UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

BACHARELADO E LICENCIATURA EM QUÍMICA

BIOQUIMICA APLICADA

DETERMINAÇÃO DA ENZIMÁTICA DA AMILASE SALIVAR

DISCENTES: MAXSUEL RIBEIRO SILVA

JOSEPH

CUIABÁ/MT2013

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

BACHARELADO E LICENCIATURA EM QUÍMICA

BIOQUIMICA APLICADA

DETERMINAÇÃO DA ENZIMÁTICA DA AMILASE SALIVAR

Relatório referente à disciplina Bioquímica Aplicada, do curso de bacharelado e licenciatura plena em Química, ministrado pelo Prof. Msc. Mayara Peron Pereira, como nota parcial para conclusão da disciplina.

DOCENTE: PROF. MSC. MAYARA PERON PEREIRA

CUIABÁ/MT2013

Introdução

O método utilizado na determinção da atividade enzimatica é o Somogyi Nelson, foi desenvolvido e adaptado na década de 40 e 50 pelos bioquímicos Michael Somogyi e Norton Nelson, inicialmente utilizado para detecção de açúcar no sangue, hoje é um método muito empregado no setor sucroalcooleiro para quantificação do teor de açúcar redutor, fornecendo resultados confiáveis e precisos.

O método consiste analise quantitativa por fotometria de absorção molecular do Mo2O7, que em função das condições impostas pelo método é proporcional a quantidade do açúcar redutor presente na amostra.

2 - Fundamentações Teóricas

O amido é um polissacarídeo que tem como função biológica primaria nos vegetais a reserva energética, é armazenado nas células “parênquima amilífero”. Formado por unidades de glicose polimerizadas por ligações glicosídicas α 1-4, podem ser encontrados na forma de dois principais grânulos; a amilose e amilopectina, a amilose não apresenta ramificações e apresenta estrutura helicoidal, já a amilopectina, possui uma estrutura ramificada similar ao glicogênio, porém com ramificações mais espaçadas, a cada 24-30 moléculas de glicose, as ramificações são realizadas por ligações do tipo 1-6(figura 1).

A amilase salivar é uma enzima especifica para hidrolise das ligações glicosídicas α 1-4, o tratamento do amido com a amilase salivar produz glicose ou oligômeros.

Os açucares são classificados em redutores e não redutores, o grupo redutor corresponde ao grupo hemiacetal, um carbono ligado a “OH” e “OR” (no caso da glicose o carbono um, quando no estado cíclico, figura 2a), os hemiacetais são caracterizados por estarem em equilíbrio termodinâmico com a forma “ceto” e “Aldo” (Aldo no caso da glicose). Ocorre que com a polimerização das unidades de glicose (ligações glicosídicas α 1-4) para formação das moléculas de amido, esses grupos hemiacetais são convertidos em grupos acetais (carbono ligado ao simultaneamente a ois grupo “OR”) restando apenas um único grupo redutor em uma das extremidades da cadeia

Figura 1

. Figura 2

A estratégia utilizada nesse experimento para a determinação relativa da atividade da enzima amilase salivar foi a quantificação do açúcar redutor, sendo que com a hidrolise de cada ligação glicosídica α 1-4 catalisada pela amilase, mais um grupo redutor é formado, tendo-se assim uma proporção direta do teor de açúcar redutor com a atividade enzimática. O método utilizado é o de Somogyi Nelson, que consiste no reativo Somogyi (solução cupro-alcalina) fundamentado na propriedade que os açucares redutores apresentam em reduzir o Cu2+(íon cúprico) em Cu1+(íon cuproso). Os açucares redutores reduzem o íon cúprico presente no reativo somogyi, a íon cuproso, que é convertido em oxido cuproso, que reduz o composto arsênio-molibdica, para oxido molibdênio (Mo2O7), figura 3, de coloração azul de molibdenio, cuja intensidade de cor é proporcional a quantidade de açúcar redutor existente na amostra podendo assim ser mensurado colorimetricamente em espectrofotometria. No experimento em questão foi utilizado um espectrofotômetro para determinação da absorbância em 510nm.

3 - Objetivo

Determinar o pH e a temperatura em que a atividade enzimática da amilase salivar é máxima.

