Universidade Federal de So Paulo Campus Diadema

Anlises Toxicolgicas: EXTRAO E IDENTIFICAO DE AFLOTOXINAS EM AMENDOIM POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA.

Resumo Este experimento teve como objetivo a determinao de aflatoxina B1 em amostras de paoca. Para que tal determinao fosse possvel, primeiramente foi realizado o preparo da amostra e, em seguida, a mesma foi submetida a analise pela tcnica de cromatografia em camada delgada.

Objetivos Analisar amostras de paoca da marca Tekinha e avaliar a presena de aflatoxinas.

IntroduoAs aflatoxinas so micotoxinas produzidas por fungos do gnero Aspergillus e contaminam principalmente alimentos que so armazenados sob a forma de gros como o amendoim e o milho.Dentre as aflatoxinas mais importantes destaca-se a aflatoxina B1. Esta aflatoxina possui elevada hepatoxicidade e grande capacidade de se concentrar em substratos, alm disso, tem uma estrutura qumica que lhe permite sofrer bioativao atravs do citocromo p450 o que acarreta na formao de metablitos com potencial carcinognico.[4]Devido a sua toxicidade necessrio que alimentos que possam conter aflatoxinas passem por um controle de qualidade antes de serem comercializados. Amostras desses alimentos podem ser analisadas por uma tcnica de triagem simples e rpida, a cromatografia em camada delgada. Esta tcnica consiste em separao e identificao de compostos atravs da diferena de polaridade entre a fase estacionria (placa de slica ou alumina) e a fase mvel (mistura de solventes ou um nico solvente). A placa obtida nesta anlise ento examinada em luz UV.Quando expostas irradiao ultravioleta, as aflotoxinas emitem diferentes fluorescncias, sendo que a aflatoxina B1 emite fluorescncia azul, o que permite sua identificao.[5]

Materiais e Mtodos Materiais: -Soluo de KCl 4%-Metanol-Liquidificador-Celite-Soluo de CuSO4 a 10%-Clorofrmio-Placas de CCD-Cuba cromatogrfica-Lmpada UV-Capilares-Vidrarias: Funil de separao, bquer e Erlenmeyer. Mtodos: Foram pesados 50g de paoca em um bquer e foram adicionados 270mL de metanol e 30mL de soluo de KCl 4%. Em seguida, a mistura foi transferida para o liquidificador e homogeneizada por 5 minutos. Aps a homogeneizao, a mistura foi filtrada com papel de filtro pregueado, sendo recolhido cerca de 150mL do extrato filtrado. Durante esta etapa foi necessrio que o papel de filtro fosse trocado devido a grande quantidade de partculas da mistura. A esse extrato foram adicionados 150mL de soluo de CuSO4 a 10% (clarificante) e 5g de Celite. A mistura foi agitada e novamente filtrada com papel de filtro. Durante esta etapa foi necessrio que o papel de filtro fosse trocado devido grande quantidade de partculas produzidas atravs da floculao com o Celite. Cerca de 150mL de filtrado foi transferido para um bquer e adicionou-se 150mL de gua ao bquer. Essa mistura foi dividida em 2 funis de separao, e a cada funil de separao foram adicionados 10mL de clorofrmio (1 extrao). Procedeu-se com a extrao normalmente e a fase orgnica foi recolhida. fase aquosa foram adicionados novamente, 10mL de clorofrmio (2 extrao), sendo recolhida novamente a fase orgnica. Esse procedimento de dividir a mistura em 2 funis de separao foi necessria pois no havia funil de separao maior, compatvel com um volume final superior a 300mL.

As fases orgnicas recolhidas foram transferidas para um Erlenmeyer de 50mL e todo seu volume foi evaporado secura em banho de gua a 80C durante 24 horas. Em seguida o extrato foi conservado em geladeira para que na semana seguinte fosse feita a leitura por CCD. Na semana seguinte, ao extrato seco foram adicionadas algumas gotas de clorofrmio para que pudesse ser feita a aplicao na placa de CCD. Foram aplicados em torno de 2mL da soluo. Aps cerca de 15 minutos na cuba cromatogrfica, com fase mvel de Tolueno : Acetato de Etila : cido Frmico (60:30:10), a placa foi lida sob luz UV.

Resultados e DiscussoAmostra analisada:

Paoca rolha TekinhaLote: 0210041109Val: 31/05/2014

Sendo a aflatoxina b1 um composto apolar, a adio de metanol (solvente de polaridade intermediria) e soluo de KCl 4% paoca foi para remover parte dos interferentes polares. Mas principalmente, para ajudar a eliminar parte dos interferentes apolares como a gordura natural (cidos graxos) presente do alimento. A homogeneizao mecnica em liquidificador foi necessria para que a eliminao descrita anteriormente fosse eficaz. Ao adicionar a soluo de clarificante (CuSO4 a 10%) e o Celite, foi obtido uma mistura floculada. O Celite uma celulose modificada que tem como objetivo flocular gorduras e protenas presentes na amostra, fornecendo dessa forma um extrato livre desses interferentes. No nosso caso, o principal motivo para usar o Celite eliminar a maior quantidade possvel de gordura para que durante a anlise esta no seja um interferente em potencial. A soluo de CuSO4 a 10% auxilia na floculao aumentando o tamanho do floculado formado, garantindo que a filtrao em papel de filtro seja eficaz.

A extrao foi realizada com clorofrmio, pois esse solvente possui carter intermedirio apolar, fazendo com que a aflatoxina tenha afinidade com este solvente. A extrao feita em duas etapas, pois no equilbrio a relao das concentraes do soluto nas duas fases aproximadamente constante, independentemente da concentrao total. Esta relao conhecida como coeficiente de partio. Dessa forma, a realizao de vrias extraes possibilita que muito mais soluto seja extrado do que fazendo apenas uma extrao. Entretanto, no se deve aumentar indefinidamente o nmero de extraes para obter melhores resultados como mostrado no grfico abaixo: [1] Grfico 1: Resultados de extraes mltiplas.

