simpósio de sanidade avícola (avisulat/ufsm) iv congresso sul brasileiro de avicultura,...

Simpósio de Sanidade Avícola (AVISULAT/UFSM)IV Congresso Sul Brasileiro de Avicultura, Suinocultura e Laticínios

Thales Quedi Furian

5 de Novembro - 2014

Atualidades em Cólera Aviária

• Uma das patologias aviárias mais antigas;

• Diagnóstico diferencial de enfermidades com notificação obrigatória;

Casos frequentes entre pequenas criações independentes

Cólera Aviária

Grande concentração de unidades de produção

Alta densidade populacional aviários

+

Mas também é uma preocupação para a avicultura industrial....

(Fotos: SOARES, 2009; JÚNIOR, 2009)

Cólera Aviária




Baixos níveis de biosseguridade


Cólera Aviária

Doenças respiratórias





Cólera Aviária


Doenças respiratórias

Diferentes hospedeiros e cronicamente

infectados






Cólera Aviária

Denominação do gênero emhomenagem a Louis Pasteur

Família Pasteurellaceae

• 10 gêneros (Pasteurella, Actinobacillus, Haemophilus, Avibacterium);(MUHAIRWWA et al., 2001; SNIPES et al., 2002; LEOTA et al., 2006, NASCIMENTO et al., 2009)

(HARPER et al., 2006)

- constantes reclassificações taxonômicas;

“A bactéria Pasteurella multocida é um patógeno enigmático” (WILKIE et al., 2012)

número de síndromes relacionadas e de hospedeiros acometidos;

agente primário (rinite atrófica, septicemia hemorrágica, cólera aviária)

• Bacilo Gram negativo;

• Imóvel, não formador de esporos;

• Coloração bipolar típica;

• Anaeróbio facultativo;

Figura 1. Micrografia eletrônica – Pasteurella spp

Figura 2. Coloração esfregaço sanguineo – P. multocida

(CHRISTENSEN; BISGAARD, 2006; GLISSON, 2008 )

Pasteurella multocida

• anorexia, cianose, estertores, descargas nasais, diarréia, morte súbita;• petéquias, hemorragias, ausência lesões;

Cólera Aviária

• lesões edematosas/inflamatórias associadas com o local de infecção;• lesões no sistema reprodutivo;

Forma aguda Forma crônica

Fot

os: C

OR

NE

LL

UN

IVE

RSI

TY

, C

DPA

/UF

RG

S)

Aves silvestresDescrita em mais de 100 espécies

Epidemiologia

Aves entre 16-40 semanasmais susceptíveis

Lotes clinicamente recuperadosReservatório do agente

Aves aquáticas

Mamíferos

(PETERSEN et al., 2001) (SAMUEL et al., 2007)

(MUHAURWA et al., 2001)(WILKIE et al., 2012)

Como realizar o diagnóstico laboratorial atualmente?

Isolamento convencional

(A laboratory manual for the isolation, identification and characterization of avian pathogens - GLISSON et al., 2008)

BHI

Ágar Sangue5% sangue ovino desf.

Ágar MacConkey

37o C 24 horas

37o C 24 horas

Testes bioquímicos

Teste Catalase

Teste Oxidase

Colôniascompatíveis

37o C 24 horas

BHI

anaerobiose

aerobiose

Coloração Gram/Azul de metileno

FígadoPulmão

Sangue cardíacoMedula óssea

• Meios de isolamento: ágar sangue, TSA, DSA

- 5% soro sanguíneo;

• Colônias geralmente acinzentadas e lisas;

• Inoculação em camundongos;

- morte em 24 a 48 horas;

(Fonte: CDPA/UFRGS, 2008)

Figura 3. Colônias de Pasteurella multocida isoladas de diferentes hospedeiros

Aves - UFRGS Bovinos - UFRGS

Suínos - UFRGS ATCC 29545 (CHRISTENSEN et al., 2007)

Diagnóstico

• Algumas dificuldades entre os testes fenotípicos

- Isolamento regiões contaminadas;

- Período para obtenção de subcultivos puros;

- Questão bem estar animal;

Métodos moleculares de diagnóstico

Diagnóstico

Detecção do gene pls

Detecção do gene kmt

(KASTEN et al., 1997)

