MOD 1 – FERRAMENTAS DE GENÉTICA MOLECULAR: MANIPULAÇÃO DO D A

1.1. Composição Química e Estrutura do D A:

Nas moléculas de DNA os componentes são: açúcar (desoxirribose), bases

nitrogenadas (Purinas: adenina e guanina/ Pirimidinas: timina e citosina) e grupo

fosfato. As bases nitrogenadas ligam-se ao carbono 1 do açúcar, por ligação

covalente. Um açúcar mais uma base ligada a ele constituem um nucleosídeo. Um

nucleosídeo com um grupamento fosfato ligado ao seu carbono 5 constitui um

nucleotídeo, que é a unidade básica de repetição dos ácidos nucléicos.

Para a formação da molécula de DNA é necessário que ocorra a ligação entre os

nucleotídeos. Os nucleotídeos estão ligados covalentemente por ligações fosfodiéster

formando entre si pontes de fosfato (figura). O grupo hidroxila do carbono-3 da

pentose de um nucleotídeo se liga ao grupo fosfato ligado ao carbono-5 da pentose do

nucleotídeo adjacente através de uma ligação fosfodiéster. Devido a esta formação a

cadeia de DNA fica com uma direção determinada, isto é, em uma extremidade temos

livre a hidroxila do carbono-5 da primeira pentose e na outra temos livre a hidroxila do

carbono-3 da última pentose. Isto determina que o crescimento do DNA se faça na

direção de 5' para 3'

Visualização da ligação fosfodiéster entre os nucleotídeos de uma molécula de DNA.

A molécula do DNA é formada pela união de duas cadeias helicoidais, enroladas ao

longo de um mesmo eixo, formando uma dupla hélice. As duas fitas de DNA estão em

direção opostas, ou seja, uma das fitas tem a direção exata da sua síntese (5' →3')

enquanto que a outra está invertida (3'→5'). Com base na estrutura de dupla hélice do

DNA e nas características de hidrofobicidade das moléculas, a estrutura do DNA fica

da seguinte forma:

• O grupo fosfato e o açúcar (parte hidrofílica) - estão localizados na parte externa da

molécula.

• As bases nitrogenadas (parte hidrofóbica) - estão localizadas na parte interna da

molécula.

O pareamento das bases de cada fita se dá de maneira padronizada, sempre uma

purina com uma pirimidina, especificamente: adenina com timina e citosina com

guanina. A proximidade destas bases possibilita a formação de pontes de hidrogênio,

sendo que adenina forma duas pontes de hidrogênio com a timina e a citosina forma

três pontes com a guanina. A dupla hélice é mantida unida por duas forças:

• Por pontes de hidrogênio formadas pelas bases complementares

• Por interações hidrofóbicas, que forçam as bases a se "esconderem" dentro da dupla

hélice.

1.2. Propriedades do D A: 1.2.1. Desnaturação do D A:

Em temperaturas elevadas, as estruturas tridimensionais tanto das proteínas quanto

dos ácidos nucleicos são rompidas. Uma macromolécula em um estado rompido, no

qual sua conformação praticamente aleatória, é dita DESNATURADA; o estado

ordenado, que é supostamente o originalmente presente na natureza, é chamado de

NATIVO. Uma transição do estado nativo para o desnaturado é chamada de

DESNATURAÇÃO. Quando uma dupla hélice de DNA ou DNA nativo é aquecida, as

focas das ligações dentro dos filamentos e entre eles são rompidas, e os dois

filamentos podem se separar. Assim, o DNA desnaturado é unifilamentar.

A desnaturação do DNA pode ser detectada através da observação do aumento da

habilidade de uma solução de DNA em absorver a luz ultravioleta, no comprimento de

onda de 260nm. Uma medida-padrão de tal absorção é a proporção logarítmica de luz

transmitida e luz incidente chamada de

ABSORBÂNCIA A; em 260nm, isto é escrito A 260 . As bases dos ácidos nucleicos

absorvem fortemente luz 260nm, e a quantidade de luz absorvida por um determinado

número de bases depende de sua proximidade uma da outra. Quando as bases ao

altamente ordenadas (muito próximas umas das outras), como no DNA bifilamentar, A

260 é menor que a para o estado menos ordenado no DNA unifilamentar. Em

particular, se uma solução de DNA bifilamentar tem um valor de A 260 = 1,0; uma

solução de DNA unifilamentar na mesma concentração tem um valor de A 260 = 1,37.

Esta relação é geralmente descrita, dizendo que uma solução de DNA bifilamentar

torna-se HIPERCRÔMICA quando aquecida. O valor correspondente para bases livres

é 1,60, de modo que a absorbância também pode ser utilizada para medir a

degradação dos ácidos nucleicos.

Se uma solução de DNA é lentamente aquecida, e A 260 é medida em várias

temperaturas, é obtida uma curva de dissociação. Nesta curva é possível verificar

diferentes estágios: (1) Antes que a subida comece, a molécula é totalmente

bifilamentar; (2) Na região da subida, os pares de bases de vários segmentos da

molécula são rompidos. Este número varia gradualmente; (3) Na parte inicial do platô

superior, alguns pares de bases ainda permanecem unidos até que uma temperatura

critica seja atingida, na qual o último par de bases se rompe e os dois filamentos se

separam completamente. Durante a dissociação toas as ligações covalentes, incluindo

as fosfodiéster, permanecem intactas. Apenas as pontes de hidrogênio e as interações

de empilhamento são rompidas. Um parâmetro conveniente para caracterizar uma

transição de dissociação é a temperatura na qual a subida de A 260 é a metade

completa. Esta temperatura é chamada de TEMPERATURA DE DISSOCIAÇÃO;

designada como Tm .

Um grande número de informações é obtido observando como a T m varia com a

composição de bases e condições experimentais. Por exemplo, foi observado que a T

M aumenta com a porcentagem de G + C, que foi interpretada em termos do maior

número de pontes de hidrogênio em um par G-C

(três) do que um par A-T (duas). Isto é, é necessária uma temperatura mais alta (mais

energia) para romper uma dupla C-G do que uma A-T, porque a estrutura da dupla

hélice está estabilizada, pelo menos em parte, por pontes de hidrogênio.

1.2.2. Renaturação do D A:

Uma solução de DNA desnaturado pode ser tratada de tal modo que o DNA nativo é

reconstituído. Este processo é chamado de RENATURAÇÃO ou REELICOIDIZAÇÃO,

e o DNA reconstituído é chamado de DNA RENATURADO.

Após a desnaturação, a solução de DNA é composta de uma mistura de filamentos

essencialmente unifilamentares. Para se renaturar, o fragmento deve encontrar seu

parceiro complementar na solução. Se as concentrações do fragmento e de seu

parceiro complementar na solução forem baixas, eles levaram muito mais tempo para

se encontrar um com o outro do que se os fragmentos estiverem em altas

concentrações. A renaturação pode ser acompanhada observando a absorbância da

solução a 260nm, pois durante a renaturação as bases se organizam e a A 260 irá

diminuir como tempo. A velocidade de diminuição é a taxa de renaturação, que está

relacionada à concentração de fragmentos individuais na solução (Co ). Isto significa

que o

DNA resfriado sofre renaturação, mas a freqüência de reassociação depende não

apenas do tempo (t) mas também da concentração inicial (Co) de uma dada seqüência

(Cot). O valor de A 260 na solução pode ser usado para avaliar a concentração geral

de DNA. A cinética de renaturação oferece um instrumento poderoso para a análise da

presença de seqüências repetidas em uma amostra. O resultado desta análise permite

avaliar qualitativamente a solução de DNA, ou seja, a presença de várias seqüências

de DNA: (1) seqüência de cópia única (levam mais tempo para renaturar); (2)

levemente repetidas (1 a 10 cópias); (3) medianamente repetidas (10 a várias

centenas de cópias); e (4) altamente repetitivas (várias centenas a vários milhões de

cópias).

1. 2.3.Hidrólise de Ácidos nucléicos:

Uma variedade de enzimas chamadas de NUCLEASES hidrolisa os ácidos nucléicos.

Elas em geral apresentam especificidade química e são classificadas como

desoxirribonucleases (DNAse) ou ribonucleases (RNAses). Além disso, as nucleases

que atuam apenas na ponta de um ácido nucléico, removendo um só nucleotídeo por

vez, são chamadas de EXONUCLEASES, e também podem ser específicas para as

pontas 3 ou 5do filamento. A maioria das nucleases atua dentro do filamento e são

denominadas de ENDONULCEASES; algumas delas são ainda mais específicas, pois

cortam apenas entre determinadas bases.

1.3. Tipos de D A:

• DNA cópia única – referem-se a seqüências de DNA que são encontradas apenas

uma vez (ou possivelmente poucas vezes) no genoma. O DNA de cópia única

compreende cerca de 45% do genoma, e inclui os genes que codificam proteínas.

Entretanto, o DNA que codifica proteína representa apenas uma pequena proporção

de todo o DNA de cópia única, a maior parte do qual é encontrado em íntrons ou em

seqüências de DNA situadas entre os genes.

• DNA repetitivo –5% do genoma consistem em DNA repetitivo, que são seqüências

que aparecem de modo repetido no genoma. Existem duas classes principais de DNA

repetitivo:

o DNA repetitivo disperso (45% do genoma) – tendem a estar espalhadas

individualmente por todo o genoma; elas não ocorrem em tandem. Uma característica

marcante das seqüências LINE e SINE, é que algumas delas podem gerar cópias de si

mesmas, as quais podem então ser inseridas em outras partes do genoma. Essa

inserção pode, algumas vezes, interromper um gene codificante de uma proteína,

causando um distúrbio genético.

Elementos intercalantes curtos ou SINEs – variam em tamanho de 90 a 500pb. Um

dos tipos mais importantes de SINEs é denominado “repetição Alu”. Essas unidades

repetitivas, que medem ~300pb, contém uma seqüência de DNA que pode ser cortada

pela enzima de restrição Alu.

Elementos intercalantes longos ou LINEs – variam em tamanho em até 7.000pb.

o DNA satélite (10% do genoma) – apresentam-se agrupadas em certos locais do

cromossomo, onde ocorrem em tandem (isto é, o começo de uma repetição encontra-

se imediatamente adjacente ao final da outra). O DNA minissatélite e microssatélite

são de especial interesse para a genética humana porque variam em comprimento

entre os indivíduos, o que os torna extremamente úteis para o mapeamento gênico.

DNA α-satélite – repetições em tandem de uma seqüência de 171pb ou mais, situadas

próximo aos centrômeros. DNA minissatélites – repetições em tandem de uma

seqüência de 4 a 500pb. DNA microssatélite – repetições em tandem de seqüências

com 2-4pb de comprimento.

1.4. Replicação do D A:

Durante o processo de síntese do DNA (replicação do DNA), as duas fitas de DNA de

cada cromossomo são desenroladas pela enzima helicase, e cada uma deles dirige a

síntese de uma fita complementar a si. Disso resultam dois dúplices de DNA filhos,

cada um dos quais é idêntico à molécula parental. Como cada dúplice filho contem

uma fita da molécula parental e outra recém-sintetizada a partir dele, diz-se que o

processo de replicação é semiconservativo. A enzima DNA polimerase catalisa a

síntese de novas fitas de DNA usando os quatro desoxinucleotídeos trifosfatados

(dATP, dCTP, dTTP, dGTP) como precursores de nucleotídeos.

A replicação do DNA inicia em pontos específicos, que são denominados origens de

replicação. Iniciando em uma dessas origens, o começo da replicação do DNA resulta

em uma forquilha de replicação em que o duplex de DNA parental se bifurca em dois

novos dúplices-filho. Como as duas fitas do duplex parental de DNA possuem

polaridades opostas, mas agem individualmente como moldes para a síntese de uma

fita-filha antiparalela complementar, as duas fitas-filhas também devem ter direções

opostas (i.e., a direção do crescimento da cadeia tem de ser 5→ 3 para uma das

fitasfilhas, a fita líder; e 3’ → 5 para a outra fita-filha, a fita de crescimento lento).

As reações catalisadas pela DNA polimerase incluem a adição de substrato de dNMP,

fornecido pelo dNTP precursor (os dois resíduos distais de fosfatos do dNTP (resíduos

β e δ) são clivados e descartados), ao grupamento livre hidroxila 3da cadeia de DNA

crescente. Esse requisito introduz uma assimetria no processo de replicação do DNA:

somente a fita líder possuirá o grupamento 3-OH livre no ponto de bifurcação. Isso lhe

permitirá uma adição continuada de nucleotídeos e um alongamento contínuo na

mesma direção em que a forquilha de replicação se move. A síntese da fita

descontínua, porém precisa ser realizado por meio de uma série progressiva de

pequenos fragmentos (100 a 1.0 nucleotídeos de comprimento), denominados

fragmento de Okazaki. Uma vez que só a fita-líder é sintetizada de forma contínua,

diz-se que a síntese das fitas de DNA é semidescontínua. Cada fragmento da fita

atrasada é sintetizado na direção 5→ 3, que é oposta à direção em que se move a

forquilha de replicação> As extremidades dos fragmentos, que são sintetizados em

sucessão, ligam-se covalentemente, sendo que a enzima DNA-ligase garante o

crescimento da cadeia na mesma direção do movimento da forquilha de replicação.

Nos cromossomos de mamíferos, a replicação do DNA é bidirecional, formando-se

“bolhas de replicação” a partir dos múltiplos pontos de iniciação. A distância entre

origens de replicação adjacentes é de cerca de 50 a 300kb. O início da replicação do

DNA, na fase S do ciclo celular, dá-se em momentos diferentes nas diversas origens,

mas, eventualmente, bolhas de replicação adjacentes podem fundir-se.

Enzimologia da replicação do DNA

Início da Replicação (Primossoma): o Topoisomerase (DNA girase > desenrola o DNA)

o Helicase (separa as fitas do DNA) o SSBP (ptn que se liga ao DNA fita simples e

serve para estabilizá-lo) o RNA Primase (faz primer com ~30 nucleotídeos)

Alongamento - Replissoma (síntese no sentido 5’>3’): o PCNA (Proliferating Cell

Nuclear Antigen) – liga-se as DNAs polimerases; o DNA polimerase - DNA polymerase

α - síntese e iniciação da fita atrasada

- DNA polimerase β - reparo do DNA

- DNA polimerase δ - síntese da fita líder e atividade 3’> 5’ exonuclease

- DNA polimerase ε - reparo do DNA e atividade 3’> 5’ exonuclease o Nucleotídios

(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) o Fita de crescimento contínuo no sentido (5’> 3’) o Fita

de crescimento lento no sentido 3’> 5’ – Fragm. de Okazaki.

Término: o Nucleases reparadoras – retiram os seguimentos de primer; o DNA

polimerase b - reparo no DNA e preenchimento de brechas o DNA ligase – une

trechos de DNA; o Telomerase – síntese dos telômeros.

1.5. Ferramentas da Genética Molecular Humana para Triagem de Mutações:

Um dos principais objetivos da genética molecular humana moderna é caracterizar as

variações polimorficas envolvidas com o desenvolvimento de doenças genéticas, para

compreender o modo pelo qual estas mutações afetam a saúde e utilizar esta

informação para melhorar o seu diagnóstico e tratamento. Os avanços na nossa

compreensão da genética molecular levaram ao desenvolvimento de tecnologias, que

possibilitam uma análise detalhada tanto dos estados normal e anormal dos genes

quanto da expressão de milhares de genes nos estados normal e patológico.

1.5.1. Hibridização em Southern Blot:

Nesta aplicação, o DNA genômico é fragmentado utilizando-se enzimas de restrição e

os fragmentos são separados por eletroforese em gel de agarose de alta resolução.

Posteriormente os fragmentos de DNA são transferidos a uma membrana de nylon e

hibridizados com sondas marcadas que contem seqüências complementares ao loco

gênico a ser estudado. Os fragmentos hibridizados são identificados por

autorradiografia ou outro sistema de detecção. As aplicações desta técnica são: (1)

detecção direta de mutações pontuais patogênicas por mapeamento de restrição; (3)

detecção de RFLP convencionais; (3) detecção de VNTR; (4) detecção de

deleções/inserções gênicas por mapeamento de restrição.

1.5.2. Eletroforese em Gel com Gradiente de Desnaturação (DGGE):

A triagem de mutações por DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) é um

método no qual a dupla fita de DNA é submetida à eletroforese em gel de

poliacrilamida em que utiliza um gradiente de agente desnaturante (uréia ou

formamida) ou de temperatura. Nestas condições, ocorre a separação das moléculas

de DNA de acordo com sua temperatura de desnaturação ou Tm, em segmentos

denominados domínios. A dissociação das fitas de DNA em tais domínios resulta em

diminuição da mobilidade eletroforética. A diferença de 1 par de bases entre as fitas de

DNA (homoduplex) pode alterar a temperatura de desnaturação em 1 ºC ou mais. A

falta de complementaridade de bases entre as fitas de DNA (heteroduplex) leva a

significante desestabilização desses domínios, resultando em diferenças na Tm entre

homo e heteroduplex acima de 6 ºC. Por esta razão, heteroduplex formadas entre

fragmentos de alelos comuns e mutantes são geralmente utilizados para a triagem de

mutações de ponto. Para detecção no DGGE, os produtos da PCR são marcados com

substâncias radioativas. Atualmente, esse sistema foi substituído por coloração dos

produtos com brometo de etídeo ou nitrato de prata. O tamanho do produto da PCR

submetido ao DGGE é de aproximadamente 1000 pares de bases. Com o aumento do

número de domínios, a mobilidade diminui, por isto, a fração de mutações detectadas

diminui com o aumento do tamanho do fragmento.

1.5.3. Polimorfismo de Conformação de Fita Simples (SSCP):

O SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) é um método de triagem de

mutações que permite detectar alterações na mobilidade eletroforética de fitas simples

de ácidos nucléicos em condições não-desnaturantes. As fitas simples de ácidos

nucléicos formam estruturas secundárias em solução que dependem da

composição/seqüência de bases e do tamanho da fita simples. Mudança em uma base

na seqüência do ácido nucléico amplificado pela PCR pode ser detectada por SSCP.

Os perfis de SSCP podem ser detectados por autorradiografia marcando-se os

produtos da PCR com substâncias radiativas. Atualmente são utilizados os sistemas

de detecção por coloração dos géis de eletroforese com nitrato de prata.

As mutações detectadas por SSCP devem ser confirmadas por sequenciamento de

DNA. A sensibilidade de detecção de mutações por SSCP é maior quando os

tamanhos dos produtos da PCR são de 150 a 200 pb, e em condições ótimas, 80 a

90% de mutações são detectáveis.

1.5.4. Polimorfismo de Tamanhos de fragmentos de Restrição (RFLP):

O RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphysm) é um método que utiliza

enzimas de restrição para detecção de polimorfismos genéticos. As enzimas de

restrição reconhecem sítios específicos na seqüência do DNA que é clivada somente

quando o sítio está presente, gerando fragmentos de vários tamanhos que são

separados e analisados por eletroforese. Quando as mutações ou polimorfismos não

estão presentes em sítios de restrição, podem ser criados sítios artificiais utilizando-se

oligonucleotídeos modificados na PCR. Esta estratégia é denominada mutagenese

sitio-dirigida mediada pela PCR. Os fragmentos gerados no RFLP podem ser

detectados por eletroforese e transferência de DNA como é o Southern blot. No caso

da PCR-RFLP, os fragmentos são separados por eletroforese em gel de agarose ou

acrilamida e detectados diretamente pela coloração com brometo de etídeo ou outro

corante fluorescente como o SYBR Green ou ainda por coloração com nitrato de prata.

A especificidade do método é de 100% quando a enzima de restrição apropriada é

utilizada. Para o controle de qualidade, amostras de DNA contendo alelos mutantes e

comuns devem ser incluídos na análise.

1.5.5.N úmero Variável de Repetições em Tandem (V TR):

Os VNTRs, um enfoque similar ao usados para os RFLPs convencionais, visa explorar

os minissatélites existentes no genoma. O DNA é digerido com uma enzima de

restrição, e os fragmentos são submetidos a eletroforese. A diferença principal é que

sondas especiais são usadas para se hibridizar apenas com uma determinada região

de minissatélite. Enquanto que os RFLPs revelam polimorfismos devido a presença ou

ausência de um sítio de restrição, os VNTRs revelam polimorfismos devido a números

diferentes de repetições situadas entre dois sítios de restrição. O numero destas

repetições pode variar consideravelmente nas populações: uma região de minissatélite

pode ter apenas duas ou três repetições, ou até 20 ou mais.

Do mesmo modo que as regiões de minissatélites podem variar de tamanho, os

microssatélites também podem variar em comprimento como resultado de números

diferentes de repetições. Cada repetição de microssatélite é substancialmente menor

que uma repetição de minissatélite (2-4pb). Elas são chamadas de repetições de

dinucleotídeos, trinucleotídeos e tetranucleotídeos, respectivamente. Uma repetição de

microssatélite pode ocorrer em tandem até várias centenas de vezes, e este número

varia consideravelmente entre as pessoas. Estes polimorfismos de repetição de

minissatélites diferem dos VNTRs em termos de seus tamanhos, e também porque

não são definidos por sítios de restrição que flanqueiam a região de repetição. A

técnica de PCR é usada para isolá-las.

1.5.6. PCR-HRM (melt de alta resolução):

A análise de “melt de alta resolução (HRM)” é um aprimoramento das antigas análises

de dissociação de DNA (ou “melting”). Este tipo de análise é usado para

caracterização de amostras de DNA de acordo com seus comportamentos de

dissociação durante sua transição de DNA dupla fita para DNA fita simples com o

aumento da temperatura (Figura).

Fundamentos de um gráfico de HRM típico. A curva de melt (verde) ultrapassa a

transição entre alta fluorescência da fase inicial (pré-melt) através da fase de melt

(melt phase) para níveis de baixa fluorescência até a basal da fase pós-melt. A

fluorescência diminui à medida que o corante intercalante é liberado do DNA duplafita

enquanto este se dissocia em fitas simples. O ponto central da fase de melt, no qual a

proporção de mudança de fluorescência é maior, define a temperatura de melting (TM)

de um determinado fragmento de DNA em estudo.

Antes de realizar uma análise de HRM, uma seqüência alvo deve ser amplificada por

meio de PCR na presença de um corante intercalante a DNA dupla fita. O corante não

interage com DNA fita simples mas se intercala ativamente ao sulco menor do DNA e

fluoresce fortemente quando assim ligado.Essa mudança na fluorescência pode ser

usada primeiramente para medir o aumento da concentração do DNA durante a fase

de amplificação pré-HRM e depois sim, para medir a dissociação do DNA induzida por

temperatura (HRM).Inicialmente a fluorescência é alta em uma análise de melt porque

o DNA está na forma de dupla hélice, entretanto, essa começa a decair a medida que

a temperatura é aumentada e o DNA se dissocia em fitas simples. O comportamento

de melting observado é característico de cada amostra de DNA em particular.

O método de PCR-HRM pode ser usado para: detectar variações de base única tais

como SNPs (single nucleotide polymorhphisms) ou descobrir mutações genéticas

desconhecidas, identificar genes candidatos de pré-disposição, estudos de associação

(comparando casos e controles, genótipo à fenótipo), determinação de prevalência de

alelos dentro de uma população ou grupo, análises de metilação de DNA, entre outros.

1.5.7. Arranjos de DNA por PCR em Tempo Real:

As análises das atividades gênicas e a identificação de mutações e polimorfismos são

realizadas de forma sistematizada usando o princípio da hibridização de DNA. As

seqüências de genes que contem mutações conhecidas são fixadas na matriz de vidro

(sondas de captura). Produtos da PCR são gerados utilizando-se iniciadores

específicos marcados com fluoróforos. A seguir os produtos da PCR são hibridizados

com as sondas capturadas na matriz de vidro e os arranjos de sinais fluorescentes são

medidos utilizando-se um sistema ultra-rápido de detecção de fluorescência e a

intensidade de cada ponto é determinada. A localização do ponto associado com a

sua intensidade determina a seqüência e a quantidade de material presente na

amostra. Estes dados são processados por programas sofisticados de computadores

que possibilitarão a análise refinada dos resultados. A possibilidade de se colocar

milhares de seqüências em uma única lâmina de arranjo possibilita a obtenção de

informações do genoma inteiro em um único ensaio, identificando milhões mutações e

polimorfismos simultaneamente. Comercialmente já estão disponíveis, em bioships,

conjuntos de polimorfismos e ou mutações para fins de estudos farmacogenéticos do

sistema citocromo P450 para cada grupo de fármacos potencialmente importantes,

assim como para diagnóstico de alterações genéticas de utilidade terapêutica na

clinica médica.

1.5.8. Sequenciamento do DNA pelo método dideoxi ou enzimático:

O método dideoxi para sequenciamento de DNA é baseado na síntese in vitro de uma

fita de DNA complementar, realizado na presença dos dideoxinucleotídeos trifosfatos,

derivados dos deoxinucleotídeos trifosfatos normais que não têm o grupo hidroxil 3’.

O protocolo básico consiste em sintetizar in vitro moléculas de DNA a partir de uma

mistura contendo: (1) moléculas de fitas simples do DNA a ser seqüenciado; (2) a

enzima DNA polimerase; (3) um iniciador curto de DNA, que permite que a DNA

polimerase inicie a sintese de DNA, e (4) os quatro deoxinucleotídeos trifosfatos

(dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Se um dideoxinucleotídeo (ddATP, ddTTP, ddGTP,

ddCTP) também está presente na reação de sequenciamento, ele pode ser

incorporado em uma cadeia crescente de DNA. Como esta cadeia agora não tem o

grupo OH 3”, a adição do próximo nucleotídeo é bloqueada, e a cadeia de DNA

termina neste ponto. O ddNTP compete com o excesso de dNTP presente no tubo de

reação, de maneira que o ddNTP é incorporado de maneira aleatória , em uma fita de

DNA crescente. Essa mistura irá produzir, eventualmente, um conjunto de DNAs de

diferentes comprimentos, complementares ao DNA-molde que está sendo

seqüenciado e terminando em cada um dos seus diferentes ddNTPs. O comprimento

exato dos produtos de síntese de DNA pode ser utilizado para determinar a posição de

cada um dos quatro tipos de nucleotídeos na cadeia crescente.