Ou seja, a partir de 5 extraes a eficincia do Total extrado no to significativa quando compara-se com a eficincia de Resduo no extrado e ainda existe a problemtica do tratamento de resduos, que acaba tornando o procedimento mais caro. Dessa forma, padroniza-se a utilizao de 2 extraes e caso seja necessrio, avaliando-se prs e contras, aumenta-se em at no mximo 5 extraes. A evaporao at a secura do extrato tem como objetivo concentrar a alquota para que a leitura na CCD seja mais eficaz.

A anlise realizada foi qualitativa, ou seja, apenas para verificar a presena ou ausncia da aflatoxina b1 na amostra atravs da comparao visual dos Rf da amostra e do padro de aflatoxina B1. Na cromatografia em camada delgada, quando o solvente percorre uma distncia L cm, o soluto, espalhado como uma banda percorre uma distncia menor, chamada de D cm. D/L , para uma dada substncia sob condies especficas, uma constante, independente da quantidade relativa da substncia ou de outras substncias presentes. A razo D/L chamada valor de Rf para aquela substncia sob aquelas condies experimentais: [2]

Sob luz ultravioleta, foi possvel visualizar uma fluorescncia azul caracterstica da presena da Aflatoxina B1 no padro, sob o Rf de 0,27. Este Rf compatvel com o que era esperado, Rf = 0,25 (ou hRf = 25).

A estrutura da aflatoxina b1 sugere que ela um composto cromforo que absorve luz UV devido presena de: tomos de oxignio, ligaes duplas conjugadas, anel aromtico e carbonilas. Sendo, portanto, possvel visualiz-la como uma fluorescncia azul sob luz UV.

Figura 1: Estrutura da Aflatoxina B1 [3]Era esperado que fosse possvel identificar uma mancha semelhante apresentada pelo padro, na amostra que foi aplicada. Entretanto, isso no aconteceu. Foi observada uma mancha escura que foi identificada como sendo sujeira inerente a amostras de alimentos. Sob luz ultravioleta no foi observada nenhum outro tipo de mancha que caracterizasse a presena de Aflatoxina B1.

Dessa forma, foi dispensado o uso de H2SO4 20% j que no havia nenhuma mancha suspeita que necessitasse confirmao. Mesmo que no tenha sido feita uma anlise quantitativa, a discusso dos limites aceitveis pela ANVISA da presena de aflatoxinas em alimentos vlida. Afinal, foi analisada qualitativamente apenas a aflatoxina b1 j que as demais aflatoxinas no puderam ser analisadas devido a falta de seus padres. De acordo com a RDC N7, de 18 de fevereiro de 2011, os limites mximos tolerados para micotoxinas do tipo aflatoxinas em alimentos so: Tabela 1: Limites Mximos Tolerados (LMT) para Micotoxinas

No caso analisado, portanto, o limite mximo tolerado para aflatoxina b1 de 20 g/kg (Alimento: Amendoim - com casca, descascasdo, cru ou tostado pasta de amendoim ou manteiga de amendoim) de acordo com a determinao da ANVISA. A determinao desses limites aceitveis importante, pois a exposio aflatoxinas pode causar problemas imunolgicos, distrbios hematopoiticos e danos significativos ao fgado (efeitos hepatotxicos). Foram demonstrados tambm, efeitos teratognicos causados pela aflatoxina b1. Nesse caso, foi demonstrada que a aflatoxina b1 pode reagir atravs de ligaes covalentes com os stios nucleoflicos de DNA, RNA e protenas e alterar a estrutura da molcula e tambm sua atividade biolgica, originando pontos de mutaes significativos. [6]Dessa forma, pode-se emitir o laudo: A PAOCA ROLHA DA MARCA TEKINHA LOTE: 0210041109 E VAL: 31/05/2014 NO APRESENTA QUALITATIVAMENTE A AFLATOXINA B1 EM SUA COMPOSIO.

ENTRETANTO, NO SE PODE EXCLUIR A PRESENA DAS DEMAIS AFLATOXINAS.

ConclusoDe acordo com a anlise realizada possvel concluir que a paoca rolha da marca TEKINHA no apresenta em sua composio a aflatoxina B1, porm no possvel afirmar se outros tipos de aflatoxinas esto ou no presentes neste produto.A partir disso, tambm possvel concluir que a tcnica de cromatografia em camada delgada uma tcnica simples, porm, eficaz para determinao qualitativa de substncias txicas em diferentes amostras.

Referncias[1] CONSTANTINO, Mauricio Gomes. Fundamentos de Qumica Orgnica experimental, pg 140-143. [2] CONSTANTINO, Mauricio Gomes. Fundamentos de Qumica Orgnica experimental, pg 159-160. [3] JUNIOR, Miguel Machinski. Aflatoxinas: Anlise em amendoim por cromatografia em camada delgada. Disponvel em: [4] PEREIRA, Kelly Cristina. DOS SANTOS, Carlos Fernando. Micotoxinas e seu potencial carcinognico. Ciencias Biologicas, Agrarias e da Saude, vol. 15, n4, ano 2011.[5] MURPHY, Patricia A. HENDRICH, Suzanne. LANDGREN, Cindy. Food Mycotoxins: An Update. Journal of food science, vol. 71, Nr.5, 2006.[6] FACCA, M.C.L.; DALZOTO, P.R. Aflatoxinas: Um perfil da situao do amendoim e derivados no cenrio brasileiro. Disponvel em: