos foram o BTZ-1 e BTZ-3, que possuem o grupo metila na posição 4, uma

cadeia lateral na posição 6 (grupos nitro e benzoilamina, respectivamente) e um

grupo carbonila na posição 3.

Novos trabalhos envolvendo estudos da relação estrutura-atividade podem

ser realizados, atribuindo a atividade à estrutura química dos compostos e

sugerindo novos grupos a serem inseridos como cadeias laterais nas moléculas,

favorecendo o resultado de maiores atividades antinociceptivas nos ensaios com

animais.



Tabela 28: Número total de contorções em 30 minutos induzidas pelo ácido acético 0,6% em camundongos. Os valores representam a média ± e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido do teste Dunnett).

GRUPO Dose N° de Contorções (mg/kg) X. ± e.p.m.

Controle X 21,2 ± 0,60 Morfina 10 1,0 ± 0,16 *

Indometacina 10 4,2 ± 0,19 * Dipirona 200 4,3 ± 0.19 *

BTZ 1 100 22,40 ± 0,40 150 19,80 ± 0,86 200 16,60 ± 1,29 *

BTZ 2 30 24,80 ± 1,53 50 21,80 ± 0,86 80 18,60 ± 0,93

BTZ 3 100 20,20 ± 1,59 150 16,00 ± 1,30 * 200 11,00 ± 0,84 *

* p < 0.01 comparados com os animais do Grupo Controle (ANOVA seguido pelo teste de Dunnett).

0

5

10

15

20

25

30ControleMorfinaIndometacinaDipironaBTZ1 100mg/kgBTZ1 150mg/kgBTZ 1 200 mg/kgBTZ 2 30mg/kgBTZ 2 50mg/kgBTZ 2 80mg/kgBTZ 3 100mg/kgBTZ 3 150mg/kgBTZ 3 200mg/kg

** *

*

*

*

Núm

ero

tota

l de

cont

orçõ

esem

30

min

Figura 38: Número total de contorções (em 30 minutos) induzidas pelo ácido acético 0,6% em camundongos tratados com os fármacos padrões e os derivados sintetizados. Os valores representam a média ± e.p.m. *P≤0,05 comparado ao grupo controle (ANOVA seguido do teste Dunnett).

Avaliação das atividades farmacológicas in vitro


Microrganismos testes ATCC

Candida albicans (C. albicans) ATCC 18804

Candida krusei (C. Krusei) ATCC 6258

Candida parapsilosis (C. parapsilosis) ATCC 22019

Candida tropicalis (C. tropicalis) ATCC 750

6. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO

6.1. METODOLOGIA

6.1.1. Materiais

Foram utilizados os seguintes reagentes e padrões antifúngicos:

DMSO: dimetilsulfóxido - Synth, Brasil

NaOH: Hidróxido de sódio (1N) - Vetec

MOPS: solução de ácido-4-morfolino-propanosulfônico - Vetec

GLICOSE: d(+)-glucose monohidratada; Merck

RPMI 1640: (10,4 g/L) - Sigma-Aldrich

FLUCONAZOL: Pfizer, New York

TERBINAFINA: Novartis, Brasil.

6.1.2. Métodos

6.1.2.1 Preparo da cultura de fungos

Foram utilizados os fungos leveduriformes de acordo com a CLSI M27-A2,

para as cepas padrões da ATCC - American Type Culture Collection.

Tabela 30: Registros da ATCC para os fungos leveduriformes utilizados neste estudo.



6.1.2.2 Preparo do meio RPMI 1640

O RPMI 1640 é um meio de cultivo sintético definido para testes de fungos,

devido a exemplos da adequação desse meio aos testes de sensibilidade da

levedura aos agentes antifúngicos. O método da microdiluição em caldo é

realizado em placas de microtitulação, para determinar a CIM, de acordo com a

Norma M-27-A2 do Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility

Testing of Yeast do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2002).

O RPMI 1640 contém 0,2% de glicose, porém, é necessária uma

concentração um pouco maior para propiciar um crescimento mais adequado aos

fungos. Com este intuito, adicionou-se um excesso de glicose (18 g) e MOPS

(34,53 g), e neutralizou-se o pH com solução de NaOH 1N.

6.1.2.3 Padrões antifúngicos

Os antifúngicos utilizados como padrões de referência (controle positivo)

foram o fluconazol e a terbinafina. Estes padrões foram preparados em uma

solução estoque e posteriormente diluídos, resultando nas concentrações finais

128; 64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5 e 0,25 µg/mL para o fluconazol e 16; 8; 4; 2; 1; 0,5;

0,25; 0,125; 0,062; 0,031 µg/mL para a terbinafina.