(LEE et al., 2000)

(LIU et al., 2004)

Detecção dos genes pm0762/pm231

Ensaio 5’ Taq nuclease

(CORNEY et al., 2007)

(TOWNSEND et al., 1998)

Variação método extração DNA






Diagnóstico




(LEE et al., 2000)

(LIU et al., 2004)





Variação método extração DNA Preservação

Amostras liofilizadas






Diagnóstico




(LEE et al., 2000)

(LIU et al., 2004)






Congeladas a -80oC

sangue total ovino






Diagnóstico




(LEE et al., 2000)

(LIU et al., 2004)






Congeladas a -80oC

soro bovino + 7,5% de glicose(LAPAGE & REDWAY, 1974)






Diagnóstico




(LEE et al., 2000)

(LIU et al., 2004)






Congeladas a -80oC

BHI+ glicerol






Diagnóstico




(LEE et al., 2000)

(LIU et al., 2004)






Congeladas a -20oC

soro bovino + 7,5% de glicose sangue total ovinoBHI+ glicerol

Patogenia

Habitante normal dasvias aéreas Cólera

Aviária

Agente

AmbienteHospedeiro

Manejo inadequado

Nutrição deficiente

Infestação parasitária

Infecções concomitantes

(MUHAIRWA et al., 2000; SAMUEL et al., 2007; WILKIE et al., 2012)

Trato respiratório superiorPrincipal sítio

Infecção do pulmãoe sacos aéreos

Disseminação paradiferentes tecidos

Corrente sanguínea

MorteChoque septicêmico

Patogenia e a virulência das cepasPatogenia e a virulência das

cepas

Sítio inicial de colonização

Vacinação ideal

Patogenicidade das cepas

?

?

Invasão da mucosas

Vacinas vivas e inativadas

Microrganismos oportunistas em

vertebrados

?

?

?(CHRISTENSEN; BISGAARD, 2006; DZIVA et al., 2008; HARPER et al., 2010)

Após mais de 125 anos dos trabalhos desenvolvidos por Pasteur...

3511 document results

Acesso em 10/10


Acesso em 10/10

“A manipulação genética de P. multocida deve auxiliar na elucidação dos mecanismos patogênicos e da associação com diferentes hospedeiros.”

Ian Wilkie – 2012Department of MicrobiologyAustralian Research Council Centre of Excellence in Structural andFunctional Microbial Genomics, Monash University, Australia

• menor uso de ferramentas de manipulação/análise genética nos últimos 25 anos;

• primeiro sequenciamento completo do genoma em 2001;

Cepa Completo Hospedeiro/tecido

Genoma (Mbp) G+C

Pm70 sim ave 2.26 40.40

36950 sim bovino/pulmão 2.35 40.44

Anand1G não caprino 2.29 40.52

Anand1P não ave/fígado 2.02 40.22

P3480 não suíno/pulmão 2.08 40.15

X73 não ave 2.31 40.31

VP161 não ave 2.26 40.21

P903 não suíno 2.35 40.14

M1404 não Bovino 2.30 40.27Boyce et al., 2012

Tabela 1. Característica do genoma das cepas de Pasteurella multocida sequenciadas

Isolados de CA

(May et al., 2001)

Todas as cepas são fortemente relacionadas;

Análise filogenética

Não há correlação entre o parentesco filogenético e o local de isolamento, o sorogrupo ou o hospedeiro de origem das amostras;

Como e por que classificar os isolados de P. multocida?

P. multocida subsp. multocida subsp. septicasubsp. gallicida

Testes fenotípicos para classificação da subespécie e do biovar

• Biotipificação: fator chave na identificação de P. multocida;(DZIVA et al., 2008 )

(MUTTERS et al., 1985 )

Teste P. multocida P. septica P. gallicida

Dulcitol - - +

Sorbitol + - +

• Enzima α-glicosidase e sequenciamento de genes housekeeping;(HUNT et al., 2001; KUHNERT, P & KORCZAK, B.M., 2006 )

Tabela 2. Características bioquímicas para diferenciação de subespécies de Pasteurella multocida

