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FRAGA, SN

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde

Programa de Pós-Graduação em Nutrição

SIMONE DO NASCIMENTO FRAGA

REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO EM RATOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO

NEONATAL

ORIENTADORA: Profa. Dra. Célia Maria Machado Barbosa de Castro

CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Sílvia Regina Arruda de Moraes

Recife 2009

REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO...

FRAGA, SN

Simone do Nascimento Fraga

REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS

TRONCO EM RATOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO

NEONATAL

ORIENTADORA: Profa. Dra. Célia Maria Machado Barbosa de Castro CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. Sílvia Regina Arruda de Moraes

Recife 2009

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de Mestre em Nutrição.


FRAGA, SN

Fraga, Simone do Nascimento

Reparo ósseo com a utilização de células tronco em ratos submetidos à desnutrição neonatal / Simone do Nascimento Fraga . – Recife: O Autor, 2009.

82 folhas: il., fig., tab.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. CCS. Nutrição, 2009.

Inclui bibliografia, anexos e apêndices.

1. Desnutrição neonatal – Células tronco. I.Título.

613.221 CDU (2.ed.) UFPE 574.876 1 CDD (22.ed.) CCS2009-045


FRAGA, SN

Simone do Nascimento Fraga

REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO

EM RATOS SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO NEONATAL

Dissertação aprovada em: 18 de fevereiro de 2009 pela banca examinadora composta por:

Recife 2009


FRAGA, SN

Aos que vêem neste estudo uma

esperança de vida!


FRAGA, SN

AGRADECIMENTOS À minha orientadora/ professora Célia Maria Machado Barbosa de Castro, que

me acolheu no laboratório, lutou por mim e me ensinou cada detalhe da pesquisa. É

impossível expressar a admiração que lhe tenho!

Ao colegiado da Pós-graduação em Nutrição da Universidade Federal de

Pernambuco, que apostou na minha capacidade e me acolheu no programa.

À minha família (mainha, painho, Mana e Bal), que sempre me incentivaram e

me apoiaram em todos os momentos da minha vida e que, mesmo com todas as

dificuldades, estiveram sempre ao meu lado me dando força e conselhos para que eu

pudesse seguir.

A Maurício Pimenta, presente em minha vida desde o início da pesquisa, mas de

forma muito especial nos últimos meses, enchendo a minha vida de alegria!

Às amigas Patrícia Brazil, Magdala Azevedo, Denise Sandrelly, Janaína

Almeida e Flávia Salviano, que dividiram comigo cada momento difícil da nossa Pós.

Aos companheiros Maiara Severo, Glívia Barros e Rodrigo Fragoso que

puderam compartilhar comigo muitas experiências adquiridas ao longo do mestrado.

Ao meu amigo Bruno Henrique Galvão, que me ajudou a tomar várias decisões

nesse árduo caminho e com o qual nunca deixo de aprender. A cada conversa que eu

tenho com você, Bruninho, eu aprendo um pouquinho a ser pesquisadora... Obrigada!

À Fátima (Dakotinha), pelos conselhos e apoio que recebi o tempo inteiro. Você

é como uma irmã pra mim!

À amiga Ana Carolina da Cruz, que sempre cuidou de mim nos momentos de

sufoco da pesquisa como se eu fosse sua filha.

Às amigas e amigos do LIKA: Alice, Isabella, Natália, Thacianna, Judith,

Bruno, Rafael, Thaís, Diogo e, especialmente, Ketlin, Dany Cantarelly e Renata, que

assumiram parte desse trabalho como se fosse seus. Obrigada pelos grandes momentos

de descontração e alegria em nossos trabalhos!

À Gabi, Paul e Marvis. Cada conversa que eu tenho com vocês é como se fosse

um aula. Obrigada pelos ensinamentos!

Aos grandes amigos, aliás, aos anjos Ribas e Marcos! Às vezes as pessoas

aparecem em nossas vidas do nada e ficam pra sempre... Muito obrigada por tudo!

Ao professor Nicodemos Teles. Professor, seguirei os seus conselhos e serei

feliz!

Ao colegiado de Nutrição, importantíssimos para nossa formação como mestres.


FRAGA, SN

À Dr. França e Sr. Paulino, pela disponibilidade dos mesmos para a realização

deste trabalho.

À Dona Neci. Obrigada pela paciência!

À Paloma Lys, Ana Paula Sobral, Mário Melo e Luciano Carvalho, pelos

ensinamentos e amizade.

À Sílvia Arruda de Moraes, pelo apoio no decorrer da pesquisa.

Às amigas Misha, Luciana, Shirley, Candice, Vanessa, Kelly, Taciana, Márcia,

Carol, Sílvia e ao amigo Humberto, por compartilharem comigo muitos bons momentos

da minha caminhada.

À Universidade Federal de Pernambuco, ao Laboratório de Imunopatologia

Keizo Asami e a Capes pelo apoio físico e financeiro para o desenvolvimento desta

pesquisa.

A Deus por permitir a realização deste trabalho.

Aos demais que participaram direta ou indiretamente para a concretização deste

sonho. Muito obrigada!


FRAGA, SN

Pouca coisa é necessária para

transformar inteiramente uma vida:

amor no coração e sorriso nos lábios.

Martin Luther King


FRAGA, SN

RESUMO A desnutrição constitui um problema de saúde pública caracterizado pela baixa ingestão de nutrientes essenciais para o crescimento e desenvolvimento do organismo. Pesquisas que envolvem desnutrição e a sua repercussão na vida adulta relevam que ela é capaz de provocar alterações na programação metabólica que repercutem ao longo da vida. No entanto, ainda pouco se conhece sobre as seqüelas envolvendo as células tronco adultas de medula óssea (CTAMO), especialmente sobre as células tronco mesenquimais em relação à quantidade e sua capacidade de diferenciação em tecido ósseo. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre o número de células tronco, bem como avaliar o reparo ósseo com essas células em lesões ósseas de animais desnutridos. Para isso, utilizou-se 64 ratos machos Wistar, dos quais 32 receberam dieta padrão (nutridos-N), com 23% de proteínas, e o restante recebeu Dieta Básica Regional (DBR) (desnutridos-D) com 7,87% de proteínas no período de aleitamento. O peso dos ratos foi aferido até completarem a idade adulta, quando eles foram subdivididos em 4 grupos (n=8): 1. N que receberam células tronco de N (G1); 2. D que receberam células tronco de D (G2); 3. N que receberam células tronco de D (G3) e 4. D que receberam células tronco de N (G4). Os outros ratos (N e D) foram usados como doadores de CTAMO que foram cultivadas por 12 dias e diferenciadas, in vitro, em osteoblastos que, por sua vez, foram implantados em defeitos críticos confeccionados nos ossos parietais dos ratos. Após 60 dias, estes foram eutanasiados e as calotas cranianas processadas para microscopia óptica. A leitura foi realizada por três patologistas e o índice Kappa foi utilizado para avaliar o grau de concordância entre eles. Para a análise dos pesos e do número de células tronco, utilizou-se o teste t-Student (p< 0,05). O teste de Mann-Whitney foi aplicado quando os resultados não passaram no teste de normalidade. Os ratos desnutridos tiveram redução do ganho de peso desde o segundo dia de vida, enquanto que o número de CTAMO não apresentou diferença entre N e D. As células tronco mesenquimais de D, entretanto, apresentaram-se em maior quantidade. Observou-se um pequeno grau de reparo ósseo entre os grupos, principalmente entre G2 e G4. Com esses dados, pode-se sugerir que a desnutrição neonatal interfere de forma permanente na vida adulta, sobre o número e a capacidade regenerativa tecidual das células tronco mesenquimais de medula óssea. Embora essas células tenham um grande potencial de diferenciação, o que permite o seu uso para estudos de regeneração de tecidos, a desnutrição no período crítico é uma agressão suficiente para diminuir o seu potencial terapêutico no tecido ósseo. Palavras-chaves: células tronco, células tronco mesenquimais, desnutrição neonatal, evolução ponderal, reparo ósseo.


FRAGA, SN

ABSTRACT

Malnutrition is a public health problem characterized by low intake of essential nutrients for growth and development of the body. Researches involving malnutrition and its consequences in adult life shows that it is capable to change the metabolic programming that impact throughout life. However, little is known about the sequels involving adult stem cells from bone marrow (ASCBM), especially on the mesenchymal stem cells for the quantity and its ability to differ into bone tissue. This study aimed to evaluate the effect of neonatal malnutrition on the number of stem cells and evaluate the bone repair with these cells in bone lesions of malnourished animals. For that, it was used 64 Wistar males rats, which 32 received standard diet (nourished-N), with 23% protein, and the remainder received Basic Diet Regional (BDR) (malnourished-D) with 7.87% of protein in the period of lactation. The weight of the rats was measured by until adult life, when they were divided into 4 groups (n = 8): 1. N who received stem cells from N (G1), 2. D who received stem cells from D (G2), 3. N who received stem cells from D (G3) and 4. D who received stem cells from N (G4). Other rats (N and D) were used as donors of ASCBM that were cultured for 12 days and differentiated in vitro into osteoblasts, which were implanted in critical defects up in the parietal bones of rats. After 60 days, the animals were euthanized and the skull was processed for optical microscopy. The reading was performed by three pathologists and the Kappa index was used to rank the degree of agreement between them. For the analysis of the weights and the number of stem cells, using the Student t-test (p <0.05). The Mann-Whitney test was applied when the results didn’t pass the test of normality. The malnourished rats were reduction of weight gain since the second day of life, while the number of ASCBM showed no difference between N and D. However, the mesenchymal stem cells of D showed up in greater quantity. There was a small degree of bone repair between the groups, principaly between G2 and G4. With these data, we can suggest that neonatal malnutrition interferes in adult life on the number and tissue regenerative capacity of mesenchymal stem cells from bone marrow in permanent way. Although these cells have great potential for differentiation, which allows its use for studies of regeneration of tissues, malnutrition in the critical period is an aggression to reduce its therapeutic potential in bone tissue.

Key-words: stem cell, mesenchymal stem cell, neonatal malnutrition, ponderal evolution, bone repair.


FRAGA, SN

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Divisão dos grupos experimentais.................................................... 35

Figura 2 Procedimentos de coleta de medula óssea........................................ 38

Figura 3 Cultura confluente de células tronco mesenquimais........................ 39

Figura 4 Células tronco mesenquimais diferenciadas em osteoblastos.......... 39

Figura 5 Defeitos críticos bilaterais................................................................ 42

Figura 6 Implante dos osteoblasto incorporados ao hidroxiepatita em um

dos defeitos críticos ........................................................................

42

Figura 7 Periósteo reposicionado e suturado.................................................. 42

Figura 8 Sutura dos planos superficiais.......................................................... 42

ILUSTRAÇÕES DO ARTIGO

Figura 1 Evolução ponderal dos grupos N e D durante o período de

aleitamento.........................................................................................

65

Figura 2 Evolução ponderal dos grupo N e D durante o período de reposição

nutricional...........................................................................................

65

Figura 3 Quantidade de CTAMO de ratos dos grupos N e D.......................... 66

Figura 4 Quantidade de CTAM, diferenciadas em osteoblastos, de ratos dos

grupos N e D......................................................................................

66

Figura 5 Defeitos críticos corados em Tricrômico de Masson......................... 68


FRAGA, SN

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Composição centesimal da Dieta Básica Regional (DBR).................... 34

Tabela 2 Composição da dieta padrão utilizada no biotério (LABINA -

Purina®, Agribrands do Brasil Ltda). Valores de enriquecimento por

Kg de ração............................................................................................

34

Tabela 3 Ocorrência de inflamção, tecido ósseo e reparo/fibroplasia ................. 45

Tabela 4 Classificação das características histopatológicas................................. 45

Tabela 5 Coincidência da Kappa.......................................................................... 45

TABELAS DO ARTIGO Tabela 1 Índice de coincidência entre os avaliadores A x B................................ 67

Tabela 2 Freqüência de parâmetros histológicos por animal segundo o grupo e

os avaliadores.........................................................................................

67


FRAGA, SN

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CO2 Dióxido de Carbono

CTAMO Células tronco adultas de medula óssea

CTAM Células tronco adultas mesenquimais

D Desnutrido

DMEM Meio de cultura de Dulbecco modificado por Eagle

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

FOP Faculdade de Odontologia de Pernambuco

G1 Grupo 1

G2 Grupo 2

G3 Grupo 3

G4 Grupo 4

C Cavidade Controle

° C Grau centígrado

HE Hematoxilina-eosina

IM Intra-muscular

LIKA Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami

MO Medula óssea

N Nutrido

NaCl Cloreto de sódio

PBS Tampão salina fosfato

PVP-I Polivinil-iodopovidona

rpm Rotações por minuto

T Cavidade Teste

TM Tricômico de Masson

UFPE Universidade Federal de Pernambuco


FRAGA, SN

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................ 14

2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................... 17

2.1 Células tronco................................................................................................ 17

2.1.1 Definições e propriedades …………………………………………………. 17

2.1.2 Diferentes tipos de células tronco………………………………………….. 18

Embrionárias………………………………………………………………... 18

Adultas…………………………………………………………………….... 18

2.2 Tecido ósseo................................................................................................... 19

2.2.1 Composição inorgânica e orgânica do tecido ósseo....................................... 22

Células Osteoprogrenitoras………………………………………………… 22

Osteoblastos………………………………………………………………… 22

Osteócitos…………………………………………………………………... 23

Osteoclastos………………………………………………………………… 22

2.2.2 Mecanismos da formação óssea……………………………………………. 24

Intramembranosa…………………………………………………………… 24

Endocondral………………………………………………………………… 25

2.2.3 Osteogênese, osteoindução e osteocondução………………………………. 25

Osteogênese.................................................................................................... 26

Osteoindução.................................................................................................. 26

Osteocondução............................................................................................... 26

2.3 Terapia celular e Reparo ósseo...................................................................... 26

2.4 Período crítico e desnutrição neonatal.......................................................... 28

2.5 Terapia celular e desnutrição........................................................................ 30

3 MÉTODOS.................................................................................................... 33

3.1 Desenho do Estudo......................................................................................... 33

3.2 Seleção da Amostra........................................................................................ 33

3.3 Divisão dos Grupos........................................................................................ 33

3.4 Acompanhamento da evolução ponderal....................................................... 35

3.5 Acondicionamento dos Animais..................................................................... 35

3.6 Coleta de medula óssea, cultura de células tronco e diferenciação em

osteoblastos....................................................................................................