6.1.2.4 Soluções dos derivados benzotiazínicos

Os derivados sintetizados foram solubilizados inicialmente em DMSO, de

forma a obter-se uma solução-estoque. As concentrações intermediárias foram

preparadas diluindo-se a solução-estoque no meio apropriado, de forma a resultar

em concentrações finais de 512; 256; 128; 64; 32; 16; 8; 4; 2 e 1 µg/mL.



6.1.2.5 Padronização dos inóculos.

As amostras de Candida spp. foram cultivadas em tubos contendo ágar

Sabouraud sólido e incubadas a 28ºC durante 24 horas. A massa de célula obtida

foi recolhida com alça estéril e ressuspensa em tubos contendo 5 mL de salina

0,85% estéril.

Após homogeneização, a determinação do número de células foi realizada

de acordo com a Escala de Mac-Farland, tubo 3.

6.1.2.6 Determinação da concentração inibitória mínima.

Para determinar a concentração inibitória mínima, foram utilizadas placas

estéreis de fundo reto e com tampa com 96 orifícios. Em cada orifício foram

dispensados 100 µL da concentração da solução do derivado benzotiazínico em

teste, e 100 µL do inóculo de cada amostra de Candida spp..

Foram adicionados 200 µL do meio RPMI aos orifícios de controle de

crescimento, contendo apenas o inóculo (controle positivo) , bem como aqueles

contendo os fármacos, mas isento do inóculo de Candida spp. Todas as

concentrações foram testadas em duplicata. Após incubação a 35º C, foram

realizadas leituras de 24 e 48 horas.

6.1.2.7 Leitura dos resultados

No método de diluição em caldo RPMI 1640, após o período de incubação, a

concentração mínima inibitória foi definida como sendo a menor concentração do

produto na qual não se observa crescimento visível. A leitura foi feita visualmente,

sem utilização de aparelhos.



6.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos últimos anos tem sido grande a incidência de infecções causadas por

espécies de Candidas que apresentam resistência microbiana no uso de

antifúngicos para tratamento das doenças. Tal fato torna necessário o

desenvolvimento de pesquisas para novos medicamentos antifúngicos. Por este

trabalho se iniciar com a síntese de cinco compostos derivados da benzotiazina,

supostamente ativos à Candida spp., segundo relatos da literatura, os

microrganismos estudados foram escolhidos devido à preocupação em suprir a

necessidade de um fármaco potencial frente às Candidiasis.

O método de diluição em caldo, embora mais trabalhoso, fornece dados

mais precisos sobre a sensibilidade dos microrganismos, tornando-se a melhor

opção em pesquisas voltadas à descoberta de compostos potencialmente ativos

contra microrganismos.

Foram testadas 10 diluições de cada derivado benzotiazínico sintetizado

neste trabalho, além das diluições de dois fármacos utilizados no mercado: o

fluconazol, representando a classe dos antifúngicos azólicos, e a terbinafina,

representando o grupo das alilaminas.

Os resultados obtidos estão apresentados na tabela 30 e figuras 39 a 43.

Na determinação da concentração inibitória mínima para o BTZ-1,

observou-se que este apresentou atividade frente à C. albicans, C. krusei e

C. parapsilosis à concentração de 32 µg/mL, sendo a CMI frente a C. tropicalis

equivalente à 256 µg/mL. Observa-se que os valores para a CMI do BTZ-1 são

muito maiores que a registrada para os padrões fluconazol e terbinafina, porém

este resultado está de acordo com experimentos realizados por Fringuelli (1998),

onde foi observada a CIM de 46 µg/mL para um derivado benzotiazínico



sintetizado, sendo que outros derivados apresentaram concentração inibitória

mínima superior a 250 µg/mL.

Para os compostos BTZ-1R e BTZ-2R, a concentração inibitória mínima foi

de 256 µg/mL, frente às cepas testadas. Supõe-se que estes resultados podem

estar relacionados ao grupo amino presente na estrutura de ambos os compostos.

Semelhante aos compostos BTZ-1, BTZ-1R e BTZ-2R, o derivado BTZ-2,

4-metil-6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona, apresentou CMI de 256 µg/mL para

C. tropicalis e CMI de 128 µg/mL para as demais espécies testadas.

Conforme pode ser verificado na tabela 30, o derivado benzoilado BTZ-3

não resultou em atividade às espécies testadas, pois apresentou CMI superior a

512 µg/mL.

A toxicidade é um dos principais fatores a ser levado em consideração no

momento da escolha de um agente químico para uso em humanos e/ou animais.

Isto se deve ao fato de que o processo de desinfecção pode acarretar desde

irritação de mucosas e pele, até intoxicações, e com isso embora diminua a

concentração de microrganismos, aumenta a predisposição do indivíduo à

enfermidades (BRASIL, 1999). In vitro nenhum dos derivados testados

apresentou efeito tóxico às leveduras, pois para todos os compostos foi

comprovado o crescimento da microbiota.