Fermentação 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14

Xilose - + + - + - + + + + + + +

Maltose - - - - - - - - - + - - -

Ornitina + + + + + + + + - + + - -

Trehalose - + - + - - + - + + - - -

Sorbitol + + + + - - - + + - + + +

Dulcitol - - - - - - - + - - - - -

Lactose - - - - - - - - - - + - +

(FEGAN et al., 1995; BLACKALL et al., 1997)


• Classificação das amostras em 13 diferentes biovares

Tabela 3. Características bioquímicas dos biovares de Pasteurella multocida

Subespécie Percentual (%)

multocida 87,50

septica 10,71

gallicida 1,79

Total 100

(Dados não publicados, 2014)

Biovar Percentual (%)

1 8,93

2 7,14

3 35,71

4 1,79

5 3,57

7 1,79

8 1,79

9 12,50

10 3,57

13 23,21

NT 0,00

Total 100

Levantamento – região sul do Brasil isolados de cólera aviária



1 8,93

2 7,14

3 35,71

4 1,79

5 3,57

7 1,79

8 1,79

9 12,50

10 3,57

13 23,21

NT 0,00

Total 100

MUHAIRWA et al., 2001

PEDERSEN et al., 2003

LEOTTA et al., 2006


multocida 87,50

septica 10,71

gallicida 1,79

Total 100




1 8,93

2 7,14

3 35,71

4 1,79

5 3,57

7 1,79

8 1,79

9 12,50

10 3,57

13 23,21

NT 0,00

Total 100

FEGAN et al., 1995

VARGA et al., 2013


multocida 87,50

septica 10,71

gallicida 1,79

Total 100


Biovar 2: hgbB-; pfhA+

Biovar 3: hgbB+; pfhA-



1 8,93

2 7,14

3 35,71

4 1,79

5 3,57

7 1,79

8 1,79

9 12,50

10 3,57

13 23,21

NT 0,00

Total 100

Não houve associação entre os biovares e a presença de 23 genes de virulência pesquisados (p˃ 0,05)


• Grande número de isolados não tipificáveis;

• Variações de reprodutibilidade dos testes;

• Menor poder discriminatório

Limitações

(MATSUMOTO & STRAIN; 1993; VARGA et al., 2007; DZIVA et al., 2008 ; GARCIA et al., 2011)

Combinada com técnicas moleculares de tipificação

Tipificação molecular

• Tipificação: isolados compartilham propriedades que os diferenciam;

Testes moleculares X testes de biotipificação


( MUHAIRWA et al., 2001; CHRISTENSEN & BISGAARD, 2006)

Testes moleculares X testes de biotipificação

Análise de enzima de restrição - REA

Ribotipagem

Análise do Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso - RAPD

Sequência Palindrômica Repetitiva - REP

Análise do Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição - RFLP

Tipificação por sequenciamento de múltiplos loci - MLSTDife

renc

iaçã

o de

cep

as d

e P.

mul

toci

da


• Técnica de PCR-RFLP em P. multocida;

- discriminação do gene ompH;

- estrutura do lipopolissacarídeo;(BOROWSKI et al., 2001; JABBARI et al., 2005; SELLYEI et al., 2013)

(TSAI et al., 2011)

• Amplificação dos genes ompH (Sellyei et al., 2013); oma87 (Furian et al., 2013);


Figura 1. Eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo - produto de amplificação gene ompH (aprox. 1000 pb). A seta preenchida indica fragmento de 500pb.

Restriction mapper version 3

GenBank U50907 – ompH gene strain X-73

DraI

HindIII

PvuII

5’-TTT AAA-3’3’-AAA TTT-5’

5’-A AGCT T-3’3’-T TCGA A -5’

5’-GTPy PuAC-3’3’-CApu PyTG-5’

IVIVI V V VIVVIIIIII PMPMFigura 2. Perfis gerados (I-VII) das cepas de Pasteurella multocida de origem aviária a partir da clivagem do produto de amplificação do gene ompH com as enzimas DraI e HindIII

PCR-RFLP

Grupo genético

Frequênciarelativa (%)

I 12,28II 42,11III 3,51IV 3,51V 17,54VI 8,77VII 12,28

Perfis gerados (I-VII) das cepas de Pasteurella multocida de origem aviária a partir da clivagem do produto de amplificação do gene ompH com as enzimas DraI e HindIII

Associação do perfil VII com o biovar 13;