36

3.6.1 Coleta de medula óssea.................................................................................. 36


FRAGA, SN

3.6.2 Cultura de células tronco e diferenciação em osteoblastos............................ 39

3.7 Anestesia geral............................................................................................... 39

3.8 Procedimentos pré-cirúrgicos........................................................................ 40

3.9 Procedimento cirúrgico.................................................................................. 40

3.10 Defeitos críticos e determinação das cavidades............................................ 40

3.11 Técnica cirúrgica............................................................................................ 41

3.11.1 Implante dos osteoblastos............................................................................... 42

3.12 Etapa final da cirurgia................................................................................... 42

3.13 Cuidados pós-operatórios………………………………………………….......... 43

3.14 Eutanásia dos animais………………………………………………………........ 43

3.15 Obtenção do material para análise histológica............................................. 43

3.16 Processamento do material para análise histológica.................................... 44

3.17 Análise histológica......................................................................................... 44

3.18 Análise estatística........................................................................................... 45

3.19 Considerações bioéticas................................................................................. 46

4 RESULTADOS............................................................................................. 47

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................... 69

6 REFERÊNCIAS........................................................................................... 71

7 APÊNDICES................................................................................................. 79

ANEXOS....................................................................................................... 82


FRAGA, SN

14

1 INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, uma especial atenção tem sido dada ao processo de transição

nutricional, caracterizada pelo aumento da prevalência do sobrepeso e da obesidade, e

pela diminuição da prevalência da desnutrição (KAC & VELÁSQUEZ-MELÉNDEZ,

2003). No entanto, a desnutrição ainda é uma realidade bastante persistente,

principalmente em países em desenvolvimento.

Estudos que envolvem as conseqüências da desnutrição têm mostrado que ela é

capaz de provocar uma série de alterações morfológicas e funcionais que podem

repercutir por toda a vida do indivíduo afetado (HALES & OZANNE, 2003; BARKER,

ERIKSSON, OSMOND, 2002). Estas alterações podem ocorrer em sistemas

fisiológicos, como sistema nervoso, muscular e imunológico.

Diversos estudos têm revelado as agressões sofridas pelo sistema nervoso

periférico, quando submetido a um processo de desnutrição protéica. Além de alterações

estruturais como a diminuição na espessura e na organização da bainha de mielina,

podem ser identificadas também alterações na velocidade de condução nervosa

(OLDFORS, 1982; OLDFORS, 1980).

Em outros estudos, onde foram abordados o binômio sistema imune e

desnutrição, observou-se que a deficiência nutricional está comumente associada com o

dano a respostas imunológicas, particularmente a imunidade mediada por células,

função fagocitária, produção de citocinas, secreção de anticorpos e afinidade dos

anticorpos ao sistema complemento (CHANDRA & NEWBERNE, 1977; GERSHWIN

ET AL, 1984; BENDICH & CHANDRA, 1990; CHANDRA, 1992b).

Além de outros sistemas fisiológicos que são afetados pela desnutrição, merece

destaque o sistema ósseo (CAMPOS, 2001). A baixa ingestão de proteínas e

carboidratos, de acordo com o Mardon et al. (2008) contribui para o aumento da

incidência da osteoporose em idosos. Embora existam vários estudos sobre a

desnutrição e a osteoporose, pouco se conhece sobre o impacto da desnutrição sobre os

mecanismos de reconstituição óssea diante do trauma na idade adulta.

A reconstituição do trauma ósseo tem sido bem estudada nas últimas décadas.

Para tal, muitas tecnologias vêm sendo testadas em cirurgias de reconstituição óssea,

tais como: resinas poliuretanas vegetais (PURICCELLI et al., 1999), plasma rico em

plaquetas (AGHALOO, MOY, FREYMILLER, 2002) e mais recentemente ultra-som

(SCHORTINGHUIS et al., 2004), porém, a maioria dessas técnicas além de serem


FRAGA, SN

15

onerosas, não reduz a morbidade clínica particularmente, em pacientes que tiveram

história prévia de desnutrição.

A terapia celular, especialmente a terapia com células tronco, é uma alternativa

terapêutica que vem tomando muito espaço no mundo científico. Estas células, que

podem ser encontradas no músculo, na placenta, no cordão umbilical, na medula óssea e

até mesmo em embriões em suas primeiras fases de desenvolvimento, têm um grande

potencial de se diferenciar de forma funcional em várias células e, dessa forma,

recuperar tecidos lesionados.

As células tronco adultas de medula óssea (CTAMO) são células multipotentes

(KUMAR, CHANDA, PONNAZHAGAN, 2008) e constituem-se de três tipos

celulares: células tronco hematopoiéticas, responsáveis pela produção de células

sanguíneas; células tronco endoteliais e, por último, células tronco adultas

mesenquimais (CTAM) (KREBSBACH et al., 1999), sendo estas correspondendo à

cerca de 0,001% - 0,01% das células da medula óssea humana (PITTENGER et al.,

1999). As CTAM são capazes de se multiplicar e se diferenciar nos diversos tipos de

tecidos do corpo e a sua manipulação experimental é possível devido à sua fácil

separação in vitro.

A pluripotencialidade das células tronco induz a hipótese de que a quantidade de

células tronco em organismos que passaram por privação nutricional no período de

aleitamento sofre interferência negativa. Ainda, o reparo ósseo com o uso dessas células

não tem a mesma eficácia que as células de organismos normais, já que a desnutrição

neonatal é capaz de alterar várias funções fisiológicas. Com base em recentes trabalhos

sobre regeneração tecidual com células tronco, acredita-se na possibilidade de que as

essas células possam ser usadas como uma alternativa terapêutica para consolidar

fraturas ósseas, mesmo que o organismo tenha passado por um processo de privação

nutricional no período crítico de crescimento e desenvolvimento.

Pretende-se, com este estudo, consolidar as hipóteses propostas tomando como

base as informações mais recentes que se dispõem na literatura. Assim, o objetivo deste

trabalho foi avaliar a evolução ponderal de animais nutridos (N) e desnutridos (D) e o

número de CTAMO, particularmente as CTAM, entre os dois grupos. Através de

análises histológicas, pretende-se ainda, avaliar o potencial das CTAM de medula óssea,

diferenciadas in vitro em osteoblastos, no reparo do tecido ósseo em animais

desnutridos.


FRAGA, SN

16

Este trabalho resultou na confecção de um artigo que será submetido a uma

revista internacional. O trabalho envolverá apenas parte dos resultados obtidos, como a

associação da desnutrição com a quantidade de células tronco, bem como as análises

histológicas do reparo ósseo em cada grupo proposto.


FRAGA, SN

17

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Células tronco

2.1.1 Definições e propriedades

Células tronco são células progenitoras indiferenciadas que têm a capacidade de

se transformar numa grande variedade de células diferenciadas funcionais, tais como

osteoblastos, condrócitos, adipócitos, células musculares e outras células do corpo

(MUGURUMA et al, 2008; CAPLAN, 2005; FUKUCHI et al., 2004; SUN et al., 2003;

REYES et al., 2001; LIECHT et al., 2000). Elas podem ser encontradas no músculo, na

placenta, no cordão umbilical, na medula óssea e até mesmo em embriões nas suas

primeiras fases de desenvolvimento.

As células tronco e as células progenitoras, que são células com um pequeno

grau de diferenciação, estão presentes em praticamente todos os tecidos humanos

normais e são fundamentais para sua saúde, manutenção e resposta a lesões ou doenças

durante a vida. Estas células são a fonte de todos os tecidos novos formados pelos

sistemas de reparo e remodelação e são moduladas por sinais químicos e físicos que

controlam sua ativação, proliferação, migração, diferenciação e sobrevida (BIANCO et

al., 2001).

De acordo com Beresford (1989), a célula tronco é um tipo especial de célula

que tem a capacidade única de se auto-renovar e dar origem a células especializadas.

Embora a maioria das células do corpo, como as células cardíacas e da pele, estejam

destinadas a realizar funções específicas, a célula tronco é indiferenciada e permanece

neste estado até que receba um sinal para se transformar em uma célula especializada

(CAPLAN, 2005).

Muschler & Midura (2002) destacam que as células tronco são células em

repouso que apresentam as propriedades de divisão celular assimétrica e a de auto-

renovação. Nestes processos, estas células são ativadas por algum sinal ou evento para

deixar seu estado de repouso e se dividir. No entanto, o resultado desta divisão celular

resulta em duas células filhas que não são idênticas. Uma célula filha prolifera

simetricamente, geralmente por muitas divisões, originando um grande número de

células, cada uma denominada célula progenitora. Estas células progenitoras

posteriormente se diferenciam para formar os tecidos maduros. Em contraste, a outra


FRAGA, SN

18

célula filha retorna ao estado original de repouso da célula mãe, até que um novo sinal

ou evento ocorra, e possui o mesmo fenótipo e todas as propriedades da célula tronco

original, que caracteriza o processo de auto-renovação.

O processo de auto-renovação, de acordo com os estudos de Lin (1998), tem

grande relevância já que, se todas as células filhas se tornassem células progenitoras, a

população de células tronco diminuiria progressivamente a partir de cada evento de

ativação. Este fenômeno resultaria em uma depleção rápida da população destas células

de todos os tecidos normais, resultando em um número insuficiente para suportar os

processos de remodelação e reparo necessários para a manutenção, em longo prazo, da

saúde do organismo.

2.1.2 Diferentes tipos de células tronco

As células tronco são classificadas de acordo com sua plasticidade, isto é, seu

potencial de diferenciação nos diversos tecidos (PERES & CURI, 2005). Desta forma,

elas podem ser do tipo:

Embrionárias

São células totipotentes, ou seja, têm uma grande capacidade de diferenciação e

de divisão. Este tipo de célula pode se diferenciar em todos os tipos de tecidos do corpo.

Adultas

São células pluripotentes que têm a capacidade de se diferenciar em muitos

tecidos, porém não em todos. Seu potencial de replicação, diferentemente das

embrionárias, é limitado. As células tronco adultas podem ser encontradas em diversos

tecidos do corpo: reservas endógenas teciduais, sangue periférico, placenta e sangue do

cordão umbilical, células perivasculares e medula óssea, sendo esta a que mais se

destaca devido a sua disponibilidade imediata e reserva praticamente ilimitada

(MUSCHLER et al., 2004).

A medula óssea tem uma população de células tronco adultas constituída de

células da linhagem hematopoiética e da linhagem mesenquimal (KREBSBACH et al.,


FRAGA, SN

19

1999), sendo estas correspondendo à cerca de 0,001% - 0,01% das células da medula

óssea humana (PITTENGER et al., 1999) e sendo ainda capazes de se multiplicarem e

se diferenciarem nos mais diversos tipos de tecidos do corpo. De acordo com Slack

(2000), as células tronco adultas humanas são capazes de manter, gerar e substituir

células terminalmente diferenciadas em seus tecidos específicos como uma

conseqüência de turnover celular fisiológico ou regeneração tecidual devido à injúria.

As células tronco mesenquimais (CTAM) da medula óssea são células adultas e

multipotentes (KUMAR, CHANDA, PONNAZHAGAN, 2008) que têm algumas

características que as distinguem das células tronco hematopoiéticas, e esses dois tipos

celulares são de fácil separação in vitro. Quando a medula óssea é dissociada e o

material é coletado em um gradiente de concentração, as células tronco mesenquimais,

quando dispensadas em frascos próprios para cultivo, aderem-se à superfície destes

frascos, enquanto as células tronco hematopoiéticas não possuem essa capacidade de

adesão (JAVAZON et al. & KIRSCHSTEIN, 2001).

Apesar das células tronco embrionárias terem um grande potencial formador de

órgãos e tecidos, a alta demanda técnica para sua obtenção e cultura, o difícil controle

da sua proliferação (podendo resultar em neoplasias), os problemas de

histocompatibilidade e os aspectos éticos e religiosos de sua utilização fizeram o

interesse dos pesquisadores se dirigirem às células tronco pluripotentes adultas

(GRIFFITH; NAUGHTON, 2002).

2.2 Tecido ósseo

O osso é uma forma especializada do tecido conjuntivo que, assim como outros

tecidos conjuntivos, é constituído por células e matriz extracelular. O íon responsável

por manter esta matriz rígida é o cálcio, na forma de cristais de hidroxiapatita

[Ca10(PO4)6(OH)2]. O osso funciona como depósito de cálcio, fosfato e outros íons,

armazenando-os e liberando-os de maneira controlada, mantendo constante a

concentração destes nos líquidos corporais (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).

O osso é um tecido de suporte que se caracteriza por representar o tecido de

maior diferenciação na evolução dos tecidos. A elaboração de fibras colágenas no tecido

conjuntivo e a mineralização no tecido ósseo representam os passos mais importantes

nesta evolução. Além do seu excelente comportamento biomecânico, o tecido ósseo

revela um potencial único para regeneração, pois é capaz de curar fraturas ou defeitos


FRAGA, SN

20

locais com tecido regenerado de igual organização estrutural sem deixar cicatriz. De

acordo com Schenk (1994), o mecanismo deste padrão de reparação é muitas vezes

considerado uma recapitulação da osteogênese embrionária e do crescimento.

A estrutura rígida do osso permite-lhe suportar forças de tensão e de compressão

intensas e, desta forma, apresentar um comportamento marcadamente dinâmico. Ele

confere proteção para órgãos vitais e frágeis, como aqueles contidos nas cavidades

craniana, torácica e no canal raquidiano. Além disso, forma um arcabouço de suporte

para a posição ortostática e para a locomoção e aloja e protege a medula óssea,

produtora das células sanguíneas e mesenquimais (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004,

KESSEL, 2001).

A observação macroscópica da superfície de um osso seccionado de forma

transversal revela que, estruturalmente, ele é composto por dois tipos de tecidos: o

compacto (cortical) e o esponjoso. O tecido compacto situa-se na superfície externa e o

tecido esponjoso, que é trabeculado, situa-se na porção interna dos ossos. A diferença

entre os dois tecidos se dá pelo tamanho e pelo número de espaços em seu interior

(VIEIRA, 1999; SCHENK, 1994).

Já microscopicamente, dois tipos de tecido ósseo são observados: o tecido ósseo

primário, imaturo ou trabecular, e o tecido ósseo secundário, maduro ou lamelar. O

tecido ósseo primário é uma forma imatura de osso, visto que é o primeiro osso a se

formar durante o desenvolvimento fetal e durante a reparação óssea, sendo muito pouco

freqüente no indivíduo adulto, no qual persiste apenas próximo às suturas dos ossos do

crânio, nos alvéolos dentários e em alguns pontos de inserção dos tendões. Ele possui

abundantes osteócitos e feixes de colágeno sem direção definida. Seu conteúdo mineral

é muito menor que o do tecido ósseo secundário (GARTNER; HIATT, 1999).

O tecido ósseo secundário é o tipo freqüentemente encontrado nos adultos.

