apresentação proteómica tp1

Departamento de Química e Bioquímica, Licenciatura em Bioquímica

Biologia Molecular 2012/2013

Docentes:

Margarida Amaral, Anabela Ramalho

Discentes:

Alexandra Salvado, nº40267

Andreia Sousa, nº40261

Licenciatura em Bioquímica, Biologia Molecular 2012-2013

Tópicos a abordar

• Os princípios da genómica e proteómica;

• Diferentes tipos de técnicas de proteómica e respectivo

equipamento;

• Análise e interpretação de resultados;

• Exemplos de aplicação.

2 FCUL, Departamento de Química e Bioquímica


Genómica

• Ciência que estuda o genoma completo de um

organismo.

determinar a sequência completa do DNA de organismos

ou apenas uma sequência de interesse

• Mas estas informações não são suficientes para saber

quais são as proteínas que estão a ser realmente

expressas na célula, num dado momento e numa

determinada condição

FCUL, Departamento de Química e Bioquímica 3


Genómica funcional

• Ciência que descreve a função de genes e proteínas

• Tenta explicar:

• Função do DNA a nível dos genes;

• Transcrição de RNA (transcriptómica)

• Síntese de proteínas (proteómica)

Genómica funcional ≠ Genómica


Enquanto a genómica foca-se em

aspetos estáticos tais como:

• Sequenciação de DNA;

• Estudos estruturais

A genómica funcional foca-se em

aspetos dinâmicos tais como:

• Transcrição de um gene;

• Tradução e interações entre

proteínas


Genómica e Genómica funcional


Genómica DNA (gene)

RNA

Proteína

Transcrição

Tradução

Transcriptómica

Proteómica

Genómica

funcional

Visão mais abrangente de como uma função biológica surge a partir da

informação codificada a partir do genoma de um organismo


Um pouco de história…

• 1970 – criação de bases de dados de proteínas usando a

técnica eletroforese bidimensional;

• 1994 – Wilkins e Willians propuseram o tema proteoma

como sendo todo o conteúdo de proteínas expressas por

um genoma;


Para compreender na totalidade a função génica era necessário o estudo

em larga escala das proteínas expressas

A análise das sequências dos nucleótidos nem sempre reflete uma relação

direta com os níveis de proteínas expressas e consequentemente com a

atividade biológica


Proteómica

• Ciência que estuda o conjunto de proteínas e as suas

isoformas (que são determinadas pelo genoma) contidas

numa amostra biológica

• Método direto para identificar, quantificar e estudar as

modificações pós-traducionais das proteínas numa

célula;

• É o equivalente proteico do genoma


• Organismo

• Tecido

• Célula

• Organelo celular


Proteómica: como surgiu?

• Necessidade de se investigar o controle da expressão

génica e os seus impactos no metabolismo celular;

• Informações importantes como:

• Quais as proteínas que são expressas;

• Os níveis de expressão destas proteínas;

• O momento de expressão destas proteínas;

• Modificações pós-traducionais;

• Interações entre proteínas;

• Respostas expressas pelas células em diferentes situações ou

tratamentos;

• Diferenças moleculares entre linhagens de células.



Proteómica vs. Genómica


• Estudo da estrutura, função e

controlo dos sistemas biológicos

através das propriedades das

proteínas;

• Conhecimento acerca da

abundância, atividade e estrutura

das proteínas expressas por uma

célula

• Não é estática: modifica-se de

acordo com as condições e

estímulos a que um organismo

está exposto

• Estudo apenas da sequência dos

genes (genoma);

• Não elucida muitos dos processos

biológicos;

• Não se obtém dados sobre a

expressão dos genes, a

quantidade expressa e o

funcionamento dos seus

produtos;

• É estática.

Ponte de ligação entre o genótipo e o fenótipo de um organismo


Fatores que afetam o proteoma duma célula


Genoma

Proteoma

Interações entre

proteínas

Temperatura

Substâncias químicas

Infeção por organismos patogénicos

Condições ambientais

Expressão génica


Proteómica: Vantagens e Desvantagens

• Vantagens

• estudo da expressão génica em condições específicas;

• identificação de proteínas que sofrem modificações pós-

traducionais (que não são detetadas por análise do genoma).

• Desvantagens

• Limitações

• Só uma parte das proteínas sintetizadas pode ser detetada

experimentalmente;

• Degradação da amostra.