Alta homologia de alguns perfis com determinados sorotipos;

Perfil II

Sorotipo 3

Perfil VII

Sorotipo 11

Sorotipo 3,4

Sorotipo 2

Perfil III

Sorotipo 4

Sorotipo 9

Sorotipo 15

Sorotipo 4

Sorotipo 5,16

Perfil V

Sorotipo 10

Sorotipo 12

Sorotipo 14

Sorotipo 6

Sorotipo 7

Sorotipo 8

Sorotipo 13

Perfil VI

Figura 3. Relação filogenética da sequência nucleotídica de 638pb do gene ompH entre os perfis gerados através de PCR-RFLP e os diferentes sorotipos de Pasteurella multocida

Kruskall-Wallis test (p<0,01)

Distribuição do índice de patogenicidade versus perfil genético de isolados de origem aviária de Pasteurella multocida

6,05

8,97

5,81

4,03

8,77

5,62

Grupo genético IP médio

I 6,05a

II 8,97b

III/IV 8,77b

V 5,81a

VI 4,03a

VII 5,62a

• Métodos de classificação de P. multocida são empregados em estudos epidemiológicos e na diferenciação de cepas isoladas em surtos (DZIVA et al., 2008).

• A variabilidade antigênica dificulta o estabelecimento de uma vacina eficiente (DAVIES et al., 2003).

Importante determinar os sorotipos de P. multocida: bacterinas protegem pobremente contra desafios das cepas heterólogas.

• Cápsula e LPS: base para a classificação de P. multocida

• Classificadas em cinco sorogrupos (A, B, D, E, F)

• Classificadas em 16 sorovares

• Casos de CA predominantes: sorogrupo A e sorovares 1-3 ou 3-4;

antígenos capsulares;

antígenos somáticos;

(BISGAARD, 2008; HARPER et al., 2012)

Cápsula

Heparina

Glicosaminoglicanos idênticos aos componentes da matriz celular

da célula eucariótica

Pode não ocorrer resposta imune do hospedeiro

(DAVIES et al., 2004; BOYCE et al., 2010)

N-acetil-glicosaminaÁcido glicurônico

Ácido hialurônico

Condroitina

Cápsula

• Resistência à dessecação;

• Maior adesão (?);

• Atividade antifagocitária;

• Interação com o sistema complemento;

• Importante papel na interação com o organismo infectado

cepas com cápsula X mutantes acapsulares

(JACQUES et al., 1993; PRUIMBOOM et al., 1996; CHUNG et al., 2001,;BOYCE et al., 2010; HARPER et al., 2012)

Métodos de tipificação capsular e relação com a patogenicidade

• Classificação fundamental:

- relação entre tipo capsular, patogenia e predisposição do hospedeiro a um

sorogrupo;rinite atrófica septicemia hemorrágica cólera aviária

tipo D tipo B ou E tipo A

(JAGLIC et al., 2005; WOO;KIM , 2006; HAPER et al., 2012)

• Prevalência pode variar conforme a distribuição geográfica e ao longo do tempo;

Métodos de tipificação capsular e relação com a patogenicidade

(CARTER & RUNDELL, 1973; CARTER & SUBRONTO, 1973; GLISSON et al., 2008; BORRATHYBAY et al., 2003)

• Tipificação: teste de hemaglutinação indireta

- isolados podem não aglutinar com antissoros homólogos;

- depende da presença do antígeno capsular;

• Métodos fenotípicos não-sorológicos

- Teste da hialuronidase: amostras do tipo A despolimerização do ácido hialurônico

- Teste da acriflavina: amostras do tipo D floculação em caldo

- microscopia com luz oblíqua colônias iridescentes

- microscopia eletrônica espessura da cápsula

(CARTER, 1955)

patogenicidade

Cepa Completo Hospedeiro/tecido

Genoma (Mbp) G+C

Pm70 sim ave 2.26 40.40

36950 sim bovino/pulmão 2.35 40.44

Anand1G não caprino 2.29 40.52

Anand1P não ave/fígado 2.02 40.22

P3480 não suíno/pulmão 2.08 40.15

X73 não ave 2.31 40.31

VP161 não ave 2.26 40.21

P903 não suíno 2.35 40.14

M1404 não Bovino 2.30 40.27

Boyce et al., 2012

Tabela 1. Característica do genoma das cepas de Pasteurella multocida sequenciadas

locus de biossíntese da cápsula B:2(Boyce et al., 2000)

locus de biossíntese da cápsula A:1(Chung et al., 1998)