Possui fibras colágenas organizadas em lamelas de 3 a 7 µm de espessura, dispostas

paralelas umas às outras ou em camadas concêntricas ao redor de canais com vasos,

formando o sistema de Havers ou ósteons. Cada sistema de Havers corresponde a um

cilindro longo, às vezes bifurcado, orientado paralelamente à diáfise e formado por um

número variável de lamelas ósseas concêntricas. No centro deste cilindro ósseo, existe

um canal revestido de endósteo, denominado canal de Havers, que contém vasos e

nervos. Os canais de Havers comunicam-se entre si, com a cavidade medular e com a

superfície externa dos ossos por meio de canais transversais ou oblíquos, denominados

canais de Volkmann, que se distinguem dos anteriores por não apresentarem lamelas


FRAGA, SN

21

ósseas concêntricas e atravessarem as lamelas ósseas. Todos os canais vasculares

existentes no tecido ósseo originam-se quando a matriz óssea se forma ao redor dos

vasos pré-existentes (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004).

As lacunas contendo os osteócitos estão, em geral, situadas entre as lamelas

ósseas, porém algumas vezes estão dentro delas. Separando grupos de lamelas, existe

um acúmulo de substância cimentante que consiste em matriz mineralizada, porém com

muito pouco colágeno. Na diáfise dos ossos longos, as lamelas ósseas se organizam em

arranjos típicos, constituindo além dos sistemas de Havers, os sistemas circunferenciais

externos, internos e intermediários. O sistema circunferencial externo situa-se logo

abaixo do periósteo e forma a região mais externa da diáfise, contendo fibras de

Sharpey que ligam o periósteo ao osso (CILLINAME, 2002).

O sistema circunferencial interno, análogo ao externo, mas não tão extenso

quanto ele, circunda completamente a cavidade medular. Trabéculas de osso esponjoso

se estendem do sistema circunferencial interno até a cavidade medular, interrompendo o

revestimento de endósteo do sistema circunferencial interno (GARTNER; HIATT,

1999). Entre os dois sistemas circunferenciais encontram-se inúmeros sistemas de

Havers e grupos irregulares de lamelas, geralmente de forma triangular, denominadas

lamelas intersticiais ou sistema intermediário, que provêm de restos de sistemas de

Havers que foram destruídos durante o crescimento do osso. O tecido ósseo secundário

que contém sistemas de Havers é característico da diáfise de ossos longos, embora

sistemas de Havers pequenos possam ser encontrados em osso compacto de outros

locais (KATCHBURIAN & ARANA, 1999).

O osso é circundado, exceto nas superfícies articulares, por uma membrana

fibrosa denominada periósteo, através da qual vasos sanguíneos, linfáticos e fibras

nervosas penetram no tecido ósseo. O periósteo é composto de duas camadas, sendo a

externa constituída principalmente de tecido conjuntivo rico em colágeno e fibroblastos

e a interna, mais delgada, composta principalmente por fibras elásticas e células

osteoprogenitoras responsáveis pela ossificação da superfície externa do osso imaturo.

O periósteo do osso imaturo é espesso, vascularizado e muito aderente, já o do osso

maduro é fino, pouco vascularizado e contém baixa concentração de fibroblastos em sua

camada externa (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; SCHENK, 1994).

A superfície interna da camada cortical é revestida por uma fina membrana

chamada endósteo, que geralmente contém uma camada de células achatadas com

potencial osteogênico. As principais funções do endósteo e do periósteo são a nutrição


FRAGA, SN

22

do tecido ósseo e o fornecimento de novos osteoblastos para o crescimento e a

recuperação do osso (GARTNER; HIATT, 1999).

2.2.1 Composição inorgânica e orgânica do tecido ósseo

O tecido ósseo é constituído por uma porção inorgânica, cujos principais

elementos são o cálcio e sais de fósforo (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004) bem

como por uma porção orgânica, que é formada basicamente por células tais como:

células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteócitos e os osteoclastos (KESSEL, 2001).

Células Osteoprogrenitoras

As células osteoprogenitoras estão localizadas na camada celular interna do

periósteo, revestindo os canais Havers e o endósteo. Estas células são derivadas do

mesênquima embrionário e são capazes de sofrer divisão mitótica e de se diferenciar em

osteoblastos. Morfologicamente, são células fusiformes que possuem núcleo oval e

citoplasma escasso com retículos endoplasmáticos rugosos esparsos e um complexo de

Golgi pouco desenvolvido. Quando impostas a condições de baixa oxigenação, estas

células podem se diferenciar em células condrogênicas. Períodos de intenso crescimento

ósseo são capazes de provocar uma maior ativação das mesmas (HENG et al, 2004;

GARTNER; HIATT, 1999).

Osteoblastos

Os osteoblastos são células ósseas imaturas derivadas das células

osteoprogenitoras e apresentam grande potencial osteogênico. São células

mononucleares derivadas do mesênquima (CILLINAME, 2002).

Eles sintetizam a parte orgânica da matriz óssea (colágeno tipo I, proteoglicanos

e glicoproteínas) e são capazes de concentrar fosfato de cálcio, participando, desta

forma, da mineralização da matriz. A matriz óssea recém-formada, adjacente aos

osteoblastos ativos, e que ainda não está calcificada, recebe o nome de osteóide

(JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004; GARTNER; HIATT, 1999; ROSS; ROMRELL,

1993).


FRAGA, SN

23

Os osteoblastos dispõem-se na superfície óssea lado a lado, num arranjo que

lembra um epitélio simples. Quando em intensa atividade sintética, se apresentam

cubóides com o citoplasma muito basófilo; porém, em estado pouco ativo, tornam-se

achatados e a basofilia citoplasmática diminui (KESSEL, 2001).

Estas células exibem aparelhos de Golgi e retículo endoplasmático rugoso bem

desenvolvido, organelas que caracterizam sua atividade secretora (GARTNER; HIATT,

1999).

Osteócitos

Os osteócitos são osteoblastos maduros. São células encontradas no interior da

matriz óssea, ocupando as lacunas. Das lacunas partem canalículos dentro dos quais os

prolongamentos dos osteócitos estabelecem contatos através de junções comunicantes, o

que permite a passagem de pequenas moléculas e íons de um osteócito para outro. Cada

lacuna contém apenas um osteócito de morfologia achatada, que exibe reduzido

citoplasma perinuclear com pequena quantidade de retículo endoplasmático rugoso e

aparelho de Golgi pouco desenvolvido. Os osteócitos são essenciais para a manutenção

da matriz óssea e sua morte é seguida por reabsorção da matriz. Já que os osteócitos são

osteoblastos maduros, pode-se afirmar que eles são células mononucleares derivadas do

mesênquima (CILLINAME, 2002).

Osteoclastos

Os osteoclastos são originados de macrófagos (células do sistema fagocítico

mononuclear) que estão presentes no tecido ósseo (ABBAS & LICHTMAN, 2005). São

células móveis, gigantes e multinucleadas que se localizam, principalmente, sobre a

superfície endóstica do córtex e, às vezes, ao redor das trabéculas, sendo encarregadas

da absorção óssea. Os osteoclastos são ricos em fosfatase ácida, colagenase,

desidrogenase, protease e anidrase carbônica e são derivados das células precursoras

mononucleadas provenientes da medula óssea. Freqüentemente, nas áreas de reabsorção

de tecido ósseo encontram-se porções dilatadas dos osteoclastos, situadas em depressões

da matriz escavada por sua atividade, as quais são conhecidas como lacunas de

Howship. Os osteoclastos apresentam citoplasma granuloso, algumas vezes com

vacúolos, fracamente basófilo nos osteoclastos jovens e acidófilo nos maduros. A


FRAGA, SN

24

superfície do osteoclasto que está em contato com o osso apresenta uma borda-em-

escova e, logo abaixo desta estrutura, ele apresenta um citoplasma com aspecto

espumoso (GARTNER; HIATT, 1999). A atividade dos osteoclastos é coordenada por

citocinas e por hormônios como a calcitonina e o paratormônio (JUNQUEIRA;

CARNEIRO, 2004; GARTNER; HIATT, 1999; ROSS; ROMRELL, 1993).

2.2.2 Mecanismos da formação óssea

Embriologicamente, o tecido ósseo é derivado do mesênquima e sua formação se

inicia como condensações de células mesenquimais que podem sofrer basicamente dois

tipos de ossificação: intramembranosa e endocondral.

Intramembranosa

É a formação do tecido ósseo através da diferenciação das células mesenquimais

em osteoblastos. Em humanos, a primeira evidência de ossificação intramembranosa

ocorre por volta da oitava semana de gestação. As células mesenquimais alongadas

situadas no mesênquima frouxo migram e se agregam em áreas específicas, onde o osso

será formado. Esta condensação de células no interior do tecido mesenquimal é a

“membrana”, a qual a denominação ossificação intramembranosa se refere. O local da

membrana conjuntiva, onde ocorre o início da ossificação é denominado centro de

ossificação primária (ROSS; ROMRELL, 1993).

O processo continua com a diferenciação das células mesenquimais em

osteoblastos que sintetizam o osteóide (matriz óssea não mineralizada composta de

colágeno e proteoglicanos) que logo se mineraliza e aprisiona alguns osteoblastos que

irão se diferenciar em osteócitos. Como vários destes grupos surgem simultaneamente

no centro de ossificação, há confluência das traves ósseas formadas, dando ao osso um

aspecto esponjoso. Entre as traves, formam-se cavidades que são penetradas por vasos

sanguíneos e células mesenquimais indiferenciadas que originarão a medula óssea

(KESSEL, 2001).

Concomitantemente, as células primitivas circundantes situadas na “membrana”

proliferam, dando origem a uma população de células denominadas osteoprogenitoras.

Estas células se mantêm em número através de atividade mitótica contínua e, portanto,

constituem uma fonte constante de osteoblastos para o crescimento das espículas ósseas.


FRAGA, SN

25

Os osteoblastos, entretanto, são células diferenciadas que não se dividem (ROSS;

ROMRELL, 1993).

Nos ossos chatos do crânio verifica-se um predomínio acentuado da formação

sobre a reabsorção de tecido ósseo nas superfícies internas e externas, assim formam-se

duas tábuas de osso compacto (cortical), enquanto o centro permanece esponjoso. A

parte da membrana que não sofre ossificação passa a constituir o endósteo e o periósteo.

Este processo de ossificação é o responsável pela formação dos ossos frontal, parietal e

de partes do occipital, do temporal, da maxila e da mandíbula (JUNQUEIRA &

CARNEIRO, 2004).

Endocondral

Inicia-se com a proliferação e a agregação de células mesenquimais no local de

formação do futuro osso. Estas células se diferenciam em condroblastos que produzem

matriz cartilaginosa do tipo hialina. Esta cartilagem, produzida neste estágio inicial,

possui forma e a aparência do osso que será formado. Os eventos posteriores à formação

da cartilagem seguem com hipertrofia dos condrócitos, redução de sua matriz a finos

tabiques, mineralização da matriz e, por fim, morte dos condrócitos por apoptose. As

lacunas que eram previamente ocupadas pelos condrócitos são invadidas por capilares

sangüíneos que trazem células osteogênicas provenientes do conjuntivo adjacente. Estas

células diferenciam-se em osteoblastos que depositam matriz óssea sobre os tabiques de

cartilagem calcificada, formando tecido ósseo onde antes havia tecido cartilaginoso.

Este tipo de ossificação é o principal responsável pela formação dos ossos curtos e

longos (ROSS; ROMRELL, 1993).

2.2.3 Osteogênese, osteoindução e osteocondução

Três diferentes mecanismos biológicos podem levar ao processo de neoformação

óssea, porém cada um destes mecanismos apresenta características específicas. Entre

estes, encontram-se a osteogênese, a osteoindução e a osteocondução (LEVIN et al.,

1995).


FRAGA, SN

26

Osteogênese

Osteogênese é a capacidade de produção direta de tecido ósseo pelas células

vivas presentes no osso. O osso esponjoso, que possui maior superfície coberta por

células, tem um maior potencial de osteogênese que o osso cortical (GOLDBERG;

STEVENSON, 1993).

Osteoindução

Processo através do qual um tecido atua sobre o outro para induzir a

diferenciação celular (URIST et al., 1967). O osso possui esta propriedade graças a uma

série de proteínas conhecidas como Bone Morphogenic Proteins (BMPs), ou proteínas

morfogenéticas óssea. Elas desempenham a função de estimular as células

mesenquimais indiferenciadas a se tornarem células osteoprogenitoras que,

eventualmente, formarão novo osso (CLOKIE et al., 2002).

Osteocondução

O termo osteocondução aplica-se ao processo tridimensional observado quando

estruturas porosas são implantadas no osso ou adjacências. O processo é caracterizado

por um crescimento inicial de tecido fibrovascular que invade a estrutura e é seguido

por deposição de osso novo diretamente sobre ela (CORNELL & LANE, 1998).

2.3 Terapia celular e Reparo ósseo

A engenharia de tecidos, que se baseia no uso de células para cura de doenças, é

uma área interdisciplinar que combina e aplica princípios da engenharia e das ciências

biológicas para o desenvolvimento de substitutos biológicos na reposição, manutenção e

melhoramento da função tecidual. Atualmente, as pesquisas nesta área estão voltadas

para o desenvolvimento na produção de estruturas e de órgãos para implantação, no

intuito de eliminar a morbidade decorrente do sítio doador.

As células do estroma da medula óssea recriam um meio embrionário em tecidos

adultos lesados, pois segundo os estudos de Petite et al. (2000), elas estão

comprometidas com a regeneração tecidual. Tais células têm propensão a se aderir em


FRAGA, SN

27

cultura, permitindo-se serem isoladas de outras células medulares, sendo possível

verificar a sua proliferação e diferenciação em osteoblastos, condroblastos, mioblastos e

adipócitos.

Okubo et al. (2000) descreveram que os osteoblastos, condrócitos, miócitos, e

adipócitos derivam-se de células progenitoras oriundas das células mesenquimais

indiferenciadas. Essas células estão presentes em diversos locais, como tecido ósseo,

muscular, subcutâneo e adiposo.

Tugerman et al. (2001), buscando utilizar as células mesenquimais

indiferenciadas como uma forma de terapia gênica no tratamento de lesões ósseas,

realizaram um trabalho in vitro no qual transfectaram essas células derivadas da medula

óssea com o vetor de adenovírus recombinante contendo a BMP-2 humana. Com as

células transfectadas em cultura, observaram claramente a proliferação e a diferenciação

osteogênica das células mesenquimais, enquanto que, in vivo, tais células, depois de

transplantadas no radio de ratos, foram capazes de formar osso e cartilagem, além de

regenerar defeitos ósseos.

