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OSMOSE ET PERMEATION (TP1)

A. INTRODUCTION

Le potentiel osmotique

Le potentiel osmotique désigné par le symbole Ψs, est fonction de la température, de la concentration de la substance dissoute, et de ses caractéristiques de dissociation.

Le potentiel hydrique La notion de potentiel hydrique a été largement discutée au cours.

Pour éclaircir des problèmes de terminologie, nous donnerons le tableau suivant :

Milieu intérieur Milieu extérieur = int - ext

Iso-osmotique Isotonique équilibre = 0

Hypo-osmotique Hypertonique plasmolyse > 0

Hyper-osmotique Hypotonique turgescence < 0

B. Evaluation des paramètres osmotiques A) Détermination du potentiel de succion tissulaire

Les tubercules de pommes de terre sont constitués essentiellement de parenchyme de réserve. En mettant à profit la grande homogénéité de ce tissu, il est possible de réaliser un certain nombre d'expériences, telles que la mesure du poids frais ou d'une longueur, sur des fragments de tubercule.

1. Préparation du matériel

- Prendre trois pommes de terre, les placer dans l’appareil afin de découper les tubercules en parallélépipèdes de section carrée (env. 0,5 cm de côté). - Conserver les segments de tissus dans un papier sopalin humide. - Ajuster alors les fragments de tissus à une longueur déterminée de 4cm (au couteau de précision). - Essuyer légèrement les segments de tissus ainsi obtenus sur un papier sopalin et les répartir en lots de 4, numéroté de 1 à 6. - Déterminer rapidement, sur les balances, le poids frais (PF0) de chaque lot (1 à 6).

2. Mode opératoire

- Préparer dans 6 tubes Falcon de 50 mL des solutions de saccharose aux concentrations indiquées (ci-dessous), à partir d'une solution stock (2M).

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- Incuber vos lots de fragments de pomme de terre dans chacun des tubes.

- Après 1 heure d’incubation, mesurer pour chacun des lots, le poids frais PFf ainsi que

la longueur moyenne Lf de chaque lot (légèrement essuyer les segments sur un papier

sopalin).

On calculera alors :

Pression osmotique d’une solution idéale (formule de Van t’Hoff) :

Π =RT/V.log aw ≈ i x CB x R x T x 1000 en Pa (1 bar = 101325 Pa)

3. Résultats

Reporter sur un graphique, les courbes correspondant au L et au PF, en fonction de la concentration molaire (M) du saccharose.

Pour chacune des courbes, déterminer la valeur de la concentration de saccharose correspondant à l'intersection avec l'abscisse. Calculer les valeurs théoriques idéale de Π pour les différentes solutions suivant la formulation de Van t’Hoff. Calculer à partir de cette valeur, le potentiel hydrique des tissus (ΨW = ΨS = -Π car ΨP = 0 au point d’intersection sur l’axe des abscisses). Exprimer alors ΨW en MPa et en Bar.

Rappels : 0 °C = 273,15 K ; R = 8,31 J/mol.K ; i = 1 pour le saccharose et pour le sorbitol, 2 pour le NaCl ; CB = Concentration Molaire de la solution. B) Observations microscopiques Les lambeaux épidermiques, constitués d'une assise cellulaire unique, permettent une observation microscopique aisée des cellules qui les composent. Les vacuoles de ces tissus

Tube Ψs (bars) expérimentale

Concentration finale (M)

Calcul Ψs (bars) Solution idéale

1 0 0,00

2 -2,6 0,10

3 -5,2 0,20

4 -11 0,40

5 0,60

6 -25,2 0,80

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occupent la presque totalité de l'espace cellulaire. Il est ainsi possible, en plongeant ces lambeaux dans des solutions de potentiel osmotique variable, d'étudier les échanges d'eau entre les cellules et le milieu extérieur, et, d'obtenir, sur la base d'observations microscopiques, des informations sur le potentiel hydrique cellulaire.

1. Mode opératoire

- Inciser délicatement, à l'aide d'un scalpel, dans l'épiderme intérieur d'un épiderme de

feuille de mâche.

- Détacher avec une paire de brucelles à pointes fines, le fragment épidermique ainsi délimité en le saisissant par un des coins.

- Placer le lambeau (face déchirée vers le bas) dans 1 mL d’une solution de sorbitol (6 tubes Eppendorf). Ajouter de 20µL de Rouge Neutre dans chaque tube Eppendorf.

- Après 5 min., observez entre lame et lamelle au microscope. Une observation à la fois !

- Dessinez les points extrêmes de turgescence et de plasmolyse, puis cherchez les points encadrant l’isotonie.

Choisir au microscope une zone facilement observable.

Observez la cellule et ses différents compartiments et organites, puis évaluez le potentiel hydrique cellulaire.

2. Evaluation du potentiel hydrique cellulaire

A l'isotonie, le potentiel hydrique de la cellule est égal au potentiel osmotique du milieu extérieur.