Para determinar a seqüência completa de um fragmento de DNA, o DNA fita dupla é

primeiramente separado em fita simples, e uma das fitas é utilizada como molde para

o sequenciamento. Quatro ddNTPs são utilizados em quatro reações de síntese de

DNA separadas com cópias da mesma fita simples de DNA molde. Cada reação

produz um conjunto de cópias de DNA que terminaram em pontos diferentes na

seqüência. Os produtos dessas quatro reações são separados por eletroforese em

quatro canaletas paralelas de um gel de poliacrilamida. Os novos fragmentos

sintetizados são detectados por um marcador (radioativo ou fluorescente) que foi

incorporado no iniciador ou em um dos deoxinucleotídeos trifosfatos utilizados para

estender a cadeia de DNA. Em cada canaleta, as bandas representam os fragmentos

que foram terminados em um dado nucleotídeo, mas em diferentes posições no DNA.

Fazendo a leitura das bandas em ordem, iniciando no final do gel e trabalhando

através de todas as canaletas até o topo, a seqüência de DNA da nova fita sintetizada

poderá ser determinada. A seqüência é idêntica à da fita 5’-3’da molécula de DNA fita

dupla original.

Sequenciamento Automático do DNA

O sequenciamento automático utiliza o princípio básico do método de Sanger e seus

ddNTPs terminais de reação. O maior avanço relacionado ao sequenciamento

automático é a utilização do laser e programas de computadores específicos que

permitem a detecção e identificação dos vários fragmentos de DNA que são

produzidos. Além disso, cada ddNTP é marcado com uma molécula fluorescente, que

quando excitada pelo laser, emite uma fluorescência em comprimentos de onda

específico para cada uma das quatro bases. Dessa forma, não há a necessidade de

fazer quatro reações independentes para cada fragmento de DNA a ser seqüenciado,

uma vez que cada ddNTPs emite fluorescência com comprimento de onda específico,

os quatro ddNTPs podem ser misturados na mesma reação e o sequenciador detecta

o sinal que é analisado por programas específicos de bioinformática resultando na

seqüência de DNA.

MÓDULO 2 - EXPRESSÃO E REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA: MANI

PULAÇÃO DE RNA E PROTEÍNAS

2.1. Estrutura e Tipos de RNA:

O RNA é uma molécula unifilamentar formada por ribose, grupo fosfato e quatro tipos

de bases nitrogenadas. Os diferentes tipos de moléculas de RNA, existentes no

interior da célula, podem ser agrupados de acordo com a sua função:

RNA transportador (tRNA): molécula responsável por transportar aminoácidos,

dispersos no citosol, para o ribossomo. Cada molécula de tRNA apresenta uma

extremidade que se liga a diferentes tipos de aminoácidos e uma região com uma

seqüência de três nucleotídeos, o anticódon, que pode parear com um dos códons do

RNAm;

RNA ribossomal (rRNA): moléculas, que juntamente com proteínas ribossômicas,

formam as sub-unidades ribossomais; RNA mensageiro (mRNA): molécula

responsável por levar a informação genética contida no DNA para ser traduzida em

proteína; RNA nuclear de pequeno tamanho (snRNA): atuam no processamento do

mRNA; Micro RNA (miRNA): VERIFICAR A SUA FU ÇÂO

2.2. Transcrição do RNA:

De modo geral, em todas as células, a expressão da informação genética é um

sistema de uma via: o DNA especifica a síntese do RNA e o RNA especifica a síntese

de polipeptídios que, subseqüentemente, formam as proteínas. Por sua

universalidade, o fluxo DNA→RNA→PTN da informação genética é descrito como

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR. O primeiro passo, a síntese de

RNA, por meio de uma RNA- polimerase dependente de DNA, é descrito como

TRANSCRIÇÃO e ocorre no núcleo das células eucarióticas. O segundo passo, a

síntese de polipeptídios, é descrito como TRADUÇÃO e ocorre nos ribossomos.

Embora o DNA seja o material hereditário de todas as células atuais, é muito provável

que, nos primórdios da evolução, o RNA tenha exercido tal função. As moléculas de

RNA podem auto replicarem-se, como as do DNA. Porém, o grupo hidroxila, presente

no carbono 2 da ribose, torna as ligações fosfodiéster açúcar-fosfato instáveis,

enquanto que no DNA, este mesmo carbono só apresenta ligações com átomos de

hidrogênio. Desse modo, o DNA é muito mais adequado do que o RNA como portador

estável da informação genética. Entretanto, muitas classes virais possuem o RNA

como molécula da hereditariedade, no lugar do DNA. Nestes casos, o RNA replica-se

por meio de um DNA intermediário, usando uma transcriptase reversa (DNA

polimerase dependente de RNA). Recentemente, tornou-se claro que as células de

mamíferos contem seqüências de DNA cromossômicos não-viral que codificam

transcriptases reversas celulares. Sabendo-se que algumas seqüências de RNA não-

viral funcionam como molde para a síntese de DNA celular, o princípio do fluxo

unidirecional da informação genética não é mais estritamente válido.

2.2.2. Unidades de Transcrição:

Somente uma pequena porção do DNA é transcrita (unidades de transcrição ou

genes). Entretanto, a maior parte do DNA jamais é transcrita, em qualquer célula. Esta

parte não transcrita é composta principalmente por pseudogenes, DNA repetitivo e

seqüências regulatórias.

Além de o genoma humano possuir uma pequena porção de unidades de transcrição,

apenas uma pequena porção deste total é traduzida em ptn, isto porque: (1) grande

parte dos RNA não é do tipo mensageiro (mRNA); (2) os transcritos primários sofrem

redução em seu tamanho, durante o seu processamento; e (3) apenas uma parte

central do mRNA maduro é traduzida, isto porque as suas terminações não são

traduzidas.

A síntese de RNA é executada pela RNA polimerase, tendo o DNA como molde. O

RNA é sintetizado como fita única, e a direção da transcrição é 5→ 3. O alongamento

da cadeia é feito pela adição de resíduos de AMP, GMP, UMP e CMP ao grupamento

hidroxila 3livre na extremidade 3da cadeia crescente de RNA. Esses nucleotídeos

resultam da eliminação de um resíduo de pirofosfato (PPi) do trinfosfato

ribonucleosídeo (rNTP) precursor apropriado. Isso significa que o nucleotídeo

localizado na ponta 5 (ribonucleotídeo iniciador) é diferente dos demais devido a

presença do grupamento trifosfato 5.

Para a transcrição, somente uma das fitas do DNA é utilizada como molde para a

síntese de RNA. Neste caso, a fita-molde é denominada de fita antesenso, enquanto

que a outra (não-molde) é chamada de fita senso. Ao documentar seqüências gênicas,

é costume apresentar apenas a fita senso. Geralmente, a orientação das seqüências

em relação a uma seqüência gênica é ditada pela fita senso e pela direção da

transcrição (p. ex., a extremidade 5de um gene refere-se as seqüências localizadas na

extremidade 5de sua fita seno, e as seqüências a montante ou a jusante de um gene

referem-se a seqüências que flanqueiam esse gene, respectivamente, pela

extremidade 5 e pela extremidade 3de sua fita senso).

Nas células eucarióticas, são necessárias três moléculas diferentes de RNA

polimerase para sintetizar os vários tipos de RNA:

RNA polimerase I: atua somente na transcrição do rRNA 45S; RNA polimerase I: atua

na síntese de mRNA e da maioria dos genes de snRNA; RNA polimerase I: atua na

síntese de tRNA, 5S rRNA.

2.2.4. Fatores de Transcrição:

As RNAs polimerases não possuem autonomia para iniciar a transcrição. Para que

este processo se realize é necessário que a combinação de elementos de curta

seqüência (fatores cis-atuantes [tabela]), adjacentes ao gene, atue como sinais de

reconhecimento para que os fatores de transcrição (fatores trans-atuantes) possam

ligar-se ao DNA para guiar e ativar a RNA polimerase. Freqüentemente, este conjunto

de seqüências curtas fica agrupado a montante da seqüência codificadora de um

gene, constituindo coletivamente, o promotor. Depois que vários fatores comuns de

transcrição se ligam a região promotora, uma RNA polimerase se une ao complexo

dos fatores de transcrição e então é ativada para iniciar a síntese de RNA a partir de

um único ponto.

Tabela 2: Características dos Elementos Cis-atuantes

Elementos Cis Comentários CG box Situado a -200pb a montante do gene. TATA box

Situado a -25pb a montante do gene. Pouco freqüente, inclusive nos promotores de

genes de manutenção. CAAT box Localizado a –80pb do início da transcrição. È o

maior determinante da eficiência do promotor. Além do promotor, existem outros

elementos cis que atuam potencializando a transcrição (acentuadores ou enhancers)

ou inibindo-a (silencidores). Ambos são elementos regulatórios, porém estão situados

bem distantes dos pontos de início da transcrição.

2.2.5 Expressão Tecido-Específica:

A expressão gênica tecido-específica envolve a ativação seletiva de genes específicos

(denominados: genes com expressão tecido-específica). Além deste grupo, observa-

se que um número razoável de genes que estão ativos em toda e qualquer célula. Tais

genes são essenciais para a manutenção das atividades gerais da célula, e por isso

são denominados de GENES DE MANUTENÇÃO. Parte dos genes para mRNA é

TECIDO-ESPECÍFICO, enquanto que todos os genes de rRNA, tRNA e alguns de

mRNA são genes de manutenção.

A distinção entre as regiões do DNA de uma célula que estão transcrevendo e as que

estão inativas reflete-se na estrutura da cromatina. A cromatina inativa apresenta uma

conformação altamente condensada e frequentemente é relacionada às regiões do

genoma que sofrem replicação tardia, durante a fase S do ciclo celular. O DNA ativo

na transcrição, por sua vez, apresenta uma conformação mais aberta e costuma

replicar-se logo no início da fase S. Ele se caracteriza por uma ligação relativamente

fraca com as moléculas de histonas H1 e pela ampla acetilação dos quatro tipos de

histonas que compõem o nucleossomo. Além disso, na cromatina ativa, as regiões

promotoras não costumam apresentar metilações.

2.3. Processamento do RNA:

O transcrito de RNA da maioria dos genes eucarióticos sofre uma série de reações de

processamento. Freqüentemente, isso envolve a remoção de segmentos internos

indesejáveis e a reunião de segmentos remanescentes (encadeamento do RNA). No

caso de transcritos resultantes da RNA polimerase I, um nucleotídeo especializado

(trifosfato 7 metilguanosina) é ligado a extremidade 5do transcrito primário

(Capeamento),

2.3.1. Encadeamento: (Obs: no mRNA, este evento só ocorre após a adição das

extremidades 5e 3modificadas)

As seqüências codificadores da maioria dos genes, tanto dos que codificam

polipeptídeos quanto os que codificam outras moléculas de RNA, são divididas em

seguimentos codificadores (os exons), que são separados por seqüências

intercalantes não-codificadoras (os introns). A transcrição consiste na produção de

uma seqüência de RNA complementar ao comprimento total do gene, abrangendo

exons e introns. Freqüentemente, entretanto, o transcrito de RNA sofre o

encadeamento do RNA, uma série de reações de processamento através das quais os

introns são removidos e descartados enquanto que os exons são unidos ponta com

ponta (encadeamento) para obter-se como produto um RNA mais maduro.

O mecanismo de encadeamento do RNA é dependente da identidade das seqüências

de nucleotídeos nos limites exon/intron (junção de encadeamento). Ele é

particularmente sensível ao que tem sido denominado de regra GU-AG: os introns

quase sempre começam com GU e terminam com AG. Embora os dinucleotídeos

conservados GU e AG sejam de importância crucial para o encadeamento, eles não

são suficientes para indicar a presença dos introns. Atualmente, sabe-se que as

seqüências adjacentes aos dinucleotídeos GT e AG são consideravelmente

conservadas. Além disso, há uma terceira seqüência conservada nos introns que é

funcionalmente importante para o encadeamento. É o chamado sítio de ramificação,

quase sempre localizado perto do final do intron, mais de 40 nucleotídeos entre o

dinucleotídeo terminal AG.

RNA splicing involves endonucleolytic cleavage and removal of intronic RNA segments

and splicing of exonic RNA segments

O mecanismo de encadeamento segue nesta ordem: (1) clivagem na junção de cadeia

5; (2) ataque nucleolítico G terminal do sítio doador de encadeamento, a fim de formar

uma estrutura em forma de laço; (3) clivagem na junção 3, com liberação do intron sob

a forma de laço e o encadeamento dos exons.

Essas reações também podem ser mediadas por complexos de RNA e de proteínas, o

ENCADEOSSOMO, que consiste de cinco tipos de snRNA (U1,U2, U4, U5, U6) e de

mais de 50 tipos de proteínas. Neste processo, cada molécula de snRNA liga-se a

uma proteína específica, formando partículas de snRNP (ribonucleoproteinas de

pequeno tamanho), e cuja especificidade da reação de encadeamento é estabelecida

por complementaridade de bases entre o transcrito e as moléculas de snRNA. O

terminal 5do snRNA U1 tem uma seqüência que pareia com a seqüência consenso do

sítio doador de encadeamento. Depois que snRNP U1 se ligou, o snRNA U2

reconhece o sítio de ramificação por complementaridade de bases e, logo após a

interação entre os snRNP U1 e U2 aproxima as duas extremidades que serão unidas.

Em seguida, uma partícula com múltiplos snRNP, contendo snRNAs U4, U5 e U6,

associam-se com o complexo U1-U2.

Mechanism of RNA splicing (GU-AG introns).

A) Mechanism. The nucleophilic attack involves the 2′-hydroxyl group attached to the

conserved A at the branch site and the G of the conserved GU at the start of the intron,

and results in a new covalent bond linking these two nucleotides to give a branched

structure (lariat). (B) Role of snRNPs. Small nuclear ribonucleoprotein particles

(snRNPs) are part of the spliceosome. U1 snRNA has a terminal sequence

complementary to the splice donor consensus and binds to it by R A-R A base pairing.

After the U1 snRNP has bound, U2 snRNA recognizes the branch site by a similar

base-pairing reaction. Interaction between the splice donor and splice acceptor

junctions is stabilized by subsequent binding of a preformed multi-snRNP particle,

containing U4, U5 and U6 snRNAs, with the U5 snRNP able to bind simultaneously to

both splice donor and splice acceptor.

Quadro 2.1: Grupos e fases de introns

Grupos de Introns Fases dos Introns

( posição em que o intron interrompe os exons)

Introns de encadeossomos - São introns tradicionais;

- Possuem seqüências conservadas que servem para a indicar as suas extremidades

(sítios de encadeamento 5e 3) e o sítio de ramificação.

Introns de Grupos I e I - Possuem estruturas secundárias que permite catalisar a sua

remoção;

- Estão presentes nos transcritos de rRNA e tRNA;

- Podem atuar como elementos móveis.

Intron de Fase 0 : Interrompem a seqüência codificadora entre codons adjacentes.

Intron de Fase 1: Interrompem um códon entre a primeira e a segunda base. Intron de

Fase 2: Interrompem um códon entre a segunda e a terceira base.

2.3.2. Capeamento do mRNA:

Este evento que ocorre durante a transcrição, no qual adiciona-se um nucleosídeo

metilado (7 metilguanosina) ao primeiro nucleotídeo 5 transcrito. A enzima

guaniltransferase é a responsável pela união entre esses dois nucleotídeos através de

uma ligação fosfodiéster especial 5-5. Assim como os mRNAs, os snRNAs também

são capeados, mas suas capas podem sofrer outras modificações. Supõe-se que as

funções da capa sejam: (1) facilitar o encadeamento; (2) facilitar o transporte no

núcleo para o citoplasma; (3) proteger o transcrito do ataque de exonucleases 5→ 3;

(4) auxiliar no encaixe da subunidade 40S ribossômica ao mRNA.

2.3.3. Poliadenilação do mRNA:

Os genes transcritos pela RNA-polimerase I não apresentam sítios de termino de

transcrição, sendo assim, a polimerase transcreve até perder afinidade pelo DNA.

Posteriormente, uma endonuclease reconhece o sítio AAUAAA e corta a jusante deste

ponto. Por fim, a enzima poli(A)- polimerase adiciona cerca de 200 resíduos de

adenilato (AMP), para formar uma cauda poli(A). Supõe-se que essa cauda tenha

várias funções, tais como: (1) facilitar o transporte do mRNA para o citoplasma; (2)

maior durabilidade a molécula; (3) facilitar a tradução, ao permitir uma intensificação

do reconhecimento do mRNA pela maquinaria ribossômica. As exceções a esta regra

são os mRNAs de histonas e snRNAs, que não sofrem adição de cauda poli(A).

2.4. Tradução do mRNA:

Para a tradução, somente o segmento central do mRNA determina a seqüência de

aminoácidos do polipeptídio a ser transcrito. As seqüências adjacentes, isto é, a região

não-traduzida 5-P e não-traduzida 3-OH auxiliam a ligar e estabilizar o mRNA nos

ribossomos, onde ocorre a tradução do segmento central.

Os ribossomos são grandes complexos de RNA e proteínas compostos por duas

subunidades. Nos eucariotos, os ribossomos citoplasmáticos contêm duas unidades: a

subunidade maior de 60S (formada por cerca de 50 proteínas ribossômicas e rRNAs

28S, 5,8S e 5S), e a subunidade menor de 40S (formada por 30 proteínas

ribossômicas e rRNA 18S).

O gene do rRNA 45S é policistrônico, pois um único transcrito possui a informação

genética para três tipos de rRNA. Após a transcrição o pré-rRNA sofre metilação nas

regiões referentes aos rRNAs 18S, 5,8S e 28S. Estas marcações auxiliam na

determinação das seqüências iniciais e terminais de cada rRNA. Após a adição desta

marcação, os introns (Classe I ou I) catalisam a sua própria remoção.

‘Processamento do pré-transcrito de rRNA.

O início da tradução é marcado pelo reconhecimento pela subunidade ribossômica

40S ao cap 5, por intermédio de suas proteínas que se ligam especificamente a ela.

Então a subunidade 40S percorre o mRNA até encontrar o códon de iniciação, que

quase sempre é o AUG (os codons alternativos para a iniciação são: ACG, GUG e

CUG). Geralmente, mas nem sempre o primeiro AUG encontrado será o codon de

iniciação. Porém, o

AUG só será eficientemente reconhecido como tal se estiver inserido na seqüência

GCCP urina CCAUGG. Os determinantes mais importantes nesta seqüência são o G,

logo após o códon AUG, e a purina (preferencialmente a adenina) no terceiro

nucleotídeo anterior a ele. A seguir, sucessivos aminoácidos são incorporados à

cadeia polipeptídica crescente por reações de condensação: o grupo amino do

aminoácido, situado no sítio A, reage com o grupamento carboxílico do aminoácido

presente no sítio P. A catálise dessa reação é feita enzima peptidil-transferase, situada

na subunidade maior.

A tradução ocorre no sentido 5→ 3 e continua até o complexo ribossômico encontrar

um dos três codons de parada (UAA, UAG, UGA). Por isso, o arcabouço do produto

primário da tradução terá uma metionina com um grupamento amino livre em uma

extremidade (a terminação N) e um aminoácido com um grupamento carboxila livre na

outra extremidade (a C-termial).

2.5. Controle da Expressão Gênica:

O principal nível de controle da expressão gênica é o inicio da transcrição. Entretanto,

vários mecanismos reguladores são necessários para manter os diferentes tipos de

expressão gênicas nos níveis temporal (estágios de desenvolvimento, estágios de

diferenciação, estágios do ciclo celular, expressão induzível) e espacial (padrão

órgão/tecido). Embora simplista, é conveniente considerar-se três amplos níveis nos

quais a regulação gênica pode operar: (1) Regulação da expressão gênica simultânea

a transcrição – a regulação pode ocorrer por meio da região promotora central de um

gene, em nível de recrutamento e processabilidade da RNA-polimerase relacionada;

(2) Regulação da expressão gênica posterior a transcrição – esta categoria inclui

mecanismos que operam em nível do processamento do RNA (encadeamento e

adição das extremidades 5e 3), transporte do mRNA, tradução, estabilidade do mRNA,

processamento e sinalização da ptn, estabilidade da ptn, etc; (3) Mecanismos

epigenéticos de controle a longo alcance da expressão gênica.

2.5.1. Controle da Expressão Gênica em nível de Transcrição:

Fatores de Transcrição trans-atuantes:

Os fatores de transcrição são proteínas que reconhecem seqüências específicas na

região de controle do gene (promotor), permitindo assim a chegada da RNA-

polimerase. As proteínas que participam do processo de transcrição de todos os genes

estruturais, e são chamadas de FATORES GERAIS DE TRANSCRIÇÃO (RNA-pol I –

TFI; RNA-pol I – TFI; e RNA-pol II – TFII). Outras chamadas de FATORES

ESPECÍFICOS DE TRANSCRIÇÃO têm funções mais específicas, ativando apenas

alguns genes em determinados estágios do desenvolvimento.

Os fatores de transcrição reconhecem e liga-se a seqüências curtas de nucleotídeos,

normalmente como resultado de uma complementaridade extensa entre a superfície

da proteína e as características das hélices do DNA. Os fatores de transcrição

apresentam duas características que são essenciais para o seu funcionamento

adequado: (1) DOMÍNIO DE ATIVAÇÃO – estimula a transcrição através da interação

com outros fatores de transcrição, bem como na formação do complexo transcricional;

(2) DOMÍNIO DE LIGAÇÃO AO DNA – permite a ligação específica do fator de

transcrição aos seus genes-alvo. Os principais são: dedo de zinco, hélice-volta-hélice,

hélice-giro-hélice e zíper de leucina.

Seqüências reguladoras cis-atuantes (silenciadores e reforçadores):

O complexo formado pela polimerase e pelos fatores gerais de transcrição é

conhecido como o aparato de transcrição basal; ele contém tudo o que é necessário

para iniciar a transcrição. Os genes que são constitutivamente expressos em uma taxa

mínima, determinada pela região promotora central a menos que a taxa de transcrição

seja elevada ou desligada por elementos reguladores positivos (reforçadores) ou

negativos (silenciadores) adicionais. Em geral, estes elementos estão situados a

alguma distância da região promotora.

Alguns genes que codificam polipeptídeos são genes de manutenção, mas ao

contrário dos produtos dos genes transcritos pelas RNAs polimerases I e I, a grande

porcentagem dos genes transcritos pela RNA pol I demonstra possuir modelos de

expresso tecido-restrito ou tecido- específico. Uma vez que o DNA de diferentes

células nucleadas de um indivíduo é essencialmente idêntico, a identidade de uma

célula é definida pelas proteínas produzidas por ela. Além dos fatores gerais de

transcrição, portanto, os fatores de transcrição tecido-específicos ou tecido-restritos

regulam a expressão de muitos genes que codificam polipeptídeos, pelo

reconhecimento e pela ligação específica de elementos de seqüência cisatuantes.

A especificidade de tecido e a especificidade do estágio de desenvolvimento são,

freqüentemente, conferidas pelas seqüências reforçadoras e silenciadoras as quais

são reconhecidas por fatores de transcrição tecido-específicos. Além de promover

ativamente a transcrição tecidoespecífica (reforçadores), alguns elementos cis-

atuantes, denominados de silenciadores, conferem especificidade de tecido ou estágio

de desenvolvimento pelo bloqueio da expressão em todos os tecidos, exceto no tecido

desejado.

Regulação da transcrição em resposta a estímulos externos:

Sinais ambientais, tais como as concentrações extracelulares de certos íons e

pequenas moléculas nutrientes, temperatura, choque, etc., podem resultar na

alteração dramática do padrão da expressão gênica nas células expostas a mudanças

nesses parâmetros. Nestes casos, o controle da transcrição ocorre da seguinte forma:

um fator de transcrição, previamente inativo, é ativado especificamente pela rota de

sinalização e, depois, liga-se subseqüentemente, a seqüências reguladoras

específicas, localizadas nos promotores dos genes-alvo, ativando, por meio disso, a

transcrição desses genes. No caso da transcrição regulada por moléculas

sinalizadoras ou seus intermediários, tais seqüências reguladoras são freqüentemente

referidas como ELEMENTOS DE RESPOSTA.

Transcrição alternativa:

Vários genes humanos possuem dois ou mais promotores alternativos, que podem

resultar em diferentes isoformas, com diferentes propriedades. As isoformas podem

proporcionar: (1) especificidade de tecido; (2) especificidade do estágio de

desenvolvimento; e (3) localização subcelular diferente.

2.5.2. Controle da Expressão Gênica em ível de Pós-Transcrição:

Controle da tradução em resposta a estímulos externos:

Seqüências cis-atuantes presentes na região 5UTR de alguns mRNAs contém um

elemento de resposta (sítio) que é reconhecida por uma proteína de ligação a

seqüência cis-atuante, potencializando assim a tradução.

Controle da tradução durante o desenvolvimento inicial:

Após a fertilização de um oócito humano, nenhum mRNA é inicialmente produzido, até

o estágio de 4 a 8 células, quando a transcrição zigótica é ativada. Antes desse

período, as funções celulares são especificadas pelo mRNA materno, que foi

previamente sintetizado durante a oogênese. Uma variedade de mRNAs é

armazenada nos oócitos em uma forma inativa, caracterizada por apresentar caudas

de poli(A). Tais mRNAs foram previamente submetidos a desadenilação, e ascaudas

do poli(A) resultantes significam que eles não podem ser traduzidos.

Subseqüentemente, na fertilização ou, mais tarde, no desenvolvimento, as espécies

de mRNAs inativas armazenadas podem ser ativadas pela poliadenilação

citoplasmática, que restaura o tamanho normal das caudas poli(A). A poliadenilação

citoplasmática parece utilizar o mesmo tipo de atividade da poli(A)-polimerase. No

entanto, além do sinal AAUAAA, o mRNA necessita possuir um elemento de

poliadenilação citoplasmático a montante, rico em uracilas.