Atualmente, a terapia celular é uma excelente alternativa para a cura de doenças

crônico-degenerativas. As possibilidades de emprego de células tronco são inúmeras, e

envolvem modelos que permitem avançar nos conhecimentos acerca dos mecanismos de

proliferação e diferenciação celular, que são imprescindíveis para a compreensão e para

o tratamento de neoplasias e de doenças degenerativas (VOGEL, 2002).

A importância destas células para a medicina regenerativa reside no fato que,

além de seu grande potencial de diferenciação, sendo estas do próprio paciente, não

correm o risco de serem rejeitadas pelo sistema imunológico do mesmo.

Para utilização clínica, o substituto ósseo ideal deve ser biocompatível, ter boas

propriedades mecânicas e demonstrar osteoindução, ou pelo menos osteocondução

(DUPOIRIEUX et al., 1994). Independente do substituto ósseo a ser utilizado, este

deverá promover a neoformação óssea.

De acordo com Muschler et al. (1997), o aspirado de medula óssea é a fonte

mais acessível de células tronco mesenquimais pluripotentes adultas, contendo uma

média de quarenta milhões de células nucleadas por mililitro. Para Krebscach et al.

(1998) o estroma da medula óssea consiste de uma população heterogênea de células

que fornece suporte estrutural e fisiológico para as células hematopoiéticas.

Adicionalmente, esse estroma contém células com características de células tronco, as


FRAGA, SN

28

quais se diferenciam em osso, cartilagem, adipócitos, além de se constituírem num

suporte hematopoiético para os tecidos.

O transplante de células tronco mesenquimais tem como objetivo compensar

uma deficiência no número e/ou atividade destas células no local interessado, que pode

ocorrer por traumatismos prévios, infecção, irradiação prévia, defeitos teciduais,

cicatrizes ou deficiência vascular (MUSCHLER et al., 2004). Este transplante pode

melhorar a evolução dos enxertos osteocondutivos e osteoindutores, mesmo nos locais

envolvidos por tecidos sadios. Isto sugere que mesmo a cicatrização de tecidos normais

pode ser limitada pela deficiência das células tronco mesenquimais (MUSCHLER et al.,

2004). Diante disso, há grande importância do provimento adicional de células tronco

no local de formação óssea (CURYLO et al., 1997; WERNTZ et al., 1996; GRUNDEL

et al., 1991; LINDHOLM et al., 1988; TAKAGI et al.,1982).

A partir destas considerações biológicas, vários estudos buscaram desenvolver

técnicas para implantação direta de células tronco mesenquimais no local necessitado de

formação óssea, trazendo benefícios tanto para fraturas com dificuldade para

consolidação quanto para os pacientes experimentando um declínio na quantidade de

células osteoprogenitoras disponíveis, como nos idosos, na osteoporose e em outros

distúrbios metabólicos (PITTENGER et al., 1999; QUARTO et al., 1995; TSUJI et al.,

1990).

2.4 Período crítico e desnutrição neonatal

Durante o período crítico de crescimento e desenvolvimento, existe uma “janela

precoce de plasticidade fisiológica”, que se define como o período em que diversos

sistemas estão muito susceptíveis a estímulos ambientais (MORGANE et al, 1978;

WINICK & COOMBS, 1972), podendo estes estímulos serem originados de qualquer

tipo de situação hostil ao desenvolvimento fisiológico.

A relação entre a desnutrição precoce e a repercussão na vida adulta vem sendo

explorada há várias décadas (WEELS, 2003; BARKER, ERIKSSON, OSMOND, 2002;

OZANNE, HALES, 1999; LUCAS, FEWTRELL, COLE, 1999). Desde então,

Widdowson e McCance (1960) demonstraram que o tamanho de ratos adultos está

relacionado ao seu estado nutricional no período de lactação. Assim, desde que foram

observados os efeitos irreversíveis da desnutrição neonatal sobre o desenvolvimento do

cérebro, formulou-se a hipótese dos períodos críticos de desenvolvimento (DAVISON;


FRAGA, SN

29

DOBBING, 1968) em que a formação e a diferenciação dos tecidos são bastante

influenciadas por estímulos diversos. De acordo com estudos desenvolvidos por Kehoe

et al. (2001) e Medeiros (1998), a desnutrição precoce ou neonatal em animais, é o tipo

de estímulo que pode provocar a ocorrência de alterações somáticas, fisiológicas e

comportamentais.

Os efeitos da programação metabólica induzidos por experiências nutricionais

alteradas no período pós-natal imediato podem causar conseqüências em longo prazo no

contexto atual da “epidemia da obesidade” (SRINIVASAN & PATEL, 2008). De

acordo com os resultados da pesquisa de Remmers et al. (2008), que usou ratos Wistar

como modelo experimental, a restrição alimentar neonatal programa ratos machos e

fêmeas para permanecerem pequenos e magros na vida adulta. Segundo este autor, o

baixo nível de leptina neonatal pode desempenhar um importante papel neste processo.

Estes achados podem ser explicados por Lipsitt, Crook e Booth (1985), em que a

aquisição de matéria-prima essencial e de fontes de energia do meio, no início da vida, é

importante para o crescimento bem como para o desenvolvimento físico e psicológico.

Kennedy (1957) relatou que a primeira semana de vida é crítica, e o peso do

animal (rato) nesta semana, determinou a ingestão alimentar e o peso corpóreo para o

resto da vida. Da mesma forma, ratos adultos submetidos à desnutrição neonatal

apresentam uma diminuição no tamanho do cérebro e na concentração de substâncias do

hipotálamo e do hipocampo (KEHOE et al., 2001) e, mesmo depois de um período

longo de recuperação nutricional, este tipo de estímulo ambiental foi capaz de afetar o

sistema serotoninérgico de ratos adultos (MEDEIROS, 1998).

Além disso, observações clínicas e estudos epidemiológicos sustentam o

conceito de que a deficiência nutricional aumenta a freqüência e a gravidade das

infecções (LANDGRAF et al., 2005). De acordo com Peters-Golden et al. (2004), a

desnutrição é uma importante causa de imunossupressão, visto que impede o

desenvolvimento e a diferenciação do sistema imune normal (LANDGRAF et al.,

2007).

Ainda no período neonatal, as modificações nutricionais podem alterar aspectos

relacionados ao desenvolvimento dos diversos sistemas fisiológicos, uma vez que esta é

uma fase de rápida proliferação e diferenciação celular (MORGANE et al., 2002, 1978).


FRAGA, SN

30

2.5 Terapia celular e desnutrição

Estudos experimentais têm mostrado que deficiências nutricionais e outras

influências que reduzem o crescimento durante o “período crítico da vida” pode afetar

permanentemente a estrutura e fisiologia de vários órgãos e tecidos (POULTER, 2001;

GODFREY & BARKER, 2000). A desnutrição energético-protéica induzida por deitas

deficientes em proteínas, em ratos, é caracterizada por falha no crescimento, com

supressão do crescimento longitudinal do osso (PUCCIARELLI, 1981; GLICK &

ROWE, 1981; HIMES, 1978; NAKAMOTO & MILLER, 1977; LEE, 1976),

provavelmente como resultado da taxa diminuída da quantidade de osso neoformado,

bem como do índice mineral alterado. A dieta livre de proteína durante o período de

vida pós-natal produz uma redução considerável na força e na rigidez do eixo femural

(FERRETTI et al., 1988), e ainda de acordo com estudos de Nakamoto & Miller (1977),

o efeito da deficiência protéica sobre o desenvolvimento de mandíbula de rato tem sido

investigado considerando o resultado representativo de qualquer osso do organismo.

A desnutrição primária causada por suprimento inadequado de macro e

micronutrientes pode levar à deficiência imunológica clinicamente significante e a

infecções em crianças (SCRIMSHAW, 2003; KEUSCH, 2003). O desenvolvimento do

sistema imunológico normal é prejudicado pela desnutrição em períodos críticos como

gestação e maturação neonatal (KEUSCH, 2003; MCDADE et al., 2001). Além disso,

estudos comprovam que crianças desnutridas apresentam deficiências no seu sistema

imunológico e maior risco de infecções, além de maior predisposição ao atraso no

desenvolvimento neuropsicomotor (GRANTHAM-MC et al., 1982).

Dados clínicos e experimentais mostram o período neonatal como uma fase de

maior susceptibilidade ao desenvolvimento de convulsões. Isso ocorre devido a uma

combinação entre diversos fatores, tais como aumento da excitação e diminuição da

inibição, além de alterações inerentes ao desenvolvimento em estruturas subcorticais

(MOSHÉ, 1993).

Estudos experimentais com ratos submetidos a processo de desnutrição precoce

e posteriormente reabilitados do ponto de vista nutricional demonstram resultados

controversos quanto à ocorrência de recuperação de estruturas do SNC previamente

danificadas. O conceito de plasticidade cerebral já foi associado à recuperação do status

nutricional (SCHONEIT & HAENSEL, 1988).


FRAGA, SN

31

Palencia et al. (1996) e Bronzino et al. (1990), em estudos experimentais,

evidenciaram que a desnutrição perinatal causa alterações permanentes, fisiológicas e

morfológicas no SNC em desenvolvimento, além de diminuir o limiar para crises

convulsivas.

O desenvolvimento pós-natal de células também tem se mostrado afetado por

desnutrição neonatal. Em estudo morfométrico de complexo de Golgi, Dı´az-Cintra et

al. (1991) mostraram uma redução significativa no tamanho e na complexidade dos

dentritos. Em estudo do desenvolvimento pós-natal, Cintra et al. (1997) observaram

plexos de fibras axonais e encontraram redução destes plexos em ratos desnutridos no

período pré-natal. No sítio de projeção axonal de células CA3 piramidais, Granados-

Rojas et al. (2002) encontraram uma redução no número de seus contatos sinápticos em

ratos desnutridos.

Ainda sobre estudos que envolvem a desnutrição protéica, Lozoff et al. (1991)

afirmaram em seu trabalho que deficiências nutricionais podem resultar numa redução

da função cognitiva, bem como da coordenação e desenvolvimento motor, estando

associada também ao aumento na morbidade e de doenças infecciosas.

O crescimento ósseo no período pós-natal depende da diferenciação das células

tronco mesenquimais da medula óssea em células osteogênica, adipogênica, fibloblastos

e linhagem reticular (BIANCO et al., 2001; TRIFFITT & OREFFO, 1998). Alterações

na regulação das células tronco mesenquimais e na atividade osteoblástica são

importantes mecanismos candidatos para a programação da trajetória do crescimento

esquelético por restrição dietética protéica durante a vida intra-uterina. Entretanto, os

efeitos da restrição dietética intra-uterina sobre os mecanismos biológicos acerca do

crescimento ósseo e da função da célula óssea, bem como os efeitos de mediadores

endócrinos sobre a função da célula óssea durante toda a vida, permanecem

desconhecidos.

De acordo com os estudos sobre as conseqüências tardias da desnutrição

neonatal, muitos dos sistemas e órgãos sofrem diversas conseqüências, mas até agora,

não há dados na literatura que mostrem que pacientes que sofreram este tipo de

desnutrição apresentam um potencial reduzido de reparo ósseo diante de um trauma na

idade adulta, bem como qualquer tipo de alteração na quantidade e/ou plasticidade das

células tronco mesenquimais.

Diante destes fatos, é de grande relevância estudar se os efeitos da desnutrição

ocorrida na fase de diferenciação e amadurecimento dos sistemas orgânicos, e seguida


FRAGA, SN

32

de recuperação ponderal através de dieta de reposição nutricional, ao longo da vida

adulta, interferem no processo de reparo ósseo com o uso de células tronco e, desse

modo, saber se esta terapia teria a mesma eficiência que num organismo com estado

nutricional normal, sem restrição de nutrientes necessários ao desenvolvimento orgânico

durante o seu período crítico.


FRAGA, SN

33

3 MÉTODOS

3.1 Desenho do Estudo

Trata-se de um estudo experimental, do tipo prospectivo, pareado, aleatório e

duplo cego. Num mesmo rato, foi possível observar os resultados tanto da cavidade

óssea (defeito crítico) teste-T quanto da cavidade controle-C, como foram denominadas.

3.2 Seleção da Amostra

Foram utilizados 64 ratos adultos do sexo masculino (Rattus novergicus, família

Muridae, variedade Wistar), provenientes do Biotério de Criação do Departamento de

Nutrição da UFPE. O mesmo foi escolhido como modelo experimental porque são

indivíduos isogênicos e consangüíneos, o que oferece uma menor variabilidade na

população que forma a amostra. Além disso, apresentam uma alta resistência ao

manuseio, pouca propensão a doenças (HARKNESS; WAGNER, 1993) e se adéquam

bem à manipulação nutricional.

3.3 Divisão dos Grupos

Os 64 ratos que participaram do estudo foram divididos em dois grupos de

acordo com a dieta oferecida durante o período de aleitamento: grupo Nutrido - N (n =

32) e Desnutrido - D (n = 32). O grupo N recebeu dieta padrão de laboratório durante o

período de aleitamento (Labina - Purina®), enquanto que o grupo D recebeu a Dieta

Básica Regional - DBR (TEODÓSIO et al., 1990) durante este mesmo período. Após o

período de manipulação nutricional, os ratos receberam água e ração padrão ad libitum

até o fim do experimento. As tabelas 1 e 2 mostram a composição nutricional de cada

dieta.


FRAGA, SN

34

Tabela 1. Composição centesimal da Dieta Básica Regional (DBR)

Ingredientes g% Composição Centesimal Proteína Carboidrato Lipídeos Cinzas Fibras Kcal%

Feijão cozido e seco 18,34 3,99 10,66 0,24 0,57 1,09 60,76

Farinha de mandioca 64,81 0,84 48,59 0,12 0,43 5,64 198,80

Carne seca salgada 3,74 2,74 - 0,06 0,06 - 11,50

Gordura da carne salgada e seca 0,35 - - 0,35 - - 3,15

Batata doce 12,76 0,30 9,99 0,03 0,20 0,48 41,43 TOTAL 100,00 7,87 69,24 0,80 1,26 7,21 315,64

Fonte: Teodósio et al. (1990)

Tabela 2. Composição da dieta padrão utilizada no biotério (LABINA - Purina®, Agribrands do Brasil Ltda). Valores de enriquecimento por Kg de ração

Enriquecimento Enriquecimento Níveis de garantia (%)

Vitamina A 20000UI Piridoxina 6mg Umidade (máx) 13

Vitamina D3 6000UI Biotina 0,1mg Proteína (min) 23 Vitamina E 30UI Colina 2000mg Extrato Etéreo 2,5

Vitamina K 6mg Manganês 50mg Matéria Fibrosa (máx) 9,0

Vitamina B12 10mg Iodo 2mg Matéria Mineral (máx) 8,0

Vitamina B2 8mg Ferro 65mg Cálcio (máx) 1.8 Pantetonato de Cálcio 24 mg Zinco 35mg Fósforo (min) 0,0

Niacina 95mg Cobre 26mg Tiamina 4mg Antioxidante 100mg Ácido Fólico 0,5mg

Fonte: Agribrands do Brasil Ltda.

