seminario proteómica

8/6/2019 Seminario protemica

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Miguel Ramrez Lpez.Sergio Medina Mendoza.

Pedro Ossandn Pradenas.

Seminario de Biotecnologa

21 de Junio del 2011

Tecnologa MdicaMorfofisiopatologa y Citodiagnstico


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`

Proteoma: formado por todas las protenas que seexpresan a partir del genoma de un organismo.

PROTEOMICA

CONOCERESTRUC. PRIMARIA

MOD. POST-TRADUCC.

LOCALIZACION

CUANTIFICACION


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Protemica de expresin:Estudio cuantitativo de la expresin de protenas.

Protemica del mapa celular o estructural:

Estudio de la localizacin subcelular de laprotenas y de la interaccin protena-protenamediante la purificacin de orgnulos y finalmentela identificacin de sus componente por

espectrometra de masas.


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` Bsqueda de Biomarcadores: molculas que sirvencomo indicadores del estado fisiolgico, y de loscambios que se producen en el proceso y desarrollo deun padecimiento

` Enfermedades Crnicas: Ej.: Caso de Obesidad.

` Enfermedades Infecciosas: Estudio de husped y del

agente patgeno.


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` Empleada para el anlisis global del proteoma,mediante dos etapas o dimensiones.


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MUESTRA PREPARA A

1 SEPARACIN

Protean IEF cell (BioRad)

2 SEPARACIN

Protean Plus odeca Cell(BioRad)

VISUALIZACIN

ELECTROFORESIS

A QUISICIN YIGITALIZACION

Escner de Fluorescencia

ensitmetroANLISIS

Software informtic P Quest

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL


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` Tcnica analtica de gran sensibilidad empleadapara identificar y caracterizar protenas.un espectrmetro de masas esta formado

bsicamente por: fuente de iones. analizador de masas.detector.


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La huella peptdica de una determinada protenaes un conjunto de pptidos generados mediante ladigestin de una proteasa especifica.

` Identifica protenas de forma rpida` igestin con tripsina` Las masas proteicas experimentales son

comparadas con masas proteicas tericaspresentes en la base de datos.` eben coincidir para identificar las proteinas


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` Cromatografa Multidimensional: Se requiere unadigestin previa antes de la separacin de las protenaspor carga e hidrofobicidad.1: Cromatografa Bidimensional2: Anlisis peptdico con MS

` Arrays de protenas: caracterizar actividades, ydeteccin protena-protena.


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` ICAT (Isotope Coded Affinity Tag):

2 muestras son marcadas con un istopo, que se une a lascistenas, luego se separan en una columna de afinidad yanalizados con MS.

` DIGE ( ifferential Gel Electroforesis): Se basa en una separacinde protenas en un 2 -PAGE y luego marcacin con flurocromos.


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` La protemica proporciona un conjunto de herramientasmuy poderosas para el estudio a gran escala de lafuncin de los genes a nivel de la protena.

` Estas herramientas son muy importantes en la saludpblica, porque nos otorga mecanismos para estudiospoblacionales de protenas que pueden estar alteradasen respuesta a una patologa.


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` Protemica salival para el descubrimiento

de biomarcadores del cncer oral


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biomolculas que se determinan en un tejido o fluidocorporal para definir una enfermedad a nivel molecular ypara predecir la respuesta a una terapia.


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H

IPTE

SIS:` Los biomarcadores presentes en la saliva son tiles para detectar

precozmente el carcinoma oral de clulas escamosas (OSCC).

OBJETIVOS:

` Identificar biomarcadores que en su conjunto puedan mejorar lasensibilidad y especificidad en la deteccin del carcinoma oral declulas escamosas (OSCC).

` Validar con tcnicas de Inmunobloting y Elisa protenassobreexpresadas en pacientes con OSCC para utilizarlas comobiomarcadores del OSCC.

` Determinar y analizar protenas que se expresan slo enpacientes con OSCC, protenas que se expresan en pacientessanos y aquellas que se expresan en ambos grupos.


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MATERIALES Y MTO OS

N Hombres MujeresEdadmedia

Pacientes OSCC

64 44 22 54 aos

Pacientes sanos

64 44 22 46.9aos

Totalpacientes

128

PROTOCOLO DE

RE

COLE

CCIN

DE LAS MUESTRA

Muestra de saliva antes deenjuagar con agua.

Centrifugacion a 2600 x g durante15 min. A 4 C para eliminardesechos y celulas

Se agrega el inhibidor de proteasa,para asegurar la preservacion de la

integridad de las proteinas.

Muestras son alicuotadas enpequeas cantidades y almacenan

a -80 C.


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Shotgun proteome analysis:Basado en cromatografa inversa de fase lquida.

` Posterior LC espectrometra de masas

` Concentracion de proteinas se midio utilizando unKit 2 Quant.` 2% de falsos positivos.


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ELECTROFORESIS EN DOS DIMENSIONES ENGEL

utilizado para mapear las proteinas en las

muestras de saliva.Las proteinas de ambas muestras se precipitaron

en etanol fro toda la noche.Centrifugacion 14.0000 x g por 20 min.

Los 100 mg de proteinas totales obtenidas de lasmuestras son analizados en E 2 .


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InmunoensayosPara inmunotransferencia : Los anticuerpos

testeados fueron MRP14, PROFILINA, C 59,

CATALASA, PROTEINA Rab-7, MOESINA

Las bandas fueron detectadas por quimioluminiscencia y cuantificado con Scion

imgenes de software.


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Pacientes con OSCC P. Sanos y con OSCC Pacientes sanos

52 409 29

CANTI A E PROTENAS ETECTA AS

MRP14 M2BP CD59 Profilina Catalasa

BIOMARCA ORESPROPUESTOS


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CONCLUSIN:

` el estudio proteomico de muestras salivales comprende

una nueva herramienta clnica y diagnstica no invasiva enla deteccin del carcinoma oral de clulas escamosas(OSCC).

` La validacin de 5 biomarcadores proteicos expresados en

pacientes con OSCC demuestran la sensibilidad yespecificidad de las tcnicas proteomicas y su importanciaen la medicina.


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Miguel Ramrez Lpez.Sergio Medina Mendoza.

Pedro Ossandn Pradenas.

Seminario de Biotecnologa

21 de Junio del 2011

Tecnologa MdicaMorfofisiopatologa y Citodiagnstico

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