Encadeamento Alternativo:

Uma fração representativa dos genes humanos sofre encadeamento alternativo, pelo

quais deferentes combinações de exons são incluídas em transcritos a partir do

mesmo gene, durante o processamento do RNA. O encadeamento alternativo resulta

em uma diversidade considerável nas regiões não traduzidas, bem como isoformas

(que são tecido-específicas). As diferentes isoformas podem fornecer uma variedade

de possibilidades de propriedades funcionais alteradas, mas o conhecimento

detalhado da significância funcional das diferentes isoformas ainda é escasso.

Poliadenilação Alternativa:

Em muitos genes, dois ou mais sinais de poliadenilação foram encontrados na região

3-UTR, e os transcritos alternativamente poliadenilados podem apresentar

especificidade de tecido; em outros casos, sinais de poliadenilação alternativos podem

ser produzidos após o encadeamento alternativo.

Edição do mRNA:

Este é um mecanismo de processamento posterior a transcrição, que pode envolver a

inserção ou a deleção ou substituição de nucleotídeos a mediada por enzimas. Os

efeitos das edições são variados, podendo gerar: stop códon prematuro tecido-

específico, mutações de sentido trocado entre outras.

2.5.3. Mecanismos Epigenéticos de Controle da Expressão Gênica:

Metilação e Compactação do DNA:

No DNA de vertebrados, a seqüência CpG é um sinal para metilação por uma DNA

metil-transferase citosina-específica, que adiciona um grupo metil no carbono 5da

citosina. A 5-metilcitosina resultante é quimicamente instável e está sujeita à

desaminação, resultando em timina. Durante longos períodos de tempo evolucionário,

o número de dinucleotídeos CpG no DNA de vertebrados tem diminuído

gradativamente, devido a lenta, porem constante conversão de CpG em TpG (e CpA

na fita complementar). Genes associados a ilhas CpG incluem todos os genes de

manutenção e genes que são amplamente expressos de uma maneira tecido-

específica. As ilhas CpG associadas com sítios de iniciação da transcrição de genes

cuja expressão é restrita a certos tecidos não são metiladas, nesses tecidos, mas são

metiladas nos tecidos onde os genes são expressos. No entanto, as ilhas CpG

localizadas a jusante do sítio de iniciação da transcrição podem ser metiladas em

tecidos onde o gene é expresso.

Outro mecanismo, além da metilação, atua na repressão da expressão gênica. Este

mecanismo é o grau de compactação da cromatina. As acetiltransferases específicas

de histonas adicionam grupamento acetil aos resíduos de lisina próximos à região N-

teminal de histonas. Os terminais N-acetilados formam, então, caudas que se projetam

a partir do centro do nucleossomo. Imagina-se que, como as histonas acetiladas

possuem uma afinidade reduzida pelo DNA, e possivelmente uma pela outra, a

cromatina pode ser capaz de adotar uma estrutura mais aberta, que está mais

apropriada para a expressão gênica. A desacetilação das histonas, no entanto,

promove a repressão da expressão gênica, presumidamente devido ao fato da

cromatina tornar-se mais condensada. Mudanças na estrutura da cromatina têm um

papel importante no controle da expressão gênica. A cromatina existe sob duas

formas, EUCROMATINA (pouco compactada) e HETEROCROMATINA (fortemente

condensada). A eucromatina é transcricionalmente ativa, e replica-se cedo na fase S

do ciclo celular. A heterocromatina é transcricionalmente inativa e replica-se

tardiamente na fase S do ciclo celular.

Pré-programação genômica (Imprinting):

A pré-programação baseia-se na inativação aleatória (independente da origem

parental) ou não (dependente da origem parental) do alelo materno ou paterno de

certos genes bialélicos. O mecanismo de pré-programação ainda não está totalmente

elucidado, entretanto especula-se que alguns mecanismos moleculares sejam

capazes de distinguir entre alelos patri- e matrilinearmente herdados. Este mecanismo

deve ocorrer da seguinte maneira: a medida que os cromossomos passam através das

linhagens germinativas do macho e da fêmea, eles devem adquirir alguma pré-

programação para sinalizar uma diferença entre alelos paternos e maternos, no

organismo em desenvolvimento. Um componentechave, ao menos na manutenção do

status de pré-programação, é a metilação do DNA, alelo-específica.

A pré-programação é uma propriedade de um número limitado de genes ou de uma

pequena região cromossômica. Atualmente, são conhecidos no genoma humano mais

de 30 genes pré-programados, sendo os dois principais: região de 1Mb em 11p15 que

contém ao menos 7 genes; um grupamento de 2,5Mb na região 15q11-q13 também

contém ao menos sete genes.

A grande maioria dos genes pré-programados conhecidos é autossômica. No entanto,

o gene XIST, que possui papel importante na inativação do cromossomo X, pode ser

considerado um exemplo de um gene pré-programado ligado ao X, uma vez que a

expressão do alelo matrilinearmente herdado é preferencialmente reprimida no

trofoblasto. Nas demais células, esse mecanismo é aleatório.

2.5.4. Regulação da Atividade das Proteínas:

A regulação da atividade da proteína compreende principalmente 3 tipos de

processos: (1) translocações de proteínas em diferentes compartimentos celulares; (2)

as interações proteína-proteína; e (3) as modificações enzimáticas reversíveis ou

irreversíveis. Estas funções aparentemente diferentes são intimamente relacionadas

umas com as outras.

A translocação subcelular de polipeptídeos recém-sintetizados ocorre por dois

caminhos principais. Na via citosólica, toda a proteína traduzida no citoplasma

(tradução livre de membrana). Subseqüentemente, o produto é enviado para uma

organela ou fica no citoplasma. A captação por organelas mais provavelmente ocorre

por receptores específicos de organelas que reconhecem seqüências peptídicas

curtas (peptídeo sinal). As proteínas que ficam residindo no citoplasma ficam lá porque

não contêm o peptídeo sinal. A segunda via é através do retículo endoplasmático. A

decisão por este caminho é tomada durante a tradução. Uma proteína destinada a

esta via geralmente contém uma seqüência de sinal hidrofobia com o seu N-terminal.

Esta seqüência de sinal é reconhecida pela partícula de reconhecimento do peptídeo

sinal (SRP), um complexo proteína-RNA, que por sua vez ancora o polissomo aos

receptores SRP da membrana do retículo. Durante a continuidade da tradução (agora

ligada a membrana), o polipeptídeo recém-sintetizado é translocado para a luz do

retículo. As proteínas são ou completamente secretadas na luz do retículo ou se forem

proteínas transmembranares, ficam ligadas à membrana do retículo.

Modificações Pós-Traducionais e a Regulação da Estabilidade da Proteína:

A meia-vida de uma proteína parece uma conseqüência de algumas seqüências

estabilizadoras e características gerais da estrutura secundária. Os aminoácidos Met,

Ser, Ter, Ala, Gli, Val e, mais provavelmente também Cis e Pro têm efeito estabilizador

sobre a proteína quando localizados na extremidade N. Todos os outros aminoácidos

tornam a proteína vulnerável a uma protease que rapidamente a degrada. A

maquinaria proteolítica responsável pela degradação seletiva de proteínas é

dependente de ubiquitina. A ubiquitina é uma pequena proteína de 76 aminoácidos

que se liga a outras proteínas. Quando a maquinaria proteolítica dependente de

ubiquitina reconhece um aminoácido desestabilizante no N-terminal de uma proteína,

uma molécula de ubiquitina é ligada covalentemente ao terminal N ou a uma lisina

próxima. Subseqüentemente, uma série de ubiquitinas adicionais é acrescentada,

produzindo uma proteína ramificada multiubiquinada. Uma protease específica

reconhece tais ubiquitinas e as degrada enquanto recicla os polipeptídeos de

ubiquitina. Como já mencionado, a degradação de proteínas dependente de ubiquitina

é especificada pelo primeiro aminoácido no terminal N de cada proteína. Embora em

todos os genes de proteínas eucarióticas o primeiro códon (AUG) codifique uma

metionina, muitas poucas espécies de proteínas prontas têm metionina em seu N-

terminal. Geralmente, o N-terminal é cotraducionalmente modificado por atividades de

aparo e adição de terminal não muito bem compreendido. Curiosamente, as proteínas

que são endereçadas ao retículo em geral têm o N-terminal não modificado, tornando-

as altamente instáveis no citosol mas não no retículo. Isto pode ser importante em

permitir que a célula seja capaz de degradar especificamente proteínas que entram na

via citosólica por acidente.

2.6. Ferramentas para Manipulação de RNA e Proteínas:

A estrutura, a expressão e a função dos genes humanos podem ser estudadas por

uma variedade de métodos. A prioridade inicial na definição da estrutura do gene é

obter uma seqüência completa de cDNA e identificar os sítios de iniciação e

terminação de tradução e os sítios de poliadenilação. A estrutura exon/intron pode

então ser determinada pela comparação da seqüência de cDNA com as seqüências

de clones de DNA genômico relacionados. Subseqüentemente, podem ser feitas

tentativas para uma caracterização genética completa, em nível genômico, por meio

do sequenciamento das regiões promotoras, das seqüências flanqueadoras 5’ e 3’ e

das seqüências de introns.

2.6.1. Métodos para obtenção de clones de genes para estudar a sua estrutura,

expressão e função:

Clonagem de cD A enriquecido – o DNA genômico de todas as células humanas

nucleadas consiste basicamente da mesma coleção de seqüências, porém, a

representatividade das várias populações de mRNA variam entre as células. Por

exemplo, mRNA de α-globina e β-globina são abundantes entre as moléculas de

mRNA de eritrócitos e, conseqüentemente, seqüências de cDNA de globina são

abundantes em bibliotecas de cDNA de eritrócitos. Métodos baseados em PCR

também foram desenvolvidos para amplificar seletivamente cDNAs correspondendo

aos subconjuntos de genes transcricionalmente ativos.

Clonagem direcionada à proteína – a seqüência de aminoácidos da um polipeptídeo

pode ser determinada para permitir a síntese de oligonucleotídeos específicos para um

gene os quais podem ser usados como sondas de hibridização para isolar um cDNA

correspondente ou um clone de DNA genômico.

2.6.2. Métodos para estudar a estrutura do gene:

2.6.2.1. Mapeamento de sítios de transcrição

Ensaio de proteção à nuclease S1 – neste ensaio, um fragmento de restrição da

extremidade 5 de um gene clonado é suspeito de conter o sítio de iniciação de

transcrição. Ele é marcado nas extremidades 5, desnaturado e misturado com o RNA

total de células nas quais acredita-se estar sendo expresso o gene relevante. O mRNA

cognato pode hibridizar com a fita de DNA anti-senso, formando um heterodúplex

RNA-DNA. Tratamento subseqüente com nuclease S1 (enzima que degrada acido

nucléico de fita simples) resulta na clivagem progressiva da extremidade livre 3 da

seqüência de DNA até o ponto em que o DNA está hibridizado à extremidade 5 do

mRNA. Fracionamento por tamanho, em uma eletroforese em gel desnaturante, pode

identificar a diferença de tamanho entre o DNA original e o DNA hibridizado após o

tratamento com nuclease S1.

Ensaio de extensão de primer – neste caso, o fragmento de restrição suspeito de

conter o sítio de iniciação de transcrição é escolhido deliberadamente para ser

pequeno. A hibridização com um mRNA cognato irá deixar um mRNA com uma

extremidade 5 livre. O DNA pode servir como um primer para a transcriptase reversa

(RT) estender a sua extremidade 3 até que a extremidade 5do mRNA seja alcançada.

O aumento de tamanho após o tratamento com a transcriptase reversa (+RT)

comparado com antes do tratamento (-RT) mapeia o sítio de início da transcrição. Um

mapeamento mais preciso é possível, em ambos os métodos, pelo seqüenciamento do

DNA após o tratamento com S1 ou RT.

Figura: (A) ensaio de proteção a nuclease S1. (B) ensaio de extensão de primer

2.6.2.2. Mapeamento dos limites exon/intron

A presença de introns pode ser usualmente inferida por meio de mapeamento

comparativo de clones genômicos e de cDNAs relacionados. Uma vez que toda a

seqüência de cDNA é estabelecida, primers para o seqüenciamento podem ser

definidos a partir dos vários segmentos de cDNA e usados para o seqüenciamento de

DNA por PCR com clones de cosmídeos desnaturados como moldes de DNA. As

sequencias obtidas devem cruzar a região limítrofe exon/intron.

2.6.3. Métodos aplicados ao estudo da expressão gênica:

Uma vez eu um clone genômico ou de cDNA torna-se disponível, pode ser marcado e

usado como sonda para detectar a expressão daquele gene ao nível de RNA. Há

diferentes métodos a disposição para se estudar a expressão de RNA, tais como:

Hibridização pela técnica de orthern blot - esse é um método de baixa resolução, mas

que permite detectar padrões de expressão por meio da hibridização de uma sonda

gênica ou de cDNA, com extratos de RNA total ou RNA poli(A)+ preparados a partir de

diferentes tecidos ou de linhagens de células. O fato de o RNA ser fracionado por

tamanho em um gel possibilita estimar o tamanho de transcritos. A presença de

múltiplas bandas de hibridização em uma canaleta pode indicar a presença de

isoformas de diferentes tamanhos.

Hibridização in situ em tecidos – neste procedimento, os tecidos são congelados ou

embebidos em parafina e cortados usando-se um micrótomo, para obter cortes muitos

finos, os quais são montados em uma lâmina de microscópio. A hibridização de uma

sonda específica para um gene, no tecido presente em lâmina, pode oferecer imagens

detalhadas de expressões representativas da distribuição de RNA no tecido de origem.

Hibridização de D A em microarranjo – para investigar a expressão de genes de

interesse, dispostos nos microarranjos, o RNA é extraído das células-alvo

selecionadas, convertido em cDNA (pela enzima transcriptase reversa), marcado com

substância fluorescente e hibridizado ao microarranjo. O cDNA marcado é,

naturalmente, uma população bastante heterogênea, correspondente ao RNA

transcrito de todos os genes expressos nas células-alvo. Um gene que é intensamente

expresso nas células-alvo será, portanto, bem representado na sonda de cDNA total;

por sua vez, um gene que é pouco expresso será escassamente representado no

cDNA marcado. Quando o cDNA marcado é hibridizado ao microarranjo, a intensidade

do sinal que permanece ligado aos clones individuais de cDNA, ou aos

oligonucleotídeos individuais, indica o quanto a respectiva seqüência é bem

representada no cDNA marcado, sendo portanto, uma medida de expressão gênica.

O estudo da expressão gênica também pode ser conduzido em nível de expressão de

proteínas. As principais abordagens são:

Imunobloting (ou Western blotting) – esse método foi projetado para analisar a

expressão bruta de proteínas usando extratos celulares fracionados, de acordo como

o tamanho das moléculas. Geralmente isso é obtido por meio de um SDS-PAGE

unidimensional, uma forma de eletroforese em gel de poliacrilamida na qual a mistura

de proteínas extraídas é dissolvida em uma solução de SDS (um detergente aniônico

que interrompe quase todas as interações não covalentes em proteínas nativas).

Mercaptoetanol também é adicionado para reduzir as pontes de enxofre. Após a

eletroforese, as proteínas fracionadas podem ser visualizadas por meio de coloração

com um corante apropriado. Géis bidimensionais também podem ser utilizados: a

primeira dimensão envolve o ponto isoelétrico, que é a separação, de acordo com a

carga, em um gradiente de pH. A segunda dimensão envolve o fracionamento por

tamanho por meio do SDS-PAGE. Nesse caso, as proteínas fracionadas são

transferidas (blotted) para uma membrana de nitrocelulose e expostas a um anticorpo

específico.

Imunocitoquímica - essa técnica visa estudar os padrões gerais de expressão em nível

de proteínas, dentro de um tecido ou outra estrutura multicelular. Essa técnica é

considerada como o equivalente protéico dos métodos de hibridização in situ, em

tecidos para rastrear a expressão de RNA. Assim como este caso, os tecidos são

geralmente congelados ou embebidos em parafina, e então cortados em secções

muito finas antes de serem montados em lamínula. O anticorpo apropriado é utilizado

para ligar-se à proteína no corte do tecido, podendo produzir dados de expressão

disponíveis para comparação com a coloração histológica de cortes de tecidos

vizinhos.

Microscopia de imunofluorescência – esse método é usado na investigação da

localização subcelular de uma proteína de interesse. Para tanto, um corante

fluorescente apropriado, é acoplado ao anticorpo desejado, permitindo que a proteína

relevante seja localizada dentro da célula por meio de microscopia de

imunofluorescência.

2.6.4. Métodos aplicados na investigação da função de genes:

Após um gene codificador de um polipeptídeo ter sido caracterizado ao nível de

nucleotídeos e uma seqüência polipeptídica esperada ter sido descoberta,

investigações adicionais se concentram na expressão, na regulação da expressão e

na função biológica do gene. Os métodos mais eficientes para a investigação da

função de um gene humano baseiam-se na extrapolação de resultados obtidos em

camundongos. O gene equivalente (ortólogo) é identificado em um camundongo e o

direcionamento a um gene-alvo é usado para eliminar a sua expressão e ver se o seu

silenciamento produz algum tipo de fenótipo mutante. Outro método muito eficiente é

expressar uma seqüência de interesse, para produzir uma proteína e usar essa

proteína de modo a identificar outras proteínas ou ácidos nucléicos aos quais ela

possa se ligar.

MÓDULO 3 – GE ÉTICA DE DOE ÇAS HUMA AS

As doenças hereditárias humanas são normalmente classificadas sob os títulos de:

Monogênicas – quando um caráter hereditário é determinado pela modificação em um

único gene. Cromossômicas – quando o distúrbio genético resulta da perda ou ganho

de uma quantidade significativa de material cromossômico.

Poligênicas (multifatoriais) – quando a doença genética é decorrente dos efeitos

combinados de vários genes, cada um fazendo uma pequena contribuição, associado

com fatores ambientais de risco. Esta classe de doença genética é mais comumente

observada. A maioria das malformações congênitas e de doenças comuns como

câncer e diabetes são exemplos de doenças genéticas multifatoriais.

3.1. Padrões de Herança Monogênica: 3.1.1. omenclatura Básica: Gene autossômico

– é o que está situado em um cromossomo autossomo, ou seja, um dos cromossomos

numerados de 1 a 2.

Gene Ligado ao X ou Ligado ao Y – refere-se ao gene situado no cromossomo X ou Y,

respectivamente. Locus (plural loci) – é a posição ou local em um cromossomo onde o

gene está situado. Alelos – são formas alternativas do mesmo gene. Heterozigoto –

refere-se a presença de dois alelos diferentes em um mesmo lócus. Homozigoto –

refere-se a presença de dois alelos idênticos em um mesmo lócus. Genótipo – é a

combinação dos alelos presentes em um ou mais loci. Fenótipo – expressão

observada de um genótipo. Heterogeneidade – refere-se a diversidade.

Heterogeneidade de lócus – significa que uma condição pode ser causada por

mutações e loci diferentes. Heterogeneidade alélica – indica que um caráter genético

pode ser causado por mutações diferentes no mesmo lócus. Dominante – significa que

uma única cópia de um gene anormal é o suficiente para o desenvolvimento do

distúrbio genético. Recessivo - indica que ambas as cópias do gene têm que estar

alteradas para a expressão da doença.

Heredograma – construção esquemática de uma árvore familial com o propósito de

facilitar o reconhecimento do padrão de transmissão do distúrbio genético.

3.1.2. Herança Autossômica Dominante:

Mas da metade dos distúrbios mendelianos é herdado como autossômico dominante.

A incidência de alguns distúrbios autossômicos dominantes é alta, pelo menos em

áreas geográficas específicas, como por exemplo: 1 em 500 para hipercolesterolemia

familiar em populações descendentes de europeus e japoneses; 1 em 550 para a

distrofia miotônica no noroeste de Quebec/Canadá; e de cerca de 1 em 2.500 a 3.0

para diversas condições, como a doença de Huntington, neurofibromatose e doença

dos rins policísticos em populações de norte-americanas.

Um fenótipo que é expresso tanto em homozigotos quanto em heterozigotos para um

alelo mutante é reconhecido como dominante. Os distúrbios dominantes ocorrem se

houver ou não um produto genético normal produzido pelo alelo normal remanescente.

Em uma doença dominante pura, homozigotos e heterozigotos para o alelo mutante

são, ambos, igualmente afetados. Entretanto, os distúrbios dominantes são mais

graves em homozigotos do que em heterozigotos, situação na qual a doença é

denominada incompletamente dominante (ou semi-dominante).

O risco e a gravidade da doença dominantemente herdada na prole dependem de se

um ou ambos os genitores está afetado e de se a característica é estritamente

dominante ou incompletamente dominante. Estipulando-se “D” como o alelo mutante e

“d” como o alelo normal, as uniões que produzem crianças com doença autossômica

dominante podem ser entre dois heterozigotos (D/d) para a mutação ou, mais

freqüentemente, entre um heterozigoto para a mutação (D/d) e um homozigoto para o

alelo normal (d/d):

União parental Prole Risco para a prole

Afetado com não afetado D/d x d/d ½ D/d

½ d/d, ½ afetado, ½ não afetado,

Afetado com afetado D/d x D/d ¼ D/D ½ D/d

½ d/d

Se estritamente dominante: ¾ afetados ¼ não afetado

Se incompletamente dominante: ½ afetado semelhante aos genitores ¼ mais

gravemente afetado que os genitores ½ não afetado

Cada filho de uma união D/d com d/d possui uma probabilidade de 50% de receber o

alelo “D” anormal do genitor e uma chance de 50% de receber o alelo normal”d”.Na

população como um todo, a descendência de genitores D/d com d/d é de,

aproximadamente, 50% D/d e 50% d/d. Obviamente, cada gestação é um evento

independente, não governado pelo resultado de gestações anteriores. Portanto, dentro

de uma família, a distribuição de filhos afetados e não afetados pode ser bem diferente

da proporção teórica esperada de1:1, especialmente se a prole for pequena.

Na prática médica, os homozigotos para os fenótipos dominantes não são

freqüentemente vistos porque as uniões que poderiam produzir uma descendência

homozigota são raras. Novamente, estipulando o alelo mutante como “D” e o alelo

normal “d”, as uniões que podem produzir um homozigoto D/D podem, teoricamente,

ser D/d com D/d, D com D/d ou D/D com D/D, ou o paciente, em situações

excessivamente raras, ter recebido a mutação de um genitor geneticamente não

afetado. Em termos práticos, somente a união entre dois heterozigotos precisa ser

considerada porque os homozigotos D/D são raros e, geralmente, gravemente

afetados para se reproduzirem. Na hipótese de união entre dois heterozigotos, ¾ dos

afetados poderiam apresentar a mesma condição se esta for dominante pura, ou 1/3

dos afetados poderia ser homozigoto e mais gravemente afetado do que os

heterozigotos D/d. De fato, não foi claramente provado que nenhum distúrbio

dominante humano fosse dominante puro. Mesmo a doença de Huntington, que é um

distúrbio mais freqüentemente invocado como dominante puro, porque a doença

geralmente é semelhante em natureza e gravidade dos sintomas tanto em

homozigotos quanto em heterozigotos, parece apresentar um curso de duração

acelerado desde o início da doença até o óbito em indivíduos homozigotos, se

comparados aos heterozigotos.

Herança incompleta dominante – a acondroplasia é um distúrbio esquelético

incompletamente dominante, que se manifesta como um nanismo de membros curtos

e cabeça grande. Os casamentos entre dois indivíduos acondroplásicos não são

incomuns. Freqüentemente, o exame clínico já é suficiente para identificar um filho

homozigoto D/D do heterozigoto D/d; os indivíduos homozigotos para a acondroplasia

são mais gravemente afetados do que os heterozigotos e comumente não sobrevivem

ao período pós-natal.

Mutação nova na herança autossômica dominante – a maioria das condições

dominantes de importância clínica ocorre não somente por meio da transmissão de

alelos mutantes, mas também por meio da herança de uma nova mutação,

espontânea, em um gameta herdado de um genitor não afetado. Isso acontece porque

os distúrbios dominantes podem ocorrer quando só um dos membros do par de alelos

em um lócus é defeituoso, tenha ele sido herdado de um genitor heterozigoto ou

surgido por meio de uma mutação espontânea no gameta transmitido por um genitor

não-afetado.

Características da herança autossômica dominante

O fenótipo geralmente aparece em todas as gerações, com cada uma das pessoas

afetadas possuindo um genitor afetado. As exceções a essa regra são: casos

originados por mutação nova ocorrida no gameta do genitor não afetado, e casos dos

quais não é expresso (não penetrante) ou só é expresso de modo sutil em uma

pessoa que herdou o alelo mutante;

Qualquer filho de um genitor afetado tem 50% e risco de herdar a o alelo mutante;

Membros fenotipicamente normais das famílias não transmitem o fenótipo afetado

para seus filhos; Homens e mulheres têm iguais probabilidades de transmitir o fenótipo

para a prole.

Distúrbios que apresentam herança autossômica dominante – acondroplasia, distrofia

miotônica, doença adulta do rim policístico, doença de Huntington, hipercolesterolemia

familiar, neurofibromatose (tipos 1 e 2), osteogênese imperfeita, retinoblastoma,

Síndrome de Marfan.

3.1.3. Herança Autossômica Recessiva:

Um distúrbio que apresenta herança autossômica recessiva só se manifesta no estado

homozigoto, sendo os indivíduos afetados portadores dos dois alelos mutantes. Com

raras exceções, um destes alelos mutantes terá sido herdado de cada um dos

genitores heterozigotos não afetados (portadores). Três tipos de combinações podem

levar a uma prole homozigota afetada por uma doença autossômica recessiva. O alelo

recessivo mutante é simbolizado como “r” e o seu alelo dominante como “R”. Embora

qualquer combinação na qual cada genitor possua ao menos um alelo recessivo possa

produzir descendência homozigota afetada, a combinação mais comum é aquela entre

dois heterozigotos não afetados.

Portador com portador

(R/rx R/r) ¼ R/R

União parental Prole Risco para a prole

½ R/r ¼ r/r

¾ não afetados ¼ afetado

Portador com afetado (R/rx r/r) ½ R/r

½ afetado

½ não afetado

Afetado com afetado (r/r x r/r) Só r/r Todos afetados

Quando dois genitores que são ambos portadores têm filhos, em média, ½ deles serão

portadores, ¼ será homozigoto afetado e o ¼ restante será homozigoto normal.