Dos 32 ratos pertencentes a cada grupo, 16 foram sacrificados para a doação de

medula para o fornecimento das células tronco. Usou-se a proporção de 1 rato doador

para 1 rato receptor. Esta proporção foi pré-estabelecida em estudo piloto.

Os 32 animais restantes (16N e 16D) foram subdivididos, ainda, em dois grupos

cada (n = 8). Estes animais foram os receptores de células tronco mesenquimais tanto de

ratos N quanto de ratos D. A ilustração (figura 1) abaixo facilita a visualização dos

grupos em questão:


FRAGA, SN

35

3.4 Acompanhamento da evolução ponderal

Os ratos foram pesados diariamente, numa planilha padronizada (Apêndice 1),

durante as três primeiras semanas de vida. A partir do desmame (23° dia), os mesmos

foram pesados em dias alternados até completarem a idade adulta (90° dia). O peso dos

animas foi aferido em balança digital pertencente ao Biotério do Departamento de

Nutrição – UFPE. Esperou-se a idade adulta dos animais para iniciar os experimentos

porque nesta idade o tecido ósseo dos mesmos já está completamente maturo.

3.5 Acondicionamento dos Animais

Os animais foram mantidos inicialmente no Biotério do Departamento de

Nutrição até os 90 dias de vida, a uma temperatura de 22°C ± 2, num ciclo claro-escuro

12/12h (HARKNESS; WAGNER, 1993; LUCA; ALEXANDRE; MARQUES, 1996). A

partir daí, os animais foram transferidos para o Biotério do Laboratório de

Imunopatologia Keizo Asami – LIKA/ UFPE, o qual manteve o mesmo sistema de

iluminação e aquecimento, e onde foram mantidos em gaiolas contendo maravalha

autoclavada de madeira macia. Como os ratos geralmente têm um comportamento

comunitário, eles foram alojados em quatro animais por gaiola.

Figura 1: Divisão dos grupos experimentais. G1 → Grupo N + células tronco de ratos N; G2 → Grupo D + células tronco de ratos D; G3 → Grupo N + células tronco de ratos D; G4 → Grupo D + células tronco de ratos N.


FRAGA, SN

36

Todas as gaiolas foram acondicionadas em uma sala exclusiva para esta pesquisa

e, durante um período de 15 dias, as animais foram mantidos numa sala de quarentena,

onde foi avaliado, pelo veterinário responsável, o seu estado geral de saúde. Durante o

período de quarentena, os animais foram vermifugados com Albendazol.

A limpeza das gaiolas e dos bebedouros foi efetuada duas vezes por semana,

segundo o protocolo de limpeza e desinfecção do Biotério do LIKA. A alimentação dos

animais se deu através de ração comercial sólida peletizada (Labina - Purina®), com

alto teor de protético (20 a 27%) e água destilada acidificada (HCl 0,005%) ad libitum.

3.6 Coleta de medula óssea, cultura de células tronco e diferenciação em

osteoblastos

A obtenção da medula óssea nos ratos doadores e o seu posterior processamento

laboratorial para a cultura, o isolamento das células tronco mesenquimais e a

diferenciação em células osteoprogenitoras (osteoblastos) baseou-se no protocolo

descrito por Abukawa et al. (2004), que por sua vez, baseou-se nos trabalhos de

Pittenger et al. (1999). Todos os procedimentos foram realizados no Laboratório de

Microbiologia do LIKA-UFPE.

3.6.1 Coleta de medula óssea

Os ratos foram anestesiados com Cloridrato de Xilasina e Cloridrato de

Ketamina (1:1) (Vetbrands®) e eutanasiados com 1mL, intracardíaco, de Cloreto de

Potássio (KCl) 19,1% como recomendado pela Associação Americana de Veterinária.

Em seguida, os mesmos foram desinfetados com álcool etílico a 70% e, a partir deste

momento, todas as etapas foram realizadas dentro de uma Cabine de Fluxo Laminar

Classe II B2, seguindo os protocolos de cultura celular (CURI & PERES, 2005), no

intuito de evitar contaminação das culturas.

Os fêmures e as tíbias dos ratos foram dissecados num tempo de 17,79±4,54

minutos e acondicionados em solução salina estéril até o momento da coleta da medula

óssea. Para a coleta da medula, os ossos foram cortados na altura das epífises, de modo

que as diáfises ficassem intactas para a coleta. A medula foi coletada diretamente num

tubo cônico estéril de 15 mL (Falcon®), com agulha 18G x 11/2”, utilizando-se Heparina

diluída em PBS (1:10) (Invitrogen®), 0,1 M, pH 7,2. Depois de realizada a coleta, as


FRAGA, SN

37

células tronco foram separadas num gradiente de Ficoll (Sigma®), sob centrifugação de

1200 rpm por 30 minutos.

Em seguida, a fase com células tronco que ficou acima do Ficoll foi aspirada

através de um pipetador automático e dispensada num tubo cônico estéril de 50mL

(Falcon®). Estas células foram então lavadas em PBS, sob centrifugação de 1800 rpm

por 10 minutos. Após a centrifugação, descartou-se o sobrenadante e obteve-se um pelet

de células que foi logo ressuspendido em 1mL de meio de cultura de Dulbecco

modificado por Eagle (DMEM) de alta glicose (Invitrogen®) suplementado com 10%

de soro fetal bovino (Invitrogen®) e antibiótico/antimicótico (Invitrogen®). Para a

contagem das células, obteve-se uma alíquota de 10µl da suspensão, a qual foi diluída

em 90µl de Trypan blue (1:10). A contagem foi realizada em câmera de Neubauer e o

resultado ajustado para 106 células/mL. A figura 2 ilustra todas as etapas supracitadas.


FRAGA, SN

38

Figura 2: Procedimentos de coleta de medula óssea. A. Rato Wistar; B. Fêmures e tíbias dissecados; C. Coleta de medula óssea; D. Células sobre Ficoll- Sigma®; E. Separação de células após centrifugação; F. Aspiração das células com pipetador automático; G. Células em cultura em atmosfera úmida, 37°C e 5% CO2; H. Troca de meio de cultura.

A

C D

E F

G H

B


FRAGA, SN

39

3.6.2 Cultura de células tronco e diferenciação em osteoblastos

As células tronco foram cultivadas por 12 dias em garrafas de cultura de 25 cm2

(Falcon) em atmosfera úmida, 5% de CO2, a 37° C e em condições estéreis. A

obtenção das células tronco mesenquimais se deu através a aderência destas ao fundo da

garrafa de cultura. A troca do meio de cultura foi realizada a cada três dias e, no décimo

dia, quando as culturas atingiram uma confluência de 80 a 90% (Figuras 3 e 4), as

mesmas foram induzidas a se diferenciar fenotipicamente em osteoblastos através da

adição de um meio indutor contendo 100 nmol/L Dexametasona, 10 nmol/L de β-

glicerofosfato e 50 ug/ml de Ácido ascórbico (PITTENGER et al., 1999).

Figura 3: Cultura confluente de células tronco mesenquimais

Figura 4: Células tronco mesenquimais diferenciadas em osteoblastos (seta)

Ao 12º dia, os osteoblastos foram retirados do frasco com 5mL de Tripsina-

EDTA (0,05%) (Invitrogen®), lavados em PBS e concentrados em cloreto de sódio

(NaCl) 0,9%, numa concentração de 106 células/10µl de NaCl. Estas células foram

mantidas em gelo até o momento da cirurgia e, posteriormente, foram incorporadas ao

cimento de hidroxiapatita (Bone Source®) e implantadas na cavidade óssea

experimental (defeito crítico).

3.7 Anestesia geral

Para a realização dos procedimentos cirúrgicos, cada rato foi pesado no dia

anterior no intuito de minimizar o estresse no momento da cirurgia. Para a anestesia

geral destes animais, foi utilizado Cloridrato de Ketamina e o Cloridrato de Xilazina

(1:1) aplicados na dosagem de 0,1mL para cada 100g de peso corpóreo por via


FRAGA, SN

40

intramuscular (IM), com um tempo de ação de aproximadamente 5 minutos e um

período aproximado de duas horas de anestesia (FERREIRA DA SILVA, 2006).

3.8 Procedimentos pré-cirúrgicos

Enquanto o rato estava anestesiado, sob papel absorvente, foi feita a tricotomia

com navalha descartável na região craniofacial, entendendo-se da região occipital até a

região nasal. Posteriormente, realizou-se uma anti-sepsia com gaze estéril umedecida

em Polivinil-iodopovidona (PVP-I) a 10%.

Em seguida, foi colocado um campo cirúrgico estéril sob a mesa, e o rato foi

posto em decúbito dorsal. Foi colocado, ainda, um campo cirúrgico fenestrado, de modo

que só ficasse exposta a região a ser manipulada.

A anestesia local foi obtida com a infiltração de 0,1 mL de Cloridrato de

Lidocaína a 2% com adrenalina (1:200.000) com o intuito de diminuir o sangramento no

trans-operatório e promover um maior conforto no pós-operatório imediato.

3.9 Procedimento cirúrgico

Os procedimentos operatórios experimentais foram realizados na Sala de

Cirurgia do Biotério do LIKA-UFPE sob técnicas de assepsia e anti-sepsia, utilizando-

se instrumental estéril e campos descartáveis. Para esterilização destes, utilizou-se o

calor úmido (autoclave), sob a pressão de 15 libras e temperatura de 121ºC por 30

minutos.

3.10 Defeitos críticos e determinação das cavidades

Foi realizado de forma bilateral nos ossos parietais dos ratos duas cavidades

circulares de 5mm de diâmetro denominadas defeitos críticos. Tais cavidades

corresponderam à cavidade teste (T) e à cavidade controle (C). Estes defeitos foram

realizados com o auxílio de uma broca de Trefina calibrada de espessura total, com

exposição da dura-máter.

Nos ratos do estudo piloto a espessura da calota foi mesurada com um

calibrador, observando-se uma média de 0,425 0,0731mm de espessura no osso

removido para criar a cavidade do defeito, sendo este dado de utilidade para a obtenção


FRAGA, SN

41

do “volume aproximado do defeito”. A obtenção deste dado possibilitou o cálculo do

número de células osteoprogenitoras por cm3 implantadas na cavidade, para que o

mesmo estivesse em concordância com a literatura. Este volume aproximado do defeito

foi determinado em 0,083 cm3.

A cavidade teste foi determinada de forma aleatória mediante sorteio. Nos

quatro grupos, estabeleceu-se a cavidade do osso parietal direito como cavidade D e a

do osso parietal esquerdo como cavidade E.

No ato cirúrgico, a cavidade T e a cavidade C foi identificada mediante o

preenchimento prévio de uma tabela (apêndice B). A cavidade T foi preenchida com

aproximadamente 106 osteoblastos/10µ de NaCl, utilizando-se o cimento de

hidroxiapatita como veículo. A cavidade C foi preenchida apenas com o coágulo

sanguíneo produzido após a criação do defeito crítico.

3.11 Técnica cirúrgica

Foi realizada uma incisão paramediana na calvária do rato intermediando pele e

periósteo, estendendo-se da região fronto-nasal à protuberância occipital externa, com

lâmina n0 15 montada num cabo de bisturi Bard-Parker Nº 3, elevado e rebatido

lateralmente mediante um perióstomo tipo Molt Nº 9, expondo os ossos parietais, parte

do occipital e do frontal.

Seguida à correta diérese dos tecidos, foram realizadas as duas cavidades ósseas

circulares na região central de cada osso parietal, de espessura total, utilizando-se a

broca Trefina calibrada com 5mm de diâmetro, acoplada numa peça reta, montada em

baixa rotação num motor elétrico. Para evitar perfurar o seio sagital e/ou a dura-máter,

evitou-se realizar pressão com os dedos sobre a calota e observou-se também o

aparecimento de uma translucidez no sulco formado no osso pela broca, sendo

finalmente removido o fragmento ósseo delicadamente com uma cureta de Lucas.

Durante a confecção dos defeitos críticos, o procedimento foi realizado sob

constante irrigação com solução fisiológica 0,9%, evitando-se assim o

superaquecimento ósseo.


FRAGA, SN

42

3.11.1 Implante dos osteoblastos

Uma vez confeccionados os defeitos críticos, de acordo com o que havia sido

estabelecido, identificou-se a cavidade T e implantou-se as células tronco mesenquimais

diferenciadas, in vitro, em osteoblastos (Figuras 5 e 6). Como o veículo utilizado para a

fixação destas células no defeito crítico foi o cimento de hidroxiapatita, antes do

implante, as células foram misturadas a este cimento num pote Dappin e, em seguida,

postas cuidadosamente sobre a cavidade pré-determinada.

Figura 5: Defeitos críticos bilaterais. Figura 6: Implante dos osteoblastos

incorporados ao cimento de hidroxiapatita em um dos defeitos críticos.

3.12 Etapa final da cirurgia

Após o preenchimento da cavidade teste, o periósteo foi reposicionado e

suturado junto ao plano muscular mediante pontos simples com fio de nylon número 5.0

(Sumervelle®), sendo finalmente suturados os planos superficiais e a pele com o

mesmo fio de nylon (Figuras 7 e 8).

Figura 7: Periósteo reposicionado e suturado.

Figura 8: Sutura dos planos superficiais.


FRAGA, SN

43

3.13 Cuidados pós-operatórios

Imediatamente após a cirurgia, foi realizada a limpeza das feridas e do corpo do

rato com PVP-I 10% para que os que despertassem primeiro da anestesia não ficassem

estimulados a praticar o canibalismo, devido ao odor exalado pelo sangue presente na

ferida cirúrgica.

Os ratos foram acondicionados em gaiolas limpas e com maravalha autoclavada.

O uso de almofadas, mesas aquecidas ou lâmpadas para manter os animais aquecidos

(HARKNESS; WAGNER, 1993; FLECKNELL, 1996) no período pós-operatório foi

descartado. Para isto, cobriu-se a calda de cada rato com a mesma maravalha, evitando

assim hipotermia corporal, depressão cardio-respiratória e óbito.

A fim de minimizar o risco de infecção, foi aplicado por cinco dias o antibiótico

Enrofloxacina 5% por via IM de 24/24h (0,5mL/10Kg). Para o controle da dor pós-

operatória, foi aplicado uma dose única de Dipirona Sódica por via intramuscular no

pós-operatório imediato (0,2mL/10Kg) (FERREIRA DA SILVA, 2006) e durante 3

dias, foi utilizado Ibuprofeno à 4%, diluído na mesma água do bebedouro na razão de

1:25 segundo os protocolos do Biotério do LIKA-UFPE.