Destaca-se que o aumento na incidência das micoses sistêmicas

intensificou a busca por antifúngicos de amplo-espectro, de ação fungicida e

causadores de poucos efeitos adversos. Como conseqüência, novos azóis e

fármacos com mecanismo de ação inovador foram desenvolvidos, além de haver

uma ampla variedade destes em desenvolvimento, como os derivados da

benzotiazina. Dentre estes derivados, destacou-se o composto BTZ-1, que



necessitou de uma concentração menor que os outros derivados para inibir o

crescimento das leveduras do gênero Candida, principalmente a C. albicans,

C. krusei e C. parapsilosis.

Tabela 31: Concentração inibitória mínima (µg/mL) para os derivados da 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona.

Leveduras C. albicans Candida krusei C. parapsilosis C. tropicalis

Padrões:

Fluconazol 0,5 0,5 1,0 8,0

Terbinafina 2,0 1,0 2,0 16,0

Compostos testados:

BTZ - 1 32,0 32,0 32,0 256,0

BTZ - 1R 256,0 256,0 256,0 256,0

BTZ - 2 126,0 126,0 126,0 256,0

BTZ - 2R 256,0 256,0 256,0 256,0

BTZ - 3 > 512,0 > 512,0 > 512,0 > 512,0



Figura 39: Resultado da determinação da CIM para o 6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona. (A)- Fluconazol e (B) - Terbinafina.

Figura 40: Resultado da determinação da CIM para o 6-amino-2H-1,4-benzotiazin-3-ona; (A)-Fluconazol e (B) - Terbinafina.

Figura 41: Resultado da determinação da CIM para 6-amino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona; (A)- Fluconazol e (B) - Terbinafina.

B A

B A

A B



Figura 42: Resultado da determinação da CIM para o 4-metil-6-nitro-2H-1,4-benzotiazin-3-ona; (A)- Fluconazol e (B) - Terbinafina.

Figura 43: Resultado da determinação da CIM para o 6-benzoilamino-4-metil-2H-1,4-benzotiazin-3-ona; (A)- Fluconazol e (B) - Terbinafina.

A B

B A

Conclusões


7. CONCLUSÕES

O método utilizado nas sínteses dos derivados foram satisfatórios,

conduzindo a bons resultados, principalmente nos compostos não-reduzidos,

cujos rendimentos foram superiores a 83%. Os compostos reduzidos, por se

encontrarem na forma de cloridratos, resultaram em rendimentos acima de 63%,

considerados satisfatórios.

As análises espectrométricas dos compostos sintetizados revelaram a

presença dos principais grupos presentes em cada composto, confirmando assim

as estruturas dos mesmos quando comparados aos dados relatados na literatura.

No estudo toxicológico, constatou-se que a metilação em N-4 aumentou a

toxicidade dos compostos, assim como a redução do grupo nitro à amino. Este

estudo possibilitou um melhor conhecimento sobre esta classe de compostos,

que se encontra pouco explorada em relação aos efeitos tóxicos que induzem.

Nos experimentos in vivo, a redução da motilidade foi observada para os

animais que receberam os compostos BTZ-1, BTZ-1R e BTZ-2, em todas as

dosagens, e para os que receberam o BTZ-2R a partir de 300 mg/kg. O composto

BTZ-3 induziu aumento na motilidade nas doses 300 e 1000 mg/kg, porém, em

doses maiores, a atividade locomotora foi reduzida.

Na avaliação da atividade farmacológica, foram utilizados modelos para

avaliar a atividade antinociceptiva dos derivados BTZ-1, BTZ-2 e BTZ-3. No

método das contorções induzidas pelo ácido acético 0,6%, o composto BTZ-3

(200 mg/kg) reduziu significativamente as contorções (48,1%). Como esperado, a

morfina apresentou maior eficácia antinociceptiva (95,3%), seguida pela

indometacina (80,1%) e pela dipirona (79,8%).

Conclusões


No método da placa quente, o BTZ-1 e o BTZ-3, ambos nas doses de

200 mg/kg, aumentaram o tempo de latência dos animais, sugerindo um efeito

analgésico periférico.

Nos experimentos antifúngicos in vitro, destaca-se a atividade antifúngica

do composto BTZ-1 frente às cepas Candida albicans, Candida Krusei e Candida

parapsilosis, com 32 µg/mL de CIM. Como os microrganismos estão em constante

mutação quando se trata de resistência aos fármacos usados na terapêutica,

sugere-se, dentro de alguns anos, novos ensaios com estes derivados

sintetizados, objetivando compostos mais ativos frentes às cepas selecionadas.

Os resultados encontrados nos ensaios realizados, associados aos

estudos precedentes relatados na literatura, justificam novas pesquisas, tanto

para avaliar a toxicidade e atividades biológicas em compostos modificados

estruturalmente, fornecendo importantes informações na relação estrutura-

atividade, quanto para avaliar outras atividades farmacológicas.

Referências Bibliográficas


8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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