Características da herança autossômica recessiva

Homens e mulheres são igualmente afetados; Em geral, apenas os membros de uma

família são afetados; A probabilidade de que um irmão ou irmã de um afetado também

seja afetado é de 1 em 4 (25%).

Distúrbios que apresentam herança autossômica recessiva – Albinismo ocolocutâneo,

alcaptonúria, anemia falciforme, doença de Tay-Sachs, fenilcetonúria, fibrose cística,

hemocromatose, galactosemia, e quase todos os erros hereditários do metabolismo.

3.1.4. Herança Ligada ao X:

Os cromossomos X e Y, que são responsáveis pela determinação do sexo, estão

distribuídos desigualmente entre homens e mulheres. Por este motivo, os fenótipos

determinados pelos genes localizados no cromossomo X apresentam uma distribuição

sexual característica e um padrão de herança que geralmente não é fácil de identificar.

Acredita-se que aproximadamente 1.100 genes estejam localizados no cromossomo

X, dos quais sabe-se que 40% são associados a fenótipos patológicos.

Uma vez que os homens possuem somente um cromossomo X, enquanto as mulheres

possuem dois, só existem dois genótipos possíveis em homens e três em mulheres

com respeito a um alelo em um lócus ligado ao X. Um homem com um alelo mutante

em um lócus ligado ao X é hemizigoto para aquele alelo, enquanto as mulheres podem

ser homozigotas tanto para o alelo do tipo selvagem quanto para o mutante, ou podem

ser heterozigotas.

Por exemplo, se XH for o alelo de tipo selvagem para o gene do fator VIII de

coagulação e um alelo mutante, Xh, provocar a hemofilia A, os genótipos esperados

em homens e mulheres poderiam ser os seguintes:

Genótipos Fenótipos

Homens Hemizigotos XH Hemizigotos Xh

Não afetados Afetados

Mulheres Homozigotos XH /XH

Heterozigotos XH /Xh Homozigotos Xh /Xh

Não afetados Não afetados (normalmente) Afetados

Inativação do cromossomo X, Compensação de doses e a Expressão de Genes

ligados ao X – A inativação do X é um processo fisiológico normal no qual um

cromossomo X é, em grande parte, inativado nas células somáticas nas mulheres

normais (mas não nos homens normais), igualando, assim, a expressão da maioria

dos genes ligados ao X em ambos os sexos (Teoria de Compensação de Dose). A

relevância da inativação do X é profunda. Ela faz com que as mulheres possuam duas

populações celulares, uma na qual um dos cromossomos X está ativo e uma outra na

qual o outro cromossomo X está ativo. Ambas as populações celulares nas mulheres

são prontamente identificadas para alguns distúrbios. Por exemplo, na distrofia

muscular de Duchenne, os portadores femininos exibem a típica expressão mosaica,

permitindo que sejam identificados pela imunocoloração para a distrofina. Dependendo

do padrão de inativação aleatória do X dos dois cromossomos X, duas mulheres

heterozigotas para uma doença ligada ao X podem apresentar quadros clínicos muito

diferentes, uma vez que diferem na proporção de células que possuem o alelo mutante

no X ativo em um tecido relevante.

3.1.4.1. Herança Recessiva Ligada ao X:

A herança recessiva ligada ao X segue um padrão bem definido e facilmente

identificável.Uma mutação recessiva ligada ao X é tipicamente expressa no fenótipo

de todos os homens que a receberam, mas somente nas mulheres que são

homozigotas para a mutação. Conseqüentemente, os distúrbios recessivos ligados ao

X geralmente estão restritos aos homens e raramente são observados em mulheres.

Características da herança recessiva ligada ao X a incidência da característica é maior

em homens do que em mulheres; as mulheres heterozigotas geralmente não são

afetadas, mas algumas podem expressar a condição com gravidade variável,

conforme determinada pelo padrão de inativação do X;

O gene responsável pela condição é transmitido de um homem afetado para todas as

suas filhas. Qualquer um dos filhos das suas filhas tem 50% de chance de herda-lo;

O alelo mutante geralmente nunca é transmitido por um homem afetado para todas as

suas filhas;

O alelo mutante pode ser mantido através de uma série de portadores femininos; se

assim o for, os homens afetados em uma família são aparentados através das

mulheres.

Distúrbios que apresentam herança recessiva ligada ao X – daltonismo verde-

vermelho, distrofia muscular de Duchenne e Becker, Hemofilia (A e B), Síndrome de

Hunter, deficiência de glicose-6-fosfato desidrogenase.

3.1.4.2. Herança Dominante Ligada ao X:

Um fenótipo ligado ao X é descrito como dominante se for regularmente expresso em

heterozigotos. A herança dominante ligada ao X pode ser imediatamente distinguida

da herança autossômica dominante pela ausência de transmissão homem a homem, o

que é obviamente impossível para a herança ligada ao X, uma vez que os homens

transmitem o cromossomo Y, não o X, para os seus filhos. Desse modo, a

característica distintiva de um heredograma dominante ligado ao X completamente

penetrante é que todas as filhas e nenhum dos filhos dos homens afetados são

acometidos; se qualquer das filhas não for afetada ou qualquer filho estiver afetado, a

herança deverá ser autossômica, e não ligada ao X. O padrão de herança por via

feminina não é diferente do padrão autossômico dominante; uma vez que a mulheres

possuem um par de cromossomos X, assim como possuem pares de autossomos,

cada filho de uma mulher afetada tem 50% de chance de herdar a característica,

independente do sexo. Nas múltiplas famílias com uma doença dominante ligada ao X,

a expressão geralmente é mais branda nas mulheres, que quase sempre são

homozigotas, porque o alelo mutante está localizado no cromossomo X inativo em

uma proporção das suas células. Portanto, a maioria dos distúrbios dominantes

ligados ao X são incompletamente dominantes, como é o caso da maioria dos

distúrbios autossômicos dominantes.

Características da herança dominante ligada ao X

Os homens afetados com parceiras normais não têm nenhum filho afetado e nenhuma

filha normal; Tanto os descendentes masculinos quanto os femininos das mulheres

portadoras apresentam o risco de 50% de herdarem o fenótipo. O padrão do

heredograma é semelhante ao observado na herança autossômica dominante As

mulheres afetadas são cerca de duas vezes mais comuns do que os homens, mas

nenhuma mulher afetada possui uma expressão mais leve (embora variável) do

fenótipo. Distúrbios que apresentam herança dominante ligada ao X – síndrome do X

frágil, raquitismo resistente a vitamina D, síndrome de Rett

3.1.5. Herança Ligada ao Y:

Apenas um pequeno número de genes foi identificado no cromossomo Y, a maioria

dos quais envolvidos na determinação da masculinidade e manutenção da

espematogênese. Eles incluem o SRY (do inglês, Sex determining Region of the Y

chromosome) e DAZ (do ingles, Deleted in Azoospermia). Um distúrbio que é ligado ao

Y é dito apresentando herança holândrica, e é transmitido por um homem para todos

os filhos homens e nenhuma das filhas mulheres.

3.1.6. Herança Pseudo-Autossômica:

A herança pseudo-autossômica descreve o padrão de herança observado em genes

na região pseudo-autossômicados cromossomos X e Y que podem ser permutados

regularmente entre os dois cromossomos sexuais. Alelos para genes na região

pseudo-autossômica podem exibir transmissão homem a homem e, portanto,

mimetizar a herança autossômica, porque podem fazer crossing-over do X para o Y

durante a gametogênese masculina e ser passados a diante a partir de um pai para a

sua descendência masculina. A discondroenteose (baixa estatura e deforminade do

antebraço) é um exemplo de condição pseudo-dominante. Maior prevalência da

doença foi observada no sexo feminino, se comparado ao masculino, sugerindo um

distúrbio dominante ligado ao X, mas a presença da transmissão homem a homem

claramente eliminou uma herança estritamente ligada ao X. O gene SHOX,

responsável por esta condição, está localizado na região pseudo-autossômica em Xp

e Yp, escapando da inativação do X.

3.1.7. Herança Materna – D A mitocondrial:

Sabe-se que alguns heredogramas de doenças hereditárias que poderiam não ser

explicados pela herança mendeliana típica de genes nucleares são conhecidos por

causarem mutações do genoma mitocondrial e por manifestarem uma herança

materna. Distúrbios provocados por mutações do DNA mitocondrial demonstram uma

série de características incomuns que resultam das peculiaridades da biologia e da

função mitocondrial.

Mais de 100 rearranjos diferentes e 100 diferentes pontos de mutação que podem

provocar doença humana foram identificados no mtDNA, freqüentemente envolvendo

os sistemas nervoso central e musculoesquelético. As doenças que resultam dessas

mutações exibem um padrão distintivo de herança devido a três características

incomuns da mitocôndria: segregação replicativa, homoplasmia e heteroplasmia, e

herança materna.

Segregação replicativa – A primeira característica singular do cromossomo

mitocondrial é a ausência da segregação firmemente controlada, observada durante a

mitose e meiose dos 46 cromossomos nucleares. Na divisão celular, as múltiplas

cópias do mtDNA em cada uma das mitocôndrias de uma célula se replicam e

distribuem aleatoriamente entre as mitocôndrias recém-sintetizadas. As mitocôndrias,

por sua vez, são distribuídas aleatoriamente entre as duas células-filhas. Este

processo é conhecido como segregação replicativa.

Homoplasmia e heteroplasmia – a segunda característica singular da genética do

mtDNA provém do fato de que a maioria das células contêm muitas cópias de

moléculas de mtDNA. Quando surge uma mutação no mtDNA, inicialmente ela só está

presente em uma das moléculas de mtDNA em uma mitocondria. Com a segregação

replicativa, porém, uma mitocôndria contendo um mtDNA mutante irá adquirir múltiplas

cópias da molécula mutante. Com a divisão celular, uma célula contendo uma mistura

de mtDNA normal e mutante pode distribuir proporções muito diferentes do DNA

mitocondrial mutante e do tipo selvagem às suas células-filhas.Uma célula-filha pode,

por acaso, receber mitocôndrias que só contêm uma população pura de mtDNA

normal, ou uma população pura de mtDNA mutante (uma situação conhecida como

homoplasmia). Alternativamente, a célula-filha pode receber uma mistura de

mitocôndrias, algumas com algumasa sem mutação (heteroplasmia). Uma vez que a

expressão fenotípica de uma mutação no mtDNA depende das proporções relativas a

de mtDNA normal e mutante nas células constituintes dos diferentes tecidos, a

penetrância reduzida, e a expressão variável e a pleiotropia são todas características

típicas dos distúrbios mitocondriais.

Herança materna do mtD A – A característica determinante da genética do mtDNA é a

herança materna. As mitocôndrias dos espermatozóides geralmente são eliminadas do

embrião, de modo que o mtDNA é herdado da mãe. Portanto, todos os filhos de uma

mulher que seja homoplasmática para uma mutação no mtDNA herdarão esta

mutação, enquanto que nenhum dos descendentes de um homem portador da mesma

mutação herdará o DNA defeituoso.A herança materna de uma mutação

homoplasmática do mtDNA causadora da neuropatia óptica hereditária de Leber está

exemplificada na figura abaixo.

Heredograma da neuropatia ópitica de Leber, uma forma de cegueira espontânea

provocada por um defeito no mtDNA. A herança se dá através da linhagem materna.

Nenhum homem afetado transmite a doença.

A herança materna na presença de heteroplasmia na mãe está associada a

características adicionais da genética do mtDNA que são de significância médica. Em

primeiro lugar, o número de moléculas de mtDNA no interior de ovócitos em

desenvolvimento é reduzido antes de ser subseqüentemente amplificado até o imenso

total observado nos ovócitos maduros. Esta restrição e subseqüente amplificação do

mtDNA durante a ovocitogênese são denominados gargalo genético mitocondrial.

Conseqüentemente, a variabilidade na percentagem de moléculas mutantes de

mtDNA observadas na descendência de uma mãe com heteroplasmia para uma

mutação no mtDNA provém, ao menos em parte, da amostragem de apenas um

subconjunto de mtDNA durante a ovocitogênese. Como poderia ser esperado, as

mães com uma elevada proporção de moléculas mutantes de mtDNA estão mais

propensas a produzir óvulos com uma proporção mais elevada de mtDNA mutante e,

conseqüentemente, apresentam maior probabilidade de ter uma prole clinicamente

afetada do que as mães com uma proporção mais baixa. Uma exceção à herança

materna ocorre quando a mãe é heteroplasmática para uma mutação por deleção no

seu mtDNA; por razões desconhecidas, as moléculas removidas de mtDNA

geralmente não são transmitidas das mães clinicamente afetadas para os seus filhos.

Embora as mitocôndrias sejam, quase sempre, exclusivamente herdadas por meio da

mãe, pelo menos um exemplo de herança paterna de mtDNA ocorreu em um paciente

com uma miopatia mitocondrial. Conseqüentemente, em pacientes com mutações

aparentemente esporádicas no mtDNA, a rara ocorrência da herança paterna de

mtDNA deve ser considerada.

Características da herança mitocondrial

Todos os filhos de mulheres homoplasmáticas para uma mutação herdarão esta

mutação; os filhos dos homens portadores de uma mutação semelhante nunca o

farão.

As mulheres heteroplasmáticas para mutações de ponto e duplicações as passarão

para todos os seus filhos. Todavia, a fração de mitocôndrias mutantes na prole, e

conseqüentemente, o risco e a gravidade da doença, podem variar consideravelmente

dependendo da fração de mitocôndrias mutantes nas suas mães, assim como da

probabilidade aleatória operando sobre um pequeno número de mitocôndrias por

célula no gargalo dos ovócitos. As deleções heteroplasmáticas geralmente não são

herdadas.

A fração de mitocôndrias mutantes nos diferentes tecidos de um indivíduo

heteroplasmático para uma mutação pode variar tremendamente, provocando, assim,

um espectro de doenças entre os membros de uma família na qual haja heteroplasmia

para uma mutação mitocondrial. A pleiotropia e a expressividade variável nos

diferentes membros afetados da família são freqüentes.

3.1.8. Fatores que Afetam os Padrões de Herança:

Mutações novas: Se uma criança nasceu com uma doença genética e não há histórico

da doença na família, é possível que a criança seja produto de uma mutação nova

(isto é especialmente provável se a doença em questão for autossômica dominante).

Isto é, o gene transmitido por um dos genitores sofreu alteração no DNA, resultando

em uma mutação de um alelo normal para um causador de doença. Os genes neste

lócus nas outras células germinativas do genitor seriam normais. Neste caso, o risco

de recorrência para a prole subseqüente do genitor não é elevado acima do da

população em geral. Entretanto, a prole da criança afetada pode ter um risco de

ocorrência substancialmente elevado. Uma grande proporção dos casos observados

de muitas doenças autossômicas dominantes resulta de mutações novas. Por

exemplo, estima-se que 7/8 de todos os casos de acondroplasia são devidos a

mutações novas, enquanto que apenas 1/8 são transmitidas por pacientes

acondroplásicos. Isto ocorre principalmente porque a doença tende a limitar o

potencial de reprodução.

Mosaicismo germinativo: Ocasionalmente, duas ou mais pessoas da prole

apresentarão uma doença autossômica dominante quando não há histórico familiar da

doença. Como a mutação é um evento raro, é improvável que isso seja devido a várias

mutações na mesma família. O mecanismo mais provável como responsável é

chamado mosaicismo germinativo. Durante o desenvolvimento embrionário de um dos

genitores, ocorreu uma mutação que afetou toa ou parte da linhagem germinativa, mas

poucas ou nenhuma das células somáticas do embrião. Assim, o genitor tem a

mutação em sua linhagem germinativa, mas de fato não expressa a doença. Como

resultado, ele (ou ela) pode transmitir a mutação para vários descendentes. Este

fenômeno, embora relativamente raro, pode ter efeitos significativos nos riscos de

recorrência, quando ele ocorre. Exemplos de doenças com mosaicismo germinativo

são: acondroplasia, neurofibromatose tipo 1, DMD e hemofilia A.

Idade atrasada de manifestação: Enquanto algumas doenças genéticas se expressam

ao nascimento, ou logo após, muitas outras não são aparentes senão já na vida

adulta. Isto é conhecido como idade atrasada de manifestação. O atraso na idade de

início reduz assim a seleção natural contra um gene de doença, aumentando a sua

freqüência na população.

Penetrância reduzida: é a probabilidade de que um gene venha, de fato, a possuir uma

expressão fenotípica. Quando a freqüência de expressão de um fenótipo é de menos

de 100% - ou seja, quando alguns falham completamente em expressá-los -, diz-se

que o gene exibe uma penetrância reduzida. A penetrância é um conceito de “tudo-ou-

nada”. É a percentagem de pessoas com um genótipo predisponente que são

afetadas, pelo menos em alguma medida. Estudos familiares mostraram que cerca de

10% dos portadores obrigatórios do gene de suscetibilidade ao retinoblastoma não

possuem a doença. Neste caso, a penetrância do gene é dita ser de 90%.

Expressividade variável: A expressividade variável refere-se a intensidade da

expressão do fenótipo da doença. As causas da expressividade variável em geral não

são conhecidas. Efeitos ambientais podem às vezes ser responsáveis: na ausência de

um determinado fator ambiental, o gene se expressa com gravidade diminuída ou

nenhuma. Uma outra causa possível é a interação de outros genes, chamados de

genes modificadores, com o gene da doença. Finalmente, a medida que a base

molecular da mutação torna-se melhor compreendida, fica claro que alguns casos de

expressividade variável são devidos a tipos diferentes de mutações (alelos diferentes)

no mesmo lócus de doença. Isto se chama heterogeneidade alélica.

Pleiotropia e Heterogeneidade: Os genes que exercem efeitos em múltiplos aspectos

da fisiologia ou anatomia são pleiotrópicos. A pleiotropia é uma característica comum

de genes humanos. A síndrome de Marfan (acometimento de olhos, esqueleto e

sistema cardiovascular), a Fibrose Cística (acometimento das glândulas sudoríparas,

pulmões, pâncreas) osteogênese imperfeita (ossos, dentes e esclera são afetados) e o

albinismo (distúrbios na pigmentação e no desenvolvimento da fibra óptica) são

exemplos clássicos de doenças hereditárias com efeitos pleiotrópicos.

Do mesmo modo que um gene pode ter múltiplos efeitos, um único fenótipo de doença

pode ser causado por mutações em diferentes loci em diferentes famílias. A causa do

mesmo fenótipo de doença por mutações em loci distintos é chamada de

heterogeneidade de lócus.

Imprinting genômico: Alguns genes de doenças podem-se expressar diferentemente

quando herdados de um sexo versus o outro. Isto é o imprinting genômico. Ele está

associado, e possivelmente causado, pela metilação do DNA.

Antecipação e Expansão de repetição: A antecipação refere-se a uma expressão mais

cedo e mais grave de uma doença. A expansão de repetições de DNA tem sido

demonstrada causando antecipação em algumas doenças humanas (ex.: doenças

neuromusculares e neurodegenerativas). Estas doenças podem ser classificadas em

grupos, dependendo do tamanho da expansão, local da repetição, conseqüências

fenotípicas da expansão, efeito da mutação e genitor no qual ocorreu tipicamente a

grande expansão.

3.2. Anomalias Cromossômicas:

As anomalias cromossômicas são responsáveis por uma proporção significativa das

doenças genéticas, ocorrendo em aproximadamente um em cada 150 nativivos. Elas

são as causas conhecidas que levam tanto ao retardo mental quanto à perda

gestacional. As anomalias cromossômicas são vistas em 50% dos abortos

espontâneos do primeiro trimestre e 20% do segundo trimestre. Assim, elas são uma

importante causa de morbidade e de mortalidade.

As anomalias cromossômicas são classificadas em dois grupos: Numérica (quando a

quantidade de cromossomo está aumentada ou diminuída), e Estrutural (quando o

cromossomo apresenta alguma anormalidade na sua estrutura).

Clinicamente, o resultado de uma anomalia cromossômica depende de ocorrer alguma

perda ou ganho de material cromossômico e, com base nisso, as anomalias

cromossômicas podem ser classificadas como balanceadas ou não balanceadas. As

anomalias cromossômicas são não-balanceadas quase sempre têm um efeito adverso

no crescimento e desenvolvimento. Em contrapartida, os rearranjos balanceados

geralmente não têm efeito na pessoa na qual estão presentes, a menos que o

funcionamento de um gene importante tenha sido perturbado por dano em um dos

pontos de quebra do cromossomo. Entretanto, a importância de se reconhecerem os

rearranjos balanceados está em sua capacidade de causar problemas em futuras

gerações, se um filho herdar um complemento cromossômico não balanceado de um

genitor balanceado.

3.2.1. Anomalias Cromossômicas uméricas: 3.2.1.1. Anomalias cromossômicas

numéricas do tipo poliploidia

A poliploidia, definida como a presença de um ou mais conjuntos haplóides de

cromossomos, é raramente vista em humanos. As condições poliplóides que foram

observadas em humanos são a triploidia (69 cromossomos em cada núcleo celular ou

3n) e a tetraploidia (92 cromossomos em cada núcleo celular ou 4n). Os cromossomos

adicionais codificam uma grande quantidade de produto gênico excedente, causando

múltiplas anomalias, tais como defeitos cardíacos e do SNC.

A poliploidia é vista em apenas 1 em 10.0 nativivos, mas essa anormalidade numérica

responde por uma taxa estimada de 15% das anomalias cromossômicas que ocorrem

na concepção. Assim, a grande maioria das concepções poliplóides é

espontaneamente abortada, e aquelas que sobrevivem até o nascimento tipicamente

morrem logo após o parto. A causa mais comum da poliploidia é a fertilização de um

ovócito por dois espermatozóides (dispermia). O zigoto resultante recebe 23

cromossomos do ovócito e 23 cromossomos de cada um dos dois espermatozóides. A

triploidia também pode ser causada pela fusão de um ovócito com um glóbulo polar,

cada um com 23 cromossomos, e pela subseqüente fertilização por um

espermatozóide. A falha meiótica, na qual um ovócito ou espermatozóide diplóide é

produzido também pode causar um zigoto triplóide.

A tetraploidia é muito mais rara do que a triploidia, tanto na concepção quanto entre os

nascidos vivos. Os raros casos de tetraploidia conhecidos são provenientes de abortos

espontâneos. A tetraploidia pode ser causada por uma falha mitótica no início do

desenvolvimento embrionário, na qual todos os cromossomos duplicados migram para

uma das células-filhas. A tetraploidia também pode resultar da fusão de dois zigotos

diplóides.

3.2.1.2. Anomalias cromossômicas numéricas do tipo aneuploidia

A aneuploidia refere-se a perda ou ganho de um ou mais cromossomos, e assim

podem ser classificadas como monossomias (2n-1) ou trissomia (2n +1). A causa mais

comum de aneuploidia é a não-disjunção, a falha de um par de cromossomos em se

separar normalmente durante a meiose. A não-disjunção pode ocorrer durante a

meiose I ou a meiose I e as suas conseqüências são:

Efeitos da não-disjunção na Meiose I – metade dos gametas produzidos apresentará

duas cópias do cromossomo (n+1), enquanto que a outra metade não possuirá

nenhum (n-1).

Efeitos da não-disjunção na Meiose I – metades dos gametas produzidos possuirá a

quantidade normal de cromossomos (n), ¼ possuirá duas cópias do cromossomo

(n+1), e ¼ não possuirá nenhum (n-1).

3.2.1.2.1. Aneuploidia de Cromossomos Autossomos Monossomia de cromossomos

autossômicos - a monossomia de qualquer cromossomo autossomo é incompatível

com a vida.

Trissomia do cromossomo 21 (síndrome de Down) – a trissomia do 21 (cariótipo 47, X

+21 ou 47, XY+21), que causa a síndrome de Down, é vista em aproximadamente

1/800 a 1.0 nativivos, fazendo dela a condição aneuploide mais comum compatível

com a sobrevivência a termo. Os problemas clínicos mais significativos incluem

retardo mental, obstrução do trato gastrointestinal, defeitos cardíacos congênitos,

infecção respiratória e leucemia. Os homens com síndrome de Down são quase

sempre estéreis; foram relatados apenas dois casos nos quais homens com Down se

reproduziram. Muitas mulheres com esta condição podem ter filhos, embora

aproximadamente 40% não ovulem. Como a reprodução é muito incomum, quase

todos os casos de trissomia do 21 podem ser considerados mutações novas (por não-

disjunção ou por translocação). O cromossomo 21 extra é de origem materna em

aproximadamente 90% dos casos. Mosaicismo é visto em 2% a 4% dos casos de

síndrome de Down, e é freqüentemente acompanhado de um fenótipo mais brando.

Trissomia dos cromossomos 13 e 18 – A trissomia do cromossomo 13 ou Síndrome de

Patau (47, X +13 ou 47, XY+13), vista em cerca de 1/10.0 nascidos, e a trissomia do

18 ou Síndrome de Edwards (47, X +18 ou 47, XY+18), com prevalência de 1/6.0

nativivos, são algumas vezes compatíveis com a vida a termo, embora 95% ou mais

dos fetos afetados sejam abortados espontaneamente. Essas trissomias são muito

menos comuns ao nascimento do que a trissomia do 21, e elas possuem um fenótipo

mais seriamente afetado, com 95% de mortalidade durante o primeiro ano de vida.

Assim, como na trissomia do 21, existe um efeito da idade materna importante, e a

mão contribui com o cromossomo extre em aproximadamente 90% dos casos.

3.2.1.2.2. Aneuploidia de Cromossomos Sexuais

Entre os bebês nativivos, cerca de 1/400 meninos e 1/650 meninas possuem alguma

forma de aneuploidia dos cromossomos sexuais. Principalmente devido à inativação

do cromossomo X, as conseqüências dessas classes de aneuploidia são menos

severas do que aquelas das aneuploidia autossômicas.

Monossomia do cromossomo X (Síndrome de Turner) – esta síndrome, que afeta

preferencialmente as mulheres, é comumente causada por um cariótipo 45, X. As

principais características clínicas descritas para esta síndrome são: baixa estatura,

infantilismos sexual, pescoço largo e alado, tórax largo e em forma de escudo e

comprometimento cardíaco. Mulheres com o diagnóstico de Turner apresentam uma

considerável variabilidade quanto ao grau de comprometimento clínico. Este fato foi

associado à presença de variações citogenéticas, tais como: o cariótipo 45,X,

normalmente relacionado a um maior número de alterações clínicas; e o cariótipo

mosaico (45, X/46, X), observado preferencialmente em pacientes com sintomas mais

brandos. Ainda, grande parte das concepções 45, X é perdida na fase pré-natal, e

entre aquelas que sobrevivem a termo são na maioria mosaicos cromossômicos. Com

base nestas observações, é provável que a presença de algumas células normais no

feto mosaico contribuía para o aumento de sua sobrevida.

Síndrome de Klinefelter – esta síndrome está associada ao cariótipo 47, XXY e é vista

em aproximadamente 1/500 a 1/1.0 nascimentos masculinos. Embora a síndrome de

Klinefelter seja uma causa comum de hipogonadismo primário no homem, o fenótipo é

menos marcante do que aquele das síndromes descritas até agora. Homens com a

síndrome de Klinefelter tendem a ser mais altos do que a média, com braços e pernas

desproporcionalmente longos. O exame clínico de pacientes pós-púberes revela

testículos pequenos (menos de 10ml) e a maioria dos homens com síndrome de

Klinefelter é estéril como resultado da atrofia dos túbulos seminíferos. Os níveis de

testosterona em adolescentes e adultos são baixos. A ginecomastia é vista em

aproximadamente 1/3 dos homens afetados, e leva a um risco aumentado de câncer

de mama. O risco pode ser reduzido por mastectomia. Os pêlos no corpo são

tipicamente esparsos nos homens pós-púberes, e a massa muscular tende a ser

reduzida. Além disso, existe uma predisposição para incapacidade de aprendizado e

redução do QI.

Trissomia do Cromossomo X – o cariótipo 47, X ocorre em aproximadamente 1/1.0

mulheres e normalmente tem conseqüências benignas. Anomalias físicas claras são

vistas raramente, mas essas mulheres algumas vezes sofrem de esterilidade,

irregularidade menstrual ou retardo mental leve. Aproximadamente 90% dos casos são

resultado de não-disjunção na mãe e, assim como as outras trissomias, a incidência

aumenta entre a prole de mulheres mais velhas. Também foram detectadas mulheres

com 4, 5 ou até mais cromossomos X. Cada cromossomo X adicional é acompanhado

por retardo mental aumentado e anomalias físicas.

Síndrome 47, XYY – a ocorrência deste cariótipo é de 1/1.0 homens. Os portadores

desta síndrome tendem a ser mais altos do que a média e possuem uma redução de

10 a 15 pontos no QI e poucos problemas físicos.

3.2.2. Anomalias Cromossômicas Estruturais:

As anomalias estruturais dos cromossomos podem ser não-balanceadas (quando o

rearranjo causa um ganho ou perda de material cromossômico) ou balanceadas

(quando o rearranjo não produz uma perda ou um ganho de material cromossômico).

Ao contrário da aneuploidia e da poliploidia, anomalias estruturais balanceadas

freqüentemente não produzem conseqüências sérias para a saúde. Entretanto, as

anomalias estruturais nãobalanceadas podem comprometer o desenvolvimento do

indivíduo portador e de sua prole.

3.2.2.1. Anomalia cromossômica estrutural do tipo translocação

Uma translocação é o intercambio de material genético entre cromossomos não

homólogos. Translocações balanceadas representam uma das aberrações

cromossômicas mais comuns nos seres humanos, ocorrendo em 1/500 a 1.0. Existem

dois tipos básicos de translocações, denominadas translocações recíprocas e

translocações balanceadas.

Translocações recíprocas – as translocações recíprocas acontecem quando ocorrem

quebras em dois cromossomos diferentes e os segmentos cromossômicos são

mutuamente intercambiado. Os cromossomos resultantes são denominados

cromossomos derivados. O portador de uma translocação recíproca normalmente não

é afetado porque possui um complemento normal do material genético. Entretanto, a

prole do portador pode ser normal, pode portar a translocação ou ter duplicações ou

deleções de material genético.

Translocações robertsonianas – nesta classe de translocação, os braços curtos de

dois cromossomos acrocêntricos (13, 14, 15, 21 e 2) são perdidos e os braços longos

se fundem no centrômero para formar um único cromossomo. Esse tipo de

translocação é confinado aos cromossomos acrocêntricos porque o braço curto

desses cromossomos é muito pequeno e não contem material genético essencial.

Quando uma translocação robertsoniana ocorre, os braços curtos são normalmente

perdidos durante as divisões celulares subseqüentes. Como os portadores da

translocação robertsoniana não perdem materiais genéticos essencial, eles são

fenotipicamente normais, mas possuem apenas 45 cromossomos em cada célula.

Suas proles, entretanto, podem herdar um braço longo ausente ou extra de um

cromossomo acrocêntricos.

Deleções – uma deleção é causada por uma quebra cromossômica e subseqüente

perda de material genômico. Uma única quebra levando a perda que inclui a ponta do

cromossomo é denominada deleção terminal. Quando ocorrem duas quebras e o

material genômico entre elas é perdido, ocorre uma deleção intersticial. As deleções

visíveis microscopicamente geralmente envolvem a perda de muitos genes, e as

conseqüências de se perder essa quantidade de material genético, mesmo sendo de

apenas um membro do par de cromossomos, podem ser severas. Um exemplo bem

conhecido de síndrome de deleção cromossômica é a síndrome de cri-du-chat (do

francês, miado de gato) que se refere ao choro característico das crianças com esta

síndrome. Esse choro normalmente se torna menos óbvio à medida que a criança

cresce, tornado o diagnóstico clínico mais difícil após os dois anos de idade. A

síndrome de cri-du-chat é causada por uma deleção do braço curto distal do

cromossomo 5: o cariótipo é 46, X, Del (5p). Vista em aproximadamente 1/50.0

nativivos, ela é também caracterizada por retardo mental (QI em torno de 35),

microcefalia, e uma aparência facial característica. A sobrevivência até a vida adulta já

foi observada, mas não é comum.

Duplicações – uma trissomia parcial, ou duplicação, de material genético pode ser

vista na prole de indivíduos que portam uma translocação recíproca. Duplicações

podem também ser causadas por crossing desigual durante a meiose, como descrito

para os loci da visão em cores ligados ao X e para a doença de Charcot-Marie-Tooth.

As duplicações tendem a produzir conseqüências menos sérias do que as deleções,

novamente ilustrando o princípio de que a perda de material genômico é mais séria do

que o seu excesso.

Cromossomo em anel – as deleções algumas vezes ocorrem em ambas as

extremidades de um cromossomo. Nestes casos, ass terminações remanescentes do

cromossomo podem então se fundir, formando um cromossomo em anel. Se o

cromossomo em anel inclui o centrômero, ele pode freqüentemente continuar através

da divisão celular, mas sua estrutura pode criar dificuldades. Os cromossomos em

anel são freqüentemente perdidos, resultando em monossomia para o cromossomo

pelo menos em algumas células (i.e., pode ser visto mosaicismo para o cromossomo

em anel). Cromossomos em anel foram descritos em pelo menos um caso para cada

um dos cromossomos humanos.

Inversões – uma inversão é o resultado de duas quebras, em um cromossomo, e

posterior reinserção do fragmento perdido em seu sítio original, mas na ordem

invertida. Se a inversão inclui o centrômero, ela é denominada inversão pericêntrica.

Inversões que não envolvem o centrômero são denominadas inversões paracêntricas.

Assim como as translocações recíprocas, as inversões são um arranjo estrutural

balanceado. Conseqüentemente, elas raramente produzem doenças no portador da

inversão. As inversões podem interferir com a meiose, entretanto, produzindo

anomalias cromossômicas na prole dos portadores da inversão. Como os

cromossomos devem se alinhar em perfeita ordem durante a prófase I, um

cromossomo com uma inversão deve formar uma laça para se alinhar com seu

homólogo normal. O crossing dentro dessa alça pode resultar em duplicações ou

deleções nos cromossomos das células-filhas. Assim, a prole de indivíduos portadores

de inversões freqüentemente possu5 we deleções cromossômicas ou duplicações.

Estima-se que 1/1.0 pessoas porte uma inversão e esteja, dessa forma, em risco de

produzir gametas com duplicações ou deleções.

Isocromossomo – algumas vezes um cromossomo se divide ao longo do eixo

perpendicular ao seu eixo normal de divisão. O resultado é um isocromossomo, um

cromossomo que tem duas cópias de um braço e nenhuma cópia do outro. A maioria

dos isocromossomos observados em nativivos envolve o cromossomo X, e indivíduos

com isocromossomos Xq (46, X,i[Xq]) normalmente possuem características da

síndrome de Turner. O isocromossomo 18q, que produz uma cópia extra do braço

longo do cromossomo 18, foi observado em bebês com a síndrome de Edwards.

Embora a maioria dos isocromossomos pareça ser formada por falhas na divisão, eles

também podem ser criados por translocações robertsonianas de cromossomos

acrocêntricos homólogos (ex.: translocação robetsoniana dos dois braços longos do

cromossomo 21).

3.3. Herança Poligênica:

O termo multifatorial é atribuído ao modo de transmissão apresentado por um grande

número de distúrbios que possuem agregação família, mas que não estão de acordo

com o padrão reconhecido de herança monogênica. Estes distúrbios incluem várias

malformações congênitas comuns (fenda labial e palatina, defeitos de fechamento do

tubo neural) e distúrbios desenvolvidos na vida adulta (diabetes, doença arterial

coronariana, hipertensão). O mecanismo genético envolve a interação de inúmeros

genes, cada um com efeito discreto (poligênico), com fatores ambiental.

3.3.1 Identificação de um distúrbio multifatorial

Por definição, os distúrbios multifatoriais têm um componente familial que não pode

ser explicado por herança mendeliana simples, e conseqüentemente não há métodos

estatísticos capazes de detectar com segurança o risco de recorrência do caráter

numa família. Diante disso, tornase importante o rastreamento de características que

permitam predizer se um distúrbio possui ou não um componente genético importante.

Para tanto, utiliza-se abordagem, tais como e estudo de agregação familiar e de

concordância entre gêmeos.

3.3.1.1. Agregação família

Doenças de herança complexa normalmente demonstram agregação familiar porque é

mais provável que os parentes de um indivíduo afetado tenham os mesmos alelos que

predispõem às doenças em comum com a pessoa afetada do que com indivíduos não

relacionados. A agregação familiar de uma doença pode ser medida por meio da

comparação da freqüência da doença nos parentes do probando afetado com a

freqüência

(prevalência) na população geral. A razão do risco relativo λr é definida como:

geralapopulaçãoadadoençanprevalenci

aafetadadeumapessoosparentesadadoençanprevalenci r=λ

O valor de λr é a medida da agregação familiar que depende do risco de recorrência

da doença na família e da prevalência na população; quanto maior é o λr, maior é a

agregação familiar. A prevalência da população faz parte do calculo porque, pois

quanto mais comum for a doença, maior a probabilidade da agregação ser apenas

uma coincidência e menor a probabilidade de ser resultante do compartilhamento de

alelos que predispõem a doença.

A análise da taxa de concordância em gêmeos pode dar uma valiosa informação sobre

a contribuição relativa de genes e ambiente em causar um determinado distúrbio. Os

gêmeos são denominados de concordantes se ambos forem afetados ou não

afetados; eles são discordantes se apenas um for afetado. Aproximadamente um terço

dos gêmeos são monozigóticos (MZ); os restantes dois terços são dizigóticos (DZ). Os

gêmeos MZ surgem de um único zigoto fertilizado, que se dividiu em dois, e, portanto

são geneticamente idênticos. Os gêmeos DZ surgem quando dois ovócitos são

fertilizados por dois espermatozóides diferentes; e portanto, compartilham em média

50% de seus genes.

Se uma condição é exclusivamente genética, as taxas de concordância geralmente

são de100% em gêmeos MZ,mas muito menos em gêmeos DZ. Se uma condição for

multifatorial, então a taxa de concordância é maior nos gêmeos MZ que nos gêmeos

DZ, mas raramente tão alta quanto 100%. Finalmente, se um distúrbio é

exclusivamente de origem ambiental, então a taxa de concordância em MZ e DZ será

aproximadamente igual.

3.3.2. Abordagens para encontrar genes de suscetibilidade

A identificação de genes que contribuem para distúrbios multifatoriais é uma área de

intensa atividade, que visa identificar genes que tenham um papel importante para o

aumento da suscetibilidade de distúrbios comuns da vida adulta de modo a

desenvolver testes para a sua detecção préclínica e novos enfoques com base

genética para a sua prevenção e tratamento. Infelizmente, os progressos têm sido

desanimadores, aponto de, após mais de uma década de grandes investimentos e

pesquisa, só terem sido identificados alguns genes de suscetibilidade de doenças

multifatoriais. Para tanto, foram aplicadas três estratégias principais: análise de

ligação, estudos de associação e desequilíbrio de ligação.

3.3.2.1. Análise de ligação

O método mais comumente usado envolve a análise de pares de irmãos afetados mais

freqüentemente do que seria esperado pelo acaso (figura 2). Em média, os pares de

irmãos seriam esperados compartilhando, 2, 1 ou 0 alelos em um determinado lócus

em uma proporção de 1:2:1. Se é identificado um lócus no qual um grande número de

pares de irmãos com um determinado distúrbio apresenta desvio estatístico

significativo desta proporção, então isto indica que os alelos neste lócus, ou em um

lócus adjacente ligado, estão de algum modo implicados em causar a doença.

Figura 2: A lógica do uso de pares de irmãos afetados na análise de ligação

Em um estudo típico, uma amostra com pelo menos 200 pares de irmãos afetados

seria analisada juntamente com seus pais e cerca de 300 loci igualmente espaçados

usando-se um painel de microssatélites polimórficos (SNPs).Isto gera uma

probabilidade significativa de se detectar ligação. Análise matemática é feita usando-

se os programas de computação, tais como MAPMARKER/SIBS ou GENEHUNTER.

Este tipo de análise de ligação, nomeada de escaneamento total do genoma (GWAs),

é uma poderosa ferramenta na detecção de loci candidatos à suscetibilidade.

Entretanto, os dados obtidos precisam ser validados em diferentes populações com o

intuito de eliminar possíveis resultados do tipo falso-positivo. Sendo assim, o passo

seguinte é utilizar estratégias de estudos de associação e de desequilíbrio de ligação.

3.3.2.2. Estudos de associação

Os estudos de ligação envolvem a análise de um grande painel de marcadores, tais

como os SNPs, em geral usando-se a tecnologia de microarranjos numa amostra

numerosa. Esta abordagem visa detectar associações, estatisticamente significativas,

entre um ou mais marcadores e a doença multifatorial sob investigação. A

desvantagem deste método é que uma associação aparente pode de fato não ser

causualmente relevante devido aos seguintes fatores:

A associação é espúria devido a um erro estatístico. Se um número suficientemente

grande de marcadores é analisado, é possível que, apenas por acaso, um ou mais

apresentem uma aparente associação estatística com a doença;

A associação pode ser espúria devido a estratificação a população. Isto significa que

tanto o distúrbio quanto o alelo aparentemente associado são comuns na população

que está sendo estudada;

3.3.2.3. Desequilíbrio de ligação

Uma vez que tenha sido feita a localização aproximada com base na análise de

ligação ou estudos de associação, a etapa seguinte geralmente envolve uma tentativa

de situar a região candidata usando-se a abordagem de desequilíbrio de ligação. A

lógica desse enfoque é baseada na hipótese de que a maioria dos membros afetados

da população em estudo compartilhariam um mesmo segmento genômico curto,

equivalente a um haplótipo em comum, circundado por alelos de suscetibilidade.

Assim, uma vez identificada a(s) região(ões) de interesse, esta(s) é(são) analisada(s)

usando-se marcadores polimórficos (geralmente SNPs) a fim de estreitar a região de

interesse, para então tentar identificar de genes candidatos. Infelizmente, este

processo não fácil, uma vez que: 1) grupos étnicos ou populações diferentes podem

desenvolver a mesma doença por motivos totalmente diferentes e, portanto, ter fatores

genéticos de risco distintos; e 2) em populações heterogenias é provável que muitos

alelos de suscetibilidade estejam presentes, o que dificulta a detecção de eventos de

desequilíbrio de ligação.

3.3.3. Exemplos de distúrbios multifatoriais:

Doença de Alzheimer – esta doença é a causa mais comum de demência senil e pré-

senil, com uma prevalência de cerca de 20% em pessoas com mais de 80 anos de

idade. Na maioria das famílias acometidas, observa-se que um padrão de herança

multifatorial. Estudos por análise de ligação, realizados em famílias com casos da

doença, permitiram a detecção de um lócus polimórficos no cromossomo 19 associado

à doença. A presença de alelos de risco no gene da apolipoproteína E (ApoE) está

freqüentemente aumentada em pacientes com o diagnóstico de Alzheimer a ponto de

que as chances dos portadores dos alelos de risco vir a desenvolver a doença é de

cerca de 35% para os homens e 50% para as mulheres. Estudos de ligação sugerem

que ainda existam quatro outros genes que conferem suscetibilidade a doença.

Diabetes mellitus tipo 1 – esta forma relativamente rara, com prevalência de 1/200,

geralmente se apresenta na infância ou no início da idade adulta. Esta doença é

causada pela destruição das células β pancreáticas que produzem insulina. Tanto os

estudos familiais quanto de gêmeos são consistentes com a herança multifatorial. O

risco de recorrência para irmãos e prole da pessoa afetada é de 5-6%. As taxas de

concordância em gêmeos MZ e DZ são de aproximadamente 30-49% e de 5-10%,

respectivamente. A pesquisa de genes de suscetibilidade identificou dois loci

definidos. O primeiro é o lócus IDDM1, onde se situa o gene HLA, que contribui com

30-40% da suscetibilidade total. Cerca de 95% das pessoas afetadas e portadoras têm

o antígeno HLA-DR3 e/ou HLA-DR4, enquanto que eles são encontrados em apenas

50% da população geral. O segundo lócus, IDDM2, inclui o gene de insulina no

cromossomo 1, juntamente com a região que contem várias cópias de seqüências

microssatélites repetida de 14pb. Um curto número de repetição confere

suscetibilidade à diabetes tipo 1, provavelmente reduzindo a expressão do gene da

insulina.

Diabetes mellitus tipo 2 – a diabetes tipo 2 afeta aproximadamente 5% dos adultos

após os 45 anos. Os riscos para parentes em primeiro grau são de 10-15%, ou seja,

duas a três vezes o risco da população geral, e a taxa de concordância para gêmeos

MZ é de 90%; logo, a evidencia em favor de uma etiologia genética é forte. O

progresso em encontrar genes que contribuem para a forma comum de manifestação

tardia do diabetes tem sido lento. Os estudos de ligação e associação identificaram

mais de 20 loci diferentes, mas freqüentemente os achados originais não foram

replicados com estudos subseqüentes dando resultados conflitantes.

MÓDULO 4: GE ÉTICA DO CÂ CER

O câncer é um importante problema de saúde pública mundial devido a sua elevada

taxa de mortalidade. Dados da Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS, 2002)

indicaram que o câncer é responsável por mais de 15% de todas as causas de morte

no mundo tanto em países desenvolvidos, quanto em desenvolvimento. No Brasil, um

levantamento feito realizado em 2003 pelo Ministério da Saúde mostrou que o câncer

ataca mais de um terço da população brasileira. O câncer, se não tratado, é

invariavelmente fatal. O diagnóstico precoce e o tratamento imediato são vitais, assim

como a identificação de pessoas com risco aumentado de câncer, antes do seu

desenvolvimento, constitui-se um importante objetivo da pesquisa do câncer.

O câncer é uma coleção de doenças que compartilham a característica comum de

crescimento celular incontrolado. Vários eventos-chave precisam ocorrer para as

células escaparem das restrições que evitam a proliferação incontrolada, tais como: 1)

sinais adicionais de crescimento dever ser produzidos e processados e as células

devem tornar-se resistentes aos sinais que normalmente inibem o crescimento; 2)

como estas características anormais tipicamente levariam ao processo de morte

celular programada (apoptose), as células devem de alguma forma invalidar este

processo; 3) a massa de células crescentes (tumor) requer nutrição, então um novo

abastecimento sanguíneo deve ser obtido pela angiogênese (formação de novos

vasos sanguíneos); 4) sinais inibitórios adicionais devem ser superados para que o

tumor atinja um estado maligno, tornando-o capaz de invadir os tecidos próximos e se

espalhar (metástase) para locais mais distantes no corpo. A capacidade de invadir e

de formar metástase distingue as neoplasias malignas das benignas.

4.1.Mecanismos básicos de controle da proliferação celular:

Um componente da regulação celular é mediado por sinais externos que chegam as

células pelos fatores de crescimento (fatores de crescimentos derivados de plaquetas,

fatores de crescimento epidermais, hormônios esteróides) produzidos por outras

células. Cada fator de crescimento interage com um receptor de crescimento

específico situado na superfície da célula. A ligação de um fator de crescimento ativa o

receptor, disparando moléculas que enviam mensagens para o núcleo da célula em

um processo chamado de transdução de sinal. As moléculas transportadoras deste

sinal incluem cinases protéicas, tais como tirosina cinase src, a cinase protéica ativada

por mitógeno (mapK) e a cinase jun (junK), que podem alterar a atividade de proteínas

alvo através de sua fosforilação. O estágio final da via de transdução de sinal é a

regulação da transcrição de DNA no núcleo. Os componentes da cascata de

transdução de sinal interagem com fatores de transcrição nuclear que regulam a

atividade de genes específicos cujos produtos protéicos influenciam o crescimento

celular e a proliferação. Os genes que codificam estes fatores de transcrição incluem

MYC, FOS e JUN.

Depois de vários ciclos de divisão celular, as células normalmente recebem sinais que

as dizem para pararem o crescimento e se diferenciarem em células especializadas.

Os sinais podem vir de polipeptídeos, de hormônios esteróides, do contato direto com

células adjacentes, ou de programas internos que definem o número de divisões

celulares permitidas. Os sinais são transduzidos até o núcleo da célula receptora.

Nesse caso, por meio da alteração dos padrões de transcrição dos genes que

governam os padrões do ciclo celular, eles reprimem genes que promovem a divisão

celular e induzem genes que inibem a entrada no ciclo de divisão celular.

mudanças envolve mutações, e a necessidade de múltiplas alterações molecular foi

caracterizada como multi-evento (multi-hit) da carcinogênese

Uma célula tumoral pode emergir a partir de uma população de células em

crescimento por meio do acúmulo de mutações nestes genes regulatórios. Ainda que

estas mutações ocorram apenas raramente, estas células podem deixar de responder

aos sinais de diferenciação e continuarem a se dividir ao invés de entrarem no

programa de diferenciação normal. Mais ainda, o câncer parece ser quase sempre

resultado de uma série de eventos progressivos que aumentam a extensão da

desregulação dentro da linhagem celular. Finalmente, emerge uma célula cujos

descendentes se multiplicam sem os controles apropriados Mudanças adicionais dão a

estas células capacidade de invadirem tecidos adjacentes e formarem metástase.

Cada uma destas

4.2. Classes de genes envolvidos no desenvolvimento do câncer:

O desenvolvimento do câncer (carcinogênese) resulta de mutações em genes que

regulam a proliferação celular e a morte celular programada. Os genes nos quais as

mutações causam câncer são classificados em duas categorias: os oncogenes e os

genes supressores tumorais (genes de manutenção e genes de controle).

O catálogo de genes envolvidos no câncer inclui também genes que são transcritos

em RNAs não-traduzidos a partir dos quais microRNAs (miRNAs) reguladores são

gerados. Existem pelo menos 250 miRNAs no genoma humano que realizam a

inibição mediada por RNA da expressão de seus genesalvo codificadores de

proteínas, ou por induzirem a degradação dos seus mRNAs-alvo ou por bloquearem

sua tradução. Aproximadamente, 10% dos miRNAs são encontrados hiperexpressos

ou inibidos em vários tumores, que são referidos como oncomirs. A hiperexpressão de

alguns miRNAs pode suprimir a expressão de genes-alvo supressores de tumores,

enquanto que a perda de função de outros miRNAs pode permitir a hiperexpressão de

oncogenes que eles regulam. Como cada miRNA pode regular até 200 genes-alvo

diferentes, a hiperexpressão ou a perda de função dos miRNAs pode ter amplos

efeitos oncogênicos porque muitos genes estarão desregulados.

Um oncogene é um proto-oncogene mutante cuja função ou expressão alterada

resulta na estimulação anormal da divisão e proliferação celular. As mutações

responsáveis pela ativação de um oncogene podem promover o ganho de função na

seqüência que codifica os elementos reguladores ou ainda um aumento do número de

cópias genômicas, levando a uma função heterecrônica ou ectópica desregulada do

produto do oncogene. Os oncogenes têm um efeito dominante em nível celular; isto é,

quando ele é ativado ou hiperexpresso, um único alelo mutante é suficiente para iniciar

a mudança no fenótipo de uma célula, de normal para maligno.

Os oncogenes ativados codificam proteínas que agem muitas etapas na via que

controla o crescimento celular, tais como: 1) fatores de crescimento que estimulam a

divisão celular (ex. SIS); 2) receptores (ex: ERBB, FMS) e proteínas citoplasmáticas

que traduzem esses sinais (ex. família RAS e ABL); 3) proteínas nucleares ligantes a

DNA e fatores de transcrição que respondem aos sinais traduzidos (MYC e JUN); e 4)

proteínas que impedem a morte celular programada (temolerase e proteínas

antiapoptóticas).

4.2.1.1.Ativação de Oncogenes:

A ativação de oncogenes compreende um ganho de função que pode ser quantitativo

(aumento de produção de um produto inalterado) ou qualitativo (síntese de um produto

sutilmente modificado em conseqüência de uma mutação ou síntese de um produto

novo por um gene quimérico criado por rearranjo cromossômico). Essas mudanças

são dominantes e normalmente afetam um só alelo do gene.

Ativação do Oncogene por amplificação gênica: A amplificação gênica é um fenômeno

caracterizado pela presença de múltiplas cópias normais de um gene ou de um

segmento genômico na célula, resultando no aumento do nível da expressão gênica. A

amplificação gênica é comum em muitos cânceres, incluindo neuroblastoma,

gliobastomas e câncer colorretal. Os segmentos amplificados do DNA são

prontamente detectados por técnicas de citogenética molecular (hibridização genômica

comparativa) ou convencional (bandeamento cromossômico). Neste último caso, a

amplificação gênica pode se apresentar como cromossomos acessórios muito

pequenos (diminutos duplos) ou como regiões de coloração homogênea (regiões

genômica que normalmente não são bandeadas e contêm múltiplas cópias

amplificadas de um segmento particular de DNA). Como e por que os diminutos duplos

ou as regiões de coloração homogênea ocorrem ainda é pouco compreendido, mas

sabe-se que as regiões amplificadas incluem cópias extras e normais de proto-

oncogenes, tais como os genes que codificam myc, ras e o receptor de crescimento

epitelial, que estimulam o crescimento celular ou bloqueiam a apoptose, ou ambos.

Ativação do Oncogene por mutações pontuais: O gene H-RAS pertence a uma família

de genes que codificam proteínas envolvidas na transdução de sinais dos receptores

acoplados à proteínas G. Um sinal do receptor desencadeia a ligação da GTP à

proteína RAS e o complexo GTP-RAS retransmite o sinal na célula. A proteína RAS

tem atividade de GTPase, logo o complexo GTP-RAS é convertido rapidamente em

GDP-RAS inativo. Mutações pontuais específicas nos genes RAS são encontradas

freqüentemente nas células de vários tumores, como os de câncer de colo, de pulmão,

de mama e de bexiga. Elas levam à substituição de aminoácidos, que fazem diminuir a

atividade de GTPase da proteína RAS. Em conseqüência, o sinal de GTP-RAS é

inativado mais lentamente e a resposta celular ao sinal do receptor se torna excessiva.

O RAS mutante estimula o crescimento da linhagem celular, transformando-a, portanto

em um tumor.

Ativação do Oncogene por translocações cromossômicas: Nem sempre os oncogenes

são resultados de uma mutação do DNA. Em alguns casos, um oncogene é ativado

por uma mutação cromossômica, geralmente através de translocação. Mais de 40

translocações cromossômicas oncogênicas foram descritas, principalmente em

leucemias esporádicas e linfomas.Em alguns casos, os pontos de quebra das

translocações são dentro de introns de dois genes, fusionando dois genes em um

gene anormal que codifica uma proteína quimérica com novas propriedades

oncogênicas. O exemplo mais bem conhecido é a translocação entre os cromossomos

9 e 2 que é observada na leucemia meilóide crônica. Neste caso, a translocação move

o proto-oncogene ABL (gene da tirosina quinase) da sua posição normal no

cromossomo 9q para a “região de grupo de ponto de quebra” do gene BCR (do inglês

breakpoint cluster region) no cromossomo 22q. A justaposição permite a síntese de

uma proteína quimérica que é maior do que a proteína abl normal e que tem a

atividade da tirosina quinase aumentada. O aumento da atividade da tirosina quinase

da nova proteína codificada pelo gene quimérico constitui-se no evento primário que

causa a leucemia mielóide crônica. Uma nova e altamente eficiente terapia para a

leucemia mielóide crônica foi desenvolvida com a droga imatinibe e é baseada na

inibição dessa atividade da tirosina quinase quimérica.

Em outros, a translocação ativa um oncogene colocando-o em seguida a um forte

promotor constitutivo, que pertence a outro gene. Dois exemplos bem conhecidos são

a translocação entre os cromossomos 8 e 14 no linfoma de Burkitt e a translocação

envolvendo o cromossomo18 no linfoma de células B.

Na maioria dos tumores do linfoma de Burkitt, o proto-oncogene MYC é translocado de

sua posição cromossômica normal em 8q24 para uma posição distal no lócus da

cadeia pesada da imunoglobulina em 14q32. Citogeneticamente, essa mutação é vista

como uma translocação 8;14 aparentemente balanceada. Entretanto, a translocação

coloca o acentuador ou outras seqüências de ativação transcricional, normalmente

associadas a genes da imunoglobulina, perto do gene MYC. O efeito dessa

translocação é a expressão desregulada do gene MYC, que resulta em crescimento

celular descontrolado. A proteína myc é um fator de transcrição com efeitos potentes

na expressão de vários genes envolvidos na proliferação celular como também na

expressão da telomerase.

O primeiro gene apoptótico implicado no câncer foi identificado no linfoma esporádico

de célula B. Em quase todos os linfomas de célula B do tipo folicular, um gene, o

BCL2, localizado em 18q21, foi encontrado ativado por uma translocação

cromossômica t(14;18) que colocou o gene sob um forte promotor e acentuador do

gene da cadeia pesada de imunoglobulina, localizado em14q32. A proteína codificada

pelo BCL2 é uma proteína de membrana interna mitocondrial com potentes efeitos

antiapoptóticos nas células B. A expressão prolongada e inapropriada desse gene,

ativada pelo promotor da imunoglobulina, resulta em expansão maciça de células B,

não por causa da proliferação aumentada, mas porque a apoptose normal dessas

células está inibida.

4.2.2. Genes Supressores Tumorais (GST):

Enquanto as proteínas codificadas pelos oncogenes promovem o câncer, as mutações

nos genes supressores de tumor contribuem para a malignidade por um mecanismo

diferente, isto é, através da perda de função de ambos os alelos de um gene. Os

GSTs são altamente heterogêneos. Alguns suprimem realmente os tumores por

regulares o ciclo celular ou por causarem a inibição do crescimento pelo contato

célula-célula; os GSTs desse tipo são denominados de genes de controle porque eles

regulam diretamente o crescimento celular. Os GSTs de controle codificam: 1) os

reguladores de vários pontos de checagem do ciclo celular (RB1, TP53); e 2)

mediadores da morte celular programada (DCC, VHL). Outros GSTs, os de

manutenção, estão envolvidos no reparo de danos ao DNA e na manutenção da

integridade genômica. A perda de ambos os alelos de genes que estão envolvidos no

reparo de danos ao DNA ou quebras cromossômicas leva diretamente ao câncer, pois

permite que mutações secundárias adicionais se acumulem ou em proto-oncogenes

ou em outros GSTs. Os GSTs de manutenção codificam: 1) proteínas responsáveis

pela detecção e pelo reparo das mutações (BRCA1 e BRCA2); 2) proteínas envolvidas

na disjunção e normal dos cromossomos durante a mitose; e 3) componentes da

maquinaria da morte celular programada.

4.2.2.1.Genes de Regulação do ciclo celular (gatekeepers):

Gene Supressor Tumoral RB1- O produto do gene RB1 é uma fotoproteína que é

hipofosforilada e depois hiperfosforilada em diferentes estágios do ciclo celular. No seu

estado hiperfosforilado, bloqueia a progressão do ciclo celular no limite entre as fases

G1 e S, inibindo assim, a entrada na fase S pela liberação de fatores que promovem a

síntese de DNA. À medida que a Rb1 se torna progressivamente mais fosforilada,

libera seus parceiros de ligação à proteína, permitindo a entrada da célula na fase S;

durante o curso do ciclo celular, a Rb1 é, então, progressivamente defosforilada, o que

permite que ela funcione novamente como bloqueio de entrada para a fase S do

próximo ciclo celular. A perda do gene Rb1 priva as células de um importante ponto

mitótico de checagem e permite a proliferação descontrolada. O gene Rb1 é, portanto,

um típico GST de regulação. É digno de nota que o Rb1 é mutado em grande número

de linhagens celulares derivadas de certos outros tumores durante sua progressão.

Gene Supressor Tumoral TP53 - A proteína p53 é uma proteína de ligação ao DNA

que parece ser um componente importante da resposta celular aos danos no DNA.

Além de ser um fator de transcrição que ativa a transcrição de genes que cessa a

divisão celular e permite o reparo de danos ao genoma, a TP53 parece, também, estar

envolvida na indução de apoptose de células que tenham sofrido danos irreparáveis

ao DNA. Portanto, a perda de função da TP53 permite que células com o DNA

danificado sobrevivam e se dividam, propagando, assim, as mutações potencialmente

oncogênicas. O gene TP53 pode, portanto, ser considerado também um GST de

regulação.

Gene Supressor Tumoral F1: A inspeção de seqüências do gene da neurofibromina

(NF1) e seus produtos protéicos demonstraram uma homologia significativa com as

proteínas que ativam a atividade da GTPase do produto do oncogene RAS. Esse

achado sugere fortemente, que pó produto do NF1 normal interage com um membro

desconhecido da família do gene RAS para regulara atividade proliferativa em células

normais.O gene mutante NF1 falha na regulação do crescimento em células normais,

a partir das quais se originam os neurofibromas observados em pacientes com

neurofibromatose tipo 1, levando a um crescimento inapropriado e a formação de

tumores.

Mutações somáticas de perda de função foram encontradas em NF1 em vários

tumores, incluindo câncer colorretal, melanoma, e neuroblastoma. As mutações na

linhagem germinativa em NF1 causam a neurofibromatose tipo1.

4.2.2.2.GTS de Manutenção (caretakers): genes que atuam em mecanismos de reparo

do D A

Existem vários sistemas complexos para reparar danos no DNA, decorrentes de

agentes mutagênicos extrínsecos (radiação ionizante, luz ultravioleta, agentes

químicos mutagênicos) ou por erros intrínsecos na replicação do DNA. Estes sistemas

usam várias famílias de enzimas para desenrolar a dupla hélice (helicases), remover o

DNA anormal (endonucleases e exonucleases), sintetizar um novo seguimento de

DNA (polimerase) e unir os novos filamentos (DNA ligases). Erros em qualquer um

destes sistemas podem levar ao acúmulo de mutações em oncogenes e genes

supressores tumorais, levando por sua vez à formação de tumores. Processos

relevantes conhecidos como associados a síndromes específicas de predisposição ao

câncer incluem a excisão de nucleotídeos, reparo de quebras bifilamentares, e o

reparo de pares de bases mal pareadas.

Impedimento de excisão de nucleotídeos: O reparo por excisão de nucleotídeos

envolve uma via que começa com a deselicoidização da cromatina, seguido da

excisão de nucleotídeos no filamento danificado, e completado pela síntese e

integração do novo DNA pela DNA polimerase e DNA ligase. A capacidade reduzida

ou ausente do reparo global do genoma ou do reparo pós-replicação representa a

perda das funções necessárias para a manutenção da integridade do genoma, e

resulta em acúmulo de mutações oncogênicas. As neoplasias cutâneas de pacientes

com o xeroderma pigmentoso possuem um nível elevado de mutações de oncogenes

e de GSTs, do que os tumores da população normal, e tais mutações parecem ser

altamente específicas do UV.

Reparo prejudicado de quebra bifilamentar:O reparo de quebras bifilamentares, como

pode ocorrer por radiação ionizante, envolve um processo complicado e não

totalmente compreendido, onde o ciclo celular é parado para permitir que um

complexo multiproteico inicie e complete de reparo. O complexo multiproteico inclui as

proteínas ATM, BRCA1 e BRCA2, reconhecidamente envolvidas com síndromes de

predisposição ao câncer.

ATM atua na parada do ciclo celular e na ativação do complexo protéico de reparo

bifilamentar. A ocorrência de mutações no gene da ATM causa a ataxia telangiectasia.

BRCA1 e BRCA2 atuam no reparo de quebras bifilamentares pelos processos de

recombinação homóloga e ligação das pontas dos filamentos de DNA quebrados. As

mutações heterozigotas nos genes que codificam BRCA1 e BRCA2 causam câncer

hereditário de mama e ovário, enquanto que mutações homozigotas no BRCA2

causam a anemia de Fanconi.

4.2.3.Inativação dos GSTs:

A existência de mutações no GSTs, levando ao câncer, foi proposta originalmente em

1960 para explicar por que certos tumores podem ocorrer em ambas as formas,

hereditária e esporádica. Por exemplo, foi sugerido que a forma hereditária do câncer

infantil de retina (retinoblastoma), podia ser iniciada quando uma célula, em uma

pessoa heterozigota para a mutação na linhagem germinativa em um gene supressor

de tumor retinoblastoma, o qual é necessário para impedir o desenvolvimento do

câncer, sofre uma segunda mutação, um evento somático, que inativa o outro alelo.

Como conseqüência desse segundo evento somático, a célula perde a função de

ambos os alelos, originando um tumor. A perda do alelo normal em um tumor é

chamada de perda de heterozigose (LOH, do inglês loss of heterozigosity). O segundo

evento em geral é uma mutação somática, embora a perda de função sem mutação,

tal como ocorre com o silenciamento transcricional, tenha sido também observada em

algumas células cancerosas. Na forma esporádica do retinoblastoma, ambos os alelos

estão também inativados, mas nesse caso, a inativação resulta de dois eventos

somáticos que ocorreram na mesma célula.

O modelo dos “dois eventos” é amplamente aceito como uma explicação para muitos

cânceres familiares além do retinoblastoma, incluindo a polipose de cólon familiar, o

câncer de mama familiar, a neurofibromatose tipo 1 (NF1), e a síndrome de Li-

Fraumeni.

Os mecanismos genéticos responsáveis pela inativação dos genes supressores

tumorais são: 1) deleção, refletida na perda de heterozigose; 2) mutações pontuais; 3)

conversão gênica; e 4) metilação do DNA.

Conversão gênica: É um evento raro no qual um membro do par de alelos

heterozigotos torna-se idêntico ao seu homólogo, possivelmente devido a formação de

um heteroduplex entre os dois alelos com o subseqüente “reparo” das bases mal

pareadas.

Metilação do D A: A inativação de GSTs pode também ser causada por uma mudança

não estrutural decorrente da hipermetilação de regiões de controle da expressão

gênica (promotor). A hipermetilação dos dinucleotídeos CpG presentes em regiões

regulatórias de genes supressores tumorais é um achado comum em muitos tumores,

e existem evidencias que este mecanismo epigenético seja o responsável pela

inativação dos genes CDKN2A, VHL, RB1 e MLH1.

MÓDULO 5 – GE ÉTICA DE DOE ÇAS I FECCIOSAS

A variabilidade genética humana na resistência/suscetibilidade a infecções é um

processo complexo e influenciado por múltiplos genes. Em principio, podemos

distinguir dois tipos diferentes de variação na resistência a patógenos infecciosos: uma

resistência natural primária, dependente de fatores genéticos que influenciam a

adesão de agentes infecciosos às células do hospedeiro e sua subseqüente

penetração intracelular, e uma resistência secundária, dependente na maior parte da

ação do sistema imunológico.

5.1. Pesquisa de genes de suscetibilidade a doenças infecciosas.

Uma primeira questão a ser abordada na pesquisa de mecanismos genéticos

associados à suscetibilidade seria a procura de indivíduos geneticamente resistentes

que não se infectam e/ou não desenvolvem a doença mesmo compartilhando o

mesmo ambiente com indivíduos infectados e que teoricamente constituem um foco de

infecção.

Um segundo indicador da existência de fatores genéticos na suscetibilidade a doenças

é a maior concordância em gêmeos monozigóticos do que em gêmeos dizigóticos. Um

exemplo disso é proporcionado por estudos sobre a tuberculose em grupos de

gêmeos mono- e dizigóticos. Enquanto 87,2% de monozigóticos eram concordantes

em relação à tuberculose, entre dizigóticos a concordância era de só 25,6%.

Outro aspecto de importância na procura de determinantes genéticos da

suscetibilidade é o estudo das correlações intrafamiliares. Cabello et al (1995)

trabalhando sobre residentes em zonas endêmicas da leishmaniose visceral (LV)

verificaram a não existência de correlação para a LV entre os pais (pai x mãe), porem

correlações significativas foram observadas nas comparações pais x filhos e entre

pares de irmãos; sabendo que o compartilhamento de genes entre os pais é

relativamente baixo (dependendo das freqüências populacionais), mas que a

correlação genética entre pais e filhos e entre irmãos é de aproximadamente ½ e ¼,

respectivamente, os resultados da agregação familiar antes observados são

evidencias claras da existência de mecanismos genéticos na infecção pela LV.

5.2. Estratégias utilizadas na detecção de componentes genéticos envolvidos na

manifestação da doença:

As estratégias adotadas na dissecção do componente genético de doenças complexas

estão as análises de agregação familial de casos, os estudos comparativos de taxas

de concordância da ocorrência da doença entre gêmeos mono e dizigóticos, e as

análises de segregação complexa, que visam descrever o modo de herança genética

que melhor explica as observações em um conjunto de pedigrees.

5.2.1. Estudos de ligação - Estudos de ligação são estudos de mapeamento genético,

cujo objetivo é localizar genes responsáveis por determinado efeito no intervalo

cromossômico mais estreito possível. Esses estudos, embora poderosos no

mapeamento de genes exercendo efeito genético moderado a intenso, não têm poder

de resolução para implicar um único gene – tipicamente, estudos de ligação terminam

localizando o gene em questão em um intervalo genômico contendo dezenas de

genes. O resultado desse tipo de estudo normalmente é expresso em LOD escores;

um LOD escore igual ou superior a 3,0 indica significância estatística, e a região

genômica encontrada passa a ser tratada como região candidata a abrigar o gene que

está se procurando identificar.

5.2.2. Estudos de associação - Os estudos de associação, em seu formato mais

simples, baseiam-se na comparação das freqüências alélicas de um marcador

genético entre os indivíduos afetados e não afetados. Determinado alelo é

considerado associado com o fenótipo estudado quando ocorre com freqüência

diferente entre indivíduos afetados em comparação com um grupo controle de não

afetados. Estudos de associação têm alto poder de detecção de efeitos genéticos

moderados a fracos e geralmente são utilizados ou na análise de genes candidatos,

ou como seqüência complementar de estudos de ligação, com o objetivo de se

identificar com precisão, em região genômica candidata, o gene responsável pelo

efeito detectado.

5.3. Genes candidatos para a suscetibilidade a doenças infecciosas:

Fator de necrose tumoral alfa (T F-αααα) – o TNF-α é um potente imunomediador e

uma citocina pró-inlamatória que tem sido associada à patogênese de numerosas

doenças humanas. O gene responsável por esta citocina encontra-se dentro do

principal complexo de histocompatibilidade (cromossomo 6p21.3); devido à sua

atividade biológica, tem se tornado alvo de procura de polimorfismos dentro deste

gene que podem contribuir para a associação desta região do genoma com um

número considerável de doenças infecciosas e auto-imunes. Polimorfismos no

promotor do gene o

TNF-α tem sido associados com a suscetibilidade a doenças meningocócica,

hanseníase, Hepatite B, Hepatite C, HIV-1, leishimaniose tegumentar, malária,

tuberculose e choque séptico. A quantidade de TNF no soro apareceu elevada em

todos estes estudos o que, juntamente com a associação genética, sugere que os

níveis elevados de TNF têm um papel patogénico. Estas considerações estiveram na

base de intervenções terapêuticas que, utilizando uma grande variedade de

compostos anti-TNF, tiveram por objetivo controlar a severidade das doenças citadas.

Lecitina ligada a manose (MBL) - é uma proteína sérica que tem um papel importante

na imunidade inata. O MBL liga-se a açúcares, sobretudo N- acetilglucosamina e

manose, existentes à superfície dos microrganismos e facilita a sua opsonização pelos

macrófagos. Ativa também o sistema complemento por intermédio de duas proteases

de serina que lhe estão associadas. Mutações que inativam o gene da MBL são

freqüentes em muitas populações. Alterações de um único aminoácido são

encontradas nos códons 52, 54 ou 57, cada uma das quais leva a uma redução

substancial na concentração de MBL nos heterozigóticos. Os homozigóticos ou

heterozigóticos combinados para estes variantes têm uma quantidade muito baixa de

MBL no soro, ou não têm MBL. Mutações no promotor do gene têm também efeito,

embora menos marcado, na quantidade de MBL sérica. As associações entre as

mutações no gene da MBL e as doenças bacterianas têm sido pouco claras. No

entanto, estudos recentes indicam que os indivíduos homozigóticos para alterações

nos códons da MBL podem ser mais susceptíveis a doença invasiva provocada por

bactérias encapsuladas, sobretudo pelo Streptococcus pneumoneae

Slc11a1 (previamente denominado RAMP1) - Algumas alterações de seqüência no

gene Slc11a1 têm sido associadas com susceptibilidade para tuberculose pulmonar

severa na África Ocidental. A função do produto deste gene é desconhecida, mas está

presente apenas nos macrófagos na membrana dos fagolisossomas em que o M.

tuberculosis se multiplica. O gene Slc11a1 é homólogo ao recentemente descrito gene

NRAMP2, que codifica para um transportador de íons bivalentes que pode influenciar

as concentrações intracelulares de ferro e, assim, a multiplicação micobacteriana.

Receptor de Vitamina D (VDR) - A forma ativa da vitamina D, vitamina D3, tem

simultaneamente funções imuno-regulatórias e um papel importante no metabolismo

do cálcio. O receptor da vitamina D3 é expresso nos macrófagos e linfócitos ativados,

e a presença da vitamina D3 leva a um aumento da ativação dos macrófagos e a uma

alteração no perfil de secreção de citocinas por parte dos linfócitos. A variação

genética no receptor da vitamina D tem sido associada com resistência à tuberculose

e infecção persistente pelo vírus da hepatite B.

Antígeno Leucocitário Humano (HLA) - O papel fundamental do HLA na iniciação e

regulação das respostas imunitárias, juntamente com as suas características

polimórficas, motivou numerosos estudos da sua influência na susceptibilidade às

doenças infecciosas. O HLA-DR2, um HLA da classe I, nas populações Asiáticas,

predispõe em geral para o desenvolvimento da hanseníase per se. No entanto,

estudos efetuados em populações indianas demonstraram que o HLA-DR2 está

simultaneamente associado com, e geneticamente ligado à hanseníase tuberculoide.

Em algumas populações asiáticas, mas não noutros continentes, o mesmo tipo de

HLA tem sido associado com susceptibilidade à tuberculose. Desconhece-se o

mecanismo envolvido nestas associações de susceptibilidade, mas especula-se que o

HLA-DR2 pode influenciar o tipo de resposta imunitária desenvolvida, levando a uma

resposta humoral mais forte porem, a respostas celulares protetoras mais fracas

contra os antígenos micobacterianos.

5.4. Bases genéticas de doenças infecciosas

5.3.1. Aspectos genéticos do vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) – algumas

linhagens deste vírus entram nas células T helper por via de um receptor de célula T

que normalmente se liga a uma citocina. Uma vez dentro da célula, o HIV insere seu

material genético no núcleo e se utiliza da maquinaria celular para se replicar. A

destruição das células T helper leva a uma grave imunodeficiência secundária.

Recentemente, foi demonstrado que indivíduos homozigóticos para uma deleção de

32pb no gene que codifica o receptor de citocina (CMKBR5) são resistentes à infecção

de HIV. Este deleção é especialmente comum nas populações do leste europeu, onde

a freqüência do gene atinge 0,16. A análise de desequilíbrio de ligação na região

cromossômica que contem CMKBR5 indica que a deleção surgiu nestas populações

há poucos anos. Como o HIV só se originou há algumas décadas, alta freqüência

gênica no Leste europeu deve ser devida a alguma outra força evolutiva ou talvez à

deriva gênica. Evidentemente, haveria uma forte seleção a favor desta mutação nas

populações hoje muito expostas ao HIV, e a deleção eventualmente aumentaria de

freqüência nestas populações.

Aspectos genéticos da Malária – o primeiro exemplo concreto sobre a relação entre

fatores genéticos e o desenvolvimento de uma doença foi dada pela interação de

polimorfismos da cadeia β da hemoglobina, a anemia sicêmica e a malária provocada

pelo Plasmodium falciparum. Pauline t al (1949) mostraram que uma anemia

hereditária, comum em americanos de ascendência africana, podia ser caracterizada

através da corrida eletroforética da hemoglobina. Os indivíduos infectados

apresentavam uma hemoglobina anormal de mobilidade eletroforética mais lenta do

que a hemoglobina normal. Esta hemoglobina denominada S (do inglês slow) é um

produto da substituição de um ácido glutâmico por uma valina na posição 6 da cadeia

β da hemoglobina. Os indivíduos que carregavam essa hemoglobina podem

apresentar duas formas da doença: a) uma anemia leve, porem com a característica

de que seus glóbulos vermelhos adotam uma forma de foice quando submetidos a

uma baixa tensão de oxigênio; estes indivíduos são heterozigotos para o gene S e são

capazes de sintetizar ambas, uma hemoglobina normal (A) junto com uma

hemoglobina anormal (S); b) a forma severa da anemia, pela condição homozigota S,

que devido a seus efeitos pleiotrópicos apresenta uma serie de manifestações

mórbidas que pode leva-los a morte. O polimorfismo da cadeia β das hemoglobinas

tem uma interação extremamente significativa com a malária: os eritrócitos dos

indivíduos normais para a hemoglobina (homozigotos A) constituem um meio

apropriado para o desenvolvimento do P. falciparum, portanto esses indivíduos

tornam-se suscetíveis à malária; já os eritrócitos dos heterozigotos AS diminuem o

desenvolvimento do parasita e conseqüentemente apresentam uma anemia leve

associada a uma malária também leve. Por outro lado, no caso dos homozigotos S, os

parasitas não se estabelece, porem estes indivíduos apresentam a forma severa da

anemia. Em outras palavras, a hemoglobina S em estado heterozigótico proporciona

alguma proteção contra a malária causada pelo P. falciparum. Temos, então, um

exemplo clássico de um polimorfismo genético sendo mantido por seleção a favor dos

heterozigotos, fenômeno este denominado de heterose, onde ambos os alelos são

favorecidos pela seleção. Ainda em relação a malária, deve-se mencionar que tanto as

talassemias como a deficiência glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD) também tem

sido sugerida como protetores contra a malária.

Esquitossomose – vários estudos epidemiológicos realizados em indivíduos que vivem

em áreas onde o Schistosoma mansoni é endêmico sugerem o envolvimento de

fatores genéticos na suscetibilidade à infecção por este parasita.Observações

anteriores de que a alta intensidade de infecções e reinfecções está agregada dentro

de famílias, e não distribuídas ao acaso, suportam a hipótese da existência de um

gene que influencia a intensidade da infecção. Através de análises de ligação

utilizando 1 famílias brasileiras e 246 microssatélites como marcadores, o principal

loco envolvido na suscetibilidade foi mapeado em 5q31-3. Esta região contem vários

genes envolvidos na regulação da resposta imune, e que são críticos na proteção

contra o S. mansoni, como as interleucinas IL3, IL4. IL5 e IL13.

Hanseníase - Hanseníase pode ser brevemente definida como doença infecciosa

crônica causada pelo Mycobacterium leprae que afeta primariamente apele e o

sistema nervoso periférico. A hanseníase é doença de manifestação clínica espectral.

Segundo Ridley e Jopling, os pólos desse espectro são ocupados de um lado pela

forma mais localizada denominada tuberculóide, associada a resposta imunológica do

tipo Th1 (celular), e do outro pela forma virchowiana (assim denominada no Brasil em

substituição ao termo “lepromatosa”da classificação original), sistêmica, e associada a

resposta imunológica do tipo Th2 (humoral), com três formas clínicas intermediárias ou

borderline. Hoje,é amplamente aceita a noção de que conjuntos diferentes de genes

modificam a susceptibilidade à doença em pelo menos dois momentos distintos,a

saber: (i) no controle da infecção per se, isto é, a doença independentemente de sua

forma de manifestação clínica; e (i), uma vez o indivíduo infectado, na definição da

diferentes formas clínicas da doença (figura).

Representação esquemática do espectro clínico da hanseníase, sugerindo a

participação de conjuntos diferentes de genes no controle das duas etapas da

patogênese da doença – infecção per se e manifestação clínica

Gene MBL: A lectina ligante de manose (MBL) liga-se a resíduos de manose e N-

acetilglicosamina presentes na superfície de bactérias e fungos, o que resulta em

ativação do Sistema Complemento, opsonização e fagocitose. Entretanto, alelos

relacionados com baixa produção desta molécula possuem elevada freqüência em

diversas populações sugerindo uma vantagem evolutiva destes. No caso da

hanseníase, cujo agente etiológico é um parasita intracelular obrigatório que depende

da fagocitose para penetrar nas células do hospedeiro a redução nos níveis de MBL

poderia conferir proteção contra a doença. De fato, Dornelles et al. relataram que

baixos níveis de MBL conferem proteção contra a hanseníase virchowiana, mas não

tuberculóide. Fitness et al. compararam a freqüência do polimorfismo 239G/A (G57E)

no exon 1 do gene MBL2 entre pacientes com hanseníase e controles e não

encontraram associação alguma. Cabe ressaltar que este SNP não leva a diminuição

na expressão da proteína. Messias-Reason et al., por sua vez, verificaram diferenças

na freqüência de polimorfismos no exon 1 do gene MBL2 entre pacientes e controles,

além disso, uma menor freqüência de genótipos/haplótipos relacionados com baixa

produção de MBL foi encontrada nos pacientes virchowianos em comparação com

tuberculóides. Esses dados sugerem que SNPs capazes de influenciar os níveis de

expressão de MBL tem papel relevante na ocorrência e forma clínica da doença.

Genes Fator de ecrose Tumoral (T F) e Linfotoxina-a (LTA) - proximidade com a região

gênica do HLA, classicamente envolvida com a hanseníase, e a relevância do TNF em

doenças infecciosas tem levado a um grande interesse sobre o papel de alterações do

gene do TNF na etiopatogenia das infecções. Na hanseníase, o TNF atua na ativação

de macrófagos estimulando a atividade micobactericida destes e a apresentação de

antígenos via MHC de classe I, mas também contribui para a ocorrência de danos

neurais. A regulação da produção desta citocina parece ter forte influência genética, o

que pode determinar a susceptibilidade a doenças. Nesse contexto, Sarno et al.

sugerem que polimorfismos no gene TNF devem estar associados com dano neural

causado pela resposta inflamatória na hanseníase. Assim, polimorfismos de base

única na região promotora do gene do TNF, com potencial para alteração desta

proteína, têm sido de interesse na investigação dos determinantes da susceptibilidade

genética para hanseníase. Um polimorfismo na posição -308 da região promotora do

gene TNF apresentou significativa associação com a hanseníase per se. Também foi

encontrada associação entre o alelo TNF2 deste SNP (-308A) e hanseníase

multibacilar em estudos indiano e tailandês. Contrariamente, em estudos brasileiros

este alelo foi associado com resistência a esta forma clínica de hanseníase. Já Levée

et al. não encontraram associação de SNPs no gene TNF com a hanseníase

estudando famílias multiplex na Polinésia Francesa. A implicação funcional deste

polimorfismo ainda é controversa; alguns estudos indicam que a presença do alelo A

resulta em maior produção desta citocina, enquanto outros não indicam relevância

funcional do mesmo. Ainda nesta região, localiza-se o gene LTA, que codifica uma

quimiocina com múltiplos efeitos na regulação do sistema imune. Shaw et al.

estudando famílias brasileiras não verificaram correlação do SNP LTA+252A/G isolado

com hanseníase. Entretanto, em análise estendida, encontraram associação com

hanseníase deste SNP em haplótipos formados com TNF-308, o que foi replicado em

estudo com a população brasileira

Gene HLA: A região 6p21 do cromossomo 6 humano, que abrange os genes do

Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I e I (HLA) e o do fator de

necrose tumoral (TNF) e linfotoxina-α (LTA), tem sido associada com a ocorrência de

hanseníase em diversos estudos, uma vez que a segregação dos haplótipos de HLA

parentais não se dá de modo aleatório entre filhos saudáveis e àqueles acometidos

pelas formas tuberculóide e virchowiana. Estudos familiares têm apontado para a

associação das regiões gênicas do HLA com a hanseníase per se. O refinamento

destes estudos levou a associação dos loci HLA-DQB1, HLA-DQA1 e HLA-DRB1 com

a doença, assim como forte ligação da região 6p21.32/HLA-DQ3 foi identificada. Todd

et al. e Hegazy et al. associaram HLA-DR2 e HLA-DQw1 com a ocorrência de

hanseníase per se. Semelhante associação de HLA-DR2 foi previamente observada

no Japão. Na população chinesa por outro lado, não houve associação de HLA-DR2

com a doença. Com relação às formas clínicas HLA-DR2, HLA-DR3 e HLA-DQw1, já

foram relacionados com a hanseníase tuberculóide. Enquanto DR2, DRw8, DQw1

foram associados com a forma virchowiana. Os genes altamente variáveis

relacionados à cadeia MHC de classe I A (MICA) e B (MICB) também têm sido

associados à hanseníase. Essas proteínas são expressas durante a apresentação de

antígenos e funcionam como co-estimulatórias para a ativação de linfócitos T γδ,

linfócitos T CD8+ e células NK. Entre os chineses HLAB e MICA-A estiveram

relacionados com proteção contra a forma multibacilar da hanseníase; enquanto na

Índia, Tosh et al. relataram associação de HLA-DRB1 e MICA*5A5.1 com a doença

per se. O gene TAP2, também localizado na região 6p21, codifica a cadeia 2 da

proteína transportadora associada ao processamento antigênico (TAP) que atua na

translocação de peptídeos do citosol para o retículo endoplasmático e na ligação de

peptídeos ao MHC de classe I. São relatados vários polimorfismos deste gene que em

combinação originam diferentes alelos (AH) os quais podem diferir quanto à

capacidade de apresentar antígenos via MHC de classe I. Rajalingam et al estudaram

a implicação destes SNPs na hanseníase e observaram que a freqüência do alelo

TAP2-B estava significativamente aumentada na hanseníase tuberculóide e

especialmente entre os pacientes com HLADR1. Contudo, devido à estreita

proximidade do gene TAP2 com a região do HLA, esses resultados devem ser

observados com cautela, uma vez que podem decorrer de desequilíbrio de ligação

com alelos HLA. Esses dados em conjunto indicam que a região do genoma humano

codificadora das moléculas do HLA está fortemente associada à ocorrência da

hanseníase, entretanto, o alelo associado varia de acordo com cada população em

função da distinção do background genético.

Assim como outras doenças infecciosas, a hanseníase possui caráter complexo e

poligênico, ou seja, a associação de alterações em diversas regiões genômicas deve

compor um perfil de susceptibilidade. Nesse contexto, os dados ora disponíveis acerca

das variações genéticas que devem contribuir para a susceptibilidade à doença

revelam que, isoladamente, estas associações são discretas. Adicionalmente, nem

todas estas associações são replicadas em diferentes populações o que sugere que

cada uma destas deve possuir um perfil genético de susceptibilidade distinto e, ainda,

aponta para possíveis equívocos associados aos desenhos dos estudos, como, por

exemplo, na seleção de controles.

MODULO 6 – MUTAÇÃO, REPARO E RECOMBI AÇÃO DO D A 6.1. MUTAÇÃO:

6.1.1. Categorias de Mutação Humana: A mutação é definida como uma mudança na

seqüência de nucleotídeos ou no arranjo do DNA, e assim são classificadas em três

categorias:

Mutações genômicas: são alterações no número de cromossomos intactos

(aneuploidias) que surgem de erros na segregação cromossômica, durante a meiose

ou mitose.

Mutações cromossômicas: são mudanças envolvendo apenas uma parte de um

cromossomo, tais como duplicações, deleções, inversões e translocações, as quais

podem ocorrer espontaneamente ou resultar de segregação anormal de cromossomos

translocados durante a meiose;

Mutações gênicas: são mudanças da seqüência do DNA dos genomas nucleares ou

mitocondriais, variando desde uma pequena mudança, como um único nucleotídeo,

até alterações que podem afetar milhões de pares de bases. As mutações gênicas são

decorrentes de falhas nos processos de replicação ou de reparo do DNA.

codificadora pode levar a perda completa da expressão gênica ou à formação de uma

variante protéica com propriedades alterada

Uma mutação genômica que deleta ou duplica um cromossomo inteiro pode alterar os

níveis de expressão de centenas ou milhares de genes. De modo semelhante, uma

mutação cromossômica que deleta ou duplica grandes porções de um ou mais

cromossomos também pode afetar a expressão de centenas de genes. Mesmo uma

pequena mutação gênica pode ter grandes efeitos fenotípicos, dependendo de qual

gene tenha sido afetado e de qual efeito a alteração tenha sobre a expressão do

mesmo. Uma mutação gênica consistindo em uma mudança de um único nucleotídeo

na seqüência

Algumas alterações no DNA, entretanto, não têm efeito fenotípico. Uma translocação

ou inversão cromossômica pode não afetar a porção crítica do genoma e pode não ter

quaisquer efeitos fenotípicos. Uma mutação dentro de um gene pode não ter efeito, ou

porque a mudança não altera a seqüência primária do aminoácido de um polipeptídio

(mutação silenciosa) ou porque a mudança não alterara as propriedades funcionais da

proteína (mutação neutra). Nem todas as mutações, portanto, tem conseqüências

clínicas.

Todos os três tipos de mutação ocorrem com freqüência apreciável em muitas

diferentes células. Se uma mutação ocorre no DNA das células que irão fornecer a

população da linhagem germinativa, a mutação pode ser passada para as gerações

futuras. Em contraste, mutações somáticas ocorrem por acaso em apenas um

subgrupo de células em certos tecidos e resultam em mosaicismo somático, como

visto, por exemplo, em muitas situações de câncer. As mutações somáticas não

podem ser transmitidas à próxima geração.

6.1.2. Tipos de Mutações Humanas 6.1.2.1. Mutação por substituição de nucleotídeos:

• Mutação de Sentido Trocado – este tipo de mutação é reconhecido quando a

substituição de um único nucleotídeo (ou mutação de ponto) em uma seqüência de

DNA é capaz de alterar o código em uma trinca de bases, e assim causar a

substituição de um aminoácido por outro no produto gênico. Em muitos distúrbios, tais

como as hemoglobinopatias, são derivados de mutações de sentido trocado.

• Mutação Sem Sentido ou Mutação de Término de Cadeia – este classe é identificada

quando uma mutação pontual no DNA causa, na seqüência do mRNA, a substituição

do códon normal por um dos três códons terminais. Como conseqüências da formação

de um códon de parada prematuro, o mRNA carregando a mutação é freqüentemente

instável, e não é possível a sua tradução; e mesmo que o mRNA esteja estável o

bastante para ser traduzido, a proteína gerada será truncada e normalmente tão

instável que será rapidamente degradada. Uma mutação de ponto não apenas pode

criar um códon de termino prematuro, como também pode destruir um códon de

término e permitir que a tradução continue até que o próximo códon de término seja

atingido. Igualmente, uma mutação criará uma proteína com aminoácidos adicionais

em seus terminais carboxila que poderá comprometer qualquer função fornecida pela

região 3-UTR posterior ao códon de terminação normal.

• Mutações no Processamento do R A – o mecanismo normal pelo qual os mRNAs

transcritos inicialmente são convertidos em mRNAs maduros requer uma série de

modificações, incluindo o “cap” 5, a poliadenilação e recomposição. Todas essas

etapas na maturação do mRNA dependem de seqüências específicas dentro do

mRNA. No caso da recomposição, a remoção dos introns e conseqüente união dos

exons requer seqüências específicas dentro e próximas das junções exon-intron (local

doador 5’) ou intron-éxon (local receptor de 3’). As mutações que afetam estas bases

requeridas em cada ponto doador ou receptora interferem na recomposição normal de

RNA naquele local. Uma segunda classe de mutações no processamento do RNA

envolve substituições de base no intron que criam locais doadores ou aceptores

alternativos que competem com os locais normais durante o processamento do RNA.

Assim, pelo menos uma proporção do mRNA maduro, em tais casos, pode conter

seqüências de intron impropriamente recompostas.

Mutações no encadeamento podem parecer por alteração das sequências

conservadas dos sítios doador e receptor de encadeamento ou por ativação de sítios

de encadeamento ocultos.

6.1.2.2. Mutação por deleção/inserção:

As mutações também podem ser causadas pela inserção, inversão, fusão ou deleção

de seqüências de DNA. Algumas deleções e inserções envolvem apenas alguns

poucos nucleotídeos e em geral são mais facilmente detectadas pelo seqüenciamento

de nucleotídeos. Em outros casos, um seguimento substancial de um gene ou um

gene inteiro é deletado, invertido, duplicado ou translocado. Nestes casos, as

mutações são normalmente detectadas pelas técnicas de biologia molecular (ex.:

transferência de Souther blotting, reação em cadeia da polimerase) ou citogenética

(ex.:bandeamento cromossômico, hibridização in situ por fluorescência, cariotipagem

espectral).

• Mutações na matriz de leitura – Quando o número de bases envolvidas não é

múltiplo de três, a mutação altera a leitura da tradução a partir do ponto de mutação,

resultando numa uma proteína com sequência de aminoácidos diferentes do

esperado. Quando o número de bases envolvidas é multiplo de três, a mutação resulta

numa proteína com a adição ou falta de aminoácidos.

• Mutação por seqüências de transposição – a inserção de seqüência LINE, como

descrito em alguns poucos pacientes não relacionados portadores da hemofilia A, com

diversos quilibases de tamanho foi encontrada inserida em um exon no gene do fator

VIII, interrompendo a seqüência de codificação e inativando o gene. Este achado

sugere que pelo menos algumas das 850.0 cópias da família LINE no genoma humano

são capazes de causar doenças por mutagênese insercional.

As mutações em distúrbios como a doença de Huntington e a Síndrome do X-frágil

envolvem a amplificação de seqüências compostas por 3 nucleotídeos. Nessas

doenças, a repetição de um único trinucleotídeo, localizado na região de codificação

(no caso da doença de Huntington) ou na região transcrita, mas não traduzida de um

gene (no caso da síndrome do X-frágil), pode se expandir durante a gametogênese, na

qual é referida como uma mutação dinâmica, e interfere com a expressão gênica

normal. Uma repetição na região de codificação irá gerar um produto protéico anormal,

enquanto a expansão repetida em partes transcritas, mas não traduzidas de um gene,

pode interferir com a transcrição, processamento do mRNA ou tradução. As mutações

dinâmicas ainda não são completamente compreendidas, porém acredita-se, que

durante a replicação a DNA polimerase deslize pelos filamentos que estão sendo

sintetizado, aumentando assim um aumento da seqüência básica de repetição. Este

fenômeno é descrito como “slippage”.

6.1.3. Conseqüências moleculares das mutações:

É bom pensar nas mutações em termos de seus efeitos sobre o produto protéico. De

maneira geral, as mutações podem resultar em GANHO DE FUNÇÃO ou em PERDA

DE FUNÇÃO do produto protéico.

Mutações de ganho de função - ocasionalmente resultam em um produto protéico

completamente novo, mas comumente, resultam em hiperexpressão do produto ou em

expressão inapropriada (no tecido errado ou no estágio errado do desenvolvimento).

As mutações de ganho de função produzem um distúrbio DOMINANTE.

Mutações de perda de função - são em geral vistas nas doenças recessivas. Aqui,

uma mutação que resulta na perda de 50% do produto protéico, mas os 50% restantes

são suficientes para o funcionamento normal. Portanto o heterozigoto não é afetado.

Em alguns casos, entretanto, 50% do produto protéico não são suficientes para o

funcionamento normal (HAPLOINSUFICIÊNCIA), podendo resultar um distúrbio

dominante. Como muitos distúrbios envolvendo a haploinsuficiência, os homozigotos

são gravemente afetados quando comparados com os heterozigotos. As mutações de

perda de função são em geral vistas nas doenças recessivas.

6.1.4. Nomenclatura para as mutações:

A posição da mutação é designada como estando no DNA genômico, numa seqüência

de cDNA ou no DNA mitocondrial, pelo prefixo g., c. ou m., respectivamente.

Uma mudança no nucleotídeo é notada primeiro pelo número daquela base, o

nucleotídeo original, o símbolo “>” e o novo nucleotídeo naquela posição. No DNA, os

símbolos dos nucleotídeos são maiúsculos; no mRNA eles são em minúsculos.

Exemplo: g.1166A>C (mutação no DNA)

Os nucleotídeos em um intron (referidos pela sigla IVS) são contados como +1, +2, e

assim por diante, onde +1 é a constante G do GT no sítio doador da ligação 5’, ou

como –1, -2, e assim por diante, contagem regressiva da altamente invariável G do

sítio aceptor de união AG 3’. Exemplos: g.IVS33+2T>A, g.IVS33-2T>A

Pequenas deleções são indicadas pelos números dos nucleotídeos deletados,

separados por sublinhado (_), seguido pelo termo del, e depois os nucleotídeos reais

deletados. Exemplo: c.1524_1427delCGTA

Pequenas inserções são designadas por ins após dois nucleotídeos entre os quais

ocorreu a inserção, seguida pelo novo nucleotídeo inserido. Exemplo:

c.1277_1278insTTAC

Uma mutação espontânea ou sem sentido pode ser descrita ao nível da proteína pela

doação do aminoácido correto, a posição daquele resíduo, e o aminoácido que

substituiu o normal. Ex: Glu6Val

As mutações na seqüência do DNA podem ocorrer de forma espontânea (mutação

espontânea) ou induzida (mutação induzida). No primeiro caso, as mutações são

decorrentes de erros cometidos ela DNA polimerase, durante o processo de replicação

do DNA. O surgimento de mutações espontâneas ocorre quando DNA polimerase

insere uma base incorreta que não pode formar pontes de hidrogênio com a base no

filamento parentalmolde. As mutações espontâneas também podem surgir como

conseqüência de mudanças tautoméricas nas bases dos nucleotídeos. Cada uma das

quatro bases nitrogenadas é capaz de existir em uma forma rara, isomérica alternativa

(tautômero), tendo propriedades diferentes de pontes de hidrogênio. As raras formas

imino (A*) e citosina (C*) fazem pares de bases com citosinas e adenina,

respectivamente, enquanto que as raras formas enol de timina (T*) e guanina (G*)

fazem pontes de hidrogênio com guanina e timina, respectivamente. Uma base pode

ser incorporada em sua forma normal e então sofrer uma mudança tautomérica após a

incorporação. Durante a rodada subseqüente de replicação do DNA, a presença de

um destes tautômeros raros no molde pode resultar na incorporação de uma base

incorreta na molécula-filha de DNA (um processo similar ocorre quando agentes

mutagênicos chamados de análogos de bases sofrem tautomerização).

Depurinação refere-se a quebra de ligações N-glicosílica entre a base (neste caso

uma purina) e a desoxirribose do nucleotídeo, com a perda subseqüente da base

nitrogenada. A menos que tal dano seja reparado antes da replicação do DNA, há uma

grande probabilidade de que surja uma mutação, pois o sítio apurínico não tem a

“informação” necessária para especificar a inserção da base complementar correta n o

novo filamento de DNA. Se a DNA polimerase atingir o sítio apurínico antes que o

reparo tenha ocorrido, a replicação pode parar e/ou uma base incorreta pode ser

inserida no novo filamento de DNA em oposição ao sitio apurínico. Novamente,

existem mecanismos específicos de reparo envolvendo enzimas chamadas de

ENDONUCLEASES AP (AP = apurínico) para lidar com tal dano.

A desaminação é um outro processo que origina mutações. Esta mutação é

caracterizada pela perda do grupo amino presente na citosina. Esta, por sua vez,

transforma-se em uracila. Após uma rodada de replicação, esta mutação leva a

substituição do par original G-C por um A-U, que se tornará então um par A-T após

outra rodada de replicação.

Já as mutações induzidas são causadas por agentes conhecidos coletivamente como

mutágenos. Os mutágenos de principal destaque são:

Radiação ionizante (raios-X): íons eletricamente carregados quando situados dentro

ou próximos de moléculas de DNA podem promover reações químicas que mudam as

bases do DNA. A radiação ionizante também pode quebrar a DNA unifilamenar ou

bifilamentar. Esta forma de radiação pode atingir todas as células do corpo, inclusive

as da linhagem germinativa;

Radiação não-ionizante (raios U.V.): esta classe de radiação forma ligações

covalentes entre bases pirimidínicas adjacentes (citosina ou timina). Estes dímeros de

pirimidina são incapazes de se parear apropriadamente com purinas durante a

replicação do DNA. Isto resulta em uma substituição de pares de bases. Como a

radiação UV é absorvida pela epiderme, não atinge a linhagem germinativa, mas pode

causar câncer de pele.

Análogos de bases: podem substituir uma base verdadeira do DNA durante a

replicação. O análogo não é exatamente igual à base que substitui, de modo que pode

causar erros de pareamento durante as replicações subseqüentes.

6.2. RECOMBI AÇÃO

Uma importante propriedade do DNA das células é a sua capacidade de sofrer

rearranjos, que podem ocasionar desde novas combinações entre os genes presentes

em qualquer genoma individual até alterações qualitativas e quantitativas na

expressão desses genes. Trata-se de uma fonte de variação genética fundamental

para permitir que os organismos evoluam em resposta a mudanças ambientais. Esses

rearranjos do DNA são realizados pela recombinação genética. Duas amplas classes

de recombinação são comumente reconhecidas: a recombinação geral e a sítio-

específica. Na recombinação geral (ou recombinação homóloga), a troca genética

envolve seqüências homólogas (complementares) de DNA. Um dos exemplos mais

importantes desse tipo de troca entre cromossomos homólogos (denominado

crossing–over) acontece na meiose. O crossing-over ocorre entre cromossomos

altamente relacionados nos estágios iniciais de desenvolvimento de óvulos e

espermatozóides. Na recombinação sítio específica não é necessária homologia

extensa do DNA. Nesse caso, as trocas ocorridas são curtas. Seqüências específicas

de nucleotídeos são reconhecidas por uma enzima de recombinação sítio-específica

que altera a posição relativa das seqüências de nucleotídeos nos genomas.

6.2.1. Recombinação geral

Esse tipo de recombinação pode ocorrer em qualquer local ao longo de 2 moléculas

complementares de DNA. O principal resultado desse processo é sempre o mesmo:

duas moléculas de DNA homólogas sobrepõem-se e trocam partes (crossing-over),

isto é, suas hélices duplas quebram-se e as duas extremidades quebradas unem-se

com suas parceiras opostas para formar, novamente, duas hélices intactas, cada uma

composta por partes das 2 moléculas de DNA iniciais.O sítio de troca pode ocorrer em

qualquer lugar da seqüência homóloga de nucleotídeos das 2 moléculas de DNA

envolvidas. Uma fita de uma das moléculas faz pareamento de bases com uma das

fitas da outra molécula, criando a junção “alternativa” (staggered joint), usualmente

chamada de junção heterodúplex, entre as duas diferentes hélices duplas.

Não há alteração nas seqüências de nucleotídeos no sítio de troca; a quebra e os

eventos de re-ligação ocorrem de uma forma tão precisa que não há perda, ganho ou

alteração de um único nucleotídeo. A freqüência de recombinação não é constante ao

longo de todo o genoma e é influenciado por efeitos tanto globais quanto locais (• X •,

e dentro do mesmo genoma). A recombinação necessita de um mecanismo que

permita que um dúplex interaja com outro dúplex homólogo (fitas simples envolvidas).

O mecanismo utilizado provém do modo pelo qual os ácidos nucléicos reconhecem um

ao outro (complementaridade). Um pareamento extensivo de bases entre dois dúplices

homólogos só poderá ocorrer se um corte é primeiramente feito em um deles,

deixando a fita livre para os eventos de desenrolamento e enrolamento necessários à

formação de um heterodúplex com a outra molécula de DNA. Portanto, qualquer

evento de troca requer pelo menos duas clivagens, uma em cada uma das fitas das

hélices duplas que irão interagir. Finalmente, cada uma das quatro fitas deve ser

clivada para permitir que cada uma seja ligada a uma parceira diferente. Na

recombinação geral, esses eventos só ocorrem quando duas hélices de DNA dividem

uma extensa região de homologia. Acredita-se que qualquer evento que resulte em

quebras na cadeia de DNA estimule o início de um processo de crossing-over. Por

isso, por exemplo, radiação UV aumenta a freqüência de crossing-over na célula, ao

criar quebras na fita dupla ou regiões de fita simples do DNA.

6.2.1.1. Enzimas e mecanismos moleculares da recombinação genética

A ação de conectar 2 moléculas de DNA de fita dupla é o ponto principal do processo

de recombinação. A troca recíproca entre as extremidades livres cria uma conexão

entre os dois dúplices, que formam uma molécula unida. O ponto no qual uma fita de

DNA cruza de um ponto para outro é chamado de junção recombinante. Uma

característica importante de uma junção recombinante é a sua capacidade de mover-

se ao longo do dúplex. Tal mobilidade é chamada de migração da ramificação. O

ponto de ramificação pode migrar em ambas as direções, à medida que uma fita é

deslocada pela outra. Quando a molécula unida rota um dúplex em relação ao outro,

isso pode ser visualizado em um plano como uma estrutura de Holliday.

A molécula unida, formada pela troca de fitas, deve ser resolvida em dois dúplices

separados. A resolução necessita de um par de clivagens adicional. Se os cortes

forem feitos no par de fitas que não foram originalmente clivadas (o par de fitas que

não iniciou a troca), todas as 4 fitas originais são clivadas. Isso resulta em moléculas

de DNA “recombinantes combinadas”. Se as mesmas duas fitas envolvidas nas

clivagens originais forem clivadas novamente, as outras duas fitas permanecerão

intactas. As clivagens liberam os dúplices parentais, os quais permanecem intactos,

salvo que cada um possuirá um vestígio do evento de recombinação, na forma de uma

região de heterodúplex. Esses recombinantes são chamados de “recombinantes

remendados”.

Proteína RecA - RecA possui um papel central na recombinação, atuando tanto como

uma proteína estrutural como em reações catalíticas. Essa enzima é capaz de parear

duas moléculas de DNA homólogas e catalisar as reações de trocas de fitas, levando

à formação do heterodúplex de DNA.RecA reconhece especificamente DNA de fita

simples e anela esse segmento a uma seqüência complementar de um dúplex

homólogo, substituindo, simultaneamente, a fita original complementar pela nova fita.

Se ATP está presente, a proteína RecA do filamento pode, então, ir desenrolando

sucessivamente diferentes partes do dúplex, na tentativa de anelar o filamento de fita

simples a uma região desenrolada. Uma vez que uma pequena porção é corretamente

pareada, usando como molde a cadeia intacta, a energia do ATP direciona a reação

de pareamento até o final. A proteína RecA é deslocada quando a nova molécula de

DNA híbrida é formada. A proteína RecA possui um papel central na regulação da

recombinação genética, na reparação do DNA e na mutagênese induzida por

UV.Estudos demonstraram que a proteína RecA é ATPase DNA-dependente. No

entanto, a reação de troca de fitas é isoenergética (para cada par de bases quebrado,

outro par é formado) e ocorre mesmo na ausência de ATP.A proteína RecA pode atuar

guiando a formação de uma hélice com quatro fitas, composta pelas duas moléculas

de DNA, acelerando o processo de troca de fitas e permitindo que a junção se mova

ao longo de toda a região do dúplex.

Enzimas Acessórias

Proteínas RecBCD - Complexo protéico com potentes atividades nucleásica, de

helicase e de ATPase. Uma carcterística importante dessas proteínas é que iniciam o

processo de desenrolamento e degradação do DNA somente em uma molécula que

contenha uma extremidade livre. Também foi demonstrado que o complexo RecBCD

promove a recombinação com maior freqüência em cadeias de DNA que contêm o

chamado sítio chi, com seqüência 5’-GCTGGTGG-3’. Quando essa seqüência é

reconhecida, uma atividade endonucleásica específica de RecBCD cliva uma das fitas

de DNA em uma região próxima ao sítio chi. O reconhecimento desse sítio faz com

que a subunidade RecD dissocie-se do complexo ou torne-se inativa, ficando o

complexo apenas com sua atividade de helicase.

Outras enzimas

RuvA e RuvB: reconhece junções Holliday, e atua como helicase RecG: helicase

RuvC: endonuclease, reconhece junções Holliday (tetranucleotídeo ATTG): direciona a

resolução SSB: protegem o segmento de fita simples da degradação por nucleases

até que o processo de pareamento homólogo inicie; DNA polimerase: preenche as

lacunas deixadas quando 2 moléculas de DNA recombinantes são clivadas

separadamente. DNA ligase: une os fragmentos deixados pela DNA-polimerase.

6.2.2. Recombinação sítio-específica

Pela sua natureza, o crossing-over geralmente preserva a ordem das seqüências de

DNA em cromossomos homólogos. Em casos excepcionais, no entanto, as células

também utilizam um elaborado processo recombinacional de regulação, que tem como

conseqüência o rearranjo de seqüências através da recombinação direta entre sítios

especiais. Segmentos de DNA podem ser movidos pela recombinação sítio-específica,

resultando, freqüentemente, na expressão de diferentes genes ou grupos de genes. A

recombinação sítio-específica não envolve extensa homologia entre as seqüências de

DNA, como ocorre no crossing-over. Ela necessita apenas que as seqüências de

ligação sejam localizadas por enzimas especializadas, que catalisam a quebra e a

reunião das moléculas. Esse tipo de recombinação é iniciado por processos

reguladores que tornam as enzimas corretas disponíveis. Na recombinação sítio-

específica conservativa, uma molécula de DNA é clivada em ambas as fitas em dois

locais específicos e as extremidades são religadas às suas novas parceiras. O

primeiro passo na recombinação sítio-específica é a ligação de proteínas

(recombinases) a alguns ou a todos os elementos de reconhecimento de um ou ambos

os sítios que irão recombinar. Depois disso, esses sítios fazem uma sinapse (ou troca

de fitas). Não é necessária homologia entre as partes recombinantes nessa etapa. A

complexidade dos sistemas de recombinação sítio-específica varia muito, e cada

sistema tem uma recombinase específica que reconhece as seqüências de DNA.

Freqüentemente, a região codificadora dessa recombinase está relacionada com seus

sítios de reconhecimento e, algumas vezes, com um elemento reforçador (enhancer)

recombinacional.

6.2.3 Consequências moleculares da recombinação (figura2):

Conversão gênica interlócus – é a transferência não recíproca de informação de

sequência entre um par de DNA não-alélicas; Conversão gênica interalélica – é a

transferência não recíproca de informação de sequências alélicas.

Ambos os mecanismos ocorrem quando uma sequência do par de sequência atuantes

como doadora, permanece inalterada. A outra sequência de DNA, a receptora, é

modificada, tendo alguma ou toda a sua sequência substituída pela sequência copiada

da doadora. A troca de seqüências é, portanto, direcionada; a seqüência receptora é

modificada pela seqüência doadora, mas não ocorre a maneira inversa.

Figura2: Conversão gênica envolve uma troca de sequências não recíproca entre

genes alélicos e não-alélicos.

O DNA nas células sofre uma ampla série de danos:

Bases púricas são perdidas pela fissão espontânea das ligações base-açúcar;

Citosinas e ocasionalmente adeninas, são desaminadas espontaneamente para

produzir uracila e hipoxantina, respectivamente; Espécies de oxigênio reativas nas

células atacam os anéis das purinas e pirimidinas; A luz ultravioleta faz com que

timinas adjacentes formem um dímero quimicamente estável; Erros na replicação do

DNA resultam na incorporação de uma base mal pareada; A radiação ionizante causa

quebras nas fitas simples e duplas; Erros na replicação ou na recombinação deixam

quebras nas fitas do DNA.

Todas essas lesões devem ser reparadas para a célula sobreviver. A importância de

sistemas de reparação eficientes é destacada por doenças graves que afetam

pessoas com deficiências nos sistemas de reparação. A reparação do DNA

freqüentemente envolve a simples eliminação da mudança que causou a lesão. Quase

sempre uma fita de DNA contendo o(s) nucleotídeos(s) danificado(s) é removida e a

lacuna é preenchida através de re-síntese. Existem ao menos cinco tipos principais de

reparação do DNA nas células humanas:

6.3.1. Reparo por reversão direta: O mecanismo mais simples de reparo de bases

alteradas é restaura-las ao normal sem uma grande cirurgia na molécula de DNA. No

caso dos dímeros de pirimidina formados no DNA por luz UV, esta reversão é mediada

pela enzima fotoliase (ativada por luz visível). A fotoliase corta os dímeros de

pirimidina gerando pirimidinas intactas. Outro exemplo de reversão direta é a

metiltransferase, uma enzima que reconhece O6 metil guanina no DNA e remove o

grupo metil agressor. Nessa reação, a guanina normal do DNA é restaurada e a

enzima inativada.

6.3.2. Reparo por Excisão de Base: Este procedimento utiliza enzimas glicosidases

para remover bases anormais. Uma endonuclease, AP- endonuclease, corta o

arcabouço de açúcar-fosfato na posição da base perdida. Uns poucos nucleotídeos da

dita de DNA são retirados por exonucleases, a lacuna é preenchida por re-síntese, e o

corte remanescente é fechado pela DNA ligase-I. O mesmo processo é utilizado para

reparar depurinações espontâneas. É interessante ressaltar que não se conhece

nenhuma doença humana causada por falha neste mecanismo de reparo do DNA.

Talvez qualquer defeito desse tipo seja letal, uma vez que este mecanismo é

responsável pela correção de um grande número de lesões no DNA.

6.3.3. Reparo por Excisão de ucleotídeo: Remove dímeros de timina e grandes

aductos químicos. O mecanismo de ação deste processo envolve a proteína XPA, que

reconhece o DNA danificado e liga-se a ele ou por ligação a RPA (proteína que se liga

a fita simples). O complexo DNA-XPARPA recruta o fator de transcrição TFIIH (um

complexo multiproteico que inclui as proteínas XPB e XPD). As proteínas XPB e XPD

são helicases e atuam na abertura das fitas de DNA, um seguimento com cerca de 30

nucleotídeos de extensão. Em seguida, dois cortes são feitos na cadeia de açúcar-

fosfato da fita danificada. XPF+ERCC1 cortam as extremidades 5’, e XPG corta a

extremidade 3’.Em seguida, a DNA polimerase ε, juntamente com o fator de replicação

C e a subunidade DPE2 sintetizam DNA para preencher a lacuna. Por fim, a DNA

ligase une as lacunas. Defeitos neste mecanismo de reparo causam a doença

autossômica recessiva Xeroderma pigmentar (XP) Pacientes XP são extremamente

sensíveis à luz UV, peles expostas ao sol desenvolvem milhares de sardas, muitas

das quais progridem para o câncer de pele.

6.3.4. Reparação Posterior a Replicação: Este procedimento é necessário para corrigir

quebras nas fitas duplas. O mecanismo usual é processo semelhante à conversão

gênica (reparação por recombinação), em que uma fita simples de um cromossomo

homólogo invade a hélice do DNA danificado. Os genes humanos envolvidos nesta

rota incluem BLM (mutado na síndrome de Bloom), e os genes de suscetibilidade ao

câncer de mama (BRCA2 talvez o BRCA1).

6.3.5. Reparo por mau pareamento: Este mecanismo corrige pares de bases mal

pareadas, causados por erros ocorridos durante a replicação do DNA. Estes erros,

normalmente, são reconhecidos e corrigidos pela função de edição das polimerases.

No caso de uma base ocasionalmente incorporada erradamente não ser percebida

durante a edição, um segundo sistema de correção, chamado de reparo de mau

pareamento, existe para lidar com tais bases pareadas erradamente. No reparo de

mau pareamento, um par de bases não ligadas por pontes de hidrogênio é

reconhecido como incorreto, e um seguimento polinucleotídico é removido, removendo

assim um membro do par incorreto.

MÓDULO 7 – CITOGE ÉTICA CLÁSSICA E MOLECULAR

7.1. Cromossomo Humano:

O complemento cromossomo humano normal, ou cariótipo, consiste em 46

cromossomos, sendo 4 autossomos e 2 cromossomos sexuais, X nas mulheres e XY

nos homens. Os cromossomos são divididos morfologicamente em metacêntrico,

submetacêntrico e acroscêntrico, dependendo da posição do centrômero. Os

cromossomos acrocêntricos possuem o braço curto pequeno, que consistem em

satélite com um pedúnculo. Eles contêm várias centenas de cópias de genes

codificadores de RNA ribossômico. Ao contrário, de quase todo o resto do material

cromossômico, a perda destes satélites, como ocorre na translocação robertsoniana,

não tem significado clínico. Note que estes satélites não tem nada a ver com

microssatélites ou minissatélites.

Com base no tamanho individual e posição dos centrômeros, os cromossomos foram

originalmente divididos em sete grupos: A (1-3), B (4-5), C (6-12 e X), D (13-15), E (16-

18), F (19-20), G (21, 2 e Y). Eles são numerados em ordem decrescente de tamanho,

e representados aos pares. Geralmente os cromossomos são mostrados como eles

aparecem na metáfase da mitose, quando eles consistem em duas cromátides-irmãs

unidas pelo centrômero. Estas cromátides surgiram como resultado da síntese de DNA

antes de células entrarem na fase mitótica.

Normalmente metade dos cromossomos de uma pessoa são herdados de cada um

dos genitores, e metade de seu conjunto genético será transmitido para cada filho. Um

conjunto único de 23 cromossomos constitui um complemento haplóide: o total normal

de 46 cromossomos vistos em todas as células somáticas representa o complemento

diplóide. Os pares de cromossomos são chamados de homólogos.

7.1.1. Composição do Cromossomo Humano:

Cada cromossomo é constituído por uma molécula longa de DNA, associada a

diversas proteínas. As proteínas associadas ao DNA classificam-se em duas grandes

categorias: proteínas histonas que interagem diretamente com a fibra de DNA, e

proteínas não-histonas. O complexo formado por DNA, histonas e proteínas não-

histonas chama-se cromatina. Logo, a cromatina é o material que compõem os

cromossomos.

cromatina a aparência de colar de

contas

As histonas são fundamentais no enrolamento da cromatina. Trata-se de proteínas

com uma alta proporção de lisina e arginina, quer dizer, de aminoácidos carregados

positivamente. Isto contribui para a união das histonas às moléculas de DNA, nas

quais predominam as cargas negativas. Existem cinco classes de histonas, chamadas

de H1, H2A, H2B, H3 e H4. A H1, da qual existem 6 subtipos, contem cerca de 220

aminoácidos, enquanto que os subtipos restantes possuem entre 103 e 135

aminoácidos cada um. Estes últimos recebem a denominação de histonas

nucleossômica, porque a molécula de DNA se enrola em tono delas, para formas os

nucleossomos, que constituem as unidades básicas do enrolamento cromatínico. Em

cada nucleossomo, as histonas nucleossômicas se associam para formar uma

estrutura octamérica, composta por dois H2A, dois H2B, dois H3 e dois H4. Ao redor

deste octâmero de histonas, o DNA dá aproximadamente duas voltas e meia. Visto

que cada volta equivale a 83 pares de nucleotídeos, o segmento de DNA associado ao

nucleossomo contém, no total, 146 pares de bases. Os nucleossomos se encontram

separados entre si por uma porção de DNA “espaçadores”, de comprimento variável

(20-60 pares de bases). A alternância de nucleossomo e segmento espaçador dá a

A cromatina é normalmente classificada como eucromatina (região do DNA que

apresenta genes ativos, ou seja, genes que estão continuamente sendo traduzidos) e

heterocromatina (região do DNA que não possui genes ativos, e que parecer funções

estruturais durante o ciclo celular). Podem ainda distinguir-se dois tipos de

heterocromatina: 1) Heterocromatina constitutiva, que nunca se expressa como

proteínas e que se encontra localizada à volta do centrômero (contem geralmente

sequências repetitivas); 2) Heterocromatina facultativa, que, por vezes, é transcrita em

outros tipos celulares, consequentemente a sua quantidade varia dependendo da

atividade transcricional da célula.

7.1.2. Estrutura do Cromossomo Humano: Em cada cromossomo existem estruturas

que são imprescindíveis para a replicação, isto é, para a duplicação do DNA. São as

seguintes:

Centrômero, ou constrição primária, – é o ponto no qual as cromátides-irmães se

juntam e onde os microtúbulos se ligam para separar as cromátides na meiose. Em

humanos, os centrômeros consistem em seqüências de repetições em tandem com

171 pb, classificadas como αsatélite, estrutura que participa da divisão das duas

cópias cromossômicas geradas como conseqüência da replicação do DNA.

Telômero – são as seqüências terminais dos cromossomos

7.1.3. íveis de Compactação do Cromossomo Humano:

Durante o ciclo celular, os cromossomos passam por um estágio ordenado de

condensação e descondensação. No entanto, quando os cromossomos estão no seu

estado mais descondensado, em um estágio do ciclo celular denominado interfase, o

DNA acondicionado na cromatina está substancialmente mais condensado se

estivesse como uma dupla hélice normal. Isto ocorre porque para caber no pequeno

espaço que o núcleo lhe oferece, o genoma precisa estar num estágio primário de

compactação. Os estágios de compactação que, a partir de uma molécula de DNA,

ocorre a formação de um cromossomo estão destacados a seguir:

Primeiramente, o DNA se enrola ao redor de um octâmero de proteínas (histonas)

para formar o nucleossomo. Cerca de 140 a 150 bases de DNA se enrolam ao redor

de cada cerne de histonas, e de 20 a 60 bases formam um elemento espaçador antes

do complexo nucleossômico seguinte. Em seguida, os nucleossomos se enrolam

sobre si e geram uma estrutura helicoidal chamada de solenóide, de 30nm de

diâmetro. Cada volta do solenóide contem cerca de 6 nucleossomos. Tanto estes

como os futuros enrolamentos dependem das histonas H1, que, além disso,

estabilizariam as fibras de 30nm. A contínua compactação do DNA gera a formação de

estruturas em forma de laço ou alças de diferentes comprimentos, ancorados em um

eixo constituídos por proteínas não-histonas. O conjunto de eixos protéico compõe

várias armações ou arcabouços, de modo que, em cada base de cada laço, as

porções do cada DNA associadas a cada um destes eixos levam o nome SAR (do

inglês, scaffold associated regions). Os extremos dos laços se acham firmemente

unidos aos eixos protéicos, porem não se sabe ainda como as SAR se sujeitam a eles.

O resultado final desta helicoidização e da organização em alças é que o DNA,

quando no seu estado máximo de compactação assume a forma denominada de

cromossomo.

7.2.N omenclatura de cromossomos

situado numa região adjacente ao telômero

Um sistema padrão para denominar os cromossomos foi estabelecido em 1971. Cada

cromossomo tem braços curtos (p) e longo (q) separados pelo centrômero. Cada

braço é dividido em regiões numeradas a partir do centrômero para a extremidade

(ex.: p1, p2, etc), e cada região é subdividida em bandas (ex.: p1.1, p1.12, etc),

novamente numerando do centrômero para a extremidade. Os termos proximal e distal

são usados com relação ao local em um ponto do cromossomo. Proximal indica que

um lócus está na metade do cromossomo adjacente ao centrômero, enquanto que o

distal indica que está

7.3. Indicação clínica para análise citogenética:

A análise cromossômica é indicada como um procedimento diagnóstico de rotina para

uma série de fenótipos específico encontrados na prática médica. Além disso, também

existem situações clínicas não específicas que indicam a necessidade de análise

cromossômica.

Problemas precoces de crescimento e desenvolvimento – a falta ou o retardo do

desenvolvimento, malformações múltiplas, baixa estatura, genitália ambígua e retardo

mental são achados freqüentes em crianças como anomalias cromossômicas. A

menos que haja um diagnóstico não-cromossômico definitivo, a análise cromossômica

deve ser realizada nos pacientes que se apresentam com uma combinação de tais

fatores.

atimorto e morte pré-natal – a incidência de anomalias cromossômicas é mais elevada

entre os natimortos (aproximadamente 10%) do que entre os nativivos

(aproximadamente 0.7%). Ela também é elevada entre as crianças que falecem no

período neonatal (cerca de 10%). A análise cromossômica deveria ser realizada em

todos os natimortos e óbitos neonatais que possam apresentar uma base citogenética

a fim de identificar uma possível causa ou alternativa, ou descartar uma anomalia

cromossômica como motivo para a perda. Em tais casos, a cariotipagem é essencial

para a consulta genética, podendo fornecer importantes informações para o

diagnóstico pré-natal em futuras gestações.

Problemas de fertilidade – os estudos cromossômicos estão indicados para mulheres

que apresentam amenorréia e para casais com história de infertilidade ou abortos

recorrentes. A anomalia cromossômica é observada em um dos genitores em cerca de

3-6% dos casos nos quais existe infertilidade ou dois ou mais abortos.

Gestação em uma mulher em idade avançada – existe o risco aumentado de

anomalias cromossômicas nos fetos concebidos por mulheres com mais de 35 anos. A

análise cromossômica fetal deveria ser oferecida como parte da rotina dos cuidados

pré-natais nessas gestações.

7.4. Métodos de Análise Cromossômica

Os 24 cromossomos encontrados no genoma humano podem ser prontamente

identificados citologicamente por uma série de procedimentos específicos de

coloração. Estes procedimentos também são úteis no diagnóstico de diversos

transtornos cromossômicos, tais como: translocações, deleções, inversões e

duplicações cromossômicas. As técnicas de bndeamento cromossômico

rotineiramente utilizadas são:

7.4.1. Técnicas de citogenética clássica

Os cromossomos são estudados coletando-se um tecido vivo (geralmente sangue),

cultivando-se o tecido pelo tempo apropriado (em geral de 48 a 72 horas para

linfócitos), adicionando-se colchicina para produzir o bloqueio metafásico, isolando-se

as células e colocando-as em uma lâmina, rompendo a membrana nuclear com uma

solução salina hipotônica, corando com um corante específico de cromossomos e

fotografando as “metáfases” de cromossomos na lâmina.As fotografias são então

recortadas e os 2 pres de cromossomos autossomos são dispostos de acordo como

seu tamanho, ficando os cromossomos sexuais a direita. Esta arrumação dos

cromossomos é denominada cariótipo.

Bandeamento G - Os cromossomos são tratados inicialmente com tripsina (para

desnaturar as proteínas) e depois submetidos à coloração pelo Giemsa. As bandas G,

que aparecem escuras, contêm DNA rico em regiões AT. Este é o método de

coloração comumente utilizado em laboratórios de análise citogenétcia.

Bandeamento Q - Quando os cromossomos são tratados com quinacrina, desenvolve

um padrão específico de bandas escuras intercaladas com outras brilhantes (Q), que

são de fácil identificação em um microscópio de fluorescência. As bandas Q coincidem

quase que exatamente com as bandas G, de modo que também são ricas em

seqüências AT.

Bandeamento R - Neste caso, os cromossomos são submetidos ao calor antes da

coloração pelo Giemsa, o que resulta num padrão de bandas escuras (bandas R) e

claras, ao contrário do obtido com os bandeamentos G e Q. A análise molecular das

bandas R mostra uma maior proporção de seqüências C-G.

Bandeamento C - Este método cora de maneira específica àquelas porções da

cromatina que permanecem, também, condensadas na interfase, como por exemplo, a

heterocromatina constitutiva dos centrômeros.

Padrão de banda de alta resolução - Este tipo de padrão de bandas é obtido através

de técnicas de padrão de bandas G ou R para corar os cromossomos que foram

obtidos em um estágio inicial da mitose (prófase ou prómetafase), quando eles ainda

se encontram em um estado relativamente não condensado. O padrão de bandas de

alta resolução é especialmente útil quando se suspeita de anomalia estrutural sutil de

um cromossomo.

7.4.2. Técnicas de citogenética molecular

Hibridização in situ com fluorescência (FISH) - Esta técnica permite examinar a

presença ou ausência de uma seqüência específica de DNA ou para avaliar o número

ou a organização de um cromossomo ou de uma região cromossômica. O princípio

básico consiste em adicionar um corante fluorescente a uma sonda de DNA, de modo

que, quando a sonda marcada hibridiza-se a seu cromossomo complementar em uma

dispersão metafásica, ele fluoresce se visto sob luz ultravioleta. As sondas

normalmente utilizadas são de seqüências genômicas únicas, que irão hibridizar-se a

uma região complementar no cromossomo. Estas sondas de seqüências únicas são

extremamente úteis para detectar anomalias sub-microscópicas tais como as

microdeleções.

Cariotipagem espectral (SKY) - A técnica de FISH foi ampliada usando-se sondas

múltiplas, cada uma marcada com uma cor diferente, de modo que várias anomalias

numéricas ou estruturais podem ser testadas simultaneamente na mesma célula. Além

disso, novas técnicas como a cariotipagem espectral, usando combinações variadas

de cinco sondas fluorescentes diferentes em conjunto com câmeras especiais e

programas de processamento de imagens, de modo que cada cromossomo é corado

de um modo único (“pintado”) para pronta identificação. Tais imagens são

especialmente úteis na identificação de rearranjos cromossômicos.

Hibridização genômica comparativa (CGH) - Esta extensão da tecnologia FISH pode

ser usada para demonstrar a presença de grandes deleções cromossômicas ou

duplicações em tecidos como tumores sólidos que não podem ser submetidos à

análise cromossômica convencional. Essencialmente a CGH envolve a hibridização

competitiva de uma mistura de DNA-teste da amostra diagnóstica e o DNA normal de

uma amostra controle com cromossomos metafásicos humanos normais. O DNA-teste

é marcado com um corante verde e o DNA controle com um corante vermelho. Se a

amostra de teste contiver mais ou menos DNA de uma determinada região

cromossômica que o DNA-controle, isto é revelado por um aumento ou diminuição da

proporção verde para vermelho, conforme revelado pela imagem processada pelo

computador. A complexidade tecnológica deste método, acoplada a seu custo,

significa qeu seu uso tende a ser limitado aos estudos das anomalias cromossômicas

de tumores.