Cápsula

(adapatado de: BOYCE et al., 2000)

• Região 1: proteínas para transporte dos polissacarídeos da cápsula;

• Região 3: enzimas para fosforilação;

• Região 2: enzima para biossíntese dos monômeros de açúcar;

cexA cexB cexC cexD lipA bcbI bcbH bcbF

lipB

bcbG bcbE bcbD bcbC bcbB bcbA

hexA hexB hexC hexD hyaA hyaB hyaC hyaD hyaE

phyA phyB

Pasteurella multocida A:1

Pasteurella multocida B:2

(CHUNG et al., 1998, BOYCE et al., 2010)

Região 01 Região 02 Região 03

AnáliseSorogrupo

A (%) D (%) NT (%) Total (%)

Testes fenotípicos 41 (75,93)a 2 (3,7)a 11 (20,37)a 54 (100)

Multiplex-PCR 49 (90,74)b 3 (5,56)a 2 (3,7)b 54 (100)

X2 (1) = 4,267 p= 0,034 (p<0,05)

Tabela 4. Tipificação capsular de 54 isolados de Pasteurella multocida de origem aviária com testes fenotípicos não sorológicos e multiplex-PCR

Leotta et al. (2006), Shivachandra et al. (2006), Jabbari et al. (2006)

Fatores de virulência

• Cápsula e LPS

• Fímbrias e adesinas

• Proteínas externas de membrana

• Toxina dermonecrótica

(ptfA, pfhA, hsf-1, tadA)

(ompH, oma87, ompA, plpB)

(toxA)

(nanH, nanB)

(sodA, sodC)

(hgbA, hgbB, exBD-tonB, fur);

• Sialidases;

• Superóxido dismutase;

• Relacionados ao metabolismo do ferro;

• Cápsula e LPS






(toxA)

(nanH, nanB)

(sodA, sodC)


• Sialidases;



FHA

PtfA


(adaptado de HATFALUDI et al., 2010)

• Cápsula e LPS






(toxA)

(nanH, nanB)

(sodA, sodC)


• Sialidases;




OmpHOma87

(adaptado de HATFALUDI et al., 2010)

• Cápsula e LPS






(toxA)


(nanH, nanB)

(sodA, sodC)


• Sialidases;



• Sialidases;




• Cápsula e LPS






(toxA)

GlicolipídeoGlicoproteína

Porçãolipídica

Porçãolipídica

Porçãoglicosídica

(adaptado de FÁTIMA et al., 2005)

(nanH, nanB)

(sodA, sodC)


• Sialidases;




• Cápsula e LPS






(toxA)

Cu

Zn

Ligaçãodissulfeto

(nanH, nanB)

(sodA, sodC)


• Sialidases;




• Cápsula e LPS






(toxA)

(adaptado de KREWULAK; VOGEL, 2008)

Transferrina Sideróforos Hemoglobina

Periplasma

Citoplasma

Complexo energético TonB

(nanH, nanB)

(sodA, sodC)


Processo ou enzima GeneFrequência absoluta e relativa

(%) – cepas aviáriasFrequência absoluta e relativa

(%) – cepas suínas

Proteínas de membrana externa

ompH 96% 98%oma87 100% 100%ompA 61% 95%plpB 98% 98%psl 96% 98%

Metabolismo do ferro

exbD-tonB 98% 98%fur 96% 98%

hgbA 98% 92%hgbB 93% 58%

SialidasesnanH 95% 85%nanB 98% 100%

Superóxido dismutasessodA 96% 100%sodC 96% 100%

Hyaluronic synthetase pmHAS 88% 92%

Toxina dermonecrótica toxA 0% 3%

Adesinas

ptfA 96% 98%pfhA 63% 53%tadD 38% 85%hsf-1 50% 20%

Tabela 5. Distribuição de 22 genes associados à virulência em Pasteurella multocida detectados por m-PCR conforme o hospedeiro de origem

Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)

• A maioria dos genes de virulência apresenta uma distribuição regular;

