Imunomarcação da p63 em carcinoma espinocelularde boca e orofaringe e comparação com os grausde malignidade

1) Doutora em Patologia Bucal pela Universidade de São Paulo; Docente do Programa de Mestrado em Odontologia da Universidade Ibirapuera.2) Doutor em Medicina pelo Curso de Pós-Graduação em Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina; Professor Titular do Departamento de Otorrinolaringologia – Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Universidade Metropolitana de Santos; Docente do Curso Pós-Graduação em Ciências da Saúde do Complexo Hospitalar Heliópolis, São Paulo.3) Doutor em Medicina pelo Curso de Pós-Graduação em Anatomia Patológica da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina; Professor da Disciplina de Patologia do Curso de Medicina da Universidade Metropolitana de Santos.4) Doutora em Patologia Bucal pela Universidade de São Paulo; Responsável pela Disciplina de Patologia Geral e Bucal do Curso de Odontologia da Universidade Metropolitana de Santos; Docente do Programa de Mestrado em Ciências da Reabilitação do Centro Universitário Nove de Julho.5) Residente de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Ana Costa, Santos; Mestrando do Curso Pós-Graduação em Ciências da Saúde do Complexo Hospitalar Heliópolis, São Paulo.

Instituição: Universidade Metropolitana de SantosCorrespondência: Cristiane Miranda França, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 948 apto. 93- Cep.:04014-002 São Paulo, SP. E-mail: crispadron@uol.com.brRecebido em: 25/07/2007; aceito para publicação em: 29/09/2007; publicado on line em: 10/11/2007.

Artigo Original

Immunolabelling of p63 in oral and oropharyngeal squamouscell carcinoma and comparison with the degree of differentiation

RESUMO ABSTRACT

Introdução: o carcinoma espinocelular (CEC) é a neoplasia maligna mais freqüente da cavidade oral e, apesar dos avanços dos métodos de diagnóstico, a sobrevida ainda é menor que 50%. Marcadores tumorais têm sido pesquisados no intuito de obterem-se informações mais precisas sobre o prognóstico dos pacientes e a proteína p63 é uma das candidatas a desempenhar esse papel. Objetivo: avaliar, por meio de análise imunoistoquímica, a possível associação entre a expressão da p63 e os graus de malignidade de carcinomas de boca e orofaringe. Material e Método: Foram selecionados 14 casos de CEC de boca e orofaringe dos arquivos de dois Serviços de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e os cortes obtidos a partir dos blocos de parafina submetidos à análise imunoistoquímica. Os tumores foram classificados em alto e baixo grau de malignidade e os escores comparados com a imunomarcação da p63. Resultados: Seis casos (43%) foram classificados como de baixo grau e, destes, quatro positivos e dois negativos para a p63, enquanto oito casos (57%) classificados como de alto grau, três foram positivos e cinco negativos para p63. Conclusão: houve uma tendência da proteína p63 ser expressa nos tumores com melhor diferenciação, todavia, maior número de casos e estudo em separado das isoformas da p63 são necessários para confirmar esses resultados.

Descritores: Neoplasia de cabeça e pescoço. Proteína supresso-ra de tumor p63. Imunoistoquímica.

Introduction: Squamous cell carcinoma (SCC) is the most frequent malignant neoplasm of the oral cavity and oropharynx and albeit the advances in diagnosis, the overall survival of the patients is less than 50%. Tumoral markers have been searched in order to obtain more precise information on the prognosis of the patients and p63 protein is one of the candidates do play this role. Objective: to evaluate immunohistochemically the putative association between the expression of p63 protein and the malignity degrees of oral cavity and oropharynx carcinomas. Materials and methods: 14 cases of SCC of oral cavity and oropharynx were selected from the archives of two services of Head and Neck Surgery and the specimens obtained from paraffin blocks underwent imunohistochemical analyzes. The tumors were classified in high or low degree of malignity and the scores compared with the immunolabelling of p63. Results: 6 cases (43%) were classified as low degree and from these, 4 were positive and 3 negative to p63 labelling. The other 8 cases (57%) were classified as high degree and from these, 3 were positive and 5 negative to p63 protein. Conclusion: there was a trend of the p63 protein to be expressed in tumors with higher differentiation, although to confirm these results a higher number of specimens, as well as a study of the different isoforms of the protein are necessary.

Key words: Head and neck neoplasms. Tumor suppressor protein p63. Immunohistochemistry

Rev. Bras. Cir. Cabeça Pescoço, v. 36, nº 4, p. 212 -214, outubro / novembro / dezembro 2007212

1Cristiane Miranda França2Rogério Aparecido Dedivitis3Ângelo Sementilli4Manoela Domingues Martins5Elio G. Pfuetzenreiter Jr.