Foi mantida, até o momento da eutanásia, a mesma alimentação ad libitum.

3.14 Eutanásia dos animais

Os ratos foram sacrificados 60 dias após a cirurgia. Para tal, administrou-se o

mesmo tipo e a mesma dose anestésica utilizada para a cirurgia e, em seguida, da

mesma forma que foi realizada a coleta de medula, os ratos foram eutanasiados com

KCl 19,1% intracardíaco.

3.15 Obtenção do material para análise histológica

Realizou-se, após a eutanásia, uma tricotomia na região craniofacial do rato e

uma limpeza da pele com álcool etílico a 70%. Em seguida, procedeu-se com uma

incisão trapezoidal, de espessura total, abrangendo a pele e os tecidos moles da região

parietal, de forma bilateral, com exposição da calota craniana. A ressecção do osso foi


FRAGA, SN

44

efetuada com auxílio de uma broca n° 701 montada em peça reta e acionada por motor

elétrico a uma velocidade de 25.000 rpm.

A calota craniana foi removida em sua totalidade tendo como limites os ossos

próprios nasais na região anterior, o osso occipital na região posterior, além dos ossos

temporais nas regiões laterais do crânio do espécime.

3.16 Processamento do material para análise histológica

As peças foram fixadas em formol tamponado a 10% em temperatura ambiente

e, posteriormente, descalcificadas em solução de ácido nítrico a 0,5% por 15 dias. Após

descalcificação, as peças foram lavadas com água destilada corrente durante 2 minutos e

mediante uma navalha, divididas em duas metades simétricas na região da sutura

sagital, correspondendo cada metade a uma hemi-calota direita e uma hemi-calota

esquerda. Posteriormente, cada hemi-calota foi cortada no diâmetro do defeito, sendo

descartadas as metades anteriores de cada lado.

Cada amostra, contendo uma metade de cada defeito foi colocada num tubo

cônico contendo álcool a 70% e encaminhadas para seu processamento histológico, no

qual foram desidratadas em soluções de álcool etílico a 80, 90% e 100%, diafanizadas

em banhos de xilol e incluídas em parafina de forma padronizada, que permitisse o

posicionamento no micrótomo e o corte da amostra no sentido coronal. Posteriormente,

os espécimes foram seccionados em cortes seriados de 5m de espessura e corados por

hematoxilina-eosina (HE) e Tricrômico de Masson (TM).

3.17 Análise histológica

A análise foi realizada por 3 histopatologistas com experiência na área. Os

avaliadores tinham conhecimento limitado sobre a metodologia deste experimento e não

sabiam qual era o grupo e/ou a cavidade que estava avaliando.

As amostras foram entregues para a avaliação em caixas identificadas com

colorações em HE e TM. A avaliação foi realizada de forma que os mesmos cortes

fossem analisados pelos avaliadores, sendo um avaliador por vez. Adicionalmente foi

entregue para cada um deles uma pasta contendo uma ficha padronizada (Apêndice C).

Utilizaram-se os parâmetros da tabela 3 para a avaliação:


FRAGA, SN

45

Tabela 3: Ocorrência de inflamação, tecido ósseo e reparo/fibroplasia INFLAMAÇÃO TECIDO ÓSSEO REPARO/FIBROPLASIA

Infiltrado inflamatório Tecido ósseo maturo Fibras colágenas Tecido de granulação Tecido ósseo imatudo Fibroblastos Vasos neoformados Osteóide

Reação de corpo estranho Osteoblastos

Estas três características histopatológicas foram avaliadas e classificadas como

expresso na tabela 4.

Tabela 4: Classificação das características histopatológicas ESCORES

Ausente - Leve +

Moderado ++ Intenso +++

3.18 Análise estatística

Todas as análises e observações histológicas foram realizadas de forma cega,

sem o conhecimento por parte dos examinadores a respeito do lado que foi determinado

como C ou T.

Os dados foram inicialmente coletados mediante formulários padronizados com

categorização das variáveis sendo estes posteriormente afixados em tabelas

padronizadas no programa MS-Excel compatível com Windows Vista.

O teste t-Student foi utilizado para comparar ganho de peso e número de células

tronco entre os grupos de animais N e D. O teste de Mann-Whitney foi aplicado quando

os dados não passaram no teste de normalidade. O software utilizado para obtenção dos

cálculos foi o programa SigmaStat® versão 2.0. A avaliação do reparo ósseo foi

baseada no teste Kappa com capacidade para analisar o índice de coincidência da

análise dos avaliadores. Foram determinados, de acordo com as análises, 4 pontos de

corte para estes índices: > 0,80 (excelente); 0,60 - 0,80 (bom); 0,40 - 0,60 (regular);

0,20 - 0,40 (pobre).

Tabela 5: Coincidência da Kappa PONTOS DE CORTE CONCEITOS

> 0,80 Excelente 0,60 - 0,80 Bom 0,40 - 0,60 Regular 0,20 - 0,40 Pobre


FRAGA, SN

46

3.19 Considerações bioéticas

Esta pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética em Pesquisa do Centro de

Ciências Biológicas e da Saúde da UFPE, sob o Processo Nº 007091/2007-19 (Anexo

A).


FRAGA, SN

47

4 RESULTADOS Os resultados obtidos com a metodologia empregada encontram-se neste artigo

que será submetido à revista NUTRITION.

Association of neonatal malnutrition with bone repair stimulated with

mesenchymal stem cells in adult rats

Associação da desnutrição neonatal com o reparo ósseo induzido com

células tronco mesenquimais em ratos adultos

FRAGA, S.N.1,2; PORTO, G.G.1; MORAES, S. R. A.4; RIBAS, K. H. S.2; PONTES –

FILHO, N. T.5; De CASTRO, C. M. M. B.1, 2, 3

1 Programa de Pós-graduação em Nutrição - UFPE 2 Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - LIKA 3 Departamento de Medicina Tropical - UFPE 4 Departamento de Anatomia – UFPE 5 Departamento de Patologia - UFPE


FRAGA, SN

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Associação da desnutrição neonatal com o reparo ósseo induzido com células tronco mesenquimais em ratos adultos

Simone do Nascimento Fraga1,2, Gabriela Granja Porto2, Sílvia Regina Arruda de Moraes4, Ketlin Helenise dos Santos Ribas2, Nicodemos Teles Pontes Filho5; Célia Maria Machado Barbosa de Castro1, 2,3

1 Programa de Pós-graduação em Nutrição - UFPE 2 Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami - LIKA 3 Departamento de Medicina Tropical - UFPE 4 Departamento de Anatomia – UFPE 5 Departamento de Patologia - UFPE Avenida Vinte de Janeiro, n° 496B, apto. 304 CEP: 51030 160 Recife-PE, Brasil E-mail: [email protected] RESUMO Objetivo: Avaliar o efeito da desnutrição neonatal sobre o crescimento corporal, número de células tronco adultas (CTAMO), número de células tronco adultas mesenquimais (CTAM) e reparo de lesões ósseas com CTAMO. Métodos: Ratos Wistar (n=64) foram divididos em grupos N e D de acordo com a dieta no período de aleitamento. N recebeu dieta padrão (23% proteínas) e D recebeu a dieta experimental (7,87% proteínas). Os ratos foram pesados diariamente até o 21° dia e em dias alternados até a idade adulta. Utilizou-se 32 (16N e 16D) como doadores de células tronco e os demais foram divididos em 4 grupos (n=8) para receber o implante de células em defeitos críticos. Os animais foram eutanasiados 60 dias após a cirurgia e o espécime foi encaminhado para análise histológica. As CTAMO e as CTAM foram quantificadas durante os experimentos. Utilizou-se o índice de Kappa para analisar a concordância entre os examinadores e o teste t de student (p<0,05) para comparar o peso e o número de células tronco entre N e D. Resultados: Os ratos D tiveram ganho de peso inferior aos N do 2° dia pós-natal até a idade adulta e apresentaram quantidade de CTAMO semelhante aos ratos N. Entretanto, a desnutrição aumentou o número de CTAM. O reparo ósseo em D foi insatisfatório. Conclusão: Sugere-se que a desnutrição neonatal interfere de forma permanente na vida adulta sobre o crescimento ponderal, o número de CTAM e sobre a capacidade da regeneração de reparo em lesões do tecido ósseo. Palavras-chave: célula tronco, célula tronco mesenquimal, desnutrição neonatal, reparo ósseo, período crítico de desenvolvimento.


FRAGA, SN

49

INTRODUÇÃO

A desnutrição neonatal é um quadro caracterizado por deficiência nutricional de

um ou de vários nutrientes no período crítico de crescimento e desenvolvimento e

constitui um tema que vem sendo explorado por diversos grupos de pesquisa1, 2, 3, 4

principalmente, sob o ponto de vista da repercussão deste quadro na vida adulta, já que

ele ainda continua sendo um problema de saúde no mundo. No período neonatal do rato

(primeiros 21 dias pós-natais), a formação e a diferenciação dos tecidos são

influenciados por diversos estímulos, uma vez que este período é uma fase de rápida

proliferação e diferenciação celular5.

Pesquisas revelam que a desnutrição neonatal é capaz de repercutir de forma

irreversível sobre o desenvolvimento do cérebro6, 7, 8, 9, como na alteração da

concentração de substâncias do hipotálamo e do hipocampo 10; no sistema imune, com o

aumento da freqüência e da gravidade das infecções11 e no crescimento ósseo pós-natal,

decorrente da diferenciação das células tronco mesenquimais em células osteogênicas12,

13. Outros estudos mostram que a desnutrição provoca várias conseqüências nos

diversos sistemas fisiológicos10, 14, 15.

Pesquisas recentes sobre os efeitos da programação metabólica mostram que a

restrição alimentar neonatal programa ratos para permanecerem pequenos e magros na

vida adulta16 e que, a indução de alterações nutricionais no período pós-natal imediato,

pode causar outras conseqüências em longo prazo17. Programações metabólicas

decorrentes de uma privação nutricional no período crítico de desenvolvimento podem

afetar também o sistema ósseo. Alterações na regulação de células tronco mesenquimais

e na atividade osteoblástica por restrição de proteínas durante a vida intra-uterina, são

mecanismos candidatos importantes para a programação da trajetória do crescimento

esquelético18. O tecido ósseo afetado pela desnutrição pode sofrer diversas


FRAGA, SN

50

conseqüências que vão desde problemas clássicos como a osteoporose19, 20 até

dificuldades na consolidação de fraturas diante de um trauma extenso.

Com o intuito de sanar este problema muitas tecnologias vêm sendo testadas em

cirurgias de reconstituição óssea, tais como: resinas poliuretanas vegetais21, plasma rico

em plaquetas22 e ultra-som23, porém, a maioria dessas técnicas além de serem bastante

onerosas, não reduz a morbidade clínica, particularmente em pacientes que tiveram

história prévia de desnutrição. Assim, o estudo com células tronco pode ser utilizado

como uma possível alternativa terapêutica para consolidar fraturas ósseas.

As células tronco são células progenitoras indiferenciadas que têm a capacidade

de se transformar numa grande variedade de células com funções distintas24, 25, 26, 27, 28, 29

e podem ser encontradas no músculo, na placenta, no cordão umbilical, na medula óssea

e até mesmo em embriões, nas suas primeiras fases de desenvolvimento.

O uso de células tronco como terapia de trauma ósseo ainda é uma alternativa

pouco estudada no que se refere ao binômio desnutrição e programação metabólica.

Sabe-se que parte destas células é responsável pela formação de vários tecidos no

período pós-natal, inclusive, o tecido ósseo. São escassos os estudos sobre desnutrição

no período crítico e capacidade de diferenciação dessas células para uma possível

utilização em terapia de reparo ósseo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar em

ratos submetidos à desnutrição neonatal a quantificação e a utilização dessas células em

reparo ósseo.

MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami

(LIKA) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) após a aprovação do Comitê

de Ética em Experimentação Animal da UFPE com protocolo de número: 007091/2007-

19.


FRAGA, SN

51

Animais

Foram utilizados 64 ratos machos albinos da linhagem Wistar provenientes do

Biotério do Departamento de Nutrição - UFPE. Os animais foram mantidos em

temperatura de 22 à 24°C e ciclo claro/escuro de 12/12 horas. Destes, metade foi

submetida no período neonatal à dieta padrão do biotério (Labina® - Purina do Brasil)

contendo 23% de proteínas, enquanto que a outra metade recebeu dieta hipoprotéica

(7,87%) 30. Os animais de ambos os grupos receberam ração e água ad libitum até o

final dos experimentos.

Manipulação nutricional

Para a manipulação nutricional 24 horas após o nascimento, os filhotes que

nasceram na mesma data e de mães diferentes, foram distribuídos de forma

randomizada em gaiolas contendo 6 animais por ninhada. Os grupos de animais

receberam dieta padrão e dieta experimental nos primeiros 21 dias de vida (fase de

aleitamento) e depois receberam dieta padrão do biotério até o final dos experimentos

(fase adulta).

Evolução ponderal

O peso corporal foi mensurado diariamente, durante os primeiros 21 dias de

vida. Após esse período, os animais foram pesados em dias alternados até completarem

89 dias.

Grupos experimentais

Os grupos experimentais foram designados de acordo com a dieta que receberam

durante a lactação e de acordo com cirurgia a que se submeteram para implante de

células tronco. Do total de 64 ratos, 32 receberam a dieta hipoprotéica (Desnutrido-D) e


FRAGA, SN

52

os demais receberam dieta padrão (Nutrido-N). A metade desses 2 grupos (n=16) serviu

como doadores de células tronco adultas e os demais foram divididos em 4 grupos

(n=8). Assim, foram obtidos 4 grupos: 1. ratos nutridos que receberam células tronco de

ratos nutridos (G1); 2. ratos desnutridos que receberam células tronco de ratos

desnutridos (G2); 3. ratos nutridos que receberam células tronco de ratos desnutridos

(G3) e 4. ratos desnutridos que receberam células tronco de ratos nutridos (G4).