Proteómica: técnicas utilizadas

• Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida • Separação (por carga e massa), deteção e quantificação das

proteínas

• ICAT (isotope-coded affinity tags) • Permite identificar diferenças no conteúdo proteico de duas amostras

• Microarrays de proteína • Interacções das proteínas e as suas funções

• Espectrometria de massa • Fragmentação de proteínas;

• Análise de péptidos;

• Identificação das proteínas (bioinformática).



Preparação da amostra

• Rutura celular através de:

• Métodos químicos (detergentes, solventes orgânicos,

entre outros)

• Métodos físicos (homogeneização com misturador,

agitação mecânica, entre outros)

• Solubilização e desnaturação das proteínas


Figura 2. Esquema da preparação da amostra.

Figura 1. Homogeneizador

de Potter – Elvehjem.


Eletroforese 2D – princípios

• Consiste em separar, sob a influência de um campo

elétrico, moléculas carregadas.

• A velocidade de migração depende de:

• Tamanho

• Forma

• Carga elétrica

• Numa eletroforese 2D, as proteínas são submetidas a

duas etapas de separação eletroforética consecutivas:

• Etapa de 1ª dimensão

• Etapa de 2ª dimensão



Eletroforese 2D – etapa de 1ª dimensão

• Consiste numa focagem isoelétrica: proteínas são

separadas pela sua carga elétrica através de um

gradiente de pH


As proteínas migram no gel até atingirem uma posição estacionária,

onde o seu pI é igual ao valor de pH (carga nula)

Figura 3. Primeira dimensão: focagem isoelétrica das proteínas.


Eletroforese 2D – etapa de 2ª dimensão

• As proteínas são submetidas a uma eletroforese

desnaturante em gel de poliacrilamida – SDS-PAGE;


As proteínas (carga global negativa) são separadas de acordo com as suas

massas moleculares – proteínas de maiores dimensões migram menos no gel

Figura 4. Segunda dimensão: SDS-PAGE.


Eletroforese 2D - Equipamento

• Focagem isoelétrica

• SDS-PAGE


Figura 5. Equipamento utilizado numa

eletroforese de focagem isoelétrica.

Figura 6. Equipamento utilizado numa eletroforese SDS-PAGE.

Unidade de

focagem

isoelétrica Câmara de

focagem

isoelétrica


Eletroforese 2D – Resultados I

• Os resultados da eletroforese são visíveis através de

vários métodos de deteção:

• Coloração de proteínas

• Corantes (Azul de Coomassie, nitrato de prata, entre outros)

• Reagentes fluorescentes

• Fluorografia ou autoradiografia

• Deteção de proteínas marcadas radioativamente (incorporação de 3H, 14C, 35S, 32P, 33P ou 125I às proteínas)


Aplicados juntamente com os métodos anteriores


Eletroforese 2D – Resultados II

• No final da eletroforese 2D obtém-se um gel contendo numerosas

manchas (“spots”) bem separadas, cada uma correspondente a uma

proteína ou a uma forma proteica.


Figura 7. Eletroforese bidimensional 2D-PAGE utilizado na análise de proteomas.


Eletroforese 2D – vantagens e desvantagens

Vantagens

• Boa resolução para proteínas;

• Deteção de modificações pós-

traducionais;

• Comparações quantitativas;

• Boa avaliação visual para

amostras pouco complexas


Desvantagens

• Limitado pelo intervalo de pH;

• As proteínas pouco abundantes

são de difícil deteção;

• Quando a quantidade de

proteínas é muito elevada a

resolução é baixa

• Análise e quantificação são

difíceis.


Eletroforese 2D – Exemplo


Figura 8. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C. albicans na faixa de pH de 3 a 10 com

tratamento com fluconazol na concentração de 1400 µg/mL em géis corados pelo azul de Coomassie.


Eletroforese 2D – Exemplo


Figura 9. Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C. albicans com tratamento com fluconazol na

concentração de 1400 µg/mL, visão ampliada das proteínas alteradas.

Alterações verificadas:


ICAT

• O método utiliza 2 marcações:

• Marcador leve

• Marcador pesado (átomos de H são substituídos por D)

• O marcador é constituído por:

a) Um grupo químico que reage com os grupos específicos das

proteínas (por exemplo: se reagir com o grupo tiol, o marcador

liga-se a todas as cisteínas na proteína)

b) Grupo biotina


Figura 10. Estrutura de um reagente ICAT especifico para os grupos tiol das proteínas.


ICAT – Como aplicar?

1. Aplicar o marcador leve a uma das amostras e o marcador pesado a outra;

2. Clivar as proteínas com tripsina (Atenção: os fragmentos com cisteína continuam marcados!)

3. Juntar os dois extratos proteicos;

4. Cromatografia de afinidade (liga a biotina da molécula de ICAT e portanto os fragmentos de interesse)

5. Obtém-se uma mistura idêntica de péptidos (os péptidos de cada amostra diferem 8 Da)

6. Espectrometria de massa


Sinais aos pares, separados por 8 unidades de

massa, com a mesma abundância

A não ser que a proteína esteja a ser expressa em

diferentes quantidades nas amostras


ICAT – Estratégia (I)


As proteínas isoladas de uma célula

saudável são tratadas com o

marcador leve (amostra de controlo)

enquanto as proteínas isoladas de

uma célula doente são tratadas com o

marcador pesado

Os péptidos marcados com ICAT são

separados dos outros péptidos por

cromatografia de afinidade

Figura 11. Estratégia de atuação do ICAT.


ICAT – Estratégia (II)

• Espectrometria de massa


Quantificação de proteínas Identificação de proteínas

• Cromatografia liquida de afinidade

Figura 12. Exemplos de cromatograma e de espectro obtido por cromatografia liquida de afinidade e

espectrometria de massa, respetivamente.


ICAT – Exemplo (Proteoma de T. Cruzi)

• Doença de Chagas (Chaguismo)

• Também conhecida por tripanossomíase americana;

• É uma infecção causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi


Figura 13. Exemplo esquemático de estratégia utilizada

para o estudo de proteoma. (Retirado de Kalume et al. 2005)

Resultados:

Expressão conservativa entre as

formas evolutivas epimastigota,

tripomastigota e amastigota.


ICAT – Exemplo (Proteoma de T. Cruzi)

• MAS…

• O número de proteínas focalizadas no gel e o número de

identificações obtidas representaram uma pequena parte de todo o

proteoma de cada forma evolutiva.


ICAT – análise quantitativa das proteínas

das formas tripomastigota e amastigota

29 proteínas com níveis ~ de expressão

9 proteínas predominantes na forma tripomastigota

3 proteínas predominantes na forma amastigota


Espectrometria de massa – I

• O espectrómetro é um aparelho complexo que:

• Vaporiza os compostos a analisar;

• Produz iões (em fase gasosa);

• Separa iões de acordo com a sua razão massa/carga (m/z).


Obtém-se um gráfico da abundância

dos iões a cada razão m/z obtida

• É constituído por:

• Sistema de introdução da amostra (input);

• Fonte de iões (câmara de ionização);

• Analisadores (separação dos iões);

• Detetor de iões;

• Sistema de tratamento de dados. Figura 14. Espectrómetro de massa.


Espectrometria de massa – II


Sistema de

introdução da

amostra

Fonte iónica

(iões em fase

gasosa)

Analisador

(Separação dos

iões)

Detetor

(deteção dos

iões)

Sistema de

dados

(tratamento de

dados)

Espetro de massa

Vácuo


Espectrometria de massa – III


Câmara de

Ionização

Campo

magnético

Campo

elétrico

Figura 15. Espectrómetro de massa e todos os seus principais componentes.


Espectrometria de massa - Fonte iónica (I)

• Na análise de proteínas, a fonte de iões mais utilizada é:

• MALDI (matrix-assisted laser desorption/ ionisation)


Porquê? A amostra é misturada com a matriz (composto

orgânico conjugado).

As matrizes são projetadas de forma a ter um máximo

de absorção ao comprimento de onda do feixe do laser.

O laser causa a excitação e a vaporização do solvente

e a amostra fica na fase gasosa.


Espectrometria de massa - Fonte iónica (II)


Desvantagens

• Se a concentração da solução

é desconhecida, é necessário

realizar diluições em série da

amostra

Melhores resultados na gama de

concentrações 0,1-10 pmol mm-3

Vantagens

• Método de ionização suave;

• Como a matriz absorve quase

toda a radiação, aumenta a

probabilidade da amostra ficar

ionizada sem fragmentar

• Produção de iões de massa

molecular elevada com

elevada sensibilidade;


Espectrometria de massa – analisador (I)

• Na análise de proteínas, o analisador mais utilizado é:

• TOF (“time of flight”)


Porquê? • Os iões entram num tubo de voo em que os iões

mais leves migram mais rapidamente, chegando em

primeiro lugar ao detetor.

• Os iões são separados com base na razão m/z, uma

vez que é aplicado, ao mesmo tempo inicial, o

mesmo potencial

• Vantagens:

• Virtualmente, não existe limite de massa molecular para amostra


Espectrometria de massa – MALDI-TOF (I)


Figura 16. Esquema do funcionamento da espectrometria de massa MALDI-TOF.