• Alguns genes estão associados com a presença de pasteurelose

(EWERS et al., 2006; BETHE et al., 2009; TANG et al., 2009)

tbpA+, pfhA+, hgbB+ toxA+

• Em aves não existem relatos de acordo com o status sanitário dos animais

• Alguns genes estão associados a determinados sorogrupos:

Sorogrupo A

pfhA+, pmHAS+, hsf-1-

Sorogrupo D

toxA+, pmHAS-, hsf-1-

Tabela 6. Frequência absoluta e relativa (%) dos genes associados à virulência detectados por PCR conforme os sorogrupos A e D de Pasteurella multocida

GeneSorogrupo A

(gene hyaD-hyaC)(n=88)

Sorogrupo D (gene dcbF)

(n=6)

ompH 85 (97%) 6 (100%)

ompA 65 (74%) 6 (100%)

plpB 86 (98%) 6 (100%)

psl 86 (98%) 5 (83%)

exbD-tonB 86 (98%) 6 (100%)

fur 85 (97%) 6 (100%)

hgbA 84 (95%) 6 (100%)

hgbB 67 (76%) 6 (100%)

nanH 79 (90%) 6 (100%)

nanB 87 (99%) 6 (100%)

sodA 86 (98%) 6 (100%)

sodC 86 (98%) 6 (100%)

pmHAS 86 (98%)b 0 (0%)b

toxA 0 (0%) 1 (17%)a

ptfA 85 (97%) 6 (100%)

pfhA 56 (64%)a 0 (0%)a

tadD 53 (60%) 0 (0%)a

hsf-1 28 (32%)b 6 (100%)a

Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)

aem negrito: associação significativa (p<0.05)bem negrito: associação significativa (p<0.001)

ompH toxA ptfA nanHexbD-

tonB sodA pfhA hgbA sodC nanB hgbBoma8

7hsf-1 fur pmHAS psI ompA plpB tadA

ompH 100

toxA 1 100

ptfA 97 1 100

nanH 93* 100 90 100

exbD-tonB 100* 100 98 100* 100

sodA 98 100 98 99 98 100

pfhA 58 0 57 60 59 59 100

hgbA 96 100 96 99* 96 96 100* 100

sodC 99 1 98 99 99* 98 100 98 100

nanB 100* 100 99 100 100* 99 100 99 100* 100

hgbB 78 100 78 80 78 78 77 82* 78 78 100

oma87 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

hsf-1 36* 100 38 33* 36 37 38 35* 36 37 42 38 100

fur 99* 100 97 99* 99* 97 96 97 98 98* 96 97 92* 100

pmHAS 90 0 90 89 89 89 98* 90 89 90 87 90 78* 90 100

psl 99* 100 97 99* 99* 97 98 97 98 98* 96 97 92* 99* 98 100

ompA 77* 100 76 76* 44 75 63* 74 77 76 68* 75 39** 77* 73 76 100

plpB 100* 100 98 100* 100** 98 98 98 99 99* 97 98 94 100* 98 100* 100 100

tadD 60 0 58 57* 59 56 48* 55 59 58 45** 57 28* 59* 62* 59 74* 59 100

Tabela 7. Percentual de genes associados aos pares entre 96 cepas de Pasteurella multocida analisadas

*em negrito: indica associação significativa (p<0.05)**em negrito: indica associação significatava (p<0.001) Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)