Coleta e cultura de células tronco

Animais com a idade adulta de 90 dias foram anestesiados com Cloridrato de

Xilasina e Cloridrato de Ketamina (0,1ml/100g peso) e eutanasiados com 1mL

intracardíaco de Cloreto de Potássio (KCl) 19,1% (Baxter). Dentro de uma Cabine de

Fluxo Laminar Classe II B2, os fêmures e as tíbias foram dissecados e acondicionados

em solução salina estéril até o momento da coleta da medula óssea. Em seguida, os

ossos foram cortados na altura da epífise, de modo que as diáfises ficassem intactas para

a coleta da medula. A coleta foi realizada diretamente num tubo cônico estéril de 15mL

(Falcon®), com agulha 18G x 11/2” (Temuro corporation, Japão) utilizando-se Heparina

1:10 em PBS 0,1 M, pH 7,2 (Invitrogen®). Depois de realizada a coleta, as células

tronco foram separadas num gradiente de Ficoll (Sigma®) sob centrifugação de 1200

rpm, por 30 minutos. Após a centrifugação a camada de células tronco que ficou acima

do Ficoll foi aspirada através de um pipetador automático e acondicionadas num tubo

cônico estéril de 50mL (Falcon®). Estas células foram então lavadas em PBS sob

centrifugação de 1800 rpm, por 10 minutos. Após a centrifugação um pelet de células

foi obtido com o descarte do sobrenadante. As células tronco foram ressuspendidas em

1mL de meio de cultura de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) de alta glicose

(Invitrogen®) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Invitrogen®) e

antibiótico/antimicótico (Invitrogen®). Para a contagem das células, foi obtida uma


FRAGA, SN

53

alíquota de 10µL, a qual foi suspensa em 90µL de Trypan blue (1:10). A contagem foi

realizada em câmera de Neubauer e o resultado ajustado para 106 células/mL. Em

seguida, as células tronco foram cultivadas em garrafas de cultura de 25 cm2 de área

(Falcon) por 12 dias, em atmosfera úmida com 5% de CO2, em condições estéreis. A

obtenção das células tronco mesenquimais se deu através da aderência destas a garrafa

de cultura. A troca do meio de cultura foi realizada a cada 3 dias. No 10o dia, quando as

culturas atingiram confluência de 80 a 90%, as mesmas foram induzidas a diferenciação

fenotípica em osteoblastos através da adição de um meio indutor contendo 100 nmol/L

Dexametasona (Aché, Brasil), 10 nmol/L de β-glicerofosfato (Fresenius Kabi Brasil

Ltda.) e 50 ug/mL de Ácido ascórbico (Sigma®).

Ao 12º dia os osteoblastos foram retirados do frasco com 5mL de Tripsina-

EDTA (0,05%) (Sigma®), lavados em PBS 0,1M (Invitrogen®) e concentrados em

cloreto de sódio (NaCl) 0,9%, na proporção de 106 /10µL de NaCl. Estas células foram

mantidas a 4oC até o momento da cirurgia.

Cirurgia e histologia

Os procedimentos operatórios foram realizados sob condições assépticas. Após a

anestesia foi realizada tricotomia na região crânio-facial seguida de anti-sepsia com

PVP-I a 10%. A anestesia foi obtida com a infiltração local de 0,1 mL de Cloridrato de

Lidocaína com adrenalina 2% na concentração de 1:200.

Foi realizada uma incisão paramediana na calvária do rato compreendendo pele

e periósteo, indo da região fronto-nasal até a protuberância occipital externa, expondo

assim os ossos parietais. Bilateralmente, foram realizadas nos ossos parietais 2

cavidades circulares de 5mm de diâmetro (defeito crítico) com o auxílio de uma broca

trefina.


FRAGA, SN

54

As cavidades foram identificadas como T ou C e no ato cirúrgico, essas

cavidades foram identificadas mediante o preenchimento prévio de uma tabela. A

cavidade T foi determinada de forma aleatória mediante sorteio e foi preenchida com

aproximadamente 106 osteoblastos/10µL em NaCl, utilizando-se o cimento de

hidroxiapatita como veículo. A cavidade C foi preenchida apenas com o coágulo

sanguíneo produzido após a confecção do defeito crítico. Este procedimento foi

realizado sob constante irrigação com soro fisiológico 0,9% a fim de evitar o

superaquecimento ósseo.

Após o preenchimento de T o periósteo foi reposicionado e suturado junto ao

plano muscular mediante pontos simples, com fio de nylon número 5.0 sendo

finalmente suturados os planos superficiais e a pele, com o mesmo fio de nylon.

A fim de minimizar o risco de infecção foi aplicado durante 5 dias, o antibiótico

Enrofloxacina 5% por via intramuscular (i.m.) de 24/24h (0,5mL/10Kg). Para o controle

da dor pós-operatória foi aplicado dose única de Dipirona Sódica i.m. (pós-operatório

imediato de 0,2mL/10Kg) e durante 3 dias utilizou-se Ibuprofeno à 4% diluído na

mesma água do bebedouro.

Após 60 dias, os animais foram eutanasiados e suas calotas cranianas foram

removidas, fixadas em formol a 10% e processadas para histologia. Foram

confeccionadas lâminas de cada defeito crítico que foram coradas com a coloração

Tricrômico de Masson. As lâminas foram analisadas por 3 especialistas que avaliaram o

grau de reparo ósseo, levando em consideração os seguintes parâmetros: inflamação,

tecido ósseo e reparo/fibroplasia.

Análises estatísticas

O teste t-Student foi utilizado para comparar ganho de peso e número de células

tronco entre os grupos de animais N e D. O teste de Mann-Whitney foi aplicado quando


FRAGA, SN

55

os dados não passaram no teste de normalidade. O software utilizado para obtenção dos

cálculos foi o programa SigmaStat® versão 2.0. A avaliação do reparo ósseo foi

baseada no teste Kappa, com capacidade para analisar o índice de coincidência entre a

análise dos três avaliadores. Foram determinados, de acordo com as análises, 4 pontos

de corte para este índice: > 0,80 (excelente); 0,60 - 0,80 (bom); 0,40 - 0,60 (regular);

0,20 - 0,40 (pobre).

RESULTADOS

Evolução ponderal

Os pesos foram referidos em grama de peso corporal e expressos em média ±

desvio-padrão (figura 1). Os animais submetidos à desnutrição neonatal apresentaram

durante o período de aleitamento redução dos seus pesos quando comparados aos

animais N (α=<0,001) e a diferença pode ser identificada já a partir do 2° dia de vida

(GN: 8,46 ± 1,01 e GD: 7,42 ± 1,52). No 21° dia de vida, que corresponde ao final do

período de lactação, D se manteve com pesos corporais menores (19,10±11,77) que os

encontrados para N (49,39±10,24) (α=<0,001).

A figura 2 mostra valores dos pesos (g), expressos em média ± desvio-padrão de

ambos os grupos do período pós-desmame até 89 dias. No 23° dia, os valores de D

(21,63±3,45) foram menores em relação aos apresentados por N (58,02±12,29)

(α=<0,001). No 89° dia de vida, D ainda apresentaram valores de pesos corporais

(271,51±23,19) inferiores quando comparados aos pesos de N (346,55±35,82)

(α=<0,001).


FRAGA, SN

56

Quantidade de CTAMO e de CTAM

A contagem total de CTAMO (valores expressos em média x 106células/mL ±

desvio-padrão) não mostrou diferença quando foram comparados os valores de N (20,94

± 10,82) com D (24,60 ± 18,07) (α=<0,05) (figura 3).

A quantidade de CTAM (valores expressos em média x106células/mL ± desvio-

padrão) foi diferente entre os grupos. Os valores da contagem de D (1,82±1,17) foram

maiores do que os valores de N (0,73±0,55) como demonstrado na figura 4 (α=<0,05).

Reparo ósseo

Para a avaliação do reparo ósseo considerou-se o resultado de apenas dois

avaliadores, já que a análise do terceiro, de acordo com os escores estabelecidos, foi

discordante dos demais. O índice de coincidência encontrado entre os dois avaliadores

estão expressos na tabela 1. De acordo com os pontos de corte estabelecidos, houve

coincidência de boa a excelente, na maioria dos casos. A tabela 2 mostra a freqüência

dos parâmetros histológicos encontrados nos animais por grupo. Para melhor

compreensão dos resultados resolveu-se agrupar os conceitos Ausente e Leve no mesmo

parâmetro (Aus-Leve).

Considerando o número de animais que tiveram o grau de inflamação Aus-Leve,

o G1 (N + células tronco N) apresentou pouco infiltrado inflamatório em T, sendo 8

animais para o primeiro avaliador e 7 para o segundo. O parâmetro tecido ósseo

neoformado, segundo os 2 avaliadores, também foi considerado Aus-Leve em todos os

animais. O parâmetro reparo/fibroplasia apresentou grau Aus-Leve, sendo 8 casos

considerados por um avaliador e 7 casos considerado pelo outro.

O G2 (D + células tronco D) apresentou grau de inflamação Aus-Leve, sendo

considerado 8 casos por um avaliador e 6 por outro. O tecido ósseo neoformado também

se apresentou Aus-Leve, porém, em menor grau que o G1 (todos os casos para ambos os


FRAGA, SN

57

avaliadores). O parâmetro reparo/fibroplasia, considerado Aus-Leve pelos 2

avaliadores, foi observado em todos os casos e ainda em menor grau que o G1.

No G3 (N + células tronco D) houve mais inflamação que os 2 grupos anteriores

por parte dos avaliadores, 8 e 3 casos, respectivamente. Praticamente não houve tecido

ósseo neoformado, pois os avaliadores encontraram para este parâmetro grau Aus-Leve

em todos os casos. O parâmetro reparo/fibroplasia foi considerado Aus-Leve na maioria

dos casos pelos avaliadores (8 e 6). O reparo foi considerado ainda menor que o G1.

O G4 (D + células tronco N) apresentou quase ausência de inflamação (7 casos

Aus-Leve), pouco tecido ósseo neoformado e pouco reparo/fibroplasia. Este grupo

apresentou um menor grau de reparo/fibroplasia que o grupo G3.

Houve ausência de inflamação no C em quase todos os animais dos grupos G1 e

G3. Entretanto, G2 e G4 apresentaram segundo a análise dos examinadores, diferentes

graus de inflamação. Um considerou ausência de resposta inflamatória ou grau leve de

inflamação e o outro considerou grau inflamatório moderado. Esses grupos

apresentaram ausência completa de tecido ósseo neoformado e de reparo/fibroplasia.

A figura 5 A-D mostra os reparos encontrados em cavidades T dos grupos G1 ao

G4. Nessa figura, é possível observar o reparo ósseo. A figura 5-E mostra a ausência de

neoformação óssea na cavidade C.

DISCUSSÃO

Neste estudo foi possível observar que durante o período de aleitamento o ganho

de peso corporal dos animais do grupo D foi menor que o do grupo N e este resultado

foi significativo desde o segundo dia de vida pós-natal. Isso sugere que a dieta

hipoprotéica utilizada interferiu negativamente sobre o ganho de peso dos animais. Este

achado é concordante com outros dados da literatura, como por exemplo, estudo recente

utilizando a mesma dieta hipoprotéica31.


FRAGA, SN

58

Sabe-se que a desnutrição energético-protéica pode causar diminuição da

quantidade de proteínas e da produção de leite, bem como, da redução no tamanho das

glândulas mamárias em mães lactantes32, 33. Estes dados poderiam justificar, em parte,

os dados relativos ao déficit ponderal encontrado nos grupos de ratos desnutridos.

Nos animais D, do período pós-natal até a idade adulta, não houve recuperação

do ganho de peso corporal. Pode-se sugerir que mesmo após reposição nutricional, os

efeitos negativos da desnutrição neonatal podem ainda repercutir sobre o crescimento

corporal do animal na idade adulta.

Deficiências de proteínas, carboidratos e gorduras que, são fontes de energia,

bem como deficiência de micronutrientes, são seguidas de alterações fisiopatológicas e

danos físico e bioquímico para o organismo. Inicialmente, essas deficiências expressam-

se na perda de peso e, quando se tornam crônicas, na diminuição do crescimento34.

Esses desequilíbrios nutricionais durante estágios iniciais da vida podem causar

impactos no desenvolvimento tardio do organismo35 e quando essas agressões

nutricionais ocorrem no período de lactação, podem resultar em retardo do crescimento

em neonatos30.

Estudos envolvendo programação metabólica explicam diversos

comportamentos fisiológicos na vida adulta de animais expostos a situações hostis,

como por exemplo, a privação nutricional no período neonatal. Com base neste fato, um

estudo mostrou que a desnutrição energético-protéica causa seqüelas na estrutura morfo-

funcional do intestino de ratos por meio do enfraquecimento das forças de ruptura e

resistência resultante de uma diminuição na funcionalidade de células produtoras de

colágeno da parede intestinal36. Isso remete à idéia da programação e seria uma

justificativa admissível para explicar o porquê do permanente déficit ponderal

observado em ratos adultos do grupo D, mesmo após reposição nutricional.


FRAGA, SN

59

Além de interferir no crescimento, a desnutrição neonatal foi capaz de alterar a

quantidade da população de CTAMO. No presente estudo, o número de CTAMO foi

semelhante nos dois grupos (N e D), em contrapartida, o número de CTAM

diferenciadas em osteoblastos foi maior em ratos adultos do grupo D quando comparado

ao do grupo N. Este outro achado nos remete novamente à idéia de programação.

Talvez, essa seja uma forma de recompensa metabólica encontrada pelo organismo

animal para suprir uma eventual situação de privação nutricional, já que essas células

mesenquimais participam ativamente do turnover celular fisiológico37 e assim são

fundamentais para a manutenção e regeneração tecidual.

O presente estudo corrobora com uma pesquisa desenvolvida sobre a avaliação

de retinóides e a taxa de proliferação celular, no qual examinaram o papel de derivados

dos retinóides sobre as taxas de proliferação celular em ratos submetidos à dieta

deficiente em vitamina A. Os ratos deficientes desta vitamina exibiram aumento

dramático do número de células mielóides na medula óssea, no baço e no sangue

periférico. Porém, esta anormalidade de proliferação celular foi revertida após adição de

ácido retinóico na dieta, indicando que, a presença ou ausência desse ácido interfere

diretamente na proliferação de células mielóides. Os autores realizaram ainda, a

quantificação da expressão de receptores celulares para atividades biológicas de

retinóides em granulócitos e observaram aumento desordenado da população de

granulócitos por bloqueio no mecanismo fisiológico de apoptose. Provavelmente a

expressão desses receptores inibida em ratos com esta deficiência nutricional, poderia

estar relacionado a um processo apoptótico deficiente38. Em nosso estudo, essa poderia

ser uma justificativa plausível para explicar o aumento do número de CTAM dos ratos

desnutridos analisados.

Embora as CTAM encontradas na medula óssea dos ratos desnutridos estejam

em maior quantidade que nos nutridos, isso não significa afirmar que essas células


FRAGA, SN

60

tenham o mesmo potencial funcional que o das células de animais que receberam aporte

nutricional adequado durante o período crítico de crescimento e desenvolvimento.