4 - Materiais

Tubos de ensaio de 10ml; Becker de 20ml; Pera; Micro pipeta; Pipetas de 1, 5 e 10ml; Forno para banho de Maria de de 45, 60 e 100°C; Refrigerador ajustado para 4 °C;

5 - Reagentes

Solução de saliva em NaCl (5mM) na proporção 1:5 (v/v); Solução tampão fosfato 0,1M, pH 6,8; Solução tampão acetato 0,1M, pH 4,0; Solução tampão glicina 0,1M, pH 9,5; Solução amido 1%; Solução amido 5%; Solução cupro-alcalina; Solução arseno-molibdica.

6 - Metodologia

Os procedimento realizados podem ser divididos em duas etapas, uma para determinação do pH ótimo da atividade enzimática e outra para determinação da temperatura ótima da atividade enzimática.

6.1 - Determinação do pH ótimo

Em um béquer de 20ml foi preparado a solução de saliva com a adição de saliva e solução de NaCl (5mM) na proporção de 1:5 (v/v), com as demais soluções utilizados no experimento previamente preparadas por outra equipe, foram preparados uma serie de sete tubos de ensaio para determinação da atividade enzimática em função do pH, conforme apresentado na tabela1.

tubos

tampão fostato

0,1M (pH 6,8)

Tampão acetato

0,1M (pH 4,0)

tampão glicina

0,1M (pH 9,5)

Água solução

amido 1%solução saliva

1a --- 1mL --- 1,5mL --- 0,1ml2a --- 1mL --- 1,25 0,25mL 0,1ml3a --- 1mL --- 1,25 0,25mL 0,1ml4a 1mL --- --- 1,25 0,25mL 0,1ml5a 1mL --- --- 1,25 0,25mL 0,1ml6a --- --- 1mL 1,25 0,25mL 0,1ml7a --- --- 1mL 1,25 0,25mL 0,1ml

Tabela 1

Nos tubos 2a, 4a e 6a, imediatamente após a adição de todos os componentes listados na tabela 1, foram adicionados 1ml de solução cupro-alcalina e incubado a banho Maria com temperatura de 100°C por 8 minutos.

Os tubos 1a, 3a, 5a e 7a, foram incubados em banho Maria com temperatura de 45°C por 10 minutos, imediatamente após a adição de todos os componentes, em seguida acrescentou-se aos tubos 1ml da solução cupro-alcalina, incubando-os em banho Maria com temperatura de 100°C por mais 8minutos. Sequencialmente todos os tubos foram resfriados em água corrente e adicionado em cada um deles 1ml da solução arseno-molibdica e 6,5ml de água destilada. Finalizando com a determinação de absorbância em 510nm.

6.2 - Determinação temperatura ótima

Para determinação da atividade enzimática em função do temperatura foram preparados uma serie de oito tubos de ensaio, conforme apresentado na tabela2.

tubos tampão fostato 0,1M (pH 6,8) Água destilada solução amido 0,5%

1b 1,5mL

2b 1mL 1,25 0,25mL

3b 1mL 1,5

4b 1mL 1,25 0,25mL

5b 1mL 1,5

6b 1mL 1,25 0,25mL

7b 1mL 1,5

8b 1mL 1,25 0,25mLTabela 2

Imediatamente após de todos os componentes listados na tabela 2 serem adicionados, os tubos foram submetidos a 10 minutos de incubação em banho Maria com diferentes temperaturas; 1b e 2b a temperatura ambiente (25 °C), 3b e 4b a temperatura de aproximadamente 4 °C, 5b e 6b a temperatura de 45°C e os tubos 7b e 8b a temperatura de 60°C, após os 10 minutos de incubação adicionou-se aos tubos 0,1ml da solução de saliva, incubando novamente em suas respectivas temperaturas, em seguida adicionou-se aos tubos 1,0mL da solução cupro-alcalina, agitando bem e incubando todos os tubos em banho Maria com temperatura de 100°C por 8 minutos, em seguida os tubos foram resfriados em água corrente e adicionou-se em cada tubo 1,0mL de solução arseno-molibdica e 6,5mL de água destilada. Finalizando com a determinação de absorbância em 510nm.

7 - Resultados e Discussões

Os resultados podem ser divididos nos referentes a determinação do pH ótimo e na temperatura ótima.

7.1 – Determinação pH ótimo

As medidas de absorbância para os tubos de ensaio preparados para determinação do pH ótimo da atividade da enzima amilase salivar, estão apresentadas na tabela3 e gráfico 1.

