Fundação Centro de Ciências e Educação Superior a Distância do Estado do Rio de JaneiroCentro de Educação Superior a Distância do Estado do Rio de Janeiro

Alexandre de Abreu Rodrigues

Bioquímica I

Relatório de Aula Pratica - 2

Cinética Enzimática

2015/1

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SUMÁRIO

Enzimas

1.1 Introdução

1.2 Experimento I

- Material- Objetivo- Procedimentos- Resultado

1.3 Experimento II - Material- Objetivo- Procedimentos- Resultado

1.4 Experimento III

- Material- Objetivo- Procedimentos- Resultado

1.5 Experimento IV

- Material- Objetivo- Procedimentos- Resultado

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1.1 Introdução

Enzimas

Biomoléculas de origem proteica que interferem na velocidade de reações orgânicas. Funcionam como catalizadores, diminuindo a energia necessária para que uma reação comece.

Divide-se em duas partes: não proteica – cofator – e proteica – apoenzima –, se o cofator for uma molécula orgânica chama-se coenzima.

A enzima se liga ao substrato através de seu sitio ativo, é este encaixe, que promove a especificidade da enzima. Quando se forma o complexo enzima substrato a enzima inicia sua atividade, este complexo é instável, e quando se desfaz são liberados os produtos e a enzima que na presença de outro substrato continuará agindo.

Existem alguns fatores que interferem diretamente nas reações enzimáticas, podendo favorecer ou prejudicar as reações. Assim como são especificas para substratos, as enzimas tem um pH e temperatura ideais para que atuem com máxima eficiência, além disto, algumas substancias quando presentes no meio podem inibir a ação enzimática – solventes orgânicos, detergentes, ureia e guandina.

1.2 Experimento I – Tempo de Reação

Material 1 pacote de gelatina sem sabor 700 ml de Água10 ml de Suco de abacaxi4 tubos cônicos (falcon) de 50 mlBéquer (600 ml)Caneta de retroprojetorEstante para tubosProveta de 10 mlPipeta de 5 ml1 cronômetro ou relógioBico de Bunsen ou placa de aquecimentoBanho-mariaGeladeira

Objetivo

Calcular o volume da gelatina hidrolisada. Representar os resultados em um gráfico que correlacione o volume de gelatina hidrolisada com o tempo de reação.

Procedimento

1. Preparo da gelatina sem sabor: Dissolva um pacote de gelatina sem sabor em 250 ml de água fervente. Após dissolver a gelatina adicione 250 ml de água gelada. Essa gelatina estará numa temperatura ideal para iniciar o experimento (cerca de 30 °C).

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2. Rotule 4 tubos falcon de 50 ml: C (controle)S30 (suco de abacaxi, com 30 min de reação)S60 (suco de abacaxi, com 60 min de reação)S90 (suco de abacaxi, com 90 min de reação)

3. Adicione 10 ml de gelatina nos 4 tubos. Leve à geladeira por 30 minutos. Retirar da geladeira quando a gelatina estiver no estado gel e esperar até que as amostras se equilibrem à temperatura ambiente.

4. Adicione 3 ml de água (temperatura ambiente) ao tubo C e mantenha-o em uma estante à temperatura ambiente. 5. Adicione 3 ml de suco de abacaxi (temperatura ambiente) aos tubos restantes e mantenha-os em uma estante à temperatura ambiente.

6. Após 30 min, descarte a parte líquida do tubo S30, lave a superfície da gelatina com o auxílio de um piscete de água e deixe-o secando, emborcado sobre um pedaço de papel toalha.

7. Após 60 min, repita o procedimento descrito na etapa “6” para a amostra no tubo S60

8. Após 90 min, repita o procedimento descrito na etapa “6” para as amostras nos tubos S90 e C.

9. Aqueça a gelatina em um banho-maria a 40 °C e transfira o líquido para uma proveta de 10 ml – anote o volume da gelatina remanescente.

Resultado

O experimento não ocorreu de acordo com o esperado, pois a temperatura e outros fatores não conhecidos influenciaram na textura do substrato, não podendo ser quantificado o volume de produto produzido, em consequência não fornecendo dados para confecção do gráfico.

A proposta do experimento teria como ponto de partida a avaliação da maneira de como os volumes iniciais de produto, variam com o tempo na presença de uma quantidade fixa de enzima. Medindo-se a quantidade de produto formado durante três períodos de tempo total de reação (30, 60 e 90 min) e lançando-se os valores aferidos, na tabela fornecida pelo roteiro e posteriormente representando os valores em um gráfico.

Portanto teoricamente, deveríamos observar nesse experimento que as enzimas se regeneram ao fim de cada ciclo de reação, de forma que não importa à quantidade de substrato, a enzima continuara atuando na transformação do substrato em produto, ou seja, uma pequena quantidade de enzima pode transformar qualquer quantidade de substrato em produto, demandando apenas de mais ou menos tempo para que seja formada uma quantidade maior ou menor de produto.

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1.3 Experimento II – Efeito do pH na atividade da Amilase Salivar

• Material

4 biscoitos cream-cracker,4 pipetas Pasteur,Saliva,Solução de iodo,Água,Vinagre,Solução de bicarbonato de sódio, (Solução de bicarbonato de sódio: adicione 1 colher de

café de NaHCO3 em 10 ml de água, misture, deixe decantar e utilize a solução).4 placas de Petri,Almofariz,4 mexedores de café,1 cronômetro.

Objetivos

Comparar a cor obtida nas amostras, no início e no final do experimento. Verificar se houve ou não mudança de cor. (A solução de iodo mudou de cor em todas as amostras? Por quê?).

Procedimentos

1. Identifique as placas de Petri de acordo com a condição experimental: “controle”, “água”, “vinagre” e “bicarbonato”.

2. Triture 1 biscoito com o almofariz e deposite na placa identificada como “controle”.

3. Mastigue 1 biscoito e deposite em uma das placas, com cuidado para que se forme uma massa homogênea a úmida; repita o procedimento com outros dois biscoitos.

4. Adicione água na amostra de biscoito triturado (“controle”), aos poucos, até obter uma pasta de consistência semelhante à dos biscoitos que foram mastigados. Anote o tempo do cronômetro.

5. Em cada placa, adicione e misture bem:Placa A: 1 ml de águaPlaca B: 1 ml de vinagre ePlaca C: 1 ml de solução de bicarbonato de sódio

6. Após 30 min, pingue de 3 a 5 gotas de solução de iodo em cada placa e anote a cor.

Resultado

Sabemos que a Amilase Salivar ou Ptialina atua na boca em meio com pH 6,7, próximo do básico. Trata-se de uma enzima que atua em polissacarídeos degradando em moléculas de maltose.

O Iodo, em nosso experimento, por reagir com amido, foi utilizado como indicador da presença deste, desta forma também indicara a atividade enzimática em cada amostra.

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Assim podemos observar o iodo nas amostras:

1. Controle: nesta amostra o iodo ficou bem escuro, por não ter nenhum tipo de enzima agindo, ele indica uma grande quantidade de amido;

2. Água: a água adicionada não altera muito o pH da amostra, desta forma a amilase continua atuando, porém o iodo encontra-se escuro (um pouco menos que a amostra 1), indicando que ainda existe uma grande quantidade de amido na amostra, ou seja, a amilase atua mas não em sua atividade máxima ou ótima;

3. Vinagre: o vinagre acidifica (protona) o meio, sabemos que a amilase salivar atua em pH 6,7, e que o pH é um fator limitante para a atuação das enzimas, o iodo desta amostra esta bem escuro demonstrando que há uma grande quantidade de amido, ou seja, a amilase não realizou a quebra do amido.

4. Bicarbonato de sódio: o bicarbonato de sódio tem um pH alto, básico, nesta amostra o iodo ficou bem claro (castanho), indicando a pouca quantidade de amido, ou seja, a amilase atuou bem, degradando o amido em maltoses.

1.3 Experimento III – Efeito da concentração de substrato na reação da Bromelina

Material

Leite em pó,10 ml de suco natural de abacaxi,100 ml de água,5 placas de Petri,5 tubos de ensaio,5 mexedores de café,1 pazinha de plástico grande,1 espátula,Caneta de retroprojetor,Estante para tubos,Proveta de 10 ml,1 pipeta automática 1ml,1 cronometro ou relógio,Balança.

Objetivo

Verificar o quanto a concentração de enzimas pode alterar a velocidade das reações enzimáticas.

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Procedimentos

1. Anote nas tampas das placas de petri as condições experimentais com os seguintes códigos: use números para identificar a quantidade de leite utilizada (ver item 2) e a letra C para as amostras Controle (onde será adicionado apenas água) e E para as amostras que terão Enzimas (onde será adicionado o suco de abacaxi):

6C e 6E 8C e 8E 10C e 10E

2. Utilizando as placas de petri (cuidado para não usar a tampa), pese o leite em pó: 6, 8 e 10 gramas nas respectivas placas. As placas 6C e 6E conterão 6 gramas de leite cada; 8C e 8E, terão 8 gramas, e as placas 10C e 10E terão 10 gramas de leite.

3. Com o auxílio de uma proveta, coloque 9 ml de água em cada placa. Misture bem, com cuidado para não derramar o leite ou a água, utilizando a espátula de plástico mais larga, até que se forme uma massa homogênea. Tampe a placa. Atenção: As placas devem ficar tampadas durante todas as etapas do experimento para evitar evaporação de água.

4. Adicione 1 ml de água nas placas identificadas como controle (C) e misture bem. Acione o cronômetro na primeira adição e anote o tempo no qual foi feita cada adição.

5. Adicione 1 ml de suco de abacaxi nas placas identificadas como enzimas (E), misture bem e anote o tempo inicial de cada adição.

6. A cada 5 minutos, passe a pazinha de plástico pequena no fundo de cada uma das placas e observe a consistência do leite. Se você perceber que a linha de separação feita no meio da placa demora a voltar a fechar, passe a medir o tempo a cada 1 minuto!

7. Quando formar uma canaleta na massa de leite, que não retorna à sua posição inicial vamos considerar como o fim da reação. Anote o tempo necessário para isso ocorrer em cada uma das placas. Atenção: o padrão de separação da massa deve ser o mesmo para todas as amostras.

Resultado

A bromelina atua nas ligações peptídicas da caseína do leite, hidrolisando, provocando uma tendência à solidificação da mistura. O experimento não ocorreu de acordo com o esperado, pois a temperatura e outros fatores não conhecidos influenciaram no resultado.

Era esperado do experimento que, devido à concentração da enzima ter sido constante, seria observado que ao aumentarmos a concentração dos substratos na reação, maior seria a atividade da enzima. Ou seja, a placa 10E, que tinha 10gr de substrato, tem um tempo de reação mais rápido que a placa 8E, que tem 8gr de substrato, e esta consequentemente mais rápido do que a 6E, que tem 6gr de substrato, assim sendo, a velocidade da reação se demonstrou crescente com adição de substrato até a saturação da enzima.

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1.4 Experimento IV – Desnaturação térmica da Bromelina

Material 10 ml de Suco de abacaxi10 tubos de ensaio ou tubos falconBéquer (250 ml)Caneta de retroprojetorEstante para tubos1 pregador para tubosProveta de 10 mlPipeta de 2 ml1 cronômetro ou relógioBico de Bunsen ou placa de aquecimentoBanho-mariaGeladeira

ObjetivoO que aconteceu com a gelatina nos tubos com água? E com os tubos com suco de abacaxi?

Por que a consistência da gelatina mudou em alguns tubos e em outros, não?

Procedimentos

1. Ferva 100 ml de água em um béquer de 250 ml e coloque um tubo contendo 5 ml de suco de abacaxi dentro do béquer, com o auxílio de um pregador para tubos, por 5 minutos. Coloque o tubo em uma estante sobre a bancada e espere atingir a temperatura ambiente (se quiser, coloque o tubo na geladeira para acelerar o processo de resfriamento, mas espere esfriar um pouco para que não quebre com o choque térmico).

2. Numere os tubos, colocando a letra C para o controle e a letra E para as amostras que terão enzima: C, 1E e 2E.

3. Coloque 2 ml de água no tubo C (controle).4. Coloque 2 ml de suco de abacaxi (não fervido) no tubo 1E.5. Coloque 2 ml de suco de abacaxi fervido no tubo 2E.6. Utilizando a proveta, coloque 10 ml de gelatina em cada tubo.7. Agite os tubos com cuidado para que a gelatina se misture de forma homogênea à solução contida no tubo.8. Leve os tubos à geladeira e aguarde cerca de 30 min*.

*O tempo exato não é possível prever porque depende da temperatura de cada geladeira; o tempo do experimento será aquele necessário para a amostra 1C endurecer. Retire os tubos da geladeira e observe o aspecto da gelatina em cada tubo.

ResultadoAtravés do experimento foi observado que o tubo contendo suco de abacaxi fervido

(2E), a bromelina não teve uma reação efetiva sobre a gelatina, pois foi desnaturada pela fervura e teve suas ligações rompidas, permitindo que a gelatina assumisse o estado (gel), enquanto o tubo contendo suco de abacaxi não fervido (1E) assumiu o estado (Sol),

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demostrado que a bromelina efetivou sua catalise, pois se encontrava em condições ótimas para executar suas funções, hidrolisando a gelatina (substrato). O tubo (C) assumiu o estado (gel), pois não possuía nenhuma enzima para catalisar a reação, atuando na função de controle.

Discussão:Através dos experimentos realizados podemos observar que as enzimas devem estar em

condições apropriadas para que efetivem suas funções, pois as alterações de tempo, temperatura, concentrações e pH influenciam diretamente a velocidade das reações e em alguns casos deixando a reação de ser efetiva.

Bibliografia:

LEHNINGER, Albert L. Princípios de bioquímica. 4ed: São Paulo. Sarvier, 2006; MARIOTO, Juliana Ribeiro; ESTÁGIO DE DOCÊNCIA – Cinética

Enzimática. Julho 2006; DA POIAN, Andreia. Bioquimica I. v. 2/ Andreia Da Poian; Debora Foguel;

Marílvia Dansa-Petretski; Olga Tavares Machado; Ana Paula Abreu-Fialho. – 5 ed. Ver. – Rio de Janeiro: Fundação CECIERJ, 2007.

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