Na última década, houve uma intensificação dos estudos empregando o uso das

células tronco como alternativa para terapia celular em tecidos não sangüíneos, devido à

capacidade dessas células em se diferenciar em linhagens celulares que incluem

miócitos, hepatócitos e neurônios, dentre outros tecidos39, 40. Estudos recentes sobre

terapia celular vêm utilizando células tronco para: reconstituição das células beta das

ilhotas pancreáticas em pacientes diabéticos41; reconstituição da musculatura cardíaca

em paciente com insuficiência cardíaca avançada42 e em lesões do sistema nervoso43, 44.

Esses estudos constituem exemplos que mostram a versatilidade dessas células o que

nos leva a crer que elas poderão ser a solução para o tratamento de lesões ósseas. A

avaliação do grau de reparo ósseo com esse tipo de célula, em nosso estudo, revelou

resultados interessantes no que se refere aos grupos propostos.

Os grupos G1 (animais nutridos com células tronco de animais nutridos) e G2

(animais desnutridos com células tronco de animais desnutridos) apresentaram uma

resposta semelhante para todos os parâmetros avaliados. Entretanto, o G2 apresentou

menos tecido ósseo neoformado e menor grau de reparo/fibroplasia que o G1. Este

resultado pode ser explicado pelo fato de que a desnutrição no período crítico pode ter

causado seqüela funcional permanente nos animais adultos. Estudo de desnutrição

utilizando o modelo da presente pesquisa, empregou macrófagos de animais desnutridos

e nessa situação, esses macrófagos não responderam com a mesma intensidade a

estímulos inflamatórios que os macrófagos dos animais nutridos45, associando mais uma

vez à idéia de programação metabólica.

O grupo G3 (animais nutridos com células tronco de animais desnutridos)

apresentou pouca neoformação óssea e grau de reparo/fibroplasia inferior ao encontrado

no grupo G1, isso pode significar que mesmo que o animal tenha tido um aporte


FRAGA, SN

61

nutricional satisfatório, durante toda a vida, esse aporte não foi suficiente para recuperar

a capacidade regenerativa das células tronco dos animais submetidos à dieta

hipoprotéica no período crítico. Assim, há possibilidade de ter ocorrido um defeito

genético que alterou a funcionalidade de tais células.

O grupo G4 (animais desnutridos com células tronco de animais nutridos), por

sua vez, apesar de ter apresentado o mesmo perfil de resposta inflamatória e de tecido

ósseo neoformado que os demais, apresentou um grau menor de reparo/fibroplasia que o

grupo G3. Isso demonstra que há necessidade permanente de macronutrientes como

carboidratos, proteínas e lipídios para as células como um todo. Nessa situação, apesar

dos animais desse grupo terem adquirido células de animais nutridos, essas podem ser

influenciadas constantemente pela conseqüência metabólica da privação nutricional

destes animais no período crítico de crescimento e desenvolvimento.

A literatura expõe de forma bem clara o alto potencial terapêutico dessas células

em organismos normais. Os resultados encontrados neste estudo foram satisfatórios e,

embora a desnutrição seja capaz de estabelecer um mecanismo compensatório

quantitativo e não qualitativo sobre as CTAMO, ela pode interferir de forma

significativa sobre a capacidade terapêutica dessas para reparo de lesão em tecido ósseo.

Talvez a utilização de fatores de crescimento, como a proteína morfogenética óssea, no

meio indutor46, devolva a essas células o potencial terapêutico esperado ou ainda, o

estudo do reparo ósseo com células tronco embrionárias promova resultados melhores.

Contudo, ainda são necessárias pesquisas que envolvam desnutrição, células tronco

mesenquimais e reconstituição óssea para que essa terapia possa ser uma escolha ideal

de reparo ósseo.


FRAGA, SN

62

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos com este trabalho permitem concluir que a desnutrição

neonatal seguida de reposição nutricional interfere de forma permanente na vida adulta

do animal sobre o crescimento ponderal, o número de CTAM e a capacidade de

regeneração de reparo ósseo. Embora essas células tenham um grande potencial de

diferenciação, o que permite o seu uso para estudos de regeneração de tecidos, a

desnutrição no período crítico é uma agressão suficiente para diminuir o seu potencial

terapêutico para reparo em lesões do tecido ósseo.

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FRAGA, SN

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FIGURAS E TABELAS

Figura 1. Evolução ponderal dos grupos N e D durante o período de aleitamento. * α<0,05.

Figura 2. Evolução ponderal dos grupo N e D durante o período de reposição nutricional. α<0,05.


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Figura 3. Quantidade de CTAMO de ratos dos grupos N e D. *α<0,05.

Figura 4. Quantidade de CTAM, diferenciadas em osteoblastos, de ratos dos grupos N e D. *=α<0,05.

*


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Tabela 1: Índice de coincidência entre os avaliadores A x B

Grupos Parâmetros Controle-C Teste-T

G1 (N + CT N)

Inflamação 0,9 1 Tecido ósseo 1 1 Reparo/Fibroplasia 0,9 0,6

G2 (D + CT D)

Inflamação 0,9 0,9 Tecido ósseo 1 0,9 Reparo/Fibroplasia 0,9 0,9

G3 (N + CT D)

Inflamação 1 1 Tecido ósseo 1 1 Reparo/Fibroplasia 0,6 0,8

G4 (D + CT N)

Inflamação 0,9 1 Tecido ósseo 1 1 Reparo/Fibroplasia 1 1

Índice Kappa: > 0,80 (excelente); 0,60 – 0,80 (bom); 0,40 - 0,60 (regular); 0,20 - 0,40 (pobre). Tabela 2: Freqüência de parâmetros histológicos por animal segundo o grupo e os avaliadores

Controle-C Teste-T

Grupos Escores Inflamação (A/B)*

Tecido ósseo

(A/B)*

Reparo/ Fibroplasia

(A/B)* Inflamação

(A/B)*

Tecido ósseo

(A/B)*

Reparo/ Fibroplasia

(A/B)*

G1 (N + CT N)

Aus-Leve 8/7 8/8 8/7 5/8 2/4 8/6 Moderado 0/1 0/0 0/1 3/0 6/4 0/2

Intenso 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8

G2 (D + CT D)


Intenso 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8

G3 (N + CT D)

Aus-Leve 7/7 4/4 8/5 8/3 8/8 8/6 Moderado 1/ 1 4/4 0/3 0/5 0/0 0/2

Intenso 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8

G4 (D + CT N)


Intenso 0/1 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8 n=8 (A/B)*: número de casos encontrados pelos avaliadores A e B; Aus-Leve: escores 1 e 2; Moderado: escore 3; Intenso: escore 4.


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B

Figura 5: Defeitos críticos corados em Tricrômico de Masson. A (G1); B (G2); C (G3); D (G4); E (controle). As setas indicam as extremidades dos defeitos.


FRAGA, SN

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5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Submetendo organismos a privações nutricionais no período crítico de

crescimento e desenvolvimento, foram observadas alterações funcionais nos sistemas

fisiológicos em questão. O início das observações desse estudo se deu através da

comparação da evolução ponderal, entre os grupos N e D, através da qual se pôde notar

redução no ganho de peso dos animais D desde 2° dia pós natal até a idade adulta. Esses

resultados corroboram com estudo recente de Barros et al. (2006), que usou o mesmo

modelo de dieta (DBR) e também encontrou efeito negativo sobre a evolução ponderal,

o que sugere que a dieta utilizada interferiu negativamente sobre o ganho de peso dos

animais.

Estudos que envolvem programação metabólica estão sendo a saída para

explicar diversos comportamentos fisiológicos na vida adulta de animais expostos a

situações hostis. Assim, observou-se que a desnutrição neonatal também foi capaz de

alterar a quantidade da população de CTAMO. Embora elas tenham se mostrado

inicialmente semelhante nos dois grupos (N e D), o número de CTAM diferenciadas em

osteoblastos foi maior em animais adultos do grupo D, achado que nos remete à idéia de

programação. Talvez essa seja uma forma de recompensa metabólica encontrada pelo

organismo animal para suprir uma eventual situação de privação nutricional já que estas

células mesenquimais participam ativamente do turnover celular fisiológico (SLACK,

2000) e assim são fundamentais para a manutenção e regeneração tecidual.

Quando as CTAM foram implantadas nos ossos parietais dos animais na

tentativa de reparar o defeito crítico, foi possível observar que os grupos propostos

tiveram respostas diferentes e, como se esperava, essa diferença ocorreu em função das

dietas oferecidas aos animais em seus períodos de aleitamento. Os grupos G1 e G2

apresentaram uma resposta semelhante para todos os parâmetros avaliados. Entretanto,

o G2 apresentou menos tecido ósseo neoformado e menor grau de reparo/fibroplasia que

o G1, sugerindo, dessa forma, que a desnutrição no período crítico pode ter causado

seqüela funcional permanente nos animais adultos.

O grupo G3 apresentou pouca neoformação óssea e grau de reparo/fibroplasia

inferior ao encontrado no grupo G1. Tais dados podem significar que a capacidade

regenerativa das células tronco de animais submetidos à desnutrição no período crítico

foi prejudicada, mesmo havendo reposição nutricional. Talvez, a alteração da

funcionalidade dessas células seja devido a uma alteração genética na tentativa de

reprogramar sua função.


FRAGA, SN

70

O grupo G4 apesar de ter apresentado o mesmo perfil de resposta inflamatória e

de tecido ósseo neoformado que os demais, mostrou um menor grau de

reparo/fibroplasia que o grupo G3. A necessidade de suprir o organismo com

macronutrientes como carboidratos, proteínas e lipídeos é imprescindível para a

manutenção das funções celulares, caso contrário, provavelmente haverá deficiência

funcional das mesmas. Nesse caso, apesar de se tratar de um grupo de animais

desnutridos que adquiriu células de animais nutridos, houve influencia dessa condição

de privação nutricional multicarencial, levando como conseqüência uma resposta

tecidual deficiente.

Os resultados encontrados neste estudo foram satisfatórios, porém, esperava-se

que os mesmo fossem ainda melhor, já que a literatura expõe de forma bem clara o alto

potencial terapêutico das células tronco em organismos normais. Embora a desnutrição

seja capaz de estabelecer um mecanismo compensatório quantitativo sobre as CTAM,

ela pode interferir de forma significativa sobre a capacidade terapêutica dessas células

na terapia celular óssea. Talvez o uso de citocinas, fatores de crescimento teciduais,

como a proteína morfogenética óssea no meio indutor (CHEN et al., 2002), devolva

para essas células o potencial terapêutico esperado. É possível que o uso de células

tronco embrionárias possa promover resultados melhores em reparo ósseo, uma vez que

estas células apresentam uma potencialidade maior em comparação as CTAMO.

Estudos sobre a biologia das células tronco adultas de medula óssea para melhor

caracterização fenotípica e genotípica, tais como expressão e liberação de fatores de

crescimento tecidual por essas células para o meio extracelular, expressão de moléculas

na superfície celular, captação de glicose marcada para avaliar o metabolismo celular,

ainda são necessários, em especial, em situações de agravo nutricional. Esse estudo é

pioneiro, pois, avaliação de reparo ósseo, desnutrição neonatal e reposição nutricional

com células tronco adultas de medula óssea não existem na literatura até os dias atuais e

abre assim, uma linha de pesquisa bastante promissora sobre um tema de grande

interesse à comunidade científica.


FRAGA, SN

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7 APÊNDICES APÊNDICE A – Planilha de evolução ponderal

PLANILHA DE EVOLUÇÃO PONDERAL Projeto de Mestrado: Simone Fraga

GRUPO: ______________________ GAIOLA:_________ D.N.: ______/_____/______

OBSERVAÇÕES: GRUPO EXPERIMENTAL (desnutrição neonatal) Até o 21º dia, as mães serão alimentadas com DBR e os filhotes serão pesados diariamente.

Serão 6 filhotes por mãe. A partir do 22º dia, os filhotes passarão a ser alimentados com Labina®. A partir de agora, os

filhotes serão pesados em dias alternados. GRUPO CONTROLE (Labina®) A alimentação será sempre Labina®, desde o período de aleitamento até o final do experimento.

Também serão 6 filhotes por mãe. O acompanhamento da evolução ponderal será igual a do grupo experimental.

DATAS PESO DOS ANIMAIS (g) PAD - 1 PAE - 2 DM - 3 DP - 4 PPD - 5 PPE - 6

1º dia 2º dia 3º dia 4º dia 5º dia 6º dia 7º dia 8º dia 9º dia

10º dia 11º dia 12º dia 13º dia 14º dia 15º dia 16º dia 17º dia 18º dia 19º dia 20º dia 21º dia

Desmame ------------ ------------ ------------ ------------ ----------- ------------ ------------

REPARO ÓSSEO COM A UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO... 80

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APÊNDICE B – Tabela de coleta de dados usada nas cirurgias

Grupo Rato nº ___ Início da Data cirurgia Data Eutanásia D.N.:___/___/___ Cirurgia ___/___/___ ___/___/___ Gaiola nº ___ _______h Fim da Cavidade Peso pré-eutanásia Peso pré-operatório Cirurgia ________g

________g _______h 1-D ( ) ou 2-E ( )

Lesão óssea ( ) Patologia óssea ( ) Lesão dura-máter ( ) Intercorrências no trans-operatório Intercorrências no pós-operatório Observações:

Grupo Rato nº ___ Início da Data cirurgia Data Eutanásia D.N.:___/___/___ Cirurgia ___/___/___ ___/___/___ Gaiola nº ___ _______h Fim da Cavidade Peso pré-eutanásia Peso pré-operatório Cirurgia ________g

________g _______h 1-D ( ) ou 2-E ( )

Lesão óssea ( ) Patologia óssea ( ) Lesão dura-máter ( ) Intercorrências no trans-operatório Intercorrências no pós-operatório Observações:


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APÊNDICE C – Planilha de avaliação histológica

Avaliação Histológica

Avaliador:

Lâminas HE Lâminas TM

N° lâmina Inflamação Tecido ósseo

Reparo/ Fibroplasia Inflamação

Tecido ósseo

Reparo/ Fibroplasia

Critérios de avaliação relacionados aos três parâmetros: Inflamação: Infiltrado inflamatório, tecido de granulação, vasos, reação de corpo estranho Tecido ósseo: tecido ósseo maturo, tecido ósseo imaturo, osteóide, osteoblastos Reparo/ Fibroplasia: fibras colágenas e fibroblastos


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ANEXOS

ANEXO A – Parecer de aprovação do estudo emitido pela Comissão de Ética em Experimentação animal (CEEA) da UFPE

simone do nascimento fraga reparo Ósseo com a …€¦ · a cada conversa que eu tenho com você,...

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