Determinação pH ótimo

Tubos Absorbância

1a 02a 0,06523a 0,12154a 0,01165a 0,01866a 0,02447a 0,0145

Tabela 3

A incubação dos tubos a 100°C tem a finalidade de cessar a atividade da amilase com a sua desnaturação, de forma que a analise da sua atividade sejam referentes unicamente às condições em que estavam submetidas antes dessa incubação.

1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

pH 4

pH 4

pH 4

pH6,8pH6,8 pH9,5

pH9,5

Absorbância X pH

pH

abso

rbân

cia

gráfico 1

Os tubos 2ª, 4ª e 6ª foram incubados a 100°C após as adições dos reagentes, logo a hidrolise do amido nesses tubos, em tese é nula, pois a amilase foi desnaturada de imediato. As soluções desses tubos correspondem aos brancos na determinação da absorbância para cada condição de pH (2a→3a, 4a→5a, 6a→7a), tendo em vista que são soluções que contem todos os componentes da solução problema, menos o analito ( açucar redutor, produto da catalise enzimática). De posse desses conceitos, constata-se a seguinte incoerência dos dados experimentais; o tubo 6a condicionado ao pH9,5, que em tese não deveria ocorrer atividade enzimática (enzima desnaturada de imediato), obteve-se valor de absorbância maior que o observado tubo 7a, onde a amilase não foi desnaturada de imediato.

A inferência da maior atividade enzimática em função da pH, assim com em função da temperatura, está fundamentada (conforme descrito na fundamentação teórica )na

proporcionalidade da atividade enzimática em condições controladas de temperatura de pH, com o valor da absorbância descontando a absorbância do respectivo branco, gráfico 2.

3a-2a 5a-4a 7a-6a

-0.02-0.01

00.010.020.030.040.050.060.07

0.0563

0.007

-0.009900000000

00001

Absorbância X pH

pH

Abso

rbân

cia

gráfico 2

7.2 – Determinação Temperatura Ótima

As medidas de absorbância para os tubos de ensaio preparados para determinação da temperatura ótimo da atividade da enzima amilase salivar, estão apresentadas na tabela4 e gráfico 3.

Determinação Temperatura ótima

Tubos Absorbância1b 02b 0,0043b 0,00454b 0,04415b 0,01496b 0,02547b 0,0278b -0,0059

Tabela 4

Para determinação da temperatura ótima usou-se o mesmo princípio adotado para determinação do pH ótimo; para cada condição de temperatura tem-se dois tubos, um deles sem o produto derivado da catalise enzimática do amido (logo o branco para essa condição de temperatura), porém a ausência desses produtos se deu pela não adição do amido e não pela desnaturação imediata da amilase.

1b 2b 3b 4b 5b 6b 7b 8b-0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

25°C25°C 4°C

4°C

45°C

45°C 60°

60°C

Absorbância X temperatura

temperatura

Abs

orbâ

ncia

gráfico 3

Assim como nas medidas fotométricas dos tubos preparados para determinação do pH ótimo, incoerência de valor de absorbância maior em soluções em que não devia ocorrer atividade enzimática podem ser observadas nas medidas de absorbância dos tubos 7b-8b (tabela4).

A inferência relativa da atividade enzimática em função da temperatura pode ser observado no grafico4.

2b-1b 4b-3b 6b-5b 8b-7b

-0.04-0.03-0.02-0.01

00.010.020.030.040.05

0.004

0.0396

0.0105

-0.0329

Absorbância X Temperatua

temperatura

Abso

rbân

cia

gráfico 4

8 – Conclusão

De acordo com os dados experimentais o pH=4 e a temperatura igual a 4°C é o ph e temperatura em que a enzima tem maior atividade. Porém em virtude das discrepâncias observadas nas medidas de absorbâncias, a confiabilidade desses resultados é reduzida significativamente, a ponto de caracterizar o experimento como insatisfatório na obtenção do seu objetivo principal. A causa mais provável para esse fato são falhas operacionais, sendo que o método utilizado é muito empregado e consagrado pela sua eficiência.

Referencias Bibliográficas

SOMOGY, M. A New Reagent for Determination of Sugars. A new Sugar Reagent,

May p. 61 — 68, 1945.

Métodos Analíticos Fermentec – Versão 2003 e 2012.

Skoog, Douglas “Fundamentos de Química Analitica”, tradução da 8ª edição norte-americana, editora Thomson.