ompH toxA ptfA nanHexbD-

tonB sodA pfhA hgbA sodC nanB hgbBoma8

7hsf-1 fur pmHAS psI ompA plpB tadA

ompH 100

toxA 1 100

ptfA 97 1 100

nanH 93* 100 90 100

exbD-tonB 100* 100 98 100* 100

sodA 98 100 98 99 98 100

pfhA 58 0 57 60 59 59 100

hgbA 96 100 96 99* 96 96 100* 100

sodC 99 1 98 99 99* 98 100 98 100

nanB 100* 100 99 100 100* 99 100 99 100* 100

hgbB 78 100 78 80 78 78 77 82* 78 78 100

oma87 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

hsf-1 36* 100 38 33* 36 37 38 35* 36 37 42 38 100

fur 99* 100 97 99* 99* 97 96 97 98 98* 96 97 92* 100

pmHAS 90 0 90 89 89 89 98* 90 89 90 87 90 78* 90 100

psl 99* 100 97 99* 99* 97 98 97 98 98* 96 97 92* 99* 98 100

ompA 77* 100 76 76* 44 75 63* 74 77 76 68* 75 39** 77* 73 76 100

plpB 100* 100 98 100* 100** 98 98 98 99 99* 97 98 94 100* 98 100* 100 100

tadD 60 0 58 57* 59 56 48* 55 59 58 45** 57 28* 59* 62* 59 74* 59 100

Tabela 7. Percentual de genes associados aos pares entre 96 cepas de Pasteurella multocida analisadas

*em negrito: indica associação significativa (p<0.05)**em negrito: indica associação significatava (p<0.001) Submetido a Brazilian Journal of Microbiology (out.2014)

Houve associação significativa na combinação da presença dos genes de virulência em 45 situações.

cólera aviária

saúde animal

Habitante normal das vias aéreas(MUHAIRWA et al., 2000; SAMUEL et al., 2007; WILKIE et al., 2012)

?? ??

cólera aviária

saúde animal

Habitante normal das vias aéreas(MUHAIRWA et al., 2000; SAMUEL et al., 2007; WILKIE et al., 2012)

?? ??

A bactéria é patogênica?

?BIOVAR 3 BIOVAR 13

multocidaseptica gallicida

BIOVAR 2

A:1

A1:3

sorogrupo D

cápsula tipo F

colônia iridescente

pfhA+

hgbA+

toxA+

hgbB+Β-hemólisefur

nanH

Dendrograma com a relação de cepas de P. multocida conforme o perfil de

virulência

Genoma Pm70 Alinhamento e comparação da sequência de aminoácidos da

proteína OmpH da cepa P52 com diferentes sorotipos de P. multocida

Utilização da inoculação de animais para determinar a patogenicidade dos isolados

(Ibrahim et al., 1998; Shivachandra et al., 2006; Mohamed et al.,2012)

rarosvariáveis quanto ao padrão de avaliação

Lei 11.794 (08/10/08)Procedimentos para o uso científico de animais

estabelecer um modelo de classificação da patogenicidade de P. multocida a partir da inoculação de pintos de corte.

Estabelecimento de um índice de patogenicidade em pintos de corte de um dia de idade para cepas de Pasteurella multocida isoladas de de aves e de suínos.

Parâmetros avaliados

1. tempo de morte (dias): observação das aves por 07 dias

2. presença de lesões macroscópicas

(Pilatti, 2014)

A B C

D E FA) aerossaculite B) Lesão local aplic. C) onfalite D) pericardite

E) perihepatite F) peritonite

*TM: Tempo de Morte; PC: Pericardite; PH: Perihepatite; PT: Peritonite; ASS: Aerossaculite; LA: local de aplicação; ONF: Onfalite;

(Pilatti, 2014)IP = ∑(IPI) N

Cálculo do Índice de Patogenicidade Individual (IPI) para cada animal

Dia de Morte TM TM x 5Somatório do Escore de Lesões (EL)

N° de Lesões Valor1 1 5 6 5,0002 0,8572 4,286 5 4,1653 0,7144 3,571 4 3,3334 0,571 2,857 3 2,5005 0,4284 2,143 2 1,6676 0,2857 1,428 1 0,8337 0,1428 0,714 0 0,000

7* 0 0 *** ***

*IPI = TM x 5 + (PC + PH + PT + ASS + CL + ONF)

Tabela 8. Relação entre o tempo de morte ou o número de lesões e o respectivo valor atribuído

Cálculo do Índice de Patogenicidade Individual (IP) para a cepa inoculada

10 aves p/ cada cepa

(Souza, 2010)

somatório escore de lesões

Fator de bonificação de sobrevivência: 0,1428

Cepa IP Cepa IP Cepa IP Cepa IP Cepa IP Cepa IP

1 10 17 10 33 7,80 49 6,11 65 4,44 81 2,25

2 10 18 9,18 34 7,75 50 5,81 66 4,43 82 2,17

3 10 19 9,13 35 7,69 51 5,63 67 4,39 83 2,1

4 10 20 8,93 36 7,69 52 5,46 68 3,95 84 2

5 10 21 8,87 37 7,5 53 5,44 69 3,89 85 1,75

6 10 22 8,69 38 7,57 54 5,26 70 3,79 86 1,67

7 10 23 8,6 39 7,44 55 5,24 71 3,60 87 1,58

8 10 24 8,51 40 7,25 56 5,17 72 3,5 88 1,42

9 10 25 8,44 41 7,20 57 5,07 73 3,31 89 1,33

10 10 26 8,27 42 6,93 58 4,93 74 3,27 90 1,33

11 10 27 8,26 43 6,77 59 4,89 75 3,12 91 1,33

12 10 28 8,13 44 6,65 60 4,88 76 2,99 92 1,33

13 10 29 8,06 45 6,56 61 4,80 77 2,6 93 1,25

14 10 30 7,93 46 6,43 62 4,73 78 2,5 94 1,17

15 10 31 7,90 47 6,42 63 4,69 79 2,42 95 1,08

16 10 32 7,82 48 6,31 64 4,56 80 2,29 96 0,17

Tabela 9. Valores dos Índices de Patogenicidade (IP) das 96 cepas de Pasteurella multocida inoculadas em frangos de corte com 01 dia idade

Classificação de Patogenicidade N° de Amostras Mediana ± DP

Alta (8-10) 37 9,13 ± 0,953 ᵃ

Intermediária (4-7) 35 5,24 ± 1,159 ᵇ

Baixa (0-3) 24 1,75 ± 0,837 ᶜ

Tabela 10. Mediana dos valores dos Índices de Patogenicidade (IP) de acordo com a distribuição das cepas de Pasteurella multocida nos grupos de patogenicidade

Letras diferentes na mesma coluna representam diferença estatística significativa (p<0,01) (Pilatti, 2014)Kruskall-Wallis test

Redes Neurais Artificiais

• Explicar, simular e predizer os resultados zootécnicos da cadeia avícola;

Gerenciamento de reprodutoras

pesadas

Gerenciamento de frangos de corte

Gerenciamento de matadouros-

frigoríficos de aves

Guahyba, 2001 Realli, 2004 Pinto, 2006 Spohr, 2010

Gerenciamento da cadeia avícola

• Explicar, simular e predizer os resultados em temas sanitários da cadeia avícola;

Avaliação da depleção

linfocitária da Bursa de Fabricius

Moraes, 2008

Avaliação da depleção

linfocitária do timo

Carvalho, 2013

Classificação da patogenicidade de

Escherichia coli

Rocha, 2006; Tejkowski, 2013

Classificação da resistência

antimicrobiana de Escherichia coli

Salle, 2009; Da Rocha, 2012


• Simula em computadores o funcionamento do cérebro humano implementando modelos matemáticos que se assemelhem às estruturas neurais biológicas;

(FERNEDA, 2006)

• RNAs calculam funções matemáticas normalmente não lineares e estão dispostas em uma ou mais camadas interligadas por um grande número de conexões associados a determinados pesos conforme as informações de entrada recebidas.

(BRAGA et al., 2000; LUDWIG & COSTA, 2007)

dendritos

sinapses

Presença de 22 genes de virulência Classificação do índice de patogenicidade das cepas


Alta

Intermediária

Baixa

Camada de entrada Camada de saída

Programa Neuroshell Classifier 2.1

Programa Neuroshell Classifier 2.1

Alternativa para determinação da patogenicidade sem a utilização de modelos animais

• Obtenção de amostras isoladas em outros hospedeiros (ruminantes, suínos, pets);

Possibilidade de transmissão horizontal de genes de virulência(DAVIES et al., 2004; BETHE et al., 2009)

Comparação perfis genéticos e tipificação molecular(ZAGLIC et al., 2005; SUBAAHARAN et al., 2010)

Amostras isoladas de animais sadios e doentes

Amostras de diferentes origens

CA na forma aguda

CA na forma crônica

Relação epidemiológica de um grupo de

genes

• Os genes toxA, tbpA e pfhA: marcadores do potencial patogênico em outras espécies (DAVIES et al., 2004; BETHE et al., 2009)

Obrigado pela atençã[email protected]

simpósio de sanidade avícola (avisulat/ufsm) iv congresso sul brasileiro de avicultura,...

Documents