INTRODUÇÃO

O carcinoma espinocelular (CEC) é o tumor maligno mais freqüente da cavidade oral e têm demonstrado aumento na sua incidência. A morbidade e mortalidade relacionadas ao CEC são elevadas e menos de 50% dos pacientes obtém cura. Vários fatores têm sido estudados para estabelecer o prognós-tico para os portadores de CEC, no entanto, na maioria dos casos, as metástases regionais em linfonodos é considerado o principal fator prognóstico e sua incidência varia de 35,3% a

1 60% . Recentemente, outro fator associado ao prognóstico do CEC é a amplificação do cromossomo 3q21-29, onde está

1-3localizado o gene TP63, que codifica a proteína p63 .A proteína p63 é um homólogo da proteína p53, sendo crítica

para o desenvolvimento e manutenção dos epitélios estratifica-dos. Animais knockout sem o gene p63 apresentam alterações no desenvolvimento, sendo a mais importante a ausência total de epitélio estratificado e seus derivados, incluindo epiderme, glândulas mamárias e próstata. Dados adicionais sugerem que essa proteína é crucial para o desenvolvimento e manutenção das células progenitoras do epitélio estratificado, estando

5,6envolvida na tumorigênese do mesmo .Recentemente, tem havido considerável interesse no papel da p63 na regulação da proliferação e diferenciação das lesões potencialmente malignizáveis e malignas. Uma vez que a expressão da p63 está quase exclusivamente restrita às células epiteliais, suas mutações são infreqüentes e ela possui

4,7,8expressão aumentada em vários tumores sólidos .

Tendo em vista a necessidade de identificação de marcadores prognósticos que indiquem fenótipos associados com o melhor ou pior prognóstico de CEC, estudamos a correlação entre a expressão da p63 e os diferentes graus histológicos de malignidades de CEC oral. O objetivo desse estudo foi avaliar, por meio de análise imunoistoquímica, a associação entre a expressão da p63 e os graus de malignidade de CEC primários de boca e orofaringe.

MATERIAL E MÉTODO

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Metropolitana de Santos. Casos de CEC primários em boca e orofaringe diagnosticados entre 2000 e 2005 foram seleciona-dos dos arquivos dos Serviços de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Ana Costa e Irmandade da Santa Casa da Misericórdia de Santos. Os blocos de parafina dos espécimes cirúrgicos foram avaliados por dois patologistas e 14 amostras foram consideradas apropriadas segundo a qualidade da preservação do tecido e quantidade de material restante no bloco.A detecção da p63 foi realizada pela técnica de imunoistoquími-ca. Cortes histológicos seriados de 4m foram dispostos em lâminas de vidro preparadas com poli-L-lisina e desparafiniza-dos, reidratados e tiveram a peroxidase endógena bloqueada com 1% de H O em etanol. Para a recuperação antigênica, foi 2 2

utilizado ácido cítrico (pH 6,0) em banhos-maria por 30 minutos e, então, foi aplicado o anticorpo monoclonal anti-p63 por uma hora (4A4, Santa Cruz Biotecnology, Palo Alto, CA, USA, 1:100), de acordo com as especificações do fabricante. A revelação da reação foi realizada com uso do Kit LSAB Peroxidase (Dako) e depois solução cromógena de diamino-benzidina (3,3'-diaminobenzidina, Sigma Chemical CO., St Louis, MO, USA) a 0,03% acrescida de 0,6mL de água oxigenada (20 volumes) em câmara escura por 10 minutos. Os cortes foram lavados, contra-corados com hematoxilina de Mayer, desidratados, diafanizados, montados com lamínula e avaliados com microscópio de luz por dois patologistas calibrados. Os controles negativos foram preparados com a substituição do anticorpo primário por tampão.Para a análise histológica das lâminas, foram seguidos os

9critérios de malignidade de Anneroth, Batsakis e Luna e o tumor classificado em baixo ou alto grau de acordo com os achados da tabela 1. Dessa forma, cada parâmetro recebeu uma pontuação e os escores médios totais de cada tumor foram obtidos por meio do resultado entre somatória dos pontos dividida pelo número de parâmetros. Foram considera-dos tumores com baixo escore aqueles cuja pontuação obtida situava-se entre 1,0 a 2,6, enquanto os de alto escore situa-vam-se entre 2,7 a 4,0.

Tabela 1 – Sistema de graduação histológica de malignidade segundo Anneroth et al. (1987).

RESULTADOS

Com relação aos escores de malignidade, dos 14 casos selecionados, seis casos (43%) foram classificados como de baixo grau e oito (57%) como de alto grau (Figuras 1 e 2).

Figura 1 – Fotomicrografia do aspecto histopatológico do CEC oral de baixo grau mostrando crescimento tumoral em blocos com células centrais pouco coesas (HE, aumento original 100x).

Figura 2 – Fotomicrografia de CEC de alto grau com acentuado pleomorfismo e mitoses aberrantes (HE, aumento original 100x).

A imunomarcação para a proteína p63 variou de 0% a 100% nos espécimes analisados. A proteína mostrou um padrão de marcação predominantemente nuclear. Nas neoplasias classificadas como de baixo escore, a distribuição da proteína foi preferentemente na periferia dos blocos tumorais e, nas neoplasias de alto grau, era observada de um modo aleatório (Figuras 3 e 4).

