mini curso biotecnologia
TRANSCRIPT
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
1/58
Faculdade de Cincias Sociais e Agrrias de Itapeva - FAIT
Mini curso
Biotecnologia na Agricultura
MsC. Mrian SberESALQ/EMBRAPA Meio Ambiente
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
2/58
Agricultura antiga
Culturas sustentveis;
Rotaes de culturas resistncia pragas einsetos, no utilizao de defensivos qumicos;
Mnimo impacto ambiental
Agricultura moderna
Modernizao agrcola;
Objetivo: LUCRO
Monocultura;
Mecanizao;
Pragas, defensivos qumicos.
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
3/58
BIOTECNOLOGIA
Impacto na comunidade global :Crise global de alimentos7-10x maior produo
Impacto positivo na sade humana :Menos gordura saturadaMais cidos graxos e mega 3
Impacto ambiental:Menor uso de pesticidasReduo de emisso de carbono
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
4/58
Correo de solos
Enriquecimento do solo com micro-organismosbenficos que estabelecem relaes simbiticas com asrazes das plantas resultando em:
Proteo contra doenas
Promoo do crescimento de razes
Quebra de cadeias qumicas disponibilizando
nutrientes para as plantas
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
5/58
Nutrio de plantas
Fixao de nitrognio em leguminosas e gramneas(inoculantes)
Aumento de nutrientes em fertilizantes de origemvegetal
Acelerao da decomposiode resduos vegetais
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
6/58
Preveno e Controle de Pragas e Doenas
Os defensivos biolgicos baseados em micro-organismospossibilitam o controle das seguintes pragas e doenas:
Lagartas
Colepteros Percevejos Mosca-branca Nematides
Rhizoctonia solanii Phytium spp. Fusarium spp. Odio
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
7/58
Bioremediao
Eliminao de sais
Reduo de metais pesados
Reduo de contaminaes por hidrocarbonetos
Revegetao
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
8/58
OGM
O melhoramento gentico de plantas constitui-se amaior aplicao da biotecnologia na agricultura. Em 2007as culturas de milho, soja, canola, algodo e arrozgeneticamente modificados ocuparam 114 milhes dehectares e envolveram 10 milhes de agricultores em 22
pases. Em 12 anos de existncia a biotecnologia OGMmovimentou US$ 6 bilhes, com crescimento de 10 a 20%ao ano.
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
9/58
+ Glyphosate
X
Plantas Sensveis ao Roundup
X
X
Shikimic acid + Phosphoenol pyruvate
3-Enolpyruvyl shikimic acid-5-phosphate(EPSP)
PlantaEPSP synthase
Aminoacidosaromticos
Sem aminocidos,
Plantas morrem
X
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
10/58
BacteriaEPSP synthase
Shikimic acid + Phosphoenol pyruvate
3-enolpyruvyl shikimic acid-5-phosphate(EPSP)
Aminocidosaromticos
Plantas Resistntes ao Roundup
+ Glyphosate
Com aminocidos,
planta vive
RoundUp no tem efeito;enzima resistente ao herbicida
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
11/58
Flavr Savr (Calgene)
Tomate transgnico Tomate tradicional
SUPERMERCADO
O tomate tradicionaltem de ser colhido
verde, para no seresmagado durante otransporte.
O tomate tradicional vaporizado com
etileno para induzir amaturao.
O tomate transgnicoamadurece na planta,
ficando com mais sabor.Mantm-se firme aps acolheita.
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
12/58
Etapas no laboratrio
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
13/58
O prximo teste no campo
No-transgenicos
Transgenicos
Resistencia ao herbicida
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
14/58
Teste final dos transgnicosAceitao do consumidor
RoundUp Ready
Antes Depois
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
15/58
CLONAGEM CELULAR
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
16/58
Engenharia Gentica ou Tecnologia do DNA Recombinante
um conjunto de tcnicas que permite aos cientistas identificar,
isolar e multiplicar genes de quaisquer organismos.
Clonagem de genes de
interesse para expresso eproduo de protenasrecombinantes: insulina,hormnio de crescimento genes de humanosclonados em bactrias;
Plantas transgnicas;
Animais transgnicos.
Clonagem molecular;
Vetores; PCR;
Bibliotecas genmicas;
Sequenciamento de DNA;
Hibridizao;
Eletroforese.
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
17/58
Tecnologia do DNA recombinante: construo de umamolcula de DNA recombinante
DNA quimera
(DNA recombinante)Fragmentos de DNA ligados a um vetor de clonagem
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
18/58
ENZIMAS DE RESTRIO
Protenas que reconhecem e clivam o DNA em pontos
especficos, geralmente em sequncias de 4, 6 e 8 bases -
palndromas
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
19/58
Vetores de clonagem
Plasmdeos podem ser modificados para carregar novos genes
devem apresentar origem de replicao;
devem apresentar um gene para seleo (gene para resistncia a antibitico);
devem apresentar mltiplos stios de clonagem (poli-linker)
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
20/58
PLASMDIOS E VETOR DE CLONAGEM
cromossomo plasmdeos
cromossomo plasmdeos
Diviso celular
ocorrem naturalmente em algumas bactrias; so molculas de DNA dupla fita e circular;muitas vezes carregam genes para resistncia a antibiticos; replicao independente da replicao cromossmica
(apresentam uma origem de replicao independente).
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
21/58
Origem de replicao
Genes para resistnciaa antibiticos
Permite que a clula
hospedeira cresa em meio
seletivo
Mltiplos stios de
clonagem
Permite a insero de DNA
exgeno
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
22/58
Transformao qumica
Eletroporao
Insero do DNA dentro da clula bacteriana
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
23/58
Cassetes de transformao so produzidos nos laboratrios
Eles so introduzidos dentro das plantas
Dois mtodos principais:
Introduzir o gene na Planta
Agrobacterium
Gene GunCultura de tecido, deveRegenerar a plantatrangnica
Cl
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
24/58
Clonagem
1 plasmdeo1 clulaTransformaoplasmdeo
recombinante
Recombinao
com o gene alvo
Enzima de
restrio
Enzima de
restrio
DN
Acromossm
ico
Gene alvo
DNA Recombinante
Transformao
Clula hospedeira
Juang RH (2004) BCbasics
A lifi S l
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
25/58
Amplificao e Seleo
1
1 clula, 1 colnia
X100
X1,000
Duplicaoplasmdeo
Duplicaobactria
Plaquear
Isolar a colnia
com o gene de interesse
=100,000 Juang RH (2004) BCbasics
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
26/58
1.Estrutura primria estrutura de nucleotdeos.
-Nucleotdeo = Acar + Fosfato + Base nitrogenada.
A ESTRUTURA DO DNA
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
27/58
1 componente - Acar
A ESTRUTURA DO DNA
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
28/58
A ESTRUTURA DO DNA
2 componente Base nitrogenada
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
29/58
A ESTRUTURA DO DNA
3 componente Grupamento Fosfato.
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
30/58
A ESTRUTURA DO DNA
Estrutura secundriaconfigurao tridimensional.
-Estrutura em dupla hlice.
-Ligaes fosfodister.
-Pontes de Hidrognio.
-Complementariedade de bases:
A -TG -C
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
31/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
32/58
Dogma Central da Biologia Molecular
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
33/58
DNA
RNA
Protena
Duplicao
Transcrio
Traduo
Transcriptase
Reversa
Transcriptoma
Proteoma
Genoma
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
34/58
Extrao de DNA
No geral, toda extrao de DNA se baseia em 4 etapasbsicas:
1. Lise das membranas lipdicas;2. Purificao do DNA ;3. Precipitao do DNA;4. Reidratao do DNA.
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
35/58
PCR: Polymerase Chain Reaction
(Reao em cadeia da polimerase)
O processo de PCR foi inventado por Kary Mullis no incio dadcada de 80 atribudo o Premio Nobel da Qumica pelo seu
trabalho.
um mtodo de amplificao (de criao de mltiplas cpias)de DNA sem o uso de um organismo vivo, por exemplo,
Escherichia coli(bactria) ou leveduras.
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
36/58
1. Desnaturao (94-96C, 30-600 segundos).
Durante a desnaturao, a cadeia dupla do DNA separada em duas cadeias simples. A DNA polimerase estvel a altas temperaturas pois obtida de organismos que vivem
em ambientes extremos (extremfilos). A DNA polimerase mais usada a Taqpolimerase (obtida de Thermus aquaticus).
2. Annealing (emparelhamento, pareamento, hibridizao) (45-80 C, 30-120segundos).
Durante o emparelhamento, os iniciadores (primers) ligam-se ao DNA de cadeia simplese a DNA polimerase liga-se aos iniciadores emparelhados.
3. Alongamento (polimerizao) (65-80 C, 30-120 segundos). Durante o alongamento, a DNA polimerase cria a cadeia de DNA complementar
medida que percorre o DNA de cadeia simples, incorporando desoxirribonucletideos
presentes na reao.
Aps cada ciclo, a quantidade de DNA duplica. Assim, aps mltiplas ciclos, o aumentoda quantidade de DNA exponencial de base 2.
PCR: Polymerase Chain Reaction
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
37/58
Reao em cadeia da polimerase (PCR)
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
38/58
1 ciclo
2 ciclo
3 ciclo
4
ciclo
5 ciclo
6 ciclo
PCR amplifica DNA
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
39/58
Que regentes so necessrios para uma reao de
PCR?
REAGENTES:1. DNA polimerase;2. Buffers (Soluo-Tampo)3. MgCl2
4. Primers5. DNA Molde6. dNTPs
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
40/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
41/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
42/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
43/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
44/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
45/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
46/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
47/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
48/58
Como eu visualizo o material amplificado?
Eletroforese
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
49/58
Eletroforese
l f d A
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
50/58
Eletroforese de DNA
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
51/58
5ul
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
52/58
Anlise da Sequncia de DNA
nucleotdeo
base
acar
fosfato
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
53/58
G C A T
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
54/58
ABI 3700 Applied Biosystems
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
55/58
Detecoa laser
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
56/58
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
57/58
Aula prtica: Extrao de DNA
1. Utilizar 400 L de TEM soluo de homogeinizao, 40 L de 10% SDS e 8
L de proteinase-K2. Incubar 55C por 1h3. Adicionar 300 L de NaCl (soluo saturada)4. Vortex por 30 segundos5. Centrifugar por 30 min 14.000 g6. Transferir o sobrenadante para um tubo novo7. Precipitar o DNA utilizando um volume de isopropanol e manter a -20C
por 2h8. Centrifugar por 15 min 14.000 g (4C)9. Lavar o pellet de DNA com etanol 100% (1 mL) e centrifugar por 5 min
(14.000 g)
10.Lavar o pellet de DNA com etanol 70% (1 mL) e centrifugar por 5 min(14.000 g)
11.Secar a temperatura ambiente12.Ressuspender o DNA em 20 L de H2O milli-Q autoclavada13.Armazenar a -20C
-
7/30/2019 Mini Curso Biotecnologia
58/58