On utilisera des solutions de sorbitol (substance qui ne pénètre pas ou peu dans les cellules) à différentes concentrations (0 ; 2; 6; 8 ; 10 et 15 %).

En travaillant chaque fois avec un lambeau frais, noter la concentration C, pour laquelle il y a une légère plasmolyse.

Déterminer par le calcul, la concentration molaire de sorbitol qui se rapproche le plus de l'isotonie et déduire le potentiel hydrique cellulaire en Mpa et en Bar.

C) Quelques propriétés des protoplastes foliaires

Le protoplaste est une cellule dont on a fait disparaître (mécaniquement ou enzymatiquement) la paroi. En l'absence des potentiels hydrostatiques (pressions) normalement exercées par la

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paroi sur le contenu cellulaire, il n'est stable que dans des conditions isotoniques (ou légèrement hypertoniques) et prend alors une forme sphérique. Les protoplastes permettent d'étudier un certain nombre de caractéristiques du plasmalemme (perméabilité, charges, ...). Nous observerons la pénétration de deux types de colorants, pour lesquels le plasmalemme présente une perméabilité sélective.

1. Isolement des protoplastes

1.1. Incubation enzymatique

- Peler délicatement, à l'aide d'une brucelle à pointes fines, l'épiderme inférieur de 3-5 feuilles de mâche (Valerianella olitoria), et découper le mésophylle en lanières de 1mm² environ. Travailler sur un papier humide, pour éviter le dessèchement.

- Déposer immédiatement dans une boîte de Pétri 2 ml contenant une solution enzymatique TL déjà prête, contenant des cellulases, des pectinases et du sorbitol. Expliquer le rôle de ces divers composés.

- Déposer les fragments de feuilles (face pelée vers le bas) à la surface de la solution d'incubation.

- Envelopper la boîte de Pétri d'une feuille d'aluminium (obscurité) en y notant votre poste de travail et incuber à 30°C durant 60 minutes sur un agitateur orbital (50-100 tpm) - (Attention à ne pas renverser la boîte).

1.2. Purification

- Filtrer la suspension de protoplastes à travers un filtre nylon (100 µm), pour éliminer les restes de feuilles non digérées et récupérer le filtrat dans un tube Falcon de 50 mL. Rincer le matériel après usage.

- Centrifuger 1,5 mL de la suspension de protoplastes (tubes eppendorf de 1.5 mL, 500

tpm, 5 min).

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- Eliminer le surnageant et laisser 100-150 µL de solution. Rincer avec 500 µL de tampon dépourvu des solutions enzymatiques. Centrifuger de nouveau. Le culot de protoplastes sera suspendu avec 100 µL de solution en tapotant sur le tube. Ne surtout pas vortexer.

- Conserver cette suspension de protoplastes dans son tube eppendorf et agiter doucement avant usage.

2. Observation et comptage des protoplastes

- Prélever une goutte de suspension de protoplastes (env. 20µL) et la déposer sur la gouttière centrale de la cellule de comptage (Malassez, voir explication). Estimer le nombre de protoplastes isolés et leur concentration (protoplastes/mL). - Observer alors, à un grossissement final de 400x-600x, les détails morphologiques des protoplastes. Dessiner une cellule de protoplaste et déterminez la position des chloroplastes, des vacuoles etc...

Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un quadrillage :

Le volume de comptage est déterminé par : -la surface du quadrillage gravé sur la lame. -la profondeur de la chambre.

Parmi les 100 rectangles totaux, on trouve 25 rectangles qui sont divisés en 20 petits carrés afin de faciliter le comptage.

→ Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3 = 1 µL

→ Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm3 = 10 nL

Lamelle planée Lame porte - objet

Profondeur de la chambre

Rigoles

Quadrillage

Plateaux surélevés

Plate-forme centrale

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Pour la Numération

Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifier l’homogénéité de la répartition des

cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer). Régler le contraste et la lumière pour observer

la grille et les protoplastes.

Observer ensuite à l’objectif x40 ou à x60 pour réaliser le comptage (Voir instructions).

Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage.

Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui chevauchent 2

arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les cellules chevauchant la ligne

horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).

3. Perméabilité sélective

- Pipeter délicatement 20 µL de la suspension de protoplastes sur deux lames de microscopie. - Ajouter sur les lames 1 et 2, respectivement, 20µL, des colorants suivants :

: Rouge neutre 0.1 % v/v en solution TL.

: Phénosafranine 0.1 % v/v en solution TL. - Recouvrir d’une lamelle et après 2 min, observez au microscope. NE PAS LAISSER

SECHER !

Pour les deux essais, déterminer, le nombre de protoplasmes colorés (A compter sur 20 protoplastes sans a priori).

Commenter les résultats.

Numération sur le rectangle = 7 protoplastes

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Annexes :

Solution TL :

10% Sorbitol Tampon MES pH 6.15 0.05 M

Ajouter extemporanément (en cours de TP):

50 % de sorbitol 20% 50 % de MES 100 mM

0.1 g de Cellulase Sigma (C-8546) 0.2 g de Pectinase Fluka (17389)