Figura 3 – Imunomarcação da p63 em CEC de baixo grau. Nota-se marcação escura nuclear, predominantemente nas células da periferia dos blocos tumorais (imunoistoquímica, aumento original 400x).

Figura 4 – Imunomarcação da p63 em CEC de alto grau. Nota-se marcação escura nuclear, aleatória nas células centrais dos blocos tumorais (imunoistoquímica, aumento original 400x).

1

2

3

4

Número de Mitoses

Padrão de Invasão

Infiltrado Linfoplasmocitário

Pleomorfismo nuclear

Grau de queratinização

Intenso

(+50% cel)

Moderado

(20-50% cel)

Mínimo

(5-20% cel)

Ausente

(0-5% cel)

Discreto

(+ 75cel

maduras)

Moderado

(50-75% cel

maduras)

Abundante

(25-50% cel

maduras)

Intenso

(0-25% cel

maduras)

0-1

2-3

4-5

Mais do que 5

Margens bem definidas

Cordões sólidos e/ou

ilhotas

Pequenos

grupos celulares n<15

Invasão maciça

Marcante

Moderado

Discreto

Ausente

213

Nos tumores de baixo grau, quatro mostraram-se positivos e dois negativos para a p63, enquanto entre os de alto grau, três foram positivos e cinco negativos para p63 (tabela 2).

Tabela 2 – Graduação dos tumores e marcação da proteína p63.

Escore médios totais obtidos pela somatória dos pontos (escores) atribuídos a cada parâmetro e dividido pelo número de parâmetros: baixo - 1,0 a 2,6 / alto- 2,7 a 4,0.

DISCUSSÃO

Nossos resultados demonstraram uma distribuição eqüitativa da proteína p63 entre os CEC de boca e orofaringe com alto e baixo grau de malignidade e não foi possível estabelecer uma correlação entre a presença da proteína e o escore tumoral. Essa observação corrobora os achados de estudo imunoisto-químico da p63 em 13 casos CEC de boca, em que não se conseguiu uma associação com a diferenciação tumoral. A explicação dada pelos autores baseou-se no pequeno número

10de casos .Outra explicação a ser considerada para esse achado é que a maioria dos estudos que mostram a alta variabilidade de expressão da p63 analisa a quantidade de células marcadas, sem levar em conta a intensidade da marcação. Todavia, avaliando-se ambos os fatores na marcação por imunoistoquí-mica da p63 em 106 carcinomas de boca, embora não encon-trassem uma diferença estatisticamente significativa entre a quantidade ou intensidade da marcação da p63 e as recidivas tumorais e metástases, os autores observaram uma leve tendência de p63 ser observada em tumores menos diferencia-

1dos .A explicação mais aceita para o fato é que, atualmente, sabe-se que o gene p63 codifica seis isoformas dessa proteína. O grupo TA p63/p51, com as isoformas , , e , é a proteína na forma integral e apresenta atividades semelhantes às da p53, como diferenciação celular, parada do ciclo celular e indução da apoptose. O segundo grupo, N p63, com as isoformas , , e não

possui o domínio terminal NH e atua como um agente dominan-2

te negativo, pois inibe a atividade do outro grupo de isoformas e 5,6da p53, por conseqüência, ela favorece a proliferação celular .

Além disso, descreveu-se uma outra isoforma, Np73L, que até 11hoje só foi encontrada em carcinomas espinocelulars . Diante

desse fato, descobriu-se que o clone 4A4 do anticorpo anti-63 não é capaz de diferenciar essas isoformas de funções antagônicas, por isso, a aparente contradição na marcação da

5,6,12 proteína . Para a diferenciação dessas isoformas são necessários estudos moleculares. Dessa forma, nota-se a importância da proteína p63 como potencial candidata a marcadora da diferenciação celular e prognóstico de CEC de boca, contudo, estudos com maior casuística e métodos que avaliem as diversas isoformas são necessários.

CONCLUSÃO

Houve uma tendência da proteína p63 ser expressa nos tumores com melhor diferenciação, todavia maior número de casos e estudo em separado das isoformas da p63 são necessários para confirmar estes resultados.

REFERÊNCIAS

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Paciente

s

Pérolas

de

queratin

a

Pleomorfis

mo

Mitoses

aberrante

s

Processo

inflamatóri

o

Pontuaçã

o

Escor

e

Final

p63

1 2 1 1 1 1,25 Baixo Positivo

2 1 2 2 2 1,75 Baixo Positivo

3 1 2 1 2 1,5 Baixo Positivo

4 3 3 2 2 2,5 Baixo Positivo

5 4 2 2 2 2,5 Baixo Negativ

o

5 2 3 4 1 2.5 Baixo Negativ

o

7 4 4 4 4 4 alto Negativ

o

8 4 3 3 2 3 alto Negativ

o

9 4 4 4 3 3,75 alto Negativ

o

10 4 3 3 3 3,25 alto Negativ

o

11 4 3 2 2 2,75 alto Negativ

o

12 3 4 2 2 2,75 alto Positivo

13 4 3 1 3 2,75 alto Positivo

14 2 3 4 3 3 alto Positivo

214