Espectrometria de massa – MALDI-TOF (II)

• Desvantagem: esta técnica é afetada por corantes, sais,

tampões ou detergentes (iónicos ou não iónicos)


Remover estes compostos por:

• Lavagem;

• Diálise;

• Resinas de troca iónica;

• Cromatografia de pipeta (cromatografia de fase

reversa em que a amostra se liga ao interior da

pipeta enquanto os sais não, a amostra é depois

removida com solventes orgânicos, exemplo:

acetonitrilo 50-75%)

Figura 17. Cromatografia de pipeta.

Solução?


Análise quantitativa de complexos proteicos

• A análise do proteoma envolve os seguintes passos:

1. Corrida em gel (eletroforese unidimensional ou bidimensional);

2. Corar a amostra (ex: azul de Coomassie);

3. Encontrar as proteínas de interesse

4. Extrair e clivar as proteínas

5. Análise da massa dos resultados

6. Procurar correspondências numa base de dados


• Ferramenta Mascot de Matrix Science

• Protein prospector

• NCBInr

• Ferramenta SwissProt do Expasy


Espectrometria de massa – exemplo


Figura 18. Exemplo de espectro obtido por espectrometria de massa

para a parvalbumina de jacaré.


Aplicações da Proteómica

• Mining de Proteomas

• Perfil de expressão de proteínas

• Identificação de interações proteína-proteína

• Mapeamento de modificações de proteínas



Mining de Proteomas

• Objetivos:

• Identificar o maior número possível de componentes do proteoma

• Catalogar todo o proteoma duma célula, num dado momento

• Interesse:

• Estudar as mudanças na composição proteíca dos proteomas


Associadas a doenças num organismo

Utilidade como marcadores de diagnóstico

(biomarcadores)


Perfil de Expressão de Proteínas - I • Objetivo:

• Medir a expressão de um conjunto de proteínas em duas amostras

e depois compará-los


Detetar e identificar as

mesmas proteínas nas duas

amostras

Ferramenta bioinformática:

MelanieTM

• interface para visualizar, explorar e analisar as imagens do gel

de electroforese 2D

• identificar os marcadores de proteína de interesse através de

análise de expressão diferencial

MelanieTM

Problemas

• Este método pode indicar apenas o nível do produto do gene por

si só e não a forma como as proteínas são modificadas


MelanieTM – Output


Análise:

• Presença ou ausência de spots

• Volume dos spots: quantificação

relativa

• Posição dos spots: modificações

pós-traducionais

Figura 20. Aspecto de um output do programa MelanieTM.


Identificação de interações proteína-proteína

• Imunoprecipitação

• Utilização de anticorpos monoclonais para remover a proteína de

interesse

• Phage Display (“Exibição de fagos”)

• Através da utilização de fagos (ex. M13) permite o rastreio dos clones

obtidos devido à ligação do fenótipo (o péptido de interesse) com o

genótipo (o vetor de clonagem) que o expressou.

• The Yeast Two Hybrid System (“Sistema do duplo híbrido”)

• Permite detectar in vivo interacções proteína-proteína – através de

um ativador transcricional que leva à expressão de um gene



Mapeamento das modificações da proteína – I

• Mapear as MPTs = identificar em que resíduo se

encontra a alteração

• Essa alteração pode ser (entre outras):

• Fosforilação – adição de um grupo fosfato (PO4) a um aminoácido

• Acetilação – introdução um grupo funcional acetil

• Alquilação – transferência de um grupo alquilo

• Metilação – substituição de H por um grupo metil (CH3).


Espectrometria

de massa


Contribuições da Proteómica

• Tendo em conta todas as aplicações da proteómica, esta

pode ser aplicada a:


Estudo de agentes

infecciosos

Desenvolvimento

de novos fármacos

Marcadores de

diagnóstico

(biomarcadores)

Cancro

Doença de Alzheimer


Conclusão

• A proteómica é um método direto

amplamente utilizado para identificar,

quantificar e estudar as modificações

pós-traducionais das proteínas de uma

célula;

• As técnicas mais utilizadas são a

eletroforese bidimensional e a

espectrometria de massa;

• As suas aplicações são vastas;

• Os seus contributos para o

desenvolvimento de novos fármacos e

de marcadores de diagnóstico são de

grande importância.


Figura 22. Interação entre as proteínas da célula

de levedura.


Bibliografia

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apresentação proteómica tp1

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